МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

Федоренко Виктория Николаевна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЦЕНКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО

ПОТЕНЦИАЛА МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ УТИЛИЗАЦИИ

НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ СЕВЕРНЫХ МОРЕЙ

03.02.03-микробиология

03.01.06-биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Нетрусов Александр Иванович

Москва – 2016

2

СОДЕРЖАНИЕ

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ…………………………………………... 5

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………... 6

ГЛАВА 1. ОСВОЕНИЕ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ АРКТИКИ

И ЕГО ВОЗДЕЙСТВИЕ НА ЭКОСИСТЕМЫ СЕВЕРНЫХ МОРЕЙ………... 11

1.1. Арктическая зона Российской Федерации………………………………… 11

1.1.1. Ресурсы нефти, природного газа и конденсата арктического

шельфа России………………………………………………………. …… 13

1.1.2. Разведанность Арктического шельфа России…………………… 14

1.2. Источники углеводородного загрязнения в Арктике……………………. 16

1.2.1. Поведение нефти в морской среде……………………………….. 20

1.2.2. Поведение нефти на льду…………………………………………. 26

1.3. Влияние нефти и нефтепродуктов на состояние экосистем северных

морей…………………………………………………………………………….. 28

1.4. Ликвидация нефтяных загрязнений в Арктике………………………….. 42

ГЛАВА 2. МИКРООРГАНИЗМЫ СЕВЕРНЫХ МОРЕЙ И ДЕГРАДАЦИЯ

НЕФТИ…………………………………………………………………………… 45

2.1. Численность микроорганизмов в морской воде…………………………. 46

2.2. Разнообразие микроорганизмов в условиях низких температур……….. 48

2.2.1. Разнообразие морских углеводородокисляющих

микроорганизмов……………………………………………………………….. 52

2.2.2. Распространенность и некоторые физиологические особенности

углеводородокисляющих микроорганизмов северных морей………………. 55

2.3. Утилизация углеводородов микроорганизмами в водной среде……….. 62

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ………………… 68

3.1. Материалы исследования…………………………………………………. 68

3.1.1. Физико-географические характеристики мест отбора проб…… 69

3.2. Методы исследований…………………………………………………….. 70

3.2.1. Питательные среды и условия культивирования

микроорганизмов................................................................................................. 70

3

3.2.2. Определение общей микробной численности (ОМЧ)…………... 71

3.2.3. Исследование температур роста микроорганизмов….………….. 71

3.2.4. Получение чистых культур микроорганизмов…………………... 72

3.2.5. Проведение сканирующей электронной микроскопии (СЭМ)…. 72

3.2.6. Изучение культуральных и физиолого-биохимических

особенностей микроорганизмов……………………………………………….. 72

3.2.7. Идентификация микроорганизмов молекулярно-генетическими

методами…………………………………………………………………………. 73

3.2.8. Изучение субстратного спектра микроорганизмов……………… 74

3.2.9. Определение степени деструкции нефти………………………… 75

3.2.10. Измерение эмульгирующей активности………………………… 76

3.2.11. Измерение величин поверхностного натяжения……………….. 77

3.2.12. Измерение степени гидрофобности поверхности клеток……… 77

3.2.13. Долговременное хранение чистых культур…………………….. 78

3.2.14. Определение выживаемости и активности клеток в

отношении углеводородов после хранения........................................................ 79

3.2.15. «Тест на ускоренное хранение»…………………………………. 79

3.2.16. Статистическая обработка полученных данных……………….. 80

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ……… 81

4.1. Выделение и селекция микробных сообществ из природных источников

4.1.1. Отбор образцов…………………………………………………….. 83

4.1.2. Подбор и оптимизация сред культивирования морских

углеводородокисляющих микроорганизмов………………………………….. 84

4.1.3. Исследование температур роста микробных сообществ………... 92

4.1.4. Биоэмульгирующая активность микробных сообществ………… 95

4.1.5. Количественная оценка деструкции углеводородов микробными

сообществами …………………………..……………………………………… 97

4.2. Выделение и селекция чистых культур микроорганизмов, активных в

отношении УВ………………………………………………………………….. 103

4.2.1. Идентификация исследуемых штаммов…………………………. 109

4

4.2.2. Спектр углеводородов, потребляемых исследуемыми

микроорганизмами……………………………………………………………… 115

4.2.3. Количественная оценка деструкции углеводородов чистыми

культурами микроорганизмов …………………………….…………………… 123

4.2.4. Биоэмульгирующая активность чистых культур

микроорганизмов……………………………………………………………….. 129

4.2.4.1. Определение индекса эмульгирования культур……………….. 130

4.2.4.2. Определение показателя гидрофобности поверхности

клеток…………………………………………………………………………….. 133

4.2.4.3. Определение способности культур к снижению поверхностного

натяжения супернатантов……………………………………. …………………. 136

4.2.4.4. Определение способности кульутр к снижению поверхностного

натяжения культуральной жидкости…………………………………………… 138

4.3. Хранение микроорганизмов……………………………………………….. 143

4.3.1. Криоконсервирование культур морских углеводородокисляющих

микроорганизмов……………………………………………………………….. 144

4.3.2. Лиофилизация культур морских углеводородокисляющих

микроорганизмов……………………………………………………………….. 151

4.4. «Тест на ускоренное хранение» лиофилизированных культур морских

углеводородокисляющих микроорганизмов………………………………….. 154

4.5. Количественная оценка деструкции углеводородов чистыми культурами

микроорганизмов после лиофилизации……………………………………….. 163

ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………………….. 166

ВЫВОДЫ………………………………………………………………………… 175

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………. 176

5

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

CFB – филогенетическая группа Cytophaga–Flavobacterium–Bacteriodetes

DAPI – 4',6-diamidino-2-phenylindole

FISH – fluorescence in situ hybridization

РСА – plate count agar

БС – бесклеточный супернатант

ГЖХ – газо-жидкостная хроматография

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

ДМСО – диметилсульфоксид

ДТ – дизельное топливо

ИЭ – индекс эмульгирования

КЖ – культуральная жидкость

КЛ – ресуспендированный осадок клеток

КОЕ – колониеобразующая единица

НД – смесь нефти с дизельным топливом

ОМЧ – общая микробная численность

ОП – оптическая плотность

ПАВ – поверхностно-активное вещество

ПАУ – полиароматические углеводороды

ПГ – показатель гидрофобности

ПН – поверхностное натяжение

ПЦР – полимеразная цепная реакция

РНК – рибонуклеиновая кислота

СОМ – сухое обезжиренное молоко

СЭМ – сканирующая электронная микроскопия

УВ – углеводород

УВО – углеводородокисляющий

6

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Добыча нефти и газа на основных материковых

месторождениях все последнее время неуклонно снижается. Вероятность

открытия новых крупных углеводородных месторождений на континенте

снизилась уже к началу 70-х годов (Лесихина и др., 2007). Прогнозируемое в

настоящее время истощение углеводородных запасов месторождений нефти

ведет к их поиску в таких местах нефтеразведки, как Северный Ледовитый

океан с его окраинными морями и области арктического шельфа, где

предположительно располагается около 25% находящихся на земле нефтяных и

газовых месторождений. Освоению новых нефтегазовых ресурсов на данной

территории способствует и глобальное потепление, приводящее к тому, что

арктические льды постепенно отступают, расширяя возможности для

разработки и эксплуатации нефтедобывающих промышленных объектов

(Climate Change…, 2003; Sommerkorn, Hass, 2009). Зона арктического шельфа

России является источником колоссальных нефтегазовых ресурсов, освоение

которых уже началось. В связи с этим возросла вероятность нефтяных

разливов, способных нанести непоправимый ущерб хрупкой природе Арктики.

Не считая крупных аварий, приводящих к значительным разливам, на всех

этапах добычи и транспортировки неизбежно возникают локальные разливы

нефти и нефтепродуктов, наносящие ущерб окружающий среде и ставящие под

угрозу исчезновения уникальные экосистемы как открытых пространств

северных акваторий, так и прибрежных зон. Для сохранения природного

потенциала арктического региона и поддержания стабильности северных

экосистем необходима разработка и внедрение новых экологически безопасных

способов борьбы с последствиями возможных нефтяных и топливных разливов.

В северных районах, где теплый период года непродолжителен, процессы

биодеградации, в которых участвуют аборигенные углеводородокисляющие

(УВО) микроорганизмы, не успевают развернуться в полной мере (Хмурчик,

Максимович, 2006). Поэтому при появлении там аварийных нефтяных разливов

7

потенциала самоочищения экосистемы недостаточно для их эффективной

утилизации. В настоящее время в мировой практике успешно применяют

биопрепараты на основе микроорганизмов, утилизирующих УВ. Биопрепараты

используют на конечной стадии ликвидации разливов, после механического

сбора и применения сорбентов (в ряде случаев – химических эмульгаторов).

Однако биопрепараты с заявленным широким диапазоном «рабочих»

температур, имеют существенный недостаток - медленную скорость

утилизации углеводородных загрязнений при низких температурах и, как

следствие, малую эффективность. Микроорганизмы в составе таких продуктов

не приспособлены к деградации нефти в условиях Арктики, о чем сообщается в

обзорах и отчетах, посвященных существующим биопрепаратам (Аушева, 2005;

Аушева и др., 2007; Нечаева и др., 2006). При внесении в загрязненную

экосистему ассоциации штаммов, способных разрушать нефть и

нефтепродукты, но не свойственных экологическому сообществу данного

местообитания, местная микробиота создает им серьезную конкуренцию, что

приводит к замедлению процессов жизнедеятельности вносимой ассоциации,

вплоть до ее гибели, т.е. происходит вытеснение местным, более сильным

сообществом, адаптированным к данным источникам субстратов и

геохимическим условиям (Власов и др., 1999). Таким образом, приоритетным в

данном контексте становится поиск морских психрофильных и психроактивных

микроорганизмов, обладающих высоким деструктивным потенциалом в

отношении УВ нефти в условиях низких температур, перспективных для

включения в состав биопрепарата для очистки акваторий северных морей от

возможных нефтяных загрязнений. В условиях природного микробиоценоза

наблюдается одновременная ассимиляция разных фракций нефти различными

группами микроорганизмов, при этом зачастую наиболее активными при

интродукции являются культуры, выделенные из мест нефтезагрязнения

(Белоусова, Шкидченко, 2004). Поэтому применение микроорганизмов,

изолированных непосредственно из загрязненных нефтью и нефтепродуктами

объектов Крайнего Севера, наиболее целесообразно, поскольку они обладают

8

специфичностью ферментных систем к биодеструкции УВ, адаптированы к

факторам окружающей среды, не являются генетически модифицированными

организмами и не оказывают токсичного действия на флору и фауну.

В настоящее время работы, посвященные исследованиям психрофильных

и психроактивных микроорганизмов-деструкторов нефтяных загрязнений,

выделенных из арктических регионов, единичны. Комплексные исследования

морских микроорганизмов различных систематических групп, касающиеся не

только изучения их функциональной активности в отношении УВ нефти, но и

вопросов подбора эффективных способов и условий их длительного

сохранения, оценки их выживаемости в процессе хранения, сохранения

биологической активности и способности к деградации УВ в условиях низких

(положительных) температур после хранения особенно актуальны.

Цель диссертационной работы - выделение и оценка

биотехнологического потенциала микроорганизмов, способных к деструкции

УВ нефти в условиях низких температур и умеренной солености, как

перспективных компонентов основы биопрепарата для биоремедиации

нефтезагрязненной морской среды в климатических условиях северных

регионов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие

задачи:

1. Провести выделение и скрининг УВО микробных сообществ и чистых

культур микроорганизмов из образцов нефтезагрязенного материала северных

регионов;

2. Провести оценку УВО и биоэмульгирующей активности выделенных

микробных сообществ и чистых культур микроорганизмов;

3. Провести подбор методов долговременного хранения отобранных

микроорганизмов и сравнительную оценку их жизнеспособности после

процессов консервации и хранения.

Научная новизна работы. Разработан новый способ выделения чистых

культур микроорганизмов, активных в отношении УВ, по показателю

9

осветлений на целлюлозных фильтрах с УВ нефти, апплицированных на

поверхность колоний микроорганизмов на плотной питательной среде.

Появление зон осветления является свидетельством проявления их

биоэмульгирующей и УВО активности.

С помощью разработанного метода впервые из состава природных

микробных сообществ макрофитов Белого моря выделен психроактивный вид

УВО микроорганизмов Nocardia coeliaca, а из сообществ Баренцева моря –

виды-нефтедеструкторы Arthrobacter rhombi, Salinibacterium amurskyense,

Shewanella vesiculosa.

В лабораторных экспериментах выявлен высокий окислительный

потенциал (до 60%) и биоэмульгирующая активность (до 50%)

индивидуальных штаммов морских микроорганизмов в условиях низких

температур и солености 30 г/л NaCl. Показана способность выделенных

микроорганизмов к использованию широкого спектра УВ при 4°С (в том числе

ароматических и полиароматических соединений, нефтепродуктов) и

образованию внеклеточных и внутриклеточных поверхностно-активных

веществ.

В рамках комплексного подхода к разработке биопрепаратов для

ремедиации нефтезагрязнённых акваторий определены условия длительного

сохранения морских микроорганизмов-деструкторов и выявлена их высокая

жизнеспособность после хранения. Показано, что для успешного

прогнозирования сроков хранения некоторых грамотрицательных

психроактивных микроорганизмов методом ускоренного хранения следует

использовать более низкие температуры хранения, чем для мезофильных

представителей.

Теоретическая и практическая значимость работы. Данная работа

расширяет представление о разнообразии представителей морского

бактериопланктона и эпифитона Белого (Кандалакшский залив) и Баренцева

(Кольский залив) морей. Разработанный оригинальный метод выделения

микроорганизмов, активных в отношении УВ, может быть использован

10

другими исследователями при выделении микроорганизмов в широком

температурном диапазоне. Показано, что бактериальные штаммы,

изолированные из нефтезагрязненных проб биоматериала арктического шельфа

не менее активны в процессе деструкции УВ нефти по сравнению с дрожжами

Каспийского моря, что еще раз доказывает необходимость поиска и селекции

активных нефтедеструкторов в регионах их предполагаемого применения для

биоремедиации загрязненных экосистем. Проведенные исследования

позволяют рекомендовать выделенные микроорганизмы для создания

препарата для биоремедиации нефтяных загрязнений в условиях Крайнего

Севера.

Подобраны условия хранения морских микроорганизмов,

обеспечивающие высокую численность и деградативную активность клеток.

Для длительного сохранения коллекций психроактивных микроорганизмов

предпочтительнее использовать метод криоконсервирования, обеспечивающий

выживаемость клеток до 90%. В перспективе получения товарной формы

биопрепарата более подходящим способом сохранения биомассы является

лиофильное высушивание в присутствии 10% сухого обезжиренного молока

(СОМ) и 7,5% сахарозы.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы представлены

и обсуждены на VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия

взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов,

2012); VIII молодежной школе-конференции с международным участием

«Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2012); XX

Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых

ученых «Ломоносов-2013» (Москва, 2013); Международной конференции

«Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред» (Москва,

2013); 6-й Всероссийской научно-практической конференции с международным

участием «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2013);

XII научной конференции "Морская биология, геология, океанология -

междисциплинарные исследования на морских стационарах", посвященной 75-

11

летию Беломорской биологической станции им. Н.А. Перцова (Москва, 2013);

XXI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых

ученых «Ломоносов-2014» (Москва, 2014); 5-м Всероссийском симпозиуме с

международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2015);

XXII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых

ученых «Ломоносов-2015» (Москва, 2015); XXIII Международной конференции

студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2016» (Москва, 2016).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 научных

работ, из них 3 статьи в изданиях из Перечня ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав,

заключения, выводов и списка литературы, включающего 372 наименования.

Работа изложена на 218 страницах, содержит 30 рисунков и 20 таблиц.

ГЛАВА 1. ОСВОЕНИЕ НЕФТЕГАЗОВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ

АРКТИКИ И ЕГО ВОЗДЕЙСТВИЕ НА ЭКОСИСТЕМЫ СЕВЕРНЫХ

МОРЕЙ

1.1. Арктическая зона Российской Федерации

В международно-правовой доктрине под Арктикой традиционно

понимается часть земного шара, центром которой является Северный

географический полюс, а окраинной границей – Северный полярный круг

(66°33’ северной широты). При этом в мировом сообществе отсутствуют

международные соглашения, закрепляющие единое общепризнанное понятие

«Арктика», и на международном уровне правовой статус арктического

пространства прямо не регламентирован. Согласно проекту «Основы

государственной политики Российской Федерации в Арктике на период до 2020

года и дальнейшую перспективу» Арктика – северная область Земли,

включающая глубоководный Арктический бассейн, мелководные окраинные

моря с островами и прилегающими частями материковой суши Европы, Азии и

Северной Америки (Основы государственной политики..., 2009). Границы

Арктической зоны Российской Федерации и других арктических стран

12

продолжают постоянно уточняться в соответствии с нормами международных

договоров и соглашений, национальными законодательствами арктических

государств, а также с нормативно-правовыми актами стран-участниц в сфере

регулирования развития арктических территорий (Ивантер и др., 2014).

Согласно Основам государственной политики РФ в Арктике «Арктическая зона

Российской Федерации (АЗРФ) – сухопутные территории Арктической зоны

Российской Федерации и прилегающие к этим территориям, землям и островам

внутренние морские воды, территориальное море, исключительная

экономическая зона и континентальный шельф Российской Федерации, в

пределах которых Россия обладает суверенными правами и юрисдикцией в

соответствии с международным правом» (Основы государственной

политики…, 2009).

В соответствии с указом Президента РФ № 296 «О сухопутных

территориях Арктической зоны Российской Федерации» от 2.05.2014 г. был

определен состав сухопутных территорий, входящих в Арктическую зону РФ

(рис. 1). К арктическим морям России относятся Баренцево, Белое, Карское,

Лаптевых, Восточно-Сибирское, Чукотское моря.

Таким образом, Арктика - отдельный макрорегион из разных частей,

объединенных общими природно-географическими и социально-

экономическими особенностями: прямым выходом к Северному Ледовитому

океану, крупными запасами полезных ископаемых и углеводородных ресурсов,

суровыми климатическими условиями и т.д.

13

Рисунок 1. Состав Арктической зоны РФ.

1.1.1. Ресурсы нефти, природного газа и конденсата арктического

шельфа России

Площадь арктического шельфа и континентального склона России

составляет 6,2 млн. км2, что соответствует 21% площади шельфа Мирового

океана (Еремин и др., 2010). При этом моря арктического континентального

шельфа содержат в своих недрах основную (почти 80%) долю начальных

суммарных ресурсов УВ всего российского шельфа (Селин и др., 2008).

Арктическая зона является чрезвычайно богатым минерально-сырьевыми

ресурсами регионом. Начальные геологические ресурсы УВ на шельфе России

составляют 136 млрд. т.у.т., а начальные извлекаемые ресурсы УВ достигают

100 млрд. т.у.т., в т.ч. 13 млрд. т. нефти и 87 трлн. м3 газа, что соответствует 22–

27% от общего объема ресурсов УВ шельфовых зон Мирового океана (Еремин

и др., 2010; Освоение ресурсного потенциала …, 2013). В связи с этим, по мере

полностью Мурманскую область, Ненецкий, Ямало-

Ненецкий и Чукотский автономные округа;

частично Архангельскую область (в составе Мезенского,

Онежского, и Приморского районов), а также муниципальные

образования г. Архангельск, Северодвинск и Новодвинск;

Республику Коми (в составе муниципального образования

городского округа Воркута);

Красноярский край (в составе городского округа г. Норильск,

Туруханского муниципального района);

Республику Саха (Якутия) (в составе Аллаиховского,

Анабарского национального (Долгано-Эвенкийского),

Булунского, Нижнеколымского и Усть-Янского);

а также земли и острова, расположенные в Северном

Ледовитом океане.

АРКТИЧЕСКАЯ ЗОНА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ включает

включает:

14

истощения мировых запасов природного газа и нефти, легкодоступных для

разработки, арктические регионы, несмотря на суровый климат и трудности

освоения, становятся все более перспективными источниками газа и нефти

(Еремин и др., 2010).

Самыми ресурсоемкими являются акватории Карского, Печорского и

Баренцева морей (западный арктический шельф), в пределах которых

сосредоточено более половины (около 62,7%) суммарных геологических

ресурсов акваторий России (Дмитриевский, Белонин, 2004; Григоренко и др.,

2007).

1.1.2. Разведанность Арктического шельфа России

Арктический шельф России исследован весьма неравномерно.

Изученность шельфа варьируется от практически неизученных акваторий до

областей, характеризующихся сравнительно высокой изученностью. По

оценкам экспертов разведанность начальных суммарных ресурсов УВ

западного арктического шельфа не превышает 21% ресурсной составляющей

(Селин и др., 2008; Энергетическая стратегия России…, 2003), подтверждены

только 6% начальных суммарных запасов шельфовой нефти и 11% начальных

суммарных запасов газа (Додин и др., 2007). При этом изученность российского

арктического шельфа значительно уступает изученности соседних шельфовых

зон Норвегии и США.

На сегодняшний день степень разведанности арктического

континентального шельфа Российской Федерации остается крайне низкой:

Баренцево море – 20%, Карское – 15%, Восточно-Сибирское, море Лаптевых и

Чукотское море – меньше 1% (Паничкин, Павленко, 2012). Изученность

акваторий Восточной Арктики до сих пор фактически находится на

рекогносцировочной стадии; здесь никогда не ставились сейсморазведочные

работы поисковой детальности и не имеется ни единой буровой скважины

(Каминский и др., 2008). Учитывая слабую разведанность Печорского,

Баренцева и Карского морей и абсолютную неразведанность ресурсов морей

15

восточной части Арктики, можно со значительной долей вероятности

предполагать открытие новых месторождений УВ на арктическом шельфе

России (Додин и др., 2007).

Шельфовые бассейны более восточных морей, хотя и привлекательны в

отношении нефтеносности, явно проигрывают Баренцеву и Карскому морям по

ресурсной насыщенности недр (Григоренко и др., 2012, рис. 2).

- Запад Баренцева моря; - Восток Баренцева моря;

- Юг Карского моря; - Sverdrup (Норвегия);

- Северный склон Аляски; - Море Бофорта устье р. Макензи

Рисунок 2. Распределение запасов нефти и газа (%) на шельфе Арктики

(Богоявленский, Богоявленский, 2011).

Прогнозная оценка ресурсов моря Лаптевых находится в диапазоне от 3,2

до 8,7 млрд. т. нефтяного эквивалента. Ресурсы Восточно-Сибирского моря

равны примерно 5,58 млрд. т. нефтяного эквивалента. Южные области

Восточно-Сибирского и Чукотского морей (их глубины также не превышают 20

м), относимые к Новосибирско-Чукотской перспективной нефтегазоносной

провинции, считаются малоперспективными. Ресурсы Чукотского моря не

превышают 3,3 млрд. т. нефтяного эквивалента (Кравец, 2013).

В связи с этим Российской Федерацией планируется интенсивное

освоение и эксплуатация новых месторождений нефти и газа Арктического

16

шельфа, что с высокой вероятностью приведет к возрастающему поступлению

нефти, продуктов ее переработки, а также продуктов факельного сжигания

попутного газа в экосистемы и последующему токсическому воздействию их на

все звенья пищевой цепи (Арктика на пороге.., 2000). Все более активное

освоение нефтяных месторождений существенно увеличит объемы

попадающих в моря нефтяных УВ. Однако известно, что полярные регионы

являются наиболее чувствительными как к загрязнению окружающей среды,

так и к происходящим климатическим изменениям, независимо от причин их

возникновения (Арктика на пороге…, 2000). Даже незначительная утечка

добываемых УВ, особенно на шельфе, приведет к непоправимому

экологическому ущербу. Нет адекватного понимания серьезности последствий

использования УВ в плане загрязнения атмосферы с неизбежным потеплением

климата, а также нарушением экологической устойчивости экосистем в связи с

разработкой месторождений и мощным антропогенным воздействием на них

(Порох, Решетникова, 2012). Поэтому требуются новые технологии добычи и

транспортировки, гарантирующие сохранение окружающей среды Заполярья.

Для разработки способов борьбы с углеводородным загрязнением

Арктики необходимо провести анализ потенциальных источников поступления,

путей миграции загрязняющих веществ, их физико-химических и механических

свойств, глубину проникновения, пути трансформации и накопления. При

таком подходе представляется возможным получить достаточно объективное

представление о нефти как о токсическом факторе в морской среде, а также о

реальных и потенциально возможных биологических последствиях нефтяного

загрязнения арктических морей России.

1.2. Источники углеводородного загрязнения в Арктике

По совокупности показателей токсичности и масштабам вовлечения в

хозяйственную деятельность нефть является одним из наиболее существенных

факторов экологического риска для биоты вообще, а арктической особенно — в

17

силу особой уязвимости природной среды к техногенному и антропогенному

загрязнению.

По характеру возникновения углеводородные загрязнения подразделяют

на естественные и антропогенные. К настоящему времени вклад естественных

источников нефтяных УВ в загрязнение арктических морей изучен достаточно

слабо и носит фрагментарный характер. Основными природными источниками

нефтяного загрязнения морской среды является выход нефти, метана,

газогидратов из осадочной толщи на дне моря, а менее значительными

источниками – эрозионные процессы. Основным источником метана в

атмосферу Арктического региона являются моря Восточной Арктики - море

Лаптевых, Восточно-Сибирское море и Чукотское море (Шахова, Семилетов,

2014). Потепление Арктического региона происходит в два раза интенсивнее

остальной части планеты (IPCC, 2001), в связи с чем прогнозируется активная

эмиссия метана из мелководного шельфа морей Восточной Арктики и

болотного метана. На сегодняшний день вклад метана из шельфа Северного

Ледовитого океана в парниковый эффект оценивается в 30–40% от вклада

двуокиси углерода. Кроме того, УВ являются компонентами липидной фракции

фито- и зоопланктона, бентоса, микроорганизмов, ихтиофауны, а также

содержатся в воде, взвеси и донных осадках (Romankevich, 1984; Немировская,

2004), в связи с чем определение антропогенных УВ в морских средах

необходимо проводить на существующем биогенном фоне. Фоновые уровни

содержания нефтяных УВ в морской среде изменяются в очень широких

пределах: 10-5

– 10 мг/л в воде и 10-1

– 104 мг/кг в донных осадках, в

зависимости от многих природных и техногенных факторов (Бескдид,

Дурягина, 2010). Максимальные концентрации обнаруживаются в прибрежных

и внутренних морских водах, зонах интенсивного судоходства и иной

хозяйственной деятельности, а также в районах выхода (просачивания) УВ из

месторождений на шельфе. К важнейшим антропогенным источникам

нефтяного загрязнения относятся:

18

• морские – морской транспорт, военные корабли, суда различного

назначения, трубопроводы, установки и устройства, используемые при

разработке ресурсов морского дна и его недр; дампинг отходов,

транспортировка нефтепродуктов и токсичных веществ, разработка морских

месторождений, перенос УВ системой глобальных океанских течений;

• наземные – реки, озера и другие водные системы, куда загрязняющие

вещества попадают с грунтовыми водами, а также в результате сброса сточных

вод с различных береговых объектов; речной сток, эоловый снос, волновая

абразия, ледниковый, ледовый и айсберговый разносы;

• атмосферные – различные промышленные предприятия, транспортные

средства и другие объекты, откуда могут происходить выбросы в атмосферу

углеводородных соединений (Бескдид, Дурягина, 2010; Диагностический

анализ…, 2011).

По данным NAS количество антропогенных УВ, поступающих в морские

воды, составляет около 1,3 млн. т. в год, (таблица 1, NAS, 2003).

Таблица 1. Источники и объемы поступления нефти в морскую среду (NAS,

2003).

Источники поступления

Наиболее вероятный

средний объем

поступления,

тыс. т/год

Доля

среднего

годового

объема, %

Поступление нефти с морского

дна (сипы)

600 (200-2000)* 46

Добыча нефти в море:

-платформы (бурение, аварии,

утечки)

-атмосферные выбросы и

выпадения

-сброс пластовых вод

38 (20-62)*

0,9

1,3

36

5

Транспортировка нефти:

-аварии танкеров

-штатные танкерные операции

150 (120-260)*

100

36

12

19

-аварии на трубопроводах

-аварии на береговых

терминалах

-атмосферные выбросы и

выпадения

12

4,9

0,4

Потребление нефти:

-береговые источники (речной

сток и др.)

-аварии судов (не танкеров)

-штатные операции и сбросы с

судов (более 100

регистрационных тонн)

-атмосферные выбросы и

выпадения

-выбросы авиационного

топлива

480 (130-6000)*

140

7,1

270

52

7,5

37

Всего 1300 (470-8300)* 100

* В скобках указан разброс известных оценок.

Таким образом, в результате антропогенного воздействия основное

количество нефти поступает в океан: 1) вместе с речными и промышленными

стоками; 2) во время аварий транспортных средств; 3) за счет слива за борт

танкерами и судами балластных эмульсий нефтепродуктов с водой. На сбросы

промывочных вод с судов приходится до 50% всех поступлений нефти в

морскую среду (Диагностический анализ…, 2011).

Ведущая роль речного стока в качестве источника загрязнений более

выражена в морях восточного сектора Арктики вследствие обширности

водосборных территорий и объема годового стока. В западном секторе Арктики

(Баренцево, Белое и, отчасти, Карское моря) основным источником нефтяного

загрязнения являются промышленные, городские и другие стоки с

индустриально развитых прибрежных территорий Западной Арктики (Проект

ЮНЕП/ГЭФ, 2012). Исходя из других литературных данных, для заливов

Баренцева и Белого морей (в частности, Кольского, Кандалакшского,

Онежского, Двинского, Мензенского и Печорского заливов) основными

20

источниками углеводородных загрязнений являются водный

трансокеанический и воздушный трансграничный переносы поллютантов

(Матишов и др., 2001). Так, вместе с водными массами Гольфстрима мигрирует

до 1–1,5 млн. тонн нефтепродуктов в год (Симонов и др., 1974). Насыщение

морских течений Гольфстрима загрязняющими веществами, и в частности

нефтепродуктами, происходит у берегов Северной Америки, Западной Европы

и Азии. «Разгрузка» морских течений происходит в Арктическом регионе,

выступающем в большей степени реципиентом трансграничного загрязнения

(Кутинов, Чистова, 2014). Крупными источниками загрязняющих веществ,

включаемых в трансграничный перенос, являются объекты Российского

Севера, расположенные на Кольском полуострове, в г. Норильске, в Западной

Сибири. Особенно большую тревогу вызывают районы освоения

месторождений углеводородного сырья в связи с перспективами эксплуатации

Штокмановского газоконденсатного, Приразломного нефтяного и других

месторождений из-за возможности нефтезагрязнения экосистем Баренцева и

Карского морей.

Кроме того, к факторам экологического риска, сопутствующим

процессам поиска и разведки УВ в море, относят: нарушение покрова донных

осадков и сообществ бентосных организмов при внедрении буровых снарядов в

морское дно; воздействие нетоксичных буровых растворов на биоту, в том

числе повышение мутности вод в окрестностях буровых платформ; попадание в

воду УВ как за счет поступления их с промышленных объектов, так и при

аварийных выбросах нефти при вскрытии продуктивных залежей (Матишов и

др., 2001).

1.2.1. Поведение нефти в морской среде

Нефть при попадании в морские воды подвергается действию ряда

факторов, в результате которых претерпевает различные изменения. Среди них

(Garret et al., 1998; Гамзаев, 2009; Бескдид, Дурягина, 2010; Врагова, 2011) -

механическое перемещение (растекание, адвекция), турбулентное

21

перемешивание (диспергирование, диффузия, осаждение), физико-химические

факторы (испарение, фотоокисление, растворение, абсорбция, биодеградация и

т.д.). Общие схемы процессов, происходящих с нефтью при разливах в воде, во

льдах и на льду представлены на рисунках 3, 4. В зависимости от глубины и

скорости трансформации разлившейся нефти, она может находиться в

нескольких формах: пленочной, растворенной, эмульгированной,

адсорбированной (Воробьев, 2006).

На начальной стадии разлива происходит растекание нефти по водной

поверхности. Этот процесс обусловлен действием сил гравитации, сил инерции,

вязкости и поверхностного натяжения (Врагова, 2011). В процессе растекания

происходит изменение свойств нефти вследствие ее испарения и растворения в

воде. При растекании нефть теряет свои летучие и водорастворимые

компоненты (Fritsche, Hofrichter, 1999) - низкомолекулярные алканы (н-алканы

и изоалканы), циклопарафины и некоторые ароматические УВ. Углеводороды

керосиновой (С11-С13), газойловой (С14-С17), соляровой (С18-С25) фракций мало

выветриваются (McGill, 1977). С уменьшением содержания легкой фракции ее

токсичность снижается, но возрастает токсичность ароматических соединений,

относительное содержание которых растет. На спокойной воде испарение

уменьшается в 1,5 раза, а при скорости ветра до 6-8 м/с – увеличивается на 60%

(Бескдид, Дурягина, 2010).

После выветривания легких углеводородных фракций возрастает вязкость

нефти, в связи с чем прекращается ее растекание. Дальнейшее увеличение

размеров пленки определяется турбулентным ветром и течением, т. е.

турбулентной диффузией (Гамзаев, 2009). Волнение поверхностных вод

приводит к диспергированию нефти и образованию стойких, медленно

расслаивающихся эмульсий. Именно благодаря последнему фактору нефтяные

эмульсии переносятся под действием ветра, течений, приливов и отливов

течениями на большие расстояния (трансокеанический перенос), что

способствует их распространению в значительно удаленные от мест

поступления нефти в море районы (Nicodem et al., 1997).

22

Рисунок 3. Совокупность основных процессов, которым подвергается

нефть в водной среде (Бескдид, Дурягина, 2010).

Рисунок 4. Последовательность и продолжительность трансформации

нефти в морской воде (AMAP, 2007; Патин, 2008).

Процесс перемещения нефтяного пятна под влиянием скорости ветра и

течений называется адвекцией. Вместе с тем, в результате действия волн и

23

турбулентного перемешивания нефть может удаляться с водной поверхности и

путем естественной дисперсии - включения нефти в объем водной толщи в

форме капелек. Благодаря этому возрастает площадь поверхности, находящаяся

в контакте с водой, и увеличивается скорость испарения и растворения нефти.

В результате интенсивной волновой активности происходит образование

эмульсий двух типов: «нефть в воде», в которой нефтяные капли образуют

дисперсную фазу в водной среде, и «вода в нефти» (шоколадный мусс), в

которой капли воды диспергированы в нефти (Cooney, 1984; Бескдид,

Дурягина, 2010). Эмульсии второго типа характерны для смеси воды и вязкой

нефти, при этом в составе они содержат от 30 до 80% воды, могут существовать

более 100 дней, а с понижением температуры их устойчивость только

возрастает (Давыдова, Тагасов, 2004). Обычно эмульгированных компонентов в

2 раза больше растворенных (Воробьев, 2006; Патин, 2008), к которым

относятся, главным образом, низшие ароматические соединения (бензол,

толуол, этилбензол, ксилол и др.), обладающие высокой токсичностью в связи

со способностью к растворению в воде. Максимальное содержание

диспергированной нефти в морской воде наблюдается в первые часы после

разлива, поскольку позже образование эмульсии «вода в нефти» подавляет

диспергирование нефти в воду за счет изменения физических свойств нефтяной

пленки (Арзамасцев, 2007).

С течением времени в попавшей водную среду нефти происходит

увеличение смолистых веществ. Высокомолекулярные компоненты нефти –

смолы и асфальтены разлагаются крайне медленно (Петров, 1984). Оставшаяся

после испарения и воздействия других физико-химических процессов нефть

становится более плотной, чем исходная, и вследствие образования нефтяных

агрегатов легко тонет и опускается на дно, где подвергается биодеградации

(Кураков и др., 2006). Диспергированная нефть также адсорбируется на

взвешенных в воде глинистых, минеральных и других частицах, в результате

чего оседает с более высокой скоростью. При этом значительную роль играет

соленость воды, которая влияет на заряд взвешенных компонентов, вызывая их

24

коагуляцию и более быстрое осаждение, чем в пресной воде (Liu et al., 2002;

Khelifa et al., 2005).

Многие нефтяные компоненты, в частности, полиароматические

углеводороды (ПАУ) интенсивно поглощают УФ-излучение с длиной волны

300–420 нм (Крылов и др., 2010). В результате воздействия солнечного света на

нефтяные пленки происходит окисление молекул ПАУ синглетным кислородом

(Hansen, 1975) – фотоокисление (фотодеградация). Продуктами фотоокисления

являются более полярные вещества: хиноны, карбоновые кислоты, диолы,

фенолы и т.д., которые благодаря относительно высокой их растворимости

переходят в водную фазу (Neff, 2002; Крылов и др., 2010).

В результате упомянутых выше механических и физико-химических

процессов при взаимодействии нефти с морской водой на различных этапах

могут образовываться следующие формы (Ильинский, 1979; Герлах, 1985;

Nicodem et al., 1998):

–молекулярные пленки, цвет которых зависит от их толщины (от 0,3 мкм до 0,3

мм) и объема разлива;

–пленки толщиной до нескольких мм (слики);

–эмульсии типа «вода в нефти» или «нефть в воде»;

–донные отложения, растворенная в воде нефть, нефтяные агрегаты.

Нефтяное пятно, находясь в контакте с берегом, частично осаждается на

его поверхность, впитывается в песок и гальку, проникает на глубину 0,5—1 м

между скальными расщелинами и камнями, откуда ее удаление представляется

весьма затруднительной задачей. Проникновение нефти во влажный песок

происходит медленнее, к тому же, приливно-отливные процессы могут

заносить загрязненный слой чистым песком. Однако обнаружение подобных

загрязнений происходит во время штормов и сезонных перемещений

прибрежного грунта. Хорошо выветренные или тяжелые нефти, смешиваясь с

минеральными и растительными частицами, образуют нефтяные лепешки

(Кураков и др., 2006). Способность береговой полосы к самоочищению, ее

уязвимость к нефтяному загрязнению зависят от морфологии берегов,

25

гранулометрического состава береговых отложений, их геологической

структуры, литологических характеристик береговых отложений (состава,

дисперсности), гидродинамики прибрежной зоны (таблица 2, Патин, 2001).

Подверженность разливам нефти прибрежной среды возрастает с увеличением

пористости нижнего слоя почвы (субстрата) и уменьшением силы волн

(Бондаренко, Базарбеков, 2006). Береговая линия непористого происхождения

(скалы), либо слабой пористости (плотный песчаный грунт, мелкозернистый

песок), подвергающиеся интенсивному воздействию волн, достаточно быстро

очищаются естественным путем. Очистка скалистых пляжей сложна и требует

интенсивной работы. В связи с этим, период сохранения нефти в береговой

зоне может варьировать от нескольких дней на скалах до более чем 10 лет в

укрытых от приливов-отливов и сырых участках (Бондаренко, Базарбеков,

2006).

Разливы, сопровождающиеся контактом нефти с береговой линией,

являются наиболее опасными, поскольку в ней концентрируется множество

биологических ресурсов (места гнездования птиц, стоянки мигрирующих птиц,

районы линьки, лежбища ластоногих млекопитающих, области размножения,

кормления/нагула, отдыха и т.п.).

Таблица 2. Классификация морской береговой линии по степени

уязвимости к нефтяному загрязнению (Патин, 2001).

Способность к

самоочищению

Характеристика и тип

береговой линии

Характеристика процессов

Высокая (тип I) Открытые скалистые и

каменистые берега

За счет волнового и прибойного

смыва нефть удаляется в течение

нескольких недель. Очистки

береговой линии не требуется.

Средняя (тип II) Аккумулятивные берега

с пляжами из мелких и

Нефть аккумулируется на

поверхности мелких песков и в

26

среднезернистых песков верхних слоях более крупных

песков, сохраняется в течение

месяцев и может быть удалена

механическими способами на

мелкопесчаных пляжах.

Низкая (тип III) Абразивные берега с

пляжами из крупного

песка, гравия и гальки

Нефть быстро проникает в

отложения на глубины до 1 м и

может сохраняться годами.

Очень низкая (тип

IV)

Абразионные участки

берега с пляжами,

сложенными валунно-

галечниковым и

гравийным материалом

Существуют условия для

быстрого накопления и

захоронения нефти в течение

нескольких лет. При сильном

загрязнении могут возникать

асфальтовые корки.

Таким образом, поступившая в поверхностные воды нефть вовлекается в

сложную цепь различных по длительности абиотических и биотических

процессов. Эти процессы зависят от климатических и погодных условий места

разлива нефти, турбулентно-циркуляционных параметров морской среды,

гидрологических особенностей водоема, состава и свойств нефти, ее количества

в водной среде.

1.2.2. Поведение нефти на льду

Важной особенностью арктических морей, определяющей поведение

нефти во время разлива, является наличие снежно-ледового покрова,

сохраняющегося на протяжении большей части года. Присутствие льда и

низкие температуры приводят к снижению скорости распространения и

перемещения разлитой нефти вследствие увеличения ее вязкости и плотности.

При этом происходит замедление процессов выветривания (испарения),

диспергирования, эмульгирования и фотоокисления нефти.

27

При разливах нефти возможны два варианты ее распространения: подо

льдом и на поверхности льда. Характер и скорость распространения нефтяного

пятна при этом во многом зависят от структуры и сплоченности льда (рис. 5)

(Emerson, 1994; ASCE Task Committee…, 1996). Неровная поверхность верхней

и нижней границ льда, его рыхлость, наличие различных видов деформации

(напластование, образование ледяных валунов и торосов) значительно

увеличивают площадь его поверхности и сорбционную емкость (Поттер и др.,

2013). Вследствие этого даже крупные разливы нефти распространяются

достаточно медленно и локализуются на относительно небольшом расстоянии

от источника разлива. Нефть в арктических условиях может длительное время

сохраняться во льду за счет ее абсорбции снежным покровом на поверхности

льда и накопления (инкапсуляции) в пористых наслоениях, каналах и пустотах

ледового покрова, ограничивающих подвижность нефтяного пятна и скорость

его дрейфа (Пархоменко, 2014). Слой нефти во льду в процессе его намерзания

оказывается в толще, где может находиться до полного таяния льда.

Рисунок 5. Схема взаимодействия нефти и снежно-ледового покрова

(Emerson, 1994).

28

Поведение нефтяного разлива в различные сезоны определяется

особенностями ледового покрытия, для которого характерны периоды

замерзания, разлома, торошения, дрейфа льда. В разломанном льду нефтяные

разливы, будучи сконцентрированными в больших толщинах,

распространяются гораздо медленнее, чем в открытой воде. При этом дрейф

льдин происходит вместе с дрейфом разлитой нефти со скоростью,

составляющей небольшой процент от скорости ветра (Пархоменко, 2014), либо

нефть перемещается относительно льда под влиянием течений. В весенний

сезон происходит сокращение ледяного покрова, в связи с чем возрастает

скорость распространения нефти вплоть до уровня ее распространения в

условиях открытой воды. При повышении температуры льда начинается

просачивание солевого раствора, заключенного между кристаллами морского

льда, в результате чего образуются вертикальные каналы, по которым нефть

впоследствии поднимается на поверхность (Поттер и др., 2013). В результате

образования подобных структур происходит увеличение пористости льда и

миграции нефти из нижних слоев к поверхности льда. Под действием

солнечных лучей нефть нагревается, в результате чего снова переходит в

жидкое состояние и подвергается процессам эмульгирования, испарения и

дисперсии.

При наличии припайного льда нефтяные разливы не достигают берегов в

течение длительного периода, что важно для прибрежной зоны, поскольку в

ней сосредоточено больше биологических ресурсов по сравнению с районами

открытого моря. Благодаря береговому припаю в арктических условиях

появляется возможность организации эффективных мер по ликвидации

аварийных разливов в более долговременные сроки, чем в теплых регионах.

1.3. Влияние нефти и нефтепродуктов на состояние экосистем

северных морей

Негативные влияния нефтезагрязнений на компоненты биологического

разнообразия в северных регионах чрезвычайно тревожны. При попадании в

29

морские среды нефть может переноситься течениями и ветром на значительные

расстояния от места разлива, проникать в толщу воды, накапливаться в донных

осадках, тем самым оказывая влияние на все группы организмов, обитающих

как в поверхностном слое, так и в толще воды и грунте (Черкашин, 2005;

Кураков и др., 2006).

В первую очередь углеводородные загрязнения оказывают воздействие на

планктонные организмы (фитопланктон, зоопланктон, простейших),

обитающих в верхних слоях воды. Выделяются зоны наибольшей и

наименьшей плотности планктона. Арктические и антарктические широты (от

75° и выше) из-за низких температур и длинной полярной ночи бедны

планктоном (Гембель, 1979). Так, численность фитопланктона в зимний период

в морских водах подо льдом составляет от 5 до 20 кл/л (Kawamura, 1967).

Обедненность Арктических вод планктонными организмами можно объяснить

низкой освещенностью покрытых льдом вод, малой глубиной проникновения

света, отсутствием прогрева поверхностных вод, и малой мощностью

эвфотического слоя (Зенкевич, 1947).

Микробиота. Микроорганизмы быстро реагируют на нефтяное

загрязнение, что проявляется в изменении их численности и таксономического

состава. Одни из них являются чувствительными к воздействию нефти, в то

время как другие могут принимать участие в разрушении УВ. В связи с этим

при загрязнении биотопа нефтью или нефтепродуктами происходит

постепенная смена доминантов микробного сообщества. Легкие фракции нефти

частично ингибируют гетеротрофные микроорганизмы, но при этом они

выступают как субстрат для УВО микроорганизмов. Более тяжелые фракции не

токсичны для микроорганизмов, но и активно не метаболизируются ими. При

этом модификация видовой структуры и характера функционирования

микробных сообществ может стать причиной разрушения всей экосистемы как

в водной, так и в наземной среде.

При попадании нефти в почву изменяется соотношение между

отдельными группами микроорганизмов, меняется направление метаболизма,

30

угнетаются процессы азотфиксации, нитрификации, разрушения целлюлозы,

происходит накапливание трудноокисляемых продуктов, уменьшается

количество корневых выделений и органических остатков растений. Нефть

заполняет поровое пространство, вытесняет почвенный воздух, то есть резко

изменяет аэрацию почв. Образование битуминозной корки еще более ухудшает

ее водно-воздушный режим. Происходит склеивание структурных

отдельностей, заметно увеличивается вязкость и плотность почвенной массы

(Мурзаков, 2005). Так, подавляется дыхательная активность и микробное

самоочищение вследствие потери почвой ее естественных свойств: разрушается

ее структура, способность к проникновению кислорода и воды, изменяется

реакция среды, возникает анаэробиоз, замедляются темпы биогеохимических

процессов (Зайцева и др., 2010). Понижение концентрации кислорода

способствует развитию анаэробных микроорганизмов. Развитие аэробной

микробиоты, в частности, грибов, затормаживается (Шамраев, Шорина, 2009).

Головченко А.В. и Полянской Л.М. было изучено влияние нефти на

таксономический состав микробных сообществ почв, подвергшихся

загрязнению (Головченко, Полянская, 2001). Авторами было отмечено

несколько тенденций в этом аспекте:

1) увеличение спектра представителей узкоспециализированных групп

микроорганизмов, окисляющих газообразные УВ, твердые парафины,

ароматические УВ. Среди бактерий это представители родов Arthrobacter,

Bacillus, Brevibacterium, Nocardia, Pseudomonas, Rhodococcus; среди

аспорогенных дрожжей – Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces,

Torulopsis;

2) обеднение секционного состава актиномицетов;

3) сокращение видового богатства микроскопических грибов и появление

новых (отличных от контрольных) видов в образцах, загрязненных нефтью;

4) перераспределение членов амилолитического сообщества по степени

доминирования и обнаружение в этом сообществе видов, обладающих

повышенной устойчивостью к данному ксенобиотику.

31

При УВ загрязнении водной среды преимущество над остальными

группами микроорганизмов получают углеводородокисляющие.

Экспериментальные работы показали, что при низких концентрациях нефтяных

УВ в морской воде (С<20 мкг/л) корреляционная связь между численностью

УВО бактерий и общим содержанием нефти в морской воде не выполняется, а

при высоких (С>20мкг/л) такая связь прослеживается достаточно отчетливо. В

первом случае микроорганизмы отдают предпочтение присутствующим в

морской воде более доступным органическим веществам, а во втором они

начинают использовать для своего роста и развития нефтяные УВ (Бутаев,

Кабыш, 2002).

Разнообразие УВО микроорганизмов в морской среде, их численность,

физиолого-биохимические особенности, а также механизмы окисления УВ

рассмотрены далее.

Фитопланктон. Ледовые водоросли и фитопланктон – важнейший

компонент экосистемы и первичное звено пищевой цепи арктической

пелагиали (Христенко, 1983; Кособокова, 2010). Фитопланктонные организмы

обитают в фотическом слое, глубина которого в высоких широтах составляет

лишь 20 м (Гембель, 1979). Ввиду того, что снежно-ледовый покров

сохраняется в Арктике на протяжении достаточно долгого времени,

вегетационный период планктонных организмов в более южных районах,

покрытых сезонными льдами, может составлять до 6-7 месяцев, а в районах с

многолетними ледовыми покрытиями, всего 2-3 месяца (Bogorov, 1960; Herman,

1989). Из-за короткого вегетационного сезона и наличия ледового покрова

центральный Арктический бассейн является районом с исключительно низкой

первичной продукцией (Кособокова, 2010). Развитие ледовых водорослей и

фитопланктона находится в прямой зависимости от количества поступающего

света и условий снабжения их питательными веществами, поэтому в полярных

районах оно имеет выраженный сезонный характер (Кособокова, 2010).

Обычно в течение года имеется два характерных для Арктики периода подъема

размножения диатомовых - весенний и осенний, - при этом для последнего

32

подъем выражен значительно слабее, чем для первого (Буткевич, 1958).

Действие УВ на фитопланктон неоднозначно и зависит от их концентрации в

воде, их свойств, поведения, чувствительности отдельных видов

фитопланктонных организмов к УВ, времени их воздействия на живые

организмы. Так, диатомеи Ditylum brighwelli, Coscinodiscus granii и Chactoceros

curvesetus погибают в течение 24 часов при концентрации керосина и жидкого

топлива 0,1% и менее, в то время как Melosira moniliformis и Grammatophora

marina выдерживают концентрацию до 1% (Миронов, 1970). Покрывая

тончайшей пленкой огромные участки водной поверхности, нефть нарушает

кислородный, углекислотный и другие виды газового обмена в поверхностных

слоях воды, пагубно воздействуя на флору и фауну (Бескдид, Дурягина, 2010).

Она уменьшает проникновение света, препятствует фотосинтезу, уменьшает

теплопроводность и теплоемкость. Вследствие уменьшения фотосинтеза

снижается и скорость деления фитопланктонных микроорганизмов. Все

морские животные прямо или косвенно зависят от фитопланктона, поэтому

гибель фитопланктона вследствие углеводородного загрязнения ведет к гибели

других организмов пищевой цепи, а также к сокращению кислорода на планете

(Гембель, 1979).

Зоопланктон. Как отмечает Кособокова К.Н., для Арктической

поверхностной водной массы, в пределах которой наблюдаются самые низкие

температуры и пониженная резко меняющаяся соленость, характерно самое

низкое число видов, не более 25-30 (Кособокова, 2010). Согласно ее данным, с

глубиной число видов растет, и достигает 65-75 видов в слое 500-2000 м, а еще

глубже их количество вновь снижается до менее 50 видов. Вместе с тем, еще в

ранних работах сообщается, что плотность как макро-, так и микропланктона

обильнее в холодных высокоширотных морях, чем в теплых тропических

(Зернов, 1934).

Большая часть зоопланктона питается одноклеточными растениями, в

связи с чем зоопланктон так же обитает в верхних слоях воды (Гембель, 1979),

как и фитопланктон, и тоже сильно подвержен влиянию нефтяного загрязнения.

33

Особая опасность для гидробионтов Северных водоемов связана с их низкой

чувствительностью и высокой уязвимостью (Харламова, Новиков, 1997), а

также особенностями воздействия токсикантов в условиях низких температур

(Богдан и др., 2005). Нефть является вязким гидрофобным соединением с

адгезивными свойствами, потому способна налипать на любые поверхности, в

том числе и на поверхность живых организмов (Христенко, 1983), склеивать их

друг с другом. В результате они теряют способность самостоятельно питаться и

передвигаться, что приводит к их быстрой гибели. Действие нефти уменьшает

видовое богатство сообществ гидробионтов, изменяет соотношение видов,

снижает первичную продукцию (Вишневецкий, Вишневецкий, 2009). Наиболее

токсичной для них является водорастворимая фракция нефти, к которой

относятся ароматические УВ (Carls et al., 2002). Среди них опасность

представляют соединения бензольного ряда и полициклические ароматические

соединения (Миронов и др., 1990).

Зоопланктон является связующим звеном между фитопланктоном и

ихтиофауной. Поэтому уничтожение зоопланктона вызывает сокращение

численности рыб и китообразных (Эрхард, Сежен, 1984).

Ихтиопланктон. Пелагическая икра, личинки ряда массовых видов рыб,

личинки донных беспозвоночных особо чувствительны к воздействию

нефтепродуктов. Это выражается в снижении выживаемости икры и личинок,

замедлении роста личинок, уменьшении жизнеспособности, в нарушениях

поведения (Борисов и др., 2001; Carls et al., 2002; Черкашин, 2005). По

литературным данным, икра и личинки погибают в течение нескольких суток

при концентрации УВ в воде в количестве 0,1-0,01 мл/л (Арзамасцев, 2007).

При этом личинки рыб более чувствительны к нефти по сравнению с икрой.

Личинки многих рыб, развивающиеся в приповерхностном слое, должны

соприкоснуться с атмосферным воздухом для заполнения плавательного

пузыря. Но этому препятствует нефть, 1 кг которой способен образовать пленку

площадью до 1 га и погубить свыше 100 млн. личинок рыб (Кураков и др.,

2006).

34

Бентос. В состав донного населения входят три относительно

автономные группировки: бентосные беспозвоночные, фитобентос и донные

ихтиоценозы (Патин, 2008). Существует положительная корреляция между

содержанием нефтяных УВ в пелагических и донных организмах и их

содержанием соответственно в воде и донных осадках. Концентрации ПАУ в

гидробионтах, как минимум, на два-три порядка величин превосходят

соответствующие значения для водной среды (Проект ЮНЕП/ГЭФ, 2012). В

водной среде создаются благоприятные условия для аккумуляции

загрязняющих веществ, особенно ПАУ, в тканях гидробионтов (Шахматова,

2012) с повышенным содержанием липидов - мозге, печени, пищеварительных

железах и гонадах (Ларин, 2007). Бентосные беспозвоночные (особенно

двустворчатые моллюски) в силу менее развитых по сравнению с рыбами

ферментных и метаболических систем, а также за счет высокой

фильтрационной активности и обитания на дне обладают, как правило,

повышенной способностью к накоплению нефтяных соединений (Ларин, 2007).

Воробьевым Д.С. сообщается, что накопление УВ мидиями зависит от ряда

факторов: степени их исходного загрязнения УВ нефти; физиологического

состояния, связанного с отсутствием (недостатком) питательных веществ;

химического спектра УВ в нефтях и нефтепродуктах (Воробьев, 2006). В

экспериментах Лозового Д.В. с природными зооценозами нефть и

нефтепродукты вызывали нарушения газового и фильтрационного процессов у

беспозвоночных гидробионтов, изменение дыхательного и сердечного ритмов,

поведенческих реакций (Лозовой, 2012). Однако нефть не является

специфическим токсикантом, поражающим какую-либо одну систему, а

вызывает несогласованные изменения в содержании белка, свободных

нуклеотидов и нуклеиновых кислот (Дивавин, Ерохин, 1978).

Нефтезагрязненные грунты и донные осадки отличаются скудным

видовым разнообразием при высокой численности и биомассе выносливых к

загрязнению форм, а при сильном хроническом загрязнении наблюдается

угнетение всего сообщества, включая резистентные формы (Виноградов и др.,

35

2002; Воробьев, 2006). Вместе с тем, бентосные организмы более устойчивы к

нефтяному загрязнению по сравнению с планктонными, погибающими при

концентрациях нефти порядка 0,01-0,001 мг/л (Янкявичюс и др., 1992).

Ихтиофауна. Поскольку рыбы, в основном, обитают в толще воды или у

дна, зрелые особи страдают от сильного загрязнения только в лагунах, на

участках приливной зоны или в закрытых водоемах, подвергшихся

катастрофическому загрязнению нефтью. Рыбы нуждаются в интенсивной

циркуляции кислорода, которая обеспечивает жабрам контакт с огромным

объемом воды, необходимым для извлечения достаточного количества

кислорода. Острое отравление большинства видов рыб наступает при

концентрации эмульгированных нефтепродуктов в диапазоне 16-97 мг/л

(Арзамасцев, 2007). Содержащиеся в воде УВ попадают на эпителий жабр,

вызывая обильное выделение слизи (особенно, ароматические УВ), при этом

нарушается водный и солевой обмен организма, дыхание, наблюдается

расстройство нервной системы, замещение печеночной ткани фиброзной,

истощение запасов гликогена, эрозия плавников, замедление роста (Кураков и

др., 2006; Арзамасцев, 2007). Накопление ПАУ в рыбах чаще всего

обнаруживают в их печени и желчи, а также в жабрах, гонадах, жировых

отложениях и тканях (Патин, 2008).

Нефтепродукты (НП) уничтожают нерестилища и кормовую базу рыб,

что вызывает резкое сокращение их численности (Александров, 1988).

Нефтяные комки и агрегаты обнаруживаются в желудках и пищеварительном

тракте морских рыб, беспозвоночных и млекопитающих (Baker et al., 1991).

Кормовой базой многих рыб являются фитопланктон и зообентос, которые

быстро накапливают токсичные продукты, входящие в состав смазочных масел

и сырой нефти. Из пищевого тракта рыбы они быстро проникают в ее жировые

ткани и внутренние органы, оказывая мутагенное и канцерогенное воздействие.

Даже небольшое содержание нефти в морской воде приводит к гибели молоди

трески. Химические вещества, содержащиеся в буровых отходах (водах,

36

сопровождающих поднимающиеся из скважины нефть или газ) оказывают

воздействие на ее репродуктивные органы.

Орнитофауна. Большинство морских птиц являются водоплавающими:

питающимися у морской поверхности, ныряющими, околоводными. Нефть

оказывает внешнее влияние на птиц, прием пищи, загрязнение яиц в гнездах и

изменение среды обитания. Вероятность загрязнения птиц нефтепродуктами

определяется продолжительностью их контакта с морской водой и способом

добывания корма. Так, птицы семейств гагарообразные, веслоногие,

чистиковые и гусеобразные в наибольшей степени взаимодействуют с морской

водой, значительная часть их активности состоит в плавании на поверхности

моря. Плавая, птицы спят или отдыхают, перемещаются в поисках кормных

участков. Общей чертой их поведения является более или менее глубокое

ныряние из положения «плавание на поверхности» при добыче корма, от чего

подгруппа получила название ныряющие (Калинка, 2015). Эта группа

ныряющих птиц очень сильно страдает во время нефтяных разливов: при

контакте оперения морских птиц с поверхностью воды, затянутой пленкой

нефтепродуктов, оно утрачивает свои теплоизоляционные и водозащитные

свойства. Оперение птиц загрязняется нефтью, намокает, и они погибают от

нарушения терморегуляции (переохлаждения), так как их тело уже не

изолировано от водной среды той воздушной подушкой, которую создает

оперение. Помимо этого перья могут слипаться, в результате чего птица не

может взлететь (Гембель, 1979). Птицы заглатывают нефть, когда чистят

клювом перья, пьют, употребляют загрязненную пищу и дышат испарениями.

Виды птиц, главным образом, чайковые и крачки объединены в

подгруппу питающиеся у морской поверхности. Они больше времени проводят

в воздухе, летая над местообитаниями, некоторые ночуют и кормятся на суше и

литорали, поэтому вероятность столкнуться с нефтяным пятном снижается

(Калинка, 2015). Некоторые птицы, например, моевки и глупыши кормятся

обычно в стаях, собирая корм с поверхности моря или в прилегающих слоях.

37

Околоводные птицы, обитающие вдоль береговой линии, только ходят

по литорали, не плавают, таким образом, имеют наименьший контакт с водой.

В районах гнездования, нагула морских и прибрежных птиц и млекопитающих

последствия разливов наиболее губительны (Калинка, 2015). Яйца птиц очень

чувствительны к воздействию нефти. Небольшое количество некоторых типов

нефти может оказаться достаточным для гибели в период инкубации.

Млекопитающие. Морские млекопитающие не менее других животных

страдают при нефтяном загрязнении: при попадании нефтепродуктов внутрь

организма могут быть поражены жизненно важные органы, в особенности

кишечник, печень, почки и легкие (Проект WWF, 2001). Известно, что легкие

фракции УВ (алканы) вызывают наркоз и судороги; ароматические и

нафтеновые – оказывают влияние на кровь и кроветворные органы. Длительное

воздействие нефти является причиной функциональных изменений

центральной нервной системы, поражения печени, щитовидной железы,

слизистых оболочек, нарушений нормального хода эмбриогенеза (Черкашин,

2005; Draft Toxicological …, 2010; Елифанов и др., 2012). В некоторых работах

сообщается о влиянии тяжелых фракций нефти на репродуктивную систему

млекопитающих (Nishimoto et al., 2008, 2009). Загрязнение меха тюленей, белых

медведей и выдр может приводить к переохлаждению организма, и,

следовательно, к гибели животных.

Морские млекопитающие по образу жизни и чувствительности к

нефтяному загрязнению можно разделить на следующие группы (Патин, 1979):

-киты и дельфины – воздействие на кожу из-за ее защитных свойств

минимально. Прямое потребление нефти практически не происходит.

Непрямое, с пищей, может встречаться у косаток и серых китов;

-тюлени и моржи, морские львы и котики – при поверхностном контакте

нарушаются изоляционные свойства меха. Молодые и неполовозрелые особи

подвергаются большему риску. Часто происходит прямое потребление нефти в

пищу, непрямое – через вылизывание щенков;

38

-каланы – при поверхностном контакте нарушаются изоляционные

свойства меха, что очень часто приводит к смерти индивидов. Прямое

потребление нефти маловероятно, непрямое – в процессе ухаживания за

щенками, что приводит к повреждению печени, почек, дисбалансу эндокринной

системы, диареи и смерти. Вдыхание нефтяных паров воздействует, в первую

очередь, на легкие и нервную систему (Патин, 1979).

В морские среды могут попадать также мутагенные и канцерогенные

соединения, образовавшиеся в результате промышленной и

сельскохозяйственной деятельности непосредственно с кораблей, перевозящих

нефть и нефтепродукты. Попадая в организмы животных, в том числе

употребляемых в пищу человеком, такие соединения вызывают рост числа

опухолевых заболеваний в их тканях.

В таблице 3 показана относительная чувствительность основных

биотических компонентов морской экосистемы и объектов прибрежной зоны

Арктики к действию пленочной и диспергированной в воде нефти.

Таблица 3. Относительная чувствительность биотических компонентов

морской экосистемы и объектов прибрежной зоны арктических морей к

действию пленочной и диспергированной в воде нефти (Патин, 2008).

Группы морской биоты и

объекты прибрежной зоны

Пленочная нефть на

поверхности моря

Нефть,

диспергированная в

толще воды (1-10 м)

Морские птицы ++++ О

Морские млекопитающие +++ +

Гипонейстон +++ +

Нектон (в том числе рыбы) + +

Бентос (пелагиаль) О О

Бентос (прибрежная зона) +++ ++

Заливы, губы ++++ +++

39

Низинные побережья и

отмели

+++ +

Приустьевые участки рек +++ +

Нерестилища в прибрежной

зоне

+++ +

Примечание: Степень чувствительности к нефтяным разливам: ++++ высокая, +++

умеренная, ++ слабая, + незначительная, О - отсутствие.

Общее воздействие нефтепродуктов на морских обитателей можно

разделить на 5 категорий: 1) непосредственное отравление с летальным

исходом; 2) серьезные нарушения физиологической активности; 3) эффект

прямого обволакивания живого организма нефтепродуктами; 4) болезненные

изменения, вызванные внедрением УВ в организм; 5) изменения в

биологических особенностях среды обитания. Зависимость основных

биологических эффектов и основные реакции морских организмов на

присутствие различных концентраций нефти в воде и донных осадках

представлены на рисунке 6.

К настоящему времени вся пелагиаль морей Арктики и основная часть

прибрежных вод находятся в области безвредных концентраций нефти.

Сублетальные эффекты (снижение скорости роста, размножения и т.д.) и острая

нефтяная интоксикация могут проявляться только в ограниченных участках

прибрежной зоны (Проект ЮНЕП/ГЭФ, 2012), где имеется сильное и

хроническое локальное загрязнение (нефтяные терминалы, порты и т.д.).

40

Рисунок 6. Последовательность основных реакций и откликов в морской

биоте в зависимости от концентрации УВ нефти в морской воде и донных

осадках (Патин, 2008).

Водоросли-макрофиты. Северные моря характеризуются богатой

флорой. Морские водоросли представлены как одноклеточными, так и

многоклеточными формами, внешне напоминающими высшие наземные

растения. Макроводоросли являются важнейшим звеном прибрежных

экосистем. Степаньян О.В. и Воскобойников Г.М. провели ряд экспериментов

по изучению влияния нефти и нефтепродуктов на рост, развитие и размножение

макроводорослей. Авторами было сделано несколько наблюдений и выводов

(Степаньян, Воскобойников, 2006):

1. Реакция макроводорослей на воздействие нефти и нефтепродуктов

зависит от их видовой принадлежности. Наиболее устойчивыми к воздействию

нефти и нефтепродуктов являются бурые водоросли (фукусовые и ламинария),

наименее - красные и зеленые (порфира, пальмария и энтероморфа).

41

2. В зависимости от стадии онтогенеза также проявляется различная

чувствительность к действию нефтетоксикантов. Так, для Laminaria saccharina

и Enteromorpha intestinalis максимально уязвимыми стадиями жизненного

цикла в условиях нефтяного загрязнения являются гаметогенез и рост

ювенильного спорофита, для Fucus vesiculosus - прорастающая зигота.

3. В большей степени воздействию нефтяного загрязнения подвергаются

водоросли литорали и сублиторали. Макроводоросли, произрастающие в

местах с хроническим нефтяным загрязнением, менее чувствительны к

воздействию нефти, чем водоросли чистых мест. Среди морских макрофитов

бурые водоросли характеризуются высокой устойчивостью к нефтяным

загрязнителям и при концентрации загрязнителя 0,01 мг/л активно растут и

развиваются, сорбируя и, возможно, включая в метаболизм УВ нефти, очищая,

таким образом, морскую среду.

4. Макроводоросли способны переносить действие значительных доз

эмульгированных и растворенных фракций нефти, превышающих предельно

допустимые концентрации в несколько раз. По сравнению с эмульгированной и

растворенной формами нефти (нефтепродуктов) более токсичной для

макроводорослей является пленка нефти (нефтепродуктов), которая снижает

интенсивность фотосинтеза и газовый обмен. Однако было отмечено, что у

некоторых фукусовых водорослей (Fucus distichus) не происходило снижения

скорости фотосинтеза при образовании пленки нефти на поверхности воды.

Одними из главных причин торможения развития прибрежных растений

и их гибели являются нарушение поступления воды, кислорода и питательных

веществ. Нефть образует пленки между семенами, корневой системой и

окружающей средой, затрудняющие водно-воздушный обмен, пищевой режим

растений. Под действием нефти изменяется структура хлоропластов, и, как

следствие, нарушаются процессы фотосинтеза. Происходят и морфологические

изменения: искривление стеблей, карликовость, скручивание листьев.

42

Прямое воздействие на растения оказывают содержащиеся в нефти

нафтеновые кислоты и другие токсические УВ. Наиболее токсичными являются

нафтеновые и керосиновые фракции.

Таким образом, УВ нефти являются высокотоксичными соединениями

для организмов, действующими на ряд уровней организации живого:

молекулярный, клеточный, организменный, биоценотический. Нефтяные

загрязнения вызывают изменения видовой и трофической структур водных и

наземных экосистем и, как следствие, нарушение их функционирования,

снижение биоразнообразия. Главные последствия загрязнений - образование

нефтяной пленки на поверхности моря, нарушающей газообмен в

поверхностных слоях воды, препятствующей проникновению света, и как

следствие - фотосинтезу, и оседание тяжелых фракций нефти на дно,

приводящее к гибели обитателей морского дна. Подавляющее большинство

представителей морской флоры и фауны особо чувствительны к действию

нефти на ранних стадиях развития (икра, личинки, эмбрионы, молодь).

Токсические эффекты УВ загрязнений проявляются в форме краткосрочных и

хронических стрессов для популяций морских птиц, млекопитающих и донных

сообществ, особенно сильно их влияние в морской прибрежной зоне и на

берегу. Восстановление биоценозов может происходить за период от одного

сезона до нескольких десятков лет в зависимости от влияния природных

условий среды (обилия пищевых ресурсов, доступности местообитаний),

времени и продолжительности УВ воздействия, степени поражения популяций

и т.д.

1.4. Ликвидация нефтяных загрязнений в Арктике

В настоящее время ликвидация углеводородных загрязнений в природе

включает три подхода: механический, физико-химический и биологический.

Механический сбор нефти включает в себя ряд мероприятий (Поттер и

др., 2013):

43

- локализация нефтяного загрязнения, которая осуществляется путем

установки стационарных или мобильных рубежей с целью предотвращения

распространения нефти по водной поверхности (боновые заграждения,

пневматические заграждения, естественные препятствия и т.д.). Однако у таких

сооружений есть ряд недостатков при их использовании в ледовых условиях. К

ним относятся низкая надежность установки бонов в дрейфующем льду,

высокий риск их повреждений вследствие ударов льдин, затруднения их

установки при наличии битого льда, возможность их использования лишь на

начальных стадиях ледостава и в конце ледового периода и т.д.

- сбор и удаление нефти с водной поверхности или в прибрежной зоне с

помощью специального оборудования (скиммерные системы, вакуумные

насосы) или вручную (вымывание нефти, сбор нефти с помощью черпаков и

скребков, срезание загрязненной нефтью растительности, применение

пассивных сорбентов). Механические способы позволяют собрать не более 10-

30% разлившейся нефти в условиях открытого моря.

Физико-химические способы. К ним относятся: сжигание нефти на

месте разлива; диспергирование нефти путем применения поверхностно-

активных веществ (ПАВ); применение сорбентов.

Сжигание нефти возможно как в битом, так и на монолитном льду. Также

можно эффективно сжигать нефть, обнаженную в результате намеренного

вскрытия льда в море или вслед за обнажением нефти изнутри или из-под льда

припая (Поттер и др., 2013). Недостатками данного способа являются высокая

степень загрязнения воздушного бассейна побочными продуктами сжигания,

сложность выполнения по прошествии более 10-12 часов после разлива, угроза

вторичных возгораний, представляющих опасность для человеческой жизни,

имущества и природных ресурсов (Арзамасцев, 2007).

Химические и физические диспергенты ускоряют процесс естественной

деструкции нефти путем снижения поверхностного натяжения на границе

раздела нефти и воды (Поттер и др., 2013). Этот процесс может длиться от

суток до нескольких недель. Метод диспергирования не эффективен в условиях

44

отсутствия ветра и волнения и спустя двое суток с момента разлива вследствие

увеличения вязкости нефти. Однако их применение особенно востребовано в

противоположных условиях (сильный ветер и волнение), когда механический

сбор нефти и сжигание на месте становятся небезопасными или

неэффективными. Современные диспергенты являются низкотоксичными

соединениями, в состав которых входят биоразлагаемые ПАВ, растворенные в

неароматических УВ или смешанные с растворителями на водной основе

(Поттер и др., 2013).

Сорбенты используются для ликвидации небольших нефтяных пятен и

очистки прибрежной зоны. В результате поглощения нефтяной плетки

образуются плавучие конгломераты, поэтому возникают сложности с

дальнейшим сбором и утилизацией загрязненного сорбирующего материала.

Биологические способы (применение биопрепаратов). На

сегодняшний день большое внимание привлекают биологические методы

очистки вод. Их применяют в случаях, когда концентрация УВ в объектах

окружающей среды слишком низка для применения механических способов их

сбора, но слишком высока для использования природных ресурсов в

хозяйственных целях без очистки (Максимович и др., 2009). Биологические

методы включают стимуляцию аборигенных УВО микроорганизмов, внесение

биопрепаратов, высаживание растений (фиторемедиация), комплексный

способ, включающий по очереди или сразу все варианты. Биоремедиация

включает, в свою очередь, биостимуляцию – стимуляцию аборигенной

микробиоты путем создания оптимальных условий для ее развития (внесением

источников биогенных элементов, витаминов, микроэлементов в загрязненный

объект), и биоаугментацию, которая заключается в добавлении УВО

микроорганизмов к существующей микробной популяции в среде (внесение

биопрепаратов). Биопрепараты создаются на основе биомассы УВО

микроорганизмов, ранее выделенных из природных сред. Микроорганизмы,

использующие УВ в качестве источника углерода и энергии, обладающие

разнообразными, мощными и подвижными ферментативными системами и

45

метаболическими путями их потребления, широко распространены в природе и

играют ведущую роль в процессах самоочищения объектов окружающей среды

(Margesin, Schinner, 2001; Миронов, 2002).

ГЛАВА 2. МИКРООРГАНИЗМЫ СЕВЕРНЫХ МОРЕЙ И

ДЕГРАДАЦИЯ НЕФТИ

Определяющим фактором развития биоты северных морей является

температура. Микроорганизмы по их активности при низких температурах

подразделяют на психрофильных (холодолюбивых) и психротрофных или

психротолерантных, психроактивных (Chattopadhyay, 2006; Margesin et al.,

2007). Наиболее распространенными в морской воде являются психрофилы,

область роста которых лежит в пределах от 0°С или ниже до 20°С и ниже, тогда

как оптимальная температура роста составляет 15°С или меньше (Morita, 1975).

Психротрофами называются микроорганизмы, которые могут расти при 5°С

или ниже независимо от их максимальных или оптимальных температур роста

(Eddy, 1960). Эта группа микроорганизмов демонстрирует активность как при

достаточно низких температурах (несколько ниже 15°С), так и в мезофильных

условиях. Для большинства микроорганизмов температурный оптимум

развития превосходит те высшие пределы, которых достигают температуры вод

и грунтов северных морей (Буткевич, 1958). Однако такое несоответствие

температурного оптимума микроорганизмов и температуры их естественной

среды обитания может объясняться сдвигом свойственного им температурного

интервала в сторону его повышения при культивировании микроорганизмов в

лабораторных условиях. Так же возможно, что при применении обычных

методов выделения не удается обнаружить ту значительную часть микробного

населения морской воды и грунтов, которая является наиболее

приспособленной к специфическим условиям существования в море вообще и к

температурным условиям в частности (Буткевич, 1958). Некоторые бактерии

существуют в микроскопических водных каналах, на границе раздела между

46

льдом и водой, благодаря чему они сохраняют способность к росту при

отрицательных температурах (Junge et al., 2001).

2.1. Численность микроорганизмов в морской воде

Численность микроорганизмов в морской воде ограничивается физико-

химическими и биотическими факторами, влияющими на рост и размножение.

К таким факторам относятся условия окружающей среды - температура,

соленость, доступность кислорода, зависящая от движения или стагнации воды,

количество и природа доступного субстрата, природа и численность популяций

животных - хищников, численность которых может сильно варьировать

(Wacksman, Hotchkiss, 1937; Carlucci, Pramer, 1959). Общая микробная

численность подвержена сезонной изменчивости, а также зависит от локации

морской воды. Так, прибрежные воды богаче бактериальным населением

(Мишустина и др., 1985). В местах соприкосновения и смешения разнородных

вод могут наблюдаться более или менее выраженные скопления бактерий. Они

наблюдаются в районах, расположенных у устьев впадающих в море рек, а

также в открытых морях в местах внедрения теплых атлантических вод с

высокой соленостью в холодные арктические воды, зачастую опресненные за

счет приносимых реками вод и вод от тающих льдов и снегов (Буткевич, 1958).

Существенным фактором, определяющим численность микроорганизмов

морских вод, является состояние сопутствующего ему планктона как

растительного, так и животного, т.к. он может выступать в роли источника

пищевого материала для микроорганизмов или в роли их потребителя.

Предполагается, что отмирание планктонных микроорганизмов при смешении

разнородных вод вследствие нарушения условий, к которым эти организмы

приспособлены, и превращение их из потребителей бактерий в материал для их

питания является одной из причин возникновения упомянутых выше

бактериальных скоплений (Буткевич, 1958).

Для численности и распределения сапрофитных бактерий в прибрежной

зоне определяющее значение играют и приливно-отливные явления. Вместе с

47

тем, есть данные, что микроорганизмы распределены достаточно равномерно

между прибрежной зоной островов Северного Ледовитого океана и его

открытыми водами (Ильинский, 1995).

Количество и видовой состав бактерий определяется в значительной мере

распределением и характером органического вещества (ОВ) в морской воде. В

зависимости от концентрации органического субстрата выделяют две группы

микроорганизмов: олиготрофные, способные жить при низком содержании

субстрата в среде, и копиотрофные (эвтрофные или сапротрофные), живущие

при высоких концентрациях субстрата в среде. Дополнительным фактором

распределения микроорганизмов может быть и очаговость произрастания и

отмирания макрофитов – важных продуцентов органического вещества. Ввиду

того, что в прибрежной зоне сосредоточено больше ОВ (прежде всего,

биомассы водорослей), ее можно считать более эвтрофицированной по

сравнению с открытой частью моря. Таким образом, очаговость распределения

ОВ приводит к зональности и очаговости в распределении бактерий в воде. Во

внутренних морях выявляется в два раза больше свободноживущих бактерий,

чем на тех же глубинах в океане. Наибольшее число бактерий обитает на

глубинах 200 и 400 м, а ниже их численность убывает (Мишустина и др., 1985).

Кроме того, значительное количество микроорганизмов обнаруживается и в

поверхностном слое воды, что связано с его повышенной опресненностью из-за

таяния льда и стока крупных рек, и вследствие уменьшения солености

создаются условия для развития большего количества микроорганизмов (Гусев

и др., 1977). Численность микроорганизмов в арктических водах в среднем

достигает до 105-10

6 клеток/мл (Brinkmeyer et al., 2003; Gerdes et al., 2005;

Harder, 2009). В Баренцевом море общая микробная численность составляет

3,1*106 - 2,1*10

7 кл/мл, в Белом – 5*10

5 - 6*10

6 кл/мл, в Карском – 2,5*10

5 -

3*106, в море Лаптевых – 2*10

5 - 2*10

6 кл/мл, в Восточно-Сибирском море и

Чукотском – 3*104

- 2,45*105 кл/мл (Саввичев и др., 2007; Саввичев и др., 2008;

Саввичев и др., 2010; Литвинова и др., 2011; Саввичев, 2011).

48

2.2. Разнообразие микроорганизмов в условиях низких температур

В районах с устойчивой низкой температурой значительная часть

бактерий представлена грамотрицательными палочками, не склонными к

спорообразованию, однако, встречаются кокковидные, коккобациллярные

формы, вибрионы. Грамположительные бактерии, в основном Arthrobacter,

Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus и другие близкие к ним группы, а

также спорообразующие организмы в районах с устойчивой низкой

температурой встречаются в гораздо меньшем количестве по сравнению с

грамотрицательными формами (Баросс, Морита, 1981). В холодных условиях с

неустойчивым температурным режимом распространены грамположительные

кокки и палочки, относящиеся главным образом к родам Arthrobacter,

Corynebacterium, Brevibacterium, Kurthia, Cellulomonas, а также родственные им

организмы. В условиях голодания размеры клеток бактерий уменьшаются

(Morita, 1982), вследствие чего увеличивается отношение их поверхности к

объему и возрастает способность клеток к утилизации энергетических

субстратов (Novitsky, Moritа, 1978; Ильинский, 1995). При этом палочковидные

бактерии могут принимать форму кокков (Novitsky, Moritа, 1978). В целом,

отмечена высокая биохимическая активность гетеротрофных микроорганизмов

в условиях арктических температур (Мишустина и др., 1985). Большинство

бактерий, обитающих в толще морской воды, относятся к хемоорганотрофам

(Мишустина и др., 1985, Hollibaugh et al., 2007).

По литературным данным, обнаруживаются существенные различия в

количественном соотношении между микробными сообществами умеренной и

арктической зоны. Так, 50% микроорганизмов умеренных широт относятся к

классу α-Proteobacteria, 30% - к γ-Proteobacteria, 10% - к Bacteroidetes и 4% - к

цианобактериям (Pedrós-Alió et al., 2015). Таксономически в водах северных

морей доминируют протеобактерии, преимущественно из классов α- и γ-

Proteobacteria, а также бактерии филогенетической группы Cytophaga–

Flavobacterium–Bacteroidetes (CFB) (таблица 4), и археи (Boeuf et al., 2014;

Pedrós-Alió et al., 2015). Микроорганизмы типов Verrucomicrobia и

49

Actinobacteria также широко распространены в арктических морских водах

(Boeuf et al., 2014). В полярных водах встречаются и цианобактерии порядков

Chroococcales, Nostocales, Oscillatoriales, Synechococcales, однако их

численность невысока (Zwirglmaier et al., 2008; Jungblut et al., 2010; Huang et al.,

2012). По некоторым данным, среди микроорганизмов арктических морей доля

α-Proteobacteria составляет 36%, γ - 32%, δ - 14%, ε - 1%; CFB-группы - 9%;

Verrucomicrobium - 6%; зеленых несерных бактерий - 2% (Bano, Hollibaugh,

2002). Однако в работе других авторов сообщается, что вклад каждого из

классов α-Proteobacteria и γ-Proteobacteria достигает лишь около 20%, а

бактерий группы CFB - 18% (Pedrós-Alió et al., 2015). В микробных

сообществах прибрежных вод также встречается около 8% представителей

класса β-Proteobacteria, наиболее распространенного в пресных водах (Galand

et al., 2008а). Бактерии обычно доминируют по численности и многообразию

над археями. Среди последних более распространены представители типа

Crenarchaeota, хотя в прибрежных водах и в некоторых глубоководных ареалах

встречаются представители типа Euryarchaeota: р. Methanogenium,

Methanococcus, Methanosarcina и Methanolobus (D’Amico et al., 2006; Galand et

al., 2008b; Hoover, Pikuta, 2010). Есть сведения об обнаружении в полярных

водах среди архейных микроорганизмов представителей нового типа -

Thaumarchaeota, нуклеотидные последовательности которых составляют около

14% от всех последовательностей в исследованном авторами метагеноме

(Alonso-Sáez et al., 2012). Среди дрожжей, способных расти в условиях низких

температур, известны представители родов Bulleromyces, Candida, Cryptococcus,

Debaryomyces, Leucosporidiella, Mrakia, Pichia, Rhodotorula, Saccharomyces,

Sporobolomyces, Trichosporon, Torulopsis, Zygosaccharomyces и т.д. (Connell et

al., 2008; Buzzini, Margesin, 2013).

50

Таблица 4. Филогенетическая принадлежность бактерий, встречающихся

в водах северных морей.

Филум Класс Род Литературный

источник

Proteobacteria α-

Proteobacteria Brevundimonas

Miteva et al., 2004;

Srinivas et al., 2009;

Hyphomonas Staley, Gosink, 1999

Loktanella Ghiglione et al.,2012

Octadecabacter

Brinkmeyer et al.,

2003;

Staley, Gosink, 1999

Paracoccus Srinivas et al., 2009;

Roseobacter Staley, Gosink, 1999

Roseovarius Srinivas et al., 2009;

Sphingomonas

Brinkmeyer et al.,

2003;

Staley, Gosink, 1999;

Miteva et al., 2004

Sphingopyxis Srinivas et al., 2009

Sulfitobacter Srinivas et al., 2009;

Gerdes et al., 2005

β-

Proteobacteria

Aquaspirillum Harding et al., 2011

Polaromonas Miteva et al., 2004;

Staley, Gosink, 1999

Rhodoferax Staley, Gosink, 1999;

Harding et al., 2011

Variovorax Gerdes et al., 2005

δ-

Proteobacteria

Desulfofaba Knoblauch et al., 1999

Desulfofrigus Knoblauch et al., 1999

Desulfotalia Knoblauch et al., 1999

Desulfuromonas Vandieken et al., 2006

Desulfuromusa Vandieken et al., 2006

γ-

Proteobacteria Acinetobacter

Brinkmeyer et al.,

2003; Srinivas et al.,

2009

Aeromonas Суслова и др., 2012

Alteromonas Staley, Gosink, 1999

Colwellia Srinivas et al., 2009;

Staley, Gosink, 1999

Cycloclasticus Prince et al., 2010

Enhydrobacter Srinivas et al., 2009

Glaciecola Brinkmeyer et al., 2003

51

Halomonas Gerdes et al., 2005

Marinobacter

Brinkmeyer et al.,

2003; Gerdes et al.,

2005; Staley, Gosink,

1999

Marinobacterium Srinivas et al., 2009

Marinomonas Srinivas et al., 2009

Neptunomonas Hedlund et al., 1999

Oceanospirillum Brinkmeyer et al., 2003

Oceanisphaera Srinivas et al., 2009

Oleispira Yakimov et al., 2003

Photobacterium Srinivas et al., 2009

Pseudoaltero-

monas

Brinkmeyer et al.,

2003; Srinivas et al.,

2009; Staley, Gosink,

1999

Pseudomonas

Brinkmeyer et al.,

2003; Miteva et al.,

2004; Srinivas et al.,

2009; Staley, Gosink,

1999

Psychrobacter

Brinkmeyer et al.,

2003; Srinivas et al.,

2009

Psychromonas Brinkmeyer et al., 2003

Shewanella

Gerdes et al., 2005;

Srinivas et al., 2009;

Staley, Gosink, 1999

Vibrio Brinkmeyer et al., 2003

Actinobacteria Actinobacteria Micrococcus Суслова и др., 2012

Plantibacter Суслова и др., 2012

Rhodococcus Суслова и др., 2012

Streptomyces Суслова и др., 2012

Firmicutes Clostridia Acetobacterium

Kotsyurbenko et

al.,1995

Bacilli Bacillus Суслова и др., 2012

Brevibacillus Суслова и др., 2012

Marinococcus Суслова и др., 2012

Bacteroidetes CFB-group Bacteroides Teske et al., 2011

Cytophaga Teske et al., 2011

Flavobacterium

Brinkmeyer et al.,

2003; Gerdes et al.,

2005

52

Flectobacillus Staley, Gosink, 1999

Gelidibacter Staley, Gosink, 1999

Polaribacter Brinkmeyer et al.,

2003; Teske et al., 2011

Psychroflexus Ghiglione et al., 2012

Psychroserpens Brinkmeyer et al., 2003

Salegentibacter Brinkmeyer et al., 2003

2.2.1. Разнообразие морских углеводородокисляющих микроорганизмов

В морской воде распространены и УВО микроорганизмы. В настоящее

время известно, что, по крайней мере, 79 родов бактерий, 9 родов

цианобактерий, 103 рода грибов и 14 родов водорослей способны использовать

нефть и ее производные в качестве единственного источника углерода и

энергии (Head et al., 2006). Большинство бактерий принадлежит к филуму

Proteobacteria, но встречаются и представители филумов Actinobacteria,

Bacteroidetes и Firmicutes.

УВ нефти и нефтепродуктов, попадающие в водные экосистемы,

являются источниками углерода и энергии для УВО микроорганизмов, вызывая

тем самым увеличение их численности при наличии благоприятных условий

для их развития. В арктических водах зимой поверхность воды покрыта льдом.

Показано, что в случае попадания нефти на его верхнюю или нижнюю

поверхность, численность УВО микроорганизмов возрастала крайне мало.

Однако в летний период их численность в присутствии нефти увеличивалась в

два раза (Atlas et al., 1978). При изучении биодеградации нефти

психротрофными микроорганизмами было показано, что отдельные штаммы р.

Pseudomonas и р. Rhodococcus способны разлагать от 15 до 26% нефти при 24°С

в течение 7-10 суток и от 28 до 47% при 4-6°С в течение 10-20 суток, т.е.

степень деструкции нефти при 4-6ºС некоторыми штаммами-деструкторами

оказалась выше, чем при 24ºС (Белоусова, Шкидченко, 2004; Пырченкова и др.,

2006; Нечаева, 2009).

К числу наиболее распространенных в воде УВО микроорганизмов

относятся представители сапротрофных микобактерий и родственных родов,

53

которые являются грамположительными и содержат миколовые кислоты в

клеточной стенке (роды Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus). Из других

УВО бактерий наиболее представительны бактерии родов Acinetobacter,

Achromobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Chromobacterium,

Micrococcus, Mycobacterium, Pseudomonas, Sphingomonas, Vibrio. В морской

воде, а также во льду обнаружены представители р. Pseudoalteromonas,

Pseudomonas, Psychrobacter, Marinobacter, Marinomonas, Oleispira, Shewanella

(Lo Giudice et al., 2010). По некоторым данным, бактерии р. Cycloclasticus и р.

Alcanivorax являются так же одними из наиболее важных, участвующих в

биодеградации сырой нефти в морской воде и морских отложениях (Prince et

al., 2010). В частности, р. Cycloclasticus способен к деградации ПАУ в

различных морских средах (Teramoto et al., 2010). Вид Cycloclasticus pugetii

(Geiselbrecht et al., 1998) имеет два различных гена диоксигеназ и способен

использовать нафталин, фенантрен, антрацен, бифенил, салицилат, толуол,

бензоат, ацетат, пропионат и глутамат в качестве единственного источника

углерода.

Изучение УВО микроорганизмов, выделенных при 4°C из образцов смеси

морского льда и морской воды о. Шпицберген, показало, что они полностью

разрушали н-алканы (C8-С34) и изопреноиды (пристан и фитан) в течение 28

дней культивирования (Deppe et al., 2005). При этом в первую очередь

деградации были подвергнуты короткоцепочечные алканы (C8-С14), их

утилизация происходила в течение первых двух недель культивирования, а

затем, по истечении этого времени, и алканы с длиной цепи от C15 до C34, а

также изопреноиды. В результате секвенирования DGGE-фрагментов

консорциума микроорганизмов было обнаружено 9 бактериальных штаммов,

отнесенных к родам Marinobacter, Pseudomonas, Pseudoalteromonas,

Psychrobacter, Shewanella, а также Agreia. Выделенные штаммы по отдельности

и в различных комбинациях – в виде смешанных культур, содержащих 2-5

штаммов, были испытаны на предмет способности разлагать различные

компоненты сырой нефти (н-алканы, пристан, ксилол, нафталин,

54

метилнафталин). Было обнаружено, что ни один из испытанных вариантов не

способен к столь же эффективной деструкции сырой нефти как оригинальный

(природный) консорциум. Таким образом, авторами была предложена гипотеза,

что в процессе биодеградации УВ в природе ключевую роль играют

некультивируемые штаммы.

Среди представителей домена Archaea еще не были подробно описаны

УВО микроорганизмы, однако есть сведения о метаногенах порядка

Methanomicrobiales, участвующих в утилизации алканов (Gray et al., 2011).

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей архей,

выделенных из нефтезагрязненных микрокосмов, показал, что многие из них

близки к организмам, способных к деградации нефти. Обнаружено, что

последовательности р. Methanocalculus и неклассифицированного семейства

Methanomicrobiaceae имеют 29% сходство с библиотеками микроорганизмов,

разрушающих нефть.

Грибная микробиота наиболее часто представлена р. Aspergillus,

Cladosporium, Fusarium, Penicillum, Trichoderma. Способностью разлагать УВ

обладают также представители семейства Mucoraceae. Они обитают в морской

воде, а также в почвах. Грибы Corollospora, Dendryphiella были выделены

только из морской воды (Мурзаков, 2005). Есть мнение, что грибы не только

активно минерализуют углеводородное загрязнение, но и являются матрицей

для адгезии других УВО микроорганизмов (Мурзаков, 2005). Помимо

микромицетов встречаются и дрожжи родов Candida, Endomycopsis, Hansenula,

Rhodotorula, Saccharomyces, Torulopsis.

Численность отдельных родов УВО микроорганизмов зависит не только

от их разной чувствительности к факторам среды, например, к температуре, но

и от взаимоотношений, складывающихся между ними в сообществе (Коронелли

и др., 1987).

На основе УВО микроорганизмов существует множество биопрепаратов,

используемых как для очистки почв, так и водных экосистем. Большинство,

если не все, микробных биопрепаратов, предлагаемых для биоочистки морских

55

акваторий, изготовлены на основе планктонных микроорганизмов и их

ассоциаций, поскольку полибактериальные препараты имеют более широкие

адаптационные и экологические возможности для использования. В России

широкое применение нашли такие препараты, как Деворойл (консорциум рр.

Pseudomonas stutzeri, Rhodococcus sp., Rhodococcus maris, Rhodococcus

erytropolis, Yarrowia sp.), Ленойл (ассоциация Bacillus brevis и Arthrobacter sp.),

Родер (препарат на основе R-диссоциантов штаммов Rhodococcus ruber ВКМ

Ас-1513Д и Rhodococcus erythropolis), Бациспецин (препарат на основе штамма

Bacillus sp. 739), Экойл (консорциум рр. Mycobacterium flavescens,

Mycobacterium, Rhodococcus sp., Acinetobacter sp.) и т.д. (Борзенков и др., 1998;

Мурыгина и др., 2001; Холоденко и др., 2002; Градова и др., 2003; Васильева,

2005).

По литературным данным, немаловажную роль в очистке морских

акваторий от нефтяных загрязнений играют симбиотические ассоциации

водорослей и УВО бактерий, обитающих на их поверхности (Семенова и др.,

2009; Воскобойников, Пуговкин, 2012). Для микроорганизмов живые

водоросли играют роль не только источников углерода и других элементов, но

и выступают в качестве подложки, носителя, что может способствовать

колонизации макрофитов разнообразными микроорганизмами (Семенов и др.,

2014). На сегодняшний день имеются некоторые данные исследований

таксономического состава и УВО эпифитона. К эпифитным УВО

микроорганизмам относятся представители родов Pseudomonas, Proteus,

Micrococcus, Arthrobacter, Corynebacterium, Mycobacterium, Rhodococcus

(Проект «Российская Федерация…, 2009).

2.2.2. Распространенность и некоторые физиологические особенности

углеводородокисляющих микроорганизмов северных морей

Способность психрофильных микроорганизмов расти в условиях низких

температур связана, в первую очередь, с особенностями строения их

ферментных белков и мембранных липидов (Margesin et al., 2003).

56

Сравнительная характеристика гомологичных ферментов психрофильных,

мезофильных и термофильных организмов показала, что их удельные

активности в условиях температурного оптимума функционирования, как

правило, близки (Хайруллин, 2009). Известно (Cavicchioli et al., 2002; Зернов и

др., 2005), что адаптация микроорганизмов к холодным условиям

существования приводит к увеличению рыхлости и подвижности третичной

структуры ферментов психрофилов, а это, в свою очередь, сказывается на

термостабильности этих ферментов (Зернов и др., 2005). В результате

ферменты психрофилов зачастую оказываются гораздо более термолабильными

по сравнению с аналогичными ферментами мезофилов. По литературным

данным (Westlake et al., 1974; D’amico et al., 2006), психрофильные

микроорганизмы обнаружены в ледниковом и морском льду, полярных

морских водах, где средняя температура обычно немного ниже 0°C. Эта низкая

температура не предел для выживания психрофилов, поскольку удельная

активность некоторых их ферментов намного выше при низких температурах,

чем у мезофильных штаммов того же вида (D’amico et al., 2006).

В исследованиях Зернова Ю.П. с соавторами было показано влияние

температуры на скорость роста Alteromonas undina P2. Культивирование

микроорганизма проводили при 13°C, 25°C, 30°C и 37°C. Авторами отмечается,

что культура не росла при 37°C, тогда как при более низких температурах

плотность культуры достигала примерно 10 оп. ед. после 24 ч роста (рис. 7).

Скорость роста при 13°C, 25°C и 30°C была примерно одинаковой.

Показано, что в первые 4 часа культура быстрее росла при 30°C, но к 8 часам

культивирования максимум оптической плотности наблюдали при 13°C.

Авторы предполагают, что с увеличением плотности клеток начала сказываться

недостаточная растворимость кислорода при повышении температуры. Кривая

роста при 13°C наиболее соответствовала логарифмической, что

свидетельствовало об оптимальности условий культивирования. Отсутствие

роста при 37°C и активный рост при 13°C указывает на температуру

экологической ниши культуры в океане. Таким образом, авторами был сделан

57

вывод, что штамм A. undina P2 является психрофильным. С биохимической

точки зрения можно ожидать, что его ферменты также имеют пониженный

температурный оптимум и термолабильны (Зернов и др., 2005).

Рисунок 7. Выращивание Alteromonas undina P2 при различных

температурах (Зернов и др., 2005).

Сравнение аминокислотных последовательностей психрофильных

ферментов показывает наличие минимальных перестановок и изменений в

первичной структуре по сравнению с мезофильными и термофильными

гомологами (Хайруллин, 2009). Однако предполагается, что этих структурных

факторов достаточно для усиления локальной подвижности за счет изменения

слабых взаимодействий, участвующих в стабилизации структуры белка. Таким

образом, эффективность психрофильных ферментов весьма велика.

Молекулярные основы данного явления в настоящее время недостаточно

изучены. Сравнение первичных последовательностей ферментов-гомологов

показывает, что аминокислотные остатки их активных центров и субстрат-

связывающих областей высоко консервативны (Хайруллин, 2009). Этот факт в

совокупности с данными о том, что ферменты психрофилов, как правило,

58

отличаются заметно сниженной термостабильностью, позволил выдвинуть

гипотезу, объясняющую их высокую удельную активность повышенной

подвижностью молекулы (D'amico et al., 2002; Grimont, Grimont, 2006). Однако

однозначно связь между стабильностью и активностью психрофильных

ферментов не установлена и, более того, в ряде случаев получены

противоречащие этой гипотезе результаты (Хайруллин, 2009). Ферменты

психрофильных бактерий весьма чувствительны к тепловой денатурации и

теряют активность уже при незначительно повышенной температуре (Ленгелер

и др., 2005).

В целом, существование в условиях низких температур и замораживания

– оттаивания ведет к снижению активности и скорости биохимических реакций,

приводит к повышению вязкости среды, изменению текучести мембран и

конформациям белка. Адаптивным ответом микроорганизмов на такие условия

являются структурные и функциональные изменения на уровне клеточных

компонентов и метаболизма, а также выработка механизмов, защищающих от

разрушительного действия внутриклеточного льда (Margesin, Schinner, 1994;

Margesin et al., 2007; Hoover, Pikuta, 2010). Психрофилы адаптированы к низкой

температуре благодаря высокому содержанию в липидах мембран

полиненасыщенных жирных кислот, обеспечивающих достаточную текучесть и

транспортную активность мембран при низкой температуре. Наряду с

увеличением доли ненасыщенных жирных кислот происходит увеличение

содержания короткоцепочечных и разветвленных жирных кислот, циклических

и цис-жирных кислот, поддерживающих полужидкое состояние мембран

(Srinivas et al., 2009). Так, изменения в мембранах, вызванные низкими

температурами, могут быть связаны с увеличением метил-разветвленных

жирных кислот (особенно, в клетках грамположительных бактерий) и их

изомеризацией за счет увеличения количества цис-изомеров ненасыщенных

жирных кислот (Margesin et al., 2007). Нижний температурный предел

микробной активности на несколько градусов ниже 0°С; при этих значениях

температуры внутриклеточная вода начинает замерзать. Однако

59

микроорганизмы способны переживать замораживание; в лабораторных

условиях этому способствует добавление в среду глицерола, сахаров и

диметилсульфоксида – веществ, препятствующих образованию кристаллов льда

и тем самым разрушению клеточных мембран (Ленгелер и др., 2005). Вместе с

тем известно, что формирование льда в клетке вызывает ее гибель. Поэтому у

психрофилов в результате воздействия экстремальных температур

сформировались специфические защитные механизмы - биосинтез

криопротекторов и ледструктурированных белков (ice structuring proteins), а

также антифризных белков (antifreeze proteins) [AFPs], которые связываются с

кристаллами льда, создают тепловой гистерезис и снижают температуру, при

которой организм может расти (Jia, Davies, 2002; D’amico et al., 2006). В

клетках психрофильных микроорганизмов обнаруживаются трегалоза и

экзополисахариды, которые предположительно выполняют роль

криопротекторов, предотвращая денатурацию и агрегацию белков (Phadtare,

2004). К другим приспособлениям относят: продукцию белков теплового (heat-

shock proteins) [HSPs] и холодового шока (cold-shock proteins) [CSPs], которые

участвуют в различных клеточных процессах, таких как транскрипция,

трансляция, сворачивание белка и регуляция текучести мембран (Phadtare,

2004); холодовых белков акклиматизации (CAPs) [Gounot, 1991; D’Amico et al.,

2002; Chattopadhyay, 2006]; синтез полярных каротиноидов, увеличивающих

текучесть мембран при низких температурах; снижение синтеза неполярных

каротиноидов (Jagannadham et al., 2000; Mueller et al., 2005); синтез или

поглощение соединений для криозащиты; продукцию биоэмульгаторов для

уменьшения вязкости и поверхностного натяжения среды - к ним относят

сурфактинподобные циклические ацилдепсипептиды (Калиновская и др., 1999).

Сезонное образование льда, воздействие низких зимних температур и

процесс таяния снега и льда летом способствует ежегодному отбору

психрофильных организмов в местообитаниях с холодным климатом. Лед, вне

зависимости от места его формирования (почва, ледники, пресноводные

водоемы или арктические моря), представляет собой особо экстремальную

60

среду микробной жизни.

Способность микроорганизмов обитать во льду обусловлена наличием

«вен» между кристаллами льда, заполненных жидкой водой, и адекватным

количеством энергоресурсов (Junge et al., 2004). Лабораторные эксперименты

подтверждают наличие микробной активности при температурах до -20°С.

Благодаря повышенной концентрации солей, вода между кристаллами морского

льда может оставаться жидкой при температуре до -35°С. Поскольку наличие

жидкой воды является главным критерием существования микробного

сообщества в таких местообитаниях, нижний предел активности

микроорганизмов может оказаться существенно ниже -20°С. Микроорганизмы,

обитающие на границе фаз «лед-вода» при пока что мало изученной

комбинации температуры, активности воды и концентрации растворенных

веществ, названы эвтектофилами (Deming, 2002).

В экспериментах с образцами льда из Чукотского моря, отобранных и

хранившихся при различных температурах, с помощью методов

флуоресцентной гибридизации (FISH) было отмечено присутствие

микроорганизмов в жидкой фазе между кристаллами льда (рис. 8), однако

большинство клеток бактерий (до 79%) были связаны с поверхностью

минеральных частиц. Процент активных клеток находился в диапазоне от 0,5 до

4%, уменьшаясь с понижением температуры образца (Junge et al., 2004).

В морских водах также широко распространены представители р.

Pseudomonas. Они не имеют толстой гидрофобной клеточной оболочки. Однако

их клетки окружены внешней мембраной, богатой фосфолипидами.

Расположенная под ней клеточная стенка бедна липидами. Поэтому снижение

гидрофобности поглощаемых субстратов осуществляется с помощью

выделяемых во внешнюю среду эмульгаторов, представляющих собой

пептидогликолипиды (Коронелли, Калюжная, 1983).

61

Рисунок 8. Микроскопические изображения морского льда из Чукотского

моря в районе Барроу, Аляска, при температуре от -5 (А) и -15°С (В).

Примечание. Бактериальные клетки, окрашенные DAPI, прикреплены к границе

раздела фаз на кристалле льда (А) и к минеральным частицам в «кармане»

между кристаллами (В) [Junge et al., 2004].

Сапротрофные микобактерии и родственные им рода (р. Corynebacterium,

Nocardia, Rhodococcus) в клеточной стенке содержат миколовые кислоты –

высокомолекулярные α-разветвленные β-оксикислоты. Установлено, что все

родококки содержат специфические липиды – миколаты и трегалозу

(Коронелли и др., 1993). Миколовые кислоты арктических родококков

представлены соединениями от С20 до С40. В клетках данных микроорганизмов

миколовые кислоты находятся в свободном состоянии, а также входят в состав

сложных липидов – пептидолипидов, гликолипидов и пептидогликолипидов

(Коронелли, 1984). Подавление синтеза миколовых кислот ведет к потере

клетками способности к окислению УВ, поскольку именно они обеспечивают

транспорт молекул УВ в клетку. Показано, что в клетках Rhodococcus opacus

количество жирных кислот увеличивалось с 3% до 34% при росте на бензоле,

феноле, 4-хлорфеноле, хлорбензоле, толуоле (Tsitko et al., 1999).

62

В составе клеточных стенок у всех микобактерий имеется значительная

доля ненасыщенных соединений с одной и двумя двойными связями. Это

обеспечивает текучесть липидной фазы клеточной стенки этих

микроорганизмов, широко распространенных в арктических водах и льдах

(Коронелли и др., 1989). Исследование липидов микобактерий методом

тонкослойной хроматографии показало, что они включают соединения

различной полярности: воска, триглицериды, свободные жирные кислоты

(обычные и миколовые), фосфолипиды (Коронелли, 1984).

Малополярные липиды представлены триглицеридами и восками в

составе клеточных стенок представителей р. Acinetobacter, Arthrobacter,

Rhodococcus. Для клеток УВО артробактерий показано отсутствие миколовых

кислот, а также образование огромных количеств воска при росте на УВ с

длиной цепи более C14. При этом способность к синтезу истинных восков у

УВО артробактерий выражена значительно сильнее, чем у микобактерий

(Коронелли и др., 1978).

Микроорганизмы морских экосистем, как и других местообитаний,

способны к выделению экзоферментов, тем самым усиливая роль гетеротрофов

в круговороте глобального цикла углерода (Teske et al., 2011).

Микроорганизмы, адаптированные к росту в средах с низкой температурой,

являются коммерчески и промышленно привлекательными источником таких

гидролитических ферментов, как протеаза, липаза, амилаза и т.д. (Margesin,

Schinner, 1994; Kasana, 2010). Следует отметить, что ферменты психрофильных

микроорганизмов давно используют в пищевой, текстильной промышленности

для создания детергентов, косметики, фармацевтических продуктов (Margesin,

Schinner, 1999; Gerday et al., 2000; Margesin et al., 2007).

2.3. Утилизация углеводородов микроорганизмами в водной среде

Биоразрушение (биодеградация) - это преобразование сложных веществ с

помощью биологической активности. Это широкое понятие включает три более

узких процесса: 1) трансформацию, или незначительные изменения молекулы;

63

2) фрагментацию, или разложение сложной молекулы на более простые

соединения и 3) минерализацию, или превращение сложного вещества в самые

простые (Н2О, СО2, Н2, NH3, CH4 и т.д.).

Деградация нефти и нефтепродуктов осуществляется за счет высокой

окислительной активности микроорганизмов. Биохимические процессы

деградации нефти с участием микроорганизмов включают в себя несколько

типов ферментных реакций на основе оксигеназ, дегидрогеназ и гидролаз,

которые осуществляют ароматическое и алифатическое гидроксилирование,

окислительное дезаминирование, гидролиз и другие биохимические

превращения исходных нефтяных веществ и промежуточных продуктов их

распада. К настоящему времени известны многие сотни бактериальных

ферментов, однако, не известно, в какой форме они существуют и действуют в

морской воде (Миронов, 2002). Гидрофобный характер углеводородной

молекулы является причиной того, что процессы окисления осуществляются

оксигеназами, в отличие от окисления более гидрофильных веществ,

происходящего под действием дегидрогеназ.

Предполагается, что деструкция УВ в водной среде включает несколько

этапов. На первом этапе сложные органические вещества подвергаются

действию экзоферментов, которые отщепляют карбоксильный или аминный

конец цепи. На втором этапе образовавшиеся промежуточные вещества

включаются в клетку, где расщепляются под действием эндоферментов

(Миронов, 2002). В работах Коронелли Т.В. сообщается, что на первом этапе в

нефтяной пленке размножаются микробактерии и артробактер, которые

снижают концентрацию УВ до нетоксичного для других микроорганизмов

уровня. При этом среда обогащается витаминами, липидами и другими

органическими соединениями и становится благоприятной для развития других

микроорганизмов, которые усваивают УВ в процессе кометаболизма

(Коронелли, 1980). Таким образом, происходит утилизация ароматических,

полиароматических, непредельных, изопреноидных и других УВ.

64

Первичное взаимодействие нефтепродуктов с микроорганизмом может

осуществляться несколькими способами:

1) путем их непосредственного контакта. При прямом контакте УВ

проникают в клетку в виде субмикроскопических капель. В процессе подобного

взаимодействия важную роль играет строение клеточной стенки, то есть

гидрофильно-гидрофобные свойства ее поверхности, обусловленные высоким

содержанием липидов в ее внешних слоях. Адгезия клеток к гидрофобным

субстратам на ранней стадии роста обеспечивает оптимальный транспорт

питательных веществ (Коронелли, 1980; Никовская и др., 1989; Bouchez-Naitali

et al., 1999).

2) путем растворения УВ в воде и переноса их в клетку пермеазами;

3) путем растворения УВ в липофильной оболочке и диффузии к

внутренней ее поверхности, где происходит их трансформация при участии

ферментов.

Транспорт УВ в клетку может осуществляться по двум путям: 1)

пассивным переносом (простая или облегченная диффузия), не требующим

энергетических затрат, скорость процесса при этом зависит от концентрации

субстрата в среде; 2) активным переносом, когда вещество поступает в клетку

против градиента концентрации в среде, процесс требует затрат энергии и

осуществляется с участием белков-переносчиков (Коронелли, 1996а;

Тимергазина, Передохова, 2012). Поверхностная активность и гидрофобный

характер клеточных стенок способствуют взаимодействию между

микроорганизмом и нерастворимым субстратом, что дает возможность

преодолеть ограниченную диффузию при его транспорте в клетку.

Процесс поглощения УВ клетками дрожжей также осуществляется в

несколько этапов. На первом этапе происходит пассивное, физико-химическое

поглощение УВ клетками и их диффузное перемещение через всю клеточную

оболочку до цитоплазматической мембраны. Второй этап включает в себя

активное поглощение УВ клетками за счет протекания метаболических

реакций, сдвигающих сорбционное равновесие и создающих соответствующий

65

сорбционный градиент, за счет которого УВ могут непрерывно поступать в

клетки (Рачинский и др., 1971; Давидова и др., 1975). Согласно другим

исследованиям, в клетках растущих на УВ дрожжей Candida tropicalis

возникают «каналы», заполненные липополисахаридами. Эти вещества

частично выходят наружу, вступают в контакт с каплями УВ и способствуют их

внедрению в толщу стенки с последующим растворением в липидах (Козлова и

др., 1973). Типичной особенностью ультратонкой структуры дрожжей является

обильное развитие пероксисом (микротелец), с которыми связаны ферментные

системы окисления УВ, а также митохондрий (Квасников, Клюшникова, 1981).

Одним из свойств морских микроорганизмов является их

олигокарбофильность (Квасников, Клюшникова, 1981) – способность

развиваться при очень низком содержании в среде органического вещества (3-

20 мг/л). Гусевым М.В. с соавторами было показано, что все выделенные из

арктических вод микроорганизмы обладали олигокарбофильностью (Гусев и

др., 1977). При этом для некоторых культур был отмечен обильный рост на

среде с дизельным топливом, и скудный – на агаризованной минеральной

среде. Таким образом, эти культуры могли поглощать УВ и в то же время

обходиться без них, используя органические соединения, содержащиеся в

агаре. Авторами было выдвинуто предположение о том, что такой способ

питания дает микроорганизмам преимущество в завоевании новых мест

обитания и адаптации к изменению состава воды.

Микробная деструкция УВ происходит путем «атаки» на молекулы после

их растворения или эмульгирования в водных средах. Процесс биодеструкции

сырой нефти, сырого газового конденсата, других нефтепродуктов,

представляющих собой смеси различных УВ, ускоряется после удаления

летучих соединений, оказывающих неблагоприятное действие на клеточные

структуры; биодеструкция конденсированных и ароматических соединений,

смол, асфальтенов ускоряется при стимулировании эмульгируемости этих

веществ или же в результате обеспечения условий для реакций биохимического

соокисления. Важную роль в процессе деградации УВ при этом играют ПАВ.

66

Под их воздействием нефтяная пленка превращается в мелкодисперсную

эмульсию, что приводит к увеличению площади поверхности нефтяных капель

и площади их контакта с бактериями (Коронелли, 1980). Исследования

Нечаевой И.А. показали, что клетки псевдомонад и родококков при росте в

присутствии глюкозы и нефти имеют значительные различия. При

культивировании на нефти это выражается в образовании на поверхности

клеток и во внеклеточном пространстве значительного количества

фибриллярных компонентов, имеющих отношение к эмульгаторам, которые

образуются у клеток при росте в присутствии таких гидрофобных субстратах,

как гексадекан, дизельное топливо, нефть. Электронно-цитохимическая

реакция на полисахариды (взаимодействие с рутением красным) показала, что

основой этих веществ являются полисахариды (Нечаева, 2009). Выяснилось,

что накопление полисахарида внутри клеток псевдомонады было выражено в

большей степени по сравнению с клетками родококка. Это может быть связано

с тем, что штамм Pseudomonas putida образует биоэмульгаторы эндо-

(связанных с клеточной стенкой) и экзо-типов, а для штамма Rhodococcus sp.

характерно образование только экзоэмульгатора.

Таким образом, потенциальные нефтяные разливы в условиях северных

регионов создают угрозу необратимого изменения хрупкой экосистемы

Арктики. УВ нефти представляют собой высокотоксичные соединения для

организмов, действуют на различные уровни организации живого:

молекулярный, клеточный, организменный, биоценотический, вызывая

изменения видовой и трофической структур водных и наземных экосистем и,

как следствие, нарушение их функционирования, снижение биоразнообразия.

Очевидно, что для сохранения колоссального природного потенциала

арктического региона и поддержания стабильности уникальных северных

экосистем необходима разработка и внедрение новых экологически безопасных

способов борьбы с последствиями возможных нефтяных разливов.

Биотехнологические способы очистки, основанные по преимуществу на

67

внесении в загрязненные среды УВО микроорганизмов в составе

биопрепаратов, зарекомендовали себя как эффективные и экологичные

средства охраны окружающей среды. Применение биопрепаратов на основе

аборигенных микроорганизмов наиболее целесообразно, поскольку они

адаптированы к низкой температуре, повышенной концентрации соли, низкому

содержанию питательных веществ, за счет чего сокращается время адаптации

клеток к условиям среды и повышается эффективность деструкции УВ нефти.

При этом включение в состав биопрепаратов штаммов микроорганизмов,

способных как к ферментативному окислению УВ, так и к синтезу

биосурфактантов различных типов, обеспечивает более эффективную

утилизацию нефтяных загрязнений за счет эмульгирования нефти,

облегчающего ее биодеградацию и увеличивающего площадь испарения УВ.

68

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Материалы исследования

Материалом для исследования являлись образцы морской воды, почвы

и грунта, растительной биомассы, собранные в загрязненных углеводородами

участках портовой зоны, набережной и объектов инфраструктуры побережья г.

Мурманск и Мурманской области (пос. Росляково), г. Кандалакша, г. Баку

(таблица 5).

Таблица 5. Места и источники сбора проб.

Место сбора проб GPS -

координаты Вид биоматериала

Мурманский порт, Акватория

порта г. Мурманск

68.94; 33.03 Почва с корнями

прибрежных растений

68.94; 33.03 Мелкие фрагменты бурых

водорослей

68.94; 33.03 Смесь бурых водорослей

68.94; 33.03 Смесь бурых водорослей

Озеро без названия на юго-

западе Ненецкого автономного

округа

66.09; 47.12 Пресная вода с нефтью на

ватном носителе

Порт г. Баку

40.34; 49.84 Смесь нефтезагрязненной

почвы и пенопласта

40.36; 49.85 Смесь морской воды и

почвы

40.37; 49.86

40.33; 49.84

Смесь разных почв из мест

нефтяного загрязнения

Пос. Росляково Мурманской

области, слив

канализационного коллектора

69.05; 33.20

Смесь бурых и зеленых

водорослей с грунтом

литорали

Порт г. Кандалакша 67.15; 32.40 Смесь бурых и зеленых

водорослей

69

Сбор материала, загрязненного углеводородами, проводили в

соответствии с ГОСТ 12.1.008-76, ГОСТ 31942-2012. Площадь отбора одной

точки составляла от 30 до 100 см2. Пробы с помощью стерильных пинцетов и

шпателей помещали в стерильные пробирки типа Falcon. Для сохранения в

пробе аэробных условий пробирки заполняли не более чем на 80% объема,

оставляя 20% и более газовой фазы.

3.1.1. Физико-географические характеристики мест отбора проб

Климат г. Мурманск и Мурманской области (пос. Росляково) – умеренно

холодный, морской, формируется под влиянием Баренцева моря, а также

течения Гольфстрим, Северо-Атлантического течения. Лето

непродолжительное, дождливое, средняя температура воздуха достигает 12-

13°C, воды – 7-10°C. Зима – долгая, сравнительно мягкая. Средняя температура

воздуха зимой составляет -5…-8°C, воды 1-2°C. Среднегодовая температура

воздуха – 0,6°C. Среднегодовая норма осадков – около 520 мм. Среднегодовая

относительная влажность воздуха около 76-80%. Средняя годовая скорость

ветра превышает 7 м/с. Через Мурманский порт осуществляется транспорт

автомобилей и оборудования, угля, строительных материалов, металлов, леса,

нефти и нефтепродуктов, химических грузов и т.д. Пос. Росляково, Мурманская

область - расположен на восточном побережье Кольского залива, в 8 км от

центра г. Североморск. С 2015 г. поселок присоединен к г. Мурманск в рамках

инвестпроектов по добыче нефти на Арктическом шельфе России. В период

отбора проб в г. Мурманск и Мурманской области температура воды

составляла 9°С, температура воздуха 18°С. Образцы были собраны в августе

2014 г.

Ненецкий автономный округ, юго-запад - климат субарктический,

формируется под воздействием арктических и атлантических воздушных масс.

расположен в зоне многолетней мерзлоты. Средняя температура воздуха зимой

-1…-3°C, средняя температура воздуха летом 8-16°C на юге; среднее

количество осадков – около 350 мм в год. Средняя скорость ветра составляет 4 -

70

8 м/с. В период отбора проб температура воды составляла 4-5°С, температура

воздуха 11°С. Образцы были собраны в августе 2014 г.

Г. Кандалакша - расположен на побережье Кандалакшского залива Белого

моря, в устье реки Нива, в 200 км к югу от Мурманска. Средняя температура

воздуха летом достигает 12-14°C, воды – 8-13°C. Зима – долгая, сравнительно

мягкая. Средняя температура воздуха зимой составляет -11…-14°C, воды -

0,2…0,1°C. Среднегодовая температура воздуха – 0,4°C. Относительная

влажность воздуха – 80%. Средняя скорость ветра – 2,6 м/с. В 48 км от

Кандалакши в пос. Белое море на территории нефтеперевалочной базы "Белое

море" в июне 1996 г. введен в эксплуатацию нефтеналивной причал. В период

отбора проб температура воды составляла 0-5°С, температура воздуха - 15°С.

Образцы были собраны в августе 2014 г.

Г. Баку - расположен в южной части Апшеронского полуострова, на

берегу Каспийского моря. Климат - мягкий континентальный и

полупустынный. Лето – жаркое, сухое, средняя температура воздуха достигает

22-26°C, воды – 23-26°C. Зима – прохладная, с небольшими скоплениями снега.

Средняя температура воздуха зимой составляет 4-6°C, воды 1-5°C.

Среднегодовая температура воздуха – 15°C. Среднее годовое количество

осадков - около 239 мм. Среднегодовая относительная влажность 75-80%.

Среднегодовая скорость ветров составляет 5 м/сек. В период отбора проб

температура воды составляла 8-10°С, температура воздуха 15°С. Образцы были

собраны в ноябре 2013 г.

3.2. Методы исследований

3.2.1. Питательные среды и условия культивирования

микроорганизмов.

Для получения накопительных культур, хроматографического и

гравиметрического анализа использовали модифицированную среду Таусона,

г/л (Романенко, Кузнецов, 1974): K2HPO4 – 1,5 (Химмед); КH2PO4 – 0,75

(Химмед); MgSO4∙7H2O – 1,0 (AppliChem); (NH4)2SO4 – 4,0 (AppliChem); NaCl –

71

30 (Panreac); гидролизат казеина – 0,5 (Himedia); дрожжевой экстракт – 0,1

(Helicon). Среду готовили на дистиллированной воде и стерилизовали

автоклавированием при 0,5 ати в течение 30 минут.

В качестве модельного углеводородного субстрата использовали смесь

товарной нефти Возейского месторождения и дизельного топлива в

соотношении 1:1 по объему (смесь НД), которую стерилизовали

автоклавированием в герметичных стеклянных флаконах в течение 30 мин при

1 ати и отдельно вносили в среду после стерилизации в количестве 1% по

объему. Культивирование микроорганизмов проводили в круглодонных колбах

емкостью 250 мл в орбитальном шейкере (130 об/мин) с системой контроля

температур Innova 43/43R (New Brunswick Scientific) при 4°С в течение 7-10

суток.

Для подсчета общей микробной численности, получения чистых культур

использовали питательные среды следующего состава, г/л:

модифицированная среда Plate Count Agar (PCA): K2HPO4 – 1,5 (Химмед);

КH2PO4 – 0,75 (Химмед); MgSO4∙7H2O – 1,0 (AppliChem); (NH4)2SO4 – 4,0

(AppliChem); NaCl – 30 (Panreac); гидролизат казеина - 5,0 (Himedia);

дрожжевой экстракт – 2,5 (Helicon); D(+)-глюкоза – 1,0;

дистиллированная вода, рН 7,0;

модифицированная среда Таусона. Для получения плотных сред

использовали пластинчатый агар («ФГУП ГНЦ ПМИБ», Оболенск) в

количестве 20 г/л.

3.2.2. Определение общей микробной численности (ОМЧ).

ОМЧ определяли методом Коха (Нетрусов и др., 2005). Посевы

инкубировали при 4°С в течение 4-7 суток.

3.2.3. Исследование температур роста микроорганизмов.

Температурный диапазон роста микробных сообществ проводили в среде

Таусона, обогащенной глюкозой в количестве 1 г/л. Прирост биомассы

микроорганизмов оценивали по величине оптической плотности при λ=540 нм

72

и толщине оптического слоя l=10 мм на спектрофотометре (LКB Biochrom 4050

Ultrospec II UV/VIS, U.K.).

3.2.4. Получение чистых культур микроорганизмов.

Выделение чистых культур микроорганизмов, способных к деструкции

нефти, проводили при 4°С методом наложения стерильного целлюлозного

фильтра (ОАО «Завод «Химреактивкомплект»», Россия), пропитанного

500−600 мкл НД, на поверхность плотной модифицированной среды РСА с

биомассой микроорганизмов. Некоторые детали использованной методики

приводятся в соответствующем разделе работы.

3.2.5. Проведение сканирующей электронной микроскопии (СЭМ).

Изучение архитектоники взаимодействия колоний микроорганизмов с

поверхностью фильтров проводили с использованием метода СЭМ.

Подготовку препаратов для СЭМ проводили по стандартной методике

(Нетрусов и др., 2005). Исследуемые образцы (фрагменты целлюлозного

фильтра с нанесенной смесью УВ и биомассой микроорганизмов) фиксировали

2,5% раствором глутарового альдегида в течение 1 часа в темноте, затем

обезвоживали в растворах этилового спирта возрастающей концентрации (20,

30, 50, 70% в течение 15 минут в кажом растворе). Затем образцы выдерживали

в 96% спирте в течение 1 ч. После обезвоживания образцы высушивали и

замораживали при -80°С. Замороженные препараты высушивали лиофильно.

Образцы напыляли золотом с палладием на ионно-напылительной установке

«IB-3 IonCoater» (Eiko, Япония). Микроскопию проводили на микроскопе

Camscan-S2 (Великобритания) c системой оцифровки изображений: плата АЦП

LCard под управлением программы MicroCapture (ООО «СМА»).

Микроскопический анализ проводили при ускоряющем напряжении 20 кэВ.

Набор спектров проводили при разрешении спектрометра 10 эВ на канал.

3.2.6. Изучение морфологических и физиолого-биохимических

особенностей микроорганизмов. Морфологические особенности препаратов

окрашенных фиксированных клеток чистых культур и микробных сообществ

изучали микроскопически с использованием светового микроскопа с фазово-

73

контрастным устройством (Carl Zeiss Jena, объективы Planachromat 40/0,65;

100/1,25) с общим увеличением х1000. Фотосъемку препаратов проводили с

помощью зеркального фотоаппарата Nikon D7000 с системой линз РА-7У 4.2

ЛОМО.

Физиолого-биохимические свойства чистых культур микроорганизмов

изучали по известным методикам (Нетрусов и др., 2005).

3.2.7. Идентификация микроорганизмов молекулярно-генетическими

методами.

Для уточнения видовой принадлежности чистых культур проводили

секвенирование нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК и

последовательности ITS-региона. Выделение ДНК из биомассы бактерий

проводили согласно методу (Булыгина и др., 2002). Концентрация полученного

препарата ДНК при использовании этого метода составляла 30 – 50 мкг/мл.

РНК в полученном препарате присутствовала в следовых количествах (менее

1%, согласно данным электрофоретического анализа).

Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего

секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК была использована

универсальная праймерная система (Lane, 1991). Объем амплификационной

смеси составлял 50 мкл и имел следующий состав: 1x буфер ДНК полимеразы

BioTaq (17 мМ (NH4)2SO4, 67 мМ трис-HCl, рН 8.8, 2 мМ MgCl2); по 12,5 нмоль

каждого из dNTP, 50 нг ДНК-матрицы; по 5 пмоль соответствующих праймеров

и 3 ед. ДНК полимеразы BioTaq (Диалат ЛТД, Россия). Температурно-

временной профиль ПЦР был следующим: первый цикл - 94°С х 9 мин, 55°С х

1 мин, 72°С х 2 мин; последующие 30 циклов - 94°С х 1 мин, 55°С х 1 мин, 72°С

х 2 мин; завершающий цикл - 72°С х 7 мин.

ДНК дрожжей выделяли набором реагентов "Проба-Экспресс" (Синтол).

Амплификацию области ITS1-5,8S-ITS2 рДНК проводили с использованием

пары праймеров ITS1F (5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'); ITS4R (5'-

TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') в общем объеме 20 мкл. ПЦР проводили с

помощью универсального набора реагентов «ПЦР-Комплект» (Синтол).

74

Температурно-временной профиль ПЦР был следующим: первый цикл - 95°С х

5 мин; последующие 30 циклов - 94°С х 20 сек, 58°С х 30 сек, 72°С х 1 мин 10

сек; завершающий цикл - 72°С х 3 мин. ПЦР программа была выполнена с

применением амплификатора ABI 2720 (Applied Biosystems Inc.,USA).

Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% геле

агарозы, окрашенном бромистым этидием, при напряженности электрического

поля 6 В/см. Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой

агарозы с применением набора реактивов Wizard PCR Preps DNA Purification

System (Promega, США), согласно рекомендациям производителя. Продукты

ПЦР дрожжей очищали от остатков олигонуклеотидов методом

дефосфолирирования с помощью смеси щелочной фосфатазы (SAP–shrimp

alkaline phosphatase) и экзонуклеазы I типа.

Секвенирование полученных ПЦР-фрагментов генов с каждым из

праймеров проводили по методу Сэнгера с соавт. (Sanger et al., 1977) с

помощью набора реактивов Big Dye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit

(Applied Biosystems, Inc., USA) на автоматическом секвенаторе ABI PRIZM

3730 (Applied Biosystems, Inc., USA) и секвенаторе ABI-3130XL Genetic

Analyser (Applied Biosystems Inc., USA) согласно инструкциям производителя.

Чтение последовательностей нуклеотидов проводили в двух направлениях.

Нуклеотидные последовательности, полученные с применением прямого

и обратного праймеров, анализировали и объединяли в общую

последовательность с помощью программного обеспечения SeqMan из пакета

DNAStar v11.0 (США). Выравнивание сиквенсов проводили с помощью

программы Chromas Lite (США). Сравнительный анализ и поиск нуклеотидных

последовательностей, гомологичных соответствующим последовательностям

изучаемых штаммов, проводили в базе данных GenBank с помощью

программного пакета BLAST (Camacho et al., 2009), а также в базе данных RDP.

3.2.8. Изучение субстратного спектра штаммов проводили с помощью

метода лунок (Егоров, 1976) на плотной среде Таусона. В качестве

единственного источника углерода и энергии для микроорганизмов в

75

минеральную среду вносили следующие УВ: н-алканы (октан, изооктан,

ундекан, додекан, тетрадекан, гексадекан), нафтеновые (циклогексан),

ароматические (бензол, толуол, ксилол, бифенил), полиароматические

(нафталин, фенантрен, антрацен, тетралин, декалин, 1-метилнафталин), смеси

УВ (бензин марки А-95, дизельное топливо, керосин, моторное масло, смола).

УВ вносили в лунку диаметром 8 мм, проделанную стерильным пробочным

сверлом в центре агаризованной минеральной среды на чашке Петри. Вокруг

лунки с субстратом производили штрихом посев культур в направлении от

лунки к краю чашки Петри. О способности к ассимиляции УВ судили по

интенсивности роста культур спустя 7-14 суток инкубации при 4°С.

3.2.9. Определение степени деструкции нефти.

Степень деструкции нефти определяли весовым (гравиметрическим)

методом по суммарному показателю убыли нефти в жидкой среде (Леоненко и

др., 2010) и методом газо-жидкостной хроматографии (Другов, Родин, 2007).

Для гравиметрического анализа экстракцию УВ нефти гексаном

проводили в соответствии с ГОСТ Р 52406-2005, ISO 9377-2:2000. Экстракцию

УВ проводили спустя 10 и 20 суток культивирования при 4°С. В пробы для

экстракции вносили по 20 мл эталонного н-гексана («Компонент-Реактив»),

после чего их помещали на орбитальный шейкер (220 об/мин) при температуре

25°С на 30 минут для перемешивания водной и углеводородной фазы и

максимально полной экстракции компонентов нефти. По завершении

перемешивания колбы наполняли дистиллированной водой до локализации

неполярной фазы с УВ в горловой части колбы, из которой стеклянной

пипеткой отбирали 1 мл экстракта. Элюаты переносили в стеклянную воронку с

обеззоленным фильтром, содержащим предварительно осушенную

прокаливанием при 160°С в течение 5 часов безводную соль Na2SО4. УВ

экстракт промывали с помощью стеклянного шприца 10 мл теплого (40°С) н-

гексана. Фильтраты собирали в предварительно взвешенные стеклянные

бюксы, после чего высушивали при комнатной температуре. После полного

испарения растворителя бюксы взвешивали ещё раз для определения

76

количества собранных УВ. Степень деструкции УВ выражали в процентах от

контроля. Контролем при определении степени испарения легких

углеводородных фракций служила питательная среда с добавлением 1 мл НД

(1:1), находившаяся в отдельной колбе в одном шейкере с опытными

образцами.

Методом газо-жидкостной хроматографии проводили анализ полученных

проб на приборе Кристалл 2000м (Хроматэк) с капиллярной колонкой DB-1

(Agilent)[длина – 30 м, диаметр – 0,25 мм, толщина слоя – 0,25 мкм] с

пламенно-ионизационным детектором (ПИД). Температура детектора

составляла 350°C; температура испарителя – 300°C; температура колонки –

100-300°С, скорость градиента – 15°С/мин; газ-носитель – гелий; расход газа –

20 мл/мин; расход водорода – 20 мл/мин; расход воздуха – 200 мл/мин. Объем

вводимой пробы составлял 1 мкл. Ввод пробы – автоматический дозатор ДАЖ-

2М (Хроматэк). Для оценки деструкции УВ использовали углеводородный

индекс (ki) - отношение суммы пристана и фитана (i-C17 и i-C18, соответственно)

к сумме н-алканов (С17 и С18): ki=(i-С17+i-С18)/(н-С17+н-С18), характеризующий

деградацию исходных нефтепродуктов (Другов, Родин, 2007). Результаты

хроматографии обрабатывали с помощью программного обеспечения OpenLAB

CDS (Agilent), MS Office Excel.

3.2.10. Измерение эмульгирующей активности.

Эмульгирующую активность определяли визуально согласно методике

(Rosenberg, 2006) а также методом Купера и Голденберга (Cooper, Goldenberg,

1987) по определению индекса эмульгирования. В мерные пробирки (V = 25

мл) с притертыми пробками вносили 5 мл гексадекана и 5 мл исследуемой

жидкости, закрывали и перемешивали на вортексе (Vortex V-1 plus, Biosan,

Latvia) в течение 2 мин при максимальной скорости. Индекс эмульгирования

рассчитывали спустя 24 ч после проведения эксперимента как отношение

объёма плотной эмульсии (Vэ, мл), образуемой при перемешивании изучаемого

раствора с гексадеканом, к общему объёму раствора (V, мл), умноженное на

77

100%: Е24 = Vэ/V×100%, где V = 10 мл. Контролем служила стерильная

питательная среда.

3.2.11. Измерение величин поверхностного натяжения.

Измерение показателя поверхностного натяжения проводили методом

Вильгельми (Щукин и др., 2004). Измерения проводили в супернатанте

исследуемой культуры при 20°С на тензиометре представляющим собой

торсионные весы ВТ-500 с подвешенной алюминиевой пластиной.

Поверхностное натяжение рассчитывали по формуле:

σ = mg/2l,

где m – масса отрыва пластины, г (среднее из трех измерений); g = 9,8 м/с2

–

ускорение свободного падения; l = 15,7 мм – длина линии отрыва (ширина

пластины). Снижение поверхностного натяжения (∆σ) рассчитывали как

разницу между значениями поверхностного натяжения стерильной среды

(контроль) и пробы исследуемой культуры.

3.2.12. Измерение степени гидрофобности поверхности клеток.

Определение гидрофобности/гидрофильности поверхности клеток

проводили по методу Розенберга в модификации Серебряковой (Серебрякова и

др., 2002). Для измерений использовали клетки, осажденные и

ресуспендированные в среде Таусона, не содержащей органики. Конечная

концентрация клеток в пробах для измерений соответствовала 0,5-0,6 единицам

оптической плотности клеточной суспензии, измеряемой на спектрофотометре

(LКB Biochrom 4050 Ultrospec II UV/VIS, U.K.) при λ=540 нм и толщине

оптического слоя l=10 мм. В пробирки, содержащие по 5 мл клеточной

суспензии, вносили по 1 мл хлороформа. Смесь встряхивали на вортексе в

течение 2 минут. После этого осторожно отбирали верхнюю водную фазу и

переносили в оптическую кювету для измерений. Показатель гидрофобности

(ПГ) клеток рассчитывали в процентах по формуле: ПГ=100-((Е*100)/Е0), где Е0

– исходная оптическая плотность микробной суспензии, Е – оптическая

плотность суспензии после взаимодействия клеток с хлороформом.

78

3.2.13. Долговременное хранение чистых культур.

Сохранение микроорганизмов проводили методом криоконсервации и

лиофильного высушивания. Выращивание биомассы для консервации

микроорганизмов проводили в модифицированной жидкой среде на основе

PCA.

Криоконсервацию проводили с использованием следующих видов

криопротекторов: раствор сухого обезжиренного молока или СОМ (Слуцкий

сыродельный комбинат, Беларусь) (10%) и глюкозы (7,5%); 2) раствор СОМ

(10%) и сахарозы (7,5%); 3) раствор декстрана (Dextran T20, Mw 20000, Ferak

Berlin, Germany) (10%) и глюкозы (7,5%); 4) раствор декстрана (10%) и

сахарозы (7,5%); 5) 5% ДМСО; 6) 10% глицерин. Стерилизацию ДМСО

осуществляли фильтрованием, используя шприцевые фильтры Minisart №

16534-K (Sartorius Stedium Biotech GmbH, Германия), хранение реактива

осуществляли в замороженном состоянии при -5°С. Остальные криопротекторы

cтерилизовали автоклавированием при 0,5 ати в течение 25 мин. Перед

добавлением углеводсодержащих протекторов клетки предварительно

осаждали центрифугированием (8000 об/мин в течение 10 мин) и

ресуспендировали в защитной среде в соотношении 1:10. ДМСО и глицерин

вносили непосредственно в культуральную жидкость и инкубировали в течение

15 мин. Приготовленные суспензии вносили по 0,5 мл в пробирки типа

Eppendorf и замораживали в криоштативе в морозильном ларе MDF-594

(Sanyo/Panasonic, Япония) при -80°С.

Лиофильное высушивание в ампулах проводили по стандартной

методике (Stacey, Day, 2007). В качестве защитных сред использовали те же

углеводсодержащие растворы, что и при криоконсервации. Суспензии

микроорганизмов помещали по 0,5 мл в стерильные ампулы с перетяжкой,

изготовленные из нейтрального стекла. Соотношение защитная среда−биомасса

составляло 1:10 по объему. Лиофилизацию проводили на установке для

лиофильной сушки Labconco FreeZone 1 L (США) при глубине вакуума 4,3 Па и

температуре конденсора −52°С в течение 2 сут. По окончании высушивания

79

газовую фазу в вакуумной камере замещали осушенным инертным газом

(аргоном) во избежание попадания влажного воздуха в ампулы. Ампулы с

высушенной биомассой запаивали под глубоким вакуумом (-1 бар) с помощью

газово-кислородной горелки. Запаянные ампулы хранили при 4°С.

3.2.14. Определение выживаемости и активности клеток в отношении

УВ после хранения.

Для определения численности жизнеспособных клеток микроорганизмов

применяли метод стандартных серийных разведений (Нетрусов и др., 2005) с

последующим посевом на плотную модифицированную среду PCA.

Выживаемость определяли по отношению числа сохранившихся клеток к

контролю − исходному числу жизнеспособных клеток (до начала хранения).

Для оценки эффективности консервирования вели подсчет колониеобразующих

единиц (КОЕ).

Оттаивание содержимого криопробирок проводили при температуре 32-

35°С. Высевы криоконсервированных образцов проводили через 40 мин после

оттаивания и тщательного перемешивания на вортексе в модифицированную

среду Таусона со смесью НД. Культивирование образцов проводили в течение

7-10 суток при 4°С при перемешивании среды.

В ампулы с лиофилизированными культурами вносили 0,5 мл

модифицированной среды Таусона, после чего проводили регидратацию клеток

в течение 15 мин, перемешивание суспензий на вортексе и высев в среду

Таусона с УВ.

3.2.15. «Тест на ускоренное хранение» (тест термостабильности).

Ампулы с лиофилизированными культурами помещали на хранение при

температурах 35 и 50ºС. Для оценки жизнеспособности клеток через

определенные промежутки времени (10 и 17 суток) ампулы вскрывали,

проводили регидратацию клеток и высев на плотную модифицированную среду

РСА. Для определения возможного времени хранения при 4°C использовали

уравнение Аррениуса: K=K0 e-E/RT

, где К0 – предэкспоненциальный множитель,

Е – энергия активации, R – газовая постоянная, Т – абсолютная температура

80

(273°+t°) [Кузнецов и др., 1977]. Для анализа экспериментальных данных

использовали метод наименьших квадратов (Gill, 1981).

3.2.16. Статистическая обработка полученных данных.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием

программы Microsoft Excel 2010. Результаты представлены в виде средней

арифметической и ее стандартной ошибки (M±m). Достоверность различий

полученных результатов оценивали с использованием коэффициента

Стьюдента (P>0,95).

81

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Основные этапы исследований, направленных на достижение

поставленной цели – селекции микроорганизмов с высоким

биотехнологическим потенциалом в отношении УВ нефти для их возможного

применения в условиях нефтяных загрязнений северных регионов в составе

биопрепаратов, представлены на следующей схеме.

Отбор и выделение микроорганизмов из нефтезагрязненных природных

источников в условиях северных регионов

Селекция микробных сообществ, активных в отношении УВ нефти

Исследование температурного диапазона роста микроорганизмов

Выделение чистых культур в условиях низких температур, исследование

их морфологических и физиолого-биохимических характеристик

Селекция и отбор культур, проявляющих активность в отношении УВ

нефти

Исследование УВО активности культур

Исследование биоэмульгирующей активности культур

Идентификация культур

Подбор методов и условий хранения культур

Оценка выживаемости клеток и прогнозирование срока хранения культур

82

Оценка сохранения ферментативной активности культур в отношении УВ

нефти после их консервации и хранения стандартными методами (общая

микробная численность (ОМЧ), гравиметрия, газо-жидкостная хроматография)

Для получения накопительных культур и выделения чистых культур УВО

микроорганизмов отбирали пробы биоматериала из загрязненных УВ

природных источников арктических райнов. На следующем этапе определяли

возможные температурные границы роста микроорганизмов. Наиболее

активные в отношении УВ нефти микроорганизмы, способные к интенсивному

росту при 4°С, исследовали стандартными микробиологическими методами и

отбирали в коллекцию. Затем проводили качественную и количественную

оценку их функциональной активности и биотехнологического потенциала

(углеводородокисляющего, биоэмульгирующего) и определяли видовую

принадлежность микроорганизмов морфологическими и молекулярно-

генетическими методами. С перспективой использования выделенных культур-

нефтедеструкторов в составе биопрепаратов для биоремедиации

нефтезагрязненных северных экосистем проводили подбор методов их

длительного сохранения с последующей оценкой чувствительности культур к

методам консервации и хранению, их выживаемости и сохранения целевой

активности после регидратации клеток. Для получения информации об

ориентировочных сроках хранения культур и предсказания возможных

изменений подобранных защитных средств в процессе хранения прибегали к

методу ускоренного тестирования, позволяющим проводить оценку

стабильности лиофилизированных культур в значительно более короткий

период времени по сравнению с фактическим сроком хранения продукта.

83

4.1. Выделение и селекция микробных сообществ из природных

источников

4.1.1. Отбор образцов

Известно, что при разработке способов микробной утилизации различных

поллютантов, целесообразным является скрининг микроорганизмов-

деструкторов в загрязненных местообитаниях, т.к. в таких условиях под

воздействием селективного давления формируются микробные штаммы с

высоким деструктивным потенциалом (Стабникова и др., 1995; Пырченкова и

др., 2006; Беляков, Плешакова, 2013). Использование аборигенной микробиоты,

выделенной из мест нефтяного загрязнения в целевом регионе ее дальнейшего

применения, позволяет эффективнее и глубже утилизировать углеводородные

субстраты. Поэтому на первом этапе работы проводили отбор образцов воды,

грунта и растительной биомассы в загрязненных УВ участках портовой зоны,

набережной, объектов инфраструктуры, побережья северных регионов (порты

г. Мурманск и Мурманской области, г. Кандалакша). С целью сравнения

биоразнообразия УВО микробиоты различных регионов и оценки ее

способности к окислению УВ в условиях низких температур проводили отбор

проб в нефтезагрязненных участках побережья Каспийского моря на

набережной г. Баку, а также на территории Ненецкого автономного округа.

Портовые города и поселки относятся к одним из основных каналов нефтяного

загрязнения арктических морей (Патин, 2008), через которые нефть и

нефтепродукты прямо поступают в морскую среду в составе промышленных,

городских, судовых и других сточных вод и отходов с береговых источников.

По некоторым данным, для заливов Баренцева и Белого морей именно

промышленные, городские и другие стоки с индустриально развитых

прибрежных территорий Западной Арктики являются основным источником

нефтяного загрязнения (Проект ЮНЕП/ГЭФ, 2012), обнаруживающегося как

непосредственно в морской воде, так и на поверхности приливно-отливной

зоны. Именно поэтому отбор образцов для дальнейших исследований

проводили вблизи нефтезагрязненных объектов портовой инфраструктуры, а

84

также в местах постоянного сброса канализационных стоков (рис. 9). Для

дальнейших исследований всего было собрано 65 образцов.

Рисунок 9. А - загрязнение нефтепродуктами береговой линии г.

Мурманск; Б - канализационный слив в портовой зоне г. Кандалакша; В -

разводы нефтяной пленки в литорали порта г. Мурманск; Г - загрязненная

нефтью колония Fucus sp., литораль порта г. Мурманск.

4.1.2. Подбор и оптимизация сред культивирования морских

углеводородокисляющих микроорганизмов

Для выделения микроорганизмов, способных к деструкции

нефтепродуктов, использовали метод накопительной культуры. Однако для

85

выделения и получения накопительных культур морских микроорганизмов

необходимо использовать среды, максимально приближенные по своему

составу к тем условиям, в которых обитают искомые сапротрофные

гетеротрофные микроорганизмы. Средний солевой состав вод Белого моря

весьма близок к солевому составу вод Баренцева моря и Мирового океана,

лишь очень незначительные отклонения наблюдаются в отношении отдельных

ингредиентов (Воронков, Мусина, 1939). Поэтому для культивирования

микроорганизмов была выбрана жидкая среда Таусона (K2HPO4 – 0,5 г/л;

MgSO4 – 1,0 г/л; (NH4)2SO4 – 4,0 г/л), в составе которой концентрацию NaCl

повысили с 5 до 30 г/л для имитирования состава и солености воды морей,

относящихся к Северному Ледовитому океану.

Ранее было подсчитано, что численность микроорганизмов в прибрежных

водах наиболее высока (Ducklow, Shiah, 1993; Wommack, Colwell, 2000). Это

связано с тем, что прибрежная полоса моря является зоной выброса большого

количества морских водорослей и морских животных, которые засыпаются

песком во время приливно-отливных течений и подвергаются процессу

гниения, продукты которого попадают в морскую воду. За счет разложившихся

остатков водорослей и тканей животных микроорганизмы поддерживают свою

жизнедеятельность (Бузолева, 2010). Кроме того, прибрежная полоса моря

испытывает наибольшее загрязнение органическими веществами, в том числе и

биогенного происхождения, как было сказано выше. Увеличение потоков

биогенных веществ, связанное с хозяйственной деятельностью на водосборе

(широким использованием минеральных удобрений в сельском хозяйстве,

поступлением коммунально-бытовых и промышленных стоков)

сопровождается эвтрофированием вод, оказывающим негативное влияние на

экологическое состояние устьевых и прибрежных экосистем (Ефимова, 2005).

Использование не оптимальной для условий роста микроорганизмов среды

может сказаться на численности и учете видового разнообразия сапротрофных

гетеротрофных бактерий. Поэтому для выявления максимального разнообразия

культивируемых форм морских микроорганизмов в среду были добавлены

86

дрожжевой экстракт (0,1 г/л) и гидролизат казеина (0,5 г/л), являющиеся

дополнительными источниками питательных веществ. Значение рН готовой

среды соответствовало 7,0. Однако спустя несколько пассажей

культивирования отмечено снижение значений водородного показателя

кислотности среды некоторыми образцами до 3,5-4,0, что свидетельствовало о

недостаточной буферной емкости среды, для увеличения которой и

стабилизации и поддержания на нужном уровне рН использовали фосфатный

буфер (K2HPO4 – 1,5 г/л; KH2PO4 – 0,75 г/л).

Для селективного выделения УВО микроорганизмов в качестве основного

источника углерода использовали товарную и сырую нефть Возейского

месторождения. Посевной материал вносили в количестве 1-2 г (мл) на 100 мл

среды. Нефть Возейского месторождения характеризуется как тяжелая, вязкая,

с высоким содержанием смол и асфальтенов. В связи с этим в жидкой среде с

добавлением сырой нефти наблюдали медленный рост микроорганизмов с

небольшим накоплением их биомассы. В варианте с внесением товарной нефти

был отмечен более высокий темп роста микробных клеток и деструкция

нефтяной пленки с образованием мицелл на поверхности раздела фаз. С целью

уменьшения плотности используемой нефти в дальнейшем ее смешивали с

дизельным топливом в соотношении 1:1. Культивирование образцов проводили

в условиях активного перемешивания среды для имитирования постоянного

волнения морских вод при температуре 4°С в напольном орбитальном шейкере.

В результате рост микроорганизмов в жидкой модифицированной среде

Таусона со смесью нефти и дизеля в качестве субстрата и источника энергии

визуально был более обильным. Всего из исследуемых образцов в селективных

условиях было получено 10 микробных сообществ (таблица 6). В качестве

контроля сравнения активности микроорганизмов в отношении УВ

использовали коммерческий биопрепарат «Микрозим-Петра».

87

Таблица 6. Селектированные из природных источников микробные

сообщества.

№

Условное

обозначение

микробного

сообщества

Источник выделения культуры Вид биоматериала

1 MZP Биопрепарат «Микрозим-

Петра» Сухой порошок

2 Nskv

Акватория порта г. Мурманск

Почва с корнями

прибрежных растений

3 Nsk1 Мелкие фрагменты

бурых водорослей

4 Nsk2 Смесь бурых водорослей

5 Nsk3 Смесь бурых водорослей

6 Nna

Озеро без названия на юго-

западе Ненецкого автономного

округа

Пресная вода с образцом

нефти на ватном

носителе

7 B7

Порт г. Баку

Смесь

нефтезагрязненной

почвы и пенопласта

8 B8 Смесь морской воды и

почвы

9 B9

Смесь разных почв из

мест нефтяного

загрязнения

10 NskR

Пос. Росляково Мурманской

области, слив

канализационного коллектора

Смесь бурых и зеленых

водорослей с грунтом

литорали

11 Csha2 Порт г. Кандалакша Смесь бурых и зеленых

водорослей

88

В ходе селекции провели не менее 30 пассажей культивирования

выделенных микробных сообществ на среде с УВ при температуре

культивирования 4°С и концентрации NaCl в количестве 30 г/л. В результате

исследования из загрязненных УВ проб были получены четыре наиболее

активных УВО микробных сообщества Nsk1, Nsk3, B8 и Csha2, проявившие

стабильность морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств.

Эти сообщества были взяты для дальнейших исследований. Отбор проб, из

которых было выделено микробное сообщество В8, проводили в ноябре 2013 г.,

при температуре окружающей среды около 0-5°С. Поэтому неудивительно, что

среди микроорганизмов, составляющих данное сообщество, есть

психроактивные представители, способные окислять УВ нефти при низких

температурах. При отборе использовали следующие показатели: помутнение

среды (водной фазы), изменение ее цвета, образование осадка, изменение

свойств нефти, а также снижение рН культуральной жидкости (рис. 10).

Следующим этапом работы стояло выявление микробного разнообразия и

количественный учет микроорганизмов. С помощью световой и фазово-

контрастной микроскопии было исследовано наличие в культивируемых

образцах роста биомассы в среде с УВ и проведена оценка морфологического

разнообразия форм микроорганизмов. Обнаружено, что микробные сообщества

Nsk1, Nsk3 и Csha2 были представлены многочисленными одиночными

клетками, а так же их агрегатами (рис. 11). Среди них встречались подвижные и

неподвижные формы, представленные кокками (одиночными и в цепочках),

сарцинами, актиномицетами, прямыми и изогнутыми палочками размерами от

очень мелких до крупных. В сообществе B8 выявлены клетки дрожжей,

которые преобладали над остальными формами.

89

Рисунок 10. Рост микробного сообщества Csha2 в жидкой

модифицированной среде Таусона со смесью нефти и дизельного топлива в

сравнении с контрольной незасеянной средой при 4°С.

Рисунок 11. Морфологическое разнообразие сообществ Csha2 (А) и B8

(Б). Фазово-контрастная микроскопия, увеличение х900.

Микроскопические исследования показали, что клетки разных УВО

микроорганизмов имеют различный характер прикрепления к каплям нефти:

некоторые из них локализованы на поверхности капель нефти и вокруг них, в

90

то время как другие, например, дрожжи, колонизируют внутреннее

пространство капли (рис. 12).

Рисунок 12. Взаимодействие клеток микроорганизмов с каплями жидких

УВ. Фазово-контрастная микроскопия, увеличение х900. Примечание. А –

локализация клеток микроорганизмов вокруг капель нефти и внутри них; Б –

колонизация клетками дрожжей внутреннего пространства капли нефти.

Подобный характер взаимодействия дрожжевых клеток с каплями нефти

был отмечен в исследованиях других авторов. Так, штамм Y. lipolytica CMGB32

спустя 72 часа культивирования на пептонной среде с 1% нефти образовывал

сложные псевдогифы и нефтяные мини-капельки с «вторгшимися» в них

дрожжевыми клетками (Csutak et al., 2015). Вероятно, характер взаимодействия

клеток с гидрофобным субстратом в значительной степени определяется их

способностью к синтезу биоэмульгирующих веществ определенного типа. Судя

по всему, проникновение клеток микроорганизмов внутрь нефтяной капли

обусловлено способностью к снижению межфазного натяжения, вязкости

нефти за счет разрушения ее молекулярной структуры и синтезу внеклеточных

биоПАВ, которые выделяются клетками в среду культивирования и

солюбизируют нефтяную пленку. Расположение клеток на поверхности капель

УВ может быть связано с увеличением гидрофобности клеточных

91

поверхностей, обеспечивающих адгезию микроорганизмов (Fickers et al., 2005),

продукцией клеточно-связанных биоПАВ, которые облегчают поглощение и

транспорт УВ субстрата в клетки.

С целью выбора оптимальной среды культивирования применяли широко

используемый в микробиологической практике метод посева на различные

твердые элективные питательные среды. Было испытано 4 варианта сред:

Plate-Count-Agar (PCA) (г/л): гидролизат казеина – 5,0; дрожжевой

экстракт – 2,5; D(+)-глюкоза – 1,0; агар – 14, рН 7,0.

Модифицированный PCA (г/л): K2HPO4 – 0,5; MgSO4 – 1,0; (NH4)2SO4 –

4,0; NaCl – 30, гидролизат казеина – 5,0; дрожжевой экстракт – 2,5; D(+)-

глюкоза – 1,0; агар –14, рН 7,0.

Среда № 2 (ГРМ) Сабуро (г/л): панкреатический гидролизат рыбной муки

– 10,0; панкреатический гидролизат казеина – 10,0; дрожжевой экстракт –

2,0; NaH2PO4 – 2,0; Д-глюкоза – 40,0; агар – 10, рН 7,0.

Среда Таусона (г/л): K2HPO4 – 0,5; MgSO4 – 1,0; (NH4)2SO4 – 4,0; NaCl –

30, агар – 20, рН 7,0.

Результаты анализа общей микробной численности в исследуемых

микробных сообществах представлены в таблице 7.

Таблица 7. Численность клеток в микробных сообществах на разных типах

сред.

Микробное

сообщество РСА

РСА

(модиф.) Среда Сабуро Среда Таусона

КОЕ/мл

Nsk1 (4,0±0,05)*105 (1,0±0,04)*10

7 (4,0±0,12)*10

5 (0,4±0,02)*10

5

Nsk3 (2,7±0,03)*105

(1,0±0,09)*107 (1,0±0,05)*10

6 (3,0±0,04)*10

6

B8 (5,0±0,07)*105 (2,0±0,20)*10

7 (4,3±0,03)*10

6 (8,4±0,15)*10

5

Csha2 (1,5±0,04)*107 (3,9±0,10)*10

7 (3,4±0,23)*10

6 (8,0±0,04)*10

7

Биопрепарат (3,5±0,03)*107 (3,4±0,04)*10

7 (5,9±0,05)*10

6 (4,0±0,03)*10

6

92

Как видно из таблицы, на среде Таусона рост микроорганизмов был

достаточно обильным, но размеры колоний достигали менее 0,5-1 мм в

диаметре, в связи с чем их подсчет был затруднен. На среде Сабуро в

большинстве случаев наблюдали сплошной рост бактерий практически без

разделения их на отдельные колонии, что, вероятно, связано с присутствием

избытка органических веществ в исследуемой среде. На модифицированной

среде РСА титр клеток был наивысшим. Кроме того, при этом наблюдали

наибольшее разнообразие колоний микроорганизмов. Эта среда содержит

набор минеральных солей и органических веществ в отличие от всех остальных

сред, что способствует наиболее полному выявлению видов микроорганизмов и

более точному учету численности гетеротрофных морских микроорганизмов на

питательной среде. Помимо этого, соленость модифицированной среды РСА

(30 г/л) позволяет осуществлять отбор морских микроорганизмов, устойчивых к

концентрациям соли более 10 г/л. Поэтому состав данной среды был признан

наиболее оптимальным для дальнейших исследований.

Для этих микробных сообществ был определен температурный диапазон

роста, способность к продукции биоэмульгаторов и деструкции нефтяных УВ.

4.1.3. Исследование температур роста микробных сообществ

Температурный диапазон роста УВО микроорганизмов определяли

методом предельных разведений по количеству колониеобразующих единиц

(КОЕ) на единицу объема плотной питательной среды при температурах

культивирования 4, 10 и 20°С. Подсчет колоний, инкубацию которых

проводили при 20°С, осуществляли спустя 2 суток после засева; при 10°С –

спустя 3 суток и при 4°С – спустя 5 суток. Результаты исследования

представлены в таблице 8.

93

Таблица 8. Численность клеток в микробных сообществах при разных

температурах культивирования.

Микробное

сообщество

Температура культивирования, °С

20 10 4

КОЕ/мл

Nsk1 (6,7±0,02)*107 (8,7±0,03)*10

7 (7,2±0,10)*10

7

Nsk3 (6,8±0,12)*107 (7,7±0,05)*10

7 (7,1±0,06)*10

7

B8 (1,1±0,23)*108 (9,1±0,04)*10

7 (1,4±0,05)*10

7

Csha2 (1,2±0,06)*107 (9,0±0,06)*10

8 (1,2±0,03)*10

8

Как видно из таблицы, наиболее оптимальной температурой роста всех

сообществ, за исключением сообщества В8, являлась температура 10°С. При

этом микробные консорциумы Nsk1, Nsk3 и Csha2 при 4°С показали более

интенсивный рост, чем при 20°С. Общая микробная численность в данных

сообществах при самой низкой температуре эксперимента достигала не менее

107 КОЕ/мл, а в случае сообщества Csha2 - до 10

8 КОЕ/мл. Схожие результаты

были получены в исследованиях других авторов. Так, численность клеток УВО

микроорганизмов, выделенных из морской воды Тронхеймс-фьорд (Норвегия),

при 5°С составляла (1,77±0,31)*108 кл/мл (Brakstad, Bonauet, 2006). Сообщество

В8 проявило наилучший рост при 20°С, однако при более низкой температуре

титр клеток был незначительно ниже.

Температурный диапазон роста выделенных микроорганизмов также был

исследован в жидкой среде на примере сообществ Nsk1 и Csha2. Показано, что

данные микробные сообщества активно растут при температуре 4-20°С, о чем

свидетельствуют результаты кинетических исследований, представленные на

рисункe 13 (a, б). Это позволяет предположить о наличии среди

микроорганизмов, составляющих данные консорциумы, как психрофильных,

так и психроактивных и даже мезофильных представителей. Данный факт

свидетельствует о широких метаболических возможностях данных сообществ.

94

Культивирование микроорганизмов при 20°С показало, что все они

достигают максимума ОП (1,7-2,3 ед. ОП) уже на начало вторых суток

культивирования (рис. 13а).

Рисунок 13. Динамика роста микробных сообществ в модифицированной

среде Таусона с глюкозой. Примечание: а - при 20°С; б – при 4°С. Микробные

сообщества: ▲ – Nsk1; ● – Csha2.

При культивировании микробных сообществ на модифицированной среде

Таусона при 4°С максимальное значение ОП биомассы, достигавшее 3,1 ед. ОП

для сообщества Nsk1 и 4,0 ед. ОП для Csha2, наблюдали на 13 сутки, однако

уже на 14 сутки культивирования регистрировали ее резкое снижение (рис. 13б)

Особенностью роста исследуемых микробных сообществ было то, что они

достигали большей оптической плотности при пониженных температурах

культивирования, чем при оптимальных. Таким образом, несмотря на снижение

скорости роста, вероятно, обусловленной снижением константы химических

реакций, по сравнению с сообществами, растущими при более высоких

температурах, конечная концентрация клеток в целом была более высокой при

4°С культивирования. Это может свидетельствовать о наличии в исследуемых

микробных сообществах психрофильных микроорганизмов, которые при 20°С

представляют собой минорный компонент сообщества, в то время как

пониженная температура создает условия для их роста и развития с

последующим доминированием в сообществе. В целом, судя по достаточно

95

широкому температурному диапазону роста микроорганизмов, можно

заключить, что выделенные микробные сообщества являются

психроактивными.

4.1.4. Биоэмульгирующая активность микробных сообществ

По литературным данным, процесс утилизации субстратов в окружающей

среде, в частности, углеводородов, может находиться под регуляторным

контролем поступающих в среду легкометаболизируемых углеводов (Rosenberg

et al., 1992; Гузев и др., 1997; Сребняк и др., 2008). С целью подтверждения

гипотезы, что образование ПАВ, как и других продуктов микробного синтеза,

зависит от условий выращивания продуцента, микробные сообщества

выращивали на двух типах сред при разных температурах (4 и 20°С).

Визуально оценивали степень эмульгации, соотнося ее с цифровой

шкалой от 0 до 3. Устойчивая без перемешивания в течение часа эмульсия,

состоящая из мелкодисперсных частиц, образование которой сопровождалось

изменением цвета нефти с черного на бурый, оценивалась в 3 балла; устойчивая

до нескольких десятков минут эмульсия в виде мицелл типа «масло в воде» и

«вода в масле» – в 2 балла; эмульсия в виде крупных мицелл и плотных частиц

УВ – в 1 балл; отсутствие эмульгирующей активности в пробе, наличие в колбе

нефтяной пленки или нераспределенной комковатой массы нефтепродуктов

оценивали в 0 баллов. Согласно данной методике эмульгирующая активность

сообществ Csha2 и Nsk2 соответствовала 3 баллам, а активность сообщества

Nsk1 - 2 баллам.

Методом Купера (Cooper, Goldenberg, 1987) устойчивые эмульсии были

обнаружены только у сообщества Nsk1 (таблица 9). Наибольшую продукцию

сурфактантов наблюдали при росте сообщества в жидкой модифицированной

среде на основе РСА при 20°С, однако на модифицированной среде Таусона

при обеих температурах значения индекса эмульгирования так же были

высокими. Эмульсии, полученные при низкой температуре, отличались

стабильностью и устойчивостью в течение суток.

96

Таблица 9. Определение индекса биоэмульгации при различных условиях

культивирования.

Микробное

сообщество

Индекс эмульгирования, %

Модифицированная среда на

основе РСА Модифицированная среда Таусона

Сразу после

встряхивания Спустя 24 ч

Сразу после

встряхивания Спустя 24 ч

20°С 4°С 20°С 4°С 20°С 4°С 20°С 4°С

Nsk1 65,9 25,9 50,0 22,2 47,6 48,1 25,9 44,2

Csha2 0 3,7 0 0 2,4 24,0 0 0

Для сообщества Csha2 эмульгирующая активность показана только

непосредственно сразу после встряхивания клеточных суспензий с

гексадеканом, исчезавшая спустя 24 ч. Однако при культивировании в среде с

добавлением нефти у данного микробного сообщества визуально

обнаруживалась наивысшая по сравнению с сообществом Nsk1 способность к

образованию коллоидных растворов, проявлявшаяся в расслоении нефтяной

пленки, образовании мицелл и микроэмульсий нефти (рис. 14). В данном

случае нефть рассеивалась в толще воды в виде капель, вследствие чего

нефтяные УВ оказались более доступны для микробной деструкции. Отмечено

и изменение консистенции нефтепродукта, цвета среды культивирования, что

свидетельствует о превращении нефти в эмульсию, т.к. под действием

микроорганизмов происходит разрыв длинных углеродных цепей на более

короткие составляющие. На основании полученных результатов можно

предполагать об индуктивной природе синтеза биосурфактантов этой

ассоциацией микроорганизмов. Возможно, продуценты биоПАВ в исследуемом

консорциуме синтезируют сурфактанты эндо-типа, прочно связанные с

клеточной стенкой, вследствие чего их обнаружение методом Купера

затруднено.

97

Рисунок 14. Образование мицелл нефти микробным сообществом Csha2 в

модифицированной среде Таусона при 4°С.

4.1.5. Количественная оценка деструкции углеводородов микробными

сообществами

Степень деструкции УВ оценивали в трех микробных сообществах Csha2,

Nsk3 и B8, из которых проводили выделение чистых культур. Все сообщества

представляли собой накопительные культуры, в которых селективным

фактором служила способность окислять УВ. Деградацию компонентов нефти

оценивали при 4°С в условиях периодического культивирования в жидкой

минеральной среде Таусона гравиметрическим методом. В качестве контроля

использовали отдельные колбы с питательной средой с добавлением 1 мл смеси

товарной нефти и дизельного топлива (НД), находившиеся в шейкере вместе с

опытными образцами в течение соответствующих промежутков времени для

учета испарения легких фракций нефти. Товарная нефть Возейского

месторождения (плотность 37,9оAPI, cернистость 0,66%), характеризуется как

тяжелая, вязкая, с высоким содержанием смол и асфальтенов. Поэтому с целью

уменьшения плотности нефти использовали добавку дизельного топлива (ДТ)

как одного из наиболее распространённых нефтепродуктов.

98

Эксперименты по деструкции УВ нефти и ее производных, проведенные с

тремя природными микробными сообществами, показали, что сообщества Nsk3

и Csha2 обладают схожей деструктивной активностью, как в первые 10 суток

культивирования, так и к 20-м суткам эксперимента, несмотря на разницу в

численности клеток (таблица 10). Максимальная суммарная степень деструкции

УВ при этом достигала 50 и 59%, соответственно. Для сообщества В8,

полученного из нефтезагрязненных участков воды Каспийского моря (г. Баку)

при температуре 8-10°С показано, что к 10-м суткам эксперимента убыль УВ

составляла около 15%, и скорее всего, была обусловлена физическим

испарением летучих УВ. В дальнейшем деструктивная способность данного

микробного сообщества возрастала, о чем свидетельствовал показатель убыли

УВ, составлявший 42% к 20-м суткам. Полученные результаты были

сопоставимы с литературными данными. Так, ранее было показано, что степень

деградации нефти при 5°С спустя 14 суток культивирования для разных

микробных сообществ составила от 21 до 70% (Mulkins-Phillips, Stewart, 1974).

Таблица 10. Численность клеток микробных сообществ и суммарная

степень деструкции УВ, измеренная весовым методом, в жидкой минеральной

среде Таусона при 4°С.

№ Название

культуры

Численность

клеток, 10

суток, КОЕ/мл

Численность

клеток, 20

суток, КОЕ/мл

Убыль УВ,

10 суток, %

Убыль УВ,

20 суток, %

1 Nsk3 (8,5±0,30)*109 >10

10 31 50

2 B8 (5,3±0,49)*109 >10

10 15 42

3 Csha2 (1,8±0,06)*108 >10

10 32 59

Качественный и количественный анализ убыли отдельных компонентов

нефти, в частности, среднекипящей фракции УВ, проводили методом газо-

жидкостной хроматографии (ГЖХ). В состав среднекипящей фракции УВ

входят алканы и нафтены с длиной цепи С12-С24. В ходе анализа для каждой

99

пробы были получены концентрации индивидуальных н-алканов и изоалканов в

мкг/мл, а также суммарные значения их убыли для среднекипящей фракции,

представленные в таблице 11 в процентном содержании относительно контроля

– пробы, не содержавшей клетки микроорганизмов. Показано, что спустя 20

суток эксперимента степень утилизации н-алканов и изоалканов сообществами

Nsk3 и Csha2 была примерно одинакова (91,3% и 95,0%) и выше, чем у

сообщества В8 (64,0%), что соотносится с результатами гравиметрии. По

результатам хроматографического анализа можно сделать вывод, что

микроорганизмы исследуемых сообществ Nsk3 и Csha2 практически полностью

подвергают деструкции среднекипящую фракцию нефти, а именно бензиновую,

керосиновую и соляровую фракции, и обладают более высоким потенциалом в

отношении УВ нефти по сравнению с сообществом В8.

Таблица 11. Количественная оценка деградации УВ нефти сообществами

микроорганизмов, измеренная газо-хроматографическим методом.

Компонент

Название культуры

Nsk3 B8 Csha2

Убыль УВ спустя 20 суток, %

С17 - 81,6 -

i-C17 80,0 82,6 -

С18 96,4 66,7 -

i-C18 61,8 71,2 82,6

С19 91,9 60,8 94,8

С20 93,7 59,4 95,6

С21 95,6 58,5 97,2

С22 95,5 58,9 97,1

С23 95,1 58,0 96,4

С24 94,8 59,3 -

100

Σ убыль 91,3 64,0 95,0

ki - 0,45 -

Примечание. «-» - данные отсутствуют.

На рисунке 15 представлена хроматограмма, отражающая деструкцию УВ

микробным сообществом Csha2 в сравнении с контролем, не содержавшим

микроорганизмы.

Рисунок 15. Хроматограмма экстракта контрольного образца смеси

товарной нефти Возейского месторождения и дизеля без добавления

микроорганизмов (черная линия) и в присутствии микробного сообщества

Csha2 (красная линия).

На хроматограмме зафиксировано значительное изменение содержания

нормальных алканов С16–С24 микроорганизмами, а также изопреновых УВ. С

возрастанием длины углеводородной цепи степень деструкции снижалась,

однако отмечена высокая степень утилизации УВ с большим числом атомов

углерода: пентакозана, гептакозана, генаконтана и т.д.

101

Алканы С15-С24 классифицируются как полулетучие органические

компоненты. Из этого следует, что при определении степени деструкции нужно

учитывать и фактор испарения. Для диагностики интенсивности

биохимических преобразований исходных нефтепродуктов и оценки вклада

микробной деградации рассчитывали углеводородный индекс ki, т.е. отношение

суммы изопреноидных алканов пристана и фитана (i-C17 и i-C18,) к сумме н-

алканов (С17 и С18):

ki=(i-С17+i-С18)/(н-С17+н-С18)

Во время культивирования микроорганизмов, а также в процессе

экстракции во всех образцах произошло полное испарение соединений С10-С16,

алкана С17 в образцах Nsk3 и Csha2, и в последнем случае – пристана и

октадекана. Поэтому расчет углеводородного индекса оказался возможен

только для сообщества B8, и равнялся 0,45 (ki контрольного образца составлял

0,49). Увеличение значения углеводородного индекса по сравнению со

значением для контрольного образца, как правило, свидетельствует о

ферментативной деградации УВ клетками микроорганизмов. Уменьшение

количества алканов н-C17 по отношению к пристану и н-C18 по отношению к

фитану так же является показателем микробного участия в убыли УВ (Frysinger

et al., 2011). Как видно из таблицы 12, количество УВ в отношении н-

C17/пристан и н-C18/фитан для сообщества В8 снизилось незначительно, что еще

раз подтверждает отсутствие микробной деградации. Однако при этом не

учитывается фактор микробной биоэмульгации, в ходе которой происходит

диспергирование нефтяной пленки и увеличение площади ее поверхности,

вследствие чего убыль УВ может возрастать. Гравиметрическим анализом было

установлено, что в промежуток времени от 10 до 20 суток эксперимента

интенсивность убыли УВ увеличивалась, что подтверждено

хроматографическим анализом. Из представленной на рисунке 16

хроматограммы видно, что в присутствии микроорганизмов сообщества В8

происходит заметное снижение концентраций УВ среднекипящей фракции.

102

Таким образом, можно предположить, что убыль УВ микробного

сообщества В8 к 20-м суткам эксперимента осуществляется преимущественно

за счет образования большого количества микробных ПАВ, которые

солюбизируют нефть и являются причиной увеличения скорости ее испарения.

Поэтому в данном случае именно процесс эмульгации вносит существенный

вклад в убыль УВ.

Рисунок 16. Хроматограмма экстракта контрольного образца смеси

товарной нефти Возейского месторождения и дизеля без добавления

микроорганизмов (черная линия) и в их присутствии микробного сообщества

В8 (красная линия).

Вместе с тем, для сообщества Nsk3 разница в количестве компонентов в

соотношении C18/фитан была значительной, что позволяет говорить о

несущественном вкладе физического удаления УВ вследствие испарения и

преимуществе микробной деградации. По данным газо-хроматографического

анализа в проведенных ранее исследованиях (Kristensen et al., 2015), в образцах

воды из Северного моря (Дания) количество алканов с длиной цепи больше С14

спустя 15 и 71 суток эксперимента снизилось незначительно (до 93,6 ± 3,3% от

103

исходных значений для отношения C17/пристан и до 96,3 ± 3,1% для отношения

C18/фитан), что говорило об отсутствии микробной деградации. В то же время

образцы из залива Диско (Гренландия) демонстрировали снижение количества

УВ до 9,2 ± 8,0% для отношения C17/пристан и до 9,2 ± 6,8% для отношения

C18/фитан, удостоверяя, что в данном случае убыль УВ происходила именно за

счет биодеградации.

Таким образом, в результате скрининга в селективных условиях в

присутствии УВ нефти были получены 4 психроактивных микробных

сообщества. На основании экспериментов по определению способности данных

сообществ к продукции биоэмульгаторов и деструкции нефтяных УВ при

пониженной температуре было установлено, что микроорганизмы,

составляющие данные консорциумы, обладают высоким биотехнологическим

потенциалом, имеющим большое практическое значение для решения проблем

очистки окружающей среды северных регионов от нефтяных загрязнений.

Поэтому следующим этапом работы стояло выделение из данных сообществ

чистых культур микроорганизмов – активных деструкторов нефти и

исследование их физиолого-биохимических свойств.

4.2. Выделение и селекция чистых культур микроорганизмов,

активных в отношении углеводородов

Известно (Коронелли, 1996б), что способность микроорганизмов к

эмульгированию нефти часто ассоциирована с УВО активностью, однако

многие из этих организмов продуцируют биосурфактанты, но не способны

расщеплять УВ. Вместе с тем, присутствие таких микроорганизмов приводит к

солюбилизации нефти, что повышает ее доступность как источника

питательных веществ для клеток микроорганизмов-нефтедеструкторов и

облегчает ее биодеградацию (Guha, Jaffe, 1996; Olivera et al., 2003). Кроме того,

при эмульгировании нефтепродуктов происходит увеличение удельной

площади взаимодействия поверхности углеводородных капель с жидкой и

газовой фазами, что способствует интенсификации процесса испарения УВ с

104

водной поверхности (Barkay et al., 1999). Следовательно, в качестве основы для

биопрепаратов должны быть использованы штаммы микроорганизмов, как

способные к ферментативному окислению УВ, так и продуцирующие

биосурфактанты различных типов. Вместе с тем, поиск, выделение и селекцию

микроорганизмов, способных к утилизации УВ в условиях северных регионов,

необходимо проводить в условиях их адаптации к пониженным температурам и

различным компонентам нефти.

Для выделения чистых культур, активных в отношении нефти, была

разработана новая методика, суть которой заключается в следующем. Готовили

ряд последовательных разведений 10-1

-10-4

накопительных культур, после чего

проводили высев 10 мкл каждого разведения на поверхность плотной

питательной среды. Посевы инкубировали при 4°С в течение нескольких суток

до появления видимых колоний, после чего их накрывали стерильным

целлюлозным фильтром, предварительно пропитанным стерильной смесью

нефти и дизельного топлива в отдельной чашке Петри.

Известен способ внесения УВ непосредственно в процессе приготовления

плотной питательной среды. Для этого нефть или нефтепродукты добавляют в

немного охлажденную агаризованную среду количестве 1,0-10,0 мас.% от

количества среды, компоненты тщательно перемешивают. В результате

образуется однородная эмульсия, в которой распределены УВ. После этого

эмульсию разливают в культуральные емкости (чашки Петри), и после

застывания среды вносят посевной материал. Однако, поскольку нефть легче

воды, она всплывает к поверхности плотной питательной среды,

концентрируясь в ее верхнем слое. Кроме того, внесение посевного материала

сопровождается удалением части УВ с поверхности среды инструментами

засева.

В предлагаемом методе были использованы целлюлозосодержащие

материалы, пропитанные УВ. В ходе работы тестировали следующие виды

целлюлозосодержащих материалов: тканая салфетка, бумажная салфетка,

мембранный фильтр и бумажный фильтр. Наиболее обильный и активный рост

105

микроорганизмов наблюдали под бумажным фильтром, поэтому он был

использован для дальнейших испытаний.

Показателем активности культур в отношении УВ нефти являлось

появление на фильтрах зон осветления в местах роста колоний в течение

времени от нескольких минут до нескольких суток и дальнейший рост колоний

не только под фильтрами, но и на их поверхности (рис. 17). Сохранение

ферментативной активности клеток после тесного контакта с углеводородной

смесью свидетельствует об устойчивости микроорганизмов к возможному

токсическому воздействию УВ, обусловленной не только активностью УВО

ферментной системы, но и синтезом ПАВ, ускоряющих микробную

биодеградацию.

Рисунок 17. Осветление пропитанных углеводородной смесью

целлюлозных фильтров в местах роста колоний микроорганизмов.

Колонии культур, осветляющие фильтры с УВ спустя несколько минут

после их аппликации, судя по всему, являются активными продуцентами

эмульгирующих веществ, выделяющими большое количество внутриклеточных

биоПАВ. Данное предположение соотносится с литературными данными, из

106

которых следует, что клетки микроорганизмов с гидрофобной клеточной

поверхностью, продуцирующие клеточно-связанные биоПАВ, способны к

непосредственному контакту с нефтепродуктами, в то время как

микроорганизмы с гидрофильными оболочками вынуждены предварительно

выделять биоэмульгаторы УВ (Волченко, 2006). Кроме того, присутствие в

окружающей среде УВ активирует у микроорганизмов-деструкторов синтез

биоПАВ, которые выступают в роли стимуляторов бактериальных клеток к

потреблению УВ (Коронелли, Юферова, 1990). Поэтому появление зон

осветления на фильтрах спустя несколько суток после аппликации и появление

роста колоний на поверхности фильтра может быть связано с активностью как

внеклеточных, так и внутриклеточных биоПАВ, а также с индукцией синтеза

ферментных окислительных систем.

Фильтр с УВ можно наносить и на поверхность только что засеянной

микроорганизмами среды, т.е. до появления отчетливого роста колоний. В этом

случае количество выросших колоний и микробное разнообразие уменьшается,

но с другой стороны, это позволяет выделить наиболее устойчивые формы

нефтедеструкторов.

Зоны осветления фильтров были исследованы с помощью метода СЭМ.

Выявлено, что поверхность целлюлозного волокна преимущественно неровная,

содержит множество бороздок и впадин разного размера и глубины. На

волокнах фильтра присутствуют хорошо различимые единичные микробные

клетки различных размеров и форм, а также их скопления и конгломераты (рис.

18). Отдельные крупные клетки и их скопления, как правило, неплотно

прилегают к поверхности волокна, в то время как клетки меньшего размера и

конгломераты образуют прочное сцепление с волокном путем образования

матрикса и нитчатых тяжей, обеспечивающих закрепление клеток на носителе.

107

Рисунок 18. Скопление клеток микроорганизмов на волокнах фильтра в

зоне его осветления. Примечание. А – электронная микрофотография

целлюлозных волокон с клетками микроорганизмов; Б – накопительная

культура Nskv; В – накопительная культура Nsk1; Г – чистая культура

дрожжей, выделенная из сообщества В8. Сканирующая электронная

микроскопия.

Очевидно, что в формировании матрикса принимают участие и

поверхностно-активные вещества, имеющие различный состав. В работе

Кащеевой П.Б. сообщается, что в адсорбции микроорганизмов участвуют

108

пептидогликановые слои клеточной стенки, поэтому немаловажную роль

играет строение клеточной стенки (Кащеева, 2014). Кроме того, наличие

адгезинов и лектинов, обладающих гидрофобными свойствами, множественных

шишковидных и шиповидных выростов клеточной поверхности, жгутиков,

фибрилл, пилевидных поверхностных тяжей позволяет преодолевать

поверхностное отталкивание на начальных этапах прикрепления к носителю

(Ильина и др., 2004).

Способность к адгезии на нефтепродуктах является важным этапом в их

утилизации микроорганизмами, поскольку именно непосредственный контакт

клеток и гидрофобного субстрата делает возможным биодеградацию

последнего (Волченко, 2006). При этом для клеток исследуемых

микроорганизмов были характерны разные варианты адгезии к поверхности

волокон с УВ (Омарова и др., 2012): интрузия (внедрение) клеток в

целлюлозные волокна (а); ориентированное прикрепление клеток к

поверхности волокон (б); иммобилизация клеток на волокнах с помощью

плотного внеклеточного биополимерного матрикса, об образовании которого

свидетельствуют слои клеток, длинные нитевидные структуры и пустоты

между агрегатами клеток (в).

Следовательно, появление зон осветления фильтра происходит в

результате деятельности микроорганизмов, обладающих способностью активно

использовать УВ в своем метаболизме. Нефтепродукты, нанесенные на

поверхность фильтров, представляют собой дополнительный питательный

субстрат для клеток микроорганизмов, в результате сродства к которому и

происходит их прикрепление и иммобилизация.

Таким образом, был разработан метод, позволяющий в краткие сроки

провести поиск и отбор микроорганизмов, активных в отношении нефти, с

возможностью быстрой («экспресс») оценки их деструктивного потенциала по

скорости и степени осветления фильтров и появления колоний на них, а также

перспектив дальнейшего выделения чистых культур. Метод может быть

применим в различных температурных интервалах, в том числе и при низких

109

положительных температурах. При этом предложенный способ позволяет

проводить поиск наиболее эффективных деструкторов УВ даже в первых

разведениях посевного материала, зачастую теряющих таковых при

использовании традиционных подходов.

4.2.1. Идентификация исследуемых штаммов

Разработанным методом из состава исследуемых консорциумов были

выделены и взяты для дальнейших исследований 11 наиболее активных в

отношении УВ штаммов микроорганизмов. С целью их идентификации были

проведены исследования по изучению морфологических и физиолого-

биохимических признаков выделенных культур. Все штаммы были способны

расти на жидких и плотных средах с содержанием NaCl в количестве 30 г/л, при

рН среды от 5,5 до 7,5. Ростовые процессы у всех исследуемых

микроорганизмов наблюдали в широком температурном диапазоне (от 4°С до

25°С), на основании чего они были отнесены к психроактивным

(психротолерантным).

Из микробного сообщества Csha2 были выделены штаммы S1-S4.

Штаммы S2 и S3 образуют колонии среднего размера (около 1,5-2,5 мм),

светло-бежевые с сероватым оттенком, гладкие, блестящие, круглой формы, с

ровными краями, слабовыпуклые, однородной структуры, мягкой

консистенции, слизистые. При старении колонии становятся более крупными (d

= 4-5 мм), шероховатыми, с появлением выпуклости в центре. При

микроскопии мазков наблюдали подвижные прямые палочки, одиночные и в

парах (рис. 19.1). Клетки грамотрицательные. Не образуют эндоспор. Аэробы.

Оксидазоотрицательные. Каталазоположительные.

Штамм S4 образует гладкие, блестящие, круглой формы, с ровными

краями, выпуклые, однородной структуры колонии, мягкой консистенции,

слизистые, липкие. При старении колонии с трудом отделяются от поверхности

питательной среды, увеличиваются в размерах и полностью сливаются друг с

другом. При микроскопии мазков наблюдали подвижные прямые палочки,

110

одиночные и в парах (рис. 19.2). Клетки грамотрицательные. Спор не

обнаружено. Аэробы. Оксидазоотрицательные. Каталазоположительные.

Штамм S1 образует средние и крупные колонии размером около 1,5-2,5

мм, светло-розового цвета с бежевым оттенком, округлые и неправильной

формы, блестящие, гладкие, выпуклые, с ровным краем, однородной

структуры, мягкой маслянистой консистенции. При старении колонии

увеличиваются в размерах и сливаются друг с другом. Неподвижные длинные

палочки (рис. 19.3). Клетки грамположительные. Споры не образуют. Аэробы.

Оксидазо- и каталазоположительные.

Штамм S1, выделенный из сообщества Nsk3, образует мелкие колонии

размером до 0,5-1,2 мм светло-желтого цвета, округлые, блестящие, гладкие,

выпуклые, с ровным краем, однородной структуры, мягкой консистенции.

Мелкие неподвижные палочки. Клетки грамположительные. Споры не

образуют. Аэробы. Оксидазо- и каталазоположительные.

Штамм S2, выделенный из той же накопительной культуры, образует

колонии размером до 1,2-1,5 мм, округлые, блестящие, гладкие, выпуклые, с

ровным краем, однородной структуры, мягкой консистенции. Цвет колоний

менялся от светло-желтого в начале роста до ярко-оранжевого при старении.

Мелкие неподвижные палочки (рис. 19.5). Клетки грамположительные. Споры

не образуют. Аэробы. Оксидазо- и каталазоположительные.

Штамм S3 образует колонии размером до 1,2 мм, бледно-розового цвета,

круглые, блестящие, слабовыпуклые, однородной структуры, мягкой

консистенции, с ровным краем. Неподвижные палочки (коккобациллы),

одиночные и в скоплениях (рис. 19.4). Клетки грамотрицательные. Аэробы.

Оксидазо- и каталазоположительные.

Штамм S4 образует колонии размером до 2,0-2,5 мм, желтого цвета,

круглые, блестящие, выпуклые, однородной структуры, мягкой консистенции, с

ровным краем. Неподвижные короткие палочки. Клетки грамположительные.

Спор не обнаружено. Аэробы. Оксидазоотрицательные.

Каталазоположительные.

111

Штамм S5 образует средние и крупные колонии размером до 3,0-3,5 мм,

кораллового цвета, круглые, блестящие, выпуклые, однородной структуры,

мягкой консистенции, с ровным краем в начале роста и зубчатым при старении

колоний. Подвижные палочки (рис. 19.6). Клетки грамотрицательные. Спор не

обнаружено. Факультативные анаэробы. Оксидазо- и каталазоположительные.

Рисунок 19. Морфология выделенных чистых культур бактерий. Фазово-

контрастная микроскопия, увеличение х900. Примечание. 1-3 – штаммы S3, S4,

S1, выделенные из сообщества Csha2; 4-6 – штаммы S3, S1, S5, выделенные из

сообщества Nsk3. Масштаб: 1-5 – 10 мкм.

Штамм S1 из микробного сообщества B8 образует кремовые, матовые,

плоские, с неровным краем, при старении - складчатые, размером до 3-4 мм.

Штамм представлен овальными почкующимися дрожжевыми клетками,

сфероидальными, эллипсоидальными и удлиненными, единичными или в

цепочках. Спор не образует. Аэроб.

112

Штамм S2 из того же микробного сообщества образует колонии кремово-

белого цвета, матовые, слегка выпуклые в центре, при старении – складчатые, с

неровным краем, размером до 3-4 мм. Штамм представлен овальными

почкующимися дрожжевыми клетками, сфероидальными, эллипсоидальными и

удлиненными, единичными или в цепочках. Спор не образует. Аэроб.

После определения основных физиолого-морфологических характеристик

штаммов была проведена их идентификация. На основании анализа

нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и фрагментов ITS региона

дрожжей (таблица 12), морфологических и физиолого-биохимических

особенностей было установлено, что 3 штамма из сообщества Csha2 (S2-S4) и 2

штамма из сообщества Nsk3 (S3, S5) относятся к классу γ-Proteobacteria.

Ближайшими гомологичными последовательностями этих штаммов являются

последовательности трех родов: Cobetia, Psychrobacter и Shewanella. Один

штамм из сообщества Csha2 (S1) и три штамма, выделенные из сообщества

Nsk3 (S1, S2, S4), принадлежат филогенетической группе Actinobacteria и

относятся к родам Arthrobacter, Nocardia, Salinibacterium. Из микробного

сообщества В8 были выделены 2 штамма, которые согласно результатам

BLAST-анализа были наиболее близки к виду Yarrowia lipolytica CBS 6124,

относящемуся к филуму Ascomycetes, классу Saccharomycetes.

Таблица 12. Таксономическая принадлежность микроорганизмов,

активных в отношении УВ нефти.

Микробное

сообщество

Штамм

Ближайший

родственный

микроорганизм

Сходство, %

Номер

типового

штамма

Csha2

S1 Nocardia coeliaca 99,9 DSM44595;

FR733721

S2 Cobetia marina 100 DSM 4741;

AJ306890

113

S3 Cobetia marina 100 DSM 4741;

AJ306890

S4 Cobetia marina 99,9 DSM 4741;

AJ306890

B8 S1 Yarrowia lipolytica 97,8 CBS 6124

S2 Yarrowia lipolytica 98,4 CBS 6124

Nsk3

S1 Arthrobacter rhombi 99,4 F98.3HR69;

Y15885

S2 Arthrobacter rhombi 99,5 F98.3HR69;

Y15885

S3 Psychrobacter cibarius 99,5 JG-219;

AY639871

S4 Salinibacterium

amurskyense 99,1

KMM 3673;

AF539697

S5 Shewanella vesiculosa 98,7 M7;

AM980877

В результате были идентифицированы штаммы арктических морских

микроорганизмов, которые, по литературным данным, являются характерными

представителями биоценозов морской среды, обитающими в психрофильных и

психроактивных условиях при температуре окружающей среды +5-+15°С и

способны к утилизации УВ загрязнений (Han et al., 2003; Bankar et al., 2009;

Bozal et al., 2009; Dziewit et al., 2013; Ibacache-Quiroga et al., 2013; Abd-Elnabya

et al., 2016). Так, Cobetia marina (DSMZ 4741), ранее описанная как Arthrobacter

marina, Pseudomonas marina, Pseudomonas halodurans, Deleya marina,

Halomonas halodurans, а также как Halomonas marina (Arahal et al., 2002) была

впервые выделена из приморской морской воды в Вудсхоле (США) в 1970 году

(Cobet et al., 1971). Есть сведения, что эти бактерии часто ассоциированы с

поверхностью макроводорослей (Ivanova et al., 2002; Ivanova et al., 2005; Lelchat

et al., 2015), что подтверждается нашими исследованиями, поскольку

114

источником выделения штаммов Cobetia marina S2, Cobetia marina S3 и Cobetia

marina S4 являлась смесь нефтезагрязненных водорослей р. Fucus.

Представители родов Arthrobacter, Cobetia, Nocardia, Psychrobacter, Shewanella

неоднократно были обнаружены в Арктике в качестве компонентов

растительной биоты, почвы, воды и донных осадков (Margesin, Miteva, 2011;

Zhang et al., 2014; Moghadam et al., 2016). Представители р. Cobetia (Cobetia

marina), Arthrobacter, Shewanella ранее были обнаружены в составе

гетеротрофного бактериопланктона Кандалакшского залива Белого моря

(Pesciaroli et al., 2012), однако, по нашим данным, среди них не был упомянут

вид Nocardia coeliaca. Таким образом, бактерия Nocardia coeliaca впервые

выделена из образцов нефтезагрязненных бурых водорослей Белого моря.

Кроме того, впервые установлено, что Nocardia coeliaca является не только

представителем морской УВО планктонной микробиоты, но и УВО эпифитона

макроводорослей Белого моря.

Бактерия Salinibacterium amurskyense (KMM 3673) ранее была

обнаружена в морских осадках Чукотского моря (Yuan et al., 2014). Показано,

что данный вид способен к деградации таких полиароматических соединений,

как нафталин, фенантрен и пирен (Isaac et al., 2013). В некоторых

исследованиях сообщается, что в образцах из Баренцева моря ранее были

обнаружены штамм Psychrobacter sp. P11F6 и штамм Psychrobacter sp. P11G3,

показавшие высокое сходство нуклеотидных последовательностей с P. cibarius

(штаммы JCM 18902 и JCM 18903) и P. nivimaris (штаммы JCM 18900 и JCM

18901) [Kudo et al., 2014; Moghadam et al., 2016]. Ранее в воде Беранцева моря

были обнаружены представители р. Arthrobacter и р. Shewanella (Литвинова и

др., 2011; Moghadam et al., 2016), однако виды Arthrobacter rhombi и Shewanella

vesiculosa, а также Salinibacterium amurskyense среди них не были упомянуты.

Таким образом, данные виды-деструкторы впервые выделены из

нефтезагрязненных образцов зеленых и бурых водорослей Баренцева моря.

Дрожжи Yarrowia lipolytica, ранее описанные как Candida lipolytica,

являются эффективными деструкторами гидрофобных субстратов.

115

Установлено, что данный микроорганизм способен расти в температурном

диапазоне от 0°C до 30°C (с оптимумом роста от 15°C до 20°C) и утилизировать

до 68% дизельного топлива спустя 10 суток культивирования (Margesin,

Schinner, 1997). При этом ранее сообщалось о выделении данного вида

дрожжей из почв прибрежной зоны Каспийского моря (Аушева, 2007), что

соотносится с нашими исследованиями.

Таким образом, из мест нефтяных загрязнений северных регионов были

выделены аборигенные микроорганизмы, способные использовать

углеводородные компоненты нефти в своем метаболизме. Поэтому на

следующем этапе работы была проведена оценка их деструктивного

потенциала в отношении УВ нефти при низких положительных температурах.

4.2.2. Спектр углеводородов, потребляемых исследуемыми

микроорганизмами

Нефть и нефтепродукты являются комплексными соединениями,

включающими широкий спектр различных индивидуальных УВ и их смесей. В

связи с этим выделенные штаммы подвергали тесту на субстратную

специфичность – способность к росту на различных УВ и их деградации. Для

исследования субстратного УВ спектра использовали метод лунок на твердой

минеральной среде (Руководство…, 1983). Для этого в лунки, проделанные в

твердой питательной среде стерильным пробочным сверлом, вносили стерильные

УВ. Посев культур проводили штрихом от лунки к периферии чашки. Об

использовании нефти и нефтепродуктов судили по интенсивности роста по

штриху через 1-7 суток культивирования по сравнению с контролем, которым

служили чашки без внесения нефти. В качестве единственного источника

углерода и энергии для микроорганизмов в минеральную среду вносили

следующие группы УВ: н-алканы (октан, изооктан, ундекан, додекан, тетрадекан,

гексадекан), нафтеновые (циклогексан), ароматические (бензол, толуол, ксилол,

бифенил), полиароматические (нафталин, фенантрен, антрацен, тетралин,

декалин, 1-метилнафталин), смеси УВ (бензин марки А-95, дизельное топливо,

116

керосин, моторное масло, смола). Общее количество УВ субстратов достигало 22.

Считается, что при использовании данного метода УВ равномерно

диффундируют в агар и частично испаряются, так что культивирование

происходит одновременно и на твёрдом субстрате, и в парах УВ (Руководство…,

1983). Полученные результаты представлены в таблице 13.

Таблица 13. Рост культур микроорганизмов на различных УВ субстратах.

Название культуры микроорганизма

Углеводо-

родный

субстрат

C.

marina

S4

C.

marina

S2

C.

marina

S3

Y.

lipoly-

tica

S1

Y.

lipoly-

tica

S2

N.

coeliaca

S1

P.

cibarius

S3

S.

amurs-

kyense

S4

A.

rhombi

S1

A.

rhombi

S2

S.

vesicu-

losa S5

н-алканы

Изооктан 1 1 2 3 3 3 1 1 1 1 1

Октан 2 2 2 4 4 3 2 1 2 2 0-1

Ундекан 4 2 3 6 6 5 3 1 3 4 0

Додекан 5 4 4 6 6 6 4 1-2 3 3 0

Тетрадекан 5 5 4 6 6 6 5 3 4 4 2

Гексадекан 3 2 2 6 6 6 3 4 4 3 1

Нафтены (циклоалканы)

Цикло-

гексан 4 3 4 5 5 5 3 5 3 5 2

Декалин 2 2 3 3 3 3-4 1 3 0 3 2

Ароматические углеводороды

Бензол 3 2 0 4 4 4 3 3 3 4 0

Толуол 4 4 4 6 6 6 5 4 4 4 3

Ксилол 4 4 4 4 4 5 3 2 3 3 0-1

Бифенил 5 2 5 5 5 5 4 4 4 4 0

Полиароматические углеводороды (ПАУ)

Тетралин 0 1 1 1 1 2 0 4 3 4 2

Нафталин 0 2 4 1 4 4 3 4 4 5 0

1-метил-

нафталин 2 2 3 2 2 4 1 3 2 3 1

Антрацен 0 3 0 3 3 4 3 4 3 3 0

Фенантрен 0 0 3 4 4 4-5 3 4 2 3 0

Нефтепродукты

117

Бензин

А-95 4 3 4 4 4 4 3 5 3 5 4

Дизельное

топливо

(ДТ)

2 1 2 5 5 5 3 0 1 3 0

Керосин 4 2 4 5 5 5 3 2 4 3 1

Моторное

масло 3 2 3 3-4 3-4 3-4 2 1-2 3 3 2

Смола 2 1 2 3 3 3 2 1 2 2 2

Примечание. 0 - отсутствие роста; 1 - едва заметный рост; 2 - очень слабый рост; 3 -

слабый рост; 4 - умеренный рост; 5 - хороший рост; 6 - отличный рост.

Среди 11 исследованных штаммов наиболее активными оказались Y.

lipolytica S1, Y. lipolytica S2 и N. coeliaca S1, которые с наиболее высокой

интенсивностью росли на н-алканах (ундекан, додекан, тетрадекан, гексадекан),

нафтенах (циклогексан), ароматических УВ (толуол, бифенил) и

нефтепродуктах (керосин, дизельное топливо). Для данных культур

микроорганизмов был характерен отчетливый рост на всех тестируемых

субстратах, в том числе на моно- и полициклических соединениях.

Исключением являлся штамм Y. lipolytica S1, рост которого в присутствии

нафталина наблюдали по всему штриху, однако он был очень слабо выражен, в

отличие от Y. lipolytica S2, рост которого при этом был умеренным. Скудный

рост дрожжевых штаммов Y. lipolytica S1 и Y. lipolytica S2 отмечали и на среде с

тетралином и 1-метилнафталином. Ранее считалось, что дрожжи могут

использовать УВ лишь с определенной длиной цепи - от С12 до С22 (Walker et

al., 1975). Однако на сегодняшний день имеются сведения о способности

дрожжей Y. lipolytica к использованию широкого спектра УВ соединений, в том

числе н-алканов, бифенила, нафталина, фенола и т.д. (Секова и др., 2015;

Blenner, 2015; DSMZ, 2015), что еще раз подтверждается данным

исследованием. По другим литературным данным, дрожжи Y. lipolytica

способны расти на средах с минимальным набором минеральных веществ,

утилизируя при этом широкий спектр субстратов, включая трудноусвояемые

118

для других микроорганизмов отходы различных производств с высоким

содержанием жиров и УВ, нефть, дизельное топливо, н-алканы (Секова и др.,

2015), что так же соотносится с результатами проведенных нами

экспериментов.

Микробный штамм S. vesiculosa S5 оказался неспособным использовать ряд

субстратов. В присутствии циклогексана, 1-метилнафталина, бензина, керосина

и моторного масла наблюдали рост различной интенсивности лишь в начале

штриха, у лунки с УВ, а в присутствии тетралина, декалина и смолы отмечали

рост в виде отдельных колоний от середины до конца штриха, что может

свидетельствовать о возможной токсичности указанных УВ на клетки данного

микроорганизма, степень которой уменьшалась по мере снижения

концентрации, делая возможным развитие штаммов (Вятчина и др., 2010). В

настоящее время в литературе есть сведения о способности арктических и

антарктических морских психротолерантных видов Shewanella spp. к

деградации УВ (Floodgate, 1984; Gentile et al., 2003; Gerdes et al., 2005), однако

вид S. vesiculosa среди них ранее не был упомянут. Возможно, это связано с

тем, что данный вид был описан сравнительно недавно (Bozal et al., 2009), и не

все его свойства изучены к настоящему времени.

Показано, что различные штаммы одного и того же вида C. marina,

выделенные из одной накопительной культуры, отличались способностью

использовать те или иные УВ соединения (рис. 20).

119

Рисунок 20. Рост некоторых исследуемых культур на минеральной среде в

присутствии тетрадекана (А) и керосина (Б). Примечание. 1 - Y. lipolytica S1, 2 -

Y. lipolytica S2, 3 - C. marina S3, 4 - C. marina S2, 5 - N. coeliaca S1, 6 - C. marina

S4, 7 - S. vesiculosa S5, 8 - P. cibarius S3.

В случае н-алканов интенсивность роста всех штаммов возрастала с

увеличением длины С-цепи - от изооктана к тетрадекану, снижаясь в

присутствии гексадекана. При этом активность штаммов в отношении октана

была выше по сравнению с изооктаном. Это можно объяснить тем, что

конформации молекул субстрата в УВ с разветвленной цепью атомов

затрудняют взаимодействие «субстрат–фермент», поэтому такие УВ мало

доступны биохимическому окислению (Dutta, Harayama, 2001). Для штамма C.

marina S2 наиболее оптимальным субстратом оказался тетрадекан, для C.

marina S4 - додекан и тетрадекан, а для C. marina S3 был отмечен более

скудный рост на этих же алканах.

Кроме того, штаммы C. marina и S3 C. marina S4 способны активно

утилизировать некоторые ароматические УВ, в частности, бифенил, что может

свидетельствовать о наличии у исследуемых бактерий ферментной системы

окисления подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ, содержащих железо-

серный кластер Риске (Shumkova et al., 2014). Данный фермент может

120

принимать участие и в окислении толуола и ксилола, которые штаммы

используют в меньшей степени. По литературным данным, алкилированные

бензолы окисляются интенсивнее, чем бензол (Брянская и др., 2014), что

соотносится с результатами эксперимента. По-видимому, бензол оказывает

токсическое воздействие на клетки C. marina S3, с чем связано отсутствие роста

данного штамма.

Штаммы C. marina и S3 C. marina S4 проявили умеренный рост в

присутствии циклогексана, в то время как для C. marina S2 интенсивность

роста оказалась ниже. Циклоалканы поддаются биологическому разложению

труднее алканов, что связано с наличием цикла, который окисляется сложнее,

чем молекулы с линейной структурой (Брянская и др., 2014).

Что касается ПАУ, наиболее выраженный рост был обнаружен лишь у C.

marina S3 при использовании нафталина. В остальных случаях на средах с

этими УВ изоляты давали слабый или скудный рост в виде отдельных колоний

по линии штриха. Штамм C. marina S2 не развивался на среде с фенантреном,

C. marina S3 – с антраценом, C. marina S4 – с тетралином, нафталином,

антраценом и фенантреном. При этом существует множество причин

ингибирования роста штаммов: конкуренция ферментов, вовлеченных в

окисление или транспортировку, накопление побочных продуктов, являющихся

цитотоксичными или тупиковыми, блокировка индукции фермента,

метаболическая репрессия, недостаток кометаболических или индуцирующих

субстратов (Bouchez et al., 1995; Juhasz et al., 2002; Сазыкин и др., 2009).

Штаммы C. marina S3 и C. marina S4 достаточно хорошо развивались на

среде с такими нефтепродуктами, как бензин и керосин, на остальных

нефтепродуктах отмечали скудный рост. Штамм C. marina S2 проявил

меньшую активность по отношению к этим источникам углерода. Таким

образом, различные штаммы одного и того же вида микроорганизма по-

разному реагируют на присутствие в среде того или иного УВ субстрата.

Некоторые из использованных в эксперименте соединений могут выступать в

роли стрессоров, и различия штаммов в способности ассимилировать эти

121

соединения свидетельствуют о вариабельности их адаптивных механизмов. По

некоторым данным, действие стрессоров обусловлено их специфичностью к

той мишени в клетке, на которую направлено их воздействие (Аринбасарова и

др., 2015).

Культура P. cibarius S3 наиболее эффективно использовала в качестве

ростового субстрата тетрадекан и толуол, хорошо развивалась на среде с

додеканом и бифенилом. В присутствии тетралина микробный рост полностью

отсутствовал, и был едва заметным при использовании изооктана, декалина и 1-

метилнафталина. На остальных УВ культура давала слабый или скудный рост.

Культурой S. amurskyense S4 была продемонстрирована наибольшая

активность при росте на среде с циклогексаном и бензином, умеренный рост на

среде с гексадеканом, бензолом, бифенилом, тетралином, нафталином,

антраценом и фенантреном, слабый и скудный рост на остальных УВ, за

исключением дизельного топлива, на среде с которым культура не развивалась.

Известно, что в компонентном составе дизельного топлива преобладают

простые неразветвленные н-алканы с длиной цепи С6-С12 (Heath et al., 1997),

которые могут оказывать токсическое воздействие на микроорганизмы путем

растворения их клеточных стенок. Поэтому вполне возможно, что культура S.

amurskyense S4 не устойчива к действию низкомолекулярных алканов

дизельного топлива.

Штаммы A. rhombi S1 и A. rhombi S2, как и в случае бактерий C. marina,

проявили различную интенсивность использования УВ. Так, для A. rhombi S1

отмечали умеренный рост в присутствии тетра- и гексадекана, толуола,

бифенила, нафталина и керосина. Штамм не использовал декалин в качестве

ростового субстрата, изооктан и дизельное топливо значительно угнетали его

рост. Вместе с тем A. rhombi S2 эффективно утилизировал циклогексан, бензин

и нафталин. Стоит отметить, что A. rhombi S2 является единственным

штаммом, демонстрировавшим столь интенсивный рост в присутствии

нафталина, что создает предпосылки использования данного штамма для

получения биопрепарата. Ранее была показана способность р. Arthrobacter к

122

ассимиляции не только нафталина, но и фенантрена, бифенила, фенола,

алифатических УВ (Seo et al., 2006; Плотникова, 2010).

Способность 9 из 11 культур к использованию нафталина и всех 11 культур

к использованию 1-метилнафталина свидетельствует о наличии в клетках

исследуемых микроорганизмов ферментной системы окисления ПАУ –

нафталин диоксигеназы, многокомпонентной оксигеназной ферментной

системы, содержащей негемное железо и состоящую из редуктазы, [2Fe-2S]

железо-серного центра Риске в ферредоксине и железо-серного флавопротеина

(Сазыкин и др., 2009). По литературным данным, этот фермент катализирует

широкий спектр реакций пяти основных групп (реакции диоксигенирования,

монооксигенирования, дегидратации, о- и м-деалкилирования и

сульфоокисления) [Ветрова и др., 2008]. Видимо, именно поэтому практически

все исследуемые в данной работе микроорганизмы обладают способностью

усваивать компоненты тяжелых фракций нефти. Не исключено, что в клетках

исследуемых культур также присутствуют нафталиновые плазмиды и имеются

различия в структуре генетических систем деструкции нафталина.

В целом все исследуемые культуры обладали менее выраженной

активностью в отношении моторного масла и смолы. Возможно, это связано с

компонентным составом этих соединений: моторные масла содержат в своем

составе функциональные и вязкостные присадки, синтетические продукты,

которые могут быть оказывать токсическое воздействие на микроорганизмы.

Смолы содержат множество конденсированных циклов, гетероатомов,

обладают низкой растворимостью, вследствие чего их деструкция с участием

микроорганизмов затруднена.

Таким образом, в ходе проведенного эксперимента была определена

способность исследуемых культур микроорганизмов к использованию

различных УВ в качестве единственных источников углерода. Установлено, что

большинство культур способны утилизировать широкий спектр

углеводородсодержащих субстратов. Наиболее высоким катаболическим

потенциалом обладают 4 из 11 культур: дрожжи Y. lipolytica S1, Y. lipolytica S2

123

и грамположительные актинобактерии N. coeliaca S1, A. rhombi S2, которые не

только использовали все тестируемые УВ (в том числе и высокоустойчивые),

но и обладали самой высокой интенсивностью роста в их присутствии.

Ферментные системы культуры S. vesiculosa S5 могут окислять ограниченный

круг УВ соединений, поскольку данный микроорганизм использовал только 12

из них. Показано, что способность различных штаммов к окислению УВ

неодинакова, что может объясняться множеством путей, механизмов

деградации, разнообразием генетических, ферментных систем окисления

различных соединений, входящих в состав нефти.

4.2.3. Количественная оценка деструкции углеводородов чистыми

культурами микроорганизмов

Результаты исследования показали, что наиболее активно деструкция УВ

для большинства культур протекает в первые 10 суток культивирования.

Потребление УВ происходит с разной интенсивностью, при этом степень

деструкции УВ спустя 20 суток культивирования у исследуемых

микроорганизмов варьировала от 13 до 62% (таблица 14).

Таблица 14. Численность чистых культур микроорганизмов и степень

деструкции УВ, измеренная весовым методом в жидкой минеральной среде

Таусона при 4°С.

№

Название культуры

микроорганизма

Численность

клеток,

10 суток,

КОЕ/мл

Численность

клеток,

20 суток,

КОЕ/мл

Убыль УВ,

10 суток, %

Убыль УВ,

20 суток, %

1 C. marina S2 (1,99±0,03)

*108

(1,19±0,03)

*1010

0 13

2 C. marina S3 (2,12±0,01)

*108

(1,10±0,03)

*1010

63 62

3 C. marina S4 (2,82±0,02) (2,20±0,12) 15 20

124

Установлено, что наиболее активными деструкторами УВ среди

исследуемых культур являлись: штамм C. marina S3, A. rhombi S1, N. coeliaca

S1, утилизировавшие до 62% УВ к 20-м суткам культивирования, а также

дрожжи Y. lipolytica S1 и Y. lipolytica S2, степень деструкции которых достигала

51%. В исследованиях Андреевой И.С с соавторами показано, что штамм Y.

lipolytica NF5-1, выделенный из грунтов зоны вечной мерзлоты Якутии, при

пониженной температуре (4-6°С) утилизировал 64% нефти Усинского

месторождения (Андреева и др., 2007). Данная нефть, как и использованная в

нашем эксперименте нефть Возейского месторождения, отличается наличием

большого количества тяжелых УВ. На основании результатов

гравиметрического анализа и результатов анализа субстратной специфичности

можно заключить, что данные культуры в первую очередь подвергают

*108 *10

8

4 Y. lipolytica S1 (1,20±0,005)

*107

(1,13±0,03)

*1010

18 51

5 Y. lipolytica S2 (1,10±0,05)

*107

(1,15±0,02)

*1010

17 51

6 A. rhombi S1 (3,18±0,26)

*108

(4,45±0,10)

*108

66 62

7 A. rhombi S2 (3,07±0,41)

*108

(2,88±0,42)

*108

17 18

8 N. coeliaca S1 (1,29±0,28)

*108

(1,42±0,05)

*1010

26 62

9 P. cibarius S3 (1,40±0,04)

*108

(1,22±0,08)

*108

21 28

10 S. amurskyense S4 (1,05±0,04)

*109

(1,08±0,04)

*109

8 18

11 S. vesiculosa S5 (2,23±0,07)

*108

(5,77±0,21)

*108

15 24

125

деструкции н-алканы, а также легкие ароматические УВ. Степень утилизации

УВ штаммом N. coeliaca S1 была более высокой в сравнении с результатами

других работ (Пырченкова и др., 2006).

Для культур C. marina S2, Y. lipolytica S1, Y. lipolytica S2, N. coeliaca S1, S.

amurskyense S4 и S. vesiculosa S5 возрастание численности клеток с 10-e по 20-e

сутки культивирования коррелировало с увеличением степени деструкции УВ.

Вероятно, в первые дни культивирования происходит приспособление

культуры к условиям среды, индукция ферментных систем, активизация

микроорганизмов, и убыль УВ обусловлена, главным образом, интенсивным

испарением УВ с поверхности среды, что приводит к потере некоторой части

УВ. В процессе культивирования постепенно накапливаются ферменты

окисления УВ и ПАВ, под действием которых и происходит дальнейшая

утилизация. Кроме того, для части культур отмечено диспергирование нефти,

которое говорит о том, что данные штаммы в определенных условиях

культивирования действительно способны синтезировать и секретировать ПАВ,

эмульгирующие нефть.

Для штаммов C. marina S4, A. rhombi S1, A. rhombi S2 и P. cibarius S3 не

наблюдали изменения активности роста клеток и степени деструкции УВ с 10-х

по 20-е сутки инкубации, однако первые два из них проявили себя как

эффективные деструкторы нефтепродуктов при пониженной температуре, в то

время как вторые два характеризовались слабой степенью утилизации УВ.

Вместе с тем, возрастание численности микроорганизмов не всегда позволяет

судить об их деструктивной активности. Штамм C. marina S3 хоть и показал

значительный прирост биомассы к 20-м суткам, однако при этом не

происходило увеличения его деструктивной активности. Можно предположить,

что увеличение численности данного микроорганизма при неизменных

значениях деструктивных показателей может являться следствием проявления

его резистентности к УВ. Полученные результаты еще раз подтверждают

зависимость активности исследуемых микроорганизмов от их таксономической

принадлежности, избирательность различных культур в отношении

126

компонентов нефти, различие их ферментативных систем и механизмов

окисления УВ, что необходимо учитывать в процессе отбора эффективных

штаммов микроорганизмов-деструкторов при создании биопрепаратов для

очистки от нефтяных загрязнений.

Методом ГЖХ проводили оценку эффективности утилизации

среднекипящей фракции нефти спустя 20 суток культивирования наиболее

активными культурами микроорганизмов: C. marina S3, Y. lipolytica S1, Y.

lipolytica S2, A. rhombi S1, N. coeliaca S1 (таблица 15).

Таблица 15. Количественная оценка деградации УВ нефти чистыми

культурами микроорганизмов, измеренная газо-хроматографическим методом.

Компонент

Название культуры

C. marina

S3

Y. lipolytica

S1

Y. lipolytica

S2

A. rhombi

S1

N. coeliaca

S1

Убыль УВ спустя 20 суток, %

C16 - - 78,9 70,5 74,8

С17 - - 90,1 72,6 79,8

i-C17 - - 53,0 73,8 66,7

С18 90,5 - 91,9 64,3 75,1

i-C18 91,5 71,5 58,2 69,7 66,4

С19 80,0 95,8 89,3 59,7 72,1

С20 74,7 97,3 90,3 57,9 71,5

С21 71,1 96,4 91,0 55,7 70,8

С22 71,6 96,8 90,0 55,2 69,4

С23 70,7 95,9 88,9 53,6 67,8

С24 71,4 - 88,3 53,8 67,2

Σ убыль 78,2 92,7 86,4 60,8 71,5

ki - - 2,39 0,43 0,70

Примечание. «-» - данные отсутствуют.

127

Исходя из полученных значений, можно заключить, что наиболее

интенсивно утилизация среднекипящей фракции происходила в присутствии

штаммов дрожжей Y. lipolytica S1 и Y. lipolytica S2. Однако данные культуры

показали меньший по сравнению с другими сравниваемыми культурами

суммарный процент убыли УВ, определенный гравиметрически. Можно

предположить, что исследуемые дрожжи обладают избирательностью в

отношении УВ нефти, и в первую очередь подвергают деструкции нормальные

алканы С12-С24, в то время как высококипящие фракции для них более

труднодоступны.

Как и в случае микробных сообществ, для некоторых культур (C. marina

S3 и Y. lipolytica S1) наблюдали выветривание некоторых алканов с длиной

цепи до С18, что не позволило рассчитать для них пристан-фитановый индекс ki.

Для штамма Y. lipolytica S2 рассчитанный индекс показал увеличение его

значения относительно контрольного (ki=0,49) почти в 5 раз, что

свидетельствует об инициации процесса окислительной деструкции н-алканов.

Для штамма Y. lipolytica S2 наблюдали существенное снижение количества н-

C18 по отношению к фитану, что так же является показателем активной

микробной деструкции УВ данной культурой. Пристан-фитановый индекс для

N. coeliaca S1 так же возрастал по сравнению с контрольным образцом, что

даёт основания полагать, что культура способна к ферментативной активности

не только УВ средне-, но и высококипящей фракции. Ранее было показано, что

при 5°C, штамм Rhodococcus sp. В15, имеющий 99,5% сходства нуклеотидных

последовательностей с Nocardia calcarea (X80618), или R. erythropolis, был

способен утилизировать алканы с длиной цепи С28 и C32 (Whyte et al., 1998)

Спустя 28 суток роста при 5°C в жидкой минеральной среде в присутствии

0,1% дизельного топлива данный штамм утилизировал почти все н-алканы с

длиной цепи С10-С21 и в меньшей степени – разветвленные алканы дизельного

топлива. Для штамма A. rhombi S1 углеводородный индекс практически не

отличался от контрольного, однако в данном случае показано увеличение

128

отношения н-C17 к пристану и н-C18 к фитану, что так же является показателем

микробного участия в убыли УВ. Изменение соотношений между н-алканами

средне- и высококипящих фракций, а также концентрациями пристана и фитана

в присутствии A. rhombi S1 показано на рисунке 21. В некоторых случаях

увеличение соответствующих отношений свидетельствует, что разветвленные

алканы могут быть более предпочтительны для биодеградации, однако такие

результаты следует интерпретировать с осторожностью (Kim et al., 1998).

Рисунок 21. Хроматограмма экстракта контрольного образца смеси

товарной нефти Возейского месторождения и дизеля без добавления

микроорганизмов (черная линия) и в присутствии A. rhombi S1 (красная линия).

Таким образом, экспериментально подтверждена способность чистых

культур использовать нефть в качестве единственного источника углерода и

энергии. Анализ хроматографических профилей выявил способность

исследуемых микроорганизмов к деструкции не только лёгких фракций нефти и

129

твёрдых парафинов, но и более тяжелых компонентов нефти, что еще раз

подтверждают результаты исследования субстратного (УВ) спектра. На

основании результатов осветления целлюлозных фильтров, пропитанных УВ,

было выдвинуто предположение о том, что полученные данные

гравиметрического анализа можно объяснить не только биохимической

составляющей убыли УВ (микробным окислением), но и биосурфактантной

активностью микроорганизмов, а также вкладом физического фактора,

обусловленного испарением нефтепродуктов, в том числе в процессе

биоэмульгации. Поэтому следующим этапом работы являлось изучение вклада

поверхностной активности в убыль УВ.

4.2.4. Биоэмульгирующая активность микроорганизмов

Известно, что углеводородокисляющая (ферментативная) активность

часто сопряжена со способностью микроорганизмов к синтезу ПАВ,

повышающих доступность УВ для клеток (Коронелли, Нестерова, 1990; Назина

и др., 2003). При этом существует два основных типа биоПАВ: биосурфактанты

– соединения, уменьшающие поверхностное натяжение на границе раздела

воздух-вода, и биоэмульгаторы – соединения, снижающие поверхностное

натяжение на границе несмешивающихся жидкостей или при взаимодействии

твердых тел с жидкостями (Batista et al., 2006). Способность к образованию

стабильных эмульсий не всегда связана со снижением поверхностного

натяжения. Так, биосурфактанты обычно обладают эмульгирующей

активностью, в то время как биоэмульгаторы не всегда снижают поверхностное

натяжение (Willumsen, Karlson, 1997; Karanth et al., 1999). В связи с этим

проводили определение способности микробных культур к продукции биоПАВ.

Оценку поверхностной активности проводили тремя методами: по

определению индекса эмульгирования, измерению показателя поверхностного

натяжения и измерению показателя гидрофобности клеток.

130

4.2.4.1. Определение индекса эмульгирования культур

Известно, что температура является одним из главных факторов,

влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов. Поэтому была проведена

сравнительная оценка перечисленных выше параметров поверхностной

активности исследуемых микроорганизмов при двух температурах: 4 и 20°С.

Показано, что температура оказывает существенное влияние на величину

синтеза биоПАВ. Культуры C. marina S2, C. marina S4, A. rhombi S1, Y.

lipolytica S1 продуцируют большее количество ПАВ при 20°С, максимальные

значения Е24 которых в культуральной среде с клетками (КС) достигали 59,3%,

56,3%, 54,1% и 33,3%, соответственно (рис. 22).

Рисунок 22. Индекс эмульгирования исследуемых культур в

культуральной среде с клетками (КС), буфере с биомассой клеток (БМ) и

бесклеточном супернатанте (БС) при 20°С.

В других экспериментах было показано, что бесклеточный супернатант

штамма Cobetia sp. MM1IDA2H-1, обладающего высокой степенью сходства

нуклеотидных последовательностей с C. marina DSM 4741, спустя 8 ч

инкубации при 30°С показал значение E24 = 44,0% (Ibacache-Quiroga et al.,

56,3

3,3

47,5

16,4

11,7 15

,6

59,3

55,5

10,2

33,3

14,5

9,8

21,7

16,1

16,4

54,1

0

5

20

0

21,3

0

10,3

4,8

5

0

1,7

9,8

0

4,9

16,9

4,7

15

0

10

20

30

40

50

60

КС БМ БС

Инд

екс

эмул

ьгир

ован

ия,

%

C. marina S2 C. marina S3 C. marina S4 Y. lipolytica S1

Y. lipolytica S2 A. rhombi S1 A. rhombi S2 N. coeliaca S1

P. cibarius S3 S. amurskyense S4 S. vesiculosa S5

131

2013), что соотносится с нашими результатами в случае C. marina S2 при 20°С.

Данный штамм в БС демонстрировал значение индекса эмульгирования 47,5%.

Эмульсии, полученные после перемешивания КС, отмытой и

ресуспендированной в буфере биомассы клеток (БМ), бесклеточного

супернатанта (БС) и гексадекана, отличались устойчивостью, их высота не

уменьшалась спустя сутки после проведения эксперимента. Штамм S.

amurskyense S4 показал самую низкую эмульгирующую активность,

достигавшую 9,8% при 20°С. В случае штаммов C. marina S3, P. cibarius S3, Y.

lipolytica S2, N. coeliaca S1 более высокую эмульгирующую активность

наблюдали при низкой температуре, максимальные значения которой

достигали 27,1%, 26,7% (в БС), 51,7% (в БМ) и 32,8% (в КС), соответственно

(рис. 23).

Рисунок 23. Индекс эмульгирования исследуемых культур в

культуральной среде с клетками (КС), буфере с биомассой клеток (БМ) и

бесклеточном супернатанте (БС) при 4°С.

Для штамма S. vesiculosa S5 значения индексов эмульгирования при

разных температурах были примерно одинаковыми и составляли 16,7-16,9%.

9,7

8,2

6,5

24

,5

15

27

,1

47

,5

8,2

26

,2

25

,4

19

,7

1,7

32

,8

0,4 1,7

0 0 00 0 0

35

51

,7

0

24

,6

0

26

,7

4,8

0 1,8

6,7 8

,6

16

,7

0

10

20

30

40

50

60

КС БМ БС

Инд

екс

эмул

ьгир

ован

ия,

%

C. marina S2 C. marina S3 C. marina S4 Y. lipolytica S1

Y. lipolytica S2 A. rhombi S1 A. rhombi S2 N. coeliaca S1

P. cibarius S3 S. amurskyense S4 S. vesiculosa S5

132

Стоит отметить, что штаммы A. rhombi S1 и A. rhombi S2 при понижении

температуры совсем не проявляли способности к эмульгации гексадекана.

При этом температура может влиять не только на количество

синтезируемых ПАВ, но и на их природу. Исходя из сравнения значений

индексов эмульгирования БС и КС, предполагалось, что при 20°С штамм A.

rhombi S2 синтезирует поверхностно-активные соединения экзо-типа, в то

время как штаммы Y. lipolytica S1 и A. rhombi S1 образуют ПАВ эндо-типа,

ассоциированные с клеточной стенкой, о чем свидетельствовало отсутствие

плотного эмульсионного слоя в супернатанте. Для культуры Y. lipolytica S2 при

20°С значения E24 были примерно одинаковыми в КС, БМ и БС, что позволяло

говорить об образовании биоПАВ экзо-/эндо- типов, а при 4°С эмульгирующую

активность наблюдали лишь в КС, что свидетельствовало о синтезе эндо-ПАВ.

Для C. marina S2 и S. vesiculosa S при 20°С наблюдали практически одинаковые

значения индексов эмульгирования гексадекана КС и БС, в то время как при

4°С индексы эмульгирования совпадали в КС, БС и БМ. На основании этих

результатов предполагалось, что при более высокой температуре культуры

образовывали ПАВ преимущественно экзо-типа, а низкая температура

способствовала образованию у данных культур поверхностно-активных

соединений обоих типов.

Культуры C. marina S3, P. cibarius S3, S. amurskyense S4 показали

образование эмульсий как в присутствии клеток, так и в их отсутствии вне

зависимости от температуры. Исходя из совпадения индексов эмульгирования

КС и БС, можно предположить, что данном случае ПАВ выделяются в среду

культивирования. В случае C. marina S4 предполагали образование эндо-ПАВ

при 20°С и эндо-/экзо-ПАВ при 4°С. Культура N. coeliaca S1 проявила

способность к продукции эмульгирующих соединений эндо-типа при низкой

температуре, в то время как при более высокой в равной степени отмечали

образование биоПАВ обоих типов.

133

4.2.4.2. Определение показателя гидрофобности поверхности клеток

Еще одним важным критерием оценки эмульгирующих свойств

микроорганизмов является определение степени их гидрофобности, поскольку

гидрофильно-гидрофобные свойства микробной клетки зависят от природы ее

поверхностных биополимеров, содержащих разнообразные ионогенные группы

(фосфатные, карбоксильные и аминогруппы) и образующих клеточную стенку,

капсулу и слизь бактерий (Курлович и др., 2014). Гидрофобность клеток

обусловлена липофильностью их клеточной стенки или компонентов клеточной

мембраны, некоторые из которых поверхностно-активны. Таким образом,

клетки сами по себе могут демонстрировать значительную эмульгирующую

активность и выступать в роли биосурфактантных агентов (Francy et al., 1991).

Показатель гидрофобности клеток определяли методом Розенберга в

модификации Серебряковой (Серебрякова и др., 2002). Регистрация показателя

гидрофобности может служить дополнительным критерием отбора бактерий,

синтезирующих связанные с клетками биоПАВ, не экскретирующиеся в

водную среду (Волченко, 2006). Поэтому для исследования были взяты

отмытые от среды и ресуспендированные в буфере клетки (БМ). Для этого

встряхивали 5 мл ресуспендированных клеток, предварительно измерив их

оптическую плотность (ОП), с 1 мл хлороформа в течение 2 мин. После этого

вновь измеряли ОП суспензии. Данный метод основан на оценке степени

адгезии клеток к поверхности раздела фаз жидких УВ и воды после

непродолжительного их перемешивания и последующего расслоения бифазной

системы «УВ-вода».

Исследование гидрофобности клеток показало, что ее степень в

большинстве случаев увеличивается с понижением температуры, достигая

100% в случае C. marina S3 и Y. lipolytica S2, а в случае C. marina S4, Y.

lipolytica S1, N. coeliaca S1 – 95,1%, 99,2% и 93,4%, соответственно, о чем

свидетельствовало уменьшение коэффициента поглощения света в водной фазе

(таблица 16). При этом для данных штаммов отмечали практически полный

134

переход клеток в гидрофобную фазу, о чем судили по изменению прозрачности

суспензии клеток.

Таблица 16. Показатель гидрофобности клеток и оптическая плотность

биомассы клеток в буфере.

Известно, что при понижении температуры в мембранах клеток

микроорганизмов увеличивается синтез жирных кислот, направленных на

повышение текучести мембраны; повышается доля ненасыщенных жирных

кислот в составе фосфолипидов за счет десатураз, вводящих двойные связи в

жирные кислоты; происходит разветвление цепей жирных кислот, уменьшение

их длины, изменение соотношений жирных кислот с цис- и транс-

конформацией двойной связи (Suutari, Laakso, 1994). При этом изменения

структуры жирнокислотного состава липидов мембран ранее наблюдали как в

клетках грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов

(Chattopadhyay, Jagannadham, 2001). Высокое количество липидов способны

накапливать и дрожжи, в частности, содержание липидов в клетках Y. lipolytica

Св-

ва

C.

mari-

na S2

C.

mari-

na S3

C.

mari-

na S4

Y.

lipoly-

tica

S1

Y.

lipoly-

tica

S2

A.

rhombi

S1

A.

rhombi

S2

N. coe-

liaca

S1

P.

ciba-

rius S3

S.

amurs-

kyense

S4

S.

vesicu-

losa S5

20°С

ОD

(540

нм)

3,98 4,62 4,42 5,04 4,29 3,26 3,51 2,43 4,86 5,84 4,26

ПГ,

% 83,4 39,0 94,9 44,0 43,7 24,6 2,0 40,0 38,5 86,2 33,0

4°С

ОD

(540

нм)

5,22 5,33 5,72 4,06 2,74 2,53 3,44 2,70 2,51 3,16 6,15

ПГ,

% 65,4 100,0 95,1 99,2 100,0 5,22 7,5 93,4 >100 54,4 70,4

135

может достигать до 43% (Wang et al., 2011; Rutter et al., 2015). Поэтому вполне

вероятно, что изменения свойств и состава клеточных мембран напрямую

связаны с изменением гидрофобности клеток. Согласно другим исследованиям,

клетки дрожжей Y. lipolytica, действительно, обладают высокогидрофобной

клеточной поверхностью, степень которой увеличивается при росте в

присутствии гидрофобных субстратов (Cirigliano, Carman, 1984; Kim et al.,

1999). На основании полученных результатов можно заключить, что

исследуемые нами дрожжи Y. lipolytica S1 и Y. lipolytica S1, а также бактерии C.

marina S3, C. marina S4, N. coeliaca S1 являются олеогенными

(липидпродуцирующими) микроорганизмами, обладающими высокой степенью

сродства к УВ при низкой температуре за счет гидрофобной клеточной

поверхности.

Для культур C. marina S2 и S. amurskyense S4 гидрофобность клеток была

выше при 20°С, а для S. vesiculosa S5 - при 4°С. Однако эмульгирующая

активность последних двух упомянутых культур была довольно слабой.

Схожие результаты были получены в экспериментах других авторов с тремя

штамамми родококков, на основании которых был сделан вывод об отсутствии

четкой связи между гидрофобностью клеток и их пенообразующей

способностью (Stratton et al., 2002). У штаммов A. rhombi S1 и A. rhombi S2 при

низкой температуре не было обнаружено биоэмульгирующей активности и

выявлена их слабая гидрофобность. В экспериментах Никовской Г.Н. с

соавторами был исследован вид Arthrobacter simplex, который так же обладал

минимальной гидрофобностью (Никовская и др., 1989).

Для отдельных штаммов (P. cibarius S3) при пониженной температуре

наблюдали превышение оптической плотности после встряхивания (ОП1)

суспензии над ОП до встряхивания (ОП0). В некоторых работах сообщается,

что подобное явление – возможное следствие образования оптически-плотной

суспензии «хлороформ в воде», стабилизированной клетками, а также

результат превышения сорбционной емкости хлороформа высокой

концентрацией клеток (Карасева и др., 2008).

136

4.2.4.3. Определение способности культур к снижению

поверхностного натяжения супернатантов

Поверхностное натяжение измеряли методом отрыва пластинки от

поверхности жидкости. Наряду с измерением поверхностного натяжения (ПН) в

супернатантах культур параллельно регистрировали его снижение в КС для

определения типа биоПАВ.

Изначально предполагали, что биоэмульгирующая активность будет

зависеть от исходной концентрации клеток в культуральной среде до их

осаждения. Однако в ходе эксперимента не было выявлено такой зависимости.

Снижение температуры культивирования до 4ºС сопровождалось уменьшением

общего уровня биомассы штаммов Y. lipolytica S1, Y. lipolytica S2, A. rhombi S1,

A. rhombi S2 и N. coeliaca S1, однако при этом наблюдали повышение синтеза

ПАВ, о чем судили по более активному снижению ПН.

При сравнении результатов снижения ПН было установлено, что

супернатанты культур Y. lipolytica S1, Y. lipolytica S2 при обеих температурах

инкубации не показали существенного снижения ПН по сравнению со

значением исходной питательной среды (57,7 мН/м), что является

подтверждением того, что данные культуры могут образовывать клеточно-

связанные ПАВ (рис. 24, рис. 25).

Для штаммов A. rhombi S1 и A. rhombi S2 отсутствие снижения ПН при

4°С коррелировало с отсутствием проявления эмульгирующей активности в

супернатанте, выявленному измерением индекса Е24, и низкими показателями

гидрофобности клеток, а в случае S. amurskyense S4 – с очень низкими

значениями индекса эмульгирования. Вместе с тем, для штаммов артробактера

и штамма P. cibarius S3 на данном этапе нельзя было дать однозначного ответа

о природе синтезируемых ПАВ. Хотя данные культуры и не показали снижения

ПН супернатантов при обеих температурах, однако при низкой температуре в

них была обнаружена слабая эмульгирующая активность.

137

Рисунок 24. Сравнение поверхностного натяжения исследуемых культур

в культуральной среде с клетками (КС) и бесклеточном супернатанте (БС) при

20°С.

Рисунок 25. Сравнение поверхностного натяжения исследуемых культур

в культуральной среде с клетками (КС) и бесклеточном супернатанте (БС) при

4°С.

0 10 20 30 40 50 60 70

C. marina S2

C. marina S3

C. marina S4

Y. lipolytica S1

Y. lipolytica S2

A. rhombi S1

A. rhombi S2

N. coeliaca S1

P. cibarius S3

S. amurskyense S4

S. vesiculosa S5

Поверхностное натяжение, мН/м

КС

БС

0 10 20 30 40 50 60 70

C. marina S2

C. marina S3

C. marina S4

Y. lipolytica S1

Y. lipolytica S2

A. rhombi S1

A. rhombi S2

N. coeliaca S1

P. cibarius S3

S. amurskyense S4

S. vesiculosa S5

Поверхностное натяжение мН/м

КС

БС

138

Супернатанты штаммов C. marina S2, C. marina S3, C. marina S4 и S.

vesiculosa S5 при 20°С не проявляли поверхностно-активных свойств, однако

при 4°С происходило уменьшение значений их ПН на 7-15 мН/м относительно

исходного значения, что могло свидетельствовать о продукции разных типов

биосурфактантов: при 20°С – клеточно-связанных биоПАВ, при 4°С – как

внеклеточных, так и клеточно-связанных ПАВ, что подтверждается

результатами измерений индекса эмульгирования и показателя гидрофобности

клеток. Этот факт соотносится с результатами экспериментов других авторов,

согласно которым поверхностно-активные соединения C. marina представляют

собой смесь жирных кислот, являющимися компонентами клеточных

(мембран). Однако у данной культуры также наблюдали поверхностно-

активные молекулы, диффундировавшие вне клетки (Satpute et al., 2010),

связанные с везикулами наружной мембраны (Kulp, Kuehn, 2010).

4.2.4.4. Определение способности культур к снижению

поверхностного натяжения культуральной среды

Установлено, что присутствие клеток в КС усиливало эффект снижения

ПН в разной степени в зависимости от конкретного штамма. Согласно

литературным данным, микроорганизмы, снижающие поверхностное

натяжение более чем на 10 мН/м, могут являться перспективными

продуцентами ПАВ (Francy et al., 1991; Григорьян, 2004). Однако из других

источников следует, что штаммы, снижающие ПН до величины не ниже 50

мН/м можно считать неактивными; от 50 до 30 мН/м – слабыми продуцентами;

ниже 30 мН/м – потенциальными продуцентами (Яковлева, 2004). Как видно из

представленных данных (рис. 21, рис. 22), при 20°С в КС для десяти культур

было зафиксировано снижение ПН ниже 50 мН/м (все, кроме S. vesiculosa S5),

для восьми – ниже 40 мН/м (все, кроме P. cibarius S3, S. amurskyense S4 и S.

vesiculosa S5). При 4°С КС всех исследуемых штаммов снижала ПН ниже 50

мН/м, всех, кроме S. vesiculosa S5 – ниже 40 мН/м, двух штаммов (C. marina S2

и C. marina S4) – ниже 30 мН/м, одного штамма (C. marina S2) ниже 20 мН/м.

139

Последний штамм хоть и эффективно снижал ПН среды и значения показателя

гидрофобности клеток были высокими, однако его эмульгирующая активность

при низкой температуре инкубации была низкой. По литературным данным,

снижение ПН среды клетками, как и показатель гидрофобности, не всегда

соответствует их пенообразующим свойствам (Stratton et al., 2002). Можно

предположить, что эмульгирующая способность исследуемого штамма не

связана с образованием веществ, способных снижать поверхностное натяжение

и увеличивающих степень гидрофобности, что соотносится с результатами

экспериментов других авторов (Комлева и др., 2006).

Согласно Ребиндеру П.А. (Ребиндер, 1971) существует два типа ПАВ:

коллоидные (мылоподобные) и истинно растворимые в воде. Коллоидные ПАВ

по строению дифильны, т.е. состоят из двух частей: «головки» (сильно

полярной (гидрофильной) группы) и «хвоста» (неполярного (гидрофобного)

радикала). Благодаря такому строению коллоидные ПАВ могут растворяться в

воде, но в то же время они имеют сродство к УВ. При увеличении длины цепи

гидрофобного хвоста происходит возрастание поверхностной активности ПАВ

и способность к снижению межфазного натяжения (Поверхностно-активные

вещества…, 2002). Сравнение степени снижения ПН в культуральной среде с

клетками, показателей гидрофобности клеток и индексов эмульгирования

штаммов Y. lipolytica S1, Y. lipolytica S2, A. rhombi S1 позволяет сказать, что

данные культуры образуют ПАВ коллоидного типа. Совокупность результатов

всех методов определения поверхностной активности подтвердила, что при

20°С данные штаммы образуют клеточно-связанные биоПАВ, обеспечивающие

адсорбцию клеток на УВ. В случае дрожжей это предположение справедливо и

для 4°С. При этом поверхностно-активные соединения исследуемых дрожжей

можно отнести к биоэмульгаторам, которые способны эффективно снижать ПН.

По некоторым сведениям, дрожжи Y. lipolytica, действительно, продуцируют

комплекс биоэмульгирующих веществ, в состав которых входят белки,

углеводы и липиды, которые связаны с поверхностью клетки и способны ее

увеличивать гидрофобность (Zinjarde, Pant, 2002). Эмульгаторы дрожжей

140

являются составной частью клеточной стенки дрожжей и способствуют

поглощению алканов (Kim et al., 2000). Анализируя убыль УВ на 20-е сутки

культивирования и биоэмульгирующую активность культур, можно

предположить, что в данном случае биодеградация нефти (51% и 51%,

соответственно) связана с изменением клеточной поверхности и образованием

гидрофобного слоя на поверхности клеток.

Для штаммов артробактера A. rhombi S1, A. rhombi S2 при низкой

температуре было обнаружено снижение ПН в присутствии клеток, в то время

как эмульгирования гексадекана в присутствии не наблюдали, а показатели

гидрофобности были низкими. Вместе с тем, в других исследованиях было

показано, что Arthrobacter sp. продуцировал до 75% внеклеточных

биосурфактантов при выращивании на ацетате или этаноле, и 100% - при росте

на УВ (Mulligan, Gibbs, 1993; Putheti, Patil, 2009). Можно предположить, что A.

rhombi S1, A. rhombi при низкой температуре при росте на гидрофильных

субстратах не проявляют биоэмульгирующих свойств или синтезируют

небольшое количество ПАВ, прочно связанных с поверхностью клеток, в связи

с чем необходимо применение дополнительных методов их регистрации.

В случае C. marina S2, C. marina S3, C. marina S4, A. rhombi S2, N.

coeliaca S1, P. cibarius S3, S. amurskyense S4 и S. vesiculosa S5 сравнение

результатов снижения ПН в супернатанте и в культуральной среде с клетками

подтвердило предположение, что при 4°С штаммы образуют как внеклеточные,

так и клеточно-связанные поверхностно-активные вещества. Ранее для штамма

Cobetia sp. MM1IDA2H-1 было отмечено образование лишь внеклеточных

биоПАВ при росте в присутствии серосодержащего гетероциклического

ароматического углеводорода дибензотиофена (DBT), которые не удавалось

регистрировать при росте в сукцинат-содержащей среде (Ibacache-Quiroga et al.,

2013). Однако в исследованиях тех же авторов было показано присутствие

гидрокси-жирных кислот в бесклеточных супернатантах данного штамма, что

может быть связано с образованием везикул наружной мембраны, содержащих

такие соединения. На примере S. vesiculosa М7 (Т) ранее было показано, что

141

вид образует небольшие сферические структуры (от 20 до 250 нм) на наружной

мембране клетки, которые содержат бактериальные липиды, белки наружной

мембраны, содержимое периплазмы и другие нерастворимые компоненты. По

некоторым данным, внеклеточный материал представляет собой сетку,

состоящую из капсульного полимера вокруг клеток и многочисленных везикул

(Frias et al., 2010). При формировании этих пузырьков часть внутренней

мембраны вытягивается, захватывает цитозольное содержимое и заключается в

капсулу (Perez-Cruz et al., 2013). Cтоит отметить, что к образованию везикул

способны не только грамотрицательные бактерии, но и грамположительные, а

также эукариоты (Lee et al., 2009; Rivera et al., 2010). При этом везикулы могут

быть как внеклеточными, так и клеточно-связанными.

Везикулы поступают в окружающую среду для выполнения нескольких

функций: участия в межвидовой коммуникации, передвижении, формировании

биопленок, адгезии к кристаллам льда и криозащиты (Cooksey, Wigglesworth-

Cooksey, 1995; Wetherbee et al., 1998; Krembs et al., 2002; Perez-Cruz et al., 2013).

Выявлено, что мембранные пузырьки принимают участие в деградации

ароматических УВ и транспорте длинноцепочечных жирных кислот (Frias et al.,

2010). На основании этих данных можно предположить, что данные структуры

являются ПАВ.

Подобные внеклеточные образования были обнаружены и у Psychrobacter

fozii NF23 (Frias et al., 2010). В этих же исследованиях для Shewanella

livingstonensis NF22 было показано, что при низкой температуре

культивирования (4°С) увеличивался синтез везикул, при этом они обладали

одинаковым размером (со средним диаметром 26,6 нм) и были равномерно

распределены между клетками. В то же время при росте при 18°С выявлено

меньшее количество везикул, они были крупнее и неодинакового размера, а

слой волокон вокруг клеток оказался более расплывчатым и тонким. Возможно,

синтез везикул, которые могут содержать в своем составе липиды,

полисахариды и белки, коррелирует со степенью гидрофобности клеток. Так, в

нашем эксперименте при 4°С было отмечено увеличение показателей

142

гидрофобности клеток рядом культур, в том числе у S. vesiculosa S5 и P.

cibarius S3, в то время как при 20°С аналогичные показатели были существенно

ниже.

Основываясь на результатах экспериментов по снижению ПН и

измерению показателя гидрофобности клеток, можно было бы сказать, что при

20°С культуры продуцируют только клеточно-связанные сурфактанты (в

культуральной среде с клетками уменьшение ПН коррелировало с

эмульгированием гексадекана при измерении Е24), однако наряду с этим

методом Купера была выявлена способность супернатантов перечисленных

культур эмульгировать гидрофобный субстрат несмотря на отсутствие

снижения ПН в супернатанте. Согласно классификации ПАВ по Ребиндеру

П.А. существуют истинно растворимые в воде ПАВ. Они имеют недостаточно

гидрофильную группу (например, короткоцепочечные спирты, амины), или

недостаточно развитый углеводородный радикал (низшие жирные кислоты),

вследствие чего они поверхностно активны, но не обязательно приводят к

значительному снижению поверхностного натяжения, что, вероятно,

справедливо и в отношении перечисленных выше культур. Кроме того,

известно, что низкомолекулярные биоПАВ эффективнее снижают

поверхностное натяжение, в то время как высокомолекулярные способствуют

стабилизации эмульсий (Rosenberg, Ron, 1999; Calvo et al., 2009). Отсюда

можно предположить, что, рост клеток исследуемых микроорганизмов при

20°С вызывает синтез высокомолекулярных биосурфактантов, а при 4°С –

низкомолекулярных. Таким образом, данные культуры образуют разные типы

биоПАВ вне зависимости от температуры, но для оценки поверхностно-

активных свойств клеток следует использовать комплекс методов,

позволяющих получить более полное представление о характере синтеза

биоэмульгирующих веществ.

В данном случае биоэмульгирующая активность также влияет на убыль

УВ нефти, однако в случае синтеза внеклеточных биосурфактантов

предполагаемый механизм действия подразумевает создание микроэмульсий

143

нефти вблизи клеток. Внеклеточные биосурфактанты, по-видимому,

обеспечивают солюбилизацию гидрофобного субстрата, способствуя

биодеградации и интенсификации испарения УВ. Таким образом,

солюбилизованные капли нефти, окруженные поверхностно-активными

веществами, оказываются в толще среды и легкодоступны для биодеградации.

Кроме того, образовавшиеся микроэмульсии обеспечивают увеличение

удельной площади взаимодействия поверхности углеводородных капель с

жидкой и газовой фазами, что может способствовать интенсификации процесса

испарения УВ с водной поверхности.

На основании полученных результатов можно заключить, что все

исследуемые нами штаммы являются продуцентами биогенных поверхностно-

активных веществ. При этом их эмульгирующая активность, локализация

биосурфактантов, степень гидрофобности клеток, количество и тип

биосурфактантов, уровень поверхностного натяжения, а также механизм

действия биоПАВ существенно зависят от штамма-продуцента и температуры

его выращивания. Если культуры Y. lipolytica S1, Y. lipolytica S2, A. rhombi S1

модифицируют поверхность клеток, обеспечивая их адсорбцию к

углеводородной фазе, то остальные культуры являются продуцентами как

эндогенных, так и экзогенных биосурфактантов, которые не только

способствуют биодеградации, но и интенсифицируют процессы испарения УВ

нефти. Исследуемые штаммы показали высокий уровень биодеградации УВ,

сравнимый с соответствующими значениями для УВО микроорганизмов в

условиях нормальной температуры (Плешакова и др., 2005; Сопрунова,

Клюянова, 2007; Ветрова и др., 2013), что говорит о возможности их

применения при создании биопрепаратов для очистки нефтяных загрязнений в

условиях низкой температуры.

4.3. Хранение микроорганизмов

Процесс исследования биотехнологического потенциала

микроорганизмов-нефтедеструкторов включает не только изучение их

144

активности в отношении нефти, но и множество других задач, одной из

которых является подбор подходящих методов хранения эффективных

штаммов. Разработка технологий консервации микроорганизмов, способных

длительно сохранять жизнеспособность, морфологические свойства,

генетическую стабильность и функциональную активность клеток

микроорганизмов различных систематических групп, является актуальной

задачей современной биотехнологии (Петриков и др., 2010; Рогозина, 2011).

При этом метод сохранения культур должен обеспечивать максимально

продолжительное время их хранения. Одними из перспективных и широко

применяемых методов сохранения культур микроорганизмов являются методы

криоконсервации и лиофилизации.

4.3.1. Криоконсервирование культур морских

углеводородокисляющих микроорганизмов

Способ криоконсервирования заключается в переводе биологических

объектов в замороженное состояние с возможностью восстановления их

биологических функций после размораживания. Преимуществами данного

метода хранения микроорганизмов являются сохранение высокого числа

жизнеспособных клеток, стабильности их физиолого-биохимических и

генетических свойств, методическая простота исполнения, низкая вероятность

заражения культур, а также возможность их использования сразу же после

разогрева без необходимости дополнительной активации. Качество процесса

криоконсервации зависит от ряда факторов: выбора криозащитных агентов или,

как их еще называют, криопротекторов или криофилактиков (Huggins, 1964), их

концентраций, скоростей замораживания-оттаивания, состава сред

культивирования до и после криоконсервирования и т.д.

По характеру действия различают эндоцеллюлярные криопротекторы,

которые проникают через плазматическую мембрану в клетки и обеспечивают

как внутриклеточную, так и внеклеточную защиту от повреждающего действия

кристаллов и экзоцеллюлярные, непроникающие в клетки криопротекторы,

145

обеспечивающие защиту на наружной поверхности клеточной мембраны

(Mazur, 1965; Похиленко и др., 2009). Деление на проникающие и

непроникающие протекторы может быть основано на молекулярном весе

используемых для криозащиты веществ (Nash, 1966; Пушкарь и др., 1978;

Чуйко, 1989), но более традиционно их разделение по скорости проникновения

в клетку (Meryman, 1971): быстро проникающие (в течение 30 мин) - метанол,

этанол, этиленгликоль, пропиленгликоль, диметилформамид,

диметилсульфоксид (ДМСО); проникающие более медленно - глицерол;

непроникающие (в концентрациях 10-40%) – моно-, олиго- и полисахариды,

маннит, сорбит, декстран, гидроксиэтилкрахмал, альбумин, желатин,

поливинилпирролидон (ПВП), полиэтиленгликоль (ПЭГ) и т.д. (Hubaalek,

2003). Кроме того, некоторые из них достигают только клеточной стенки (КС),

но не проникают через цитоплазматическую мембрану (ЦМ). На этом

основании выделяют 3 категории криоагентов (Tao, Li, 1986): (1) проникающие

через КС и ЦМ (ДМСО, глицерин); (2) проникающие через КС, но не через ЦМ

(моно- и дисахариды, аминокислоты, полимеры с низкой МВт, например, ПЭГ-

1000); (3) не проникающие даже через КС (полимеры с более высокой МВт -

белки, полисахариды, ПЭГ-6000, декстран, ПВП и т.д.). На основании данной

классификации такие криопротекторы, как ДМСО и глицерин, в дальнейшем

упоминаются как «проникающие» или «эндоцеллюлярные», а криопротекторы,

содержащие углеводы, декстран и СОМ – как «непроникающие» или

«экзоцеллюлярные».

Для длительного сохранения исследуемых культур морских

психроактивных УВО микроорганизмов и их функциональной активности

методом заморозки использовали клеточные суспензии бактерий плотностью

не менее 109 КОЕ/мл, дрожжей – не менее 10

7 КОЕ/мл, находящиеся в конце

экспоненциальной и ранней стационарной фазе роста. Для культивирования

клеток использовали богатую модифицированную среду на основе РСА. В

работе использовали два типа криопротекторов: непроникающие (СОМ – 10%;

глюкоза – 7,5%; СОМ – 10% сахароза – 7,5%; декстран – 10%; глюкоза – 7,5%;

146

декстран – 10%; сахароза – 7,5%) и проникающие (5% ДМСО и 10% глицерин).

В качестве контроля сравнения замораживали клеточные суспензии без

внесения криозащитных агентов. Возобновление роста и жизнеспособность

культур проверяли на плотной модифицированной среде на основе РСА.

Высевы криоконсервированных образцов проводили через 40 мин после

оттаивания и через 7 суток хранения. Для оценки эффективности

криоконсервирования вели подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ),

поскольку воздействие низких температур вызывает повреждение части клеток,

вследствие чего в деконсервированных клеточных суспензиях может снижаться

их общее количество.

Было установлено, что устойчивость штаммов к воздействию низких

температур различна, однако корреляции между криорезистентностью и

таксономической принадлежностью не было выявлено. Штаммы N. coeliaca S1

и A. rhombi S2 показали самую высокую выживаемость вне зависимости от

присутствия криозащитных агентов или их типа. Процент жизнеспособных

клеток в случае N. coeliaca S1 варьировал от 79% в присутствии смеси глюкозы

и декстрана до 95% в присутствии ДМСО. В случае A. rhombi S2 выживаемость

клеток составляла от 65% в присутствии смеси сахарозы и декстрана до 96%

при наличии в среде ДМСО (рис. 26). Штамм S. amurskyense S4 демонстрировал

самые низкие показатели выживаемости при заморозке с разными видами

криофилактиков – от 14% до 19%. Для штамма C. marina S2 применение

разных комбинаций эндоцеллюлярных криопротекторов вызывало

значительные потери количества клеток от исходного их количества, и данные

хладоограждающие агенты оказались неприемлемыми для сохранения клеток.

В то же время при замораживании культуры с эндоцеллюлярными

протекторами была достигнута сохранность клеток до 52% в случае ДМСО и

36% в случае глицерина.

147

Рисунок 26. Влияние криоконсервации на выживаемость клеток при

хранении культур до 1 недели. Примечание. «Гл-СОМ» - комбинация глюкозы

и СОМ; «Сах-СОМ» - комбинация сахарозы и СОМ; «Гл-д» - комбинация

глюкозы и декстрана; «Сах-д» - комбинация сахарозы и декстрана.

По литературным данным проникающие криопротекторы обладают более

эффективным защитным действием от повреждающих процессов, поскольку

они стабилизируют свободную воду в клетке, способствуя при замораживании

переходу ее в аморфное мелкокристаллическое и стеклообразное состояние,

неопасное для клеточных мембран (Сведенцов, 2010). Проникающие

криопротекторы создают защитный слой из своих макромолекул на

цитоплазматической мембране, уплотняют ее, повышают устойчивость

мембраны к повреждающему действию кристаллов, предупреждая переход

кристаллизации воды из внеклеточной среды во внутриклеточную (Сведенцов,

2010). Предполагается, что внутриклеточная кристаллизация не является

спонтанной, а возникает в результате прорастания внутриклеточного льда через

каналы клеточной мембраны (Mazur, 1965). По результатам эксперимента была

отмечена высокая защитная эффективность ДМСО для ряда штаммов: C.

marina S2, C. marina S3, C. marina S4, Y. lipolytica S1, Y. lipolytica S2, A. rhombi

15

82

63

73

82

41

95

68

70

14

25

5

94

32

46

63

54

75

94

62

16

50

23

60

41

42

79

79

63

16

46

38

21

32

29

63

65

82

63

15

7

52

78

93

58

55

49

96

95

65

14

26

36

71

83

45

36

68

87

68

72

19

50

1

43

2

25

69

43

94

91

5

3

0

C.marina S2

C.marina S3

C.marina S4

Y.lipolytica S1

Y.lipolytica S2

A.rhombi S1

A.rhombi S2

N.coeliaca S1

P.cibarius S3

S. amurskyense S4

S. vesiculosa S5

Выживаемость, %

Гл-СОМ Сах-СОМ Гл-д Сах-д ДМСО 5% Глицерин 10% Заморозка без ЗС

148

S2, N. coeliaca S1. Выживаемость клеток при этом составляла 55-96%.

Глицерин оказался более эффективен для сохранения штаммов A. rhombi S1, P.

cibarius S3, S. amurskyense S4, S. vesiculosa S5, их выживаемость в его

присутствии достигала 19-72%. В исследовании Хасаевой Ф.М. выживаемость

штамма Arthtrobacter sp. KM-4 в присутствии 10% глицерина составляла около

40% от исходного спустя 1 сутки и 35% спустя 1 месяц хранения (Хасаева,

2011), в то время как нами были получены более высокие результаты

выживаемости: 68% для A. rhombi S1 и 87% A. rhombi S2.

Вместе с тем, защитное действие некоторых непроникающих

криопротекторов оказалось не менее эффективным, чем экзоцеллюлярных

агентов, а в отдельных случаях титр жизнеспособных клеток в их присутствии

был выше, чем при использовании ДМСО и глицерина. Так, криоконсервант на

основе сочетания глюкозы и СОМ обеспечивал сохранение 73% и 82% клеток

дрожжей Y. lipolytica, в то время как в присутствии ДМСО была

зарегистрирована их выживаемость на уровне 58% и 55%. Использование

указанной выше комбинации сохранило 95% клеток A. rhombi S2 и 70% клеток

P. cibarius S3, а в ответ на добавление 5% ДМСО - 96% и 72%, соответственно,

т.е. эффективность действия разных типов криопротекторов оказалась

сопоставимой. Высокие показатели выживаемости клеток C. marina S3, N.

coeliaca S1 и S. vesiculosa S5 наблюдали при использовании комбинации 7,5%

раствора сахарозы и 10% СОМ: 94%, 94% и 50% по сравнению с 78%, 95% и

50% при использовании 5% ДМСО и в последнем случае – 10% глицерина. Для

штамма A. rhombi S1 схожие показатели сохранности клеток были обнаружены

при использовании комбинации 7,5% сахарозы и 10% декстрана (63%) и 10%

глицерина (68%).

Согласно литературным данным, ДМСО и глицерин могут оказывать

токсическое влияние на деконсервированные клетки, в связи с чем возникает

необходимость их удаления из размороженных суспензий (Белоус и др., 1987)

путем последовательных отмываний и центрифугирования. В нашем

эксперименте отмывка клеток после их размораживания от данных

149

криопротекторов в подавляющем большинстве случаев вызывала снижение

титра жизнеспособных клеток относительно титра клеток в присутствии

проникающих агентов (таблица 17). Кроме того, удаление криоконсервантов из

размороженных объектов путем отмывания дополнительно травмирует клетки,

что вызывает снижение их численности.

Таблица 17. Выживаемость клеток в присутствии криопротекторов 10%

ДМСО и 5% глицерин и при их отмывании.

Название культуры

Выживаемость, %

Клетки в

присутствии

5% ДМСО

Клетки в

присутствии

10%

глицерина

Отмытые от

ДМСО клетки

Отмытые от

глицерина

клетки

C. marina S2 52 36 77 54

C. marina S3 78 71 56 43

C. marina S4 93 83 58 6

Y. lipolytica S1 58 45 20 15

Y. lipolytica S2 55 36 36 5

A. rhombi S1 49 68 58 57

A. rhombi S2 96 87 80 64

N. coeliaca S1 95 68 93 53

P. cibarius S3 65 72 64 55

S. amurskyense S4 14 19 7 15

S. vesiculosa S5 26 50 34 50

Стоит отметить, что количество жизнеспособных клеток культур N.

coeliaca S1 и A. rhombi S2 без использования криопротекторов составляло 91%

и 94%, соответственно, и было сопоставимо с выживаемостью в присутствии

ДМСО. По-видимому, устойчивость исследуемых культур к воздействию

низкой температуры определяется их структурными и физиологическими

150

особенностями (Ившина, 1997): присутствием специфических липидных

компонентов в составе клеточной стенки, синтезом жирных кислот с нечетным

числом углеродных атомов, поверхностно-активных соединений

(биосурфактантов). Помимо указанных штаммов численность жизнеспособных

клеток при их заморозке без защитных соединений была достаточно высока для

культур C. marina S3, Y. lipolytica S2 и A. rhombi S1 и составляла около 43%,

69% и 43%, соответственно. Для остальных микроорганизмов показатель

жизнеспособных клеток без криопротекторов значительно снизился по

сравнению с исходным и варьировал от 0,39% до 25%. Ранее в работах была

подчеркнута зависимость сохранности клеток от скорости воздействия

криопротектора на биообъект, молекулярной массы криоагентов (при ее

увеличении выживаемость чаще снижается) и видовой принадлежности клеток

(Гордиенко, Пушкарь, 1994). Полученный результат может свидетельствовать о

том, что в некоторых случаях криопротекторы, в том числе и непроникающего

типа, могут оказывать цитотоксическое действие на клетки некоторых морских

микроорганизмов.

Важным критерием оценки эффективности криоконсервации является

проверка сохранения деконсервированными культурами основных

морфологических и функциональных особенностей. Микроскопические

исследования не выявили изменений морфологических характеристик клеток

после заморозки и оттаивания по сравнению с нативными клетками. Была

сохранена стабильность основных макроморфологических показателей

(размеров, формы колоний, их цвета, консистенции и т.д.). Деструктивную

активность в отношении УВ после криоконсервации оценивали в жидкой среде

Таусона с УВ при 4°С. Показано, что все изучаемые штаммы сохраняли

способность к разрушению УВ, о чем судили по образованию мицелл нефти у

поверхности раздела фаз, разбивании пленки нефти и помутнении среды,

свидетельствующем о наращивании биомассы клеток.

Таким образом, исходя из полученных результатов, можно заключить,

что криоконсервация является перспективным и эффективным методом

151

сохранения культур морских микроорганизмов, позволяющим с помощью

криопротекторной обработки достигнуть выживаемости клеток выше 90% в

случае культур C. marina S3, C. marina S4, A. rhombi S2 и N. coeliaca S1; 70-80%

и выше – в случае культур Y. lipolytica S1, Y. lipolytica S2, P. cibarius S3; 50-60%

и выше – в случае культур C. marina S2, A. rhombi S1, S. vesiculosa S5; до 20% -

в случае S. amurskyense S4. Однако ни один из испытанных в работе

криопротекторов не обладает универсальным действием. Показано, что

непроникающие криопротекторы, в частности, 7,5% раствор сахарозы с 10%

СОМ и 7,5% раствор глюкозы с 10% СОМ обладают не менее, а иногда даже

более эффективным защитным действием, о чем свидетельствуют высокие

показатели выживаемости. В связи с этим для надежности процесса

консервации высокого количества микроорганизмов рекомендовано

применение нескольких видов протекторов. Данный метод рекомендован для

сохранения крупных коллекций микроорганизмов, поскольку он прост в

исполнении и не трудоемок.

4.3.2. Лиофилизация культур морских углеводородокисляющих

микроорганизмов

Одним из альтернативных криоконсервированию способов хранения

культур микроорганизмов является их хранение в лиофилизированном

состоянии. Лиофилизация – процесс, состоящий из предварительного

замораживания биоматериала и его последующего высушивания в вакууме.

Лиофильное (сублимационное) высушивание зарекомендовало себя как

надежный метод длительного хранения микробной биомассы, а сухие формы

препаратов – как наиболее удобные формы для транспортировки на большие

расстояния. Вместе с тем, эффективность лиофилизации зависит от множества

факторов: биологических особенностей микроорганизмов, связанных с их

видовой специфичностью, возраста культуры, состава защитных сред, режима

сублимации, условий хранения и т.д. Цель данного эксперимента состояла в

исследовании жизнеспособности штаммов после лиофилизации и в процессе

152

хранения и их биологической активности после восстановления из

высушенного состояния.

Одним из факторов, оказывающих влияние на длительность хранения

биоматериала, является выбор защитной среды. Известно, что непроникающие

протекторы, использующиеся в процессе криоконсервации, могут с успехом

применяться и для лиофилизации культур (Похиленко и др., 2009). Поэтому в

качестве защитных сред использовали те же комбинации (глюкоза + СОМ,

сахароза + СОМ, глюкоза + декстран, сахароза + декстран) и проводили

сравнительную оценку выживаемости клеток в зависимости от состава данных

защитных сред.

Для успешной лиофилизации плотность микроорганизмов в защитной

среде должна быть как можно более высокой, 109−10

10 кл/мл (Нетрусов и др.,

2005). Исходная плотность клеток для всех выделенных бактериальных

культур, выращенных в жидкой модифицированной среде на основе РСА,

составляла не менее 1010

КОЕ/мл, дрожжей – не менее 108 КОЕ/мл. Считается,

что увеличение плотности суспензии, закладываемой на хранение,

обусловливает увеличение количества жизнеспособных клеток после

лиофилизации (Malik, 1992; Malik, Hoffmann, 1993). По некоторым данным,

уплотненные суспензии клеток имеют более высокий титр выживания, чем

разбавленные, так как лизированные клетки и клеточные вещества могут

выполнять криозащитную роль (Шендеров и др., 1998). Поэтому для

увеличения плотности суспензий клетки до смешивания с защитными средами

осаждали центрифугированием. Количество жизнеспособных клеток оценивали

сразу после лиофилизации, а также спустя 0,5 и 1 год хранения при 4°С.

Показано, что численность жизнеспособных клеток изучаемых

микроорганизмов сразу после лиофилизации в значительной степени зависела

от состава защитной среды, а также от их видовой принадлежности. Наилучшая

выживаемость клеток была отмечена в случае культур Y. lipolytica S1, Y.

lipolytica S2 и P. cibarius S3 при использовании комбинации «глюкоза +

153

декстран». Число жизнеспособных клеток составляло 84%, 92% и 90%,

соответственно (рис. 27).

Рисунок 27. Влияние состава защитных сред на выживаемость культур

после лиофилизации. Примечание. «Гл-СОМ» - комбинация глюкозы и СОМ;

«Сах-СОМ» - комбинация сахарозы и СОМ; «Гл-д» - комбинация глюкозы и

декстрана; «Сах-д» - комбинация сахарозы и декстрана.

Наибольшее число клеток штаммов A. rhombi S1 сохранялось при

использовании протектора «сахароза + СОМ» - 73%; S. amurskyense S4 - при

использовании комбинации «сахароза + декстран» - 72%; N. coeliaca S1 - при

использовании комбинаций «сахароза + СОМ» и «сахароза + декстран» - 55% в

обоих случаях; A. rhombi S2 – на защитной среде «сахароза + декстран» - 36%.

Все штаммы C. marina демонстрировали низкую выживаемость клеток на среде

«глюкоза + декстран», которая варьировала от 8% до 13%, однако и при

использовании других защитных сред число жизнеспособных клеток было

невелико и составило от 15% до 24%. Жизнеспособность культуры S. vesiculosa

S5 оказалась чрезвычайно чувствительной и неустойчивой к процессу

19

21

20

57

75

56

33

42

76

51

6

18

24

17

72

90

73

30

55

68

35

7

9

8

13

84

92

50

27

53

90

47

2

15

22

18

73

64

30

36

55

70

72

0

C. marina S2

C. marina S3

C. marina S4

Y. lipolytica S1

Y. lipolytica S2

A. rhombi S1

A. rhombi S2

N. coeliaca S1

P. cibarius S3

S. amurskyense S4

S. vesiculosa S5

Выживаемость, %

Гл-СОМ Сах-СОМ Гл-д Сах-д

154

лиофилизации, о чем свидетельствовали практические нулевые показатели

выживаемости.

Таким образом, полученные результаты не позволили отдать

предпочтение какой-либо из сред для сохранения культур морских УВО

микроорганизмов. Поэтому с целью получения экспресс-оценки длительности

хранения исследуемых культур и выбора защитной среды, обеспечивающей

эффективное длительное хранение, применяли метод «ускоренного хранения»

(тест термостабильности).

4.4. «Тест на ускоренное хранение» лиофилизированных культур

морских углеводородокисляющих микроорганизмов

Метод «ускоренного хранения» (тест термостабильности) включает

исследование жизнеспособности лиофилизированных культур с

использованием уравнения Аррениуса при повышенных температурах и

экстраполяцию полученных результатов на реальные условия хранения (4°С).

Основной принцип метода заключается в том, что при повышенной

температуре существенно возрастает подвижность молекул воды и других

веществ, вследствие чего возрастает и скорость химических реакций,

лимитирующих срок хранения (Федюкина, Волков, 2009), в связи с чем

изменения свойств препарата, присущие окончанию срока хранения,

происходят значительно быстрее. В основе метода лежат два теоретических

положения (Кузнецов и др., 1977):

1. Скорость снижения количества жизнеспособных клеток от времени

описывается уравнением кинетики первого порядка:

где M0 – исходное количество клеток в образце, M – количество клеток в

момент времени t, К – константа скорости физико-химических процессов,

протекающих в образце при данной температуре и приводящих к снижению

выживаемости клеток.

tKMM 0lnln

155

2. Зависимость константы скорости К от температуры описывается

уравнением Аррениуса:

где К0 – предэкспоненциальный множитель, Е – энергия активации, R –

газовая постоянная, Т – абсолютная температура (273°+t°). Логарифмируя

данное уравнение, получаем:

TR

EKK

1lnln 0 или

TR

EKK

1lnln 0

Графически данное уравнение изображается прямой линией в

координатах (-ln К) и 1/T. Отношение E/R является tg угла наклона прямой к

оси абсцисс. Таким образом, пользуясь графиком, можно путем экстраполяции

прогнозировать выживаемость клеток при любой температуре хранения.

Для прогнозирования срока хранения исследуемых культур

микроорганизмов ампулы с лиофилизированными клетками хранили при 35°С

или 50°С, после чего оценивали жизнеспособность микроорганизмов.

Было установлено, что высокая температура хранения оказывает

отрицательное воздействие на выживаемость исследуемых культур; в

частности, при использовании защитных сред «глюкоза + СОМ» и «глюкоза +

декстран»: показатели выживаемости клеток снижались до нулевых значений

спустя 10 сут хранения при 50°С и 35°С, в связи с чем прогнозирование

выживаемости оказалось невозможным. При этом наблюдали изменение

структуры матрикса лиофилизированных культур, его плотности, пористости,

цвета со светло-желтого на коричневый, что свидетельствовало о протекании в

препаратах реакции Майяра – сложной последовательности химических

превращений, происходящих при нагревании между редуцирующими сахарами

и свободными аминокислотами и пептидами (Ames, 1988). Глюкоза в отличие

от сахарозы является редуцирующим сахаром, вследствие чего обладает

довольно высокой реакционной способностью и быстро вовлекается в реакции

неферментативного потемнения при повышении температуры хранения (рис.

RT

E

eKК

0

156

28). Предполагается, что отсутствие роста микробных клеток после их

хранения при 35°С или 50°С может быть обусловлено возможным

ингибирующим действием продуктов реакции Майяра, что подтверждается

литературными данными (Einarsson et al., 1983; Einarsson et al., 1988).

Рисунок 28. Неферментативное потемнение биомассы клеток в среде с

протекторами, содержащими глюкозу (две ампулы справа).

На основании ускоренного теста термостабильности был сделан прогноз

времени хранения лиофилизированных культур в сахарозосодержащих

защитных средах при 4°С (таблица 18). Для этого по уравнению Аррениуса

были рассчитаны значения констант K, характеризующих скорость физико-

химических процессов, протекающих в лиофилизированных препаратах при

данной температуре и приводящих к снижению выживаемости клеток. При

изучении влияния сахарозосодержащих защитных сред на выживаемость

микроорганизмов, было установлено, что высокие значения титра клеток

микроорганизмов, определяемые непосредственно после лиофилизации, не

157

всегда коррелируют с длительностью сроков сохранения жизнеспособности

культур.

Проведенные исследования показали, что культуры выдерживают

процесс лиофилизации с разной степенью успешности. Несмотря на то, что

комбинации «сахароза + СОМ» и «сахароза + декстран» обеспечивали

хорошую выживаемость культур C. marina S2, C. marina S4, P. cibarius S3

после лиофилизации, при длительном хранении (4°С) в них в течение первого

года хранения ожидалось сильное и быстрое падение титра жизнеспособных

клеток по сравнению с исходным значением, особенно в случае среды

«сахароза + декстран». На рисунке 29 представлены графики зависимости

концентрации жизнеспособных клеток на примере C. marina S4 при

температуре 35°С и 50°С в защитных средах «сахароза+СОМ» и

«сахароза+декстран».

Рисунок 29. График зависимости концентрации жизнеспособных клеток

(M) от времени хранения при температуре 50°С и 35°С для C. marina S4 в

присутствии защитной среды: а – 7,5% сахароза + 10% СОМ; б - 7,5% сахароза

+ 10% декстран.

Из приведенных данных следует, что численность жизнеспособных

клеток C. marina S4 существенно снижается при хранении при 50°С, особенно в

случае комбинации «сахароза+декстран», достигая нулевых значений.

Пользуясь полученными графиками, путем экстраполяции находили константу

y = -0,633x + 22,114R² = 0,9971

y = -0,2995x + 21,998R² = 0,9997

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20

Ln M

Время, сутки

50оС

35оС

y = -1,3199x + 19,016R² = 0,8322

y = -0,6x + 21,199R² = 0,9924

-5

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20

Ln M

Время, сутки

50оС

35оС

а б

158

К для 4°С и прогнозировали выживаемость клеток. Согласно прогнозу время

хранения данных культур с использованием среды «сахароза + СОМ» могло

составить от 3−4 мес. до 11-12 мес., до падения титра жизнеспособных клеток

до 102

кл/мл, еще гарантирующим восстановление культур (Ившина и др.,

1994). Однако при сравнении полученных экспериментально (таблица 19) и

прогнозируемых данных для культур C. marina S2, C. marina S3, C. marina S4,

P. cibarius S3 оказалось, что реальный титр клеток, хранившихся при 4°С в

течение 0,5 и 1 года, намного выше ожидаемого. Это может свидетельствовать,

что экспериментальные температуры хранения 35°С или 50°С являются

слишком высокими для данных грамотрицательных микроорганизмов, и

последующая реактивация культур дает заниженные результаты титра клеток, в

связи с чем расчет константы Аррениуса является неточным. Полученный

результат свидетельствует о необходимости дальнейших исследований не

только по подбору защитных сред для лиофилизации данных культур УВО

микроорганизмов, но и возможных температур хранения.

Вместе с тем, дрожжевыми штаммами Y. lipolytica S1, Y. lipolytica S2, а

также бактериями N. coeliaca S1, S. amurskyense S4 и A. rhombi S1 были

продемонстрированы высокие показатели прогнозируемой выживаемости. На

рисунке 30 представлены графики зависимости концентрации жизнеспособных

клеток на примере культуры N. coeliaca S1 в защитных средах

«сахароза+СОМ» и «сахароза+декстран». Из представленных данных следует,

что увеличение температуры хранения культуры N. coeliaca S1 не влечет за

собой столь быстрого вырождения бактериальной суспензии, как в случае

исследуемых грамотрицательных микроорганизмов. Предполагаемый срок

хранения данных культур при 4°С с использованием защитной среды «сахароза

+ СОМ» может составить не менее 45 лет.

159

Рисунок 30. График зависимости концентрации жизнеспособных клеток

(M) от времени хранения при температуре 50°С и 35°С для N. coeliaca S1 в

присутствии защитной среды: а – 7,5% сахароза + 10% СОМ; б - 7,5% сахароза

+ 10% декстран.

Культуры дрожжей Y. lipolytica S1, Y. lipolytica S2 и грамположительных

микроорганизмов N. coeliaca S1, S. amurskyense S4, A. rhombi S1 оказались

более устойчивы к воздействию подобранных температур хранения, и

прогнозируемые ориентировочные показатели выживаемости в случае

защитной среды «сахароза + СОМ» коррелировали с экспериментально

полученными. Известно, что грамположительные бактерии лучше переносят

воздействие различных повреждающих факторов, чем грамотрицательные

(Miyamoto-Shinohara et al., 2000), что подтверждается и результатами

проведенного эксперимента. Клетки данных микроорганизмов отличаются

повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот в клеточных

стенках, вероятно, обеспечивающих устойчивость клеток не только к

замораживанию-высушиванию, но и повышенным температурам хранения.

Таким образом, на основе метода «ускоренного хранения» с

использованием уравнения Аррениуса была показана возможность

прогнозирования выживаемости активных в отношении УВ морских

бактериальных культур. На основании проведенного эксперимента можно

заключить, что наиболее пригодной защитной средой для длительного

y = -0,0094x + 23,213R² = 0,9845

y = -0,033x + 23,26R² = 0,8695

22,5

22,6

22,7

22,8

22,9

23

23,1

23,2

23,3

0 5 10 15 20

LnM

Время, сутки

35оС

50оС y = -0,0325x + 23,229R² = 0,9906

y = -0,0118x + 23,246R² = 0,7223

22,6

22,7

22,8

22,9

23

23,1

23,2

23,3

0 5 10 15 20

LnM

Время, сутки

50оС

35оС

а б

160

сохранения большинства исследуемых культур морских УВО микроорганизмов

является комбинация 7,5% сахарозы с 10% СОМ. Максимальные значения

выживаемости непосредственно после лиофилизации были показаны

культурами Y. lipolytica S1, N. coeliaca S1 и P. cibarius S3, численность клеток

которых так же оставалась на самом высоком уровне относительно других

культур спустя 1 год хранения при 4°С. При этом количество жизнеспособных

клеток во всех образцах составило не менее 108-10

10 кл/мл и снизилось всего на

один порядок, что существенно превышает тот уровень, что необходим для

восстановления популяции микроорганизмов (Ившина и др., 1994). Возможно,

в клетках данных микроорганизмов скорость окислительных процессов

значительно ниже, в связи с чем наблюдается более медленное падение титра

клеток с течением времени. В результате проведенных исследований

подобраны методы эффективного длительного сохранения культур УВО

морских микроорганизмов, которые позволяют сохранить большое число

жизнеспособных клеток с высокой функциональной активностью и могут быть

использованы при получении сухой формы биопрепарата для утилизации

нефтяных загрязнений в северных регионах.

161

Таблица 18. Прогнозируемые и экспериментально полученные показатели выживаемости

лиофилизированных клеток морских УВО микроорганизмов при 4°С по уравнению Аррениуса.

Штамм Защитная среда Значения

констант

скорости

К

Титр после

лиофили-

зации

(КОЕ/мл)

Прогнозируемая выживаемость (КОЕ/мл) после хранения

в течение

следующих сроков

Прогнозируемый

срок хранения

0,5 года 1 год 5 лет 10 лет

C. marina S2 Сахароза + СОМ 0,13415

(3,50±0,02)*109

0,25*101 - - - ~3-4 месяца

Сахароза + декстран 0,19070 (3,65±0,15)*10

9

- - - - ~2-3 месяца

C. marina S3 Сахароза + СОМ 0,01223 (7,90±1,10)*109

3,20*108 3,54*10

7 0,58*10

1 - ~3,5-4 года

Сахароза + декстран 0,11221 (6,50±0,10)*109 0,44*10

1 - - - ~5 месяцев

C. marina S4 Сахароза + СОМ 0,04188 (2,90±0,10)*10

9

3,46*105

4,79*101 - - ~11-12 месяцев

Сахароза + декстран 0,10313 (2,60±0,50)*109 2,85*10

1 - - - ~4-5 месяцев

Y. lipolytica S1 Сахароза + СОМ 0,00000038 (2,53±0,15)*108 2,53*10

8 2,53*10

8 2,53*10

8 2,53*10

8 110 лет и больше

Сахароза + декстран 0,01965 (2,57±0,24)*108 7,48*10

6 2,18*10

5 - - ~2 года

Y. lipolytica S2 Сахароза + СОМ 0,00072 (2,26±0,07)*108 2,10*10

8 1,84*10

8 6,42*10

7 1,72*10

7 ~50 лет

Сахароза + декстран 0,03461 (1,60±0,30)*107 3,15*10

4 6,21*10

1 - - ~10-11 месяцев

A. rhombi S1 Сахароза + СОМ 0,00972 (1,39±0,05)*1010

2,41*109 4,19*10

8 2,72*10

2 - ~5 лет

Сахароза + декстран 0,00109 (4,68±0,40)*109 3,85*10

9 4,68*10

9 7,76*10

8 1,06*10

8 ~44-46 лет

N. coeliaca S1 Сахароза + СОМ 0,00046 (1,20±0,04)*1010

1,18*1010

1,17*1010

1,15*1010

1,14*1010

~110 лет

Сахароза + декстран 0,00103 (1,21±0,20)*1010

1,17*1010

1,14*1010

1,10*1010

1,07*1010

~45-50 лет

162

P. cibarius S3 Сахароза + СОМ 0,04982 (7,10±0,40)*109 6,35*10

5 5,93*10

1 - - ~11-12 месяцев

Сахароза + декстран 0,04945 (7,30±0,20)*109 6,77*10

5 6,83*10

1 - - ~11-12 месяцев

S. amurskyense

S4

Сахароза + СОМ 0,00073 (1,14±0,04)*1010

9,99*109 8,76*10

9 3,00*10

9 7,91*10

8 ~67-70 лет

Сахароза + декстран 0,43259 (2,34±0,27)*1010

5,14*104 - - - ~2-3 месяца

Примечание. «-» - выживаемость клеток, равная нулю. На культурах A. rhombi S1 и S. vesiculosa S5 тест не проводили.

Таблица 19. Фактическая выживаемость чистых культур морских УВО микроорганизмов после хранения в

течение 0,5 и 1 года.

Срок

хране-

ния

Защитная

среда

C. marina

S1

C. marina

S2

C. marina

S3

Y. lipolytica

S1

Y. lipolytica

S2

A. rhombi

S1

N. coeliaсa

S1

P. cibarius

S3

S. amurs-

kyense S4

Выживаемость, КОЕ/мл

0,5 года

Сахароза

+

СОМ

(4,14±0,04)*109 (4,44±0,07)*109 (1,37±0,04)*109 (2,49±0,05)*108 (1,60±0,07)*108 (6,42±0,06)*109 (1,20±0,01)*1010 (7,66±0,07)*109 (6,96±0,60)*109

Сахароза

+

декстран

(1,92±0,24)*109 (2,89±0,29)*109 (9,60±0,20)*108 (1,40±0,005)*108 (4,85±1,05)*107 (6,54±0,08)*109 (1,18±0,03)*1010 (7,20±0,08)*109 (6,16±0,24)*109

1 год

Сахароза

+

СОМ

(1,90±0,19)*109 (3,27±0,16)*109 (1,11±0,21)*109 (2,03±0,05)*108 (9,45±0,05)*107 (5,29±0,07)*109 (1,21±0,15)*1010 (7,20±0,2)*109 (6,46±0,10)*109

Сахароза

+

декстран

(1,36±0,04)*109 (2,26±0,06)*109 (9,35±0,15)*108 (1,28±0,03)*108 (3,33±0,08)*107 (5,33±0,05)*109 (1,13±0,07)*1010 (6,25±0,05)*109 (5,85±0,07)*109

163

4.5. Количественная оценка деструкции углеводородов чистыми

культурами микроорганизмов после лиофилизации

Для оценки способности всех изучаемых штаммов к разрушению УВ

после лиофилизации биомассу микроорганизмов с протектором «сахароза +

СОМ», хранившуюся 0,5 года при 4°С, инокулировали в жидкую среду Таусона

с УВ. Проверку достоверности полученных результатов проводили путем двух

дополнительных последовательных пересевов исследуемых образцов. Показано,

что изучаемые штаммы сохраняли способность к деструкции УВ при 4°С после

лиофильного высушивания на протяжении всех трех пассажей культивирования.

Несмотря на заметное снижение численности жизнеспособных клеток культур

C. marina S2, C. marina S3, C. marina S4, A. rhombi S2, S. amurskyense S4, S.

vesiculosa S5, изучаемые микроорганизмы сохранили определенную активность

в отношении УВ (углеводородокисляющую, биоэмульгирующую) в условиях

низких температур, сохранявшуюся в течение ряда последовательных пересевов.

В частности, наблюдали образование мицелл нефти у поверхности раздела фаз,

разбивание пленки нефти и помутнение среды, свидетельствующее о

наращивании биомассы клеток. Культуры дрожжей Y. lipolytica, бактерии N.

coeliaca S1 и A. rhombi S1, кроме выше перечисленных показателей, были

способны к изменению цвета среды со светло-желтого (в случае первого и

второго пересевов) и бесцветного (в случае третьего пересева) до темно-

коричневого, что, вероятно, связано с активным эмульгированием, деструкцией

нефтяной пленки и переходом УВ в толщу среды. Для данных культур методами

гравиметрии и газо-жидкостной хроматографии была определена суммарная

убыль УВ, а также отдельно убыль среднекипящих фракций УВ (таблица 20) в

третьем после реактивации клеток пассаже культивирования.

Показано, что штамм N. coeliaca S1 оказался весьма устойчивым к

многочисленным повреждающим факторам процесса лиофилизации и сохранил

способность у утилизации УВ нефти на том же уровне, что и до процессов

высушивания и хранения, о чем свидетельствовал показатель убыли УВ (62% на

164

20-е сутки инкубации). Согласно данным ГЖХ анализа, среднекипящая фракция

в данном случае подверглась микробной деструкции на 70% - так же, как и до

высушивания клеток, о чем свидетельствовал углеводородный индекс.

Культуры C. marina S3 и Y. lipolytica S1, несмотря на высокий титр клеток

в жидкой среде, сопоставимый с титром неповрежденных лиофилизацией

клеток, показали снижение активности в отношении УВ почти в 2 раза (35% и

31%), а A. rhombi S1 – в 4 раза (12%). Вместе с тем, если для C. marina S3 и A.

rhombi S1 убыль среднекипящей фракции УВ так же снизилась в 2 раза, то для Y.

lipolytica S1 она сохранялась на том же уровне, и достигала 88%. Можно

заключить, что в данном случае суммарная убыль УВ, измеренная

гравиметрически, отражает микробную деструкцию (ki =2,35) именно алканов

С15-С24, в то время как более тяжелые фракции оказываются более

труднодоступны для окисления. Схожую ситуацию наблюдали и для штамма Y.

lipolytica S2, активность которого после лиофилизации снизилась в 4 раза (до

13%), однако убыль среднекипящей фракции сохранялась на высоком уровне и

достигала 93%. По литературным данным, общий уровень убыли нефти культур

после высушивания, составляющий 14%, говорит о сохранении достаточно

высокой нефтеокислительной активности (Петриков, 2011).

Таким образом, проведенные испытания показали, что все культуры

выдерживают процесс лиофилизации, но с различной долей успешности,

вероятно, обусловленной особенностями штаммов. В большинстве случаев

процесс лиофилизации вызывал снижение степени деструкции нефти, однако их

способность к окислению УВ в соответствии с литературными данными

оставалась на уровне, позволяющим рекомендовать данный способ длительного

хранения культур для получения сухих форм препаратов.

165

Таблица 20. Численность клеток восстановленных лиофильно высушенных чистых культур микроорганизмов

и степень деструкции УВ в жидкой минеральной среде при 4°С.

Примечание. «-» - данные отсутствуют.

№ Название культуры

микроорганизма

Численность

клеток,

10 суток,

КОЕ/мл

Численность

клеток,

20 суток,

КОЕ/мл

Убыль УВ,

10 суток, %

(гравиметрия)

Убыль УВ,

20 суток, %

(гравиметрия)

Убыль

среднекипящей

фракции УВ,

20 суток, %

(ГЖХ)

ki

1 C. marina S3 (2,33±0,02)

*108

(2,80±0,10)

*108

6 35 38 0,44

2 Y. lipolytica S1 (1,96±0,14)

*107

(8,20±0,05)

*108

19 31 88 2,35

3 Y. lipolytica S2 (2,00±0,50)

*105

(1,30±0,07)

*108

8 13 93 -

4 A. rhombi S1 (3,33±0,21)

*108

(3,46±0,62)

*108

11 12 32 -

5 N. coeliaca S1 (2,10±0,05)

*107

(3,05±0,43)

*108

13 62 70 0,64

166

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы в связи с активным освоением арктического шельфа с

целью добычи нефти и нефтепродуктов существенно возросла актуальность

разработки и совершенствования технологий ликвидации последствий нефтяных

разливов и восстановления биоценозов северных экосистем. При этом

увеличивается роль методов морской микробиологии и морской биотехнологии,

основанных на применении морских микроорганизмов, способных к деструкции

УВ в условиях низких температур с перспективой их дальнейшего применения

для биоремедиации окружающей среды. Несмотря на то, что в прошедшее

десятилетие появилось много публикаций по изучению таксономического

разнообразия микроорганизмов, обитающих в морской воде, на поверхности

морских водорослей и животных, в осадках и почве Арктического региона,

малоизученным остается потенциал таких микроорганизмов в отношении УВ

нефти. В частности, в литературе немногочисленны сведения о всестороннем

исследовании углеводородокисляющих, биоэмульгирующих свойств

психрофильных и психроактивных морских микроорганизмов с приоритетной

задачей создания на их основе биопрепаратов, требующей разработки методов и

условий длительного сохранения клеток и оценки их выживаемости.

Данное исследование является одним из немногих, в котором проведена

комплексная оценка биотехнологического потенциала умеренно галофильных

морских микроорганизмов при пониженной температуре (4°С) с учетом их

уникального метаболизма, климатических особенностей и абиотических

факторов географических зон их дальнейшего предполагаемого внедрения и

применения. В соответствии с поставленной в работе целью был проведен отбор

микроорганизмов с требуемыми свойствами из различных экологических ниш

Крайнего Севера с хроническим нефтяным загрязнением, а также из биоценозов

Каспийского моря для сравнения скоростей метаболизма УВ клетками

микроорганизмов и исследования их УВО активности при воздействии низких

167

температур. Несмотря на то, что все исследуемые микробные консорциумы

способны к росту в диапазоне 4-20°С, температура культивирования оказывает

существенное влияние на численность клеток аэробных гетеротрофных

микроорганизмов из разных географических широт. Показано, что некоторые

аборигенные микробные сообщества полярных регионов при 4°С

культивирования в 5-10 раз превышали численность микроорганизмов

Каспийского моря в тех же условиях, что, вероятно, обусловлено особенностями

строения и адаптации их клеток к длительному существованию в

низкотемпературных условиях. В частности, для микробиоты почв северных

районов характерна высокая продуктивность в течение короткого летнего

периода (Евдокимова, 1973; Паринкина, 1989), а также уменьшение размеров

клеток, что позволяет им существовать в энергетически более выгодной форме

(Евдокимова, 2002). Сообщество, выделенное из воды Каспийского моря,

составляли, преимущественно, дрожжевые клетки, что позволяет предполагать

меньшее число их генераций и более низкий суммарный выход биомассы. Кроме

того, есть сведения, что температурный диапазон роста дрожжей меньше, чем у

бактериальных штаммов (Margesin et al., 2003). В ходе исследования

температурного диапазона роста двух микробных сообществ из полярного

региона установлено, что скорость роста микробных клеток выше при 20°С,

однако максимальное накопление биомассы отмечено при 4°С, что необходимо

учитывать при наработке биомассы микроорганизмов при создании

биопрепаратов. Это соотносится с результатами других авторов, согласно

которым концентрация клеток ассоциации бактерий Acinetobacter sp., Bacillus sp.

и Pseudomonas sp. при 10°С к 12-му дню культивирования достигала 108 кл/мл, в

то время как при 30°С максимальная концентрация была только 107 кл/мл

(Мокеева и др., 2011).

Для аборигенных сообществ микроорганизмов северных широт отмечен

более высокий УВО потенциал, что подтверждает целесообразность отбора проб

и выделения микроорганизмов в регионе дальнейшего их применения в целях

168

очистки от нефтяных загрязнений. Суммарная степень деструкции УВ в

условиях низких температур в присутствии таких сообществ составила более

50%, при этом микроорганизмы практически полностью утилизировали

компоненты среднекипящей фракции, что характеризует их как активных

окислителей УВ соединений. Активность микробного сообщества В8,

полученного из Каспийского моря, составляла 42%, однако анализ

хроматографических профилей деструкции УВ данным сообществом позволяет

говорить о вкладе процесса биоэмульгации в убыль УВ, обуславливающим

увеличение удельной площади поверхности нефти и, как следствие,

увеличением испарения УВ.

Разработан новый биотехнологический подход к выделению чистых

культур микроорганизмов, активных в отношении УВ, с использованием

адсорбированных на фильтрах УВ. Ранее был предложен способ

культивирования микроорганизмов, способных к утилизации летучих и

относительно нерастворимых УВ, в результате которого в чашку Петри вносили

агаризованную среду и микроорганизмы, а в крышку – фильтровальную

пластинку с УВ. После этого чашки переворачивали так, что слой

микроорганизмов оказывался над фильтрующими пластинками (Kleinheinz,

Bagley, 1997), и дальнейшую их инкубацию проводили в парах УВ.

Предложенный же нами подход позволяет в краткие сроки проводить не только

скрининг УВО микроорганизмов, но и продуцентов биосурфактантов, которых

описанным выше способом невозможно было учесть. Разработанный метод

способствует быстрому и более полному выявлению разнообразия в природных

образцах микроорганизмов, активных в отношении нефти, он прост и может

быть рекомендован к дальнейшему практическому применению.

Представители родов Arthrobacter и Shewanella ранее неоднократно были

обнаружены в составе микробиоты Баренцева моря (Margesin, Miteva, 2011;

Zhang et al., 2014; Moghadam et al., 2016), однако виды-нефтедеструкторы

Arthrobacter rhombi и Shewanella vesiculosa здесь были выделены впервые.

169

Кроме того, впервые установлено присутствие вида Salinibacterium amurskyense

в данном регионе, который ранее был обнаружен только в осадках Чукотского

моря, а в Белом море – УВО микроорганизма Nocardia coeliaca. Впервые

установлено, что микроорганизмы-деструкторы A. rhombi, S. amurskyense, S.

vesiculosa, N. coeliaca являются не только представителями морской

планктонной микробиоты, но и эпифитных микробных сообществ

макроводорослей. Среди указанных микроорганизмов так же были выделены

виды C. marina, P. cibarius и дрожжи Y. lipolytica.

Перспективность микроорганизма как биотехнологического агента

определяется набором его специфических физиолого-биохимических

характеристик, в частности, способностью катаболизировать УВ нефти,

широтой спектра их потребления, синтезом биоПАВ и т.д. (Карасева и др.,

2012). Установлено, что выделенные психроактивные микроорганизмы

обладают способностью использовать широкий спектр УВ соединений, в том

числе и таких трудноусвояемых для многих микроорганизмов субстратов, как

нафталин, фенантрен, алифатические УВ, смола и т.д., что может быть связано с

хроническим присутствием данных УВ в источниках их выделения и

многолетней адаптацией микроорганизмов к ним как источникам питания. В

соответствии с литературными данными, психроактивные дрожжи обладают

более высоким потенциалом в отношении таких УВ, как н-гексадекан, фенол,

фенантрен и антрацен, чем бактерии (Margesin et al., 2003). Однако в нашем

исследовании показано, что крупный катаболический потенциал отмечен как у

дрожжей Y. lipolytica S1 и Y. lipolytica S2, так и у грамположительных

актинобактерий N. coeliaca S1 и A. rhombi S2, которые были способны

утилизировать все тестируемые УВ (в том числе и высокоустойчивые) и

обладали наиболее высокой интенсивностью роста в их присутствии.

Выявленная широкая субстратная специфичность исследуемых

микроорганизмов значительно повышает их конкурентоспособность и делает их

перспективным объектом биотехнологии и дальнейших научных разработок.

170

При сравнении полученных данных по исследованию УВО активности

выделенных морских микроорганизмов с ранее изученными результатами в

условиях низких температур (4°С) установлено, что деструктивная активность

отдельных штаммов (12-62% спустя 20 суток культивирования) была

сопоставима или превышала аналогичные показатели, описанные в литературе.

В частности, УВО активность N. coeliaca S1, утилизировавшего до 62% УВ,

превышала активность различных родственных штаммов Rhodococcus sp.,

которые разлагали от 28 до 47% при 4-6°С в течение 28 суток (Пырченкова и др.,

2006). Так же наиболее заметную деструктивную активность при 4°С проявили

штаммы C. marina S3, A. rhombi S1 (62% убыли УВ), а также дрожжи Y. lipolytica

(51% убыли УВ). При этом штаммы были способны к деградации не только

средне-, но и высококипящих фракций нефти, что подтверждено результатами

исследования их субстратного спектра. В присутствии легких фракций нефти

микроорганизмы обладали более высокой скоростью роста, чем в присутствии

тяжелых компонентов (мазут, смола и т.д.). Это соотносится с литературными

данными, согласно которым микроорганизмы в подледной морской воде в

первую очередь утилизировали алканы (около 65%), затем метилированные

ПАУ (около 34%) и в последнюю очередь ПАУ (около 1,8%) [Garneau et al.,

2016].

Способность микроорганизмов к использованию УВ субстратов зачастую

связана с синтезом биоПАВ, увеличивающих биодоступность УВ за счет

диспергирования нефтепродуктов (Коронелли, Нестерова, 1990; Salihu, 2009). В

ходе проведенных нами исследований было показано, что величина

эмульгирующей активности конкретных штаммов микроорганизмов имеет

температурную зависимость, что подтверждается литературными данными. Так,

в исследовании Пирог Т.П. с соавторами показано, что снижение температуры

культивирования штамма Rhodococcus erythropolis ЭК-1 с 30°С до 20°С

сопровождалось уменьшением уровня биомассы, однако при этом наблюдали

повышение синтеза ПАВ (Пирог и др., 2005). В нашем исследовании штаммы C.

171

marina S2, C. marina S4 и A. rhombi S1 были более активны при 20°С (Е24=56,3%,

59,3% и 54,1%, соответственно), в то время как штаммы C. marina S3, Y.

lipolytica S1, N. coeliaca S1 и P. cibarius S3 - при 4°С (Е24=27,1%, 51,7%, 32,8% и

26,7%, соответственно).

Взаимодействие микроорганизмов с УВ может происходить путем их

непосредственного контакта с УВ за счет гидрофобной клеточной поверхности,

обусловленной наличием в ней липидных компонентов (Zhang, Miller, 1995).

Ранее сообщалось, что гидрофобность поверхности некоторых микроорганизмов

уменьшается с повышением температуры (Muda et al., 2014), Показано, что с

понижением температуры степень гидрофобности клеток выделенных нами

микроорганизмов достигает 100% в случае C. marina S3 и Y. lipolytica S2, а в

случае C. marina S4, Y. lipolytica S1, N. coeliaca S1 - 95,1%, 99,2% и 93,4%,

соответственно. Полученные значения значительно превышают аналогичные

показатели (87-96%), полученные ранее для штаммов Rhodococcus sp. F2, R.

erythropolis B2, Rhodococcus sp. J8 при нормальной температуре (Волченко,

2006). Увеличение температуры вызывает снижение поверхностного натяжения

жидкости (Moraes et al., 2008), адгезивных свойств клеток и снижение доли

клеток с гидрофобной поверхностью, что соотносится с нашими результатами

при 20°С. Микроорганизмы с высокой гидрофобной клеточной поверхностью

являются наиболее перспективными в случае их применения для ликвидации

нефтяных загрязнений на поверхности водоемов, т.к. их биомасса

концентрируется на поверхности раздела вода/нефть и не диффундирует в

толщу водоема (Волченко, 2006).

Не менее важной характеристикой поверхностно-активных свойств

микроорганизмов является тип локализации биоПАВ, которые могут быть

связаны с клеточной стенкой или выделяться в окружающую среду.

Локализация биоПАВ указывает на физиологию взаимодействия

микроорганизмов с УВ и помогает выбрать направление биотехнологического

производства культур-продуцентов сурфактантов (Волченко, 2006). При

172

исследовании способности выделенных культур к снижению поверхностного

натяжения установлено, что присутствие клеток в культуральной среде и низкая

температура усиливали эффект снижения ПН в разной степени в зависимости от

конкретного штамма. В работе Волченко Н.Н. и Карасевой Э.В. при сравнении

величин поверхностного натяжения и индекса эмульгирования жидких культур

и их супернатантов также было выявлено, что у большинства изолятов

поверхностно-активные свойства связаны с биомассой бактерий, а не с

супернатантом (Волченко, Карасева, 2006). Ранее было показано, что штамм C.

marina MM1IDA2H-1 способен снижать ПН на 29 мН/м относительно

контрольного значения (Ibacache-Quiroga et al., 2013). Однако нами установлено,

что штамм C. marina S2 при низкой температуре намного эффективнее снижал

ПН (на 37,8 мН/м относительно контроля) по сравнению с предыдущим

исследованием.

Применение комплекса методов оценки поверхностно-активных свойств

клеток выявило, что у дрожжей Y. lipolytica S1, Y. lipolytica S2 и бактерии A.

rhombi S1 поверхностно-активные свойства связаны с биомассой бактерий, в то

время как у всех остальных исследованных культур они являются как клеточно-

связанными, так и внеклеточными. При этом характер взаимодействия

описанных культур с УВ разнится: в первом случае культуры модифицируют

поверхность клеток, обеспечивая их адсорбцию к углеводородной фазе, а во

втором - синтезируют различные виды биосурфактантов, которые не только

способствуют биодеградации, но и интенсифицируют процессы испарения УВ

нефти за счет создания микроэмульсий нефти вблизи клеток.

Таким образом, совокупность результатов осветления целлюлозных

фильтров, пропитанных УВ, данных исследования углеводородокисляющей и

биоэмульгирующей активности исследуемых культур свидетельствует о

перспективах их применения для утилизации нефтяных разливов в условиях

северных регионов, т.к. биоэмульгирующая активность микроорганизмов в

сочетании с углеводородокисляющей способностью обеспечивает большую

173

биодоступность УВ. Выявленная способность изучаемых микроорганизмов к

образованию высоких концентраций биоПАВ является основанием для их

рекомендации к широкомасштабному (промышленному) производству.

Для поддержания жизнеспособных клеток морских микроорганизмов в

лабораторных условиях рекомендован простой в исполнении и нетрудоемкий

метод криоконсервации. Согласно результатам, он позволяет сохранить 20-90%

клеток в зависимости от вида и штамма микроорганизма, а также типа

криопротектора. Так, в аналогичных исследованиях Каменских Т.Н. с

соавторами на примере различных видов Rhodococcus sp. показано, что

использование 10% раствора глицерина позволяло сохранить от 46 до 94%

клеток, в то время как 5% ДМСО обеспечивал жизнеспособность на уровне 30-

67% (Каменских и др., 2010). Проведенный нами аналогичный эксперимент

показал обратные результаты: ДМСО обеспечивал более высокую защитную

эффективность для большинства штаммов (55-96% выживаемости клеток), в то

время как максимальная эффективность глицерина в случае штаммов A. rhombi

S1, P. cibarius S3, S. amurskyense S4, S. vesiculosa S5, оказалась 19-68%. Вместе с

тем установлено, что защитное действие использованных нами непроникающих

криопротекторов, содержащих углеводы, не менее эффективно, чем

проникающих, и в отдельных случаях позволяет достичь выживаемости до 94%

клеток. Вместе с тем, подобные исследования по длительному сохранению

морских микроорганизмов, активных в отношении нефти, проводятся впервые.

Полученные результаты еще раз подтверждают необходимость

индивидуального подбора наиболее эффективных условий хранения для каждой

систематической группы микроорганизмов (Ившина и др., 1994). Для

надежности процесса сохранения высокого количества клеток микроорганизмов

рекомендовано применение нескольких видов протекторов.

Метод лиофилизации является более подходящим способом сохранения

биомассы в перспективе получения товарной формы биопрепарата,

обеспечивающий длительное поддерживание жизнеспособности клеток

174

исследуемых микроорганизмов и сохранение их биологических особенностей

при использовании защитной среды «сахароза + СОМ». Разные виды и даже

штаммы микроорганизмов обладают специфическими реакциями на

высушивание-регидратацию (Ившина и др., 1994). По литературным данным,

дрожжи плохо переносят лиофилизацию. Значительная часть дрожжей погибает

при лиофилизации, жизнеспособными остаются лишь 1-30% клеток

(Куплетская, Нетрусов, 2011). Однако в нашем эксперименте дрожжи Y.

lipolytica S1, Y. lipolytica S2, а также бактерия P. cibarius S3 демонстрировали

наилучшую выживаемость клеток (84-90%) в присутствии указанной выше

среды. Установлено, что для прогнозирования сроков хранения некоторых

грамотрицательных психроактивных микроорганизмов неприменимо

использование температуры хранения выше 35°С. Показано, что

микроорганизмы сохраняют свою деградативную активность в отношении УВ

нефти, что подтверждено данными гравиметрического и хроматографического

анализа. При этом эффективность деструкции УВ культурой N. coeliaca S1

оставалась на том же уровне, что и до процессов высушивания и хранения

(62%).

Таким образом, проведенные различными методами исследования УВО

активности, поверхностно-активных свойств выделенных нами морских

микроорганизмов, их устойчивости к процессам криоконсервации и

лиофилизации и выживаемости клеток в процессе хранения позволяют их

охарактеризовать как эффективных нефтедеструкторов с высоким

биотехнологическим потенциалом в условиях низких положительных

температур. Суммируя все перечисленные выше свойства выделенных и

исследованных психроактивных микроорганизмов, можно заключить, что они

обладают рядом преимуществ в условиях углеводородного загрязнения и

перспективны в целях практического использования в качестве деструкторов и

эмульгаторов нефти на поверхности морских акваторий в условиях холодного

климата северных регионов. Полученные результаты позволяют рекомендовать

175

исследованные психроактивные микроорганизмы и их сочетания друг с другом

для создания на их основе сухих форм комплексных биопрепаратов для

биоремедиации нефтезагрязненных экосистем в Арктике.

ВЫВОДЫ

1. Разработан способ выделения микроорганизмов, активных в отношении УВ

нефти, путем аппликации фильтров, пропитанных УВ, на поверхность плотной

питательной среды с колониями микроорганизмов.

2. В результате скрининга микроорганизмов разработанным методом были

выделены 11 психроактивных штаммов, способных к деструкции УВ в условиях

умеренной солености и низких температур.

3. Впервые показано присутствие в Баренцевом море видов-нефтедеструторов

Arthrobacter rhombi, Salinibacterium amurskyense, Shewanella vesiculosa,

выделенных из нефтезагрязненных образцов зеленых и бурых водорослей, а в

Белом море - вида Nocardia coeliaca, изолированного из образцов

нефтезагрязненных бурых водорослей.

4. Установлено, что выделенные морские психроактивные микроорганизмы

обладают высоким окислительным потенциалом, и способны использовать

широкий спектр УВ, в том числе ароматических и полиароматических

соединений. При этом в убыль УВ существенный вклад вносит испарение

легких фракций УВ с поверхности среды и микробная эмульгация.

5. Осуществлен подбор защитных сред для длительного хранения морских

микроорганизмов, активных в отношении УВ. Для получения товарной формы

биопрепарата предпочтительней использовать метод лиофильного высушивания

с использованием защитной среды «7,5% сахароза + 10% СОМ». Установлено,

что метод ускоренного хранения не всегда подходит для прогнозирования

выживаемости культур психроактивных микроорганизмов.

176

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Александров А.К. Влияние загрязнения на рыбохозяйственные водоемы //

Материалы I Всесоюз. конф. по рыбохозяйственной токсикологии. Рига,

1988. – С. 3-14.

2. Андреева И.С., Емельянова Е.К., Загребельный С.Н., Олькин С.Е.,

Резникова И.К., Репин В.Е. Утилизация углеводородов

психротолерантными штаммами-деструкторами // Прикл. биохимия и

микробиология. – 2007. – Т. 43. – № 2. – С. 223-228.

3. Арзамасцев И.С. Эколого-географические аспекты развития нефтегазового

комплекса на Дальнем Востоке России / под ред. П.Я. Бакланова; Рос.

Акад. Наук, Дальневост. Отд-ние, Тихоокеан. Ин-т географии.

Владивосток: Дальнаука, 2007. – 325 c.

4. Аринбасарова А.Ю., Бирюкова Е.Н., Меденцев А.Г. Антистрессовые

системы дрожжей Yarrowia lipolytica (обзор) // Прикл. биохимия и

микробиология. – 2015. – Т. 51. – № 2. – С. 122-131.

5. Арктика на пороге третьего тысячелетия: ресурсный потенциал и

проблемы экологии / Под ред. И.С.Грамберга, Н.П.Лаверова. СПб.: Наука,

2000. – 247 с.

6. Аушева Х.А. Разработка новой формы биопрепарата для очистки водных

объектов от тонких нефтяных пленок: Дис. ... канд. биол. наук. – Москва,

2007. – 181 с.

7. Аушева Х.А., Бабусенко Е.С., Султыгова З.Х., Марквичев Н.С.

Использование микроводорослей Platymonas viridis для интенсификации

процесса биодеструкции нефти // Успехи в химии и химической

технологии. – 2005. – Т. XIX. – № 5. – С. 63-67.

8. Аушева Х.А., Гончарук Д.А., Бабусенко Е.С., Марквичев Н.С. Влияние

толщины нефтяной пленки на динамику ее биодеструкции под действием

биопрепарата на основе иммобилизованных клеток Acinetobacter valentis //

177

Химическая промышленность сегодня. – 2007. – № 4. – С. 41-43.

9. Баросс Д., Морита Р. Жизнь микроорганизмов при низких температурах:

экологические аспекты. В сборнике статей: Жизнь микробов в

экстремальных условиях, под ред. Д. Кашнера. М.: Мир, 1981. – 521 с.

10. Белоус А.М., Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф. Биохимия мембран.

Замораживание и криопротекция. / Под редакцией Болдырева А.А. М.:

Высшая школа, 1987. – 80 с.

11. Белоусова Н.И., Шкидченко А.Н. Деструкция нефтепродуктов различной

степени конденсации микроорганизмами при пониженных температурах //

Прикл. биох. и микробиол. – 2004. – T. 40. – № 3. – C. 312-316.

12. Беляков А.Ю., Плешакова Е.В. Скрининг микроорганизмов-деструкторов

компонентов буровых растворов // Известия Саратовского университета.

Новая серия. Серия Химия. Биология. Экология. – 2013. – Т. 13. – № 4. –

С. 37-42.

13. Бескдид П.П., Дурягина Е.Г. Загрязнение морской среды нефтью и

нефтепродуктами // Эксплуатация морского транспорта. – 2010. – Т. 62. –

№ 4. – С. 51-56.

14. Богдан В.В., Шкляревич Г.А., Руоколайнен Т.Р. Влияние нефтяного

загрязнения Белого моря на литоральных бокоплавов // Проблемы

изучения, рационального использования и охраны ресурсов Белого моря.

Материалы докладов IX международной конференции 11-14 октября 2004

г., Петрозаводск, Карелия, Россия, 2005. – C. 51.

15. Богоявленский В.И., Богоявленский И.В. Поиск, разведка и освоение

месторождений нефти и газа на шельфе Арктики [Электронный ресурс] //

Бурение и нефть. – 2011. – № 7-8. URL: http://burneft.ru/archive/issues/2011-

07-08/7.

16. Бондаренко А.П., Базарбеков К.У. Восстановление экосистем

нарушенных нефтепродуктами: уч. пособие. Павлодар, 2006. – 195 с.

178

17. Борисов В.М., Осетрова Н.В., Пономаренко В.П., Семенов В.Н., Сочнев

О.Я. Влияние разработки морских месторождений нефти и газа на

биоресурсы Баренцева моря: Методические рекомендации по оценке

ущерба рыбному хозяйству. М.: Экономика и информатика, 2001. – 272 с.

18. Борзенков И.А., Беляев С.С., Ибатуллин Р.Р., Поспелов М.Е., Свитнев

А.И. Способ очистки почвы, природных и сточных вод, загрязненных

нефтью и нефтепродуктами, с использованием биопрепаратов. Патент РФ

RU 2114071. Опубл. 27.06.1998.

19. Брянская А.В., Уварова Ю.Е., Слынько Н.М., Демидов Е.А., Розанов А.С.,

Пельтек С.Е. Теоретические и практические аспекты проблемы

биологического окисления углеводородов микроорганизмами //

Вавиловский журнал генетики и селекции. – 2014. – Т. 18. – № 4/2. – С.

999-1012.

20. Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Марусина А.И., Кравченко И.К., Быкова

С.А., Колганова Т.В., Гальченко В.Ф. Изучение нуклеотидных

последовательностей nifH генов у представителей метанотрофных

бактерий // Микробиология. – 2002. – T. 71. – № 4. – C. 500-508.

21. Бузолева Л.С. Способ приготовления питательной среды для учета

сапрофитных гетеротрофных бактерий в морской воде. Патент РФ RU

2425870. Опубл. 01.02.2010.

22. Бутаев А.М., Кабыш Н.Ф. О роли нефтеокисляющих микроорганизмов в

процессах самоочищения прибрежных вод Дагестанского побережья

Каспийского моря от нефтяного загрязнения // Вестник Дагестанского

науч. центра РАН. – 2002. – № 13. – С. 69-77.

23. Буткевич В.С. Избранные труды. / [Отв. ред. чл.-кор. АН СССР А.А.

Имшенецкий]. М.: Изд-во АН СССР, 1958. – Т. 2. – 389 с.

24. Васильева Н.С. Разработка сухих препаративных форм

микробиологических препаратов Ленойл, Елена, Азолен: Дис. … канд.

техн. наук. – Щелково, 2005. – 131 с.

179

25. Ветрова А.А., Овчинникова А.А., Филонов А.Е., Пуптус И.Ф., Воронин

A.M. Деструкция нефти бактериями рода Pseudomonas, содержащими

различные плазмиды биодеградации // Известия Тульского

государственного университета. Естественные науки. – 2008. – № 2. – С.

186-193.

26. Ветрова А.А., Иванова А.А., Филонов А.Е., Забелин В.А., Нечаева И.А.,

Ле Т.Б.Н., Боронин А.М. Сравнительная эффективность деградации

нефтепродуктов консорциумом плазмидосодержащих штаммов-

деструкторов и биопрепаратами "микробак", "БИООЙЛ" // Известия

Тульского государственного университета. Естественные науки. – 2013. –

№ 2-1. – С. 258-272.

27. Виноградов Г.А., Березина Н.А., Лаптева Н.А., Жариков Г.П.

Использование структурных показателей бактерио- и зообентоса для

оценки качества донных отложений (на примере водоемов

Верхневолжского бассейна) // Водные ресурсы. – 2002. – Т. 29. – № 3. – С.

329–336.

28. Вишневецкий В.Ю., Вишневецкий Ю.М. Анализ воздействия

загрязняющих веществ на поверхностные водные объекты // Изв. Юж.

Фед. Ун-та. Техн. Науки. – 2009. – T. 96. – № 7. – С. 135–139.

29. Власов С.А., Краснопевцева Н.В., Крашенинникова Т.К., Вавер В.И.

Способ очистки почвы от нефти и нефтепродуктов. Патент РФ RU

2128703. Опубл. 10.04.1999.

30. Волченко Н.Н. Влияние условий культивирования на поверхностно-

активные свойства углеводородокисляющих актинобактерий: Дис. …

канд. биол. наук. – Краснодар, 2006. – 148 с.

31. Волченко Н.Н., Карасёва Э.В. Скрининг углеводородокисляющих

бактерий - продуцентов поверхностно-активных веществ биологической

природы и их применение в опыте по ремедиации нефтезагрязненной

почвы и нефтешлама // Биотехнология. – 2006. – № 2. – С. 45-60.

180

32. Воробьев Д.С. Влияние нефти и нефтепродуктов на макрозообентос //

Известия Томского политехнического университета. – 2006. – Т. 309. – №

3. – С. 42-45.

33. Воронков П.П., Мусина A.A. Солевой состав воды Белого моря // Тр. ГГИ.

– 1939. – Вып. 8. – С. 52-64.

34. Воскобойников Г.М., Пуговкин Д.В. О возможной роли Fucus vesiculosus

в очистке прибрежных акваторий от нефтяного загрязнения // Вестник

МГТУ. – 2012. – Т. 15. – № 4. – С. 716-721.

35. Врагова Е.В. Математическая модель поведения нефтяных разливов на

акватории рек и болотной местности // Мир науки, культуры, образования.

– 2011. – Т. 31. – № 6. – С. 434-439.

36. Вятчина О.Ф., Горбачевская О.П., Стом Д.И., Беломестнова А.И.

Характеристики штаммов алканотрофных микроорганизмов,

перспективных для удаления нефтезагрязнений // Известия Иркутской

государственной экономической академии (Байкальский государственный

университет экономики). – 2010. – № 5. – С. 299-303.

37. Гамзаев Х.М. Моделирование растекания нефтяной пленки по

поверхности моря // Прикл. механика и техническая физика. – 2009. – Т.

50. – № 3. – С. 127-130.

38. Герлах Е.А. Загрязнение морей. Диагноз и терапия. Л.: Гидрометеоиздат,

1985. – 264 с.

39. Гембель А.В. Общая география мирового океана. М.: Высш. Школа, 1979.

– 215 с.

40. Головченко А.В., Полянская Л.М. Влияние нефти на численность,

биомассу и жизнеспособность грибов в верховых торфяниках //

Микробиология. – 2001. – Т. 70. – № 1. – С. 111-117.

41. Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С. Физические основы низкотемпературного

консервирования клеточных суспензий. Киев, Наукова думка, 1994. – 143

с.

181

42. ГОСТ 12.1.008-76 «ССБТ. Биологическая безопасность. Общие

требования».

43. ГОСТ 31942-2012 «Вода. Отбор проб для микробиологического анализа».

44. ГОСТ Р 52406-2005 «Вода. Определение нефтепродуктов методом

газовой хроматографии».

45. Градова Н.Б., Гориова И.Б., Эддауди Р., Салина Р.Н. Использование

бактерий рода Azotobacter при биоремедиации нефтезагрязненных почв //

Прикл. биохим. и микробиол. – 2003. – Т. 39. – № 3. – С. 318-321.

46. Григоренко Ю.Н., Маргулис Е.А., Новиков Ю.Н., Соболев В.С. Морская

база углеводородного сырья России и перспективы ее развития //

Нефтегазовая геология. Теория и практика. – 2007. – Т. 2. URL:

http://www.ngtp.ru/rub/5/003.pdf.

47. Григоренко Ю.Н., Прищепа О.М., Соболев В.С., Жукова Л.И. Ареалы

углеводородонакопления как основа развития нефтедобычи в Российской

Арктике // Нефтегазовая геология. Теория и практика. – 2012. – Т. 7. – №

2. URL: http://www.ngtp.ru/rub/6/34_2012.pdf.

48. Гузев B.C., Халимов Э.М., Волде М.И., Куличевская И.С. Регуляторное

действие глюкозы на активность углеводородокисляющих

микроорганизмов в почве // Микробиология. – 1997. – Т. 66. – № 2. – С.

154-159.

49. Гусев М.В., Сенцова О.Ю., Коронелли Т.В., Федоров В.Д.

Функционирование микроорганизмов в водных экосистемах.

Микробиологическое разрушение нефтепродуктов в Северном Ледовитом

океане // Биологические науки. – 1977. – № 8. – С. 110-119.

50. Давидова Е.Г., Рачинский В.В., Сиушева А.Г. Транспорт н-алканов в

клетки дрожжей Candida tropicalis // Изд. Тимиряз. с/х акад. – 1975. – № 2.

– С. 17-23.

51. Давыдова С.Л., Тагасов В.И. Нефть и нефтепродукты в окружающей

среде. М.: РУДН, 2004. – 163 с.

182

52. Диагностический анализ состояния окружающей среды Арктической зоны

Российской Федерации (Расширенное резюме). [Ред. Б.А. Моргунов]. M.:

Научный мир, 2011. – 200 с.

53. Дивавин И.А., Ерохин В.Е. Изменение биохимических показателей

некоторых прибрежных гидробионтов Баренцева моря при

экспериментальной нефтяной интоксикации // Гидробиол. журнал. – 1978.

– Т. 14. – № 5. – С. 73-77.

54. Дмитриевский А.Н., Белонин М.Д. Перспективы освоения нефтегазовых

ресурсов российского шельфа // Природа. – 2004. – № 9. – С. 3-10.

55. Додин Д.А., Евдокимов А.Н., Каминский В.Д. Минерально-сырьевые

ресурсы Российской Арктики (состояние, перспективы, направления

исследований). СПб: Наука, 2007. – 767 с.

56. Другов Ю.С., Родин А.А. Экологические анализы при разливах нефти и

нефтепродуктов, практическое руководство. М.: БИНОМ. Лаборатория

знаний, 2007. – 270 с.

57. Евдокимова Г.А. Динамика численности микроорганизмов в ризосфере

некоторых злаков в условиях Кольского полуострова // Почвоведение. –

1973. – № 12. – С. 38-46.

58. Евдокимова Г.А. Микробный компонент природных и техногенных

систем Севера. // Геоэкология. – 2002. – № 3. – С. 237-242.

59. Елифанов А.В., Гашев С.Н., Моисеенко Т.И. Влияние сырой нефти на

организм грызунов в подостром эксперименте // Труды Карельского

научного центра РАН. – 2012. – № 2. – С. 76-83.

60. Еремин Н.А., Кондратюк А.Т., Еремин А.Н. Ресурсная база нефти и газа

арктического шельфа России // Электронный журнал «Георесурсы.

Геоэнергетика. Геополитика». – 2010. – Вып. 1.

URL: http://www.oilgasjournal.ru/2009-1/3/rubric/eremin.pdf.

183

61. Ефимова Л.Е. Особенности формирования солевого состава и

распределения биогенных элементов в зоне смешения речных и морских

вод в Белом море: Дис. … канд. геогр. наук. – Москва, 2005. – 144 с.

62. Зайцева Т.А., Рудакова Л.В., Комбарова М.М., Баранова К.С.

Микроорганизмы-деструкторы нефти // Пермский Государственный

Технический Университет. – 2010. – Т. 4. – № 4. – С. 59-63.

63. Зенкевич JI.A. Фауна и биологическая продуктивность моря. М.:

Советская наука, 1947. – Т. 2. – 588 с.

64. Зернов С.А. Общая гидробиология. М.; Л.: Биомедгиз, 1934.

65. Зернов Ю.П., Дедков В.С., Антонова Ю.А., Михненкова Н.А., Дегтярев

С.Х. Термолабильная щелочная фосфатаза из психрофильного

микроорганизма Alteromonas undina P2 // Биотехнология. – 2005. – № 2. –

С. 38-43.

66. Иванов В.П., Сокольский А.Ф. Научные основы стратегии защиты

биологических ресурсов Каспийского моря от нефтяного загрязнения.

Астрахань: Изд-во КаспНИРХа, 2000. – 181 с.

67. Ивантер В.В., Лексин В. Н., Порфирьев Б.Н. Арктический сверхпроект

России // Проблемный анализ и государственно-управленческое

проектирование. Теория. Практика. Методология. – 2014. – Т. 7. – № 6

(38). – С. 6-24. URL: http://voprosik.net/arkticheskij-sverxproekt-rossi.

68. Ившина И.Б., Каменских Т.Н., Куюкина М.С., Рычкова М.И., Шадрин

О.А., Чумаков О.Б. Методы консервации культур Rhodococcus spp. и их

применение в практике поддержания специализированного фонда

алканотрофных родококков // Микробиология. – 1994. – Т. 63. – № 1. – С.

118-128.

69. Ившина И.Б. Бактерии рода Rhodococcus: биоразнообразие, детекция,

иммунодиагностика: Дис. … докт. биол. наук. – Пермь, 1997. – 98 с.

70. Ильина Т.С., Романова М.Ю., Гинцбург А.Л. Биопленки как способ

существования бактерий в окружающей среде в организме хозяина:

184

феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития //

Генетика. – 2004. – Т. 40. – № 11. – С. 1445-1456.

71. Ильинский В.В. Экология углеводородокисляющих морских бактерий:

Дис. … канд. биол. наук. – Москва, 1979. – 169 с.

72. Ильинский В.В. Бактериопланктон поверхностных вод Центральной

Арктики в период календарной весны // Микробиология. – 1995. – Т. 64. –

№ 5. – С. 696-704.

73. Калинка О.П. Оценка уязвимости акватории кольского залива и

чувствительности его берегов при разливах нефти: Дис. … канд. геогр.

наук. – Мурманск, 2015. – 164 с.

74. Калиновская Н.И., Кузнецова Т.А., Михайлов В.В., Иванова Е.П.,

Романенко Л.А. Биосурфактанты морских бактерий и штаммы бактерий,

их продуцирующие. Дальневосточное отделение Российской академии

наук. Научные разработки для практического использования. Вып. 2.

Владивосток, Дальнаука, 1999.

75. Каменских Т.Н., Калашникова Е.А., Ившина И.Б. Особенности

криоконсервации алканотрофных актинобактерий рода Rhodococcus //

Вестник Пермского университета. Серия: Биология. – 2010. – Т. 1. – № 1. –

С. 15-19.

76. Каминский В.Д., Иванов В.Л., Грикуров Г.Э., Поселов В.А. 60 лет

исследований. НИИГА–ВНИИОкеангеология в Арктике и Антарктике:

история, достижения, перспективы // Проблемы Арктики и Антарктики. –

2008. – Т. 80. – № 3. – С. 5-16.

77. Карасева Э.В., Волченко Н.Н., Самков А.А. Способ отбора

нефтеокисляющих бактерий-продуцентов биосурфактантов. Патент РФ

RU 2320715. Опубл. 27.03.2008.

78. Карасева Э.В., Волченко Н.Н., Худокормов А.А. Нефтеокисляющий

штамм Rhodococcus erythropolis b2 как основа создания биопрепарата для

ликвидации углеводородных загрязнений и рекультивации земель //

185

Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского

государственного аграрного университета. – 2012. – № 83 (09). – С. 1-10.

79. Кащеева П.Б. Создание новых функциональных материалов для очистки

водных сред от нефти и нефтепродуктов: Дис. … канд. хим. наук. –

Москва, 2014. – 107 с.

80. Квасников Е.И., Клюшникова Т.М. Микроорганизмы деструкторы нефти

в водных бассейнах. Киев: Наукова думка, 1981. – 132 с.

81. Козлова Т.М., Медведева Г.А., Мейсель М.Н., Рылкин С.С., Шульга А.В.

Непосредственное обнаружение прохождения н-парафина через

клеточную стенку дрожжей // Микробиология. – 1973. – Т. 42. – № 5. – С.

937-939.

82. Комлева Е.В., Булатова Р.И., Петухова Н.И., Зорин В.В. Скрининг

микроорганизмов – эффективных продуцентов биоэмульгаторов //

Башкирский химический журнал. – 2006. – Т. 13. – № 1. – С. 84-88.

83. Коронелли Т.В., Голимбет В.Е., Ушакова Н.А., Розынов Б.В. Водные

нефтеокисляющие артробактерии // Микробиология. – 1978. – Т. 47. – № 3.

– С. 501-504.

84. Коронелли Т.В. Липиды сапрофитных микобактерий: Автореф. дис. … д-

ра биол. наук. – Москва, 1980. – 49 с.

85. Коронелли Т.В., Калюжная Т.В. Изменение ультраструктуры клеток

сапротрофных микобактерий под влиянием изониазида // Микробиология.

– 1983. – № 2. – С. 205-210.

86. Коронелли Т.В. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов.

М., Изд. Московского Университета, 1984. – 158 с.

87. Коронелли Т.В., Ильинский В.В., Янушка В.А., Красникова Т.И.

Углеводородокисляющая микрофлора акваторий Балтийского моря и

Куршского залива, загрязненных при разливе мазута. // Микробиология –

1987. – Т. 56. – № 3. – С. 472-477.

186

88. Коронелли Т.В., Ильинский В.В., Дермичева С.Г., Комарова Т.И., Беляева

А.Н., Филлипова З.О., Розынов Б.В. Углеводородокисляющие

микроорганизмы арктических вод и льдов // Изв. АН СССР. Сер. Биол. –

1989. – № 4. – C. 581-587.

89. Коронелли Т.В., Нестерова Е.Д. Экологическая стратегия бактерий,

использующих гидрофобный субстрат // Микробиология. – 1990. – Т. 59. –

№ 6. – С. 993-997.

90. Коронелли Т.В., Юферова С.Г. Поверхностно-активные свойства

некоторых штаммов углеводородокисляющих бактерий // Вестн. Моск. ун-

та. Серия 16. Биология. – 1990. – № 1. – С. 14-18.

91. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Юферова С.Г., Ильинский В.В.,

Чивкунова О.Б., Розынов Б.В. Полярные липиды углеводородокисляющих

бактерий. // Микробиология. – 1993. – Т. 62. – № 2. – C. 231-237.

92. Коронелли Т.В. Поступление углеводородов в клетки микроорганизмов //

Усп. микробиологии. – 1996. – № 6. – С. 579-585.

93. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического

разрушения углеводородов в окружающей среде (обзор) // Прикл.

биохимия и микробиология. – 1996. – Т. 32. – № 6. – С. 579-585.

94. Кособокова К.Н. Зоопланктон арктического бассейна: структура

сообществ и региональные особенности количественного распределения:

Дис. ... д-ра биол. наук. – Москва, 2010. – 326 с.

95. Кравец В. Освоение российского арктического шельфа необходимо

ускорить. Часть 2 // ROGTEC: Российские нефтегазовые технологии. –

2013. – Вып. 31. – С. 48-55.

96. Крылов В.А., Мосягин П.В., Крылов А.В., Бочкарева Л.В., Маткивская

Ю.О. Влияние света люминесцентных ламп на стабильность образцов,

содержащих полициклические ароматические углеводороды // Вестник

Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. – 2010. – Т. 1. – №

4. – С. 79-85.

187

97. Кузнецов В.Д., Филиппова С.Н., Муравьева С.А., Фишман В.М.

Прогнозирование выживаемости лиофилизированных спор Actinomyces

parvullus, основанное на методе «ускоренного хранения» //

Микробиология. – 1977. – Т. 46. – № 2. – C. 318-323.

98. Куплетская М.Б., Нетрусов А.И. Жизнеспособность лиофилизированных

микроорганизмов после 50 лет хранения // Микробиология. – 2011. – Т. 80.

№ 6. – С. 842-846.

99. Кураков А.В., Ильинский В.В., Котелевцев С.В., Садчиков А.П.

Биоиндикация и реабилитация экосистем при нефтяных загрязнениях. М.:

изд. «Графикон», 2006. – 336 с.

100. Курлович Н.А., Леонов В.В., Соколова Т.Н. Связь показателя

гидрофобности микробных клеток с их биопленкообразующей

способностью // Биофизика. – 2014. – Т. 59. – № 6. – С. 1131-1134.

101. Кутинов Ю.Г., Чистова З.Б. Основные факторы, влияющие на

состояние окружающей среды Арктической зоны РФ (АЗРФ) // Состояние

арктических морей и территорий в условиях изменения климата: сб.

материалов Всероссийской конференции с международным участием /

отв. Ред. Рябченко С.В. Архангельск: ИД САФУ, 2014. – С. 20-21.

102. Ларин А.А. Влияние нефтяного загрязнения на биохимические

показатели Mytilus galloprovicialis / Материалы междунар. науч. конф.

Саранск, 2007. – С. 100-101.

103. Ленгелер Й., Древс Г., Шлегель Г. Современная микробиология.

Прокариоты [в 2-х томах]. М: Мир, 2005. – 656 с.

104. Леоненко И.И., Антонович В.П., Андрианов А.М. Методы

определения нефтепродуктов в водах и других объектах окружающей

среды (обзор) // Методы и объекты хим. анализа. – 2010. – Т. 5. – № 2. – С.

58-72.

188

105. Лесихина Н., Рудая И., Киреева А., Кривонос О., Кобец Е.

Нефть и газ российской Арктики: экологические проблемы и

последствия. Доклад объединения Bellona – 2007 [Электронный ресурс].

URL: http://www.bellona.ru/reports/oil_gas_report_ru.

106. Литвинова М.Ю., Ильинский В.В., Перетрухина И.В.

Количественная оценка гетеротрофного бактериопланктона в воде

северного и среднего колен Кольского залива // Фундаментальные

исследования. – 2011. – № 7. – С. 203-206.

107. Лозовой Д.В. Влияние нефтяных углеводородов на байкальских

гидробионтов в естественных и лабораторных условиях // Георесурсы. –

2012. – Т. 43. – № 1. – С. 53-58.

108. Максимович Н.Г., Хмурчик В.Т., Мещерякова О.Ю. Опыт очистки

подземных вод от нефтяного загрязнениями биологическими методами //

Промышленная безопасность и экология. – 2009. – Т. 37. – № 4. – С. 34-36.

109. Матишов Г.Г., Никитин Б.А., Сочнее О.Я. Экологическая

безопасность и мониторинг при освоении месторождений углеводородов

на арктическом шельфе. М.: Газоил пресс, 2001. – 322 с.

110. Миронов О.Г. Деление некоторых диатомовых водорослей в

морской воде, содержащей нефтепродукты // Биол. науки. – 1970. – № 7. –

С. 69-72.

111. Миронов О.Г., Писарева Н.А., Щекатурина Т.Л., Лапин Б.П.

Исследование состава аренов в черноморских мидиях методом

высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) // Гидробиол.

журнал. – 1990. – Т. 26. – № 4. – С. 59-62.

112. Миронов О.Г. Бактериальная трансформация нефтяных

углеводородов в прибрежной зоне моря // Морской экологический журнал.

– 2002. – № 1. – Т. 1. – С. 56-66.

189

113. Мишустина И.Е., Щеглова И.К., Мицкевич И.Н. Морская

микробиология. Владивосток: Изд-во Дальневост. Ун-та, 1985. – C. 179-

181.

114. Мокеева А.В., Алексеев А.Ю., Емельянова Е.К., Забелин В.А.,

Заушинцена А.В., Тараканова А.С., Шестопалов А.М., Ильичева Т.Н.

Ассоциация штаммов бактерий-нефтедеструкторов для ремедиации

нефтезагрязненных территорий // Вестник НГУ. Серия: Биология,

клиническая медицина. – 2011. – Т. 9. – Вып. 3. – С. 27-33.

115. Мурзаков Б.Г. Экологические проблемы нефтегазового комплекса и

пути их решения. М.: МГУ, 2005. – 199 с.

116. Мурыгина В.П., Войшвилло Н.Е., Калюжный С.В. Биопрепарат

"Родер" для очистки почв, почвогрунтов, пресных и минерализованных

вод от нефти и нефтепродуктов. Патент РФ RU 2174496. Опубл.

10.10.2001.

117. Назина Т.Н., Соколова Д.Ш., Григорьян А.А., Сюэ Я.-Ф., Беляев

С.С., Иванов М.В. Образование нефтевытесняющих соединений

микроорганизмами из нетфяного месторождения Дацин // Микробиология.

– 2003. – Т. 72. – № 2. – С. 206-211.

118. Немировская И.А. Углеводороды в океане (снег-лед-вода-взвесь-

донные осадки). М.: Изд-во Научный мир, 2004. – 328 с.

119. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. Практикум по

микробиологии: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений. [Под ред.

А.И. Нетрусова]. М.: Издательский центр «Академия», 2005. – 608 с.

120. Нечаева И.А. Биодеградация углеводородов нефти психротрофными

микроорганизмами-деструкторами: Автореф. дис. … канд. биол. наук. –

Пущино, 2009. – 24 с.

121. Нечаева И.А., Гафаров Л.Б., Филонов А.Е., Пумтус И.Ф., Боронин Л.

М.. Составление и отбор ассоциаций микроорганизмов, способных к

деградации углеводородов нефти при пониженной температуре // Известия

190

Тульского государственного университета. Серия Химия. – 2006. – № 6. –

C. 179-188.

122. Никовская Г.Н., Гордиенко A.C., Глоба Л.И. Гидрофильно-

гидрофобные свойства микроорганизмов при различных условиях

культивирования // Микробиология. – 1989. – Т. 58. – № 3. – С. 448-451.

123. Омарова Е.О., Лобакова Е.С., Дольникова Г.А., Некрасова В.В.,

Идиатулов Р.К., Кащеева П.Б., Перевертайло Н.Г., Дедов А.Г.

Иммобилизация бактерий на полимерных матрицах для деградации нефти

и нефтепродуктов // Вестн. Моск. ун-та. Серия 16. Биология. – 2012. – № 1.

– С. 28-35.

124. Освоение ресурсного потенциала и обеспечение экологической

безопасности Арктики: доклад министра природных ресурсов и экологии

Российской Федерации С. Е. Донского на III Международном арктическом

форуме «Арктика – территория диалога» (25.09.2013, г. Салехард) //

Министерство природных ресурсов и экологии Российской Федерации:

интернет-сайт. – 2013. – С. 2.

URL: http://www.mnr.gov.ru/upload/iblock/0bd/doklad_forum.doc.

125. Основы государственной политики Российской Федерации в

Арктике на период до 2020 года и дальнейшую перспективу. Утверждены

Президентом РФ 18 сентября 2008 года (Пр –1969) // Российская газета. –

30 марта 2009.

126. Паничкин И.В., Павленко В.И. Экономические оценки состояния и

перспектив разработки морских нефтегазовых ресурсов Арктики //

Арктика: экология и экономика. – 2012. – Т. 7. – № 3. – С. 14-21.

127. Паринкина О.М. Микрофлора тундровых почв. Л.: Наука,1989. – 159

с.

128. Пархоменко В.П. Моделирование распространения нефтяного

разлива в море, покрытом льдом // Актуальные проблемы гуманитарных и

естественных наук. – 2014. – № 10. – С. 463-466.

191

129. Патин С.А. Влияние загрязнения на биологические ресурсы и

продуктивность Мирового океана. М.: Пищепромиздат., 1979. – 325 с.

130. Патин С.А. Нефть и экология континентального шельфа. М.: Изд-во

ВНИРО, 2001. – 247 с.

131. Патин С.А. Нефтяные разливы и их воздействие на морскую среду и

биоресурсы. М.: Изд-во ВНИРО, 2008. – 507 с.

132. Петриков К.В. Биологические поверхностно-активные вещества,

продуцируемые микроорганизмами-нефтедеструкторами родов

Pseudomonas и Rhodococcus: Автореф. дис. … канд. биол. наук. – Москва.

2011. – 23 с.

133. Петриков К.В., Власова Е.П., Ветрова А.А. Получение сухой формы

биопрепарата для очистки от нефтяных загрязнений и изучение его

свойств при долговременном хранении // Изв. Тульского гос.

университета. Естественные науки. – 2010. – № 1. – С. 186-195.

134. Петров А.А. Углеводороды нефти. М.: Наука, 1984. – 264 с.

135. Пирог Т.П., Волошина И.Н., Игнатенко С.В. Cинтез поверхностно-

активных веществ нефтеокисляющими бактериями Rhodococcus

erythropolis ЭК-1. В сб. «Перспективы и проблемы развития

биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран

Содружества: Материалы Междунар. науч.- практ. конф. 25-28 мая 2005

г.». / Сост. и общ. ред. А.Н. Евтушенкова. – Мн.: РИВШ, 2005.

http://elib.bsu.by/handle/123456789/14756.

136. Плешакова Е.В., Позднякова H.H., Турковская О.В. Получение

нефтеокисляющего биопрепарата путём стимуляции аборигенной

углеводородокисляющей микрофлоры // Прикл. биохимия и

микробиология. – 2005. – Т. 41. – № 6. – С. 634-639.

137. Плотникова Е.Г. Бактерии-деструкторы ароматических

углеводородов и их хлорпроизводных: разнообразие, особенности

192

метаболизма, функциональная геномика: Автореф. дис. … докт. биол.

наук. – Пермь. 2010. – 48 с.

138. Поверхностно-активные вещества и композиции: справочник / Под

ред. М.Ю. Плетнева. М.: ООО Фирма Клавель, 2002. – 768 с.

139. Поттер С., Дикинс Д., Оуэнс Э. Ликвидация разливов нефти на

арктическом шельфе. Передовой международный опыт / ред. Д. Шольц.

Москва, 2013. – 140 с.

140. Похиленко В.Д., Баранов А.М., Детушев К.В. Методы длительного

хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития

// Известия высших учебных заведений. Поволжский регион.

Медицинские науки. – 2009. – Т.12. – № 4. – С. 99-119.

141. Порох А.Н., Решетникова Л.М. Современная ситуация в Арктике и

на Каспии: сравнительный анализ и перспективы сотрудничества в

решении глобальных проблем. Тамбов: Грамота, 2012. – Т. 24. – № 10: в 2-

х ч. – Ч. I. – C. 142–153.

142. Проект «Российская Федерация – Поддержка Национального плана

действий по защите арктической морской среды»: Отчет о выполнении

пилотного проекта «Очистка арктической морской среды от загрязнений с

помощью бурых водорослей». Санкт-Петербург; Мурманск: ООО

«СИРЕНА», 2009. – 87 с.

143. Проект WWF «Оценка и сохранение морского биологического

разнообразия Баренцева моря». Санкт-Петербург, 2001. – 19 с.

144. Проект ЮНЕП/ГЭФ: Российская Федерация – поддержка

Национального плана действий по защите арктической морской среды.

Москва, 2012.

URL: http://npa-arctic.iwlearn.org/Documents/da_full/section_4.3.3.pdf.

145. Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус А.М. Криопротекторы. Киев:

Наук. думка, 1978. – 204 с.

193

146. Пырченкова И.А., Гафаров А.Б., Пунтус И.Ф., Филонов А.Е.,

Боронин А.М. Выбор и характеристика активных психротрофных

микроорганизмов-деструкторов нефти // Прикл. биохимимия и

микробиология. – 2006. – T. 42. – № 3. – C. 298-305.

147. Рачинский В.В., Давидова Е.Г., Лопатышкина А.И. Локализация

окисления н-парафинов дрожжами // ДАН СССР. – 1971. – Т. 200. – № 2. –

С. 457-460.

148. Ребиндер П.А. Применение ПАВ и других химических реагентов в

нефтехимической промышленности. М.: Недра, 1971. – 207 с.

149. Рогозина Е.А. Сравнительная характеристика отечественных

биопрепаратов, предлагаемых для очистки почв и грунтов от загрязнения

нефтью и нефтепродуктами // Нефтегазовая геология. Теория и практика. –

2011. – Т. 5. – № 3. URL: www.ngtp.ru/rub/7/37.2010.pdf.

150. Романенко В.И., Кузнецов С.И. Экология микроорганизмов пресных

водоемов. Ленинград: Наука, 1974. – 193 с.

151. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Практ.

Пособие / под ред. Н.С. Егорова. 2-е изд. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1983. –

251 с.

152. Саввичев А.С. Микробные процессы циклов углерода и серы в

морях Российской Арктики: Автореф. дис. … д-ра биол. наук. – Москва,

2011. – 48 с.

153. Саввичев А.С., Русанов И.И., Пименов Н.В., Захарова Е.Е.,

Веслополова Е.Ф., Леин А.Ю., Крейн К., Иванов М.В. Микробные

процессы циклов углерода и серы в Чукотском море // Микробиология. –

2007. – Т. 76. – № 5. – С. 603-613.

154. Саввичев А.С., Русанов И.И., Захарова Е.Е., Веслополова Е.Ф.,

Мицкевич И.Н., Кравчишина М.Д., Леин А.Ю., Иванов М.В. Микробные

процессы циклов углерода и серы в Белом море // Микробиология. – 2008.

–Т. 77. – № 6. – С. 734-750.

194

155. Саввичев А.С., Захарова Е.Е., Веслополова Е.Ф., Русанов И.И., Леин

А.Ю., Иванов М.В. Микробные процессы циклов углерода и серы в

Карском море // Океанология. – 2010. – Т. 50. – № 6. – С. 942-957.

156. Сазыкин И.С., Сазыкина М.А., Чистяков В.А. Разложение нефти

микроорганизмами. Экологические аспекты // Известия вузов. Северо-

Кавказский регион. Естественные науки. – 2009. – № 6. – С. 88-92.

157. Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток / под ред. Е.П.

Сведенцова. Сыктывкар: Информационно-издательский отдел Коми НЦ

УрО РАН, 2010. – 80 с.

158. Секова В.Ю., Исакова Е.П., Дерябина Ю.И. Применение

экстремофильных дрожжей Yarrowia lipolytica в биотехнологии (обзор) //

Прикл. биохимия и микробиология. – 2015. – Т. 51. – № 3. – С. 290-304.

159. Селин В.С., Цукерман В.А., Виноградов А.Н. Экономические

условия и инновационные возможности обеспечения

конкурентоспособности месторождений углеводородного сырья

арктического шельфа. Апатиты: изд. Кольского научного центра РАН,

2008. – 267 с.

160. Семенов А.М., Федоренко В.Н., Семенова Е.В. Микроорганизмы на

поверхности морских макрофитов в северных морях России и их

возможное практическое использование // Биосфера. – 2014. – Т. 6. – № 1.

– С. 60-76.

161. Семенова Е.В., Семенов А.М., Иванов М.Н., Шеляков О.В.,

Шлыкова Д.С., Нетрусов А.И. Роль микроорганизмов-эпифитов

фукусовых водорослей в деградации углеводородных загрязнений

акваторий северных морей // Экология и промышленность России. – 2009.

– № 3. – С. 16-18.

162. Серебрякова Е.В., Дармов И.В., Медведев Н.П., Алексеев С.А.,

Рыбак С.И. Оценка гидрофобных свойств бактериальных клеток по

195

адсорбции на поверхности капель хлороформа // Микробиология. – 2002.

Т. 71. – № 2. – С. 237-239.

163. Симонов А.И., Орадовский С.П., Ющак А.А. Современное состояние

химического загрязнения вод северной Атлантики // Метеорология и

гидрология. – 1974. – № 3. – С. 61-69.

164. Сопрунова О.Б., Клюянова М.А. Штаммы-деструкторы нефтяных

углеводородов // Вестник Астраханского государственного технического

университета. – 2007. – № 1. – С. 182-183.

165. Сребняк Е.А., Ботвинко И.В., Винокуров В.А., Малахова Д.В.

Способ получения биопрепарата для восстановления водоемов,

загрязненных нефтью или нефтепродуктами. Патент РФ RU 2327649.

Опубл. 27.06.2008.

166. Стабникова Е.В., Селезнева М.В., Рева О.Н., Иванов В.Н. Выбор

активного микроорганизма-деструктора углеводородов для очистки

нефтезагрязненных почв // Прикл. биохимия и микробиология. – 1995. – Т.

31. – № 5. – С. 534-539.

167. Степаньян О.В., Воскобойников Г.М. Влияние нефти и

нефтепродуктов на морфофункциональные особенности морских

макрофитов // Биология моря. – 2006. – Т. 32. – № 4. – С. 241-248.

168. Суслова М.Ю., Липко И.А., Мамаева Е.В., Парфенова В.В.

Разнообразие культивируемых бактерий, выделенных из водной толщи и

донных осадков шельфа Карского моря // Микробиология. – 2012. – Т. 81.

– № 4. – С. 524-531.

169. Тимергазина И.Ф., Переходова Л.С. К проблеме биологического

окисления нефти и нефтепродуктов углеводородокисляющими

микроорганизмами // Нефтегазовая геология. Теория и практика. – 2012. –

Т. 7. – №1. URL: http://www.ngtp.ru/rub/7/16_2012.pdf.

196

170. Федюкина Г.Н., Волков В.Я. Оценка свойств сухих бактерийных

препаратов по данным метода ЯМР-релаксации // Биотехнология. – 2009. –

№ 2. – С. 73−82.

171. Хайруллин Р.Ф. Новая психрофильная протеиназа Serratia

proteamaculans: Дис. ... канд. хим. наук. – Москва, 2009. – 85 с.

172. Харламова М.А., Новиков М.А. К вопросу об уточнении понятий

чувствительности, устойчивости и стабильности экосистем //

Биоиндикация и оценка повреждения организмов и экосистем. –

Петрозаводск, 1997. – С. 163-167.

173. Хасаева Ф.М. Деградация пиридина и его производных

представителями родов Arthrobacter и Rhodococcus: Дисс. ... докт. биол.

наук. – Москва, 2011. – 228 с.

174. Хмурчик В.Т., Максимович Н.Г. Борьба с нефтяным загрязнением

карста // Антропогенная динамика природной среды: материалы

Междунар. науч. – практ. конф. Пермь, 2006. – Т. 2. – С. 375-379.

175. Холоденко В.П., Чугунов В.А., Ермоленко З.М., Миронова Р.И.,

Жиркова Н.А., Мартовецкая И.И. Биопрепарат для очистки воды и почвы

от нефти и нефтепродуктов. Патент РФ RU 2191752. Опубл. 27.10.2002.

176. Христенко С.И. Транспорт и окружающая среда (морские

нефтеперевозки). Киев: Наукова думка, 1983. – 200 с.

177. Черкашин С.А. Отдельные аспекты влияния углеводородов нефти на

рыб и ракообразных // Вестник ДВО РАН. – 2005. – № 3. – С. 83-91.

178. Чуйко В.А. Механизмы криозащитной эффективности и

фармакологические свойства ДМСО // Криобиология. – 1989. – № 1. – С.

3-10.

179. Шахматова О.А. Отклик гидробионтов на стрессовые факторы

морских экоcистем // Экосистемы, их оптимизация и охрана. – 2012. – №

7. – С. 98-113.

197

180. Шахова Н.Е., Семилетов И.П. Метан в морях Восточной Арктики:

избранные результаты исследования (1994 - 2014). Проект «Поисковые и

фундаментальные научные исследования в интересах развития

Арктической зоны Российской Федерации на 2014 год».

181. Шамраев А.В., Шорина Т.С. Влияние нефти и нефтепродуктов на

различные компоненты окружающей среды // Вестник Оренбургского

государственного университета. – 2009. – № 6 (100). – С. 642-645.

182. Шендеров Б.А., Гахова Э.Н., Манвелова М.А., Пиорунский Д.А.,

Карнаухов В.Н. Способ длительного хранения естественных

симбиотических ассоциаций микроорганизмов человека и животных.

Патент РФ RU 2123044. Опубл. 10.12.1998.

183. Щукин Е.Д., Перцов А.В., Амелина Е.А. Коллоидная химия. М.:

Высшая школа, 2004. – 445 с.

184. Энергетическая стратегия России на период до 2020 года.

Утверждена распоряжением Правительства Российской Федерации №

1234-р от 28 августа 2003 года.

185. Эрхард Ж.П., Сежен Ж. Планктон. Состав, экология, загрязнение. Л.:

Гидрометеоиздат, 1984. – 256 с.

186. Яковлева О.В. Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus

Cohn продуценты поверхностно-активных веществ: Дисс… канд. биол.

наук. – Уфа, 2004. – 117 с.

187. Янкявичюс К., Пакальнис Р., Баранаускене А., Янкавичюте Г.

Влияние нефтяного загрязнения Балтийского моря на жизнедеятельность

планктонных организмов и роль гидробактерий в самоочищении морских

вод // Экология (Вильнюс). – 1992. – № 4. – С. 1-6.

188. Abd-Elnabya H.M., Abou-Elelaa G.M., Ghozlanb H.A., Husseina H.,

Sabryb S.A. Characterization and bioremediation potential of marine

Psychrobacter species // The Egyptian Journal of Aquatic Research. – 2016. –

V. 42. – P. 1-11.

198

189. Alonso-Sáez L., Waller A.S., Mende D.R., Bakker K., Farnelid H., Yager

P.L., Lovejoy C., Tremblay J.-E., Potvin M., Heinrich F., Estrada M., Riemann

L., Bork P., Pedrós-Alió C., Bertilsson S. Role for urea in nitrification by polar

marine Archaea // Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America. – 2012. – V. 109. – P. 17989-17994.

190. AMAP (Arctic Monitoring and Assessment Programme). AMAP

Assessment 2002: Persistent organic pollution in the Arctic. Oslo: AMAP,

2007. – 57 p.

191. Ames J.M. The Maillard browning reaction — an update. – V. 17. –

London: Chem. Ind., 1988. – P. 558-561.

192. ASCE Task Committee on Modeling Oil Spill. State-of-the-art Review of

Modeling Transport and Fate of Oil Spill // Journal of Hydraulic Engineering. –

1996. – V. 122. – № 11. – P. 594-609.

193. Arahal D.R., Castillo A.M., Ludwig W., Schleifer K.H., Ventosa A.,

Proposal of 433 Cobetia marina gen. nov., comb. nov., within the Family

Halomonadaceae, to include the 434 species Halomonas marina // Systematic

and Applied Microbiology. – 2002. – V. 25. – P. 207–211.

194. Atlas R.M., Horowitz A., Busdosh M. Prudhoe crude oil in Arctic marine

ice, water and sediment ecosystem degradation and interaction with microbial

and benthic communities // J. Fish. Res. Board Can. – 1978. – V. 35. – № 5. – P.

585-590.

195. Baker J.M., Clark R.B., Kingston P.F., Jenkins R.H. Natural recovery of

cold water marine environment after an oil spill // Presented at the Thirteens

Annual Arctic and Marine Oil spill Program Technical Seminar, June 1990. –

1991. – 111 p.

196. Bankar A.V., Kumar A.R., Zinjarde S.S. Environmental and industrial

applications of Yarrowia lipolytica // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2009. – V.

84. – № 5. – P. 847-865.

199

197. Bano N., Hollibaugh J.T. Phylogenetic composition of bacterioplankton

assemblages from the Arctic Ocean // Appl. Environ. Microbiol. – 2002. – V.

68. – № 2. – Р. 505-518.

198. Barkay T., Navon-Venezia S., Ron E., Rosenberg E. Enhancment of

solubilization and biodegradation of polyaromatic hydrocarbons by the

bioemulsifier alasan // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – V. 65. – № 6. – P.

2697-2702.

199. Batista S.B., Mounteer A.H., Amorim F.R., Tótola M.R. Isolation and

characterization of biosurfactant/bioemulsifier-producing bacteria from

petroleum contaminated sites // Bioresource Technology. – 2006. – V. 97. – №

6. – P. 868-875.

200. Blenner M.A. Enzymatic deconstruction and metabolism of lignin for

biofuels // Advances in Enzymatic Conversion of Biomass to Biofuels. Future

Medicine Ltd. – 2015. – P. 20-34.

201. Boeuf D., Humily F., Jeanthon C. Diversity of Arctic pelagic prokaryotes

with an emphasis on photoheterotrophic bacteria: a review. // Biogeosciences

Discussions. – 2014. – V. 11. – Р. 2419-2455.

202. Bogorov B.G. Perspectives in the study of seasonal changes of plankton

and of the number of generations at different latitudes. In: Perspectives in

Marine Biology. [Ed. by Buzzati-Traverso А.А.]. Simp. “Held at scripps

institution of Oceanogr. Univ. of Calif. March, 24 — April, 2, 1956”, 1960. – P.

145-158.

203. Bozal N., Montes M.J., Miñana-Galbis D., Manresa A., Mercadé E.

Shewanella vesiculosa sp. nov., a psychrotolerant bacterium isolated from an

Antarctic coastal area // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. – 2009. – V. 59. – (Pt 2). –

P. 336-340.

204. Bouchez M., Blanchet D., Vandecasteele J.-P. Degradation of polycyclic

aromatic hydrocarbons by pure strains and by defined strain associations:

200

inhibition phenomena and cometabolism // Appl. Microbiol. Biotechnol. –

1995. – V. 45. – P. 156-164.

205. Bouchez-Naitali M., Rakatozafy H., Marchal R., Leveau J.Y.,

Vandecasteele J.P. Diversity of bacterial strains degrading hexadecane in

relation to the mode of substrate uptake // J. Appl. Microbiol. – 1999. – V. 86. –

№ 3. – P. 421-428.

206. Brakstad O.G., Bonaunet K. Biodegradation of petroleum hydrocarbons

in seawater at low temperatures (0-5°C) and bacterial communities associated

with degradation // Biodegradation. – 2006. – V. 17. – № 1. – P. 71-82.

207. Brinkmeyer R., Knittel K., Jürgens J., Weyland H., Amann R., Helmke E.

Diversity and structure of bacterial communities in arctic versus Antarctic pack

ice // Appl. Environ. Microbiol. – 2003. – V. 69. – № 11. – P. 6610-6619.

208. Buzzini P., Margesin R. Cold-adapted Yeasts: Biodiversity, Adaptation

Strategies and Biotechnological Significance. Springer Berlin Heidelberg, 2013.

– 350 p.

209. Camacho C., Coulouris G., Avagyan V., Ma N., Papadopoulos J., Bealer

K., Madden T.L. BLAST+: architecture and applications // BMC

Bioinformatics. – 2009. – 10:421.

210. Calvo C., Manzanera M., Silva-Castro G.A., Uad I., González-López J.

Application of bioemulsifiers in soil oil bioremediation processes // Future

prospects. Sci. Total Environ. – 2009. – V. 407. – № 12. – P. 3634-3640.

211. Carls M.G., Marty G.D., Hose J.E. Synthesis of the toxicological impacts

of the Exxon Valdez oil spill on Pacific herring (Clupea pallasi) in Prince

William Sound, Alaska, U.S.A. // Can. J. Fish. Aquat. Sci. – 2002. – V. 59. – P.

153-172.

212. Carlucci A.F., Pramer D. Factor affecting the survival of bacteria in sea

water // Appl. Microbiol. – 1959. – V. 7. – № 6. – P. 388–392.

201

213. Cavicchioli R., Siddiqui K.S., Andrews D., Sowers K.R. Low-

temperature extremophiles and their applications // Curr. Opin. Biotechnol. –

2002. – V. 13. – P. 253-261.

214. Chattopadhyay M., Jagannadham M. Maintenance of membrane fluidity

in Antarctic bacteria // Polar Biology. – 2001. – V. 24. – № 5. – P. 386–388.

215. Chattopadhyay M.K. Mechanism of bacterial adaptation to low

temperature // Journ. Of Bioscienc. – 2006. – V. 31. – № 1. – P. 157-165.

216. Cirigliano M.C., Carman G.M. Isolation of a bioemulsifier from Candida

lipolytica // Appl. Environ. Microbiol. – 1984. – V. 48. – P. 747-750.

217. Climate Change, Permafrost, and Impacts on Civil Infrastructure / U.S.

Arctic Research Commission. Permafrost Task Force Report. – December 2003.

Special Report 01–0.

218. Cobet A.B., Jones G.E., Albright J., Simon H., Wirsen C. The effect of

nickel on a marine bacterium: fine structure of Arthrobacter marinus // J. Gen.

Microbiol. – 1971. – V. 66. – P. 185-196.

219. Cooksey K.E., Wigglesworth-Cooksey B. Adhesion of bacteria and

diatoms to surfaces in the sea: a review // Aqua. Microb. Ecol. – 1995. – № 9. –

P. 87-96.

220. Connell L.B., Redman R., Craig S., Scorzetti G., Iszard M., Rodriguez R.

Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica // Microb.

Ecol. – 2008. – № 56. – P. 448-459.

221. Cooney J.J. The fate of petroleum pollutants in fresh-water ecosystems //

Petroleum Microbiology. – 1984. – Р. 399-434.

222. Cooper D.G., Goldenberg G.G. Surface-active agents from two Bacilllus

species // Appl. Environ. Microbiol. – 1987. – V. 53. – № 2. – P. 224-229.

223. Csutak O., Corbu V., Stoica I., Ionescu R., Vassu T. Biotechnological

Applications of Yarrowia lipolytica CMGB32 // Agriculture and Agricultural

Science Procedia. – 2015. – V. 6. – P. 545-553.

202

224. D’Amico S., Claverie P., Collins T., Georlette D., Gratia E., HoyouxA.,

Meuwis M-A., Feller G., Gerday C. Molecular basisof cold adaptation // Philos.

Trans. R. Soc. London B. Biol. Sci. – 2002. – V. 357. – P. 917-925.

225. D’Amico S., Collins T., Marx J.-C., Feller G., Gerday C. Psychrophilic

microorganisms: challenges for life // EMBO Rep. – 2006. – V. 7. – № 4. – P.

385-389.

226. Deming J.W. Psychrophiles and polar regions // Curr. Opin. Microbiol. –

2002. – V. 5. – № 3. – P. 301-309.

227. Deppe U., Richnow H.-H., Michaelis W., Antranikian G. Degradation of

crude oil by an Arctic microbial consortium // Extremophiles. – 2005. – V. 9. –

P. 461-470.

228. Draft Toxicological Intake Values for Priority Contaminants in Soil. –

Wellington: Ministry for the Environment, 2010. – 168 p.

229. DSMZ. German Collection of Microorganisms and Cell Cultures. Strains

degrading/utilizing natural or xenobiotic compounds. – 2015.

http://www.dsmz.de/.

230. Ducklow H.W., Shiah F. Bacterial production in estuaries. In: Aquatic

microbiology: An ecological approach. [Ed. by Zn T. Ford. Blackwell]. 1993. –

P. 261-288.

231. Dutta T.K., Harayama S. Biodegradation of n-alkylcycloalkanes and n-

alkylbenzenes via new pathways in Alcanivorax sp. strain MBIC 4326 // Appl.

Environ. Microbiol. – 2001. – V. 67. – №. 4. – P. 1970-1974.

232. Dziewit L., Cegielski A., Romaniuk K., Uhrynowski W., Szych A.,

Niesiobedzki P., Zmuda-Baranowska M.J., Zdanowski M.K., Bartosik D.

Plasmid diversity in arctic strains of Psychrobacter spp. // Extremophiles –

2013. – V. 17. – № 3. – P. 433-444.

233. Eddy B.P. The use and meaning of the term “psychrophilic” // J. Appl.

Bacteriol. – 1960. – V. 23. – P. 189-190.

203

234. Einarsson H.B., Snygg G., Eriksson C. Inhibition of bacterial growth by

Maillard reaction product // J. Agric. Food Chem. – 1983. – V. 31. – № 5. – P.

1043-1047.

235. Einarsson H., Eklund T., Nes I.F. Inhibitory mechanisms of Maillard

reaction products // Microbios. – 1988. – 53 (214). – Р. 27-36.

236. Emerson R. Oil spill risk analysis // Environmental risk assessment for oil

and gas de-velopment on the continental shelf of the Russian Far East. –

Magadan, 1994. – P. 34-40.

237. Fickers P., Benetti P.-H., Waché Y., Marty A., Mauersberger S., Smit M.

S., Nicaud J.-M. Hydrophobic substrate utilisation by the yeast Yarrowia

lipolytica, and its potential applications // FEMS Yeast Research. – 2005. – № 5

(6-7). – P. 527-543.

238. Floodgate G.D. The fate of petroleum in marine ecosystems. / In: RM

Atlas, Petroleum microbiology. New York: MacMillan, 1984. – P. 355-397.

239. Francy D.S., Thomas J.M., Raymond R.L., Ward. C.H. Emulsification of

hydrocarbon by subsurface bacteria // Journal of Industrial Microbiology. –

1991. – № 8. – Р. 237-246.

240. Frias A., Manresa A., de Oliveira E., López-Iglesias C., Mercade E.

Membrane vesicles: a common feature in the extracellular matter of cold-

adapted antarctic bacteria // Microb Ecol. – 2010. – V. 59. – № 3. – P. 476-486.

241. Fritsche W., Hofrichter M. Aerobic degradation by microorganisms. //

Biotechnology. – 1999. – V. 11b: Environmental Process. – P. 145-167.

242. Frysinger G.S., Hall G.J., Pourmonir A.L., Bischel H.N., Peacock E.E.,

Nelson R.N., Reddy C.M. Tracking and modeling the degradation of a 30 year

old fuel oil spill with comprehensive two-dimensional gas chromatography //

International Oil Spill Conference Proceedings. – 2011. – V. 2011. – № 1. – P.

428.

243. Galand P.E., Lovejoy C., Pouliot J., Garneau M., Vincent W.F. Microbial

community diversity and heterotrophic production in a coastal Arctic

204

ecosystem: a Stamukhi lake and its source waters // Limnology and

Oceanography. – 2008а. – V. 53. – P. 813-823.

244. Galand P.E., Lovejoy C., Pouliot J., Vincent W.F. Heterogeneous

archaeal communities in the particle-rich environment of an arctic shelf

ecosystem // Journal of Marine Systems. – 2008b. – V. 74. – P. 774–782.

245. Garneau M.-È., Michel C., Meisterhans G., Fortin N., King T.L., Greer

C.W., Lee K. Hydrocarbon biodegradation by Arctic sea-ice and sub-ice

microbial communities during microcosm experiments, Northwest Passage

(Nunavut, Canada) // FEMS Microbiology Ecology. – 2016. – V. 92. – № 10. –

P. 1-18.

246. Garrett R.M., Pickering I.J., Haith C.E., Prince R.C. Photooxidation of

Crude Oils // Environ. Sci. Technol. – 1998. – V. 32. – № 23. – P. 3719-3723.

247. Geiselbrecht A.D., Hedlund B.P., Tichi M.A., Staley J.T. Isolation of

Marine Polycyclic Aromatic Hydrocarbon (PAH)-Degrading Cycloclasticus

Strains from the Gulf of Mexico and Comparison of Their PAH Degradation

Ability with That of Puget Sound Cycloclasticus Strains // Appl. Environ.

Microbiol. – 1998. – V. 64. – № 12. – P. 4703-4710.

248. Gentile G., Bonasera V., Amico C., Giuliano L., Yakimov M.M.

Shewanella sp. GA-22, a psychrophilic hydrocarbonoclastic antarctic bacterium

producing polyunsaturated fatty acids // J. Appl. Microbiol. – 2003. – V. 95. –

P. 1124-1133.

249. Gerdes B., Brinkmeyer R., Dieckmann G., Helmke E. Influence of crude

oil on changes of bacterial communities in Arctic sea-ice // FEMS Microb. Ecol.

– 2005. – V. 53. – № 1. – P. 129-139.

250. Gerday C., Aittaleb M., Bentahir M., Chessa J-P., Claverie P., Collins T.,

D’Amico S., Dumont J., Garsoux G., Georlette D.,Hoyoux A., Lonhienne T.,

Meuwis M-A., Feller G. Cold-adapted enzymes: from fundamentals to

biotechnology // Trends Biotechnol. – 2000. – V. 18. – P. 103-107.

205

251. Ghiglione J.-F., Galand P.E., Pommier T., Pedrós-Alió C., Maas E.W.,

Bakker K., Bertilson S., Kirchman D.L., Lovejoy C., Yager P.L., Murray A.E.

Pole-to-pole biogeography of surface and deep marine bacterial communities //

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

America. – 2012. – V. 109. – P. 17633-17638.

252. Gill P.E. Practical optimization. [Eds. Gill P.E., Murray W., Wright

M.H.]. London: Acad. Press, 1981. – 509 p.

253. Gounot A.M. Bacterial life at low temperature: physiological aspects and

biotechnological implications // J. Appl. Bacteriol. – 1991. – V. 71. – P. 386-

397.

254. Gray N.D., Sherry A., Grant R.J., Rowan A.K., Hubert C.R., Callbeck

C.M., Aitken C.M., Jones D.M., Adams J.J., Larter S.R., Head I.M. The

quantitative significance of Syntrophaceae and syntrophic partnerships in

methanogenic degradation of crude oil alkanes // Environmental Microbiology.

– 2011. – V. 13. – № 11. – P. 2957-2975.

255. Grimont F., Grimont P.A.D. The Genus Serratia. In Prokaryotes: A

Handbook on the Biology of Bacteria, V. 6. Third Edition: Proteobacteria:

Gamma subclass [Ed. Dworkin M.]. Springer, New York, 2006. – P. 219-244.

256. Guha S., Jaffe P. Biodegradation kinetics of phenanthrene partitioned into

the micellar phase of nonionic surfactants // Environ. Sci. Technol. – 1996. – V.

30. – № 2. – P. 605–611.

257. Han S.K., Nedashkovskaya O.I., Mikhailov V.V., Kim S.B., Bae K.S.

Salinibacterium amurskyense gen. nov., sp. nov., a novel genus of the family

Microbacteriaceae from the marine environment // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.

– 2003. – V. 53. – (Pt 6). – P. 2061-2066.

258. Hansen H.P. Photochemical degradation of petroleum surface films on

sea-water // Mar. Chem. – 1975. – V. 3. – P. 183-195.

259. Harder T. Marine epibiosis: сoncepts, ecological consequences and host

defence // Mar. Indust. Biofouling. – 2009. – V. 4 – P. 219-231.

206

260. Harding T., Jungblut A.D., Lovejoy C., Vincent W.F. Microbes in high

arctic snow and implications for the cold biosphere // Appl. Environ. Microbiol.

– 2011. – V. 77. – P. 3234-3243.

261. Head I.M., Jones D.M., Roling F.M. Marine microorganisms make a meal

of oil // Nature. – 2006. – №. 4. – P. 173-182.

262. Heath D.J., Lewis C.A., Rowland S.J. The use of high temperature gas

chromatography to study the biodegradation of high molecular weight

hydrocarbons // Org. Geochem. – 1997. – V. 26. – № 12. – Р. 769-785.

263. Hedlund B.P., Geiselbrecht A.D., Bair T.J., Staley J.T. Polycyclic

aromatic hydrocarbon degradation by a new marine bacterium, Neptunomonas

naphthovorans gen. nov., sp. nov. // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – V. 65.

– № 1. – P. 251-259.

264. Herman Y. The Arctic Seas: Climatology, Oceanography, Geology, and

Biology. New York, Springer US, 1989. – 888 p.

265. Hollibaugh J.T., Lovejoy C., Murray A.E. Microbiology in polar oceans //

Oceanography. – 2007. – V. 20. – № 2. – P. 138-143.

266. Hoover R.B., Pikuta E.V. Psychrophilic and psychrotolerant microbial

extremophiles in polar enviroments // Polar Microbiol. – 2010. – P. 115–156.

267. Huang S., Wilhelm S.W., Harvey H.R., Taylor K., Jiao N., Chen F. Novel

lineages of Prochlorococcus and Synechococcus in the global oceans // ISME J.

– 2012. – V. 6. – P. 285-297.

268. Hubaalek Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms //

Cryobiology. – 2003. – V. 46. – P. 205-229.

269. Huggins C.E. Frozen Blood // Ann. Surg. – 1964. – V. 160. – № 4. – P.

643-649.

270. Ibacache-Quiroga C., Ojeda J., Espinoza-Vergara G., Olivero P., Cuellar

M., Dinamarca M.A. The hydrocarbon-degrading marine bacterium Cobetia sp.

strain MM1IDA2H-1 produces a biosurfactant that interferes with quorum

207

sensing of fish pathogens by signal hijacking // Microb Biotechnol. – 2013. – V.

6. – № 4. – P. 394-405.

271. IPCC, 2001: Climate Change 2001: The Scientific Basis. Contribution of

Working Group I to the Third Assessment Report of the Intergovernmental

Panel on Climate Change. Cambridge University Press: United Kindom and

New York, 2001. – 881 p.

272. Ivanova E.P., Bakunina I.Y., Sawabe T., Hayashi K., Alexeeva Y.V.,

Zhukova N.V., Nicolau D.V., Zvaygintseva T.N., Mikhailov V.V. Two species

of culturable bacteria associated with degradation of brown algae Fucus

evanescens // Microb. Ecol. – 2002. – V. 43. – P. 242-249.

273. Ivanova E.P., Christen R., Sawabe T., Alexeeva Y.V., Lysenko A.M.,

Chelomin V.P., Mikhailov V.V. Presence of ecophysiologically diverse

populations within Cobetia marina strains isolated from marine invertebrate,

algae and the environments // Microbes and Environments. – 2005. – V. 20. – P.

200-207.

274. Isaac P., Sánchez L.A., Bourguignon N., Ferrero M.A. Indigenous PAH-

degrading bacteria from oil-polluted sediments in Caleta Cordova, Patagonia

Argentina // International Biodeterioration & Biodegradation. – 2013. – V. 82. –

P. 207-214.

275. ISO 9377-2:2000 «Water quality - Determination of hydrocarbon oil

index - Part 2: Method using solvent extraction and gas chromatography»,

NEQ.

276. Jagannadham M.V., Chattopadhyay M.K., Subbalakshmi C., Vairamani

M., Narayanan K., Rao C.M., Shivaji S. Carotenoids of an Antarctic

psychrotolerant bacterium, Sphingobacterium antarcticus, and a mesophilic

bacterium, Sphingobacterium multivorum. // Arch. Microbiol. – 2000. – V. 173.

– P. 418-424.

277. Jia Z., Davies P.L. Antifreeze proteins: an unusual receptor–ligand

interaction // Trends Biochem. Sci. – 2002. – V. 27. – P. 101-106.

208

278. Juhasz A.L., Stanley G.A., Britz M.L. Metabolite repression inhibits

degradation of benzo[a]pyrene and dibenz[a,h]anthracene by Stenotrophomonas

maltophila VUN 10, 003 // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 2002. – V. 28. – P.

88-96.

279. Jungblut A.D., Lovejoy C., Vincent W.F. Global distribution of

cyanobacterial ecotypes in the cold biosphere // ISME Journal. – 2010. – V. 4. –

P. 191-202.

280. Junge K; Krembs C.; Deming J.; Stierle A.; Eicken H. A microscopic

approach to investigate bacteria under in situ conditions in sea-ice samples //

Annals of Glaciology. – 2001. – V. 33. – № 1. – P. 304-310.

281. Junge K., Eicken H., Deming J.W. Bacterial activity at –2 to –20°C in

Arctic winter time sea ice // Appl. Environ. Microbiol. – 2004. – V. 70. – P.

550-557.

282. Karanth N.G.K., Deo P.G., Veenanadig N.K. Microbial production of

biosurfactant and their importance // Ferment. Sci. Technol. – 1999. – V. 77. –

P. 116-126.

283. Kasana R.C. Proteases from psychrotrophs: An Overview // Crit. Rev.

Microbiol. – 2010. – V 36. – № 2. – P. 134-145.

284. Kawamura A. Observations of phytoplankton in the Arctic Ocean in

1964. In-form. Bull. Plankton. Jap. Comm. Number Dr. Matsues., 1967. – Р.

71-89.

285. Khelifa A., Stoffyn-Egli P., Hill P.S., Lee K. Effects of salinity and clay

type on oil – mineral aggregation // Mar. Environ. Research. – 2005. – V. 59. –

P. 235-254.

286. Kim S.-J., Sohn J.H., Sim D.S., Kwon K.K., Kim T.H.The Effects of

bioremediation on the oil degradation in oil polluted environments. In: New

Developments in Marine Biotechnology. [Eds. Gal Y. Le, Halvorson H.O.].

New York: Springer Science & Business Media, 1998. – P. 181-188.

209

287. Kim T.H., Lee J.H., Oh Y.S., Bae K.S., Kim S.J. Identification and

characterization of an oil-degrading yeast Yarrowia lipolytica 180 // J.

Microbiol. – 1999. – V. 37. – P. 128-135.

288. Kim T.H., Oh Y.-S., Kim S.J. The possible involvement of the cell

surface in aliphatic hydrocarbon utilization by an oil degrading yeast Yarrowia

lipolytica 180. J. Microbiol. Biotechnol. – 2000. – V. 10. – P. 333-337.

289. Kleinheinz G.T., Bagley S.T. A filter-plate method for the recovery and

cultivation of microorganisms utilizing volatile organic compounds // J.

Microbiol. Methods. – 1997. – V. 29. – P. 139–144.

290. Knoblauch C., Sahm K., Jørgensen B.B. Psychrophilic sulfate-reducing

bacteria isolated from permanently cold Arctic marine sediments: description of

Desulfofrigus oceanense gen. nov., sp. nov., Desulfofrigus fragile sp. nov.,

Desulfofaba gelida gen. nov., sp. nov., Desulfotalea psychrophila gen. nov., sp.

nov. and Desulfotalea arctica sp. nov. // International Journal of Systematic

Bacteriology. – 1999. – V. 49. – P. 1631-1643.

291. Kotsyurbenko O.R., Simankova M.V., Nozhevnikova A.N., Zhilina T.N.,

Bolotina N.P., Lysenko A.M., Osipov G.A. New species of psychrophilic

acetogens: Acetobacterium bakii sp. nov., A. paludosum sp. nov., A. fimetarium

sp. nov. // Arch. Microbiol. – 1995. – V. 163. – P. 29-34.

292. Krembs C., Eicken H., Junge K., Deming J.W. High concentrations of

exopolymeric substances in Arctic winter sea ice: implications for the polar

ocean carbon cycle and cryoprotection of diatoms // Deep-Sea Res. Part I. –

2002. – V. 49. – P. 2163-2181.

293. Kristensen M., Johnsen A.R., Christensen J.H. Marine biodegradation of

crude oil in temperate and Arctic water samples // Journal of Hazardous

Materials. – 2015. – V. 300. – P. 75-83.

294. Kudo T., Kidera A., Kida M., Kawauchi A., Shimizu R., Nakahara T.,

Zhang X., Yamada A., Amano M., Hamada Y., Taniyama S., Arakawa O.,

Yoshida A., Oshima K., Suda W., Kuwahara H., Nogi Y., Kitamura K., Yuki

210

M., Iida T., Moriya S., Inoue T., Hongoh Y., Hattori M., Ohkuma M. Draft

genome sequences of Psychrobacter strains JCM 18900, JCM 18901, JCM

18902, and JCM 18903, isolated preferentially from frozen aquatic organisms //

Genome Announc. – 2014. – 2 (2).

295. Kulp A., Kuehn M.J. Biological functions and biogenesis of secreted

bacterial outer membrane vesicles // Annu. Rev. Microbiol. – 2010. – V. 64. –

P. 163-184.

296. Lane D.J. 16S/23S sequencing // Nucleic acid techniques in bacterial

systematics. [Eds. Stackebrandt E., Goodfellow M., Chichester]. John Wiley &

Sons, Ltd., 1991. – P. 115-175.

297. Lee E.Y., Choi D.Y., Kim D.K., Kim J.W., Park J.O., Kim S., Desiderio

D.M., Kim Y.K., Kim K.P., Gho Y.S. Gram-positive bacteria produce

membrane vesicles: proteomics-based characterization of Staphylococcus

aureus-derived membrane vesicles // Proteomics. – 2009. – V. 24. – № 9. – P.

5425-5436.

298. Lelchat F., Cerantola S., Brandily C., Colliec-Jouault S., Baudoux A.-C.,

Ojima T., Boisset C. The marine bacteria Cobetia marina DSMZ 4741

synthesizes an unexpected K-antigen-like exopolysaccharide // Carbohydrate

Polymers. – 2015. – V. 124. – P. 347-356.

299. Liu J., Zhou Z., Xu Z., Masliyah J. Bitumen–clay interactions in aqueous

media studied by zeta potential distribution measurement // Journal of Colloid

and Interface Science. – 2002. – V. 252. – P. 409-418.

300. Lo Giudice A., Bruni V., De Domenico M., Michaud L. Psychrophiles –

cold adapted hydrocarbon – degrading microorganisms. In: Handbook of

Hydrocarbon and Lipid Microbiology. [Ed. by Timmis K.N.]. Springer, Berlin,

2010. – Р. 1897-1921.

301. Malik K.A. Liquid-drying of microorganisms using a simple apparatus //

World J. Microbiol. Biotechnol. – 1992. – V. 8. – № 1. – Р. 80-82.

211

302. Malik K.A., Hoffmann P. Long-term preservation of yeast cultures by

liquid-drying // World J. Microbiol. Biotechnol. – 1993. – V. 9. – № 3. – Р. 372-

376.

303. Margesin R., Schinner F. Properties of cold-adapted microorganism and

their potential role in biotechnology // Journal of Biotechnology. – 1994. – V.

33. – P. 1-14.

304. Margesin R., Schinner F. Bioremediation of diesel-oil-contaminated

alpine soils at low temperatures // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1997. – V. 47.

– P. 462-468.

305. Margesin R., Schinner F. Biotechnological applications of cold-adapted

organisms. Springer, 1999. – 338 p.

306. Margesin R., Schinner F. Biodegradation and bioremediation of

hydrocarbons in extreme environments // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2001.

– V. 56. – P. 650-663.

307. Margesin R., Gander S., Zacke G., Gounot A.M., Schinner F.

Hydrocarbon degradation and enzyme activities of cold-adapted bacteria and

yeasts // Extremophiles. – 2003. – № 7. – Р. 451-458.

308. Margesin R., Neuner G., Storey K.B. Cold-loving microbes, plants, and

animals —fundamental and applied aspects // Naturwissenschaften. – 2007. –

V. 94. – P. 77-99.

309. Margesin R., Miteva V. Diversity and ecology of psychrophilic

microorganisms // Res. Microbiol. – 2011. – V. 162. – P. 346-361.

310. Mazur P. The role of cell membranes in the freezing of yeast and other

single cells // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 1965. – V. 125. – № 2. – P. 658-676.

311. McGill W.B. Soil restoration following oil spills // Canad. Petrol.

Technol. – 1977. – V. 16. – № 2. – P. 60-67.

312. Meryman H.T. Cryoprotective agents: A review // Cryobiology. – 1971. –

V. 3. – № 2. – P. 173-183.

212

313. Miteva V.I., Sheridan P.P., Brenchley J.E. Phylogenetic and physiological

diversity of microorganisms isolated from a deep greenland glacier ice core //

Appl. Environ. Microb. – 2004. – V. 70. – № 1. – P. 202-213.

314. Miyamoto-Shinohara Y., Imaizumi T., Sukenobe J., Murakami Y.,

Kawamura S., Komatsu Y. Survival rate of microbes after freeze-drying and

long-term storage // Cryobiol. – 2000. – V. 41. – № 3. – P. 251-255.

315. Moghadam M.S., Albersmeier A., Winkler A., Cimmino L., Rise K,

Hohmann-Marriott M. F., Kalinowski J., Rückert C., Wentzel A., Lale R.

Isolation and genome sequencing of four Arctic marine Psychrobacter strains

exhibiting multicopper oxidase activity // BMC Genomics. – 2016. – V. 17. – №

117.

316. Moraes M.A., Rosa G.S., Pinto L.A.A. Moisture sorption isotherms and

thermodynamic properties of apple funji and garlic. // Int. J. Food Sci. Technol.

–2008. – V. 43. – P. 1824-1831.

317. Morita R.Y. Psychrophilic bacteria // Bacteriol. Rev. – 1975. – V. 39. – P.

144-167.

318. Morita R.Y. Starvation-survival of heterotrophs in the marine

environment // Advances in Microb. Ecol. – 1982. – № 6. – P. 171-198.

319. Mueller D.R., Vincent W.F., Bonilla S., Laurion I. Extremotrophs,

extremophiles and broadband pigmentation strategies in a high arctic ice shelf

ecosystem // FEMS Microbiol. Ecol. – 2005. – V. 53. – P. 73-87.

320. Muda K., Aris A., Salim M.R., Ibrahim Z., van Loosdrecht M.C.M.,

Nawahwi M.Z., Affam A.C. Aggregation and surface hydrophobicity of

selected microorganism due to the effect of substrate, pH and temperature //

International Biodeterioration & Biodegradation. – 2014. – V. 93. – P. 202-209.

321. Mulkins-Phillips G.J., Stewart J. Effect of environmental parameters on

bacterial degradation of Bunker C oil, crude oils, and hydrocarbons // Appl.

Microbiol. – 1974. – V. 28. – № 6. – P. 915-922.

213

322. Mulligan C.N., Gibbs B.F. Factors influencing the economics of

biosurfactant. In: Biosurfactant production, properties and application. [Ed. by

Kosaric N.]. New York; Mercel Decker, 1993. – P. 329-371.

323. NAS (National Academy of Sciences). Oil in the Sea III: Inputs, Fates,

and Effects. National Research Council. Washington, D.C.: The National

Academies Press, 2003. – 265 p.

324. Nash T. Chemical constitution and physical properties of compounds able

to protect living cells against damage due to freezing and thawing. In:

Cryobiology. [Ed. by Meryman H.T.]. Academic Press, London-New York,

1966. – P. 179-211.

325. Neff J.M. Bioaccumulation in marine organisms: effect of contaminants

from oil well produced water. Amsterdam; London: Elsevier, 2002. – 452 р.

326. Nicodem D.E., Conceic M., Fernandes A.Z., Guedes C.L.B., Correa R.J.

Photochemical processes and the environmental impact of petroleum spills //

Biogeochemistry. – 1997. – V. 39. – P. 121-138.

327. Nicodem D.E., Guedes C.L.B., Correa R.J. Photochemistry of petroleum

I. Systematic study of a Brazilian intermediate crude oil // J. Mar. Chem. –

1998. – V. 63. – P. 93-104.

328. Nishimoto S., Yamawaki M., Kitamura S.I., Akiyama K., Kakinuma

Y.K., Sugahara T.S. Risk Assessment of Heavy Oil on Terrestrial Mammals //

Interdisciplinary Studies on Environmental Chemistry. Biological Responses to

Chemical Pollutants, 2008. – P. 269-274.

329. Nishimoto S., Yamawaki M., Akiyama K. Kakinuma Y.K., Kitamura S.I.,

Sugahara T. Severe abnormalities in the reproductive organs of mice caused by

chemical substances contained in heavy oil // The Journal of Toxicological

Sciences. – 2009. – V. 34. – № 2. – Р. 239-244.

330. Novitsky J.A., Morita R.Y. Starvation-induced barotolerance as a survival

mechanism of a psychrophilic marine vibrio in the waters of the Antarctic

convergence // Mar. Biol. – 1978. – V. 49. – № 1. – P. 7-10.

214

331. Olivera N., Commendatore M., Delgado O., Esteves J. Microbial

characterization and hydrocarbon biodegradation potential of natural bilge

waste microflora // Journal of Industrial Microbiol. Biotechnol. – 2003. – V. 30.

– № 9. – P. 542-548.

332. Pedrós-Alió C., Potvin M., Lovejoy C. Diversity of planktonic

microorganisms in the Arctic Ocean // Progress in Oceanography. – 2015. – V.

139. – P. 233-243.

333. Perez-Cruz C., Carrión O., Delgado L., Martinez G., López-Iglesias C.,

Mercade E. New type of outer membrane vesicle produced by the gram-

negative bacterium Shewanella vesiculosa M7T: Implications for DNA Content

// Appl. Environ. Microbiol. – 2013. – V. 79. – № 6. – P. 1874-1881.

334. Pesciaroli C., Cupini F., Selbmann L., Barghini P., Fenice M.

Temperature preferences of bacteria isolated from seawater collected in

Kandalaksha Bay, White Sea, Russia // Polar Biol. – 2012. – V. 35. – P. 435-

445.

335. Phadtare S. Recent developments in bacterial cold-shock response // Curr.

Issues Mol. Biol. – 2004. – V. 6. – P. 125-136.

336. Prince R.C., Gramain A., McGenity T.J. Prokaryotic Hydrocarbon

Degraders. In: Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. [Ed. by

Timmis K.N.]. Springer, Berlin, 2010. – P. 1671-1691.

337. Putheti R.R., Patil M.C. Pharmaceutical formulation development of

floating and swellable sustained drug delivery systems: a review // E-J. Sci.

Technol. – 2009. – V. 4. № 2. – P. 1-12.

338. Rivera J., Cordero R.J.B., Nakouzi A.S., Frases S., Nicola A., Casadevall

A. Bacillus anthracis produces membrane-derived vesicles containing

biologically active toxins // PNAS. – 2010. – V. 107. – № 44. – P. 19002-

19007.

339. Romankevich E.A. Geochemistry of organic matter in the ocean.

Springer, Berlin, 1984. – 334 p.

215

340. Rosenberg E., Lagmann R., Kushmaro A., Taube R., Adler R., Ron E.Z.

Petroleum bioremediation — a multiphase problem // Biodegradation. – 1992. –

№ 3. – P. 337-350.

341. Rosenberg E., Ron E.Z. High- and low-molecular-mass microbial

surfactants // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1999. – № 52. – P. 154-162.

342. Rosenberg E. Biosurfactants. In: The Prokaryotes. A Handbook on the

Biology of Bacteria 3rd ed. V. 1. [Ed. by Dworkin M. et al.]. New York,

Springer Science+Business Media Inc., 2006. – P. 834-849.

343. Rutter C.D., Zhang S., Rao C.V. Engineering Yarrowia lipolytica for

production of medium-chain fatty acids // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2015.

– V. 99 (17). – P. 7359-7368.

344. Salihu A., Abdulkadir I., Almustapha M.N. An investigation for potential

development on biosurfactants // Biotechnology and Molecular Biology

Reviews. – 2009. – V. 3. – № 5. – Р. 111-117.

345. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-

terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1977. – V. 84. – P. 5463-

5467.

346. Satpute S.K., Banat I.M., Dhakephalkar P.K., Banpurkar A.G., Chopade

B.A. Biosurfactants, bioemulsifiers and exopolysaccharides from marine

microorganisms // Biotechnol. Adv. – 2010. – V. 28. – P. 436-450.

347. Seo J.S., Keum Y.S., Hu Y., Lee S.E., Li Q.X. Phenanthrene degradation

in Arthrobacter sp. P1-1: initial 1,2-, 3,4- and 9,10-dioxygenation, and meta-

and ortho-cleavages of naphthalene-1,2-diol after its formation from

naphthalene-1,2-dicarboxylic acid and hydroxyl naphthoic acids //

Chemosphere. – 2006. – V. 65. – № 11. – Р. 2388-2394.

348. Shumkova E.S., Egorova D.O., Korsakova E.S., Dorofeeva L.V.,

Plotnikova E.G. Molecular biological characterization of biphenyl-degrading

bacteria and identification of the biphenyl 2,3-Dioxygenase α-subunit genes //

Microbiology. – 2014. – V. 83. – № 1. – Р. 160-168.

216

349. Sommerkorn M., Hass S.J. «Arctic Climate Feedbacks: Global Implicat

ions» / WWF International Arctic Programme, August, 2009.

350. Srinivas T.N.R., Nageswara Rao S.S.S., Vishnu V.R.P., Pratibha M.S.,

Sailaja B., Kavya B., Hara K.K., Begum Z., Singh S. M., Shivaji S. Bacterial

diversity and bioprospecting for cold-active lipases, amylases and proteases,

from culturable bacteria of Kongsfjorden and Ny-Alesund, Svalbard, Arctic. //

Current Microbiology. – 2009. – V. 39. – № 5. – P. 537-547.

351. Staley J.T., Gosink J.J. Poles apart: biodiversity and biogeography of sea

ice bacteria // Annu. Rev. Microbiol. – 1999. – V. 53. – № 1. – P. 189-215.

352. Stratton H.M., Brooks P.R., Griffiths P.C., Seviour R.J. Cell surface

hydrophobicity and mycolic acid composition of Rhodococcus strains isolated

from activated sludge foam // Journal of Industrial Microbiology and

Biotechnology. – 2002. – № 28. – P. 264-267.

353. Suutari M., Laakso S. Microbial fatty acids and thermal adaptation // Crit.

Rev. Microbiol. – 1994. – V. 20. – P. 285-328.

354. Tao D., Li P.H. Classification of plant cell cryoprotectants // J. Theor.

Biol. – 1986. – V. 123. – P. 305-310.

355. Teramoto M., Suzuki M., Hatmanti A., Harayama S. The potential of

Cycloclasticus and Altererythrobacter strains for use in bioremediation of

petroleum-aromatic-contaminated tropical marine environments // Journal of

Bioscience and Bioengineering. – 2010. – V. 110. – № 1. – Р. 48-52.

356. Teske A., Durbin A., Ziervogel K., Cox C., Arnosti C. Microbial

community composition and function in permanently cold seawater and

sediments from an Arctic Fjord of Svalbard // Appl. Environ. Microbiol. – 2011.

–V. 77. – № 6. – P. 2008-2018.

357. Tsitko I.V., Zaitsev G.M., Lobanok A.G., Salkinoja-Salonen M.S. Effect

of Aromatic Compounds on Cellular Fatty Acid Composition of Rhodococcus

opacus // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – V. 65. – № 2. – Р. 853-855.

217

358. Vandieken V., Finke N., Jørgensen B.B. Pathways of carbon oxidation in

an Arctic fjord sediment (Svalbard) and isolation of psychrophilic and

psychrotolerant Fe (III)-reducing bacteria // Mar. Ecol. Prog. Ser. – 2006. – V.

322. – P. 29-41.

359. Wacksman S.A., Hotchkiss M. Viability of bacteria in sea water // J.

Bacteriol. – 1937. – V. 33. – № 4. – P. 389-400.

360. Walker S., Austin H., Colwell R. Utilization of mixed hydrocabon

substrate bу petroleum-degrading microorganisms // J. Gen. and Appl.

Microbiology. – 1975. – V. 21. – № 21. – Р. 27-39.

361. Wang J., Zhang B., Chen S. Oleaginous yeast Yarrowia lipolytica mutants

with a disrupted fatty acyl-CoA synthetase gene accumulate saturated fatty acid

// Process Biochem. – 2011. – № 46. – Р. 1436-1441.

362. Westlake D.W. S., Jobson A., Philippe R., Cooke F.D. Biodegradability

and crude oil composition // Can. J. Microbiol. – 1974. – V. 20. – № 7. – P. 915-

928.

363. Wetherbee R., Lind J.L., Burke J., Quatrano R.S. The first kiss:

establishment and control of initial adhesion by raphid diatoms // J. Phycol. –

1998. – №. 34. – P. 9-15.

364. Whyte L.G., Hawari J., Zhou E., Bourbonnière L., Inniss W.E., Greer

C.W. Biodegradation of variable-chain-length alkanes at low temperatures by a

psychrotrophic Rhodococcus sp. // Appl. Environ. Microbiol. – 1998. – V. 64.

№ 7. – P. 2578-2584.

365. Willumsen P.A., Karlson U. Screening of bacteria isolated from PAH-

contaminated soils for production of biosurfactants and bioemulsifiers //

Biodegradation. – 1997. – № 7. – Р. 415-423.

366. Wommack K.E., Colwell R.R. Virioplankton: viruses in aquatic

ecosystems // Microbiol Mol Biol Rev. – 2000. – V. 64. – № 1. – Р. 69-114.

367. Yakimov M.M., Giuliano L., Gentile G., Crisafi E., Chernikova T.N.,

Abraham W.-R., Lünsdorf H., Timmis K.N., Golyshin P.N. Oleispira antarctica

218

gen. nov., sp. nov., a novel hydrocarbonoclastic marine bacterium isolated from

Antarctic coastal sea water // International Journal of Systematic and

Evolutionary Microbiology. – 2003. – 53. – (Pt 3). – P. 779-785.

368. Yuan M., Yu Y., Li H.-R., Dong N., Zhang X.-H. Phylogenetic diversity

and biological activity of Actinobacteria isolated from the Chukchi shelf marine

sediments in the Arctic Ocean // Mar. Drugs. – 2014. – V. 12. – P. 1281-1297.

369. Zhang Y., Miller R.M. Effect of rhamnolipid (biosurfactant) on

solubilization and biodegradation of n-alkanes // Appl. Environ. Microbiol. –

1995. – V. 61. – P. 2247-2251.

370. Zhang G., Cao T., Ying J., Yang Y., Ma L. Diversity and novelty of

actinobacteria in Arctic marine sediments // Antonie van Leeuwenhoek. – 2014.

– V. 105. – № 4. – Р. 743-754.

371. Zinjarde S., Pant A. Emulsifier from a tropical marine yeast, Yarrowia

lipolytica NCIM 3589 // J. Basic Microbiol. – 2002. – V. 42. – № 1. – P. 67-73.

372. Zwirglmaier K., Jardillier L., Ostrowski M., Mazard S., Garczarek L.,

Vaulot D., Massana R., Ulloa O., Scanlan, D.J. Global phylogeography of

marine Synechococcus and Prochlorococcus reveals a distinct partitioning of

lineages among oceanic biomes // Environ. Microbiol. – 2008. – V. 10. – P.

147-161.