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Sonda mediadora de PCR: un nuevo enfoque para la detección de PCR en tiempo real basado en sondas primarias sin etiquetas y en indicadores fluorogénicos universales secundarios estandarizados
B. Faltin, S. Wadle, G. Roth, R. Zengerle y F. von Stetten
Noviembre de 2012
www.clinchem.org/content/58/11/1546.full
© Copyright 2012 by the American Association for Clinical Chemistry
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ResumenResumen
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en diagnósticos clínicos
Multiplicación de ADN Varias aplicaciones, p. ej.:
• Genotipo (p. ej., polimorfismos de nucleótido único)
• Cuantificación (p. ej., carga de patógenos)
• Perfiles de expresión (p. ej., detección del cáncer)
Figura 1. Representación esquemática del principio de PCR.
Desnaturalización del ADN objetivo
Hibridación de los cebadores
Elongación de los cebadores
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Resumen (continuación)Resumen (continuación)
PCR en tiempo real (p. ej., sonda de hidrólisis de PCR)
Ventajas• Especificidad, sensibilidad• Poco tiempo para la obtención
de resultados• Análisis multiplex
Desventajas
• Alto costo (sonda individual para cada objetivo)
• Señal de fondo desigual en las diferentes sondas
Elongación del cebador y escisión de la sonda de hidrólisis
Figura 2. Sonda de hidrólisis: estructura (arriba) y escisión durante la elongación del cebador (abajo).
Hibridación de cebadores y sondas de hidrólisis
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PreguntaPregunta
¿Por qué la sonda de hidrólisis de PCR tiene un alto costo durante el desarrollo del ensayo o cuando se aplica a numerosos objetivos diferentes?
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MétodosMétodos
Sonda mediadora de PCR Nuevo enfoque para multiplicación
en tiempo real Sonda mediadora (MP)
• Región de 3’ específica según objetivo (sonda)
• Región genérica de 5’ (mediador)
• Sin etiqueta Indicador universal (UR)
• Fluoróforo y extintor• Conformación de horquilla• Sitio mediador de hibridación
Figura 3. Estructura de la sonda mediadora (arriba) e indicador universal (abajo)
*
* El extintor y el fluoróforo deben estar en estrecha proximidad
*
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Métodos (continuación)Métodos (continuación)
Figura 4. Sonda mediadora de PCR: (A) ADN objetivo, (B) Desnaturalización, (C) Hibridación de MP y cebadores, (D) Elongación del cebador; escisión de MP; liberación del mediador, (E) Hibridación del mediador al UR, (F) Elongación del mediador, (G) Degradación en el término de 5’ del UR. El extintor se libera del UR o (H) Desplazamiento en el término de 5’; desplegado de la horquilla y activación.
Desnaturalización del ADN objetivo
ADN objetivo
Sonda mediadoraPolimerasa
Hibridación de cebadores y sonda mediadora
Elongación del cebador y escisión de la sonda mediadora; liberación del mediador
Degradación en el término de 5’ Desplazamiento en el término de 5’
Elongación del mediador
Hibridación del mediador al indicador universal
Cebador
Mediador
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PreguntaPregunta
¿Qué requisitos deben cumplirse para el diseño de secuencia de la sonda mediadora y el indicador universal?
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Figura 5. Imprecisión intraensayo entre la MP de PCR y la sonda de hidrolisis de PCR. Los números de copias con cálculo regresivo de MP de PCR (abscisa) se trazan en comparación con los resultados de la sonda de hidrólisis de PCR (ordenada). Cálculo de 5 concentraciones de ADN diferentes con 8 reproducciones cada una.
ResultadosResultados
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Figura 6. Multiplicación dúplex de varias concentraciones de ADN de HPV18 y 300 copias de ACTB de H. sapiens. Los números de copias calculadas de HPV18 se trazan para la MP de PCR (abscisa) y la sonda de hidrólisis de PCR (ordenada).
Resultados Resultados (continuación)(continuación)
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Figura 7. Multiplicación de una serie de dilución de ADN de HPV18 (a) y E. coli (b). Los valores de la copias con cálculo regresivo para MP de PCR (abscisa) se trazan en comparación con los valores de la sonda de hidrólisis de PCR (HP) (ordenada).
Resultados (continuación)Resultados (continuación)
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Resultados (continuación)Resultados (continuación)
Figura 8. Límite de detección. MP de PCR (negro), Sonda de hidrólisis de PCR (gris).
95 %
Sonda de hidrólisis de PCR: 85 copias/rxn
Sonda mediadora de PCR:78 copias/rxn
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Figura 9. Eficiencia de la extinción de la fluorescencia. Sondas de hidrólisis específicas (panel izquierdo) e indicadores universales (panel derecho).
Resultados Resultados (continuación)(continuación)
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Resultados (continuación)Resultados (continuación)
Tabla 1. Ahorro de costos para MP de PCR en comparación con la sonda de hidrólisis de PCR. Sobre el punto de equilibrio de 4 oligonucleótidos, la MP de PCR es más económica que la sonda de hidrólisis de PCR. Se calculan los costos de síntesis de oligonucleótidos para un número diferente de objetivos (escala de síntesis de 0.05 nmol).
Costos de la síntesis de oligos ($)
Número de objetivos 1 4 10
Sonda de hidrólisis de PCR 245 980 2450
MP de PCR1 655 895 1500
UR 600 675 950
MP 55 220 550
1Costo de MP de PCR = Costo de UR + Costo de MP
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PreguntaPregunta
¿Cuál es la ventaja de la MP de PCR en comparación con la sonda de hidrólisis de PCR?
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ConclusiónConclusión La MP de PCR es una técnica de PCR alternativa
en tiempo real El límite de detección (LOD), la imprecisión entre ensayos e
intraensayos y la capacidad doble de la MP de PCR son comparables con la sonda de hidrólisis de PCR
Síntesis de bajo costo de MP específicas según objetivo y sin etiqueta
Solo se requiere un indicador fluorogénico universal (UR) para controlar la multiplicación de diferentes muestras
Ahorro de costos en la síntesis de UR gracias a la economía de escalas
El UR tiene una alta eficiencia de enfriamiento independiente del objetivo
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