硕 士 学 位 论 文

IHHNV 衣壳蛋白-凡纳滨对虾鳃细胞膜受体的初步研究

尹 晓 彤

指导教师 费荣梅 副教授

专业名称 预防兽医学

研究方向 兽医微生物学与免疫学

答辩日期 二○一五年五月

分类号 S852

学 号 2012107045

THE PRELIMINARY STUDY OF THE IHHNV

CAPSID PROTEIN RECEPTORS ON THE GILL

MEMBRANE OF LITOPENAEUS VANNAMEI

By

Yin Xiaotong

Supervised by Dr. Associate Prof. Fei Rongmei

A Dissertation

Submitted to

Nanjing Agricultural University

In Partial Fulfillment of the Requirements for

The Master Degree of Agronomy（Veterinary Medicine）

Completed in May, 2015

Commencement in May, 2015

原 创 性 声 明

本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作

所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已

经发表或撰写过的作品成果对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以

明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。

学位论文作者（需亲笔）签名： 年 月 日

学位论文版权使用授权书

本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并

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权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以

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保密□，在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密□。

（请在以上方框内打“√”）

学位论文作者（需亲笔）签名： 年 月 日

导师（需亲笔）签名： 年 月 日

目 录

i

目 录

摘 要 .................................................................................................................................. Ⅰ

ABSTRACT ........................................................................................................................ III

第一篇 文献综述

第一章 传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）研究进展 .................................. 1

1 IHHNV 简介 ................................................................................................................. 1

1.1 IHHNV 的发现及流行情况 .................................................................................. 1

1.2 IHHNV 的易感动物、临床症状、病理特征 ..................................................... 1

1.3 IHHNV 的传播途径 .............................................................................................. 3

2 IHHNV 的结构特征及基因组特征 ............................................................................. 3

3 感染的分子机制 .......................................................................................................... 3

参考文献 ............................................................................................................................ 5

第二章 病毒覆盖蛋白印迹技术（VOPBA）原理及其应用 .......................................... 9

1 VOPBA 原理 ................................................................................................................ 9

2 VOPBA 的应用 ............................................................................................................ 9

参考文献 .......................................................................................................................... 11

第三章 噬菌体肽库展示技术 .......................................................................................... 13

1 噬菌体肽库展示技术分类 ........................................................................................ 13

2 噬菌体肽库展示技术原理 ........................................................................................ 13

3 噬菌体肽库展示技术应用 ........................................................................................ 14

3.1 生物信息传递 ...................................................................................................... 14

3.2 抗体及疫苗制备 .................................................................................................. 14

3.3 抗原表位分析 ...................................................................................................... 14

3.4 疾病诊断与治疗 .................................................................................................. 15

参考文献 .......................................................................................................................... 16

第二篇 试验研究

第四章 IHHNV CP 原核表达和多克隆抗体的制备 ..................................................... 17

1 材料与方法 ................................................................................................................ 17

IHHNV 衣壳蛋白凡纳滨对虾细胞膜受体的初步研究

ii

1.1 主要材料 .............................................................................................................. 17

1.2 主要试剂与仪器 .................................................................................................. 18

1.3 IHHNV CP 蛋白原核表达载体的构建 .............................................................. 18

1.4 IHHNV CP 蛋白诱导表达及纯化 ...................................................................... 18

1.5 IHHNV CP 蛋白多抗的制备及效价的测定 ...................................................... 19

2 结果与分析 ................................................................................................................ 20

2.1 IHHNV CP 原核表达载体的构建 ...................................................................... 20

2.2 IHHNV CP 诱导表达及纯化 .............................................................................. 21

2.3 IHHNV CP 多抗效价的测定 .............................................................................. 21

2.3.1 兔抗 IHHNV CP 多抗的间接 ELISA 方阵滴定结果 ................................. 21

2.3.2 兔抗 IHHNV CP 多抗的三免效价的测定 ................................................... 22

3 讨论 ............................................................................................................................ 23

参考文献 .......................................................................................................................... 24

第五章 IHHNV 衣壳蛋白凡纳滨对虾鳃细胞膜受体筛选及验证 .............................. 27

1 材料与方法 ................................................................................................................ 27

1.1 主要材料 .............................................................................................................. 27

1.2 主要试剂与仪器 .................................................................................................. 28

1.3 凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白的提取 ...................................................................... 28

1.4 IHHNV CP 凡纳滨对虾鳃细胞膜受体一维的筛选 .......................................... 28

1.4.1 VOPBA .......................................................................................................... 28

1.4.2 HIS Pull Down ............................................................................................... 29

1.5 IHHNV CP 凡纳滨对虾鳃细胞膜受体 VOPBA 二维的筛选 ........................... 30

1.6 疑似受体蛋白 NM23 的验证 .............................................................................. 31

1.6.1 pGEX -4t-1 -NM23 原核表达载体的构建及纯化 ....................................... 31

1.6.2 NM23 VOPBA 验证实验 .............................................................................. 32

1.6.3 NM23 GST Pull Down 验证实验................................................................. 32

2 结果 ............................................................................................................................ 32

2.1 IHHNV CP 凡纳滨对虾鳃细胞膜受体的筛选 .................................................. 32

2.1.1 未感染 IHHNV 凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白的提取 ..................................... 32

2.1.2 VOPBA（一维）实验 VOPBA 和 HIS Pull Down ..................................... 33

2.1.3 VOPBA（二维）实验 .................................................................................. 34

2.2 疑似受体蛋白 NM23 的验证 .............................................................................. 35

2.2.1 NM23-pGEX -4t-1 原核表达载体的构建及纯化 ........................................ 35

2.2.2 NM23 VOPBA 验证实验 .............................................................................. 36

目 录

iii

2.2.3 NM23 GST Pull Down .................................................................................. 37

3 讨论 ............................................................................................................................ 38

参考文献 .......................................................................................................................... 41

第六章 噬菌体随机十二肽库筛选 IHHNV 衣壳蛋白结合肽 ...................................... 45

1 材料与方法 ................................................................................................................ 45

1.1 主要材料 .............................................................................................................. 45

1.2 主要试剂与仪器 .................................................................................................. 45

1.3 噬菌体随机十二肽库筛选衣壳蛋白结合肽 ...................................................... 46

1.3.1 噬菌体随机十二肽库容量的测定 ............................................................... 46

1.3.2 IHHNV CP 与噬菌体随机十二肽库的亲和筛选 ....................................... 46

1.4 第四次洗脱液得到单克隆的克隆特性 .............................................................. 47

1.5 噬菌体结合特性鉴定 .......................................................................................... 47

1.6 阳性单克隆噬菌体 DNA 的提取 ....................................................................... 47

1.7 序列 A 氨基酸序列与 NM23 氨基酸序列比对 ................................................. 47

2 结果与分析 ................................................................................................................ 48

2.1 E.coli ER2738 的生长曲线测定 ...................................................................... 48

2.2 噬菌体随机十二肽库筛选衣壳蛋白结合肽 ...................................................... 48

2.3 洗脱噬菌体和噬菌体单克隆的间接 ELISA 检测 ............................................. 49

2.4 噬菌体单克隆插入序列的 PCR 鉴定及测序 .................................................... 49

参考文献 .......................................................................................................................... 52

全文总结 .............................................................................................................................. 55

致 谢 .............................................................................................................................. 57

发表论文 .............................................................................................................................. 59

附 录 实验主要所需试剂配制 ...................................................................................... 61

摘 要

Ⅰ

IHHNV 衣壳蛋白凡纳滨对虾鳃细胞膜受体的初步研究

摘 要

对 虾 传 染 性 皮 下 及 造 血 组 织 坏 死 病 毒 病 （ Infectious Hypodermal and

Haematopoietic Necrosis ，IHHN）为对虾主要病毒病之一，近些年，IHHNV 流行范

围遍布全球各地，造成严重的经济损失。IHHHV 敏感宿主是细角滨对虾和凡纳滨对

虾，对细角滨对虾引起急性感染和高死亡率，对凡纳滨对虾可导致慢性矮小残缺综合

症（RDS），对养殖业造成巨大经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将 IHHNV 列为

须向其申报的甲壳类重要疾病之一。目前，IHHNV 在流行病学和诊断方面受到重视，

但其致病机理鲜有报道。本文重点着力于 IHHNV 衣壳蛋白鳃细胞膜受体的研究，通

过 VOPBA、Pull Down、噬菌体随机十二肽库，筛选 IHHNV CP 受体蛋白，为 IHHNV

进一步研究提供依据。

本文首先提取 IHHNV 射阳株发病凡纳滨对虾鳃组织的 DNA，根据 GenBank 公

布的射阳株序列（Accession KF214742）设计引物构建了 IHHNV CP 原核表达载体。

进行蛋白原核表达，目的蛋白主要以包涵体形式表达，用 HisTrapTM

HP 柱纯化目的蛋

白后，进行尿素透析，将透析后的蛋白免疫新西兰白兔，制备多克隆抗体，三免后抗

体效价达到 1：102400。

利用匀浆、超速离心分离未感染 IHHNV 凡纳滨对虾的鳃细胞膜蛋白，获得均匀

分布的凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白条带。

利用 VOPBA 结合 Pull Down 实验筛选 IHHNV CP 凡纳滨对虾鳃细胞膜受体，得

到 Signal transducer and activator of transcription（STAT信号转导与转录激活因子）、Heat

shock protein 90（热休克蛋白90）、Prophenoloxidase-2（酚氧化酶原2型）、Na+/K

+-ATPase

alpha subunit（Na+/K

+-ATP 酶 a 亚基）、NM23 protein 五种蛋白。将 NM23 基因构建到

pGEX -4t-1 原核表达载体上，进行原核表达，用 GST 磁珠进行纯化，进行 NM23 与

CP 的 VOPBA 和 NM23 与 CP 的 GST Pull Down 验证实验，结果表明，NM23 能与

IHHNV CP 相互作用。

利用噬菌体随机十二肽库淘选 IHHNV CP 结合肽，经过三次亲和→洗脱→扩增→

亲 和 的 循 环 淘 洗 过 程 ， 得 到 6 种 十 二 肽 可 以 与 IHHNV CP 结 合 ， A

IHHNV 衣壳蛋白凡纳滨对虾细胞膜受体的初步研究

Ⅱ

（ SWSSWVYRDPQT ）、 B （ HSFKWLDSPRLR ）、 C （ SSFKWLDSPRLR ）、 D

（HRSKWVYSDPQR）、E（YWSKWVDWHPQR）、F（SSCKWVDWD*AE），其中 B

与 C 只相差第一个氨基酸，B 是 H，C 是 S。D 与 E 均含有 SKWV 和 PQR，可能是

IHHNV CP 的特征结合肽。序列 A（SWSSWVYRDPQT）与 NM23 蛋白比对后发现，

SW*Y（*为 V 或 I）也可能是 IHHNV CP 的特征结合肽。通过之前 VOPBA 和 GST Pull

Down 验证实验，进一步证明 IHHNV CP 能与 NM23 protein 相互作用。

关键词：IHHNV；衣壳蛋白；鳃细胞膜蛋白；受体；NM23 蛋白

ABSTRACT

III

THE PRELIMINARY STUDY OF THE IHHNV

CAPSID PROTEIN RECEPTORS ON THE GILL

MEMBRANE OF LITOPENAEUS VANNAMEI

ABSTRACT

Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis（IHHN）is one of the main viral

diseases of penaeid shrimp.In recent years, it has circulated around the world, causing

serious economic loss. The World Organization for Animal Health（OIE）listed IHHNV as

a key crustacean virus that must be declared. At present, many studies have been

undertaken including epidemiological surveys and establishing diagnostic methods, but the

pathogenic mechanism of IHHNV infection are still relatively unknown. This study mainly

focus on the gill cell membrane receptors of the IHHNV capsid protein.To scan out the

receptors, VOPBA, Pull Down, the phage dodecapeptides display library were used. This

study could provide novel insights into the pathogenesis of IHHNV.

Prokaryotic expression of IHHNV CP was conducte firstly,using the primers according

to the Sheyang isolate（Accession KF214742）, after DNA of gill tissue was extracted. The

protein was primarily expressed in precipitate. After purified by HisTrapTM

HP, CP was

urea dialysed and then used to immune the New Zealand white rabbits to prepare

polyclonal rabbit antibody.After three times of immune, the titer was up to 1：102400.

The gill tissue from Litopenaeus vannamei uninfected by IHHNV was choosen to

prepare the gill membrane proteins .Uniform distribution of gill membrane proteins were

acquired after tissue homogenization and ultracentrifugation.

Signal transducer and activator of transcription, Heat shock protein90,

Prophenoloxidase-2, Na+/K

+-ATPase alpha subunit, NM23 protein were scaned out using

VOPBA and HIS Pull Down.The NM23 gene was cloned into the pGEX-4t-1 vector and

prokaryotic expressed.After purified by Glutathione Sepharose™ 4B, the NM23 VOPBA

and NM23 GST Pull Down confirmatory experiments were proceeded. The results shown

that the NM23 could interact with IHHNV CP.

Then IHHNV CP binding peptides were scanned out by the phage dodecapeptides

IHHNV 衣壳蛋白凡纳滨对虾细胞膜受体的初步研究

IV

display library.After four times of the circulatory affinity, elution, amplification and affinity,

six kinds of dodecapeptides were scanned out, which could interact with IHHNV CP. They

were A（SWSSWVYRDPQT）,B （HSFKWLDSPRLR）, C（SSFKWLDSPRLR）, D

（HRSKWVYSDPQR）, E（YWSKWVDWHPQR）,F（SSCKWVDWD*AE）.Among these

dodecapeptides, B and C differed by the first amino acid, B was H, C was S.Both D and E

contained SKWV and PQR, which probably the characteristic binding peptides of IHHNV

CP. SW*Y（*meaned V or I）also possibly the characteristic binding peptides of IHHNV CP

after the contrast between sequence A（SWSSWVYRDPQT）and the amino acids sequence

of NM23 protein. By means of the NM23 VOPBA and NM23 GST Pull Down

confirmatory experiments, the interaction between IHHNV CP and NM23 protein was

further proofed.

KEY WORDS: IHHNV; Capsid protein; Gill membrane proteins; Receptor; NM23

protein

第一篇 文献综述 第一章 传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）研究进展

1

第一篇 文献综述

第一章 传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）

研究进展

随着生活水平的不断提高，人们对对虾产品的需求日益提高，大规模对虾养殖业

蓬勃发展，但在集约化、最大利益化的驱使下，病毒性和细菌性感染难以控制，加上

世界水产品养殖的大量进出口，导致许多水产品疾病暴发。自 1981 年以来，在美洲

及亚洲的虾群中相继出现了一系列新的病原体，导致很高的致死率，严重影响对虾养

殖业的发展[1]。目前已报道二十几种对虾病毒，其中对虾传染性皮下及造血组织坏死

病毒（Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus, IHHNV）、白斑综合征

病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）、黄头病毒（Yellow Head Virus, YHV）、桃

拉综合征病毒（Taura Syndrome Virus，TSV）呈世界性流行。IHHNV 在我国有较高

的检出率，但致死率不高，发病对虾主要影响对虾的生长发育，导致生长缓慢、表皮

畸形、产量下降等，造成 10%-50%的经济损失[2-3]。

1 IHHNV 简介

1.1 IHHNV 的发现及流行情况

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒病（IHHN）也称慢性矮小残缺综合征

（Runt-Deformity Syndrome，RDS），是养殖对虾主要的病毒病之一，早在 1981 年于

美国夏威夷地区养殖细角滨对虾（Litopenaeus stylirostris）中被发现，并对其造成 90%

以上的致死率 [4]。

自暴发以来，IHHN 迅速向世界各地传播蔓延。1996 年，Lightner 发现 IHHNV

在美洲、大洋洲、东亚及东南亚均有传播。2000 年，非洲养殖对虾中也发现有 IHHNV

感染。韩国于 2010 年，在养殖的凡纳滨对虾（L. vannamei）中首次分离出一株 IHHNV

毒株[5]。

1.2 IHHNV 的易感动物、临床症状、病理特征

IHHNV 衣壳蛋白凡纳滨对虾细胞膜受体的初步研究

2

据报道，大多数对虾都能感染 IHHNV。目前几种对虾已经确定为是 IHHNV 的宿

主或潜在携带者，包括来自养殖厂、野生和人工感染来源的对虾，已在细角滨对虾、

凡纳滨对虾、斑节对虾（P.monodon）检测到 IHHNV 。有报道称褐虾（P. subtilis）易

被实验室感染，但感染组织中没有相应的病理特征[6]。在墨西哥东海岸的褐沟虾和白

对虾中也检测到了较低的发病率。除了对虾外，利用 PCR 技术和 DIG 探针，在罗氏

沼虾的后期幼体和亚成体中也检测到了 IHHNV 感染，引起高死亡率，并能产生在细

角滨对虾、凡纳滨对虾、斑节对虾中出现的、类似于 RDS 引起的畸形[7]。2005 年，

国内研究在对饵料、环境生物进行检测时发现绒鳌近方蟹呈 IHHNV 阳性[8]。IHHNV

易感宿主如表 1-1。

细角滨对虾感染 IHHNV 后会在水面上无活力的游动，然后静止，翻转并沉入水

底。相对于成虾，IHHNV 对稚虾感染更为严重 [9] 。其他种属的对虾相对于细角滨对

虾，感染 IHHNV 后表现为慢性感染。IHHNV 会引起凡纳滨对虾 RDS，造成生长速

率显著减慢以及表皮畸形引起的触角鞭毛皱起、额剑弯曲、表皮粗糙或残缺、腹部甲

壳病变、尾节弯曲 [10-12]。IHHNV 不会严重影响斑节对虾的生长速率和繁殖率，不会

产生严重的畸形[2]。

组织病理学检测以及电镜观察显示在细角滨对虾、凡纳滨对虾、斑节对虾急性和

亚急性感染的组织中具有大的 Cowdry type A 核内包涵体，分布在鳃、神经索、胃黏

膜、触角腺、表皮的真皮层、造血组织和结缔组织中[13-14]。细角滨对虾在鳃、神经索、

神经节这些组织的损伤要比凡纳滨对虾严重[15-18]，这些病理学特征引起了 IHHNV 感

染后的特征临床症状。

表 1-1 已知可自然感染和人工感染 IHHNV 的宿主

Table 1-1 Known host species reported to be naturally or experimentally infected with IHHNV

Phylum Order Family Species References

Arthropoda Decapoda Penaeidae Penaeus stylirostris Lightner et al,1983;Bell and

Lighter,1984

P.vannamei Lightner et al,1983;Bell and

Lighter,1984

P.monodon Primavera and Quinitio,2000

P.setiferus Guzmάn-Sάenz et al.,2009

P．japonicus Tang et al.,2007

P.californiensis Robles-Sikisaka et al.,2010

P.subtilis Coelho et al.,2009

P.aztecus Guzmάn-Sάenz et al.,2009

Artemesia longinaris Martorelli et al.,2010

Arthropoda Decapoda Palaemonidae Macrobrachium rosenbergii Hsieh et al.,2006

Palaemon macrodactylus Martorelli et al.,2010

Arthropoda Decapoda Varunidae Cyrtograpsus angulatus Martorelli et al.,2010