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- II -

Tag der mündlichen Prüfung: 27.07.2012

Gutachter:

Prof. Dr.-Ing. Bernd Niemeyer

Helmut-Schmidt-Universität / Universität der Bundeswehr Hamburg

Prof. Dr. rer. nat. Andreas Prange

Universität Hamburg

- III -

Danksagung

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Juni 2007 bis März 2011 im Helmholtz-

Zentrum Geesthacht Zentrum für Material- und Küstenforschung angefertigt.

Ich möchte besonders Prof. Dr.-Ing. Bernd Niemeyer für die Bereitstellung des

interessanten Themas, für die sehr guten Bedingungen im Labor sowie für die

wissenschaftliche Betreuung und vielfältigen Diskussionen danken.

Herrn Prof. Dr. Andreas Prange danke ich für die Anfertigung des Zweitgutachtens.

Besonders möchte ich mich bei Dr.-Ing. Henning Rosenfeld für die vielfältige

Betreuung und der großen Unterstützung bei der Anfertigung dieser Arbeit bedanken.

Allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern in Geesthacht danke ich für die sehr gute

Zusammenarbeit. Mein besonderer Dank gilt Rainer Jablonski für die Hilfe im Labor,

Dr. Jürgen Gandraß und Stephan Lassen für die Hilfe an verschiedenen Massen-

spektrometern. Des Weiteren danke ich Sven Reinecke, der im Rahmen seiner

Diplom- und Studienarbeit zu dieser Dissertation beigetragen hat.

Dr. Simone Hubo, Cristiam Vargas und Moundih Fonka von der Helmut-Schmidt-Uni-

versität / Universität der Bundeswehr Hamburg danke für die sehr gute Zusammen-

arbeit.

Bei Annika, Britta, Dana, Jan-Henrik, Mechthild, Nadine und Sven möchte ich mich für

die schöne Zeit außerhalb des Laboralltages bedanken.

Meinen Eltern und meiner Familie möchte ich für die stetige Unterstützung danken.

Danijela, du bist einfach ein wunderbarer Mensch.

- IV -

Abkürzungs- und Symbolverzeichnis - V -

Abkürzungsverzeichnis

4-MeBT 4-Methyl-1H-benzotriazol

5-MeBT 5-Methyl-1H-benzotriazol

AAL Aleuria Aurantia Lektin

ABA m-Aminophenylboronsäure

Abb. Abbildung

Aeats 1-Aminoethyl-3-aminopropyltrimethoxysilan

amu atomare Masseneinheit

APS-Silica mit Aptes silanisiertes Silica

Aptes Aminopropyltriethoxysilan

ASF Asialofetuin

BFD Benzoylformiatdecarboxylase

BSA Bovines Serumalbumin

BT 1H-Benzotriazol

ca. circa

Con A Concanavalin A bzw. Concanavalin Agglutinin

cps counts per second (Einheit der Intensität der dargestellten Massenspektren)

d Dublett (NMR)

Da Dalton

DC Dünnschichtchromatographie

dd Dublett von Dublett (NMR)

DMF Dimethylformamid

DMSO Dimethylsulfoxid

DMSO-D6 Deuteriertes Dimethylsulfoxid für die NMR-Spektroskopie

DTT Dithiothreitol

EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid

ELLA Enzyme-linked Lectin Assay

ESI Elektrospray Ionisation

et al. et alii

GHS Globally Harmonized System of Classification, Labelling and Packaging of Chemicals (Global harmonisiertes System zur Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien)

GOD Glucose Oxidase

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure

IAA Iodoacetic acid (Iodessigsäure)

IFC integrated micro-fluidic cartridge (Fließsystem im Biacore 3000)

IPG immobilisierter pH-Gradient

IS interner Standard

LC/MS Flüssigchromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie

LC-TBL triazinbasierter Ligand für die Adsorption von Benzotriazolen

m Multiplett (NMR)

m/z Masse-zu-Ladungsverhältnis

MALDI Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation

Man Mannose

MOPAC Molecular Orbital Package

MRM Multiple Reaction Monitoring (Scan-Modus in der Massenspektrometrie)

MS Massenspektrometrie

MWCO Molecular Weight Cut Off (Membrandurchlässigkeit für Proteine)

n.d. nicht durchgeführt

Abkürzungs- und Symbolverzeichnis - VI -

n.n. nicht nachweisbar

NH2-TBL aminofunktionalisierter triazinbasierter Ligand

NHS N-Hydroxysuccinimid

NMR Nuclear Magnetic Resonance (Kernmagnetische Resonanz)

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PDB Protein Data Base

ppb parts per billion

ppm parts per million

ppt parts per trillion

q Quartett (NMR)

quint Quintett (NMR)

RCA Ricinus Communis Agglutinin

rel. relativ

Rf-Wert Retentionsfaktor-Wert

RT Raumtemperatur

RU Resonance Units (Resonanzeinheiten)

Rx organischer Rest eines Moleküls

SAM Self Assembled Monolayer (Selbstorganisierende Monoschicht)

SDS Sodium dodecylsulfate (Natriumdodecylsulfat)

SPR Surface Plasmon Resonance (Oberflächenplasmonresonanz)

t Triplett (NMR)

TBL triazinbasierter Ligand

TG Thyroglobulin

TOF Time of Flight (Flugzeit)

TPP Thiaminpyrophosphat

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

Symbolverzeichnis

[A] Konzentration des Analyten

[L] Konzentration des Liganden

[LA] Konzentration des Ligand-Zielmolekül-Komplexes

GB geschätzte freie Bindungsenergie

A Enzymaktivität [U/mL]

ABFD Flächenbedarf BFD [nm2]

AO Oberflächenbelegung [µmol/m2]

AV volumenunabhängige Enzymaktivität [U/mg]

C Konzentration [M] = [mol/L]

CProtein Proteinkonzentration [mg/mL]

d Küvettenschichtdicke [cm]

dSub Abstand Substituenten [Å]

J Kopplungskonstante [Hz]

KA Assoziationskonstante [L/mol]

ka, kd Geschwindigkeitskonstante für die Hin- und Rückreaktion

Ka-ester Säurekonstante eines Boronsäureesters

Ka-säure Säurekonstante einer Boronsäure

KD Dissoziationskonstante [mol/L]

Keq Kombination von Ktrigonal und Ktetraedrisch

Ktetraedrisch Assoziationskonstante der Boronsäureesterbildung aus dem tetraedrischen Zustand

Abkürzungs- und Symbolverzeichnis - VII -

Ktrigonal Assoziationskonstante der Boronsäureesterbildung aus dem trigonalen Zustand

log KOW dekadischer Logarithmus des Oktanol/Wasser-Verteilungskoef-fizienten [dimensionslos]

M Molare Masse [g/mol], bei Makromolekülen in [Da]

m Masse

mAPS Masse APS-Silica [g]

MLigand Molare Masse der Liganden [g/mol]

mSi,O Masse der übrigen Elemente, insbesondere Silicium und Sauerstoff [g]

mTBL berechnete Masse TBL1 oder TBL2 [g]

NA Avogadrokonstante [6,022·1023 mol-1]

q* Gleichgewichtsbeladung Silica [mg/g]

RGG Resonanzsignal im Gleichgewicht

Rmax Resonanzsignal bei vollständiger Belegung

V Volumen

w%C-APS prozentualer Kohlenstoffmassenanteil in APS-Silica

w%C-TBL prozentualer Kohlenstoffmassenanteil in TBL1 oder TBL2

w%H-APS prozentualer Wasserstoffmassenanteil in APS-Silica

w%H-TBL prozentualer Wasserstoffmassenanteil in TBL1 oder TBL2

w%N-APS prozentualer Stickstoffmassenanteil in APS-Silica

w%N-TBL prozentualer Stickstoffmassenanteil in TBL1 oder TBL2

w%Si,O prozentualer Anteil der übrigen Elemente in TBL1 oder TBL2

E Extinktionsänderung [min-1]

chemische Verschiebung [ppm]

BFD molarer Extinktionskoeffizient von BFD [0,032 L·mmol-1·cm-1]

- VIII -

1 Einleitung und Zielsetzung...............................................................................1

2 Allgemeine Grundlagen ....................................................................................4

2.1 Grundlagen der Glycobiologie ..................................................................4

2.2 Vorstellung der Interaktionspartner...........................................................5

2.2.1 Boronsäurebasierte Liganden und damit prozessierte Glycosysteme ...........................................................................................6

2.2.2 Triazinliganden und damit prozessierte Glyco- und Schadstoffsysteme ...................................................................................6

2.2.3 Lektine ......................................................................................................7

2.3 Prinzip der Affinitätsseparation .................................................................8

2.4 Wechselwirkungsmechanismen..............................................................10

2.4.1 Molekulare Interaktion durch kovalente Wechselwirkungen...................10

2.4.2 Molekulare Interaktion durch nicht-kovalente Wechselwirkungen ..........10

3 Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung....................16

3.1 Einführung ..............................................................................................16

3.1.1 Strukturelle Voraussetzungen der Wertstoffe .........................................16

3.1.2 Prinzip der Wechselwirkung ...................................................................17

3.2 ABA-Affinitätsseparation von Glycoproteinen.........................................20

3.2.1 Immobilisierung von m-Aminophenylboronsäure....................................20

3.2.2 Blutplasma ..............................................................................................21

3.2.3 Synthetische Proteinmischungen ...........................................................23

3.2.4 Rückschlüsse..........................................................................................26

3.3 Entwicklung eines Aufreinigungsverfahrens für Benzoylformiatdecarboxylase.................................................................26

3.3.1 Benzoylformiatdecarboxylase.................................................................26

3.3.2 Beschreibung der ligandvermittelten Affinitätsseparation .......................28

3.3.3 Verwendete Trägermaterialien und Immobilisierung vonTPP.................29

3.3.4 Bindungsstudien mit TPP am ABA-Adsorbens.......................................30

3.3.5 Bindungsstudien mittels 31P-NMR-Spektroskopie...................................33

3.3.6 Affinitätsseparation .................................................................................36

3.3.6.1 Aufschluss der rekombinanten E. coli-Bakterien ....................................36

3.3.6.2 BFD-Aktivitätstest und Proteinkonzentrationsbestimmung.....................36

3.3.6.3 2D-Gelelektrophorese, Tryptischer Verdau und MALDI-MS...................37

3.3.6.4 TPP-vermittelte Affinitätsseparation .......................................................38

3.3.6.5 Affinitätstrennung mit direkt immobilisiertem TPP ..................................41

3.4 Rückschlüsse..........................................................................................42

4 Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung ............................44

4.1 Synthetische Liganden für Glycoproteine - Stand der Wissenschaft ..........................................................................................44

4.2 Vorstellung der verwendeten Triazinliganden.........................................46

4.3 Triazinliganden in der Affinitätsseparation..............................................47

4.4 Synthese der Triazinliganden .................................................................50

4.4.1 Synthese von TBL1 und TBL2................................................................50

4.4.2 Synthese von NH2-TBL1 und NH2-TBL2.................................................51

4.5 Grundlagen der Surface Plasmon Resonance und Funktionsweise des Biacore 3000 ..........................................................52

4.6 Immobilisierungen...................................................................................57

4.6.1 Immobilisierung von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 auf Sensorchips............57

4.6.2 Immobilisierung von TBL1 und TBL2 auf Silica ......................................63

- IX -

4.6.2.1 Ergebnisse der Elementaranalyse..........................................................64

4.6.2.2 Ergebnisse der massenspektrometrischen Charakterisierung ...............67

4.7 Interaktionsstudien..................................................................................71

4.7.1 SPR-Interaktionsstudien mit NH2-TBL1 und NH2-TBL2..........................71

4.7.2 Adsorptionsexperimente mit TBL1-Silica und TBL2-Silica......................75

4.7.2.1 Glucose Oxidase ....................................................................................75

4.7.2.2 Zucker.....................................................................................................76

4.7.3 Vergleichende SPR-Interaktionsstudien mit natürlichen Liganden .................................................................................................82

4.8 Molecular Modeling und Docking............................................................85

4.8.1 Grundzüge des Molecular Modeling und Docking ..................................85

4.8.2 Durchführung der Simulationen ..............................................................86

4.8.3 Ergebnisse der Simulationen..................................................................88

4.8.3.1 Stärke der Wechselwirkung - Bindungsenergien....................................88

4.8.3.2 Bindungsmodus der Saccharide.............................................................90

4.8.3.3 Bindungsmodus von Glucose Oxidase...................................................93

4.9 Rückschlüsse..........................................................................................94

5 Triazinliganden für die adsorptive Schadstoffanreicherung und als Erkennungselemente chemischer Sensoren................................................96

5.1 Schadstoffauswahl..................................................................................96

5.2 Chemische Sensoren .............................................................................97

5.3 Anreicherungsverfahren .........................................................................98

5.4 Ligandenentwicklung ..............................................................................99

5.5 Self Assembled Monolayer als Grundlage chemisch-sensitiver Oberflächen ..........................................................................................102

5.5.1 Herstellung und Charakterisierung der SAMs auf den Sensorchips ..........................................................................................103

5.5.1.1 Kontaktwinkelmessung .........................................................................103

5.5.1.2 Reinigung und Aufbringen des Monolayers ..........................................104

5.5.2 Verifizierung der SAM-Herstellung mittels Lektinen..............................105

5.5.2.1 Concanavalin A und GOD ....................................................................105

5.5.2.2 Ricinus Communis Agglutinin und ASF ................................................107

5.6 Rückschlüsse........................................................................................108

6 Zusammenfassung........................................................................................110

7 Summary ........................................................................................................114

8 Anhang ...........................................................................................................117

8.1 Ergänzende Abbildungen und Tabellen................................................117

8.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien.......................................................133

8.3 Chemikalien ..........................................................................................135

9 Abbildungsverzeichnis .................................................................................140

10 Tabellenverzeichnis ......................................................................................146

11 Literaturverzeichnis ......................................................................................147

Einleitung und Zielsetzung - 1 -

1 Einleitung und Zielsetzung Im Jahr 2010 wurde in Deutschland mit Biopharmazeutika ein Umsatz von 5,17

Milliarden Euro erzielt [1, Seite 9]. Biopharmazeutika sind Arzneimittel, zu denen auch

jene zählen, die mit Hilfe gentechnisch veränderter Organismen hergestellt werden.

Am gesamten deutschen Pharmamarkt haben Produkte der medizinischen Bio-

technologie einen Anteil von ca. 17 %, wobei die Bedeutung weiter zunimmt [1, Seite 9].

Ende 2010 waren in Deutschland 198 Biopharmazeutika zugelassen. Davon machen

115 rekombinant hergestellte Proteine (u.a. Insulin, Wachstumshormone, Gerinnungs-

modulatoren, Enzyme, Epoetin) sowie 25 monoklonale Antikörper den größten Anteil

aus [1, Seite 10].

Ein Kostenfaktor ist das Downstream Processing, die Aufreinigung von Bio-

pharmazeutika oder anderen Wertstoffen aus den Organismen. Der Kostenanteil liegt

bei ca. 50-70 % und kann für hochreine pharmazeutische Produkte bis zu 90 % der

gesamten Produktionskosten ausmachen [2, Seite 279]. Hier besteht ein hohes

Einsparpotential, wenn Verfahrensschritte sorgfältig ausgewählt werden [3, Seite 35].

Der Downstream-Prozess wird von chromatographischen Verfahren dominiert, wobei

bis zum finalen Produkt zwei bis vier dieser Schritte eingesetzt werden [4, Seite 3; 5,

Seite 139]. Unter den chromatographischen Verfahren ragt die Affinitätsseparation,

deren Grundprinzip die biospezifische Interaktion zwischen einem an ein Träger-

material immobilisierten Liganden und einem Wertstoff ist, hinsichtlich ihrer

Leistungsfähigkeit und hohen Selektivität heraus. Durch diesen Schritt kann die

Reinheit des Produktes um das 1000-fache erhöht werden, bei gleichzeitig sehr hohen

Ausbeuten, die bis zu 99 % betragen. Mittels eines geeigneten Affinitätstrennschrittes

kann sich somit die Anzahl nachfolgender Aufreinigungsschritte reduzieren, was

wiederum eine Zeit- und Kostensenkung im Downstream Processing nach sich zieht.

Der Nachteil der Affinitätstrennverfahren liegt in der Verwendung von Naturstoffen als

Liganden. Viele dieser biospezifischen, insbesondere proteinogenen, Liganden sind

aufgrund ihrer Struktur sehr instabil. Sie können durch Mikroorganismen abgebaut

werden und besitzen nur eine geringe Stabilität gegenüber harschen physikalischen

und chemischen Einflüssen. Weiterhin sind viele natürliche Liganden toxisch und

zudem in ihrer Gewinnung kostenintensiv [5, Seite 148-149].

Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, durch Anwendung stabiler, synthetischer

Liganden diese Nachteile zu kompensieren und die Vorteile für Affinitätsseparations-

verfahren zu nutzen. Des Weiteren soll überprüft werden, ob sich die in dieser Arbeit

verwendeten synthetischen Liganden als selektive chemische Erkennungselemente für

Sensoren eignen, die durch ihre Affinität chemische Verbindungen in wässrigen

Medien detektieren können.


Zwei Stoffklassen werden auf ihre Eignung als synthetische Liganden untersucht.

Dabei handelt es sich um Boronsäure- und Triazinderivate, die beide durch

unterschiedliche Bindungsmechanismen mit Zuckerstrukturen interagieren können.

Zur Evaluation beider Stoffklassen werden in dieser Arbeit Glycoproteine und

Saccharide herangezogen. Die sich daraus ergebenden Erkenntnisse wurden

verwendet, um optimierte Anwendungen für die untersuchten Liganden zu entwerfen,

die gezielt die Vorteile der molekularen Interaktionen ausnutzen, die diese Liganden

auszeichnen.

Für Boronsäurederivate wird in diesem Zusammenhang die ligandvermittelte

Aufreinigung des rekombinanten Enzyms Benzoylformiatdecarboxylase aus E. coli-

Fermentationsaufschlüssen vorgestellt. Triazinderivate zeigen hohe Affinitäten und

Selektivitäten zu einigen Benzotriazolen, die als anthropogene Schadstoffe in die

Umwelt gelangen. Dies soll für sensorische Anwendungen genutzt werden, die eine

permanente Umweltüberwachung erlauben. Dabei sollen ausgewählte Boronsäure-

und Triazinderivate im Idealfall folgenden Anforderungen genügen:

Affinität / Selektivität: möglichst ähnliche Affinitäten und Selektivitäten zu

ausgewählten Wertstoffen entsprechend ihren natürlichen

Analoga

Zugänglichkeit: kommerziell erhältlich oder kostengünstige Synthese

Stabilität: hohe Stabilität gegenüber harschen chemischen und

physikalischen Konditionen; kein mikrobieller Abbau;

kovalente Immobilisierung am Trägermaterial

Toxizität: keine Humantoxizität; bei Freisetzung keine Umwelt-

auswirkungen

Der Aufbau der Arbeit ist durch die Untersuchung der beiden Ligandenklassen

gekennzeichnet.

Allgemeine theoretische Grundlagen werden in Abschnitt 2 erläutert. In Abschnitt 3

erfolgt die Charakterisierung eines Boronsäureliganden. Im ersten Teil dieses

Abschnitts werden die Trenneigenschaften für Glycoproteine erörtert. Im zweiten Teil

wird die Entwicklung eines Affinitätsseparationsverfahrens für das Enzym

Benzoylformiatdecarboxylase ausführlich dargestellt.


Triazinbasierte Liganden für Glycoproteine werden eingehend in Abschnitt 4

behandelt. Es wird die Synthese und Immobilisierung der Liganden dargestellt, gefolgt

von einem Verfahren zur Charakterisierung oberflächengebundener Triazinliganden

mittels Massenspektrometrie. Detailliert erfolgt die Darstellung der Ergebnisse zur

Eignung für die Affinitätsseparation von Triazinderivaten.

Nicht nur in der Affinitätsseparation sind selektive und spezifische Interaktionen

notwendig. Die Untersuchung der Eignung von Triazinmolekülen als chemisches

Erkennungselement für Sensoren wird in Abschnitt 5 überprüft. Des Weiteren wird

hier ein Verfahren für die Immobilisierung von Liganden auf planaren

Sensorgoldoberflächen mittels Self Assembled Monolayer vorgestellt. Die

Immobilisierung wird aufgrund der definierten Interaktionen zunächst mit Lektinen

vollzogen.

Allgemeine Grundlagen - 4 -

2 Allgemeine Grundlagen Im nachfolgenden Abschnitt sollen allgemeine Grundlagen und die in dieser Arbeit

verwendeten Reaktionssysteme erläutert werden. Relevante Aspekte der Glycobiologie

werden beleuchtet, da ein Themenschwerpunkt die Entwicklung von Aufreinigungs-

strategien für Glycokonjugate mit Hilfe synthetischer Liganden ist. Anschließend

werden die verwendeten Interaktionspartner bzw. Bindungspartner vorgestellt. Auf die

Grundlagen der Affinitätsseparation und den dabei auftretenden Wechselwirkungs-

mechanismen zwischen den Interaktionspartnern wird im darauffolgenden Unter-

abschnitt eingegangen.

2.1 Grundlagen der Glycobiologie Kohlenhydrate sind die am häufigsten vorkommenden Biomoleküle auf der Erde.

Einerseits sind Kohlenhydrate am strukturellen Aufbau von Lebewesen beteiligt,

andererseits stellen sie eine wichtige Energiespeicherform dar. Daneben kommt den

Kohlenhydraten auch als Informationsträger eine wichtige Rolle zu Teil. Viele

biologische Mechanismen laufen auf Grundlage von molekularen Erkennungs-

prozessen von Kohlenhydratstrukturen ab [6, Seite 741].

Die für die molekulare Erkennung wichtigen Kohlenhydrate liegen dabei als

Glycokonjugate vor. Es handelt sich um Verbindungen zwischen Kohlenhydraten und

anderen biochemischen Stoffgruppen. Typische makromolekulare Vertreter sind

Glycoproteine, Proteoglycane oder Glycolipide [7, Seite 255-256]. Aber auch

niedermolekulare Verbindungen wie Steroide, Alkaloide oder Polyphenole können

glycosyliert vorliegen [8, Seite 1303-1328].

Glycoproteine liegen zum einen als Zellmembranproteine oder innerhalb der Zelle in

verschiedenen Zellorganellen vor. Die meisten Proteine des Blutplasmas sind ebenfalls

glycosyliert [9, Seite 514]. Dagegen sind Proteoglycane und Glycolipide ausschließlich

Bestandteil von Zellmembranen. Die Gesamtheit der Kohlenhydratstrukturen auf der

Zellmembran wird als Glycocalix bezeichnet [7, Seite 255-256]. In eukaryotischen

Zellen treten zwei posttranslationale Glycosylierungsformen von Proteinen auf. Zum

einen kann das erste Monosaccharid, für gewöhnlich N-Acetylgalactosamin, über eine

-O-glycosidische Bindung mit der OH-Gruppe der Seitenkette von Serin oder

Threonin verknüpft werden, man spricht von einer O-Glycosylierung [10; Seite 89].

Beim zweiten Typ (N-Glycosylierung) wird ein größer verzweigtes Oligosaccharid über

eine -N-glycosidische Bindung an die Amid-Gruppe aus Asparagin gehängt [10; Seite

73]. Die Glycosylierung findet im Endoplasmatischen Retikulum und im Golgi-Apparat

durch verschiedene Glycosyltransferasen statt.


Mit Hilfe von Lektinen werden die in den Kohlenhydratstrukturen gespeichterten

Informationen “abgerufen”. Bei Lektinen handelt es sich um Proteine, die in der Lage

sind, hochspezifisch und reversibel an bestimmte Kohlenhydratstrukturen von

Glycokonjugaten zu binden [11, Seite 1593]. Im Gegensatz zu Enzymen modifizieren

sie die Zuckerstrukturen nicht und benötigen im Gegensatz zu Antikörpern keinen

antigenen Impuls zur Synthese. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die Grenzen

zunehmend verschwimmen. Jedes Lektin besitzt typischerweise zwei oder mehrere

Kohlenhydratbindungsstellen. Lektine können in fast allen Organismen gefunden

werden und variieren in ihrer Größe, chemischen Zusammensetzung und

Kohlenhydratspezifität. Einen Überblick zu Lektinen bietet der Review von Lis und

Sharon [12, Seite 637-674].

Die molekulare Erkennung zwischen Glycokonjugaten und Lektinen ist Grundlage für

eine Vielzahl biologischer Mechanismen und Effekte. Zelluläre Mechanismen sind

beispielsweise die Zell-Zell-Erkennung oder die Signalübertragung zwischen Zellen [13,

Seite 860]. Aber auch bei der Pathogenese von Infektionskrankheiten und

Entzündungsvorgängen sowie der Immunantwort hierauf sind Wechselwirkungen von

Glycokonjugaten und Lektinen vielfältig beteiligt [14, Seite 43; 15, Seite 2370]. Ein

aktuelles Beispiel verdeutlicht die Relevanz. Die im Frühsommer 2011 ausgebrochene

schwere Verlaufsform des hämolytisch-urämischen Syndroms (HUS) wird durch

enterohämorrhagische Escherichia coli-Bakterien (EHEC) verursacht [16, Seite 2].

EHEC bildet bestimmte toxische Lektine, sogenannte Shiga-like Toxine. Diese können

nach Eintritt in den Blutkreislauf an Globotriaosylceramid, einem Glycolipidrezeptor, der

sich auf den Endothelzellen der Blutgefäße der Nierenkörperchen befindet, binden.

Dadurch kommt es zu einer Einstülpung der Endothelzellmembran, was die Aufnahme

der Lektine in die Zelle bewirkt. Dort schädigen sie die Ribosomen, behindern somit die

Proteinbiosynthese und bewirken das Absterben der Endothelzellen. Neben einer

massiven Schädigung des Dickdarms kann es im Verlauf einer EHEC-Infektion zu

Nierenversagen kommen [17, Seite 673; 18, Seite 1077].

2.2 Vorstellung der Interaktionspartner Zur Gewährleistung eines besseren Überblicks werden in den nachfolgenden

Abschnitten, die verwendeten Reaktionssysteme vorgestellt. Da diese Arbeit

kapitelweise nach den Liganden gegliedert ist, werden diese, um Redundanzen zu

vermeiden, ausführlich in den jeweiligen Kapiteln vorgestellt. Hier wird detaillierter auf

das Vergleichssystem der Lektine und Glycoproteine eingegangen.


2.2.1 Boronsäurebasierte Liganden und damit prozessierte Glycosysteme

Als boronsäurebasierter Ligand wird m-Aminophenylboronsäure (ABA) verwendet.

Dieser Ligand wird ausführlich in Abschnitt 3 vorgestellt.

Um Trenneigenschaften von ABA für Glycoproteine zu evaluieren, werden Glucose

Oxidase, Fetuin und Asialofetuin als Modellverbindungen verwendet. Glucose

Oxidase (GOD) stellt ein Flavoenzym dar, das die Oxidation von -D-Glucose zu -

Gluconolacton und Wasserstoffperoxid mittels Sauerstoff katalysiert. Für die

experimentellen Studien wird GOD aus dem Schimmelpilz A. niger verwendet.

Zusätzlich zu GOD aus A. niger werden Molecular Modeling-Studien mit GOD aus dem

Schimmelpilz P. amagasakiense durchgeführt. In beiden Fällen ist GOD ein

homodimeres Enzym mit einer molaren Masse von ca. 160 kDa. Jede Untereinheit des

glycosylierten Enzyms besitzt einen FAD-Cofaktor. Der Kohlenhydratanteil von GOD

aus A. niger beträgt ca. 24-30 %, der von GOD aus P. amagasakiense ca. 13 % [19,

Seite 141; 20, Seite 505].

Das verwendete Fetuin wird aus Kälberblut isoliert. Der Kohlenhydratanteil von Fetuin

liegt bei etwa 26 % und das Molekülgewicht beträgt 44,8 kDa [21, Seite 2863]. Fetuin

besitzt insgesamt sechs Glycane, wobei drei O-verknüpft und drei N-verknüpft sind [22,

Seite 18255]. Durch Abspaltung endständiger Sialinsäuren der Glycane von Fetuin

erhält man Asialofetuin. Als komplexes Vielstoffgemisch wird Seehund-Blutplasma

verwendet.

Das andere Zielmolekül für ABA Benzoylformiatdecarboxylase wird in Abschnitt 3

ebenfalls detailliert behandelt.

2.2.2 Triazinliganden und damit prozessierte Glyco- und Schadstoff-systeme

Zwei verschiedene triazinbasierte Liganden (TBL), TBL1 und TBL2, werden für die

Interaktion mit Glycoproteinen verwendet. Die Liganden TBL-LC2, TBL-LC11,

TBL-LC19 und TBL-LC20 werden auf ihre Eignung für sensorische Anwendungen

aufgrund ihrer Bindungseigenschaften zu Benzotriazolen untersucht. In Abschnitt 4

und 5 werden die Liganden ausführlich vorgestellt.

Als Glycoproteine werden ebenfalls GOD (s.o.) und zusätzlich Thyroglobulin (TG)

verwendet. TG ist ein dimeres Protein aus zwei identischen Untereinheiten [23, Seite

491]. Es konnten 20 potentielle Glycosylierungsstellen identifiziert werden, von denen

zwei mit Glycanen verknüpft sind. Ein Glycan von TG ist fucosyliert. Der

Kohlenhydratanteil des ca. 660 kDa schweren Proteins beträgt je nach Organismus ca.

8-10 % [24, Seite 1981; 25, Seite 695; 26, Seite 164]. Anzutreffen ist es in der


Schilddrüse von Wirbeltieren, wo es an der Bildung von Schilddrüsenhormonen

beteiligt ist [23, Seite 491].

Die Untersuchung der Eignung für sensorische Bestimmungen von Benzotriazolen wird

mit 1H-Benzotriazol und 5-Methyl-1H-benzotriazol durchgeführt. Die Vorstellung

erfolgt in Abschnitt 5.

2.2.3 Lektine Lektine sind der Maßstab für synthetische Kohlenhydratliganden. Sie werden in dieser

Arbeit als Referenz zur Beurteilung der Eignung synthetischer Kohlenhydratliganden in

der Affinitätsseparation herangezogen.

Lektine finden vielfach Anwendung als Werkzeuge in der Glycokonjugat-Forschung,

unter anderem zur Quantifizierung von Glycokonjugaten mittels Microarray-Techniken.

Durch Gelelektrophorese getrennte Glycokonjugate können mit Hilfe der Lektinblotting-

Technik nachgewiesen werden [27, Seite 726; 28, Seite 907].

In der Affinitätsseparation werden Lektine als Liganden zur Aufreinigung von

Glycokonjugaten, insbesondere von Glycoproteinen, eingesetzt [29, Seite 2926; 30,

Seite 62; 31, Seite 86; 32, Seite 85; 33, Seite 130; 34, Seite 427]. Daneben erhält man

Informationen über die Kohlenhydratzusammensetzung, die unter Verwendung

verschiedener Lektine mit unterschiedlicher Spezifität verfeinert werden können [35,

Seite 137].

Concanavalin A (Con A) wird aus der Schwertbohne isoliert und besteht aus vier

homologen Untereinheiten, von denen jede 26,5 kDa schwer ist und aus 238

Aminosäuren besteht. Für die kohlenhydratbindende Funktion benötigt das Lektin

Mn2+- und Ca2+-Ionen. Con A bindet mannose- und glucosehaltige Glycoproteine.

Dabei wird Mannose bevorzugt gebunden. Das Lektin besitzt eine konservierte

Monosaccharid-Bindungsstelle, in dessen erweiterten Umfeld sich die Bindungs-

regionen für Oligosaccharide befindet [36, Seite 19].

Aus den Ricinusbohnen, den Samen des Wunderbaums, können zwei verschiedene

Lektine isoliert werden. Dabei handelt es sich um Ricinus communis agglutinin

(RCA120) und um Ricin (RCA60). Beide sind stark toxisch. Das verwendete Glycoprotein

RCA120 ist 120 kDa schwer und besteht aus zwei Untereinheiten. Es besitzt eine

Affinität zu Galactose [37, Seite 227].

Aus den Fruchtkörpern des orangeroten Becherlings (Aleuria aurantia), einem Pilz,

wird das fucosespezifische Aleuria aurantia Lektin (AAL) isoliert. Das homodimere

Lektin ist 72 kDa schwer [38, Seite 27062].

Als Modellglycoprotein für Con A wird GOD, für RCA120 wird Asialofetuin und für AAL

wird TG verwendet.


2.3 Prinzip der Affinitätsseparation Die Affinitätsseparation ist eine Trenntechnik, die es ermöglicht, Biomoleküle anhand

ihrer Funktion oder Struktur aus der Flüssigphase abzutrennen. Das Prinzip beruht auf

der Bildung stabiler, spezifischer und reversibler Komplexe zweier Bindungspartner.

Ein Bindungspartner bzw. Interaktionspartner, der Ligand, wird an einem festen

Trägermaterial kovalent immobilisiert [39, Seite 9]. Mit dieser stationären Phase

(Adsorbens) kann der andere Bindungspartner, das Zielmolekül oder Wertstoff,

aufgereinigt werden. Grundvoraussetzung ist eine hohe Bindungsstärke (Affinität), die

durch die Dissoziationskonstante KD beschrieben werden kann. KD sollte einen Wert

von kleiner 10-5 mol/L annehmen, was einen on/off-Mechanismus in Form eines

Adsorptions- und Desorptionschrittes ermöglicht [40, Seite 87]. Faktoren wie der pH-

Wert, Ionenstärke, Druck und Temperatur, sterische Zugänglichkeit der verwendeten

Liganden beeinflussen die Lage des Gleichgewichts und somit den Trennprozess.

Vom Liganden kann das Zielmolekül zum einen spezifisch durch kompetitive

Verdrängung desorbiert werden. Dabei kann ein Überschuss an Molekülen im

Desorptionspuffer verwendet werden, die mit den Zielmolekülen um die

Bindungsstellen am Liganden konkurrieren. Zum anderen kann die Desorption

unspezifisch durch deformierende Bedingungen erfolgen. Solche Bedingungen können

z.B. durch Temperatur- oder pH-Änderung erreicht werden. Ändert sich die räumliche

Struktur von mindestens einem Bindungspartner, wird das Zielmolekül vom Adsorbens

entfernt [39, Seite 10]. Abb. 1 zeigt schematisch einen Affinitätsseparationszyklus.

Abb. 1: Grundschema der Affinitätsseparation. Die Einteilung der Verfahrensschritte erfolgt in Adsorption (1), Waschen (2), Desorption (3) und Regeneration (4).

Nach Aufgabe eines Substanzgemisches, welches das Zielmolekül und unerwünschte

Verbindungen enthält, bindet das Zielmolekül an den immobilisierten Liganden

(Adsorption). Im Waschschritt werden unerwünschte Verbindungen vom Adsorbens


gespült. Anschließend folgt die Desorption, bei der die Zielmoleküle vom Liganden

entfernt und in aufgereinigter Form zurückgewonnen werden. Im Regenerationsschritt

wird das Adsorbens für eine erneute Verwendung equilibriert.

In Abb. 2 ist eine mögliche Einteilung von Affinitätsseparationsverfahren auf Grundlage

der verwendeten Liganden dargestellt [41, Seite 71]. Zu unterscheiden sind Verfahren,

die mit biospezifischen Liganden oder mit pseudo-biospezifischen Liganden durch-

geführt werden. Biospezifische Liganden können in hochspezifische und gruppen-

spezifische Liganden eingeteilt werden. Gruppenspezifische Liganden können im

Gegensatz zu hochspezifischen Liganden eine bestimmte Affinität zu Zielmolekülen

einer bestimmten Substanzklasse besitzen [39, Seite 32].

Abb. 2: Klassifizierung der Affinitätsseparationsverfahren auf Basis der benutzten Liganden nach Vijayalakshmi [41, Seite 71]. In den Klammern sind mögliche Zielmoleküle der aufgeführten Liganden angegeben.

Auch das verwendete Trägermaterial besitzt einen Einfluss auf die Affinitätsseparation.

Trägermaterialien sollen eine schnelle Immobilisierungschemie sowie eine hohe

mechanische, chemische und mikrobiologische Stabilität aufweisen. Zur Vermeidung

unspezifischer Wechselwirkungen zwischen Trägermaterial und Zielmolekülen sollte

die Oberfläche hydrophil sein und keine hydrophoben oder ionogenen Bereiche

aufweisen [31, Seite 84]. Des Weiteren soll das Trägermaterial eine hohe Kapazität für

ein bestimmtes Zielmolekül aufweisen. Die Kapazität hängt von der zugänglichen

Oberfläche des Trägermaterials und der effektiven Ligandendichte auf der Oberfläche

ab. Zudem muss die Porenweite berücksichtigt werden, denn sie beeinflusst die

Zugänglichkeit der Zielstoffe zu den immobilisierten Liganden bzw. die Art des dazu


wirkenden Stofftransportmechanismus. Die Partikelgröße, deren Größenverteilung,

sowie die Rigidität des Trägermaterials besitzen einen Einfluss auf die Fließ-

eigenschaften [42, Seite 2-6]. Trägermaterialien können in natürliche und synthetische

Materialien eingeteilt werden. Zu den natürlichen Materialen zählen beispielsweise

Agarose [42, Seite 6-9] oder Silica [42, Seite 6-9]. Synthetische Materialien werden

durch Polymerisation und Quervernetzung von Monomeren, z.B. von Acrylamid [42,

Seite 16-31] oder verschiedener Methacrylat-Monomere [42, Seite 31-39], hergestellt.

2.4 Wechselwirkungsmechanismen Im nachfolgenden Abschnitt werden die Mechanismen erläutert, die für die Bindung

zwischen Ligand und Zielmolekülen verantwortlich sind. Dabei kann zwischen

kovalenten und nicht-kovalenten Wechselwirkungen unterschieden werden. Letztere

sollen in Abschnitt 2.4.2 detaillierter beschrieben werden. Kovalente Wechsel-

wirkungen in Affinitätstrennverfahren werden ausführlich in Kapitel 3 behandelt.

2.4.1 Molekulare Interaktion durch kovalente Wechselwirkungen Reversible, kovalente Wechselwirkungen zwischen Ligand und Zielmolekül können für

die Affinitätsseparation genutzt werden. Liganden, welche die Bedingung der

Reversibilität erfüllen, sind Derivate der Borsäure. Eine nicht-reversible Methode, die

folglich die Zerstörung des Zielmoleküls zur Folge hat, basiert auf immobilisiertem

Hydrazin [43, Seite 661].

2.4.2 Molekulare Interaktion durch nicht-kovalente Wechselwirkungen

Nicht-kovalente Wechselwirkungen spielen in der belebten Natur eine entscheidende

Rolle. Sie sind z.B. verantwortlich für die Ausbildung der DNA-Doppelhelix, für die

korrekte Faltung von Proteinen und für die molekulare Erkennung [44, Seite 144]. Im

Folgenden sollen die Prinzipien der molekularen Interaktion durch nicht-kovalente

Wechselwirkungen unter besonderer Berücksichtigung der Kohlenhydraterkennung

durch Lektine und synthetischer Analoga erläutert werden. Zwischen Liganden und

Zielmolekülen treten eine Reihe verschiedener nicht-kovalenter Wechselwirkungen auf.

Sie werden grob in elektrostatische Wechselwirkungen sowie in Induktions- und

Dispersionswechselwirkungen eingeteilt [45, Seite 4].

Ionenpaarwechselwirkungen (Salzbrücken) sind in ihrer Stärke vergleichbar mit denen

chemischer Bindungen. Ihre Stärke beträgt 100 bis 350 kJ/mol [46, Seite 27]. Ion-

Dipol-Wechselwirkungen treten z.B. zwischen einem Na+ und einem Wassermolekül

auf. Ihre Stärke beträgt zwischen 50 bis 200 kJ/mol. Weiterhin zählen zu Ion-Dipol-

Wechselwirkungen koordinative Bindungen, also die Komplexierung von Metallionen

[46, Seite 27]. Die Stärke von Dipol-Dipol-Wechselwirkungen beträgt ca. 5 bis


50 kJ/mol [46, Seite 28]. Als eine besondere Form der Dipol-Dipol-Wechselwirkung

kann die Wasserstoffbrückenbindung aufgefasst werden, bei der ein Wasserstoffatom

an ein elektronegatives Atom oder eine elektronenziehende, funktionelle Gruppe

gebunden ist und von einem Molekül oder einer funktionellen Gruppe mit

Dipolcharakter angezogen wird [46, Seite 29]. Sie ist mit 4 bis 60 kJ/mol zwar ähnlich

stark wie die Dipol-Dipol-Wechselwirkung, jedoch deutlich stärker richtungsabhängig.

Zu den Wasserstoffbrückenbindungen zählen auch sogenannte CH- -, OH- - und NH-

-Wasserstoffbrücken. Sie treten zwischen delokalisierten -Elektronensystemen

aromatischer Verbindungen und an Kohlenstoff, Sauerstoff oder Stickstoff gebundenen

Wasserstoffatomen auf. Mit 6,0 bis 10,5 kJ/mol zählen diese Wechselwirkungen zu den

schwächeren Wasserstoffbrücken. Obwohl sie bereits einen starken dispersiven

Charakter haben, unterscheiden sich diese Wasserstoffbrücken von reinen van der

Waals-Wechselwirkungen durch ihre ausgeprägte Richtungsabhängigkeit. Bei der

molekularen Erkennung von Kohlenhydratstrukturen durch Lektine oder synthetischen

Liganden spielen sie eine wichtige Rolle [47, Seite 6069; 48, Seite 13888-13892; 49,

Seite 6553]. Kationen- -Wechselwirkungen treten zwischen aromatischen

Verbindungen und Kationen auf. Ihre Stärke beträgt 5 bis 80 kJ/mol. Aromatische - -

Wechselwirkungen entstehen zwischen zwei aromatischen Ringen, wobei ein Ring oft

elektronenreich während der andere Ring elektronenarm ist. Ihre Stärke liegt zwischen

0 bis 50 kJ/mol. Dagegen sind van der Waals-Wechselwirkungen (London-Dispersions-

Wechselwirkungen) mit 0 bis 5 kJ/mol deutlich schwächer. Hierbei wird ein unpolares

Molekül durch ein Ion oder Dipol partiell polarisiert, wodurch eine schwache

elektrostatische Anziehung entsteht [46, Seite 27-37; 50, Seite 8-14]. Weiterhin kann

zwischen zwei völlig unpolaren Molekülen ein momentanes Dipolmoment zu einem

bestimmten Zeitpunkt durch die Bewegung der Elektronen um den Atomkern entstehen

[51, Seite 686-688]. Einen Überblick über die beschriebenen zwischenmolekularen

Kräfte gibt Tabelle 1.


Tabelle 1: Zusammenstellung der intermolekularen Kräfte.

Wechselwirkungsart Beispiel Bindungsstärke [kJ/mol]

Bemerkungen Literatur

Ionenpaarwechsel-wirkung

100-350 elektrostatische Wechselwirkung

[46, Seite 27]

Ion-Dipol-Wechsel-wirkung

50-200 elektrostatische Wechselwirkung

[46, Seite 27]

Dipol-Dipol-Wechsel-wirkung

5-50 elektrostatische Wechselwirkung oder Induktions-wechselwirkung

[46, Seite 28]

Wasserstoffbrücken-bindung

3-60 CH- : 6-11

elektrostatische Wechselwirkung oder Induktions-wechselwirkung stark richtungs-abhängig

[46, Seite 29] [48, Seite 13876]

Kation- -Wechsel-wirkung

5-80 Induktions-wechselwirkung

[46, Seite 32] [50, Seite 8-14]

- -Wechselwirkung

0-50 Dispersions-wechselwirkung richtungsab-hängig

[46, Seite 33-35] [50, Seite 8-14]

van der Waals-Wechselwirkung

0-5 Dispersions-wechselwirkung

[46, Seite 35-36] [50, Seite 8-14]

Die Stärke dieser zwischen Ligand und Zielmolekül auftretenden intermolekularen

Wechselwirkungen kann durch die Assoziationskonstante KA bzw. Dissoziations-

konstante KD beschrieben werden. Zwischen dem Liganden L und dem zu bindenden

Zielmolekül M bildet sich folgendes chemisches Gleichgewicht aus.

(1)

Die freie Standardbindungsenthalpie G0 steht dabei über der Assoziationskonstanten

über nachfolgende Beziehung im Zusammenhang. Dabei ist R die universelle

Gaskonstante, T die Temperatur, H0 die Standardbindungsenthalpie und S0 die

Standardbindungsentropie.

00A

0 STHKlnRTG (2)


mit

ML

LMKK 1

DA (3)

Aus Gleichung (2) ist ersichtlich, dass Änderungen der Enthalpie und der Entropie zur

Änderung der gesamten freien Standardbindungsenthalpie G0 beitragen und damit

die Stabilität des Ligand-Zielmolekül-Komplexes beeinflussen. Durch Anlagerung eines

Zielmoleküls an einen Liganden kann die Enthalpie gesenkt bzw. die Entropie erhöht

werden. Daraus resultiert nach der Gibbs-Helmholtz-Gleichung (Gleichung 2) eine

Abnahme der freien Bindungsenthalpie und es kommt zur exergonischen Anlagerung

des Zielmoleküls [52, Seite 1230]

Weiterhin spielt die „geometrische Passung“ von Ligand und Zielmolekül eine wichtige

Rolle. Sie folgt dem Schlüssel-Schloss-Modell, bzw. dem durch Koshland eingeführten

Induced-Fit-Modell [53, Seite 13876]. Bei Letzterem wird eine gewisse Flexibilität von

Ligand und Zielmolekül vorausgesetzt. Die Annäherung des Zielmoleküls an den

Liganden bewirkt eine derartige Änderung der Konformation der Bindungsregion, dass

das Zielmolekül aufgenommen werden kann. Nach der Ausbildung des Ligand-

Zielmolekül-Komplexes können zum Teil erhebliche Konformationsänderungen bei den

Bindungspartnern beobachtet werden [54, Seite 3986]. Abb. 3 zeigt schematisch beide

Modelle.

Abb. 3: Schematische Darstellung des Schlüssel-Schloss-Prinzips (A) und des Induced-Fit-Modells (B)

Der Chelateffekt (Multivalenz) leistet bei natürlichen Liganden einen deutlichen Beitrag

zur Affinität. Dieser Effekt setzt sich additiv aus den Einzelbeiträgen der G0-Werte der

Wasserstoffbrücken aber auch anderer intermolekularer Wechselwirkungen zusammen.

Beispielsweise weisen Lektine zu Oligosacchariden eine höhere Affinität auf als zu


Monosacchariden [55, Seite 955]. Oligosaccharide werden über ein größeres Netzwerk

von Wasserstoffbrücken und hydrophoben Interaktionen gebunden, als es für

Monosaccharide der Fall ist [12, Seite 654; 56, Seite 543]. In Abb. 4 sind

beispielsweise die wichtigsten Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Concana-

valin A und einem Trimannosid dargestellt [57, Seite 975]. In analoger Weise wird

durch den Einbau mehrerer Bindungszentren bei synthetischen Liganden eine

Affinitätssteigerung angestrebt [54, Seite 3984].

Abb. 4: Schematische Darstellung der wichtigsten Wasserstoffbrücken, die an der Bindung zwischen Concanavalin A und eines Trimannosids beteiligt sind. Entnommen aus [57, Seite 975]. Darüber hinaus kommt es bei der Bindung eines Zielmoleküls auch zu entropischen

Veränderungen. Hierbei ändert sich die Anzahl an Translations-, Rotations-,

Schwingungs- und Konformationsfreiheitsgraden durch Bildung des Ligand-Ziel-

molekül-Komplexes [58, Seite 2773]. Beispielsweise wird bei synthetischen Liganden

beobachtet, dass macrocyclische Liganden im Gegensatz zu acyclischen Liganden

eine höhere Affinität zu entsprechenden Zielmolekülen aufweisen. Begründet ist dieser

Effekt unter anderem durch den geringeren Verlust an Konformationsfreiheitsgraden

der macrocyclischen Liganden [59, Seite 22-26]. Häufig ist jedoch die Enthalpie-

Entropie-Kompensation zu beobachten. Der Aufbau einer Wechselwirkung zwischen

mehreren Bindungszentren ist zwar enthalpisch stark begünstigt, führt allerdings oft zu

größeren Einschränkungen der Freiheitsgrade [54, Seite 3986].

Die Affinitätsseparation wird in der Regel in wässrigen Medien durchgeführt. Hier übt

Wasser einen enormen Einfluss auf die Affinität zweier Bindungspartner zueinander

aus. Wasser konkurriert sehr effektiv um polare Bindungsstellen von Liganden und


bildet mit diesen Wasserstoffbrücken aus. Das bedeutet, die Bindungstasche eines

Liganden und das Zielmolekül selbst liegen solvatisiert vor. Daher ist in unpolaren oder

aprotischen Lösungsmitteln die Ausbildung von Wasserstoffbrücken weit effektiver [59,

Seite 39].

In wässrigen Systemen spielen zudem hydrophobe Effekte, auch hydrophobe

Wechselwirkungen oder Interaktionen genannt, eine wichtige Rolle (vgl. Abb. 5). Es

handelt sich hierbei um entropische Effekte.

Abb. 5: Darstellung hydrophober und polarer Bereiche von Kohlenhydraten am Beispiel von -D-Glucose. In Rot dargestellt sind OH-Gruppen, in Blau die hydrophoben Bereiche der Glucose.

Viele Bindungstaschen von Lektinen besitzen ausgeprägte hydrophobe Bereiche durch

aromatische Seitenketten von Aminosäuren, die von Wasser nicht perfekt solvatisiert

werden können. Kommt es zum Kontakt mit hydrophoben Bereichen von Kohlen-

hydraten wie in Abb. 5 dargestellt, die durch aliphatische Protonen (CH-Protonen)

gebildet werden, erfolgt die Freisetzung von Wassermolekülen und es kommt zu einer

Lösungsmittelreorganisation. Die Entropie und somit die freie Standardbildungs-

enthalpie steigt. Zwischen Kohlenhydrat und Zucker entstehen dabei CH- -Bindungen

[60, Seite 2693].

Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 16 -

3 Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung

3.1 Einführung Eine der wenigen Möglichkeiten, Wertstoffe mittels Affinitätsseparation abzutrennen,

bei der die Affinität zwischen Ligand und Wertstoff über kovalente Bindungen entsteht,

kann durch Boronsäuren realisiert werden [61, Seite 79]. Hierbei handelt es sich um

organische Derivate der Borsäure mit der allgemeinen Formel R-B(OH)2.

Der erste und bis heute am häufigsten verwendete Boronsäureligand in der Affinitäts-

separation ist m-Aminophenylboronsäure (ABA). Die Aminogruppe in meta-Position

des Phenylrings von ABA dient der Immobilisierung [62, Seite 120]. Als

Trägermaterialien für ABA kommen natürliche Polymere (Agarose, Dextran, Cellulose),

synthetische Polymere (Polymethacrylate, Polyacrylamide, Polystyrene) und Silica zum

Einsatz [63, Seite 76]. Dargestellt ist die Strukturformel von ABA in Abb. 6.

Abb. 6: Strukturformel von m-Aminophenylboronsäure (ABA).

Bei dem Liganden handelt es sich um ein Derivat der Phenylboronsäure. Kuivila et al.

beobachteten zuerst die Affinität von ABA zu Zuckeralkoholen [64, Seite 781]. Erste

systematische Untersuchungen zur Affinität zwischen Phenylboronsäuren und

verschiedenen Substraten, auf die im Folgenden noch eingegangen wird, erfolgten

durch Lorand et al. [65, Seite 769-774].

In der vorliegenden Arbeit wurde ausschließlich ABA als Ligand verwendet, auf den

sich die weiteren Ausführungen beziehen. Nachfolgend werden die strukturellen

Voraussetzungen der Wertstoffe, die zur Ausbildung einer kovalenten Bindung zu ABA

notwendig sind, erläutert. Im Anschluss wird das Prinzip der Wechselwirkung näher

erläutert.

3.1.1 Strukturelle Voraussetzungen der Wertstoffe ABA bildet mit ein- und mehrwertigen Alkoholen, wie Diole und Polyole, unter

basischen Bedingungen stabile Ester. Unter sauren Bedingungen werden die

sogenannten Boronsäureester wieder gespalten [66, Seite 1037]. Handelt es sich um

mehrwertige Alkohole, werden fünf- oder sechsgliedrige cyclische Boronsäureester

gebildet (vgl. Abb. 7). Voraussetzung hierfür ist, dass die Hydroxygruppen 1,2- oder

1,3-ständig zueinander sind, wie es beispielsweise bei 1,2-Propandiol und 1,3-


Propandiol der Fall ist [67, Seite 176; 68, Seite 442]. Kohlenhydrate sind ebenfalls in

der Lage, mit Boronsäuren Ester zu bilden. Liegt ein Monosaccharid in Ringform vor,

ist für die Esterbildung eine coplanare Anordnung der benachbarten Hydroxygruppen

erforderlich, d.h. dass diese cis-ständig zueinander stehen [69, Seite 295]. Bedingt

durch die starre Konformation von Kohlenhydraten bildet ABA mit diesen stabilere

cyclische Ester als mit acyclischen Diolen [68, Seite 442].

In der Affinitätsseparation umfasst das Spektrum der Zielmoleküle von ABA neben

Diolen und Kohlenhydraten auch solche Moleküle, die Diole als funktionelle Gruppen

besitzen. Durch ihren Kohlenhydratanteil können auch Biomakromoleküle wie Glyco-

proteine oder RNA mittels Affinitätsseparation durch ABA als gruppenselektiver Ligand

isoliert werden.

Der Stand der Forschung soll anhand einiger Beispiele aus der Literatur kurz skizziert

werden, in denen ABA als Ligand für Separationsverfahren zur Anwendung kam.

Glad et al. beschreiben die Trennung von Mischungen diverser Mono- und Di-

saccharide [70, Seite 258]. Auch die Isolierung von catechol-haltigen Verbindungen wie

z.B. -Hydroxycarbonsäuren, Polyphenolen und Nukleotiden ist bereits beschrieben

worden [71, Seite 59; 72, Seite 249; 73, Seite 20; 74, Seite 226; 75, Seite 73; 76, Seite

354; 77, Seite 934]. Bei der Anwendung auf Biomakromoleküle wurde durch Ackerman

et al. die Trennung von RNA und DNA untersucht [78, Seite 176]. Die Isolierung von

Glycoproteinen mittels ABA-Affinitätsseparation ist ebenfalls bereits in der Literatur

dargestellt. Als Beispiele sei hier auf die Abtrennung von Immunglobulinen,

glycosylierten Mistel-Lektinen, Ovalbumin, Transferrin und Erythropoetin1 verwiesen

[79, Seite 278; 80, Seite 1681; 81, Seite 3639; 82, Seite 121]. Aber auch in der

klinischen Anwendung zur Diagnose von Diabetes mellitus wird ABA als Ligand zur

Trennung von glycosylierten und nicht-glycosylierten Hämoglobin verwendet [83, Seite

23].

Biomakromoleküle, die keine kovalente Bindung mit ABA eingehen können, lassen sich

durch die sogenannte ligandvermittelte Affinitätsseparation aufreinigen. Das Prinzip

wird in Abschnitt 3.3.2 vorgestellt [62, Seite 122; 63, Seite 78].

Die Desorption des Wertstoffes von der ABA kann zum einen durch pH-Verschiebung

ins Saure erfolgen. Zum anderen ist der Einsatz eines kompetitiv wirkenden Agens

möglich, z.B. Sorbitol oder Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris), das mit ABA

selbst einen Ester bildet und so eine Freisetzung des Wertstoffes bewirkt [63, Seite 76].

3.1.2 Prinzip der Wechselwirkung Reaktionsmechanistisch lässt sich die Bildung des cyclischen Esters durch eine Folge

gekoppelter Gleichgewichte beschreiben. Abb. 7A zeigt diese für ABA. Da das 1 Erythropoetin ist ein glycosyliertes Peptidhormon und besser unter dem Namen EPO bekannt.


Boratom von ABA (Abb. 7A 1) eine Lewissäure darstellt, kann es koordinativ ein

Wassermolekül binden. Unter Abgabe eines Protons wird eine kovalente Bindung zum

zuvor koordinativ gebundenen Wasser ausgebildet, so dass sich die tetraedrische

Form 2 der ABA bildet. Das Boratom wird dabei vom sp2- in den sp3-hybridisierten

Zustand überführt. Die tetraedrische Form 2 kann mit einem Diol anschließend zum

cyclischen Ester 4 unter Abgabe von zwei Wassermolekülen weiter reagieren. Ein

zweiter Reaktionsweg ist formal ebenfalls möglich. Hier reagiert das Diol zunächst mit

ABA zum Intermediat 3. Auch das Intermediat 3 ist eine Lewissäure und reagiert sauer,

nachdem ein Wassermolekül koordinativ gebunden wurde. Auch über diesen

Reaktionspfad entsteht der cyclische Ester 4 [67, Seite 177; 84, Seite 14-16].

Da ABA eine Lewissäure ist, ist die Wechselwirkung nicht nur auf Diole beschränkt. Mit

Lewisbasen wie z.B. Citrationen, Imidazol und Phosphationen kann ABA ebenfalls eine

Verbindung eingehen [85, Seite 11180]. Diese Tatsache muss bei der Wahl des

Puffers für die Affinitätstrennung berücksichtigt werden [86, Seite 5298].

Abb. 7: Bildung eines cyclischen Esters aus ABA und einem Diol. In Abb. 7A sind die gekoppelten Gleichgewichte dargestellt. Abb. 7B zeigt, dass Keq eine Kombination von Ktrigonal und Ktetraedrisch ist. Zwecks Übersichtlichkeit fehlt das koordinativ gebundene Wasser in Abb. 7B.

Die Ursache für die Esterbildung ist im Säure-Base-Verhalten von ABA zu suchen. Die

ABA-Ester stellen selbst Säuren dar, die im Vergleich zur freien ABA stärker sind.

Beispielsweise hat Phenylboronsäure, der im Vergleich zu ABA die Aminogruppe fehlt,

einen pKa-Wert von 9,0. Dagegen besitzt der Fructose-Ester einen Wert von 5,2 [84,

Seite 16]. Bei ABA in Abb. 7A, mit einem pKa-Wert von 8,8, ist daher die

Säurekonstante des Esters (Ka-ester) größer als die Säurekonstante der Boronsäure

(Ka-säure). Jedoch ist die Assoziationskonstante der Esterbildung Ktrigonal aus der

trigonalen ABA-Form häufig um 105 Größeneinheiten kleiner als die Assoziations-


konstante der Esterbildung Ktetraedrisch aus der tetraedrischen ABA-Form [84, Seite 15].

Die Esterbildung findet demnach bevorzugt aus dem tetraedrischen Zustand der ABA

statt. Der Anteil an dieser Zustandsform wird erhöht, wenn der pH-Wert erhöht wird.

Die Hydroxydionen können dann direkt an die trigonale Form der ABA binden und

Ktetraedrisch sowie auch die Esterausbeute erhöhen. Aus kinetischer Sicht ist die Bildung

über die tetraedrische Form ebenfalls um die Größenordnung 104 bis 106 bevorzugt [68,

Seite 443; 84, Seite 15].

Untersuchungen von Yan et al. und Springsteen et al. zur Esterbildung von

Phenylboronsäure mit verschiedenen Diolen verdeutlichen den Einfluss des pH-Wertes.

In diesen Studien wurde die Gesamtassoziationskonstante Keq bestimmt, die die Lage

des Gleichgewichts unter Einbeziehung der trigonalen und tetraedrischen Esterform

beschreibt (Abb. 7B). Exemplarisch sind in Tabelle 2 die Keq-Werte für Glucose und

Fructose bei unterschiedlichen pH-Werten dargestellt. Demnach erhöht sich Keq um

mehr als den Faktor 10, wenn der pH-Wert von 6,5 auf 8,5 ins basische Milieu

verschoben wird [86, Seite 5297; 87, Seite 11208]. Aus Tabelle 2 wird auch ersichtlich,

dass die chemische Natur des Diols einen starken Einfluss auf Keq besitzt.

Tabelle 2: Gesamtassoziationskonstanten Keq von Glucose und Fructose mit Phenyl-boronsäure bei verschiedenen pH-Werten [87, Seite 11208].

Zucker pH-Wert Keq [M-1]

6,5 0,84

7,5 4,6 Glucose

8,5 11

6,5 29

7,5 210 Fructose

8,5 560

Die Keq-Werte sind im Vergleich zu anderen Assoziationskonstanten, die man in der

Affinitätsseparation findet, klein. Bei größeren Wertstoffen ist eine Affinitätssteigerung

durch Mehrfachbindung von ABA an ein einzelnes Wertstoffmolekül möglich, wie es

beispielsweise bei Glycoproteinen durch ihren Kohlenhydratanteil vorstellbar ist.

Details zur Affinitätsseparation von Glycoproteinen mit ABA werden in Abschnitt 3.2

behandelt.

Der hohe pH-Wert, der für die Anwendung von ABA notwendig ist, wirkt sich negativ

auf proteinogene Wertstoffe aus. Hier muss im Vorfeld die pH-Stabilität solcher

biologischen Wertstoffe ermittelt werden. Daher wird auch versucht, organische

Boronsäuren zu synthetisieren, die einen niedrigeren pKs-Wert als ABA aufweisen und

somit Zielmoleküle bei kleineren pH-Werten binden sollten. Jedoch ist kein Ligand


hiervon kommerziell erhältlich [88, Seite 684; 89, Seite 463; 90, Seite 93; 91, Seite 63;

92, Seite 22].

3.2 ABA-Affinitätsseparation von Glycoproteinen Wie in Abschnitt 3.1.1 bereits dargestellt wird ABA als Affinitätsligand für Glycoproteine

verwendet. Im Fokus der Arbeit stand lange Zeit die Isolierung und strukturelle

Charakterisierung von Glycoproteinen mittels Lektinaffinitätsseparation aus Seehund-

blutplasma [29, Seite 2923]. In diesem Abschnitt soll die Eignung von ABA für die

Isolierung von Glycoproteinen aus Blutplasma, das zu den komplexesten Fluiden

überhaupt zählt, überprüft werden. Des Weiteren erfolgt die Anwendung eines

Standardverfahrens zur Trennung von glycosylierten und nicht-glycosylierten Proteinen

aus synthetischen Proteinmischungen [62, Seite 123-125]. Nachfolgend wird zunächst

die notwendige Immobilisierung von ABA an einen Polymerträger beschrieben.

3.2.1 Immobilisierung von m-Aminophenylboronsäure Bei dem Trägermaterial handelt es sich um das Methacrylatpolymer Toyopearl AF-

Tresyl-650M der Firma Tosoh (Stuttgart, Deutschland) mit einer spezifischen Ober-

fläche von 42 m2/g (Herstellerangaben). Das Trägermaterial besitzt eine hydrophile

und nicht geladene Oberfläche, um unspezifische Wechselwirkungen zu reduzieren.

Weiterhin besitzt der Träger eine gute mechanische und chemische Stabilität [31, Seite

84; 93, Seite 149]. Aktiviert ist das Material mit Trifluorethansulfonylchlorid

(Tresylchlorid), somit können Nucleophile leicht immobilisiert werden [42, Seite 86].

Der Reaktionsmechanismus für die Immobilisierung von ABA ist in Abb. 8 aufgezeigt.

Abb. 8: Immobilisierung von m-Aminophenylboronsäure an einen tresylierten Träger. Im Rahmen einer nucleophilen Substitution reagiert die primäre Aminogruppe von ABA mit dem elektrophilen Kohlenstoffatom unter Abspaltung der Tresylgruppe.

Für die Immobilisierung werden 0,5 g Toyopearl AF-Tresyl-650M mit 4 mL einer

21,3 µM ABA-Lösung in Kopplungspuffer (0,5 M Na2HPO4, 0,5 M NaCl, pH 8) versetzt.

Unter leichtem Schütteln ist die Reaktion nach ca. 4 h abgeschlossen. Nicht

umgesetzte Tresylgruppen werden mit Tris-Puffer (0,5 M, pH 8) geblockt. Die

Bestimmung des ABA-Gehaltes im Überstand erfolgt mittels UV/Vis-Spektroskopie bei


einer Wellenlänge von 296 nm in einer Quarzküvette mit einer Schichtdicke von 1 cm.

Als Referenzwert wird der Kopplungspuffer verwendet.

Im trockenen Zustand befinden sich laut Herstellerangaben ca. 80 µmol/g Tresyl-

gruppen auf dem Träger. Da das zu immobilisierende ABA ein kleines Molekül ist und

im Überschuss vorliegt, sollte eine annährend vollständige Substitution der Tresyl-

gruppen erreicht werden.

Der bestimmte ABA-Gehalt nach der Immobilisierung beträgt jedoch 145 µmol/g und

weicht somit um ca. 81 % vom theoretisch möglichen Gehalt ab. Erklärt werden kann

diese Beobachtung dadurch, dass ABA mit der Aminogruppe, den Hydroxygruppen

sowie dem negativ geladenen Boratom Wasserstoffbrückenbindungen mit der

hydrophilen Trägeroberfläche ausbildet.

In einem zweiten Versuch erfolgt die Überprüfung dieser Vermutung, indem ein Träger

mit bereits geblockten Tresylgruppen verwendet wird. Zur Herstellung wird der Träger

einige Stunden mit Kopplungspuffer behandelt und die Tresylgruppen anschließend mit

Trispuffer geblockt. Das Adsorbens wird mit Wasser gewaschen und getrocknet. 4 mL

der ABA-Lösung in Kopplungspuffer werden zu dem Adsorbens gegeben. Zu erwarten

ist, dass die Konzentration an ABA im Überstand konstant bleibt. Tatsächlich zeigt die

Bestimmung von ABA nach 4 h Einwirkzeit, dass 55 µmol/g physisorbiert sind. Zieht

man diese, durch unspezifische Adsorption erreichte ABA-Beladung vom im ersten

Versuch erhaltenen Beladungswert von 145 µmol/g ab, lässt sich damit der

tatsächliche ABA-Gehalt zu 90 µmol/g abschätzen, der dem theoretischen Wert

deutlich näher kommt und eine vollständige Umsetzung der Tresylgruppen mit ABA

vermuten lässt.

3.2.2 Blutplasma Für die Anreicherung von Glycoproteinen aus der Realprobe Blutplasma werden 0,5 g

trockenes ABA-Adsorbens in eine 10 x 0,5 cm Glassäule überführt und mit Laufpuffer

(0,02 M HEPES, 0,5 M NaCl, 0,02 M MgCl2, pH 8,5) equilibriert. Zur Desorption enthält

der Laufpuffer 70 mM Tris, regeneriert wird mit einem Acetatpuffer (0,2 M

Natriumacetat, pH 4,5). Der Fluss beträgt 1,6 mL/min. Plasmaproben werden im

Vorfeld zu gleichen Teilen mit Laufpuffer verdünnt. 200 µL werden anschließend auf

die Säule gegeben. Die Desorptionsfraktionen werden gesammelt, durch Ultrafiltration

(MWCO 10 kDa (Ausschlussgröße)) in Reinstwasser überführt, gefriergetrocknet und

anschließend der 2D-Gelelektrophorese zugeführt (vgl. Abschnitt 3.3.6.3).

In Abb. 9A ist ein beispielhaftes Chromatogramm zu sehen. Ein schwacher

Desorptionspeak ist zu erkennen, was den Schluss zulässt, dass nur wenig

glycosylierte Proteine an das Trägermaterial gebunden haben. Ebenfalls ist

Trägermaterial ohne ABA-Ligand verwendet worden. Hier erscheint kein


Desorptionspeak (Abb. 9B). Daher kann ein Einfluss des Trägermaterials auf den

Verlauf der Affinitätsseparation ausgeschlossen werden.

Abb. 9: ABA-Affinitätsseparation von Seehundplasma mit ABA-Toyopearl AF-Tresyl-650M (A). Daneben ist eine Auftragung von Plasma auf den Träger ohne ABA-Liganden zu sehen (B).

Abb. 10A zeigt ein 2D-Gel mit dem aufgetrennten Blutplasma. Bei dem rechten Gel

(Abb. 10B) handelt es sich um die Visualisierung der Desorptionsfraktionen. Jedoch ist

hier nur ein schwacher, sehr breiter Spot bei etwas unterhalb des 72 kDa-

Markerproteins zu erkennen. In Abb. 10B ist dieses Protein ebenfalls als verschmierter

Spot zu erkennen. Dies deutet daraufhin, dass in diesem Fall nur das Serumalbumin

aus dem Seehundplasma angereichert wird. Zum Vergleich: Bovines Serumalbumin

(BSA) ist ca. 66 kDa und humanes Serumalbumin ca. 65 kDa groß [7, Seite 88; 94,

Seite 639]. Dies lässt den Schluss zu, dass es sich um ein unspezifisches

Adsorptionsverhalten handelt. Dass keine anderen Proteine identifiziert werden

konnten, liegt eventuell an der zu gering aufgegebenen Gesamtproteinmenge, die aus

drei vereinigten Desorptionsfraktionen gewonnen worden sind.

Umfangreiche Untersuchungen zum Adsorptionsverhalten komplexer Proteingemische

an ABA-Sepharose haben Brena et al. durchgeführt [95, Seite 112]. Sie verwendeten

humanes Blutplasma. Unter ähnlichen Trennbedingungen (Laufpuffer: 0,02 M HEPES,

0,01 M MgCl2, pH 8,5; Desorptionspuffer: 0,2 M Sorbitol in Laufpuffer) konnten u.a.

Immunoglobuline, Transferrin und Haptoglobin aber auch humanes Serumalbumin

identifiziert werden. Entscheidenden Anteil an der Bindung bestimmter Glycoproteine

scheint der Zusatz von Mg2+-Ionen im Laufpuffer zu haben. Ohne Mg2+-Ionen konnten

Brena et al. zwar kein humanes Serumalbumin identifizieren, aber auch nicht die

Glycoproteine Transferrin und Haptoglobin.


Abb. 10: 2D-Gele des Seehundplasmas (A) und der Desorptionsfraktion (B). Der Protein-marker ist bei (A) auf der rechten, bei (B) auf der linken Seite aufgetragen worden. Für die 2D-Gelelektrophorese werden 7 cm IPG-Streifen (pH 3-10) und entsprechende Fertiggele (Tris-HCl, 8-16 %) für die Mini-Protean-Zelle (Bio-Rad) verwendet.

3.2.3 Synthetische Proteinmischungen Da die Abtrennung von Glycoproteinen aus dem komplexen Fluid Blutplasma nicht

zufriedenstellend ist, soll in diesem Abschnitt die Anwendbarkeit von ABA auf

Proteinmischungen demonstriert werden, die nur aus wenigen Komponenten bestehen.

Die Glycoproteine GOD und Fetuin sowie das nicht-glycosylierte BSA werden auf die

kommerziell erhältliche ABA-Sepharose (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland)

zunächst einzeln und anschließend als Gemisch aufgetragen. Das Adsorbens wird in

eine 10 x 0,5 mm Glassäule eingeschlämmt und anschließend mit Laufpuffer (20 mM

HEPES, 20 mM MgCl2, 0,2 M NaCl, pH 8,5) equilibriert. Die Proteine werden im

Laufpuffer gelöst, wobei die Konzentrationen bei Einzel- oder Gemischaufgabe in etwa

equimolar sind (GOD 2,0 mg/mL, Fetuin 0,6 mg/mL, BSA 0,8 mg/mL). Die Desorption

findet mit einem sorbitolhaltigen HEPES-Puffer statt (20 mM HEPES, 100 mM Sorbitol,

pH 8,5), gefolgt von einem Regenerationsschritt mit einem Acetatpuffer (0,2 M

Natriumacetat, pH 5,0) [62, Seite 123-125]. Der Fluss während der Durchführung

beträgt 1,6 mL/min. Durchlauf- und Desorptionsfraktion werden gesammelt, mittels

Ultrafiltration in Reinstwasser überführt und anschließend gefriergetrocknet. Für die

1D-Gelelektrophorese werden TGX-Minigele verwendet. Von den Proteinstandards

und den gefriergetrockneten Proben werden wässrige Lösungen (0,02 mg/mL)

hergestellt. Die Gemischlösung wird direkt verwendet. Alle Lösungen werden mit

Laemmli-Puffer (62,5 mM Tris-HCl, 2 % (w/v) SDS (Natriumdodecylsulfat), 25 % (v/v)

Glycerol, 0,01 % (w/v) Bromphenolblau, pH 6,8) und -Mercaptoethanol gemischt um

anschließend für 5 min auf 95 °C erhitzt zu werden. Das Verhältnis zwischen

Probenlösung, Laemmli-Puffer und -Mercaptoethanol beträgt 20:19:1 (v/v/v). Nach

dem Abkühlen werden je 5 µL in die Taschen der Gele überführt. Die

Gelelektrophorese findet anschließend bei 100 V in SDS-Laufpuffer (25 mM Tris,


192 mM Glycin, 0,1 % SDS w/v) statt. Die Färbung der Gele erfolgt mittels Coomassie-

Brillant-Blau.

In Abb. 11 sind die Affinitätschromatogramme der einzelnen Proteine und die Aufgabe

als Gemisch zu sehen. Zu erkennen ist, dass bei allen drei Einzelaufgaben ein

Desorptionspeak erscheint, der bei der Einzelaufgabe von GOD (Abb. 11A) sowie der

Gemischaufgabe (Abb. 11C) am deutlichsten ausgeprägt ist. Bei Fetuin (Abb. 11B) und

dem nicht glycosylierten BSA (Abb. 11C) ist der Desorptionspeak ähnlich intensiv.

Abb. 11: Affinitätschromatogramme der Einzelaufgaben von GOD (A), Fetuin (B) und BSA (C) und als Gemischaufgabe der drei Proteine (D).

Das von der Durchlauf- und der Desorptionsfraktion angefertigte 1D-Gel ist in Abb. 12

zu sehen. Da GOD aus zwei gleichschweren Untereinheiten besteht, zeigt sich dessen

Bande bei 80 kDa, die von BSA bei 67 kDa und von Fetuin bei 48 kDa.


Abb. 12: 1D-Gel der Standards und Proben. Belegung der Gel-Taschen: 1. Marker, 2. BSA, 3. GOD, 4. Fetuin, 5. Durchlauffraktion, 6. Desorptionsfraktion, 7. leer, 8. Ausgangs-proteingemisch, 9. Laemmli-Puffer, 10. Marker.

Von den applizierten Standards (Abb. 12, Bahn 2-4) ist nur die GOD-Bande deutlich zu

erkennen. BSA zeigt sich als schwache Bande bei ca. 67 kDa, der Fetuin-Standard ist

ebenfalls nur schwach zu erkennen. Hinsichtlich der Konzentration der Standards

wurde auf eine Optimierung zur besseren Visualisierbarkeit verzichtet. Bahn 8 zeigt

das Ausgangsproteingemisch, welches auf die ABA-Säule aufgegeben wurde. Hier

können GOD, BSA und Fetuin identifiziert werden. Bahn 5 zeigt die Durchlauffraktion,

wobei das gleiche Auftrennungsmuster wie beim Ausgangsgemisch zu erkennen ist.

Die Desorptionsfraktion ist in Bahn 6 zu sehen. Hier können GOD und BSA identifiziert

werden, die Fetuin-Bande fehlt.

Das Vorhandensein von BSA in der Desorptionsfraktion zeigt die Neigung von ABA zu

unspezifischen Wechselwirkungen (vgl. Abschnitt 3.4), selbst bei Anwendung auf

einfache Proteinmischungen. Das Fehlen von Fetuin in der Desorptionsfraktion ist

vermutlich auf die Sialinsäurereste zurückzuführen, die sich endständig an den

Glycanen befinden [22, Seite 18265]. Unter den basischen Trennbedingungen ist

Sialinsäure deprotoniert und negativ geladen. Dadurch kann es zu Abstoßungskräften

zum ebenfalls negativ geladenen ABA-Liganden kommen. Sterisch betrachtet, können

die Sialinsäurereste die weiteren Monosaccharideinheiten durch ihre Endständigkeit

eventuell abschirmen, so dass für ABA keine Bindungsstelle zugänglich ist.


3.2.4 Rückschlüsse ABA ist als Ligand für die selektive Anreicherung von Glycoproteinen aus

synthetischen Gemischen als auch komplexen Fluiden nicht geeignet. Dies wurde

dadurch gezeigt, dass nicht-glycosylierte Albumine mit abgetrennt wurden. Ein

ähnliches Bindungsverhalten wurde auch durch Liu et al. beobachtet. Sie

beschichteten elektrochemisch Glaskohlenstoffelektroden mit einem Polymer, auf dem

ABA immobilisiert ist. Cyclovoltametrische Interaktionsstudien mit GOD und BSA

zeigten, dass beide Proteine an ABA binden können. GOD konnte mit Sorbitol

desorbiert werden, BSA dagegen nur unzureichend [96, Seite 215].

Etliche Publikationen, die ABA zur Glycoproteinanreicherung beschreiben, setzen nur

synthetische Mischungen ein [80, Seite 1676; 82, Seite 117]. Wird die Aufreinigung von

Realproben beschrieben, sind anschließend immer zusätzliche Schritte notwendig, um

zum aufgereinigtem Wertstoff zu gelangen. Bei dem bereits aufgeführten Beispiel zur

Aufreinigung von Erythropoetin aus Zellaufschlüssen waren nach der Affinitäts-

separation mit ABA-Sepharose die Durchführung einer Anionenaustausch- und Gel-

permeationschromatographie erforderlich, um das Produkt in der benötigten Reinheit

zu isolieren [79, Seite 281].

3.3 Entwicklung eines Aufreinigungsverfahrens für Benzoylformiatdecarboxylase

Der Nachteil der unspezifischen Adsorption aus Vielstoffgemischen kann umgangen

werden, wenn vorher alle ABA-Moleküle auf dem Adsorbens mit einem einzigen Stoff

abgesättigt werden und so keine Angriffsplätze für die unspezifische Adsorption

bestehen. In diesem Abschnitt wird deshalb ein Verfahren beschrieben, bei dem ein

Coenzym in einem vorgelagerten Schritt an das ABA-Adsorbens gebunden wird. Mit

diesem Adsorbens soll ein entsprechendes Zielenzym aufgereinigt werden. Die

Desorption des Enzym-Cofaktor-Komplexes erfolgt durch einen einfachen pH-

Gradienten.

3.3.1 Benzoylformiatdecarboxylase Benzoylformiatdecarboxylase (BFD) ist ein thiaminpyrophosphatabhängiges Enzym

des Mandelatstoffwechselweges in Pseudomonas putida, einer gram-negativen

Bakterienart. Es katalysiert die nichtoxidative Decarboxylierung von Benzoylformiat zu

Benzaldehyd und Kohlenstoffdioxid. Das Enzym ist aufgebaut aus vier identischen

Untereinheiten, die jeweils ca. 55 kDa schwer sind (Abb. 13) [97, Seite 955; 98, Seite

9921]. Als Cofaktor benötigt jede Untereinheit neben Thiaminpyrophosphat (TPP) auch

Ca2+- und Mn2+-Ionen.


Abb. 13: Darstellung einer Untereinheit der BFD als Stick-Modell (links) und als Ribbon-Modell (rechts); TPP (1), Mn2+ (2), Ca2+ (3). PDB-Datei 1bfd aus [98].

Neben der Decarboxylaseaktivität besitzt das Enzym auch eine Carboligaseaktivität.

Hierbei katalysiert BFD die Reaktion zwischen einer -Ketocarbonsäure und einem

Aldehyd. In Abb. 14 ist das allgemeine Reaktionsschema dargestellt.

Abb. 14: Allgemeines Reaktionsschema der durch BFD katalysierten C-C-Kupplungs-reaktion zwischen einem Aldehyd und einer -Ketocarbonsäure [99, Seite 312].

Die dabei gebildeten chiralen 2-Hydroxyketone, die wichtige Bausteine in der

chemischen und pharmazeutischen Industrie sind, entstehen mit hoher

Enantiomerenreinheit [100, Seite 520]. Das Vorhandensein eines chiralen Zentrums

und einer prochiralen Carbonylgruppe machen 2-Hydroxyketone zugänglich für weitere

Umsetzungen [101, Seite 536]. Ob die Carboligaseaktivität von BFD von

physiologischer Bedeutung für Pseudomonas putida ist, ist bisher nicht geklärt [102,

Seite 345]. Durch Wilcocks et al. wurde die Carboligaseaktivität zum ersten Mal

beschrieben. Sie beobachteten die Bildung von (S)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon in

Gegenwart von Benzoylformiat und Acetaldehyd [103, Seite 1701; 104, Seite 1060].

Hinsichtlich der Substratspezifität von BFD besteht eine bevorzugte Umsetzung von

aromatischen Substraten gegenüber aliphatischen Substraten [105, Seite 2201]. Das

Vorhandensein einer Carboxygruppe, wie im Benzoylformiat enthalten, ist für die

Carboligaseaktivität nicht von Bedeutung. Der korrespondierende Aldehyd der

-Ketocarbonsäure wird ebenfalls umgesetzt. Benzaldehyd, als korrespondierender

Aldehyd zu Benzoylformiat wurde für die Synthese chiraler 2-Hydroxyketone eingesetzt.


Des Weiteren können meta-substituierte Benzaldehydderivate als Substrate dienen

[106, Seite 1487].

Die BFD, die in dieser Arbeit aufgereinigt werden soll, wird rekombinant in E. coli

exprimiert. Im Vorfeld wurden auf DNA-Ebene der BFD sechs Codons für Histidin am

3’-Ende eingeführt. Auf Proteinebene sind am C-terminalen Ende dementsprechend

sechs Histidinreste vorhanden [106, Seite 1485]. Das macht die rekombinante BFD

zugänglich für die Metallchelat-Affinitätssepartion an Ni2+-Ionen, die an träger-

gebundene Nitriloessigsäure immobilisiert sind. Ni2+ besitzt vier Koordinationsstellen,

wobei zwei besetzt sind durch die Nitriloessigsäure. Die verbleibenden Stellen werden

durch den Histidin-Tag komplexiert, wobei BFD gebunden wird. Desorbiert wird mit

Hilfe eines Puffers, der einen Komplexbildner enthält, z.B. Imidazol, und somit BFD

kompetitiv vom Ni2+ verdrängt [107, Seite 541].

Nachteilig können sich jedoch Kreuzreaktivitäten mit anderen histidinreichen Proteinen

auswirken. Weiterhin muss der Histidin-Tag nach der Aufreinigung entfernt werden,

was einen weiteren Aufreinigungsschritt erfordert. Wird die BFD direkt aus

Pseudomonas putida isoliert, müssen zwangsläufig mehrstufige konventionelle Protein-

aufreinigungsmethoden verwendet werden. Typische Protokolle beinhalten eine

Fällung mit Ammoniumsulfat sowie Aufreinigungsschritte mittels Anionenaustausch-

chromatographie und Farbstoff-Affinitätsseparation [106, Seite 1485].

Grundsätzlich ist ein Verfahren wünschenswert, das BFD in einem Schritt aufreinigt,

um Ausbeuteverluste zu reduzieren. Dies ist durch die Metallchelat-Affinitätsseparation

aufgrund der nachfolgenden Prozedur zur Entfernung des Histidin-Tags nicht gegeben.

3.3.2 Beschreibung der ligandvermittelten Affinitätsseparation Maestas et al. führten eine Aufreinigungsmethode ein, die es ermöglichen sollte

Enzyme mittels ABA-Affinitätsseparation aufzureinigen, welche eigentlich keine Affinität

zu ABA aufweisen. Viele dieser Enzyme benötigen für ihre Funktion Cofaktoren. Diese

enthalten häufig diolhaltige Gruppen und können mit ABA wechselwirken. ABA wird

demnach mit dem entsprechenden Cofaktor für das aufzureinigende Enzym

abgesättigt. Das Enzym bindet spezifisch an den Cofaktor, unerwünschte Bestandteile

werden entfernt (Abb. 15). Die Desorption erfolgt durch Spaltung der Bindung zwischen

ABA und dem Cofaktor [108, Seite 227]. In der Literatur wird das Verfahren auch als

ligandvermittelte Affinitätsseparation bezeichnet [63, Seite 78]. Neben diolhaltigen

Cofaktoren können auch alle jenen Cofaktoren verwendet werden, die in

ausreichendem Maße an ABA binden [108, Seite 228].


Abb. 15: Schematischer Trennzyklus der ligandvermittelten Aufreinigung von BFD. 1: Absättigung mit TPP. 2: Aufgabe des BFD-haltigen Gemisches. 3: Adsorption von BFD an TPP und Ausspülen der unerwünschten Stoffe. 4: Desorption von TPP und damit auch der daran gebundenen BFD. 5: Regeneration.

Auf dieser Grundlage soll ein Affinitätsseparationsverfahren entwickelt werden, bei

dem BFD aus einem E. coli-Zellaufschluss aufgereinigt wird. Hierzu wird der Cofaktor

Thiaminpyrophosphat (TPP) an ABA-Trägermaterialen gebunden. Das geschieht

vermutlich über die Diphosphatgruppe von TPP. Wie in Abschnitt 3.1.2 erwähnt, sind

bereits Boronsäure-Phosphat-Komplexe beschrieben worden [85, Seite 11180]. Die

Strukturformel von TPP ist in Abb. 16 dargestellt.

Abb. 16: Strukturformel von Thiaminpyrophosphat.

Der Vorteil dieser, im Folgenden als TPP-vermittelte Affinitätsseparation bezeichneten,

Methode ist, dass eine simple pH-Verschiebung durch Verwendung eines schwach

sauren Puffers zur Desorption des Enzym/Cofaktor-Komplexes ausreicht. Gleichzeitig

nutzt man die hohe Selektivität und Affinität der Enzym/Cofaktor-Wechselwirkung aus.

3.3.3 Verwendete Trägermaterialien und Immobilisierung von TPP Für die Versuche werden zwei Adsorbentien verwendet. Die TPP-vermittelte

Affinitätsseparation erfolgt unter Anwendung des in Abschnitts 3.2.1 beschriebenen

ABA-Polymer-Adsorbens.

Neben dem ABA-Adsorbens wird ein zweites Adsorbens für vergleichende

Untersuchungen hergestellt, bei dem TPP direkt an Toyopearl AF-Tresyl-650M

immobilisiert ist. Die direkte Immobilisierung von TPP an verschiedene


Trägermaterialien wird bereits in der Literatur beschrieben. Ein Verfahren zeigt die

Anbindung von TPP, vermutlich über die Diphosphatgruppe, an Aminoethyl-Sepharose

nach Aktivierung mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) [109, Seite

242; 110, Seite 888]. An Diazobenzoylaminohexyl-Sepharose kann TPP über den

Thiazolring ebenfalls erfolgreich immobilisiert werden [111, Seite 15].

Eine direkte Immobilisierung von TPP an Toyopearl AF-Tresyl-650M sollte aufgrund

der vorhandenen primären Aminogruppe möglich sein. Hierbei wird eine 0,1 M TPP-

Lösung in Phosphatpuffer hergestellt, von der 4 mL auf 0,5 g Trägermaterial gegeben

werden. Die nicht umgesetzten Tresylgruppen werden nach 4 h mit Tris-Puffer geblockt.

Das erhaltene Adsorbens weist eine leicht orange Färbung auf.

3.3.4 Bindungsstudien mit TPP am ABA-Adsorbens Der Gehalt an TPP, der am ABA-Adsorbens gebunden werden kann, wird in

verschiedenen Bindungsstudien untersucht. Variiert werden die Einflussparameter

Temperatur und Reaktionsdauer. Für die Untersuchung werden 0,5 g trockenes ABA-

Adsorbens in eine 10 mL Glassäule gefüllt. Anschließend werden 10 mL verschieden

konzentrierter TPP-Lösungen in Laufpuffer (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 2 mM MgCl2,

pH 8,5) auf die Säule gegeben. Der Konzentrationsbereich erstreckt sich von 0,02 bis

0,3 M. Zu beachten ist, dass bei höheren TPP-Konzentrationen der pH-Wert mit

Natronlauge erneut eingestellt werden muss. Das Adsorbens wird zusammen mit der

TPP-Lösung inkubiert. Die Bedingungen hinsichtlich Temperatur und Einwirkzeit finden

sich in Tabelle 3.

Tabelle 3: Zusammenstellung der Parameter und Ergebnisse der Bindungsstudien von TPP an ABA-Toyopearl

Nr. TPP-Konzentration

[mM] Volumen

[mL] Reaktionsdauer

[h] Temperatur

[°C]

TPP immobilisiert, bezogen auf ABA

[%]

1 20 5 Durchfluss RT n. d.

2 20 10 Durchfluss RT n. d.

3 20 10 1 RT n. d.

4 20 10 1 40 ca. 0,01

5 330 10 16 40 0,95

6 170 10 16 40 0,21

7 200 10 16 80 0,12

Anschließend erfolgt die Entfernung des TPP-Überschusses durch Spülen mit Lauf-

puffer. Die Desorption des gebundenen TPPs wird durch die Erniedrigung des

pH-Wertes realisiert (Desorptionspuffer: 0,01 M KH2PO4, 0,15 M NaCl, 2 mM MgCl2,


pH 6). Diese Fraktionen werden in geeigneten Messkolben aufgefangen und auf das

jeweilige Volumen mit Laufpuffer eingestellt. Ein exemplarisches Chromatogramm ist in

Abb. 17 dargestellt.

Abb. 17: Chromatogramm eines typischen Versuches mit TPP. 1: Entfernen des Über-schusses von TPP durch Waschen mit Laufpuffer. 2: Desorption von TPP

Die Bestimmung von TPP erfolgt photometrisch bei einer Wellenlänge von 296 nm in

Quarzküvetten. Eine lineare Kalibrierung erfolgt im Bereich von 4,3 µM bis 56,7 µM

TPP in Laufpuffer [112, Seite 717]. Von den Desorptionsfraktionen werden zur

Bestimmung geeignete Verdünnungen hergestellt.

Zur Überprüfung der Vermutung, dass die Bindung von TPP über die Diphosphat-

gruppe erfolgt, wird der Versuch in beschriebener Weise mit Thiamin durchgeführt.

Diesem Molekül fehlt die Diphosphatgruppe. Die Strukturformel von Thiamin ist in

Abb. 18 gegeben.

Abb. 18: Strukturformel von Thiamin.

In der letzten Spalte von Tabelle 3 sind die Ergebnisse zusammengefasst. Berechnet

wurde das prozentuale Verhältnis der gebundenen Stoffmenge von TPP zu der

Gesamtstoffmenge an ABA pro Gramm Trägermaterial.

Es zeigt sich, dass sich möglichst hohe TPP-Konzentrationen, lange Einwirkzeiten und

erhöhte Temperaturen günstig auf die Beladung des ABA-Adsorbens mit TPP aus-

wirken. Als Optimum kristallisiert sich eine TPP-Konzentration von 0,33 M bei 40 °C

und 16 h Einwirkzeit heraus (Zeile 5, Tabelle 3). Unter diesen Bedingungen kann an


ca. 1 % aller ABA-Moleküle TPP gebunden werden. Das entspricht einer Dichte an

TPP von 0,9 µmol/g bzw. 0,021 µmol/m2, bei einer spezifischen Oberfläche des Träger-

materials von 42 m2/g und einer ABA-Dichte von 90 µmol/g.

Versuche die TPP-Beladung an ABA durch weitere Temperaturerhöhung zu steigern,

scheitern an der begrenzten Hitzestabilität des Adsorbens. Weiterhin kann die

gebundene TPP-Menge nicht durch höhere TPP-Konzentrationen vergrößert werden,

da mit 0,33 M die Sättigungskonzentration in der Laufpuffer-Lösung erreicht ist.

Zudem zeigt auch TPP unter basischen Bedingungen sowie unter erhöhten

Temperaturen nur eine begrenzte Stabilität [113, Seite 55]. Dies schließt auch eine

Erhöhung des pH-Wertes zur Beladungssteigerung aus und ist vermutlich ursächlich

für die geringe Oberflächenbelegung von TPP am ABA-Adsorbens. Jedoch können der

Literatur in diesem Zusammenhang keine Daten unter experimentell vergleichbaren

Bedingungen entnommen werden, um die Stabilität von TPP abschätzen zu können.

Viele ältere Studien befassen sich mit dem Abbau von TPP und Thiamin bei

Temperaturen, die bei der Zubereitung von Lebensmitteln zu finden sind. Bei einer

Temperatur von 100 °C ist nach einer Stunde der Großteil des Thiamins in wässrigen

Puffersystemen abgebaut [114, Seite 129]. Vermutlich wird dadurch die Abnahme der

TPP-Konzentration bei 80 °C bewirkt (Zeile 7, Tabelle 3). Einer anderen Studie kann

entnommen werden, dass bei Temperaturen um 40 °C und nach 16 h Inkubationszeit

bei pH 8,2 kein vollständiger Abbau von Thiamin stattfindet. Hier sind noch ca. 6 % des

Thiamins nachweisbar [115, Seite 186].

Nachfolgend soll abgeschätzt werden, ob unter den optimierten TPP-Bindungs-

bedingungen eine ausreichende TPP-Menge auf der Oberfläche zur Adsorption von

BFD zur Verfügung steht. Für die Bestimmung des Platzbedarfes eines BFD-Moleküls

ist daher die größtmögliche, zweidimensionale Projektion des Enzyms aus der ent-

sprechenden PDB-Datei 1bfd mit der Swiss-PDB-Viewer 4.0-Software ermittelt worden

[98, Seite 9918]. Die Projektion entspricht einem Quadrat mit einer Kantenlänge von

7 nm. Geht man davon aus, dass die angenommen Quadrate ohne Lücken aneinan-

dergereiht werden, berechnet sich die theoretische Oberflächenbelegung AO in

µmol/m2 wie folgt.

ABFD

24

o NA

10A (4)

ABFD Flächenbedarf BFD [nm2]

NA Avogadrokonstante [mol-1]


Es ergibt sich eine theoretische maximale Oberflächenbelegung von BFD zu

0,034 µmol/m2. Da die TPP-Belegung nur bei 0,021 µmol/m2 liegt, kann die

tatsächliche, maximal mögliche Oberflächenbelegung mit BFD auch nur 0,021 µmol/m2

betragen. Der Gesamtplatzbedarf der BFD pro Gramm Träger berechnet sich dann zu

26 m2/g, was 62 % der Gesamtfläche des Trägermaterials entspricht. Somit ist eine

1 %ige Belegung für das weitere Verfahren ausreichend, wenn die Bindung des

Enzyms an den Cofaktor ungehindert abläuft.

Ähnliche Ligandendichten von immobilisierten TPP für Affinitätsseparationsverfahren

können auch der Literatur entnommen werden. O’Brien et al. beschreiben für die

Immobilisierung von TPP an Sepharose 4B eine Ligandendichte von 6 µmol/mL [116,

Seite 19]. Das entspricht etwa 1,5 µmol/g trockener Sepharose mit der Annahme, dass

1 g Sepharose auf 4 mL bei Benetzung anschwillt. Auch niedrigere Ligandendichten

wurden beschrieben. Matsura et al. stellten einen TPP-Sepharose-4B-Träger mit

0,04 µmol/mL TPP (0,01 µmol/g) her [109, Seite 242].

Im Vergleich zu anderen in der Literatur beschriebenen ligandvermittelten Affinitäts-

separationsverfahren ist die Immobilisierungsausbeute von TPP an ABA klein.

Maestas et al. beschreiben, dass für NAD+ 39 % aller ABA-Moleküle mit diesem

Cofaktor versehen werden konnten. NAD+ besitzt durch die Ribose-Einheit eine Diol-

gruppe, womit die höheren Ausbeuten erklärt werden können. In der gleichen Studie

wurden auch Untersuchungen mit Pyridoxal, einem Cofaktor der nicht über eine

Diolgruppe verfügt, vorgenommen. Hier konnte nur an 2 % aller ABA-Moleküle

Pyridoxal gebunden werden [108, Seite 228].

Weiterführende Informationen zur TPP-ABA-Bindung wurden durch einen Referenz-

versuch mit Thiamin gewonnen. Die in analoger Weise durchgeführten Versuche

zeigen jedoch ähnliche Chromatogramme wie mit TPP. Daraus kann geschlossen

werden, dass Thiamin ebenfalls an ABA bindet und dass die Bindung nicht, entgegen

des in Abschnitt 3.1.2 aus der Literatur zitierten kovalenten Bindungsmechanismus,

über die Diphosphatgruppe erfolgt. Eine mögliche Erklärung ist, dass ionogene

Wechselwirkungen zwischen dem positiv geladenen quaternären Stickstoffatom des

TPP bzw. Thiamins und dem negativ geladenen Boratom verantwortlich sind, was im

Folgenden untersucht wird. Dennoch sollte die TPP-vermittelte Affinitätsseparation mit

BFD möglich sein, da eine ausreichende Menge TPP auf dem ABA-Adsorbens

vorhanden ist. In Abschnitt 3.3.6 wird darauf eingegangen.

3.3.5 Bindungsstudien mittels 31P-NMR-Spektroskopie Die Vermutung, dass ionogene Wechselwirkungen für die Adsorption von TPP am

ABA-Adsorbens und nicht kovalente Bindungen verantwortlich sind, soll mittels 31P-

NMR-Spektroskopie überprüft werden. Das 31P-Isotop mit dem Kernspin 1/2 ist das


einzige natürliche Phosphorisotop und einer der empfindlicheren Kerne in der NMR-

Spektroskopie [117, Seite 228]. In zwei Experimenten wird zum einen TPP alleine und

ein Gemisch von TPP und ABA in Lösung unter basischen Bedingungen vermessen.

Erfolgt eine Bindung über die Diphosphatgruppe, sollten die gemessenen chemischen

Verschiebungen P und das Kopplungsmuster bei beiden Experimenten unterschiedlich

sein.

Zur Probenvorbereitung werden je zwei 20 µM Lösungen von TPP und ABA in D2O

hergestellt, die anschließend zu gleichen Teilen gemischt werden. Der pH-Wert wird

auf 9-10 mit 2 M NaOH-Lösung eingestellt und ein Aliquot in ein 10 mm NMR-

Röhrchen überführt. Als externer Standard dient 85 % H3PO4. Für die Aufnahme des

TPP-Spektrums erfolgt die Vermessung der 20 µM TPP-Lösung. Gemessen wird bei

einer Frequenz von 121,5 MHz mit einem 10 mm Mehrkern-Probenkopf. Für die 1H-

Breitbandentkopplung wird die Waltz16-Pulssequenz verwendet. Die Wiederholzeiten

betragen 5 s. In Abb. 19 sind beide Spektren dargestellt.

Abb. 19: 31P-NMR-Spektren von TPP (A) und TPP und ABA (B).

Befindet sich TPP alleine in basischer Lösung treten drei Signale mit den Signal-

schwerpunkten bei -5,40 ppm (t), -9,42 ppm (d) und -10,32 ppm (d) ppm auf (Abb. 19A).


Das Singulett bei -12,21 ppm ist eine Verunreinigung, da es auch bei der Vermessung

von reinem D2O auftrat. Werden TPP und ABA zusammen vermessen, ändert sich das

Spektrum stark. Das Dublett bei -10,3 ppm verschwindet und aus dem Triplett bei -

5,40 ppm wird ein Dublett. Zudem sind die Signale in Abb. 19B, bis auf das Signal der

Verunreinigung, schwach tieffeldverschoben.

Aufgrund der Protonierung der Diphosphatgruppe bei niedrigen und ihrer

Deprotonierung bei hohen pH-Werten ist die chemische Verschiebung der 31P-Signale

stark vom pH-Wert abhängig. Insbesondere bei dem terminalen Phosphoratom der

Diphosphatgruppe steigt die chemische Verschiebung von ca. -11 ppm auf -6 ppm,

wenn der pH-Wert von 3 auf 8 erhöht wird. Darüber hinaus bleibt sie konstant. Die

chemische Verschiebung des integralen Phosphoratoms steigt dagegen um ca. 1 ppm

von -11,5 auf -10,5 ppm [118, Seite 104; 119, Seite 313].

Das 11B-Isotop mit einer natürlichen Häufigkeit von 80 % besitzt einen Kernspin von 3/2

[120, Seite 134]. Bildet TPP mit ABA einen binären Komplex wie in Abb. 20

vorgeschlagen, sollte es zusätzlich zur Spin-Spin-Kopplung des Boratoms mit einem

Phosphoratom kommen. Dabei sollte das als Dublett auftretende Signal des Phosphor-

atoms in ein Dublett von Quartett aufgespaltet werden [120, Seite 134].

Abb. 20: Mögliche binäre Komplexe von ABA mit TPP.

Da das 31P-NMR-Spektrum in Abb. 19B dieses Muster nicht aufweist, ist davon

auszugehen, dass die vermutete Wechselwirkung über die Diphosphatgruppe nicht

stattfindet. Warum für TPP in Abb. 19A ein abweichendes Spektrum erhalten wurde,

kann abschließend nicht eindeutig geklärt werden. Vergleicht man die Kopplungs-

konstanten mit Literaturwerten von TPP und anderen biochemisch relevanten Di- bzw.

Triphosphaten (z.B. Adenosindiphosphat bzw. Adenosintriphosphat) stellt man eine

hohe Übereinstimmung fest [118, Seite 104; 119, Seite 312; 121, Seite 3251]. Die

gemessenen Kopplungskonstanten betragen, wie die der Literatur entnommenen, ca.

20 ppm. Daraus kann geschlossen werden, dass es sich um geminale Phosphor-

kopplungen handelt. Da innerhalb der Messreihe die TPP-Lösung zuletzt vermessen

wurde, kann aufgrund der recht starken basischen Bedingungen ein beginnender


Abbau von TPP nicht ausgeschlossen werden, wodurch sich chemische

Verschiebungen und die Kopplungsmuster ändern können.

Anhand der 31P-NMR-Messdaten kann die Vermutung untermauert werden, dass

ionogene Wechselwirkungen für die Adsorption von TPP am ABA-Adsorbens

verantwortlich sind.

3.3.6 Affinitätsseparation Die Protein-Cofaktor-Wechselwirkung zwischen TPP und TPP-abhängigen Enzymen

ist aufgrund der physiologischen Relevanz stark genug, um Affinitätstrennungen

durchzuführen. Dissoziationskonstanten kleiner als 10-5 M ermöglichen den benötigten

on/off-Mechanismus und erlauben einen Waschschritt, ohne dass nennenswert Protein

verloren geht [40, Seite 87]. Aus verschiedenen Organismen wurden bereits Proteine

bzw. Enzyme aufgereinigt, die Thiamin binden können oder es als Cofaktor benötigen

[122, Seite 327-329]. Die in der Literatur beschriebenen Dissoziationskonstanten liegen

im Bereich von 1,1·10-6 M bis 2,8·10-8 M [123, Seite 662; 124, Seite 334; 125, Seite

683; 126, Seite 578; 127, Seite 5].

3.3.6.1 Aufschluss der rekombinanten E. coli-Bakterien Die E. coli-Bakterien, in denen die BFD exprimiert wurde, stammen aus der

Arbeitsgruppe von Prof. Liese (Institut für Technische Biokatalyse, Technische

Universität Hamburg-Harburg). Der Aufschluss der Bakterien erfolgt mittels Ultraschall

(Sonifier 450 von Branson, Dietzenbach, Deutschland). Hierzu werden ca. 10 g Zellen

im gefrorenen Zustand eingewogen und mit 15 mL Aufschlusspuffer (2 M K2HPO4,

2 mM MgCl2, pH 7,5) vermengt. Anschließend werden ca. 5 mL Aliquote unter Kühlung

mittels Ultraschall zweimal für 1 min bei maximaler Leistung (400 W) behandelt. Die

Aliquote werden vereinigt, anschließend die Zelltrümmer bei 5000 g und 4 °C

abzentrifugiert und der Überstand abgenommen. Dieser wird bis zur weiteren

Verwendung bei -80 °C gelagert.

3.3.6.2 BFD-Aktivitätstest und Proteinkonzentrationsbestimmung Die Aktivitätsbestimmung der BFD wird nach der durch Iding et al. beschriebenen

Methode durchgeführt [106, Seite 1492]. Der Test basiert auf der Decarboxylierung von

Benzoylformiat zu Benzaldehyd, wobei die Änderung der Extinktion durch Benz-

aldehydproduktion verfolgt wird. Qualitativ kann die Aktivität der Lösung auch durch

das Auftreten eines marzipanartigen Geruchs, der durch Benzaldhyd verursacht wird,

festgestellt werden.

Für den Test sind 50 µL der BFD-haltigen Lösung mit 950 µL Substratpuffer (0,15 M

KH2PO4, 2,5 mM MgSO4, 0,5 mM TPP, 10 mM Benzoylformiat, pH 7,4) zu mischen und

in eine Quarzküvette zu überführen. Direkt nach der Vermischung erfolgt die Messung


der Extinktion bei =340 nm für 100 s. Der Substratpuffer und die Küvette werden im

Vorfeld auf 30 °C temperiert. Die BFD-Aktivität berechnet sich nach folgender Formel.

BFDProbe

total

dV

VEA (5)

A Enzymaktivität [U/mL]

E Extinktionsänderung [min-1]

V Proben- und Gesamtvolumen [mL]

d Schichtdicke der Küvette [cm]

BFD molarer Extinktionskoeffizient von BFD [0,032 L·mmol-1·cm-1]

Ist die Proteinkonzentration bekannt, berechnet sich die volumenunabhängige BFD-

Aktivität wie folgt.

ProteinV C

UA (6)

AV volumenunabhängige Enzymaktivität [U/mg]

CProtein Proteinkonzentration [mg/mL]

Die volumenunabhängige BFD-Aktivität wird zur Beurteilung des Aufreinigungs-

prozesses benötigt.

Der Proteingehalt im Überstand wird photometrisch zum einen bei einer Wellenlänge

von 280 nm und zum anderen nach der Bradford-Methode bestimmt [128, Seite 248-

254]. Die Kalibrierung erfolgt bei beiden Methoden mit BSA im entsprechenden Puffer.

3.3.6.3 2D-Gelelektrophorese, Tryptischer Verdau und MALDI-MS Zur Beurteilung und Visualisierung der durchgeführten Affinitätsseparationen werden

2D-Gele angefertigt. Mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorption/Ionisation Massen-

spektrometrie (Matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI-MS) nach einem

tryptischen Verdau kann BFD in den Gelen identifiziert werden. Die Durchführung

erfolgt nach einem in der Arbeitsgruppe vorhandenen Protokoll.

Die Proben für die 2D-Gelelektrophorese werden mittels Ultrafiltration entsalzt und

aufkonzentriert. Für die isoelektrische Fokussierung (Trennung von Proteinen nach

ihrem isoelektrischen Punkt) werden IPG-Streifen (11 cm) mit einem linearen pH-

Gradienten von 3-10 verwendet. Durch passive Rehydration über Nacht erfolgt die

Aufnahme der Proteine in die Streifen. Anschließend wird die Fokussierung bei


steigenden elektrischen Spannungen durchgeführt: 200 V für 30 min halten, 500 V für

30 min halten, 1000 V für 30 min halten, 1000 V bis 6000 V in 30 min, 6000 V halten

bis mindestens 15 kV·h erreicht sind.

Die Trennung nach dem Molekulargewicht der Proteine erfolgt mittels SDS-PAGE

(Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese). Dazu werden die Streifen

nach der isoelektrischen Fokussierung in zwei verschiedenen Puffern equilibriert (beide

Puffer: 0,37 M Tris-HCl, 6 M Harnstoff, 2 % (w/v) SDS, 30 % (v/v) Glycerol; Puffer 1

zusätzlich 20 mg/mL DTT (Dithiothreitol); Puffer 2 zusätzlich 25 mg/mL IAA (Iodessig-

säure)). Die Streifen können anschließend in die Aussparung des Acrylamidgels gelegt

werden. Die Trennung erfolgt bei 100 V pro Gel in SDS-Laufpuffer (25 mM Tris,

192 mM Glycin, 0,1 % SDS (w/v)). Die anschließende Färbung wird mittels Coomassie

Brilliant-Blue durchgeführt.

Die interessierenden Spots werden aus dem Gel geschnitten und mit 200 µL einer

0,2 M Ammoniumbicarbonat/Acetonitril-Lösung (6:4, v/v) solange entfärbt, bis kein

Coomassie-Blue-Farbstoff mehr sichtbar ist. Nach 30 min Trocknung der Gelstücke

unter vermindertem Druck (Vakuumzentrifuge Alpha RVC, Christ, Osterode am Harz,

Deutschland) erfolgt die Zugabe von 20 µL Trypsinlösung (20 µg/mL) und 50 µL einer

40 mM Ammoniumbicarbonat/Acetonitril-Lösung (93:7, v/v). Die Proben werden bei

37 °C über Nacht inkubiert.

Zur Probenvorbereitung für die MALDI-MS werden die tryptischen Proteinverdaue

erneut mittels Vakuumzentrifuge aufkonzentriert und mit je 10 µL einer Aceto-

nitril/Wasser-Mischung (1:1, v/v), die 0,1 % Trifluoressigsäure enthält, aufgenommen.

Die Matrix für die Peptide ist eine 1 µg/µL -Cyano-4-hydroxyzimtsäure-Lösung in

Ethanol/Aceton (2:1, v/v). Proben und Matrix werden im Verhältnis 1:1 gemischt und

1 µL wird auf ein 800 µm Anchorchip Target (Bruker, Bremen, Deutschland) pipettiert.

Die Kristallisierung erfolgt bei Raumtemperatur. Anschließend erfolgt die Messung

mittels MALDI-MS. Die erhaltenen „Peptide Mass Fingerprints“ werden mittels

MASCOT-Suche identifiziert.

3.3.6.4 TPP-vermittelte Affinitätsseparation Für die TPP-vermittelte Affinitätsseparation wird der Überstand des E. coli-Auf-

schlusses mittels Ultrafiltration in Laufpuffer (vgl. Abschnitt 3.3.4) umgepuffert und

aufkonzentriert. Zur Durchführung der Versuche werden ca. 3,5 g ABA-Adsorbens in

eine 20x1 cm Glassäule gefüllt und unter den optimierten Bedingungen mit TPP

gesättigt (Tabelle 3, Nr. 5). Nach dem Entfernen des Überschusses von TPP werden

2 mL des umgepufferten E. coli-Aufschlusses auf die Säule gegeben. Der Fluss wird

auf 1,8 mL/min gesetzt, detektiert wird photometrisch bei =254 nm. Ein

exemplarisches Chromatogramm ist in Abb. 21 dargestellt, wobei angemerkt werden


muss, dass die Aufgabe der Aufschlusslösung nicht an die Kapazität der Säule

angepasst ist.

Abb. 21: Beispielchromatogramm für die ligandvermittelte Affinitätsseparation mit TPP nach Aufgabe von 2 mL E. coli-Aufschluss. Durchlauffraktion während des Adsorptions-schrittes (1), Desorptionsfraktion (2).

Die Durchlauffraktion wird verworfen. Anschließend erfolgt die Desorption von BFD

zusammen mit TPP durch pH-Wert-Absenkung von 8,5 auf 6,0 durch den Desorptions-

puffer. Sind die Dissoziationskonstanten zwischen TPP und verschiedenen TPP-

abhängigen Enzymen klein, sollte im Idealfall BFD an TPP mit hoher Affinität und

Selektivität binden. Qualitativ wird der Aufreinigungsprozess mittels 2D-Gelelektro-

phorese beurteilt (Abb. 22).

Gel 1 in Abb. 22 zeigt den Gesamtaufschluss, Gel 2 nach der TPP-vermittelten

Affinitätsseparation. Die BFD wird als Spot bei ca. 55 kDa in beiden Gelen sichtbar, der

mit MALDI-MS nach dem tryptischen Verdau eindeutig identifiziert werden kann

(Abb. 23). Augenscheinlich hat die Komplexität des aufgegebenen E. coli-Aufschlusses

in Gel 2 abgenommen. Es kann ein Aufreinigungseffekt nachgewiesen werden. Auf

dem 2D-Gel sind nach der Aufreinigung viele Spots verschwunden. Darunter auch

diejenigen hochkonzentrierten Proteine, die sich im Gel als stark ausgeprägte Spots

um den BFD-Spot manifestieren. Trotz Abnahme der Komplexität ist auch auf diese

Weise die unspezifische Adsorption nicht vollständig unterdrückbar.


Abb. 22: 2D-Gele des Zellaufschlusses (1) (8-16 % Tris-HCl Gel), der ABA-TPP-De-sorptionsfraktion (2) (8-16 % Tris-HCl Gel) und der TPP-Desorptionsfraktion (3) (10 % Tris-HCl Gel).

Der in die Breite gezogene BFD-Spot spricht für eine Überladung des IPG-Streifens.

Um den Aufreinigungseffekt zu beurteilen, wird sowohl die Proteinkonzentration und

BFD-Aktivität im Aufschluss als auch in der Desorptionsfraktion bestimmt. Der

aufgegebene E. coli-Aufschluss besitzt eine BFD-Aktivität von 72,3 U/mL und der

Proteingehalt nach Bradford konnte zu 7,3 mg/mL bestimmt werden. Die

volumenunabhängige BFD-Aktivität beträgt daher ca. 10 U/mg. Nach der TPP-

vermittelten Affinitätsseparation beträgt die volumenunabhängige BFD-Aktivität in den

Desorptionsfraktionen 6,4 U/mg (Abb. 22, Gel 2). Das bedeutet, dass die Aktivität

durch den Prozess gesenkt wird.


Abb. 23: Beispiel zur Identifizierung von BFD in 2D-Gelen. Die Gelspots werden aus-geschnitten, tryptisch verdaut und der peptide mass fingerprint gemessen. Auf der linken Seite ist das MS-Spektrum des peptide mass fingerprints von BFD zu sehen. Rechts die nachfolgende MASCOT-Suche zeigt eine erfolgreiche Identifizierung (75 % Sequenzhomologie) von BFD an. Übereinstimmende Peptide sind in roter Farbe dargestellt.

Wird das Experiment ohne TPP-Absättigung des ABA-Adsorbens durchgeführt, ist die

volumenunabhängige BFD-Aktivität in der Desorptionsfraktion ähnlich gering. Das von

diesen Desorptionsfraktionen angefertigte Gel (Abb. 61 im Anhang) sieht Gel 2 aus

Abb. 22 sehr ähnlich.

3.3.6.5 Affinitätstrennung mit direkt immobilisiertem TPP Die Affinitätsseparation mit kovalent immobilisiertem TPP wird diskontinuierlich im

Aufschlusspuffer (Abschnitt 3.3.6.1) durchgeführt, da zur Desorption TPP eingesetzt

wird. Aufgrund der Eigenabsorption von TPP bei =254 nm ist eine Detektion mit dem

verwendeten UV/Vis-Detektor nicht möglich.

Ca. 0,5 g TPP-Adsorbens werden mit 2 mL E. coli-Aufschluss versetzt und für 30 min

leicht geschüttelt. Anschließend wird das Adsorbens dreimal mit Aufschlusspuffer

gewaschen. Mit einer 0,2 M TPP-Lösung in Aufschlusspuffer erfolgt die Desorption der

BFD. Mittels Ultrafiltration wird der Überschuss an TPP entfernt und die Protein-

konzentration sowie die BFD-Aktivität bestimmt.

Dass die dargestellte Vorgehensweise mit immobilisiertem TPP möglich ist, zeigen

Studien von Muniyappa et al. und O’Brien et al. [125, Seite 681; 129, Seite 21]. In

diesen Studien wurden Affinitätsseparationen mit TPP-funktionalisierten Trägern durch-

geführt. Nach der Adsorption TPP-abhängiger Proteine konnten diese mit TPP

kompetitiv desorbiert werden.

Das 2D-Gel der Desorptionsfraktion ist auf der rechten Seite in Abb. 23 (Gel 3)

dargestellt. Es zeigt sich, dass deutlich weniger Spots zu sehen sind als in der

Desorptionsfraktion, die durch die TPP-vermittelte Affinitätsseparation gewonnen

worden ist. Weiterhin ist die volumenunabhängige BFD-Aktivität der Desorptions-

fraktion auf 41 U/mg von ausgehend 10 U/mg deutlich gestiegen. Das entspricht einem

Aufreinigungsfaktor von 4 [130, Seite 33].


3.4 Rückschlüsse Ein durch TPP vermitteltes Affinitätsseparationsverfahren scheitert vermutlich an der

zu geringen Menge TPP, die an ABA immobilisiert werden kann. An nur 1 % aller ABA-

Gruppen kann unter den optimierten Bedingungen TPP gebunden werden. Im

Umkehrschluss sind damit zu viele ABA-Liganden frei auf der Oberfläche des Trägers

zugänglich und können zur Ausbildung unspezifischer Wechselwirkungen mit dem

Zielmolekül führen. Insbesondere der Phenylring und die negative Ladung des

Boratoms der ABA-Liganden verursachen hydrophobe und ionogene Wechsel-

wirkungen [63, Seite 74]. In Abb. 24 sind die polaren und hydrophoben Bereiche der

ABA-Liganden dargestellt.

Abb. 24: Darstellung von polaren Regionen (rot) und unpolaren Regionen (grau) im ABA-Molekül

Experimentell lässt sich die Natur der unspezifischen Wechselwirkungen durch

Separationsversuche ohne TPP-Absättigung unter schwach sauren Bedingungen

abschätzen. Dazu wird der in Abschnitt 3.3.4 beschriebene Laufpuffer verwendet,

jedoch bei einem pH-Wert von 6,9. Unter diesen Bedingungen sollte die Mehrzahl der

ABA-Liganden im trigonalen Zustand vorliegen, so dass die Boratome keine negativen

Ladungen tragen. Von den ABA-Liganden können daher keine ionogenen Wechsel-

wirkungen ausgehen und hydrophobe Effekte sollten zum Tragen kommen. Ein 2D-Gel

einer Desorptionsfraktion dieser Versuche ist in Abb. 62 im Anhang zu finden. In dem

Gel der Desorptionsfraktion befinden sich nur wenige Proteine, die als Spots

detektierbar sind. Hieraus lässt sich folgern, dass die hohen unspezifischen Wechsel-

wirkungen in erster Linie ionogener Natur sind. Ionogene Wechselwirkungen können

durch eine hohe Ionenstärke unterdrückt werden [131, Seite 74]. Eine NaCl-


Konzentration von 0,15 mM im Laufpuffer ist hierfür ausreichend. Jedoch werden durch

zu hohe Salzkonzentrationen wiederum hydrophobe Effekte verstärkt [63, Seite 74].

Allerdings sind auch hydrophobe Effekte vom pH-Wert abhängig. Beispielsweise

beobachteten Xia et al. eine höhere Kapazität von Phenyl-Sepharose zu Lysozym aus

Hühnereiern, wenn der pH-Wert von 6 auf 7,5 erhöht wird [132, Seite 231].

Singhal et al. erwähnen jedoch, dass die hydrophobe Natur von Phenylboronsäuren

wahrscheinlich das Haupthindernis für ihre Anwendung bei der Trennung von

Biomakromolekülen sei [69, Seite 307].

Dagegen ist die Affinitätsseparation mit direkt immobilisiertem TPP eine Alternative. Mit

diesem Verfahren konnte BFD aus einem E. coli-Zellaufschluss aufgereinigt werden,

wobei sich ein Aufreinigungsfaktor von 4 ergab.

Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 44 -

4 Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung

4.1 Synthetische Liganden für Glycoproteine - Stand der Wissenschaft

Im Folgenden soll ein kurzer Überblick über aktuelle Entwicklungen synthetischer

Liganden für Kohlenhydrate gegeben werden. Neben dem Einsatz in der

Affinitätsseparation ist das Ziel vieler Arbeitsgruppen, synthetische Kohlenhydrat-

liganden als Therapeutika und Diagnosewerkzeuge für die Erkennung und Behandlung

von Krankheiten einzusetzen, deren Ursache die kohlenhydratvermittelte Zell-Zell-

Erkennung ist (vgl. Abschnitt 2.1) [133, Seite 3178].

Synthetische Liganden für Kohlenhydrate fallen in das Fachgebiet der supra-

molekularen Chemie. Die Mechanismen der Wechselwirkung und die auftretenden

Bindungskräfte entsprechen denen, die in Abschnitt 2.4 dargelegt sind.

Voraussetzung für die biomimetische Kohlenhydraterkennung und -bindung durch

synthetische Liganden ist erstens eine hinreichende Größe der Liganden, die es

ermöglicht Kohlenhydrate vollständig zu umschließen. Zweitens müssen polare und

unpolare funktionelle Gruppen synthetischer Liganden so positioniert sein, dass sie

kongruent zu polaren und unpolaren Molekülregionen von Kohlenhydraten sind.

Drittens müssen die Liganden eine hinreichende Rigidität aufweisen. Das hat einerseits

entropische Gründe (vgl. Abschnitt 2.4.2), verhindert aber auch mögliche

intramolekulare Wechselwirkungen eines Liganden oder Selbstorganisation mehrerer

Liganden [133, Seite 3178-3180].

Aufgrund der komplexen Stereochemie von Kohlenhydraten müssen synthetische

Liganden hinsichtlich der Selektivität hohen Anforderungen genügen [134, Seite 3629].

Bei vielen in jüngerer Zeit beschriebenen Liganden werden zur Bindung meist

Wasserstoffbrücken ausgenutzt. Hierbei handelt es sich einerseits um Wasserstoff-

brücken zwischen Protonendonatoren und -akzeptoren, andererseits um CH- -

Wasserstoffbrücken aromatischer Molekülteile der Liganden und den CH-Protonen der

Kohlenhydrate [135, Seite 1750-1751]. Vielfach werden die Untersuchungen zur

Wechselwirkung zwischen synthetischen Liganden und Kohlenhydraten in nicht

kompetitiven Lösungsmitteln, etwa Chloroform, DMSO oder Dimethylformamid (DMF),

durchgeführt. Hierbei bilden sich oft starke Ligand-Kohlenhydrat-Komplexe aus.

Arbeitet man in wässrigen Systemen, ist ein erheblicher Abfall der Bindungsstärke zu

beobachten [133, Seite 3178]. Mazik et al. beispielsweise synthetisierten einen

acyclischen Liganden, der in Chloroform zu Glucose eine Dissoziationskonstante (1:1-

Bindung) von 8,3·10-6 M besitzt. In Wasser steigt die Konstante auf 5,0·10-1 M. Für das

Disaccharid D-Cellobiose in Wasser liegt der Wert bei 2,9·10-3 M [136, Seite 2961]. Es


gibt daher nur wenige Beispiele synthetischer Liganden, die auch in Wasser

Kohlenhydrate mit adäquaten Affinitäten binden können und zudem selektiv sind [133,

Seite 3180].

Macrocyclische Kohlenhydratliganden besitzen eine größere Rigidität. Dadurch ist der

Entropieverlust infolge der Kohlenhydratbindung niedriger und die Stärke der Bindung

größer [59, Seite 22-23]. Beispielsweise synthetisierten Ferrand et al. einen macro-

cyclischen Liganden, der D-Cellobiose mit einer Dissoziationskonstante von 1,6·10-3 M

in Wasser binden konnte. D-Lactose, ein Epimer der Cellobiose, besitzt dagegen eine

um zwei Zehnerpotenzen geringere Assoziationskonstante [137, Seite 621]. Der

Ligand hat einen „tempelartigen“ Aufbau und bietet eine Kavität für D-Cellobiose

begrenzt von polaren und unpolaren meist aromatischen Molekülregionen (Abb. 25A).

In Abb. 25B ist die komplexe Struktur des Liganden dargestellt.

Abb. 25: Schematischer Aufbau (A) und Struktur (B) des durch Ferrand et al. synthe-tisierten macrocyclischen Liganden. Beide Abbildungen sind aus [133, Seite 3185] entnommen.

Ein weiterer macrocyclischer Ligand aus der Davis-Arbeitsgruppe bindet an ein

Decapeptid, das einen Ausschnitt aus Casein Kinase II darstellt. N-Acetylglucosamin

ist o-glycosidisch an einen Serinrest des Peptids gebunden. Das Peptid konnte in

Wasser mit einer Dissoziationskonstante von 9,6·10-4 M gebunden werden. War das

Peptid nicht glycosyliert, fand keine Bindung statt [138, Seite 1778]. Für weitere

Beispiele biomimetischer Kohlenhydraterkennung durch synthetische Liganden in

Wasser sei auf aktuelle Reviews verwiesen [133, Seite 3180-3188; 139, Seite 951-955].

Jedoch sind die Dissoziationskonstanten zu groß, als dass dadurch der benötigte

on/off-Mechanismus erreicht wird. Von Lektinen ist allerdings auch bekannt, dass sie


zu Monosacchariden ebenfalls nur eine geringe Affinität mit Dissoziationskonstanten im

millimolaren Bereich besitzen [11, Seite 1594].

Bei vielen synthetischen Liganden für Kohlenhydrate wirkt sich die aufwendige

Synthese, die damit geringen Syntheseausbeuten und hohen Kosten nachteilig auf

ihren Einsatz in der Affinitätsseparation aus. Beispielsweise sind für den Liganden in

Abb. 25B acht Syntheseschritte notwendig.

4.2 Vorstellung der verwendeten Triazinliganden Die Arbeitsgruppe um Lowe entwickelte und synthetisierte acyclische Liganden auf

Triazinbasis, die ebenfalls in der Lage sind, in wässrigen Systemen mit

Kohlenhydratstrukturen zu interagieren [140, Seite 223; 141, Seite 59; 142, Seite 270;

143, Seite 96]. Diese Liganden wurden bereits in der Affinitätsseparation zur

Aufreinigung von Glycoproteinen aus synthetischen Mischungen eingesetzt. Die hier

verwendeten Liganden sind in Abb. 26 dargestellt und werden nachfolgend als TBL1

und TBL2 bezeichnet. Als NH2-TBL1 und NH2-TBL2 bezeichnete Liganden sind im

unteren Teil der Abbildung dargestellt. Die aminofunktionalisierten Derivate der

Liganden wurden synthetisiert, um sie Surface Plasmon Resonance Messungen

zugänglich zu machen. TBL1 und TBL2 werden dagegen auf Silica immobilisiert.

Abb. 26: Darstellung der in dieser Arbeit verwendeten Triazinliganden. Im unteren Teil der Abbildung ist der Triazinkern orange hinterlegt. Die Substituenten des Triazinkerns sind in roter Farbe hervorgehoben. Im Fall von NH2-TBL1 ist der Substituent Benzylamin und für NH2-TBL2 ist es 5-Aminoindan (vgl. Abschnitt 4.4). Blau hinterlegt ist der Molekülteil, an dem die Immobilisierung an das Trägermaterial erfolgt.


In den Publikationen wurden Triazinliganden bisher nur zur Affinitätsseparation

definierter Glycoproteingemische eingesetzt. Assoziationskonstanten zu GOD wurden

ebenfalls bestimmt. Immobilisiert an Sepharose ergibt sich für TBL1 ein Wert von

2,1·10-5 M. Die Dissoziationskonstante für TBL2 beträgt 2,3·10-6 M. Damit wären die

Bedingungen für den benötigten on/off-Mechanismus erfüllt [40, Seite 87]. Jedoch ist

angesichts der Strukturformeln fraglich, durch welche enthalpischen oder entropischen

Effekte diese niedrigen Bindungskonstanten zustande kommen sollen. Hinsichtlich der

Selektivität zu verschiedenen Monosacchariden konnte eine Präferenz für Mannose

festgestellt werden [140, Seite 233; 142, Seite 280].

Gegenüber anderen synthetischen Liganden für Kohlenhydrate, wie beispielsweise der

in Abb. 25B dargestellte Ligand, zeichnen sich die Triazinliganden durch eine einfache,

maximal dreistufige Synthese und kostengünstige Edukte aus. Die Liganden können

daher in größerer Menge bereitgestellt werden. Daraus resultierend kann die

Herstellung von Adsorbentien mit synthetischen Liganden kostengünstiger erfolgen.

4.3 Triazinliganden in der Affinitätsseparation Der Vorteil von Affinitätsliganden auf Triazinbasis gegenüber natürlichen Liganden, die

zum ausgewählten Wertstoff ähnliche Selektivitäten und Affinitäten haben, ist ihre hohe

chemische und mikrobiologische Stabilität. Das bedeutet, es können Desorptions-

bedingungen bzw. Cleaning-in-place- sowie Sterilisation-in-place-Methoden ange-

wendet werden, bei denen biologische Liganden ihre Funktion verlieren würden.

Zudem sind sie günstiger herzustellen, wodurch ein Upscaling effizienter wird. [144,

Seite 254; 145, Seite 307; 146, Seite 573]. Über Vor- und Nachteile von Triazin-

liganden gegenüber natürlichen Liganden kann sich im Review von Vijayalakshmi

informiert werden [41, Seite 72]. Im nachfolgenden Abschnitt wird ein kurzer Überblick

über Triazinliganden, die in der Affinitätsseparation verwendet werden, gegeben.

Reaktive Triazinfarbstoffe sind in der Lage, selektiv mit Proteinen und Enzymen zu

interagieren [147, Seite 302]. Diese Farbstoffe sind ursprünglich verwendet worden,

um Textilien zu färben [148, Seite 95]. Den Prototypen dieser Klasse von

gruppenselektiven Affinitätsliganden stellt Cibacron Blue F3GA (Abb. 27A) dar. In

frühen Studien sind mit immobilisiertem Cibacron Blue F3GA Enzyme wie

Phosphofructokinase, Glutathionreduktase und Pyruvatkinase aufgereinigt worden [149,

Seite 393]. Cibacron Blue F3GA imitiert anionische, heterocyclische Substrate wie

Nucleinsäuren, Nucleotide und Coenzyme und passt in die Bindungstasche

entsprechender Enzyme [146, Seite 563].


Abb. 27: Strukturformel von Cibacron Blue F3GA (A); optimierte Struktur von Cibacron Blue F3GA als Ligand für alkalische Phosphatase (B) und Pferdeleber-Alkohol-dehydrogenase (C). Rot hinterlegt sind bei (B) und (C) die strukturellen Änderungen gegenüber Cibacron Blue F3GA. Blau hinterlegt ist der Molekülteil, an dem die Immobilisierung erfolgt.

Neben Cibacron Blue F3GA finden weitere Triazinfarbstoffe wie Procion Blue MX-R

oder Procion Red HE3B Verwendung für Proteinabtrennungen [150, Seite 151; 151,

Seite 195]. Cibacron Blue F3GA stellt also nur einen Vertreter der Triazinfarbstoffe dar,

von denen die meisten mit bestimmten Enzymen interagieren können [152, Seite 51].

Die Fähigkeit von Triazinfarbstoffen, bestimmte Substrate oder Cofaktoren von

Enzymen zu imitieren, ist eine zufällig gefundene Eigenschaft [153, Seite 118]. Um

höhere Affinitäten zu erzielen, wurden einige Triazinfarbstoffe strukturell optimiert. Das

Ziel ist, die Moleküle hinsichtlich ihrer sterischen und polaren Eigenschaften für die

Bindungstasche der Enzyme besser zugänglich zu machen. Hierfür wurden

wissensbasierte Ansätze durchgeführt, bei denen Strukturdaten, insbesondere NMR-

und röntgenkristallographische Daten, von Enzym-Cofaktor-Komplexen ausgewertet

wurden. Man spricht von der ersten Generation biomimetischer Farbstoffe [154, Seite

34]. Cibacron Blue F3GA ist zum Beispiel durch Austausch eines Sulfonat-Restes

durch einen Methylenphosphonat-Rest verändert worden (Abb. 27B). Durch diesen

Liganden wurde alkalische Phosphatase aus der Darmschleimhaut von Kälbern

aufgereinigt. Dabei konnte ein Aufreinigungsfaktor von 330 erzielt werden [155, Seite

237]. Demgegenüber erreicht unverändertes Cibacron Blue F3GA einen

Aufreinigungsfaktor von 20 [156, Seite 108]. In Abb. 27C ist ein veränderter Cibacron

Blue F3GA-Ligand dargestellt, der immobilisiert an Agarose, effektiv Pferdeleber-

Alkoholdehydrogenase aus Rohextrakten binden kann [153, Seite 118]. Hier wurde ein

kurzer Spacer eingebaut und die Sulfonat- durch eine Carboxygruppe ersetzt.


Zur Entwicklung der zweiten Generation biomimetischer Triazinliganden werden

Methoden aus der kombinatorischen Chemie und Molecular Modeling eingesetzt [144,

Seite 248-253; 154, Seite 37]. Dabei werden Liganden entwickelt, deren Einsatz-

spektrum über die Aufreinigung von Enzymen hinausgeht. Beispielsweise sind die in

Abschnitt 4.1 vorgestellten glycoselektiven Triazinliganden solche Neuentwicklungen.

Andere Beispiele stammen insbesondere aus den Arbeitsgruppen von Lowe und

Clonis/Labrou. Als Ersatz für die Liganden Protein A und Protein L wurden

synthetische Triazinliganden entwickelt, die jedoch großtechnisch noch nicht zum

Einsatz kommen. In der Biotechnologie werden weiterhin Protein A und Protein L zur

Aufreinigung von Immunglobulinen verwendet. Der synthetische Ligand für humanes

Immunglobulin G (IgG) hat eine Assoziationskonstante von 1,4·105 M-1 zu humanem

IgG. Angewendet auf humanes Blutplasma reinigt er IgG mit Reinheiten von 98-99 %

in einem Schritt auf [157, Seite 73; 158, Seite 12]. Jedoch werden gleiche Reinheiten

auch mit Protein A erzielt, dessen Assoziationskonstanten zu humanem IgG im Bereich

von 4,0·107-2,0·108 M-1 liegen [159, Seite 75]. Ein weiteres Beispiel ist ein Ligand für

den monoklonalen anti-HIV Antikörper 4E10. Die Assoziationskonstante des

Antikörper-Ligand-Komplexes beträgt 2,4·106 M. Angewendet auf polyphenolfreie

Rohextrakte aus Blättern von transgenen Tabakpflanzen, in denen der Ligand

exprimiert wurde, konnte der Antikörper mit 95 % Reinheit gewonnen werden [160,

Seite 423]. Beide Beispiele sind in Abb. 28 dargestellt.

Abb. 28: Strukturformeln der triazinbasierten Liganden für humanes IgG (A) und für den monoklonalen anti-HIV Antikörper 4E10 (B). Blau hinterlegt ist der Molekülteil, an dem die Anbindung an das Trägermaterial erfolgt.

Weitere Beispiele und eine detaillierte Beschreibung der Vorgehensweise bei der

Generierung synthetischer Liganden mit Fokus auf triazinbasierte Liganden können

dem Review von Clonis entnommen werden [161, Seite 9-17].


4.4 Synthese der Triazinliganden Triazine sind sechsgliedrige aromatische Heterocyclen. Man spricht von 1,3,5-

Triazinen oder s-Triazinen (s = symetrisch), wenn das Molekül aus drei alternierend

angeordneten Stickstoff- und drei Kohlenstoffatomen besteht [162, Seite 9507].

Ein Derivat des 1,3,5-Triazins ist das 2,4,6-Trichloro-1,3,5-triazin. Die Chloratome

lassen sich durch nucleophile Verbindungen im Rahmen einer nucleophilen

aromatischen Substitutionsreaktion austauschen [163, Seite 1090-1091]. Auffallend ist,

dass die Substitution der Chloratome stufenweise durch Temperatursteuerung erfolgen

kann [162, Seite 9508; 164, Seite 252]. In Abb. 29 ist das allgemeine Reaktionsschema

dargestellt.

Abb. 29: Temperaturgesteuerte, nucleophile Substitution der Chloratome durch Amino-gruppen.

Die stufenweise Substituierbarkeit der Chloratome im 2,4,6-Trichloro-1,3,5-triazin

beruht auf zwei Effekten. Erstens: Bei einer nucleophilen aromatischen Substitution

läuft die Reaktion über so genannte Meisenheimer-Komplex-analoge Zwischenstufen

ab [164, Seite 250-251]. Werden nun die Chloratome schrittweise substituiert, nimmt

die Stabilität der Zwischenstufe ab. Das heißt, die stabilste Zwischenstufe liegt bei der

Substitution des ersten Chloratoms vor, aufgrund der -I-Effekte der zwei verbleibenden

Cl-Atome. Zweitens: Der nach der Reaktion vorliegende NH-R-Substituent ist nicht wie

die Cl-Atome in der Lage, die Meisenheimer-Komplex-analoge Zwischenstufe zu

stabilisieren [164, Seite 252; 165, Seite 517].

4.4.1 Synthese von TBL1 und TBL2 Die Synthese der Affinitätsliganden TBL1 und TBL2 (Abb. 26 oben) erfolgt in An-

lehnung an das von Gupta et al. und Palanisamy et al. entwickelte Protokoll [140, Seite

220; 142, Seite 267].

Von 1,3,5-Trichloro-2,4,6-triazin (TBL1: 0,68 g, 3,6 mmol; TBL2: 0,50 g, 2,7 mmol) wird

eine Lösung in Aceton (TBL1: 14 mL; TBL2: 5 mL) hergestellt und mittels Eisbad auf

0 °C heruntergekühlt. Anschließend wird der Substituent tropfenweise zur Triazin-

lösung gegeben (Benzylamin für TBL1: 0,80 mL, 7,3 mmol und 5-Aminindan für TBL2:

0,73 g, 5,5 mmol in je 10 mL Aceton/Wasser (1:1, v/v) sowie ein equimolarer Gehalt an

Natriumhydrogencarbonat). Nach 10 min wird das Eisbad entfernt und die Lösung über


Nacht bei Raumtemperatur weitergerührt. Mittels Dünnschichtchromatographie (DC)

wird überprüft, ob das gesamte 1,3,5-Trichloro-2,4,6-triazin abreagiert ist (Kieselgel 60

F254 DC-Platten (Merck, Darmstadt, Deutschland), Laufmittel Hexan:Ethylacetat (6:1,

v/v), =254 nm). Zu den Lösungen wird je 50 mL deionisiertes Wasser gegeben und

die Präzipitate über eine Glasfritte (Porengröße 2) unter reduziertem Druck abgesaugt,

mit reichlich Wasser gewaschen und bei 60 °C und 50 mbar im Vakuumtrockenschrank

für 6 h getrocknet. Die Reinheit und Authentizität der bisubstituierten Triazinliganden

N,N'-Dibenzyl-6-chloro-1,3,5-triazin-2,4-diamin (TBL1) und 6-Chloro-N,N’-(di-2,3-di-

hydroinden-5-yl)-1,3,5-triazin-2,4-diamin (TBL2) wird mittels DC (Laufmittel

Hexan:Ethylacetat (6:1, v/v), =254 nm), NMR (Nuclear Magnetic Resonance) und

ESI-MS (Electrospray Ionization Mass Spectrometry) bestimmt.

Die Ausbeute beträgt für beide Verbindungen, bezogen auf die eingesetzte Menge an

1,3,5-Trichloro-2,4,6-triazin, ca. 90 %. Der Rf-Wert von TBL1 ist mit 0,70 und von TBL2

0,38 bestimmt worden. Die chemischen Verschiebungen des 1H-NMR-Spektrums in

DMSO-D6 von TBL1 können wie folgt zugeordnet werden. 4,59 ppm (s, 4H CH2

Benzylamin), 7,28 ppm (breites s, 10H, CH aromatisch). Das ESI-MS-Spektrum für

TBL1 zeigt einen Hauptpeak bei 326,1 amu [M+H]+ (berechnet 326,1 amu). Für TBL2

zeigt sich folgendes Bild. 1H-NMR in CDCl3: 2,09 ppm (quint, 4H, CH2 aliphatisch),

2,89 ppm (t, 8H, CH2 aliphatisch), 7,16 ppm (d, 2H, CH aromatisch), 7,24 ppm (d, 2H,

CH aromatisch) und 7,40 ppm (s, 2H, CH aromatisch). Das ESI-MS-Spektrum zeigt

den zu erwartenden Molekülpeak bei 378,2 [M+H]+ (berechnet 378,1). Zusätzlich zu

den 1H-NMR- und ESI-MS-Spektren befinden sich 13C-NMR-Spektren im Anhang

(Abb. 63: ESI-MS TBL1, Abb. 67: 1H-NMR TBL1, Abb. 71 13C-NMR TBL1; Abb. 64:

ESI-MS TBL2, Abb. 68: 1H-NMR TBL2, Abb. 72: 13C-NMR TBL2).

4.4.2 Synthese von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 Um die Liganden für SPR-Messungen zugänglich zu machen und sie auf Adsorbens-

bzw. Sensoroberflächen zu immobilisieren, ist die Einführung einer primären Amino-

gruppe notwendig. Eine direkte Substitution des verbliebenen Chloratoms mit

Ammoniak ist schwierig und erfordert harsche Reaktionsbedingungen [166, Seite 2005].

Die Alternative ist die Substitution mit Ethylendiamin, wobei Ethylendiamin auch als

kurzer Spacer fungiert. Dieser Umstand sollte sich insbesondere auf den

Immobilisierungsprozess positiv auswirken, da die primäre Aminogruppe nicht direkt

am Liganden sitzt und sterisch besser zugänglich ist. Durch den Einsatz eines großen

Überschusses an Ethylendiamin im Reaktionsansatz wird die Substitution beider

Aminogruppen von Ethylendiamin durch die Liganden verhindert.

Die Durchführung der Synthese erfolgt in Anlehnung an Li et al. [167, Seite 194]. Dazu

werden TBL1 (0,70 g, 2,1 mmol) oder TBL2 (0,6 g, 1,6 mmol) in je 75 mL Toluol


suspendiert. Zu den Suspensionen, die auf 100 °C temperiert werden, wird ein

Überschuss an Ethylendiamin unter starkem Rühren pipettiert (NH2-TBL1: 2,2 mL,

33 mmol; NH2-TBL2: 1,6 mL, 24 mmol). Die Reaktionsansätze werden über Nacht

weiter bei 100 °C gerührt und anschließend mittels DC (Laufmittel Hexan:Ethylacetat

(6:1, v/v), =254 nm) auf das Vorhandensein von TBL1 und TBL2 überprüft. Das Toluol

wird unter Vakuum am Rotationsverdampfer bei 40 °C entfernt und die Rückstände in

Methanol:5 M HCl (95:5, v/v) aufgenommen. Diese Suspensionen werden erneut bis

zur Trockene eingeengt und anschließend wird aus demselben Lösungsmittelgemisch

umkristallisiert. Die Reaktionsprodukte, N2-(2-Aminoethyl)-N4,N6-dibenzyl-1,3,5-triazin-

2,4,6-triamin (NH2-TBL1) und N2-(2-Aminoethyl)-N4,N6-(di-2,3-dihydroinden-5-yl)-1,3,5-

triazin-2,4,6-triamin (NH2-TBL2) werden bei 60 °C und 50 mbar getrocknet (Abb. 26

oben). Durch die Umkristallisation aus einem Methanol-Salzsäuregemisch werden die

Liganden als Hydrochloride isoliert. Die Reinheit und Authentizität wird mittels DC (2-

fache Entwicklung der DC-Platte, Laufmittel: 1. Hexan:Ethylacetat (6:1, v/v), =254 nm;

2. Methanol:Chloroform:Essigsäure (8:4:0,5 v/v/v), 254 nm und Ninhydrin als Sprüh-

reagenz) sowie NMR und ESI-MS überprüft.

Die Ausbeute für NH2-TBL1 liegt bei ca. 55 %, die für NH2-TBL2 bei ca. 67 % bezogen

auf TBL1 und TBL2. Der Rf-Wert von NH2-TBL1 ist 0,38, der für NH2-TBL2 beträgt 0,40.

Im Dünnschichtchromatogramm konnte kein Ethylendiamin mehr nachgewiesen

werden. Die chemischen Verschiebungen des 1H-NMR-Spektrums in DMSO-D6 von

NH2-TBL1 können wie folgt zugeordnet werden. 2,98 ppm (d, 2H, CH2 Ethylendiamin),

3,60 ppm (breites s, 2H, CH2 Ethylendiamin), 4,53 ppm (s, 4H CH2 Benzylamin) und

7,19-7,45 ppm (m, 10H, CH aromatisch). Im ESI-MS-Spektrum für NH2-TBL1 zeigt sich

ein Hauptpeak bei 350,3 amu [M+H]+ (berechnet 350,2 amu). Im Gegensatz dazu

werden die chemischen Verschiebungen des 1H-NMR-Spektrums in DMSO-D6 von

NH2-TBL2 wie folgt zugeordnet. 2,02 ppm (quint, 4H, CH2), 2,84 ppm (breites s, 8H,

CH2), 3,11 ppm (s, 2H, CH2 Ethylendiamin), 3,67 ppm (s, 2H, CH2 Ethylendiamin),

7,20 ppm (breites s, 2H, CH aromatisch), 7,38 ppm (breites s, 2H, CH aromatisch) und

7,49 ppm (breites s, 2H, CH aromatisch). ESI-MS für NH2-TBL2 zeigt einen Hauptpeak

bei 402,4 amu [M+H]+ (berechnet 402,2 amu). Neben den 1H-NMR- und ESI-MS-

Spektren befinden sich 13C-NMR-Spektren im Anhang (Abb. 65: ESI-MS NH2-TBL1,

Abb. 69: 1H-NMR NH2-TBL1, Abb. 73: 13C-NMR NH2-TBL1; Abb. 66: ESI-MS NH2-

TBL2, Abb. 70: 1H-NMR NH2-TBL2, Abb. 74: 13C-NMR NH2-TBL2).

4.5 Grundlagen der Surface Plasmon Resonance und Funktionsweise des Biacore 3000

Um die Interaktionen der synthetischen Liganden mit verschiedenen Glycoproteinen zu

untersuchen und optimierte Trennbedingungen zu finden, werden Surface Plasmon


Resonance Messungen (SPR, dt. Oberflächenplasmonresonanz) durchgeführt. Diese

Methode erlaubt es, biomolekulare Wechselwirkungen zwischen einem auf einer

Sensoroberfläche immobilisierten und einem frei in Lösung befindlichen Bindungs-

partner in Echtzeit zu untersuchen. Es handelt sich bei der SPR um eine Biosensor-

technologie, die kein Labeling des immobilisierten Bindungspartners benötigt. Obwohl

das Auftreten von Oberflächenplasmonen von Wood 1912 bereits beschrieben werden

konnte und später zur Charakterisierung dünner Schichten diente, konstruierten erst

1983 Nylander und Liedberg Biosensoren auf Grundlage dieses Effektes [168, Seite

35].

Im Folgenden soll das Messprinzip näher beleuchtet werden. In einem Metall können

sich Leitungselektronen wie die Teilchen in einem Gas oder einer Flüssigkeit frei

bewegen, wobei die Elektronen in ihrer Gesamtheit als Plasma bezeichnet werden. Als

Plasmaschwingung wird die kollektive, longitudinale Anregung des Leitungselektronen-

gases gegen die Atomrümpfe bezeichnet, wobei ein Plasmon ein Quant dieser

Plasmaschwingung ist. Plasmone lassen sich in Volumen- und Oberflächenplasmone

unterscheiden. Bei Volumenplasmonen handelt es sich ausschließlich um longitudinale

Plasmaschwingungen, während Oberflächenplasmone auch einen transversalen

Schwingungsanteil besitzen [169, Seite 299-301; 170, Seite 826]. Die Anregung von

Plasmonen in einer dünnen Metallschicht kann durch Elektronen, die durch die Metall-

schicht transmittieren, erfolgen. Weiterhin kann die Anregung auch durch Photonen

oder Elektronen eintreten, die von der Metallschicht reflektiert werden [169, Seite 299-

301].

Die Anregung der Oberflächenplasmonwellen durch Photonen ist nur an Grenzflächen

zwischen einer dünnen Metallschicht und einem Dielektrikum (die zu vermessende

Lösung) möglich, bei der es zu einer Resonanzkopplung von Leitungselektronen und

Licht kommen muss. Jedoch kann zur Anregung der Oberflächenplasmonwellen die

Metalloberfläche nicht einfach mit Licht bestrahlt werden [168, Seite 36; 171, Seite 214].

Die Anregung kann durch einen von Kretschmann entwickelten Prismenkoppler

erreicht werden, wobei das Prisma direkt auf der dünnen Metallschicht aufliegt [172,

Seite 2135-2136]. Nach diesem Prinzip arbeitet auch das verwendete Biacore 3000

(GE Healthcare, Uppsala, Schweden). Hierbei wird der Effekt der abgeschwächten

Totalreflektion (attenuated total reflection, ATR) ausgenutzt. An der Grenzfläche

zwischen Prisma und Metallschicht wird das Licht totalreflektiert. Dabei bildet sich an

der Grenzfläche eine evaneszente, elektromagnetische Welle aus, welche in die

Metallschicht penetriert. Unter Resonanzbedingungen entstehen an der Grenzfläche

zum Dielektrikum Oberflächenplasmone. Die Resonanzbedingung ist bei einem

bestimmten Resonanzwinkel des eingestrahlten Lichtes erfüllt. Dies ist dann der Fall,


wenn Energie und Richtung der Komponente des Lichtvektors, die parallel zur Metall-

schicht verläuft, mit der Anregungsenergie und Richtung des Verlaufs der Oberflächen-

plasmonenwelle übereinstimmt. In diesem Fall wird Energie übertragen und ein

Minimum an Lichtenergie reflektiert und detektiert. Grafisch dargestellt ist die

Resonanzbedingung in Abb. 30B.

Abb. 30: Vereinfachte Darstellung der Resonanzbedingung. Keine Resonanz findet statt, wenn die Komponente des Lichtvektors, die parallel zur Metallschicht verläuft, hin-sichtlich Energie und Richtung mit der Anregungsenergie und Richtung des Verlaufs der Oberflächenplasmonenwelle übereinstimmt (A). Dagegen ist in (B) die Resonanz-bedingung erfüllt. Die Oberflächenplasmonenwelle erzeugt ein elektromagnetisches Feld, das einige

100 nm in das umgebende Medium hineinreicht. Die Resonanzbedingungen und damit

der Wert des Resonanzwinkels hängen direkt vom Brechungsindex des Dielektrikums

ab [171, Seite 219]. Adsorptions- und Desorptionsprozesse an der Sensoroberfläche

führen zur lokalen Änderung des Brechungsindexes und somit zur Verschiebung des

Resonanzwinkels [168, Seite 38]. Dabei entspricht eine Resonanzwinkeländerung von

0,1° einer Änderung der Oberflächenbeladung von ca. 1 ng/mm2 [173, Seite 26-27]

Diese Korrelation ist bis zu einer Oberflächenbeladung von 50 ng/mm2 linear [174,

Seite 523]. Beim verwendeten Biacore 3000 (GE Healthcare, Uppsala, Schweden) wird

die Winkeländerung in Resonanzeinheiten (Resonance Units, RU) ausgedrückt, wobei

eine Winkeländerung von 0,1° 1000 RU entspricht.

Der Aufbau eines SPR-Gerätes mit Prismenkoppler ist in Abb. 31A erläutert. Nach

diesem Aufbau arbeitet auch das Biacore 3000. Hierbei wird nahinfrarotes Licht einer

LED keilförmig auf die Sensoroberfläche geleitet. Das Licht trifft dadurch in einem breit

gefächerten Winkelbereich auf die Oberfläche. Das reflektierte Licht wird durch ein

Anordnung lichtsensitiver Dioden erfasst, die Winkeländerungen von 10-5° auflösen

können [175, Seite 22]. Als Metallschicht wird Gold verwendet, welches auf einem

Glasträger dünn aufgebracht und dem Biacore 3000 in Form austauschbarer

Sensorchips zugeführt wird. Auf der Goldoberfläche, die in Kontakt mit der zu

untersuchenden Lösung steht, werden die Liganden immobilisiert. Ändert sich der

Brechungsindex der Lösung, ändert sich der Resonanzwinkel (Abb. 31B). Als


Resonanzsignal gegen die Zeit aufgetragen, ergibt sich dann das sogenannte

Sensorgramm (Abb. 31C).

Abb. 31: Schematischer Aufbau eines SPR-Biosensors mit Prismenkoppler (A). Ändert sich der Brechungsindex der Lösung im Fließkanal, ändert sich der Resonanzwinkel (B), Wird die Änderung des Resonanzwinkels, ausgedrückt in Resonanzeinheiten, in Abhän-gigkeit von der Zeit graphisch dargestellt, erhält man das Sensorgramm (C). Sche-matische Darstellung des optischen Systems des Biacore 3000 (D, C) [175, Seite 19-22].

In Abb. 31D ist der schematische Aufbau des optischen Systems im Biacore 3000

aufgezeigt. In der optischen Einheit befinden sich die Lichtquelle, das Prisma und der

Detektor. Dem schließt sich das optische Interface an. Es besteht aus Silicon und

bewirkt eine gute optische Kopplung zwischen Prisma und dem Glasträger des

Sensorchips [175, Seite 2-11]. Zwischen der Goldschicht des Sensorchips und der IFC

(Integrated -Fluidic Cartridge) befinden sich bei eingesetztem Chip vier separate

Flusszellen (Abb. 31E).


In dieser Arbeit wurden CM5- und C1-Sensorchips verwendet. Beim CM5-Chip ist die

Oberfläche mit einer Schicht aus unverzweigtem carboxymethylierten Dextran bedeckt,

die ca. 100 nm dick ist. Bei Dextran handelt es sich um ein aus carboxymethylierten

Glucose-Monomeren aufgebautes Polysaccharid. Die Dextranschicht bietet eine

hydrophile Oberfläche. Im Gegensatz dazu ist die Goldoberfläche beim C1-Chip direkt

carboxyliert [176, Seite 19.13.4].

Abb. 32: Zusammenhang zwischen der SPR und der Affinitätsseparation. Im oberen Teil der Abbildung sind die Schritte der Affinitätsseparation dargestellt. Im Sensorgramm sind die Schritte grau hinterlegt. Adsorption (1), Waschen (2), Desorption (3) und Regeneration (4).

Vorteilhaft bei der Verwendung der SPR-Technik zur Entwicklung von Affinitätstrenn-

verfahren ist die geringe Ligandenmenge, die zur Immobilisierung benötigt wird.

Ebenfalls ist weniger Probenmaterial notwendig und der Verbrauch an Laufpuffern,

Wasch- und Desorptionslösungen fällt geringer aus. Den Zusammenhang zwischen

der SPR-Technik und der Affinitätsseparation verdeutlicht Abb. 32.


4.6 Immobilisierungen

4.6.1 Immobilisierung von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 auf Sensorchips Die Immobilisierung von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 erfolgt auf CM5- und C1-Chips.

Hiefür wird das Amin-Coupling-Kit von GE Healthcare verwendet, das für die

Immobilisierung die notwendigen Chemikalien 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbo-

diimidhydrochlorid (EDC), N-Hydroxysuccinimid (NHS) und Ethanolaminhydrochlorid

(1,0 M, pH 8,5) enthält. Von EDC und NHS werden Lösungen in Reinstwasser von je

0,4 M bzw. 0,1 M angesetzt. Je ca. 1,5 mg werden von NH2-TBL1 bzw. NH2-TBL2

eingewogen, in 100 µL DMSO gelöst und anschließend mit 900 µL Acetatpuffer

(10 mM, pH 5,0) verdünnt. Diese Lösungen können direkt in das Biacore 3000 injiziert

werden. Für einige Versuche erfolgt auch eine Verdünnung mit DMSO/Acetatpuffer

(1:9, v/v).

Während der Immobilisierung ist ein Fluss von 5 µL/min verwendet worden. Zur

Aktivierung der Carboxygruppen werden die Lösungen von EDC und NHS im

Verhältnis von 1 zu 1 gemischt und danach injiziert. Über das Injektionsvolumen kann

der Aktivierungsgrad der Oberfläche und somit auch die Immobilisierungsausbeute

gesteuert werden. Anschließend erfolgt die Aufgabe der Ligand-Lösungen in 3-10 µL-

Impulsen. Die Chipoberfläche wird danach mit 5 µL einer Ethanol/Wasser-Mischung

(7:3, v/v) und 70 %igem Ethanol gewaschen, um ungebundene Liganden zu entfernen.

Zur Deaktivierung verbliebener aktivierter Carboxygruppen auf der Oberfläche werden

50 µL einer 1 M Ethanolamin-Lösung injiziert. Mit HBS-N-Puffer (0,01 M 2-[4-(2-

hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethansulfonsäure (HEPES), 0,15 M NaCl, pH 7,4;

GE Healthcare) ist anschließend die Chipoberfläche für einige Stunden gespült worden

[177, Seite 1527].

Die Anzahl der Publikationen von SPR-Anwendungen, die sich mit der Immobilisierung

kleiner Moleküle als Liganden befasst, ist niedrig. In der Regel werden

Biomakromoleküle immobilisiert. Einen Überblick über aktuelle Anwendungen bietet

der Review von Homola [178, Seite 475-489].

Damit kleine Moleküle mittels der Amin-Coupling-Methode direkt auf CM5- oder C1-

Chips immobilisiert werden können, benötigen sie eine Amino- oder Thiolfunktion. Sind

diese Funktionen bereits nativ im Molekül enthalten, dürfen sie sich nicht in der

Bindungsregion befinden, mit der die Interaktion zum Zielmolekül stattfindet. Ist keine

Amino- oder Thiolfunktion enthalten, müssen diese chemisch am Molekül eingeführt

werden, wie es bei den verwendeten Liganden NH2-TBL1 und NH2-TBL2 durch

Ethylendiamin geschehen ist. In der Literatur finden sich ähnliche Vorgehensweisen.

Cannon et al. beispielsweise modifizierten Cobalamin (Vitamin B12) mit Diaminopentan,

um es anschließend auf CM5-Chips zu immobilisieren [179, Seite 4]. Weitere Beispiele


zur Darstellung aminofunktionalisierter Liganden, die speziell für die Immobilisierung

mittels Amin-Coupling auf CM5-Chips synthetisiert wurden, finden sich bei

Samsonova et al. und Svedham et al. [180, Seite 978; 181, Seite 191].

Der Reaktionsmechanismus der Immobilisierung von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 ist in

Abb. 33 dargestellt.

Abb. 33: Reaktionsmechanismus der Aktivierung gefolgt von der Immobilisierung der Triazinliganden auf einer CM5-Chipoberfläche (R = Dextranmatrix). Nach der Reaktion mit EDC und NHS bildet sich ein aktivierter NHS-Ester aus, der in der Lage ist, mit den synthetischen Liganden unter Ausbildung einer Carbonsäureamid-Gruppe zu reagieren.

Aufgrund der geringen Wasserlöslichkeit der Triazinliganden, die nach der Synthese

als Hydrochloride isoliert werden, müssen diese zunächst in einem geeigneten

organischen Solvens gelöst werden. Es wird DMSO verwendet, da es sich als

Lösungsmittel für organische Salze besonders gut eignet [182, Seite 155].

Anschließend muss der DMSO-Gehalt mit Acetatpuffer auf 10 % eingestellt werden,

höhere Gehalte können das Flusssystem des Biacore 3000 beschädigen.

In einem Vorversuch ist bestimmt worden, ob DMSO die Immobilisierung stört. Dazu

wird über die aktivierte Chipoberfläche ein DMSO-Acetatpuffer-Gemisch ohne

Liganden injiziert. Es konnte keine Änderung des Resonanzsignals festgestellt werden.

Auch die Immobilisierung der Liganden war anschließend noch möglich (vgl. Abb. 76

im Anhang).

In einem zweiten Vorversuch ist das Verhalten beider Liganden gegenüber der

nichtaktivierten CM5-Chipoberfläche untersucht worden. Da die Liganden als Hydro-

chloride vorliegen, sollte eine effektive Vorkonzentrierung auf der Chipoberfläche statt-

finden. Die protonierten und damit positiv geladenen Aminogruppen der Liganden

lagern sich hierbei an die negativ geladenen Carboxygruppen der Dextranmatrix an

und erhöhen so die Effektivität und Ausbeute der Amin-Coupling-Methode [176, Seite

19.13.5]. Abb. 77 im Anhang zeigt, dass die gewünschte Vorkonzentrierung auf der

Chipoberfläche erfolgt. Nach einem kurzen Impuls steigt das Resonanzsignal bei NH2-

TBL1 um ca. 400 RU an, während es bei NH2-TBL2 ca. 50 RU sind.

Ein exemplarisches Sensorgramm für die Immobilisierung von NH2-TBL1 und

NH2-TBL2 ist in Abb. 34 dargestellt. Nach der Aktivierung sollte das Resonanzsignal

um ca. 200 bis 300 RU gestiegen sein, wobei etwa 40 % aller Carboxygruppen aktiviert

werden [173, Seite 40; 183, Seite 272]. In Abhängigkeit der Konzentration der


injizierten Ligand-Lösungen und des Injektionsvolumens kann die Belegung der

Chipoberfläche gesteuert werden.

Abb. 34: Immobilisierung von NH2-TBL1 (A) und NH2-TBL2 (B) auf CM5-Sensorchips. Der obere Teil der Abbildung von A und B zeigt bezüglich der Ordinatenachse das gesamte Sensorgramm, während der untere Teil der Abbildung den Bereich zwischen 21000 und 27000 RU vergrößert darstellt. Experimentelle Bedingungen zu A: (1) Aktivierung, (2) NH2-TBL1-Injektion (7 µL, 2,2 mg/mL), (3) Ethanolamin-Injektion (50 µL), (4) Ethanol-Injektion (70 %, 2x5 µL), (5) Ethanolamin-Injektion (25 µL). Experimentelle Bedingungen zu B: (1) Aktivierung, (2) NH2-TBL2-Injektion (3 µL, 0,2 mg/mL), (3) Ethanolamin-Injektion (50 µL), (4) Ethanol-Injektion (70 %, 5 µL). Der Doppelpfeil in (B) zeigt graphisch die Immobi-lisierungsausbeute an.

Aus Abb. 34 geht hervor, dass die Immobilisierung beider Liganden auf der Dextran-

matrix der CM5-Sensorchips erfolgreich verläuft, da das Resonanzsignal am Ende des

Immobilisierungsprozesses höher ist als zu Beginn. In der Abb. 34B ist dies durch den

Doppelpfeil kenntlich gemacht worden. Nach Abschluss der Ethanolamin-Injektion ist


das Resonanzsignal größer als zu Beginn der Immobilisierung, infolge der

Massenzunahme auf der Chipoberfläche durch die immobilisierten Liganden. Einen

Überblick zu den in dieser Arbeit durchgeführten Immobilisierungen liefert Tabelle 4.

Tabelle 4: Immobilisierungsexperimente von NH2-TBL1 und NH2-TBL2. Die Differenz der Resonanzsignale wird nach 10 min bestimmt, nachdem die Injektion von Ethanol oder Ethanolamin abgeschlossen ist.

Nr. Ligand Aktivierungs-

ausbeute [RU]

Konzentration Ligand

[mg/mL]

Kontakt-zeit

[min]

Immobilisierungs-ausbeute

[RU]

Oberflächen-belegung [µmol/m2]

1 NH2-TBL2 190 1,9 6 3599 9,00

2 NH2-TBL2 220 0,19 1 2239 5,57

3 NH2-TBL2 104 0,19 0,6 1629 4,05

4 NH2-TBL2 170 0,38 0,6 1634 4,06

5 NH2-TBL2 42 0,011 2,2 26 0,06

6 NH2-TBL2 116 0,015 3,5 88 0,21

7 NH2-TBL2 233 0,015 5 185 0,46

8 NH2-TBL2 (C1-Chip)

346 0,025 2 214 0,53

9 NH2-TBL1 177 0,062 1,4 100 0,28

10 NH2-TBL1 296 2,2 1 57 0,16

Aus der Immobilisierungsausbeute wird die Oberflächenbelegung auf der Chip-

oberfläche berechnet. Zur Berechnung wird davon ausgegangen, dass ein Anstieg des

Resonanzsignals um 1 RU einer Massenzunahme auf der Oberfläche von 1 pg/mm2

entspricht. Daraus berechnet sich die Oberflächenbelegung AO in µmol/m2 nach

folgender Formel [173, Seite 27].

LigandO M

alanstiegsonanzsignReA (7)

MLigand Molare Masse der Liganden [g/mol]

Unter den gewählten experimentellen Bedingungen zeigt NH2-TBL2 gegenüber NH2-

TBL1 ein besseres Immobilisierungsverhalten. Grundsätzlich lässt sich festhalten, dass

durch Verwendung konzentrierter Ligand-Lösungen und langen Kontaktzeiten eine

höhere Oberflächenbelegung von NH2-TBL2 erreicht werden kann. Beispielsweise in

Experiment-Nr. 4 (Tabelle 4) konnten 1634 RU immobilisiert werden, was einer

Oberflächenbelegung von 4,1 µmol/m2 entspricht. Eine signifikant geringere Belegung

wird erreicht, wenn die Ligandenkonzentration um eine Zehnerpotenz niedriger ist. In


Experiment-Nr. 6 (Tabelle 4) konnte eine Signaldifferenz von 88 RU ermittelt werden.

Das entspricht einer Oberflächenbelegung von ca. 0,2 µmol/m2.

Ein anderes Bild zeichnet sich ab, wenn NH2-TBL1 auf einem CM5-Chip immobilisiert

werden soll. Nach der Immobilisierung von NH2-TBL1 lässt sich der Großteil des

Liganden wieder von der Oberfläche waschen und nur ein kleiner Teil verbleibt auf

dieser. Es konnte zwar eine Vorkonzentrierung von NH2-TBL1 auf der nicht-aktivierten

Dextranoberfläche beobachtet werden, diese kann jedoch nicht auf die

Wechselwirkung zwischen der geladenen Amino- und Carboxygruppe zurückgeführt

werden. Möglicherweise beruht die Vorkonzentrierung auf der Oberfläche auf einer

glycospezifischen Interaktion zwischen den carboxymethylierten Glucosemolekülen

des Dextrans und von NH2-TBL1. Gupta et al. berichten auch von einer Affinität zu

Glucose [140, Seite 218].

Des Weiteren ist die Oberflächenbelegung im Gegensatz zu NH2-TBL2 unabhängig

von der Konzentration der injizierten Ligand-Lösung. Wird eine niedrig konzentrierte

Lösung injiziert, kann ein Wert für die Oberflächenbelegung von 0,28 µmol/m2

bestimmt werden (Nr. 9, Tabelle 4). Durch Verwendung einer 35mal höher

konzentrierten Lösung war es nicht möglich, diesen Wert deutlich zu steigern. Hier

wurde ein Wert von 0,16 µmol/m2 bestimmt (Nr. 10, Tabelle 4).

Um die Plausibilität der experimentellen Ergebnisse der Oberflächenbelegung zu

überprüfen, werden diese mit einem berechneten Wert verglichen. Am Beispiel von

NH2-TBL2 ist das Vorgehen verdeutlicht.

Zunächst muss der Platzbedarf eines einzelnen immobilisierten NH2-TBL2-Liganden

theoretisch bestimmt werden. Dazu wird von folgenden Modellvorstellungen

ausgegangen, die in Abb. 35 visuell dargestellt sind. Zunächst wird die Konformation

von NH2-TBL2 gewählt, bei der die 5-Aminoindan-Substituenten den größtmöglichen

Abstand voneinander haben. Der Abstand wird zwischen den weitesten voneinander

entfernt liegenden Kohlenstoffatomen der Substituenten bestimmt. Dieser wird mit dem

Swiss-PDB-Viewer 4.0 bestimmt und beträgt ca. 17 Å (Abb. 35A). NH2-TBL2 ist über

Ethylendiamin an die Dextranmatrix immobilisiert. Das verleiht dem Liganden ein

gewisses Maß an Flexibilität, und es kann angenommen werden, dass der Ligand

durch die „Ethylendiaminbrücke“ kreisförmig rotieren kann (skizziert in Abb. 35B).

Dieser Kreis beschreibt den Platzbedarf eines einzelnen Liganden. Des Weiteren wird

davon ausgegangen, dass die beschriebenen Kreise möglichst dicht gepackt sind

(Abb. 35C), sich dabei aber nicht überlappen (Abb. 35D). Damit kommt man zu einer

hexagonal dichtesten Packung. Unter Berücksichtigung der Ausschlussfläche, die bei

einer hexagonal dichtesten Packung frei bleibt, berechnet sich die theoretische Ober-

flächenbelegung in µmol/m2 auf der Chipoberfläche nach folgender Formel.


3N2/d

105A

A

2

Sub

25

)htheoretisc(O (8)

NA Avogadro-Konstante [mol-1]

dSub Abstand Substituenten [Å]

Die berechnete Oberflächenbelegung für NH2-TBL2 beträgt 0,66 µmol/m2. Dieser Wert

ist eine Zehnerpotenz niedriger als der für Experiment-Nr. 4 in Tabelle 4 berechnete

Wert. Werden Lösungen niedriger Ligandenkonzentrationen injiziert, kommt der

experimentell bestimmte Wert der theoretischen Oberflächenbelegung sehr nahe (Nr. 6,

Tabelle 4).

Abb. 35: Zur Bestimmung der theoretischen Ligandendichte wird die Konformation von NH2-TBL2 gewählt, bei der der größtmögliche Abstand der 5-Aminoindan-Substituenten auftritt. Die Konformation wird einer Energieminimierung unterzogen, und der Abstand zwischen beiden am weitesten voneinander entfernten Kohlenstoffatomen von 5-Aminoindan bestimmt (A). Draufsicht mit skizzierter Kreisfläche (B). Hexagonal dichteste Kreispackung der Liganden unter der Annahme, dass sich die Kreisflächen nicht überlappen (C). Überlappung der Kreisflächen (D).

Mögliche Gründe für die höheren tatsächlichen Oberflächenbelegungen von NH2-TBL2

sind vermutlich in der Struktur der Dextranmatrix zu suchen. Bei der Berechnung wird

von der Annahme ausgegangen, dass die Oberfläche planar ist. Die Dextranmatrix auf

dem CM5-Chip ist ca. 100 nm dick und weist eine gewisse Flexibilität ebenso Ecken

und Kanten auf. Daher ist es vorstellbar, dass NH2-TBL2 in der Lage ist, etwas in die

Oberfläche einzudringen und somit dort an aktivierte Carboxymethyl-Gruppen zu


immobilisieren sowie über Ecken und Kanten weitere „virtuelle“ Oberflächen abzu-

decken [177, Seite 1527]. Es würde so zu einem Stapeleffekt der Liganden kommen,

wobei mehrere Liganden übereinander liegen.

Weiterhin ist der Fall wie in Abb. 35D dargestellt möglich, bei dem sich die Kreisflächen

überlappen. Hier müssten die gewählten Modellvorstellungen angepasst werden. Dies

liegt daran, dass innerhalb der beschriebenen Kreisfläche mehrere modifizierte

Glucosemonomere des Trägers liegen und so die tatsächliche Oberflächenbelegung

höher sein kann.

Zur Überprüfung der Modellvorstellung wird auf einem C1-Chip eine Immobilisierung

von NH2-TBL2 vorgenommen. Die Oberfläche dieses Sensorchips besitzt eine planare,

carboxylierte Oberfläche ohne Dextranmatrix. An dieser wird NH2-TBL2 ebenfalls

mittels Amin-Coupling gebunden [176, Seite 19.13.4]. Hier konnte eine Signaldifferenz

von 214 RU bestimmt werden, was einer Ligandendichte auf der Oberfläche von

0,53 µmol/m2 entspricht (Nr. 8, Tabelle 4). Dieser Wert liegt sehr nahe an der

berechneten Oberflächenbelegung von 0,66 µmol/m2. Es kann angenommen werden,

dass NH2-TBL2 in einer hexagonal dichtesten Kreispackung auf der Oberfläche des

C1-Chips angeordnet ist. Somit bestätigt sich auch die Vermutung, dass die Liganden

in der Lage sind, in die Oberfläche der Dextranmatrix einzudringen. Wäre die

Vermutung, wie in Abb. 35D dargestellt, korrekt, müsste auch bei der Verwendung

eines C1-Chips eine höhere Oberflächenbelegung zu beobachten sein.

Für die Berechnung der theoretischen Oberflächenbelegung von NH2-TBL1 werden die

gleichen Annahmen wie für NH2-TBL2 gemacht. In der Konformation, in der die Benzyl-

Substituenten den größten Abstand voneinander haben, beträgt dieser 14,7 Å. Es

ergibt sich eine berechnete, maximale Oberflächenbelegung von 0,9 µmol/m2, die

höher ist als die experimentell erreichte. Diese liegt bei 0,28 µmol/m2 bzw.

0,16 µmol/m2 (Nr. 9 und Nr. 10 in Tabelle 4).

Es konnte in diesem Abschnitt gezeigt werden, dass die Modifizierung von TBL1 und

TBL2 mit Ethylendiamin eine erfolgreiche Strategie zur Immobilisierung von Triazin-

liganden auf Sensorchipoberflächen sein kann. Anhand von NH2-TBL2 konnte nach-

gewiesen werden, dass die Oberflächenbelegung steuerbar ist. Jedoch lassen sich die

Immobilisierungsbedingungen nicht pauschal auf andere Liganden übertragen, wie

NH2-TBL1 zeigte. Hier müssen andere Parameter gefunden werden, welche die

diskutierte glycospezifische Interaktion mit der Dextranmatrix verhindert und so die

Oberflächenbelegung erhöht.

4.6.2 Immobilisierung von TBL1 und TBL2 auf Silica TBL1 und TBL2 werden auf Kieselgel 100 mit einer Korngrößenverteilung von 0,063-

0,200 mm (Herstellerangaben) immobilisiert. Die Funktionalisierung wurde durch


Mitarbeiter der Arbeitsgruppe von Prof. Niemeyer an der Helmut-Schmidt-Uni-

versität / Universität der Bundeswehr Hamburg vorgenommen. Zunächst wird das

Silica mit Aminopropyltriethoxysilan silanisiert [184]. Hierzu wird 1 g Silica eingewogen,

bei 60 °C und unter vermindertem Druck über Nacht getrocknet. Das Silica wird in

20 mL Toluol suspendiert und unter Rühren wird 1 mL Aminopropyltriethoxysilan

(Aptes) zur Suspension gegeben. Der Reaktionsansatz wird 1,5 h unter Rückfluss

gekocht. Anschließend erfolgt das Abfiltrieren und Waschen des Silicas mit jeweils

20 mL Toluol und Aceton. Das Silica wird bei 60 °C für 6 h getrocknet.

Zur Immobilisierung der Liganden werden 326 mg (1 mmol) TBL1 oder 378 mg

(1 mmol) TBL2 in 15 mL DMSO gelöst. Die Lösungen sowie 140 µL (1 mmol) Tri-

ethylamin werden zu 1 g aminofunktionalisiertem Silica (APS-Silica) gegeben. Die

Suspension wird bei 80 °C über Nacht gerührt. Anschließend wird das Silica abfiltriert,

gründlich mit DMSO und Aceton gewaschen und bei 60 °C für 6 h getrocknet.

Der Erfolg der Immobilisierung ist mittels Elementaranalyse an der Helmut-Schmidt-

Universität überprüft worden. Weiterhin erfolgte die Entwicklung einer massenspektro-

metrischen Methode mittels ESI-MS für den qualitativen Nachweis der Liganden auf

der Silica-Oberfläche.

4.6.2.1 Ergebnisse der Elementaranalyse Die Immobilisierung von Triazinliganden durch eine nucleophile Substitution auf amino-

funktionalisiertem Silica ist u.a. durch Anspach et al. beschrieben worden [151, Seite

197]. Die Charakterisierung des Trägermaterials kann mittels IR-, NMR-Spektroskopie,

Thermogravimetrie sowie der Elementaranalyse erfolgen [185, Seite 3166]. Die

Ergebnisse, der in dieser Arbeit durchgeführten Elementaranalyse, sind in Tabelle 5

dargestellt.

Tabelle 5: Ergebnisse der Elementaranalyse.

Probe Kohlenstoff

(%) Stickstoff

(%) Wasserstoff

(%) C/N-Verhältnis (experimentell)

C/N-Verhältnis (theoretisch)

Oberflächenbelegung (µmol/m2)

APS-Silica

3,6 1,1 0,3 - -

TBL1-Silica

7,5 2,2 0,6 4,1 3,4 0,7

TBL2-Silica

10,3 2,8 0,9 4,6 4,2 1,0

Im Vergleich zum APS-Silica, dem Ausgangsmaterial steigt der Kohlenstoff- und

Stickstoffgehalt bei TBL1- und TBL2-Silica deutlich an. Daraus kann geschlossen

werden, dass die Immobilisierung erfolgreich verlaufen ist. Weiterhin kann durch die

vorhandenen Daten sowohl das Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnis als auch die Ober-

flächenbelegung berechnet werden. Das aus den experimentellen Werten berechnete


Verhältnis sollte mit dem Verhältnis, das sich aus der Summenformel ergibt, über-

einstimmen.

Dabei wird davon ausgegangen, dass eine bestimmte Masse APS-Silica neben

Kohlenstoff und Stickstoff weitestgehend aus den Elementen Silicium und Sauerstoff

besteht. Die Masse der Elemente Silicium und Sauerstoff mSi,O berechnet sich wie folgt.

100

wm

100

wm

100

wmmm APSH%

APSAPSN%

APSAPSC%

APSAPSO,Si (8)

mSi,O Masse der übrigen Elemente, insbesondere Silicium und Sauerstoff [g]

mAPS Masse APS-Silica [g]

w%C-APS prozentualer Kohlenstoffgehalt in APS-Silica

w%N-APS prozentualer Stickstoffgehalt in APS-Silica

w%H-APS prozentualer Wasserstoffgehalt in APS-Silica

Die Masse an Silicium und Sauerstoff mSi,O im Silica muss nach der Immobilisierung

von TBL1 und TBL2 konstant bleiben. Der prozentuale Anteil w%Si,O sinkt jedoch infolge

des steigenden Kohlenstoff-, Stickstoff- und Wasserstoffgehaltes und ergibt sich zu

TBLH%TBLN%TBLC%O,Si% www%100w , (9)

w%Si,O prozentualer Gehalt der übrigen Elemente in TBL1 oder TBL2

w%C-TBL prozentualer Kohlenstoffgehalt in TBL1 oder TBL2

w%N-TBL prozentualer Stickstoffgehalt in TBL1 oder TBL2

w%H-TBL prozentualer Wasserstoffgehalt in TBL1 oder TBL2

woraus sich die Gesamtmasse nach der Immobilisierung berechnet.

O,Si%

O,SiTBL w

%100mm (10)

mTBL berechnete Masse TBL1 oder TBL2 [g]

Die Massenanteile von Kohlenstoff, Stickstoff und Wasserstoff, die nach der

Immobilisierung auf das APS-Silica gelangt sind, ergeben sich dann wie nachfolgend

beispielhaft für Kohlenstoff dargestellt.


100

wm

100

wmm APSC%

TBLTBLC%

TBLTBLC (11)

mC-TBL Masse für Kohlenstoff in TBL1 oder TBL2 [g]

Aus den Massenanteilen von Kohlenstoff und Stickstoff wird die Stoffmenge berechnet

und das Kohlenstoff-Stickstoffverhältnis gebildet. Aus der Summenformel der Liganden

berechnet sich das theoretische Verhältnis. In Tabelle 5 sind die Ergebnisse hierfür

aufgeführt.

Das experimentelle Kohlenstoff-Stickstoffverhältnis ist bei beiden Liganden größer als

das aus der Summenformel berechnete Verhältnis. Dies deutet darauf hin, dass der

Trocknungsschritt nach der Immobilisierung nicht ausreichend war. Auf der Oberfläche

verbleibende kohlenstoffhaltige Lösungsmittelreste erhöhen vermutlich den Kohlen-

stoffgehalt, was wiederum zur Erhöhung des Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnisses führt.

Zur Berechnung der Oberflächenbelegung bezogen auf ein Gramm Trägermaterial wird

daher der Stickstoffgehalt herangezogen. Für TBL1-Silica ergibt sich eine Oberflächen-

belegung von 0,16 mmol/g. Diese beträgt bei TBL2-Silica 0,24 mmol/g.

Anspach et al. haben für die Immobilisierung ihrer Triazinliganden auf APS-Silica

mittels Photometrie Werte in gleicher Größenordnung bestimmt. Für Procion Red

MX5B berechneten sie einen Wert von 0,35 µmol/m2, für Procion Red HE3B einen

Wert von 0,12 µmol/m2. Mit einer molaren Masse von 615 g/mol und 1228 g/mol waren

die verwendeten Liganden allerdings deutlich größer und haben einen höheren

Platzbedarf, was die niedrigere Oberflächenbelegung begründet [151, Seite 196].

Andere Immobilisierungsstrategien für Triazine, z.B. über Silanisierung mittels

Glycidoxypropyltrimethoxysilan und Anbindung der Liganden über Epoxy-Gruppen,

liefern deutlich geringere Oberflächenbelegungen, wie Anspach et al. und Lowe et al.

zeigten [151, Seite 199; 186, Seite 307].

Zum Vergleich wird erneut ein theoretischer Wert für die Oberflächenbelegung

berechnet. Dazu wurde die spezifische Oberfläche mittels der BET-Methode1 durch

Mitarbeiter der Arbeitsgruppe von Prof. Niemeyer an der Helmut-Schmidt-Universität

Hamburg bestimmt. Für das verwendete Kieselgel 100 liegt diese bei 292 m2/g. Jedoch

ist nicht die gesamte spezifische Oberfläche des Silicas für die Liganden zugänglich.

Um die Zugänglichkeit abzuschätzen wird die BJH-Methode2 angewandt, bei der die

1 Die BET-Methode zur Bestimmung der spezifischen Oberfläche ist nach ihren Entdeckern S. Brunauer, P. H. Emmet

und E. Teller benannt. 2 Die BJH-Methode zur Berechnung der Porengrößenverteilung ist nach ihren Entdeckern E. P. Barret, L. G. Joyner und

P. P. Halenda benannt.


Verteilung der Porenweite bestimmt wird. Bei Kenntnis der Größe der Liganden kann

die Oberfläche abgeschätzt werden, die für die Liganden zugänglich ist.

Die maximale Ausdehnung beider Liganden beträgt 15 Å für TBL1 und 17 Å für TBL2

(vgl. Abschnitt 4.6.1). Für die Berechnung muss ein größerer Wert angenommen

werden, da die Liganden bei ihrer maximalen Ausdehnung Kontakt mit den Wänden

des Adsorbens hätten. Zur groben Abschätzung wird daher ein Wert von 30 Å

verwendet. Damit ergibt sich aus dem BJH-Plot, dass 229 m2 pro Gramm der Ober-

fläche für die Liganden zugänglich sind. Somit ergibt sich für die TBL1 eine

Oberflächenbelegung von 0,7 µmol/m2 und für TBL2 von 1,0 µmol/m2. Angemerkt sei,

dass sogenannte Flaschenhälse nicht bei der BJH-Methode berücksichtigt werden.

Hierbei handelt es sich um lokale Engstellen im Porengefüge, durch die die Liganden

aufgrund ihrer Größe nicht hindurchpassen.

Die theoretisch mögliche Oberflächenbelegung wird wie folgt abgeschätzt. Unabhängig

von der Struktur des Kieselgels beträgt die Silanoldichte auf der Oberfläche ca.

7,7 µmol/m2 (Kiselev-Zhuravlev-Konstante) [187, Seite 20]. Infolge sterischer Gründe

kann Aptes bei der Funktionalisierung nur mit einer oder zwei Silanolgruppen zum

APS-Silica reagieren. Im vorliegenden Fall wird eine 1:2-Stöchiometrie zugrunde gelegt,

da das dem Aptes chemisch ähnliche 1-Aminoethyl-3-aminopropyltrimethoxysilan

(Aeats) in dieser Weise reagiert [188, Seite 94]. Das bedeutet, dass pro Quadratmeter

Trägermaterial 3,9 µmol Aptes-Moleküle angebunden werden können. Bei

vollständiger Umsetzung aller Aminogruppen sind dann ebenfalls 3,9 µmol/m2 TBL1

bzw. TBL2 immobilisiert.

Dieser größere theoretische Wert lässt sich durch folgende Überlegungen erklären.

Erstens beträgt das stöchiometrische Verhältnis 1:1 bei der Immobilisierung, d.h. auf

1 mol Ligand kommt etwa 1 mol der Aminogruppen des APS-Silicas. Um die

Immobilisierungsausbeute zu steigern kann eine Erhöhung der Ligandenkonzentration

im Reaktionsansatz angestrebt werden. Zweitens können auch sterische Gründe, die

durch die reine Größe der Liganden verursacht werden, eine Rolle spielen.

Die Ergebnisse der Elementaranalyse belegen die erfolgreiche Immobilisierung von

TBL1 und TBL2 auf APS-Silica. Zur Absicherung dieses Ergebnisses wird ein

qualitativer massenspektrometrischer Nachweis angewendet, der im nachfolgenden

Abschnitt vorgestellt wird.

4.6.2.2 Ergebnisse der massenspektrometrischen Charakterisierung Für die qualitative Überprüfung des Erfolges der Immobilisierung mittels ESI-MS wird

wie folgt vorgegangen. Es werden 20 mg des modifizierten Silicas mit 400 µL einer 2 M

Kaliumhydroxydlösung hydrolysiert. Nach 2 h werden 25 µL des Hydrolysates

entnommen und mit 75 µL Trimethylsilylimidazol versetzt. Die Mischung wird für 15 min


bei Raumtemperatur gerührt und anschließend stehengelassen, wobei sich eine

organische und eine wässrige Phase ausbildet [189, Seite 332]. 10 µL der organischen

Phase werden entnommen und mit 1 mL Methanol/Ameisensäure (99:1, v/v) verdünnt.

Die Lösung wird dann mittels einer Spritzenpumpe direkt in die ESI-Quelle des

Massenspektrometers injiziert. Die Messung erfolgt im positiven Modus mit folgenden

Einstellungen der ESI-Quelle: Ionspray voltage 4500 V, Nebulizing gas (gas 1) 35 psi,

Turbo gas 50 psi, Turbo gas temperature 350 °C mit eingeschaltetem Interface heater,

Curtain gas 10 psi. Analytabhängige Parameter sind während den Messungen

verändert worden. Zur genaueren Charakterisierung sind die Molekülionenpeaks

fragmentiert worden.

Die Hydrolyse des Silicas unter basischen Bedingungen und die anschließende

Derivatisierung der Hydrolyseprodukte mit Trimethylsilylimidazol ist in Abb. 36

dargestellt.

Abb. 36: Hydrolyse und Derivatisierung der TBL-Liganden.

Unter diesen Bedingungen sollten, wie aus Abb. 36 hervorgeht, die TBL-Liganden

weiterhin kovalent an (3-Aminopropyl)-tri-(trimethylsilyloxy)-silan gebunden sein. Die

gemessenen Massenspektren der derivatisierten Hydrolyseprodukte von TBL1-, TBL2-

und APS-Silica sind in Abb. 37 dargestellt. Die Molekülionen [M+H]+ sind markiert

abgebildet. Für das derivatisierte Hydrolyseprodukt von TBL1-Silica (Abb. 37A) findet

sich der monoisotopische Peak bei 643,5 Da, der berechnete Wert liegt bei 643,3 Da.

Der Wert für die monoisotpische Masse des derivatisierten Hydrolyseproduktes TBL2-

Silica (Abb. 37B) beträgt 695,6 Da. Dagegen liegt der berechnete Wert bei 695,3 Da.

Abb. 37C zeigt das Massenspektrum von APS-Silica nach Hydrolyse und Deri-

vatisierung. Der Wert für die monoisotopische Masse wird bei 354,2 Da erwartet,

welcher experimentell bei 354,1 Da bestätigt wurde. Die anderen Peaks, die in den

Massenspektren zu sehen sind, stellen weitere derivatisierte Hydrolyseprodukte von

Silica dar. Aus den Spektren geht eindeutig hervor, dass die Immobilisierung

erfolgreich verlaufen ist, da die zu erwartenden Peaks von TBL1- und TBL2-Silica auch

tatsächlich nachgewiesen werden können. Daneben findet sich das Hydrolyseprodukt

von APS-Silica (3-Aminopropyl)-tri-(trimethylsilyloxy)-silan ebenfalls in den

Massenspektren von TBL1 und TBL2. Hieraus kann geschlossen werden, dass nicht

alle Aminogruppen nach der Immobilisierung mit den Liganden belegt sind.


Abb. 37: Massenspektren der derivatisierten Hydrolyseprodukte von TBL1- (A), TBL2- (B) und APS-Silica (C) nach Hydrolyse und Derivatisierung. Die Molekülpeaks der Liganden und von APS-Silica sind schwarz eingerahmt.

Zur endgültigen Absicherung wurden von den Hydrolyseprodukten Fragmentspektren

angefertigt, die in Abb. 38 dargestellt sind. Einige der auftretenden Peaks sind mit

möglichen Fragmentionen annotiert. Das Fragmentspektrum des Hydrolyseproduktes

von APS-Silica befindet sich in Abb. 75 im Anhang.

Die Fragmentionen bei 553,2 Da und 606,5 Da von TBL1- bzw. TBL2-Silica

entstammen der Abspaltung einer Trimethylsilyloxy-Gruppe in Form von Trimethyl-

silanol. Dabei verbleibt die positive Ladung am Siliciumatom, die über die Sauerstoff-

atome stabilisiert wird. Bei 264,2 Da findet sich auch das entsprechende Fragment für

APS-Silica. Charakteristisch für das Hydrolyseprodukt von TBL1-Silica ist das Auftreten

des Benzylkations bei 91,2 Da, welches sich zum stabilen Tropyliumion umlagert [117,

Seite 255]. Das entsprechende Fragmention nach Verlust eines Benzylrestes und einer

Trimethylsilyloxy-Gruppe ist bei 463,2 Da zu sehen. Wiederum in allen Spektren von

Abb. 38 und Abb. 75 findet sich ein Peak bei ca. 73 Da, der für die Abspaltung eines

Trimethylsilylkations spricht [190, Seite 8].


Abb. 38: Fragmentspektren der Hydrolyseprodukte nach Derivatisierung von TBL1- (A) und TBL2-Silica (B).

Weiterhin ist in beiden Spektren sowie im Spektrum des Hydrolyseproduktes von APS-

Silica ein ausgeprägter Peak bei 207,1 Da zu erkennen. Da die Peaks in allen

Fragmentspektren auftreten ist davon auszugehen, dass zunächst der Triazinrest des

Moleküls abgespalten wird. Anschließend muss es zu einer intramolekularen Um-

lagerung des (3-Aminopropyl)-tri-(trimethylsilyloxy)-silan-Restes kommen. Mit einer

einfachen Abspaltung weiterer Molekülteile sind die auftretenden Fragmentionen in den

Massenspektren nicht zu erklären. Dass intramolekulare Umlagerungen, zumindest

zweier benachbarter Trimethylsilyloxy-Gruppen, möglich sind, zeigt die Literatur [191,

Seite 10]. Um welches Fragmention es sich in den Massenspektren handelt, konnte

abschließend nicht ermittelt werden.

Durch die vorgestellte massenspektrometrische Methode konnten die Ergebnisse aus

der Elementaranalyse bestätigt werden. Grundsächlich ist es möglich, diese Methode

als quantitative Methode auszulegen. Dazu genügt die Quantifizierung von (3-Amino-

propyl)-tri-(trimethylsilyloxy)-silan, dem Hydrolyseprodukt von APS-Silica, zum einen

auf APS-Silica selbst und zum anderen auf dem Silica nach der Immobilisierung der

Liganden. Die Differenz beider Messungen liefert die Menge an immobilisierten Ligand.


4.7 Interaktionsstudien In Abschnitt 4.6 ist die Immobilisierung der triazinbasierten Liganden auf Silica und auf

Sensorchips ausführlich beschrieben worden. Im folgenden Abschnitt soll die Eignung

der Liganden auf ihr Affinitätstrennverhalten hinsichtlich verschiedener Glycoproteine

und Saccharide untersucht werden. Dabei wird zunächst auf Interaktionsstudien mittels

SPR eingegangen.

4.7.1 SPR-Interaktionsstudien mit NH2-TBL1 und NH2-TBL2 Eine schematische Darstellung einer SPR-Messung ist in Abb. 39 dargestellt. Das in

rot dargestellte Sensorgramm zeigt das Resonanzsignal der Referenzzelle, wo nur

eine Änderung des Brechungsindex durch die Probeninjektion detektiert wird. Das

schwarze Sensorgramm offenbart Interaktion mit einem Liganden. Nach dem Anstieg

durch den Brechungsindex, der für alle Flusszellen gleich ist, kann ein weiterer Anstieg

durch die Interaktion eines Analyten mit einem Liganden beobachtet werden. Die

Differenz beider Sensorgramme ergibt die Netto-Anbindung.

Abb. 39: Schematische Darstellung einer SPR-Interaktionsmessung. Die Interaktionsstudien erfolgen mit den Glycoproteinen GOD und TG. Als Negativ-

kontrolle wird das nicht glycosylierte BSA verwendet. Die Standardpuffer von

GE Healthcare HBS-N (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, pH 7,4) und HBS-EP (HBS-N-

Puffer mit 3 mM EDTA, 0,005 % Netzmittel P20, pH 7,4) sowie ein Tris-HCl-Puffer

(0,01 M Triethylamin, 0,2 M NaCl, pH 7,0) werden zunächst auf ihre Eignung

untersucht. Der Tris-HCl-Puffer wird in den Interaktionsstudien von Palanisamy et al.

verwendet und hat sich als geeignet erwiesen [142, Seite 268]. Details zu den

injizierten Probenvolumina, Proteinkonzentrationen und den Einstellungen am

Biacore 3000 befinden sich in den Bildunterschriften.

Von den drei getesteten Standardpuffern zeigt HBS-N die beste Leistung für die

Durchführung der Interaktionsstudien. Dagegen kommt es zu keiner Interaktion, wenn

HBS-EP oder Tris-Puffer eingesetzt werden. In Abb. 40 sind die Sensorgramme für die

getesteten Puffer dargestellt.


Abb. 40: Sensorgramme zum Einfluss von HBS-N-, HBS-EP- und Tris-Puffer auf das Adsorptionsverhalten von NH2-TBL2 zu GOD. Bedingungen: 1 mg/mL GOD, Fluss: 5 µL/min, immobilisierte NH2-TBL2-Menge: 1629 RU.

Jedoch kommt es in der Referenzflusszelle mit HBS-N-Puffer ebenfalls zur Adsorption

von GOD. Der HBS-EP-Puffer wird für SPR-Messungen häufig verwendet. Das darin

enthaltene Netzmittel P20, auch unter seinem Handelsnamen TWEEN 20 bekannt,

dient der Unterdrückung hydrophober Wechselwirkungen. Dabei soll insbesondere

verhindert werden, dass sich Proteine in Lösung über ihre hydrophoben Oberflächen-

bereiche zu Koagulaten zusammenlagern. Weiterhin sollen auch unspezifische

hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Liganden und Proteinen verhindert werden.

Wie im einleitenden Abschnitt und in Abschnitt 4.1 dargelegt, spielen auch hydrophobe

Wechselwirkungen bei der Bindung von Kohlenhydratstrukturen sowohl bei Lektinen

als auch bei synthetischen Liganden eine wichtige Rolle. Palanisamy et al. vermuten

einen hydrophoben Bindungsanteil auch bei NH2-TBL2. Im vorliegenden Fall ist es

möglich, dass das Netzmittel P20 diesen hydrophoben Bindungsanteil unterdrückt und

so die Adsorption von GOD an NH2-TBL2 verhindert [142, Seite 280]. Für weitere

Experimente wird daher HBS-N-Puffer verwendet.

Zur Abschätzung unspezifischer Wechselwirkungen von NH2-TBL2 wird BSA

verwendet. Serumalbumine sind Transportproteine für kleine, hydrophobe Moleküle

[192, Seite 583]. Für zwei unterschiedliche Oberflächenbelegungen von NH2-TBL2 auf

dem CM5-Chip und Fließgeschwindigkeiten sind BSA-Injektionen in Abb. 41 dargestellt.

Bei geringen Fließgeschwindigkeiten in Kombination mit einer hohen immobilisierten

Ligandenmenge kommt es zur Entstehung von hohen unspezifischen Wechsel-

wirkungen (Abb. 41A). Der Effekt kann zwar durch einen größeren Fluss bei moderater

Ligandendichte deutlich reduziert werden, dennoch ist der Anteil erheblich (Abb. 41B).


Abb. 41: Sensorgramme der Interaktion von NH2-TBL2 mit BSA. Bedingungen für (A): 1 mg/mL BSA, Fluss: 5 µL/min, immobilisierte NH2-TBL2-Menge: 3599 RU. Bedingungen für (B): 1 mg/mL BSA, Fluss: 30 µL/min, immobilisierte NH2-TBL2-Menge: 1634 RU.

Palanisamy et al. beschreiben die Desorption für NH2-TBL1 und NH2-TBL2 von GOD

mittels Methyl- -D-mannopyranose. In Abb. 42A sind die Desorptionsversuche mit

Methyl- -D-mannopyranose für GOD zu sehen. Nach der zweimaligen Injektion von

0,5 M Methyl- -D-mannopyranose in HBS-N-Puffer erfolgt nicht die gewünschte

Desorption der GOD. Auch eine weitere Erhöhung der Methyl- -D-mannopyranose -

Konzentration brachte nicht den gewünschten Effekt. Nur nach Injektion einer

70 %igen Ethanollösung konnte GOD desorbiert werden (Abb. 42A, Position 2).

Abb. 42: Sensorgramme zu den Desorptionsversuchen von NH2-TBL2 mit GOD (A) und TG (B). Zur besseren Übersicht ist nur die Ligandenflusszelle dargestellt. Bedingungen und Bemerkungen: (A): 1 mg/mL GOD, Fluss: 5 µL/min, immobilisierte Ligandenmenge: 3599 RU. (B): 1 mg/mL TG, Fluss: 10 µL/min, immobilisierte Ligandenmenge: 3599 RU. Verwendete Desorptionsreagenzien: 1. Methyl- -D-mannopyranose (0,5 M in HBS-N-Puffer), 2. Ethanol/Wasser (7:3, v/v), 3. Natriumdodecylsulfat (0,5 % in Wasser w/v).


Auch für das Glycoprotein TG konnte mit Methyl- -D-mannopyranose keine

spezifische Desorption erzielt werden. Für TG ist das nur mit dem unspezifisch

wirkenden Detergenz Natriumdodecylsulfat gelungen (Abb. 42B).

Die beschriebenen Experimente mit NH2-TBL2 sind mit hohen Ligandendichten

durchgeführt worden, die von 4 bis 8 µmol/m2 reichen. Die Ligandendichte ist ein

Faktor, der unspezifische Wechselwirkungen verursachen kann [39, Seite 161]. Daher

ist durch die Generierung von weniger dicht belegten Sensorchipoberflächen versucht

worden, unspezifische Wechselwirkungen von NH2-TBL2 zu reduzieren. Hierfür sind

Sensorchips mit Ligandendichten von ca. 0,06 bis 0,5 µmol/m2 hergestellt worden (vgl.

Tabelle 4 in Abschnitt 4.6.1). In beschriebener Weise sind die gleichen Protein-

lösungen injiziert worden. Im Gegensatz zur starken, unspezifischen Adsorption an

Sensorchips mit hohen Ligandendichten erfolgt bei den niedrigen Ligandendichten

keine Adsorption der Glycoproteine TG und GOD. Ein beispielhaftes Sensorgramm ist

hierzu im Anhang unter Abb. 78 zu finden. Die Ligandendichte beträgt hier 0,2 µmol/m2.

Ähnliche Beobachtungen haben Palanisamy et al. gemacht, wenn sie GOD auf eine

TBL2-Sepharose applizieren. Das GOD befindet sich dann in der Durchlauffraktion,

wenn die Ligandendichte der Sepharose im gequollenen Zustand niedriger als

11 µmol/g ist. Sie begründen diese Beobachtung damit, dass mehrere immobilisierte

TBL2-Moleküle mit einem GOD-Molekül einen Komplex eingehen. Ist die

Ligandendichte zu gering, sind die TBL2-Moleküle zu weit voneinander entfernt, um

einen effektiven Ligand-Makromolekül-Komplex zu bilden [142, Seite 273].

Ein ähnliches Bild ergibt sich, wenn man die beschriebenen Versuche mit NH2-TBL1

durchführt. Unter den gewählten Immobilisierungsbedingungen ist es nicht möglich,

NH2-TBL1 mit ähnlich hohen Ausbeuten an die Chipoberfläche zu binden, wie es für

NH2-TBL2 der Fall ist (vgl. Abschnitt 4.6.1). Beispielhafte Sensorgramme für GOD und

TG sind im Anhang in Abb. 79 zu finden. Zu erkennen ist, dass bei GOD das

Resonanzsignal nach Ende der Injektion wieder auf die Basislinie zurückfällt. Fast

gleich sehen die Sensorgramme für TG und BSA aus. Hier findet zwar augenscheinlich

eine Interaktion statt, die aber unspezifischer Natur sein könnte, da diese auch bei BSA

auftritt.

Die Neigung von Triazinliganden zur unspezifischen Adsorption wurde beispielsweise

auch durch Mohammad et al. beobachtet. Sie untersuchten die unspezifische

Adsorption von drei Triazinfarbstoffen zu humanem Serumalbumin und Transferrin.

Insbesondere Serumalbumin wurde von allen drei Farbstoffen adsorbiert und konnte

nur unspezifisch durch hohe Salzkonzentrationen bzw. durch Ethylenglycol desorbiert

werden [193, Seite 82-83]. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass unter den

gewählten Bedingungen keine glycospezifische Interaktion zwischen den Triazin-


liganden und GOD sowie TG auftritt. Zum einen können mittels Methyl- -D-

mannopyranose die Glycoproteine nicht kompetitiv desorbiert werden, zum anderen

findet auch die Adsorption des nicht-glycosylierten BSA statt, was sich auf jeden Fall

für die Anwendung auf hochkomplexe Gemische störend auswirkt.

4.7.2 Adsorptionsexperimente mit TBL1-Silica und TBL2-Silica Mit den Adsorbentien TBL1- und TBL2-Silica werden Interaktionsstudien im

Batchverfahren durchgeführt. Dabei wird erneut GOD als Modellglycoprotein

verwendet. Des Weiteren werden Studien mit verschiedenen Zuckern in Wasser und

Dimethylformamid (DMF) durchgeführt.

4.7.2.1 Glucose Oxidase Aus einer Stammlösung von GOD (1 mg/mL) in 0,1 M KH2PO4-Puffer (pH 7) werden

Verdünnungen im Bereich von 0,025 bis 1 mg/mL hergestellt. Zu 10 mg von TBL1-,

TBL2- und APS-Silica gibt man 1 mL der verschiedenen GOD-Lösungen.

Anschließend wird über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Konzentrations-

bestimmung von GOD erfolgt im Überstand bei =280 nm. Kalibriert wird ebenfalls mit

GOD. Die Gleichgewichtsbeladung berechnet sich nach folgender Formel.

Silica

GOD*

m

VCC*q 0 (12)

q* Gleichgewichtsbeladung Silica [mg/g]

C0 Ausgangskonzentration GOD [mg/mL]

C* Gleichgewichtskonzentration [mg/mL]

VGOD Zugabe GOD-Lösung [mL]

mSilica Einwaage Silica [mg]

Mit BSA wird der Versuch in oben beschriebener Weise durchgeführt, jedoch nur bei

einer festen Konzentration von 1 mg/mL.

Die Adsorptionsisothermen von GOD mit TBL1- und TBL2-Silica sind in Abb. 43A

dargestellt. TBL2-Silica zeigt das beste Adsorptionsverhalten gegenüber GOD gefolgt

von APS- und TBL1-Silica. In den SPR-Studien konnte bei hoher Oberflächenbelegung

ebenfalls eine Anbindung von GOD beobachtet werden. Jedoch erfolgt auch die

Adsorption von BSA an TBL1- und TBL2-Silica. Säulenversuche mit TBL2-Silica zeigen,

dass nach der Adsorption von GOD die Desorption mit Methyl- -D-mannopyranose

nicht möglicht ist (Abb. 43B).


Abb. 43: Adsorptionsisothermen von GOD mit TBL1-Silica, TBL2-Silica und APS-Silica (A). Darstellung eines Desorptionsversuches (B). Bei (1) erfolgt die Injektion von 0,5 mL einer GOD-Lösung in Tris-Puffer (10 mM Tris-HCl, 0,1 M NaCl, pH 7). Die Injektion von Methyl- -D-mannopyranose (0,5 M in Tris-Puffer) bei (2) zeigt zwar einen Anstieg der Intensität durch die Eigenabsorption von Methyl- -D-mannopyranose, jedoch keinen Desorptionspeak. Bei (3) wird der Tris-Puffer über das Adsorbens gefördert und die Intensität sinkt wieder. Erst nach Waschen mit Ethanol/Wasser (2:8, v/v) konnte GOD desorbiert werden (4).

Diese Adsorptionsexperimente offenbaren wie die Ergebnisse der SPR-Studien, dass

eine glycospezifische Interaktion unter den gewählten Bedingungen nicht mit den

Liganden TBL1 und TBL2 möglich ist.

4.7.2.2 Zucker Nachfolgend werden die Liganden hinsichtlich ihres Adsorptionsverhaltens gegenüber

verschiedenen Zuckern charakterisiert. Dabei werden Saccharide verwendet, die

typischerweise auch in Glycoproteinen vorkommen [9, Seite 216]. Neben Wasser wird

DMF verwendet. Es ist ein aprotisches organisches Lösungsmittel und ist weniger

kompetitiv als Wasser, d.h. es konkurriert mit den Zuckern weniger um die

Bindungsstellen am Liganden [194, Seite 82].

Von TBL1-, TBL2- und APS-Silica werden je 20 mg in 2 mL Vials eingewogen. Die

Zucker Methyl- -D-mannopyranose, Methyl- -D-glucopyranose, N-Acetyl-D-glucos-

amin und 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose werden in Reinstwasser und

DMF gelöst. Die Konzentration aller Zucker beträgt in Wasser und DMF je 5 mM. Des

Weiteren werden Mischungen der Zucker mit Konzentrationen von je 5 mM in DMF und

Wasser angesetzt. Die Mischungen bestehen aus Methyl- -D-mannopyranose und

N-Acetylglucosamin. Von den Zuckerlösungen werden je 1 mL zu den verschiedenen

Adsorbentien pipettiert und die Vials für 24 h bei Raumtemperatur unter leichtem

Schütteln inkubiert. Unter den gleichen Bedingungen erfolgt als Vergleichsversuch die

Inkubation der Zucker, jedoch ohne Adsorbens.

Die Quantifizierung des Zuckergehaltes erfolgt mittels LC/MS nach einer Methode von

Rogatsky et al. [195, Seite 1806-1807]. Die Zucker werden chromatographisch


getrennt und massenspektrometrisch detektiert. Bei dieser Methode wird ausgenutzt,

dass Cäsium-Kationen mit ungeladenen Zuckern im positiven Modus der ESI-MS

einfach positiv geladene Adukte bzw. Komplexe [Zucker+Cs]+ bilden [196, Seite 3503].

Das API 4000 ist ein MS/MS-Gerät und arbeitet im Multiple Reaction Monitoring-Modus

(MRM). Die Übergänge [Zucker+133]+ 133+ mit einer dwell time (Verweilzeit auf

einem Übergang) von 300 ms werden für jeden Zucker detektiert [195, Seite 1807].

Dabei wird im ersten Quadrupol (Q1) des Massenspektrometers jeweils für 300 ms ein

bestimmtes Zucker-Adukt [Zucker+133]+ in die Kollisionszelle (Q2) überführt. Dort wird

das Zucker-Adukt gespalten und die Masse für das Cs+-Kation (133 g/mol) im dritten

Quadrupol (Q3) detektiert. Die Einstellungen am Massenspektrometer sind in Tabelle 6

dargestellt.

Tabelle 6: Massenspektrometereinstellungen

Parameter Wert

Ionspray voltage 5500 V

Nebulizing gas 40 psi

Turbo gas 35 psi

Interface Heater ein

Declustering potential 27 V

Entrance potential 10 V

Collision energy 15 V

Collision cell exit potential 11 V

Q1 resolution niedrig

Q3 resolution hoch

Deflector voltage 220 V

CEM 2200 V

Das verwendete HPLC-System ist im Anhang aufgeführt. Zur Trennung der

Zuckergemische wird eine 5 µm Amino-HPLC-Säule (2x100) mm eingesetzt. Als

mobile Phase wird Acetonitril/Wasser (72:28 v/v), dotiert mit 40 µM Cäsiumacetat,

verwendet. Der Fluss beträgt 0,2 mL/min. Die Auswertung erfolgt über die Peakflächen

der Chromatogramme. Zur Kalibration werden 10 mM Standardlösungen der Zucker

hergestellt. Daraus werden Volumina von 1,0 µL bis 7,2 µL entnommen und in

entsprechende HPLC-Vials überführt, mit 1000 µL mobiler Phase verdünnt und

anschließend mit 1 µL einer 20 mM Saccharose-Lösung dotiert. Von den

Verdünnungen werden anschließend 5 µL injiziert.

Ein typisches Chromatogramm für ein Zuckergemisch bestehend aus den Zuckern

Methyl- -D-mannopyranose, N-Acetyl-D-glucosamin und Saccharose ist in Abb. 44

dargestellt.


Abb. 44: Beispielchromatogramm eines Zuckergemisches bestehend aus Methyl- -D-mannopyranose, N-Acetyl-D-glucosamin und Saccharose

Zuckermischungen bestehend aus Methyl- -D-mannopyranose und Methyl- -D-

glucopyranose können nicht verwendet werden, da keine vollständige Auftrennung

durch die verwendete Säule erreicht worden ist. Diese wäre jedoch im vorliegenden

Fall zwingend notwendig, da sich durch die Messung im MRM-Modus die Eingangs-

masse oder die Masse des Übergangs unterscheiden muss. Die Eingangsmasse

[Zucker+Cs]+ und die Masse des detektierten Übergangs [Zucker+133] 133 ist

jedoch für Methyl- -D-mannopyranose und Methyl- -D-glucopyranose gleich.

Da die Bildung des Zucker-Cs+-Komplexes eine Reaktion 2. Ordnung darstellt und

somit von der Saccharid- und Cs+-Konzentration abhängt, wird ein linearer Zusammen-

hang zwischen Analytkonzentration und Peakfläche der Chromatogramme nur in

einem engen Konzentrationsbereich der Analyten erwartet. Rogatsky et al. verwenden

zur Verbesserung der Linearität entsprechende isotopenmarkierte Zucker als internen

Standard [195, Seite 1808]. Da es sich im vorliegenden Fall nur um einfache

Mischungen handelt, wird auf isotopenmarkierte Standards verzichtet. Stattdessen

sollte zu Testzwecken Saccharose als interner Standard verwendet werden. Dieser

eluiert nach den beiden Monosacchariden (Abb. 44). In Abb. 45 ist beispielhaft die

Kalibrierung für Methyl- -D-mannopyranose ohne und unter Verwendung von

Saccharose als interner Standard dargestellt.


Abb. 45: (A) Methyl- -D-mannopyranose-Kalibrierung ohne internen Standard. (B) Me-thyl- -D-mannopyranose-Kalibrierung mit internem Standard (Saccharose). Jede Verdün-nungsstufe ist zweimal injiziert worden. Auf der Abszissenachse ist die absolute inji-zierte Masse von Methyl- -D-mannopyranose angegeben. Unter Verwendung eines in-ternen Standards wird die Peakfläche von Methyl- -D-mannopyranose durch die Peak-fläche des internen Standards Saccharose dividiert.

Zu erkennen ist, dass unter Verwendung von Saccharose keine Verbesserung der

Linearität erfolgt. Als Konsequenz wird auf die Verwendung eines internen Standards

verzichtet. Die Ermittlung der Kalibrierfunktion erfolgt durch quadratische Regression

und ist in Abb. 45 angegeben.

In Abb. 46 sind die Ergebnisse der Adsorption von TBL1-, TBL2- und APS-Silica mit

Methyl- -D-mannopyranose, N-Acetylglucosamin, Methyl- -D-glucopyranose, 4-O- -

D-Galactopyronosyl-D-mannopyranose dargestellt. Dazu wird die Differenz zwischen

der Zuckerkonzentration der Standards und der Zuckerkonzentration im Überstand


nach Inkubation mit Adsorbens gebildet. Bezogen auf den Standard ergibt sich der

prozentual adsorbierte Zuckeranteil.

Abb. 46: Adsorption verschiedener Mono- und Disaccharide gelöst in Wasser oder DMF an TBL1-, TBL2- und APS-Silica. Die Zuckermischungen bestehen aus Methyl- -D-mannopyranose und N-Acetylglucosamin. (1) Methyl- -D-mannopyranose in Wasser, (2) Methyl- -D-mannopyranose in DMF, (3) Methyl- -D-mannopyranose-Gemisch in Was-ser, (4) Methyl- -D-mannopyranose-Gemisch in DMF, (5) N-Acetylglucosamin in Wasser, (6) N-Acetylglucosamin in DMF, (7) N-Acetylglucosamin-Gemisch in Wasser, (8) N-Acetyl-glucosamin-Gemisch in DMF, (9) 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose in Wasser, (10) 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose in DMF, (11) Methyl- -D-glucopyranose in Wasser, (12) Methyl- -D-glucopyranose in DMF.

Es ist zu erkennen, dass nur in wenigen Fällen eine signifikante Adsorption der Zucker

sowohl in Wasser als auch in dem nicht kompetitiven Lösungsmittel DMF stattgefunden

hat. Dagegen findet die Adsorption des Disaccharids 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-

mannopyranose in DMF an TBL1- und TBL2-Silica statt. Hier konnten 25 % des in der

Ausgangskonzentration enthaltenen Disaccharids an TBL1-Silica adsorbiert werden.

Im Fall von TBL2-Silica sind es noch 6 %. Unter diesen Bedingungen zeigt APS-Silica

kein Adsorptionsvermögen für 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose. Aus

Wasser konnte das Disaccharid dagegen nicht adsorbiert werden.

Von Methyl- -D-mannopyranose können nur marginale Mengen sowohl in DMF als

auch in Wasser adsorbiert werden. Ein ähnliches Verhalten zeigt N-Acetylglucosamin,

jedoch mit der Ausnahme, dass APS-Silica 23 % von N-Acetylglucosamin gelöst in


DMF adsorbiert. Methyl- -D-glucopyranose zeigt in beiden Lösungsmitteln an TBL1-

und TBL2-Silica keine Adsorption. Ein Batch-Versuch von Methyl- -D-glucopyranose

mit APS-Silica wurde nicht durchgeführt. Die Zuckermischungen, bestehend aus

Methyl- -D-mannopyranose und N-Acetylglucosamin, in DMF und Wasser bestätigen

die Ergebnisse der Einzelstoffversuche.

Das niedrige Adsorptionsverhalten für Monosaccharide in Wasser und DMF liegt

eventuell in der Multivalenz begründet. Lektine besitzen zu Monosacchariden eine

geringere Affinität als zu Oligosacchariden. Bindungstaschen von Lektinen sind in der

Lage, mit mehr als einer Monosaccharid-Einheit eines Oligosaccharids zu interagieren,

welches sich in einer höheren Affinität äußert [197, Seite 1015]. Oligosaccharide sind

größer als Monosaccharide, dadurch ergibt sich eine größere Kontaktfläche für die

Ausbildung hydrophober Effekte und es kann ein größeres Wasserstoffbrückennetz

ausgebildet werden.

Eine ähnliche Präferenz synthetischer, acyclischer Liganden gegenüber Disacchariden

in organischen Lösungsmitteln wurde durch Mazik et al. gefunden. Sie synthetisierten

mehrere Liganden und führten NMR- und Fluoreszenz-Titrationen in Chloroform durch.

Beispielsweise zu -Maltose, einem Disaccharid bestehend aus zwei Glucose-

monomere, konnte für einen der synthetisierten Liganden unter Annahme eines

1:1-Komplexes eine Dissoziationskonstante von 2,7·10-6 M bestimmt werden. Dagegen

war die Affinität des gleichen Liganden zu -D-Glucopyranose mit KD = 1,3·10-3 M

deutlich niedriger. Als Grund vermuten sie ein ähnliches multivalentes Bindungs-

verhalten, wie sie auch bei Protein-Kohlenhydrat-Komplexen auftreten. Aufgrund der

Größe des Disaccharids können sich mehr Wasserstoffbrücken bzw. CH- -Kontakte zu

dem Liganden ausbilden. Des Weiteren zeigten die Experimente und Molecular

Modeling Studien auch die Formation eines 2:1-Komplexes. Hier ist das Disaccharid

ähnlich wie in Abb. 25 zwischen zwei Liganden „eingeklemmt“, so dass sich von zwei

Seiten effektiv Wasserstoffbrücken bzw. CH- -Kontakte zum Kohlenhydrat ausbilden

[198, Seite 2068; 199, Seite 1564].

Das kann damit eine mögliche Erklärung für das Verhalten sein, das Disaccharid

bevorzugt zu adsorbieren. Zwei benachbarte TBL1- bzw. TBL2-Moleküle auf dem

Silica bilden mit einem 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose-Molekül einen

2:1-Komplex, der mit den Monosaccharidstrukturen nicht gebildet wird. Durch die

größere Anzahl von Bindungen wird die Affinität zum Disaccharid gesteigert.

2:1-Komplexe bei der Kohlenhydraterkennung in Wasser durch synthetische Liganden

werden ebenfalls von Mazik et al. beschrieben [200, Seite 2963].


4.7.3 Vergleichende SPR-Interaktionsstudien mit natürlichen Liganden

In den beiden vorangegangenen Abschnitten ist experimentell die Eignung von

Triazinliganden für Affinitätstrennverfahren untersucht worden. An dieser Stelle soll ein

Vergleich mit natürlichen Liganden stattfinden. Für die Experimente werden das Lektin

AAL und ein polyklonaler Antikörper gegen humanes Haptoglobin verwendet.

Beide Liganden werden mittels Amin-Coupling auf die Oberfläche des CM5-Chips

immobilisiert (Abschnitt 4.6.1). Hierfür wird von AAL eine 0,5 mg/mL und von dem

polyklonalen Antikörper eine 0,01 mg/mL Lösung in Acetatpuffer hergestellt und auf die

aktivierte Chipoberfläche injiziert. Nach der Immobilisierung beträgt die Oberflächen-

belegung für AAL 0,09 µmol/m2 und für den Antikörper 0,03 µmol/m2.

Abb. 47: Spezifische Desorption von TG durch Fucose. Nach dem Ende der Injektion einer 0,15 µM TG-Lösung bei einem Fluss von 10 µL/min (1) genügt zur vollständigen Desorption ein kurzer Impuls einer 100 mM Fucose-Lösung (2).

Abb. 47 zeigt, dass durch einen kurzen Fucose-Impuls (100 mM) das Glycoprotein TG

von der Chipoberfläche vollständig und spezifisch desorbiert werden kann. Für die

Haptoglobin-Desorption wird eine 10 mM Glycin-Lösung (pH 1,5) verwendet. Unter

diesen Bedingungen denaturieren die Bindungspartner, in Folge dessen sich die starke

Antigen-Antikörper-Bindung löst. Im Regenerationsschritt erfolgt die Renaturierung des

Antikörpers.


Abb. 48: Bestimmung der Dissoziationskonstanten von AAL und TG (A und B) sowie zwischen dem polyklonalen Antikörper und Haptoglobin (C und D). In A und C der Abbildung sind die Sensorgramme der Konzentrationsreihen dargestellt. Die Konzentrationen von TG und Haptoglobin sind in µmol/L angegeben. Das Resonanz-signal im Gleichgewicht (grau hinterlegter Bereich in A und B) wird gegen die jeweilige Konzentration zum Erhalt der Adsorptionsisothermen aufgetragen (C und D). Experimentelle Bedingungen: Fluss 10 µL/min; Injektionsvolumen 110 µL; Kontaktzeit 660 s, Puffer HBS-EP.

Zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten von AAL gegenüber TG und des

Antikörpers gegenüber Haptoglobin werden Sensorgramme bei verschiedenen

Konzentrationen aufgezeichnet und daraus die jeweiligen Adsorptionsisothermen

ermittelt (Abb. 48). Nach dem Klassifizierungssystem von Giles et al. können die

bestimmten Isothermen dem L2-Typ zugeordnet werden, wobei es sich um die

Langmuirische Adsorptionsisotherme handelt [201, Seite 3975]. Aus den SPR-Daten

berechnen sich die Dissoziationskonstanten wie folgt.

Im Gleichgewicht läuft die Adsorption und Desorption der Zielmoleküle gleich schnell

ab. Die Geschwindigkeitsgleichung für eine Interaktion zweier Bindungspartner (vgl.

Gleichung (1) in Abschnitt 2.4.2) lautet demnach.

]LA[k]L[]A[kdt

]LA[dda (13)


Hier ist [LA] die Konzentration des Ligand-Zielmolekül-Komplexes, [A] die

Konzentration des Analyten, [L] die Konzentration des Liganden auf der Chipoberfläche

und ka bzw. kd die Geschwindigkeitskonstante für die Hin- und Rückreaktion.

Die noch unbesetzten Liganden zu einem beliebigen Zeitpunkt berechnen sich zu

[L] = [L]0 - [LA], wobei [L]0 die Gesamtzahl der immobilisierten Liganden darstellt. Wird

dieser Ausdruck in die obere Gleichung eingesetzt, ergibt sich dann folgender

Zusammenhang.

]LA[k]LA[]L[]A[kdt

]LA[dd0a (14)

Aufgrund des großen Überschusses an Zielmolekülen, die kontinuierlich über die

Sensorchipoberfläche geführt werden, kann [A] als konstant betrachtet werden.

Zwischen dem Resonanzsignal R und [LA] besteht ein linearer Zusammenhang und

man kann für Gleichung 14 auch schreiben, wobei Rmax das Resonanzsignal bei

vollständiger Belegung der Liganden mit Analytmolekülen ist.

RkRR]A[kdt

dRdmaxa (15)

Im Gleichgewicht ist dR/dt = 0 und nach Umstellung ergibt sich daraus die

Dissoziationskonstante KD. In der Gleichung ist RGG das Resonanzsignal im

Gleichgewicht.

]A[R

R]A[

k

kK

GG

max

a

dD (16)

Nach RGG umgestellt ergibt sich folgende Gleichung.

D

maxGG K]A[

R]A[R (17)

Diese Gleichung entspricht der Langmuirischen Adsorptionsisotherme. Abb. 47B und D

zeigen die Auftragung von RGG gegen die injizierten Konzentrationen von TG und

Haptoglobin. Rmax und KD können durch nichtlineares Fitting oder durch Linearisierung,

z.B. durch Scatchard-Auftragung, von Gleichung 17 berechnet werden.

Dabei können Dissoziationskonstanten zwischen AAL und TG mit 2,9·10-7 mol/L und

zwischen dem polyklonalen Antikörper und Haptoglobin von 2,4·10-8 mol/L bestimmt


werden. Die ermittelten Dissoziationskonstanten liegen in einem Größenbereich, wie

man sie für Lektine und Antikörper erwartet [202, Seite 650]. Jedoch muss

einschränkend auf zwei Punkte hingewiesen werden. Die Konzentrationsreihen wurden

bei einer relativ niedrigen Flussgeschwindigkeit von 10 µL/min durchgeführt. Eine

niedrige Flussgeschwindigkeit kann dazu führen, dass der Massentransfer aus der

Lösung zu den Liganden der limitierende Schritt wird. Dadurch könnten zu niedrige

Konstanten bestimmt werden [203, Seite 169]. Zudem ist im grau hinterlegten Bereich

der Sensorgramme von Abb. 47A und C noch ein Anstieg zu verzeichnen, das

Gleichgewicht ist demnach noch nicht erreicht. Ursächlich hierfür kann der sehr hohe

Belegungsgrad der Liganden auf der Chipoberfläche sein, der dazu führt, dass in der

vorgegebenen Injektionszeit das Gleichgewicht nicht erreicht wird.

Für beide Liganden ist die Spezifität der Wechselwirkung mit einer BSA-Lösung

untersucht worden. Es konnte keine Interaktion zwischen AAL oder dem Antikörper

festgestellt werden.

In diesem Abschnitt konnte auf die hervorragende Affinität und Selektivität der Bindung

zwischen natürlichen Liganden und ihren jeweiligen Zielmolekülen hingewiesen werden.

Insbesondere die kompetitive Desorption, die zwischen TG und AAL möglich ist,

konnte zwischen den synthetischen Liganden und den verwendeten Modell-

glycoproteinen nicht realisiert werden.

4.8 Molecular Modeling und Docking Die Ergebnisse aus den Interaktionsstudien belegen die unspezifische Natur der

Wechselwirkung zwischen den Triazinliganden und den verwendeten Biomakro-

molekülen. Mit Hilfe von Molecular Modeling und Docking-Simulationen sollen Daten

zu Wechselwirkungsmechanismen erhalten werden, die experimentell so detailliert

nicht erhalten werden können. Zum einen soll die Stärke der Wechselwirkung

abgeschätzt werden, wobei in dieser Arbeit die geschätzte freie Bindungsenergie GB

berechnet wird. Zum anderen soll beurteilt werden, wie die Triazinliganden mit

Proteinen und Zuckern interagieren (Bindungsmodus). In Abschnitt 5 wird dann die

Entwicklung von Triazinliganden vorgestellt, die in der Schadstoffanalytik zur

Anwendung kommen sollen. Rechnergestützte Methoden werden hier verwendet, um

den Syntheseaufwand zu reduzieren. Nicht geeignete Strukturvorschläge werden im

Vorfeld bereits verworfen.

4.8.1 Grundzüge des Molecular Modeling und Docking Unter Molecular Modeling werden im Allgemeinen rechnergestützte Verfahren ver-

standen mit dem Ziel, das Verhalten (Struktur, Interaktionen, Wirkmechanismen) von


Molekülen oder Molekülsystemen zu simulieren [204, Seite 1]. Dabei wird in

Kraftfeldmethoden und quantenmechanische Verfahren unterschieden.

Kraftfeldmethoden sind empirische Verfahren, die auf der klassischen Newton-

Mechanik aufbauen. Atome eines Moleküls werden als „harte Kugeln“ aufgefasst [204,

Seite 184]. Die zwischen den Atomen eines Moleküls wirkenden kovalenten und nicht-

kovalenten Kräfte werden durch eine analytische Funktion mit anpassbaren

Parametern, dem Kraftfeld, beschrieben. Mit Hilfe von Kraftfeldrechnungen können

Energieminimierungen oder Konformationsanalysen (Berechnung von Struktur-

eigenschaften) durchgeführt werden. Sie können aber auch z.B. zur Berechnung von

Molekülspektren dienen [204, Seite 168]. Grundsätzlich ist jedoch festzuhalten, dass

kraftfeldbasierte Methoden für große Systeme, z.B. Proteine, aufgrund des geringeren

Rechenaufwandes angewendet werden.

Nachteil der kraftfeldbasierten Methoden ist der Ansatz der klassischen Mechanik.

Eigenschaften oder Vorgänge, die aufgrund der Elektronenverteilung im Molekül

zustande kommen (Bindungsbrüche, delokalisierte Bindungen), können nicht

berechnet werden. Hierzu müssen quantenmechanische Rechenverfahren

herangezogen werden. Mit diesen Verfahren wird versucht mit Hilfe der Schrödinger-

Gleichung die elektronische Struktur von Molekülen zu generieren. Die mathematisch

geschlossene Lösung ist nur für einfache Fälle, wie z.B. beim Wasserstoffatom,

möglich [205, Seite 229-231]. Daher ist man bei Molekülen zur Lösung auf Nährungen

angewiesen. Hierzu zählen semiempirische Methoden, die Dichtefunktionaltheorie und

ab initio-Methoden, wobei der Rechenaufwand und die Genauigkeit in der genannten

Reihenfolge zunehmen.

Die vorangegangenen Methoden sind auch Bestandteil des Dockings. Dabei handelt

es sich um eine Methode, bei der versucht wird, die bevorzugte Orientierung zwischen

einem Ligand und einem Zielmolekül zu berechnen. Über Scoring-Funktionen erfolgt

die Berechnung der geschätzten freien Bindungsenergie GB [205, Seite 310-313].

4.8.2 Durchführung der Simulationen Durchgeführt wurden die Berechnungen in der Arbeitsgruppe von Prof. Niemeyer an

der Helmut-Schmidt-Universität Hamburg. Die im Folgenden angegebene Durch-

führung wird nur in Ihren Grundzügen beschrieben.

Die Generierung der Ligandenmodelle erfolgt mit der Software ChemBio3D Ultra 11.0

[206, Seite 4612]. Um den experimentellen Verhältnissen möglichst nahe zu kommen,

bestehen Ligandenmodelle aus den eigentlichen Triazinliganden und einem kurzen

Ausschnitt des jeweiligen Trägermaterials. Diese Startstrukturen werden um alle

fehlenden Wasserstoffatome ergänzt [207, Seite 320]. Zur Geometrieoptimierung wird

das Kraftfeld MMFF94 (algorithm steepest descent) verwendet [208, Seite 209]. Eine


weitere Optimierung der Molekülstruktur erfolgt mit der semiempirischen PM3-Methode

(MOPAC). Mit Hilfe dieser quantenmechanischen Berechnungen kann die Genauigkeit

der Endergebnisse erhöht werden [209, Seite 1]. Die optimierten Startstrukturen

werden im PDB-Format gespeichert und in AutoDock 4.0 importiert. Das Docking-

Programm berechnet die GB-Werte. [210, Seite 293; 211, Seite 1639]. Stellen kleine

Moleküle die Zielmoleküle (Saccharide oder Schadstoffe vgl. Abschnitt 5) dar, werden

auch sie in entsprechender Weise für das Docking vorbereitet. Im Gegensatz dazu

werden die 3D-Strukturen von Proteinen von der Protein Data Base bezogen und

optimiert. Docking-Studien mit GOD wurden zum einen mit GOD aus A. niger (PDB-

Datei 1CF3) und zum anderen mit GOD aus P. amagasakiense (PDB-Datei 1GPE)

durchgeführt [212, Seite 971], da nur von dem Enzym aus P. amagasakiense die

dimere Struktur vorlag. Eine Einschränkung bei den PDB-Dateien muss jedoch in

Betracht gezogen werden. In beiden Fällen wurde im Vorfeld der Kristallisation und

röntgenkristallographischen Studien GOD partiell deglycosyliert. Dabei wurden etwa

95 % des Kohlenhydratanteils von GOD entfernt [213, Seite 208]. Korrekturen an den

Aminosäuren (z.B. Korrektur Bindungsordnung, Bindungswinkel) werden mit dem

SwissPDB-Viewer 4.0.1 durchgeführt. Fehlende Wasserstoffatome werden in chemisch

korrekter Weise ergänzt, um mögliche Ausbildungen von Wasserstoffbrücken-

bindungen zu modellieren. Weiterhin sind alle Torsionen frei rotierbar, was die

Genauigkeit der Berechnungen erhöht. Dadurch soll auch eine größtmögliche Anzahl

an Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Liganden und Zielmolekülen erreicht

werden. Die Parameter für die paarweise berechneten atomaren Interaktionen folgen

dem Lennard-Jones-Modell [214, Seite 301; 215, Seite 215; 216, Seite 1518] Als

Suchalgorithmus für das Docking wird der Lamarckian-genetic-Algorithmus mit

folgenden Parametern verwendet, die in Tabelle 7 aufgeführt sind [211, Seite 1639].

Tabelle 7: Lamarckian-genetic-Algorithmus Parameter

Parameter Wert

Number of docking runs (conformations) 50

Population size 150

Max. number of generation per individual 2,5·107

Number of generations for picking worst individual 10

Max. number of top individuals that automatically survive 1,0

Grid map setting points and spacing 126·126·126; 0,900 Å

Rate of gene mutation 0,02

Rate of crossover 0,8

Variance of cauchy distribution for gene mutation 1,0


4.8.3 Ergebnisse der Simulationen Bei der Modellerstellung wurde das jeweilige Trägermaterial berücksichtigt, welches

bei den Interaktionsstudien angewendet wurde.

Um SPR-Ergebnisse mit den Docking-Ergebnissen vergleichen zu können, wird ein

Dextranmodell konstruiert, auf dem die Liganden entsprechend den realen

Verhältnissen immobilisiert sind. Dabei wird von einer Carboxygruppe pro Glucose-

monomer ausgegangen [177, Seite 1527]. Nicht von Liganden besetzte Carboxy-

gruppen sind im Modell mit Ethanolamin geblockt worden. Es wurden Modelle mit

hoher und niedriger Ligandendichte konstruiert, da bei den SPR-Studien ebenfalls

Sensorchips mit unterschiedlicher Ligandendichte hergestellt worden sind (Abb. 49).

Für ergänzende Modeling-Studien zu den Adsorptionsexperimenten mit TBL1- und

TBL2-Silica wird ein Silicamodell verwendet, welches in der Arbeitsgruppe von

Prof. Niemeyer an der Helmut-Schmidt-Universität Hamburg entwickelt wurde. Wie bei

dem Dextranmodell werden die Liganden auf dem Silicamodell entsprechend den

experimentellen Verhältnissen immobilisiert.

Abb. 49: Strukturformeln der Ligandenmodelle am Beispiel von NH2-TBL2 mit hoher (A), mittlerer (B) und geringer Ligandendichte (C). Orange hinterlegt ist die Dextranmatrix. Um die Berechnungszeit zu verringern, ist bei hohen und mittleren Ligandendichten auf einen größeren Ausschnitt der Dextranmatrix verzichtet worden.

4.8.3.1 Stärke der Wechselwirkung - Bindungsenergien Von den 50 verschiedenen Konformationen, die AutoDock innerhalb eines Docking-

Laufs berechnet, wird jeweils die niedrigste freie Bindungsenergie GB als Maß zur

Abschätzung der Affinität gewählt. Je kleiner die GB-Werte desto größer ist die Stärke

der Interaktion.

Neben GOD aus P. amagasakiense und A. niger werden drei Saccharide für die Unter-

suchung herangezogen. Methyl- -D-mannopyranose wird von Palanisamy et al. und


Gupta et al. als das Monosaccharid mit der höchsten Affinität zu den Triazinliganden

beschrieben [140, Seite 233; 142, Seite 280]. Das Trimannosid -Man(1 6) -

Man(3 1) -Man ist ein wichtiges Strukturelement (Trimannosylkern) von Glyco-

proteinen [9, Seite 522] und 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose konnte in

den Batch-Experimenten gut von TBL1-Silica adsorbiert werden.

In Tabelle 8 sind die GB-Werte bei Verwendung des Dextran-Modells, in Tabelle 9 die

Werte bei Verwendung des Silica-Modells dargestellt. Nur geringe Unterschiede

zwischen den GB-Werten der Saccharide und GOD bei Verwendung der

Dextranmodelle hoher und mittlerer Ligandendichte können festgestellt werden. Kein

einheitliches Bild ergibt sich, wenn das Modell niedriger Ligandendichte angewendet

wird. Für Methyl- -D-mannopyranose steigen die Werte, insbesondere bei NH2-TBL1,

auf ca. 10 kcal/mol an, was eine schwächere Bindung impliziert, wenn die Oberfläche

nur von wenigen Liganden belegt ist. Dagegen kann für GOD aus A. niger der niedrige

GB-Wert auch bei niedriger Ligandendichte berechnet werden.

Die Bindungsenergien bei Verwendung des Silicamodells liegen höher als bei

Verwendung des Dextranmodells, mit der Ausnahme von GOD aus A. niger bei

Verwendung des TBL2-Silica-Modells. GB konnte zu -8,16 kcal/mol berechnet werden.

Dagegen beträgt der Wert bei TBL2-Silica -0,16 kcal/mol. Diese Ergebnisse korrelieren

gut mit den Batch-Versuchen von TBL1- und TBL2-Silica mit GOD (vgl. Abschnitt

4.7.2.1). Die Bindungsenergien von 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose sind

in etwa genau so groß wie die von Methyl- -D-mannopyranose. Aus den

Dockingstudien kann eine Präferenz für das Disaccharid, die sich aus den

experimentellen Untersuchungen ergibt, nicht belegt werden (vgl. Abschnitt 4.7.2.2).

Tabelle 8: Ergebnisse der Docking-Simulationen bei Verwendung des Dextranmodells.

GB (kcal/mol)

Substrat NH2-TBL1

(hoch) NH2-TBL1

(mittel) NH2-TBL1 (niedrig)

NH2-TBL2 (hoch)

NH2-TBL2 (mittel)

NH2-TBL2 (niedrig)

GOD aus P. amagasakiense -2,79 -2,60 n.d. -5,96 -3,58 n.d.

GOD aus A. niger +2,37 +0,77 -1,07 -5,69 -2,34 -4,19

-Man(1 6) -Man(3 1) -Man (Trimannosylkern)

-4,32 -4,86 n.d. -4,73 -5,32 n.d.

4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose

-5,24 -4,09 n.d. -4,34 -4,98 n.d.

Methyl- -D-mannopyranose -4,86 -4,27 +9,17 -6,24 -5,21 -1,87


Tabelle 9: Ergebnisse der Docking-Simulationen bei Verwendung des Silicamodells.

GB (kcal/mol) Substrat

TBL1-Silica-Modell TBL2-Silica-Modell

GOD aus A. niger -0,38 -8,16

Methyl- -D-mannopyranose -1,24 -2,42

4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose -1,37 -2,70

Die erhaltenden GB-Werte bewegen sich in den Größenordnungen zu bekannten

Literaturwerten aus Docking-Studien mittels AutoDock zwischen Lektinen und

Sacchariden. Für synthetische Liganden existieren bisher keine Werte unter

Verwendung von AutoDock. Beispielsweise berechneten Neumann et al. zwischen

WGA und N-Acetylglucosamin einen GB-Wert von -3,81 kcal/mol und für ein

Disaccharid bestehend aus zwei N-Acetylglucosamin-Molekülen einen Wert

von -4,66 kcal/mol [216, Seite 1523]. Adam et al. untersuchten die Interaktion des

fucosespezifischen Lektins PA-IIL aus P. aeruginosa mit verschiedenen

Monosacchariden. Mit -L-Fucopyranose konnte GB zu -9,33 kcal/mol und zwischen

Methyl- -L-Fucopyranose zu -10,70 kcal/mol berechnet werden [217, Seite 2240].

Weitere Beispiele finden sich bei Nurisso et al. [218, Seite 474-477].

Aus den GB-Werten kann nicht ohne weiteres auf eine Glycospezifität der Liganden

geschlossen werden. Dazu muss die Orientierung der Bindungspartner zueinander

(Bindungsmodus) genauer untersucht werden (vgl. Abschnitt 4.8.3.2 und 4.8.3.3).

4.8.3.2 Bindungsmodus der Saccharide Die Untersuchung des Bindungsmodus der Saccharide wird exemplarisch am Beispiel

von Methyl- -D-mannopyranose unter Verwendung der Dextranmodelle vorgestellt.

In Abb. 50 sind die Konformationen zu den niedrigsten freien Bindungsenergien GB

zwischen den Dextranmodellen und Methyl- -D-mannopyranose dargestellt. Durch das

Programm AutoDock werden intermolekulare Wechselwirkungen zum einen als

Wasserstoffbrückenbindungen und zum anderen als sogenannte close contacts

ausgegeben. Dabei sind in Abb. 50 close contacts als sphärisches Drahtmodell

dargestellt. Auftretende Wasserstoffbrücken dagegen erscheinen als grün gepunktete

Linie zwischen den Atomen. Unter close contacts fasst AutoDock die übrigen

intermolekularen Wechselwirkungen zusammen, die keine Wasserstoffbrücken-

bindungen sind. Da AutoDock Interaktionen zwischen einzelnen Atomen von Liganden

und Zielmolekülen paarweise berechnet, werden die für die Kohlenhydratbindung


wichtigen OH- - und CH- -Wasserstoffbrücken ebenfalls in close contacts eingeordnet

[219, Seite 11416].

Abb. 50: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL2 (Dextranmodell) mit Methyl- -D-mannopyranose. Die Struktur des Zuckers ist gelb hinterlegt. In (A) ist NH2-TBL2 (hoch), in (B) NH2-TBL2 (mittel) und in (C) NH2-TBL2 (niedrig) abgebildet. In (D) ist die Orientierung einer CH- -Wasserstoffbrücke zwischen NH2-TBL2 (mittel) und Methyl- -D-mannopyranose dargestellt. Farbliche Zuordnung der Atome: Kohlenstoff grau; Wasserstoff hellgrau; Sauerstoff rot; Stickstoff blau. Wasser-stoffbrücken zwischen zwei Atomen sind als grün gepunktete Linie dargestellt.

Aus Abb. 50A geht hervor, dass sich bei hoher Ligandendichte ausschließlich close

contacts zwischen Methyl- -D-mannopyranose und NH2-TBL2 ausprägen, wobei in

dieser Konformation auch Wechselwirkungen mit der Dextranmatrix ausgebildet

werden.

Dagegen zeigt Abb. 50B die Ausbildung einer Wasserstoffbrücke zwischen einer

sekundären Aminogruppe des Liganden und dem Sauerstoffatom im Ring der Methyl-

-D-mannopyranose. Ebenfalls bilden sich eine Vielzahl von close contacts aus. Aus

der Lage der 5-Aminoindansubstituenten zum Zucker können einige close contacts

möglichen CH- -Wasserstoffbrücken zugeordnet werden, was anhand von Abb. 50D

erläutert werden soll. Hier ist Methyl- -D-mannopyranose in Wechselwirkung mit NH2-

TBL2 mittlerer Ligandendichte dargestellt. Zwischen dem Zentrum des aromatischen


Rings und dem Wasserstoffatom beträgt die Distanz 2,69 Å. Der Winkel der hierbei

entsteht, beträgt 137°.

Aus der Literatur sind vergleichbare CH- -Bindungslängen zwischen Lektinen und

Kohlhydraten bekannt [220, Seite 200]. Takahashi et al. führten zudem

Untersuchungen zwischen sechsgliedrigen aromatischen Ringsystemen als Protonen-

akzeptoren und verschiedenen organischen Protonendonatoren durch. Dabei konnte

festgestellt werden, dass sich die Bindungswinkel zwischen 150° und 170° bewegen.

Weiterhin konnte eine Korrelation zwischen Bindungslänge und -winkel zur Stärke der

ausgebildeten Wasserstoffbrücken beobachtet werden. Je größer die Bindungsstärke,

desto kleiner die Bindungslänge und der Bindungswinkel geht gegen 180° [221, Seite

2424]. Aufgrund des geringen Bindungswinkels kann daher von einer schwachen CH-

-Wechselwirkung zwischen Methyl- -D-mannopyranose und NH2-TBL2 bei mittlerer

Ligandendichte auf dem Dextranmodell ausgegangen werden.

Abb. 50C zeigt NH2-TBL2 bei niedriger Ligandendichte. Hier wird die Ausbildung

zweier Wasserstoffbrücken deutlich, jedoch ausschließlich zwischen der Dextranmatrix

und Methyl- -D-mannopyranose. GB fällt deutlich niedriger als bei hoher bzw.

mittlerer Ligandendichte aus.

Unter Verwendung des Dextranmodells von NH2-TBL1 konnten ausschließlich close

contacts berechnet werden. Dabei steht hauptsächlich die Dextranmatrix mit Methyl- -

D-mannopyranose in Wechselwirkung, wie Abb. 51 zeigt.

Abb. 51: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten G-Werten von NH2-TBL1 mit Methyl- -D-mannopyranose, dessen Struktur gelb hinterlegt ist. NH2-TBL1 (hoch) (A), NH2-TBL1 (mittel) (B), NH2-TBL1 niedrig (C).

Palanisamy et al. beschreiben das Auftreten von Wasserstoffbrücken zwischen TBL2

und Methyl- -D-mannopyranose. Dabei werden, im Gegensatz zu NH2-TBL2 bei

mittlerer Ligandenkonzentration, vier Wasserstoffbrücken zwischen den drei

Stickstoffatomen eines TBL2-Moleküls und den Hydroxylgruppen eines Methyl- -D-

mannose-Moleküls ausgebildet. Ein zweites TBL2-Molekül soll die Entstehung von CH-


-Interaktionen bewirken, die zwischen der Methylgruppe eines Methyl- -D-manno-

pyranose-Moleküls bewirken [142, Seite 280].

Ebenso beschreiben Gupta et al. für TBL1 das Auftreten von Wasserstoffbrücken

zwischen Ligand- und Zuckermolekül. In 1H-NMR-Titrationsexperimenten konnten sie

eine Veränderung der chemischen Verschiebung von Hydroxylgruppen-Protonen der

Zucker bei Zugabe von TBL1 beobachten. Daraus schlossen sie auf eine Beteiligung

der Hydroxylgruppen an Wasserstoffbrückenbindungen. Des Weiteren stützten sie die

experimentellen Befunde durch Molecular Modeling Studien. Hierbei konnte die

Ausbildung von zwei Wasserstoffbrücken zwischen TBL1 und Mannose sowie Glucose

beobachtet werden. Ferner vermuten sie eine derartige Konformation zwischen TBL1

und Mannose, bei der die Benzylreste so angeordnet sind, dass sie eine Kavität

ähnlich der „tempelartigen“ Struktur Abb. 25A bilden. Auf diese Weise soll es zu

weiteren, den Bindungskomplex stabilisierenden Interaktionen kommen [140, Seite

232].

In eigenen Dockingstudien konnte eine klare glycospezifische Interaktion zwischen den

TBL-Liganden und Methyl- -D-mannopyranose nicht bestimmt werden. Dockingstudien

mit den zwei anderen Sacchariden unter Verwendung des Dextranmodells sowie die

Verwendung des Silicamodells belegten ebenfalls keine eindeutige glycospezifische

Interaktion. Die Abbildungen hierzu befinden sich im Anhang (Abb. 80, Abb. 81,

Abb. 82 und Abb. 83).

4.8.3.3 Bindungsmodus von Glucose Oxidase Die Darstellungen zu den Orientierungen der Dextranmodelle zu GOD aus A. niger

befinden sich im Anhang unter Abb. 84 und Abb. 85. Zu erkennen ist, dass zwischen

den verwendeten Ligandmodellen keine glycospezifische Interaktion stattfindet. Close

contacts und vereinzelt auch Wasserstoffbrücken entstehen vornehmlich zu

Aminosäuren. Im Fall von NH2-TBL1 steht hierbei hauptsächlich die Dextranmatrix in

Kontakt mit den Aminosäuren Glutamin, Valin, Asparagin, Prolin, Glycin, Threonin und

Lysin. Bei NH2-TBL2 ist es Alanin, Asparagin, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Tyrosin,

Leucin und Lysin. Auch die Bindungsregion von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 an die

Untereinheit von GOD aus A. niger zwischen den einzelnen Ligandendichten ist

unterschiedlich. Das gleiche Bild ergibt sich für die Verwendung der Silica-Modelle,

wenn diese mit GOD aus A. niger gedockt werden (vgl. Abb. 86).

Erstaunlicherweise tritt bei der Verwendung von GOD aus P. amagasakiense ein

gegenteiliger Effekt auf (vgl. Abb. 87 im Anhang). Bei diesen Berechnungen steht

NH2-TBL1 und NH2-TBL2 sowohl bei hoher als auch bei mittlerer Ligandendichte über

close contacts mit dem aus fünf Monosacchariden bestehenden Glycan

[Man( 1 2)Man( 1 3)Man( 1 4)GlcNAc( 1 4)GlcNAc( 1) Asn] in Kontakt. Di-


rekte Wasserstoffbrücken zwischen den Liganden und dem Glycan konnten nicht

berechnet werden. Eine ähnliche Beobachtung kann auch für NH2-TBL2 gemacht

werden, wobei sich in diesem Fall auch verschiedene Aminosäuren von GOD in

Wechselwirkung mit dem Liganden befinden. Aus der Orientierung der beteiligten

Bindungspartner zueinander kann eine glycospezifische Interaktion ausgeschlossen

werden.

Die Sequenzhomologie von GOD aus P. amagasakiense zu GOD aus A. niger beträgt

81 %. Das Glycan von GOD aus P. amagasakiense, an dem die Wechselwirkung mit

NH2-TBL1 und NH2-TBL2 stattfindet, ist in beiden Enzymen chemisch identisch [222,

Seite 95]. Der Grund für die unterschiedlichen berechneten Interaktionen ist vermutlich

darin zu suchen, dass im röntgenkristallografischen Datensatz GOD aus

P. amagasakiense als Dimer und GOD aus A. niger als Monomer vorliegt. Damit sind

Interaktionen mit Aminosäuren möglich, die sonst nicht an der Oberfläche liegen

würden, sondern die Kontaktflächen zu den einzelnen Monomeren bilden.

4.9 Rückschlüsse In diesem Abschnitt wurde die Eignung zweier bekannter Triazinliganden für ihren

Einsatz in der Affinitätsseparation zur Anreicherung von Glycoproteinen untersucht. Im

Vergleich zu anderen synthetischen Kohlenhydratliganden zeichnen sich TBL1 und

TBL2 durch eine schnelle zwei- bzw. dreistufige Synthese aus. Die Einführung einer

primären Aminogruppe durch Umsetzung von TBL1 und TBL2 mit Ethylendiamin zu

NH2-TBL1 sowie NH2-TBL2 eröffnet die Möglichkeit, triazinbasierte Liganden auf

Sensorchips für SPR-Messungen zu immobilisieren. Im Gegensatz zu weiteren

Immobilisierungsmöglichkeiten kleiner Moleküle auf Sensorchips ergeben sich dadurch

zwei Vorteile. Zum einen können die Standardprotokolle und Standardreagenzien der

Hersteller verwendet werden. Zum anderen findet die Immobilisierung unter milden

Reaktionsbedingungen innerhalb des Biacore 3000 statt. Dadurch kann die

Ligandendichte auf der Sensorchipoberfläche sehr gut gesteuert werden. Die

Immobilisierung von TBL1 und TBL2 auf Silica konnte erfolgreich durchgeführt werden

und wird durch die Elementaranalyse bestätigt. Gestützt werden die Ergebnisse durch

einen neu entwickelten massenspektrometrischen Nachweis oberflächengebundener

Triazine.

Die Untersuchung des Adsorptionsverhaltens zu Mono- und Disacchariden in Wasser

und DMF zeigte, dass ausschließlich in dem organischen Lösungsmittel eine

Adsorption des Disaccharides durch TBL1 stattfindet. Dieses Ergebnis deckt sich mit

den Bindungseigenschaften synthetischer Liganden, die in der Literatur beschrieben

sind. In weniger stark kompetitiven Lösungsmitteln wie DMF, DMSO oder Chloroform

weisen sie deutlich höhere Affinitäten zu Kohlenhydraten als in Wasser auf.


Mit zwei verschiedenen Methoden wurde das Adsorptionsverhalten beider Liganden zu

größeren Molekülen (den Glycoproteinen) untersucht. Die SPR-Ergebnisse zeigen,

dass keine spezifische Adsorption zu den verwendeten Glycoproteinen GOD und TG

stattfindet. Ähnliche Ergebnisse konnten durch die Batchexperimente erhalten werden.

Zwar findet eine Adsorption von GOD statt, die jedoch nicht für Trennprozesse aus

komplexen Gemischen ausgenutzt werden kann, da nicht-glycosyliertes BSA ebenso

eine Anbindung aufweist.

Durch Anwendung computergestützter Methoden konnte die nicht-glycospezifische

Interaktion bestätigt werden.

Der in diesem Abschnitt gezogene Vergleich zu Lektinen und Antikörpern zeigt die

noch vorhandene Überlegenheit natürlicher Liganden. Die Interaktion zwischen

Lektinen und Glycokonjugaten ist ein derart komplexer Vorgang, der durch strukturell

einfache triazinbasierte Liganden nicht nachgeahmt werden kann. Die Anwendung der

Liganden in organischen Lösungsmitteln ist jedoch vielversprechend, da man gerade

die Liganden wegen ihrer Stabilität gegenüber den Lösungsmitteln einsetzten möchte.

Wenn sich die Affinität zu den gewünschten Molekülen in solchen Lösungsmitteln noch

erhöht, wäre das ein zusätzlicher Nutzen. Zu untersuchen bleibt die Anwendung auf

natürliche Vielstoffgemische.

Triazinliganden für die adsorptive Schadstoffanreicherung - 96 -

5 Triazinliganden für die adsorptive Schadstoffanreicherung und als Erkennungselemente chemischer Sensoren

Moderne instrumentell-analytische Verfahren sind hinsichtlich der Nachweisgrenze,

des Probendurchsatzes und anderer Kenndaten sehr leistungsfähig [223, Seite 4742-

4744]. War man vor ca. 50 Jahren in der Lage im parts per million-Bereich (ppm) zu

messen, liegen moderne Verfahren im parts per billion- (ppb) bzw. parts per trillion-

Bereich (ppt) oder darunter. Gas- oder Flüssigchromatographie mit nachfolgender

massenspektrometrischer Detektion werden im Allgemeinen zur Bestimmung von

Schadstoffen in Oberflächengewässern angewendet [224, Seite 31].

Nachteilig wirkt sich jedoch die Probennahme für diese laborgebundenen Verfahren

aus, insbesondere an unzugänglichen Orten. Beispielsweise können auf offener See

nur wenige Kampagnen im Jahr durchgeführt werden, wodurch die gewonnenen Daten

über Schadstoffkonzentrationen gering zeitaufgelöst sind [225, Seite 178]. Des

Weiteren müssen Proben in hinreichend großen Volumina gezogen werden, da die

Konzentration vieler Schadstoffe im Spurenbereich liegt [226, Seite 846]. Die nach-

folgende Dateninterpretation, z.B. die Modellierung der Verfrachtung von Schadstoffen,

Aussagen zu Veränderungen im Ökosystem, ist unter Umständen nicht möglich oder

gestaltet sich schwieriger [227, Seite 482]. Hier sind Verfahren wünschenswert, die

in situ automatisiert Schadstoffe in Oberflächengewässern, insbesondere im Meer-

wasser, im Spurenbereich erfassen.

Im ersten Teil dieses Abschnitts wird die Entwicklung und Charakterisierung von

Triazinliganden vorgestellt, die selektiv mit ausgewählten Schadstoffen interagieren

können. Mit Hilfe der Triazinliganden sollen zum einen Adsorbentien für

Anreicherungsverfahren von Schadstoffen hergestellt werden. Zum anderen sollen

Triazinliganden die Rezeptorfunktion chemischer Sensoren übernehmen. Dazu

müssen die Liganden auf der Oberfläche eines Sensors immobilisiert werden. Dies

kann u.a. durch Self Assembled Monolayer (SAM) geschehen. Im zweiten Teil dieses

Abschnitts wird ein Verfahren zur Herstellung von SAMs auf Goldoberflächen etabliert.

Als Sensormessprinzip wird hier die SPR eingesetzt.

5.1 Schadstoffauswahl Die Schadstoffe entstammen der Benzotriazolklasse. Aus dieser wurden 1H-Benzo-

triazol (BT), 4-Methyl-1H-benzotriazol (4-MeBT) und 5-Methyl-1H-benzotriazol (5-

MeBT) als Modellverbindungen ausgewählt (Abb. 52).


Abb. 52: Strukturformeln der verwendeten Benzotriazole.

1H-Benzotriazol und seine Derivate kommen bei einer Reihe von Anwendungen zum

Tragen. Sie werden als antikorrosiv wirkende Zusätze in Kühl- und Hydraulikflüssig-

keiten, in Gefrierschutzmitteln, in Enteisungsmitteln für Flugzeuge und als Silberschutz-

mittel in Spülmaschinenreinigern verwendet. Benzotriazole sind durch eine hohe

Wasserlöslichkeit gekennzeichnet und weisen einen niedrigen log KOW-Wert

(Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizient) auf. Jedoch sind sie schlecht biologisch ab-

baubar und toxisch für aquatische Organismen [228, Seite 1002; 229, Seite 559-560].

Daher lassen sich erhöhte Konzentrationen im Ablauf von Kläranlagen aber auch in

Flüssen und Seen nachweisen. Häufig findet man Konzentrationsspitzen in Gewässern,

die sich in der Nähe von Flughäfen befinden [230, Seite 7189]. Tabelle 10 gibt einen

Überblick zu den Konzentrationen ausgewählter Benzotriazole in der Umwelt.

Tabelle 10: Konzentrationen ausgewählter Benzotriazole in verschiedenen Gewässern und Abwässern.

Ort (Gewässer/ Abwasser) BT (µg/L) 4-MeBT (µg/L) 5-MeBT (µg/L) Literatur

Weil am Rhein (Rhein) 0,34 - 0,11 [230, Seite 7189]

Oberglatt, Schweiz (Glatt, Flughafennähe) 2,54 0,47 [230, Seite 7189]

Hamburg Blankenese (Elbe) 0,48 0,45 0,13 [231, Seite 600]

Berlin (Abwasser vor Abwasserbehandlung) 12 1 2 [232, Seite 7195]

Berlin (Abwasser vor Abwasserbehandlung) 8 1 2 [232, Seite 7195]

5.2 Chemische Sensoren Wolfbeis definiert chemische Sensoren als kleine Anordnungen die ein Erkennungs-

element, einen Transduktor und einen Signalprozessor enthalten und geeignet sind,

kontinuierlich und reversibel eine chemische Konzentration anzuzeigen [233, Seite

522]. Das hier genannte Erkennungselement entspricht der Rezeptorfunktion. Die

Triazinliganden sollen auf geeigneten Sensoroberflächen immobilisiert werden und

selektiv mit den ausgewählten Benzotriazolen interagieren. Tritt eine Wechselwirkung

zwischen Rezeptorfunktion und Schadstoff auf, ändern sich bestimmte physikalische

Eigenschaften an der Sensoroberfläche (z.B. Massenänderung, Leitfähigkeits-

änderung). Die Stärke dieser Änderung wird vom Transduktor interpretiert und in ein

elektrisches Signal umgewandelt, das vom Signalprozessor verarbeitet wird (Abb. 53B)

[234; Seite 9].


5.3 Anreicherungsverfahren Durch Anreicherungsverfahren sollen Benzotriazole aus Meerwasser mit Hilfe der

selektiv wirkenden Adsorbentien aufkonzentriert werden. Dagegen sollen Begleitstoffe

das Adsorbens passieren. Durch geeignete Bedingungen erfolgt die Desorption der

Benzotriazole vom Adsorbens. Die im Desorbat enthaltene Analytkonzentration ist

hinreichend für die Detektion. Nach Regeneration steht das Adsorbens für eine erneute

Schadstoffaufkonzentrierung zur Verfügung (Abb. 53A).

Eine Herausforderung bei der Entwicklung eines chemischen Sensors bzw. eines

Anreicherungsverfahrens für in situ-Messungen sind die Konzentrationen der

Schadstoffe in Oberflächengewässern. Diese liegen im ppb- und ppt-Bereich, bzw.

darunter (Abb. 53C und D).

Abb. 53: Schematische Darstellung der Messverfahren sowie Verdeutlichung der Heraus-forderung bei Messungen im Spurenbereich. (A) Schematische Darstellung eines Anreicherungsverfahrens. (B) Schematische Darstellung eines chemischen Sensors. (C) Bei Messungen im Spurenbereich mittels chemischer Sensoren muss KD hinreichend klein sein, damit das Gleichgewicht weit auf der Seite des Ligand-Schadstoff-Komplexes (LM) liegt. (D) Des Weiteren steigt der Messfehler, hier verdeutlicht durch die Horwitzfunktion [235, Seite 68A], je geringer die Konzentration des Analyten ist.


Diese niedrigen Schadstoffkonzentrationen können durch chemische Sensoren bisher

nur unter Zuhilfenahme von Antikörpern als Liganden gegen die zu messenden

Schadstoffe detektiert werden. Diese weisen die benötigte hinreichend kleine

Dissoziationskonstante auf. Wird die SPR als Sensormessprinzip gewählt, können

Schadstoffkonzentrationen im ppm- und ppb-Bereich gemessen werden.

Beispielsweise immobilisierten Hegnerová et al. auf einem SAM aus Alkylthiolen ein

Bisphenol A-BSA-Konjugat. Eine feste Konzentration eines polyklonalen anti-

Bisphenol A-Antikörpers wird mit der zu untersuchenden Wasserprobe gemischt und in

das SPR-Gerät injiziert. Nicht reagierter Antikörper bindet an das immobilisierte

Bisphenol A-BSA-Konjugat, was als Anstieg des Resonanzsignals erfasst wird.

Bisphenol A kann dabei bis zu einer Konzentration von 0,14 ng/mL (ppm-Bereich) in

Abwasserproben bestimmt werden [236, Seite 1966]. Zuvor gingen Soh et al. ähnlich

vor. Sie immobilisierten Bisphenol A jedoch direkt auf dem SAM [237, Seite 426].

Atrazin ist ebenfalls nach der genannten Methodik in Flusswasserproben bestimmt

worden. Farre et al. nutzten ein portables SPR-Gerät, wobei noch 20 pg/mL (ppb-

Bereich) detektiert werden konnten [238, Seite 212]. Weitere Beispiele zur Bestimmung

von 2,4-Dichlorophenoxyessigsäure und 2,4,6-Trinitrotoluol finden sich bei

Larsson et al. und Kim et al. [239, Seite 746; 240, Seite 1132].

Der Nachteil dieser Verfahren ist, dass Antikörper kostspielig hergestellt werden

müssen. Des Weiteren besitzen sie die Nachteile natürlicher proteinogener Liganden,

die in dieser Arbeit bereits angesprochen worden sind.

5.4 Ligandenentwicklung Um ein effektives und zuverlässiges chemisches Sensorsystem oder

Anreicherungsverfahren zu entwickeln, ist es notwendig die umweltgefährdenden

Stoffe als Einzelsubstanzen oder als Summenparameter zu erfassen. Zur Entwicklung

eines geeigneten Liganden bzw. einer geeigneten Rezeptorfunktion wird eine

Ligandenbibliothek erstellt. Aus dieser Bibliothek werden die vier besten Liganden mit

Hilfe computerchemischer Methoden herausselektiert [241, Seite 375]. Anschließend

erfolgt die Synthese, Charakterisierung und Immobilisierung auf Silica. Diese Arbeiten

wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Niemeyer an der Helmut-

Schmidt-Universität Hamburg durchgeführt.

Die Liganden, die für die Untersuchungen herangezogen worden sind, sind in Abb. 54

dargestellt. Bei den Substituenten von 1,3,5-Trichloro-2,4,6-triazin handelt es sich

ausnahmslos um aromatische Verbindungen (2-Naphthalenthiol, 4-Aminoquinaldin, 5-

Dimethylamino-1-naphthalensulfonamid, 2-Naphthalensulfonamid, 2-Aminobenzo-

thiazol).


Abb. 54: Strukturen der verwendeten Liganden. TBL-LC11 (A); TBL-LC19 (B); TBL-LC02 (C); TBL-LC20 (D).

Die Synthesevorschrift für TBL-LC19 ist nachfolgend hier kurz angerissen. Von 1,3,5-

Trichloro-2,4,6-triazin werden 1,3 mmol (0,25 g) in 6 mL Aceton und 2 mL Wasser

unter Rühren im Eisbad aufgelöst. Anschließend erfolgt die tropfenweise Zugabe einer

Lösung bestehend aus 1,3 mmol (0,2 g) Aminobenzothiazol und 1,3 mmol (0,12 g)

Natriumhydrogencarbonat in 2 mL Aceton und 4 mL Wasser. Der Reaktionsansatz wird

im Eisbad für 2 h gerührt, das entstehende Präzipitat wird abfiltriert, mit Aceton und

Ethanol gewaschen und getrocknet. Von dem mit Aminobenzothiazol substituierten

1,3,5-Trichloro-2,4,6-triazin werden 0,8 mmol (0,24 g) in 14 mL DMF/Wasser (6:1, v/v)

gelöst. Zu dieser Lösung wird unter Rühren 0,8 mmol (0,2 g) Dansylamid in DMF und

0,8 mmol (0,08 g) Natriumhydrogencarbonat in Wasser zugegeben. Nach Erwärmen

auf 45 bis 55 °C wird für 24 h gerührt. Das entstehende Präzipitat wird abfiltriert, mit

Aceton gewaschen und getrocknet. TBL-LC19 liegt als gelbliches Pulver vor.

Die Immobilisierung der Liganden erfolgt auf mit Aminopropyltriethoxysilan

silanisiertem Kieselgel 100 nach der in Abschnitt 4.6.2. beschriebenen Methode. Von

den funktionalisierten Kieselgelen werden 20 mg im trockenen Zustand in 2 mL Vials

eingewogen. APS-Silica dient als Negativkontrolle. Von BT und 5-MeBT werden

Lösungen in Wasser hergestellt (2 mg/mL). Hiervon werden je 1 mL zu den

Adsorbentien pipettiert und über Nacht inkubiert. Die Bestimmung von BT und 5-MeBT

erfolgt photometrisch bei einer Wellenlänge von =257 nm bzw. =263 nm. Hierzu wird

im Bereich von 0,02 µmol/mL bis 0,15 µmol/mL kalibriert. Vergleichsproben, die ohne

Adsorbens inkubiert worden sind, zeigten kaum Veränderungen der Konzentrationen.

Die Schwankung der bestimmten Werte, verglichen mit denen aus der Einwaage

berechneten Werte, liegt zwischen 5 und 10 %.

Die Ergebnisse aus den Simulationen sind in Abb. 55A dargestellt. Deutlich erkennbar

ist eine signifikante Selektivität von TBL-LC19 für BT gegenüber 5-MeBT. Die GB-

Werte betragen für BT ca. -10,2 kcal/mol, dagegen für 5-MeBT nur -1,9 kcal/mol. TBL-

LC02, TBL-LC11 und TBL-LC20 zeigen auch hohe GB-Werte (-10 bis -9 kcal/mol),

jedoch sind die Differenzen zwischen diesen für BT und 5-MeBT gering. Das als

Negativkontrolle untersuchte APS-Silica zeigt gegenüber beiden Schadstoffen


ebenfalls keine Präferenz. Die GB-Werte sind jedoch mit ca. -8 kcal/mol etwas

geringer. Die Orientierung von TBL-LC19 gegenüber BT ist in Abb. 55B dargestellt.

Dabei treten insbesondere - -Wechselwirkungen zwischen den Bindungspartnern auf.

Zudem bildet sich zwischen BT und der Silicaoberfläche eine Wasserstoffbrücke aus

[241, Seite 378].

Abb. 55: Simulationsergebnisse von BT und 5-MeBT gegenüber TBL-LC02, TBL-LC11, TBL-LC19, TBL-LC20 und APS-Silica (A). Orientierung von TBL-LC19 gegenüber BT bei der Konformation bei der niedrigsten Freien Bindungsenergie (B). BT ist in der Abbildung gelb hinterlegt. Die Linien zwischen TBL-LC19 und BT deuten die - -Wechselwirkung an [241, Seite 378].

Adsorptionsversuche im Batch wurden mit TBL-LC02, TBL-LC11 und TBL-LC19

durchgeführt. Als Negativkontrolle diente erneut APS-Silica. Die Ergebnisse sind in

Abb. 56 dargestellt. Hier bestätigen sich die Simulationsergebnisse hinsichtlich TBL-

LC19. Dieser Ligand zeigt eine deutlich höhere Adsorption von BT verglichen mit 5-

MeBT. Obwohl die Simulationsergebnisse auf keine Präferenz von TBL-LC02

gegenüber einem der untersuchten Schadstoffe hindeuten, zeichnet sich in den

Experimenten ein anderes Bild ab. TBL-LC02 adsorbiert im hohen Maße 5-MeBT. TBL-

LC11 und die Negativkontrolle APS-Silica präferiert keinen der Schadstoffe. Weiterhin

können die Ergebnisse, mit der Ausnahme von TBL-LC02 gegenüber 5-MeBT, gut mit

den Simulationsergebnissen qualitativ korreliert werden [241, Seite 379].


Abb. 56: Ergebnisse der Adsorptionsversuche. BT (1), 5-MeBT (2).

5.5 Self Assembled Monolayer als Grundlage chemisch-sensitiver Oberflächen

SAMs aus Alkylthiolen bieten eine Möglichkeit, Oberflächen für sensorische

Anwendungen maßgeschneidert zu modifizieren. Neben der hier angewendeten SPR

sind SAMs mit einer Reihe anderer Sensormesstechniken kompatibel, bei denen

Massenänderungen auf einer Oberfläche detektiert werden (z.B. Quarzkristall-

Mikrowaage, Ellipsometrie, Infrarot-Reflexions-Absorptions-Spektroskopie) [242, Seite

1146]. Somit können Protokolle für Oberflächenmodifizierungen durch SAMs auf

andere Sensormesstechniken übertragen werden. Des Weiteren können Sensor-

oberflächen aus SAMs reproduzierbar für mehrere Messungen eingesetzt werden.

Beispielsweise der durch Farre et al. entwickelte SPR-Sensor für Atrazin wurde

120 mal reproduzierbar auf Flusswasserproben angewendet [238, Seite 212].

Grundsätzlich können zwei Möglichkeiten unterschieden werden, hochgeordnete

Monolagen auf eine Oberfläche zu bringen. Einerseits durch die Herstellung von

Langmuir-Blodgett-Schichten, bei der eine in einer Flüssigkeit geordnete Monolage

amphiphiler Moleküle auf einen Festkörper übertragen wird. Die andere Möglichkeit ist

die Herstellung von SAMs. Letztere Möglichkeit ist in dieser Arbeit zur Anwendung

gekommen. Die schematische Darstellung eines SAMs ist in Abb. 57A gegeben [243,

Seite 1543].

Zur Herstellung von SAMs werden langkettige amphiphile Moleküle verwendet. Sie

besitzen eine polare Kopfgruppe und einen unpolaren Molekülteil, in der Regel ein

langkettiger Alkylrest. Zur Bildung eines SAMs muss die polare Kopfgruppe in der Lage

sein, mit der Oberfläche eines Festkörpers zu interagieren, was unter anderem über

kovalente Bindungen geschehen kann. Beispielsweise können SAMs auf Glas-


oberflächen durch Silanisierung mittels langkettigen Silanen generiert werden. Starke

polare Wechselwirkungen zwischen Alkylthiolen und Gold, welche von ihrer Bindungs-

stärke her betrachtet bereits kovalenten Charakter haben, kann man ebenfalls zur

Herstellung von SAMs ausnutzten [244, Seite 45]. Die Alkylthiole besitzen die

allgemeine Formel HS-R-RE, wobei R für die Alkylkette und RE für eine funktionelle

Gruppe steht, an der weitere Reaktionen stattfinden können. Eine funktionelle Gruppe

muss jedoch nicht zwingend am Thiol vorhanden sein. Die Entstehung eines SAMs

läuft in zwei Schritten ab. Im ersten Schritt chemisorbiert die Thiolgruppe an der

Goldoberfläche, dabei entsteht ein Thiolat. Im zweiten Schritt sorgen van-der-Waals-

Wechselwirkungen, die zwischen den Alkylketten der Thiole auftreten, für den

spontanen Selbstanordnungsprozess [244, Seite 42-48].

5.5.1 Herstellung und Charakterisierung der SAMs auf den Sensorchips

Für die Herstellung der SAMs wird das SIA Kit Au von GE Healthcare, bestehend aus

den Goldchips und Chipträgern, verwendet. Außerhalb des Biacore 3000 werden die

SAMs auf die Goldchips aufgebracht. Gegen die verwendeten Chemikalien besitzt das

Biacore 3000 nur eine begrenzte Resistenz. Anschließend können die Goldchips auf

einen Chipträger geklebt werden um den Sensorchip einsatzfähig zu machen.

5.5.1.1 Kontaktwinkelmessung Zur Charakterisierung der Goldoberflächen vor und nach Aufbringen des SAMs werden

Kontaktwinkelmessungen durchgeführt.

Das Absetzen eines Flüssigkeitstropfens, hier Wasser, auf die Oberfläche eines

Festkörpers führt entweder zum Beibehalten der Tropfenform oder zur Benetzung der

Oberfläche. Welche Form sich ausbildet und wie groß der Kontaktwinkel zwischen

dem äußersten Berührungspunkt von Tropfenflüssigkeit und Festkörper ist, hängt von

der Natur des Festkörpers und der Flüssigkeit ab. In Abb. 57B ist die Definition des

Kontaktwinkels grafisch dargestellt.

Abb. 57: Schematische Darstellung eines SAMs aus 11-Mercaptoundecansäure (A). Zur Definition des Kontaktwinkels (B).


Durch Aufbringen eines SAMs auf die Goldoberfläche ändern sich die Oberflächen-

eigenschaften, somit muss sich auch der Kontaktwinkel ändern, was als indirekte

Erfolgskontrolle des Self Assembly-Prozesses dient.

Die Messungen werden mit dem Kontaktwinkelmesssystem DSA 100E durchgeführt,

das sich aus einem beweglichen Probentisch, einem Videosystem (bestehend aus

Kamera, Linsensystem, Prisma, Lichtquelle und Lichtblende) und dem Tropfendosier-

system zusammensetzt.

Kontaktwinkelmessungen können auf zwei verschiedene Arten durchgeführt werden,

die auf der Methode des liegenden Tropfens basieren. Bei der statischen Methode wird

der Tropfen durch das Dosiersystem auf die Oberfläche abgesetzt, die Injektionsnadel

herausgezogen und das Tropfenbild aufgezeichnet. Wird die dynamische Methode

angewendet, verbleibt die Injektionsnadel im Tropfen. Wahlweise kann Flüssigkeit

zudotiert oder entfernt werden, wobei dann sogenannte Fortschritts- bzw.

Rückzugswinkel bestimmt werden [245, Seite 161-164]. Die Kontaktwinkel werden in

dieser Arbeit nach der statischen Methode bestimmt. Hierzu ist ein optimales

Tropfenbild mit klarer Trennung zum Spiegelbild notwendig. Die Gesamtgröße des

Tropfens soll ca. 50 bis 70 % des Tropfenbildes einnehmen. Am Kontaktbereich des

Tropfens zur Oberfläche wird die Beleuchtungsstärke so eingestellt, dass der

Hintergrund gut vom Tropfen und der Oberfläche unterscheidbar ist. Gleiches gilt für

die Bildschärfe, da die Konturen des Tropfens klar erkennbar sein müssen. Durch die

Software wird aus dem Tropfenbild anschließend der Kontaktwinkel bestimmt.

5.5.1.2 Reinigung und Aufbringen des Monolayers Vor dem Aufbringen der SAMs ist eine Reinigung der Goldchips notwendig. Hierfür

wird ein Gemisch aus 96 %iger Schwefelsäure und 30 %igem Wasserstoffperoxid (3:1,

v/v) verwendet, in das die Goldchips für 30 bis 45 min eingelegt werden. Eventuell

anhaftende organische Substanzen werden dadurch oxidiert. Nachfolgend werden die

Chips mit Wasser gründlich gespült und mit gereinigter Druckluft getrocknet.

Die Dokumentation des Reinigungserfolges durch die Kontaktwinkelmessung zeigt

eine Abnahme des Winkels um ca. 20°. Vor der Reinigung beträgt der Kontaktwinkel

90°, nach der Reinigung 70°.

Zur SAM-Herstellung werden von den Thiolen (1-Octadecanthiol und 11-Mercapto-

undecansäure) 1 mM Lösungen in Ethanol hergestellt und die Goldchips in diese für

15 bis 18 h eingelegt. Danach werden die Chips mit Ethanol und Wasser gespült, mit

gereinigter Druckluft getrocknet und die Kontaktwinkel gemessen.

In Abb. 58 sind die Tropfenbilder der SAMs aus 1-Octadecanthiol und 11-Mercapto-

undecansäure dargestellt. 1-Octadecanthiol besitzt keine funktionelle Gruppe RE,


daher ist die Oberfläche des SAMs unpolar. Die Kontaktfläche zu Wasser ist daher

klein und der Kontaktwinkel wird größer (Abb. 58A). Im Fall von 1-Octadecanthiol

vergrößert sich der Winkel von 70° auf 106°, was eine erfolgreiche Aufbringung des

SAMs indiziert.

Abb. 58: Tropfenbild nach Aufbringen eines SAMs aus 1-Octadecanthiol (A) und 11-Mercaptoundecansäure (B)

Dagegen trägt 11-Mercaptoundecansäure als funktionelle Gruppe eine Carboxygruppe.

Somit ist nach Aufbringen eines SAMs aus diesen Molekülen eine Abnahme des

Kontaktwinkels zu erwarten, da die Oberfläche polarer wird. Schon mit bloßem Auge ist

dies in Abb. 58B zu erkennen. Tatsächlich verkleinert sich der Winkel auf etwa

20° bis 25°, was auch in diesem Fall auf eine positive SAM-Generierung schließen

lässt.

5.5.2 Verifizierung der SAM-Herstellung mittels Lektinen Neben der Kontaktwinkelmessung erfolgt der Nachweis der SAM-Herstellung durch die

Immobilisierung der Lektine Con A und RCA auf SAMs aus 11-Mercaptoundecansäure.

Neben dem in Abschnitt 4.6.1 beschriebenen Protokoll der Immobilisierung mittels

Amin-Coupling innerhalb des Biacore 3000 wird untersucht in wie fern die

Immobilisierung der Lektine außerhalb des Gerätes erfolgen kann. Für die sich

anschließenden Interaktionsstudien dienen die Modellglycoproteine GOD und ASF.

5.5.2.1 Concanavalin A und GOD Die Carboxygruppen des SAMs aus 11-Mercaptoundecansäure werden durch EDC

und NHS in aktivierte Ester überführt. In mehreren Impulsen wird eine 1 mg/mL Con A-

Lösung bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 µL/min injiziert. Abschließend werden

mit Ethanolamin verbliebene aktivierte Carboxygruppen deaktiviert und mehrere

Stunden mit HBS-EP-Puffer gespült.


Abb. 88A im Anhang zeigt ein Beispielsensorgramm der Immobilisierung von Con A.

Insgesamt ist bei der dargestellten Immobilisierung ein Signalanstieg von 1470 RU zu

beobachten, was einer Beladung von 0,014 µmol/m2 entspricht. Der theoretische Wert

bei maximaler Beladung liegt bei 0,034 µmol/m2 bei einem Platzbedarf von 50 nm2 pro

Con A-Molekül.

Anschließend werden 100 µL einer 2 mg/mL GOD-Lösung in HBS-EP-Puffer bei

10 µL/min injiziert (Abb. 59A). Auf der Referenzzelle ist kein Signalanstieg zu

verzeichnen. Dagegen findet auf der Con A-Flusszelle eine deutliche Adsorption statt.

Unmittelbar nach Ende der Injektion sind 300 RU GOD auf der Chipoberfläche

verblieben. In der Abbildung ist dies durch den Pfeil ohne Beschriftung kenntlich

gemacht worden. Diese lassen sich mit einer 1 M Methyl- -D-mannopyranose-Lösung

in HBS-EP-Puffer kompetitiv von der Oberfläche desorbieren. Nach zwei Injektionen

von je 20 µL Methyl- -D-mannopyranose können ca. 60 % an GOD entfernt werden.

Versuche mit einer 1 mg/mL BSA-Lösung zeigen, dass weder auf der Con A-Zelle

noch auf einer Referenzflusszelle ohne Con A eine Anlagerung auftritt (Abb. 59B).

Abb. 59: Beispielsensorgramme von Injektionen von GOD (A) und BSA (B) auf Con A be-schichtete SAMs. Injektion von GOD oder BSA bei (1 in Abb. 59A und Abb. 59B). Desorption mit Methyl- -D-mannopyranose bei (2 in Abb. 59A und Abb. 59B).

Bei der Immobilisierung außerhalb des Gerätes werden die Goldchips vor dem

Einsetzen in den Chiphalter mit Con A funktionalisiert. Die Oberfläche des Goldchips,

ebenfalls bestehend aus 11-Mercaptoundecansäure, wird mit 20 µL eines EDC/NHS-


Gemisches behandelt, anschließend wird mit 20 µL HBS-EP-Puffer gespült. Auf den

Chip werden für 1 min 20 µL Con A in Acetatpuffer gegeben, mit HBS-EP-Puffer

gespült und mit 20 µL Ethanolamin verbliebene aktivierte Carboxygruppen desaktiviert.

Nach erneutem Spülen mit Puffer wird der Chip in den Chiphalter eingesetzt und ist

einsatzfähig. Jeder der vorangegangenen Schritte wird fünfmal ausgeführt.

Nach dem Einsetzen des Chips zeigt sich nach 60-minütigem Spülen mit HBS-EP-

Puffer eine deutliche Abnahme des Resonanzsignals. Das deutet auf ungebundenes

Con A auf dem SAM des Sensorchips hin. Nach Stabilisierung des Resonanzsignals

der einzelnen Flusszellen erfolgt die Injektion von 50 µL einer 1 mg/mL GOD-Lösung

bei einem Fluss von 10 µL/min. Unmittelbar danach verbleiben 142 RU auf der

Oberfläche. Die anschließende Desorption mit Methyl- -D-mannopyranose verläuft

äußerst unbefriedigend. Im Vergleich mit direkt im Biacore 3000 immobilisiertem Con A

ist es nicht möglich GOD zu desorbieren. Eine Wiederholung des Versuchs nach 24 h

zeigt, dass keine Adsorption von GOD mehr möglich ist. Dies deutet auf eine Ablösung

des Lektins vom SAM hin. Das Sensorgramm hierzu ist in Abb. 89A im Anhang

dargestellt.

5.5.2.2 Ricinus Communis Agglutinin und ASF Unter den gleichen Bedingungen wie für Con A beschrieben wird die Immobilisierung

von RCA auf dem SAM durchgeführt (Abb. 88B im Anhang). Nach der einmaligen

Injektion einer 1 mg/mL RCA-Lösung verbleiben 1400 RU auf der Chipoberfläche

(Abb. 60A). Es ergibt sich eine Oberflächenbelegung von 0,012 µmol/m2. Der

theoretische Wert bei maximaler Beladung für RCA liegt bei 0,022 µmol/m2, ausgehend

von einem Platzbedarf von 64 nm2 pro RCA-Molekül. Wird eine 1 mg/mL ASF-Lösung

injiziert, zeigt sich ein deutlicher Anstieg der Signalstärke. 70 % des adsorbierten ASF

konnten mittels 0,1 M Lactose-Lösung desorbiert werden. Wird eine ASF-Lösung auf

eine Referenzzelle injiziert, kann ebenfalls eine Wechselwirkung beobachtet werden.

Es bindet nahezu die gleiche Menge ASF an die Referenzflusszelle wie an die

Flusszelle mit RCA. Jedoch fällt das Signal deutlich schneller ab und es kann auf der

Referenzflusszelle auch nicht mit Lactose-Lösung desorbiert werden (Abb. 60A).

In Abb. 60B ist ein Beispielsensorgramm der Injektion von BSA auf einen mit RCA

beschichteten SAM dargestellt. Wechselwirkungen zwischen dem Lektin und dem

Testprotein sind nicht zu beobachten. Eine schwache unspezifische Adsorption tritt

dagegen zwischen der Referenzzelle und BSA auf.


Abb. 60: Beispielsensorgramme von Injektionen von ASF (A) und BSA (B) auf RCA be-schichtete SAMs. Injektion von ASF oder BSA bei (1 bei Abb. 60A und Abb. 60B). De-sorption mit Lactose bei (2 bei Abb. 60A und Abb. 60B).

Die Durchführung der Immobilisierung von RCA außerhalb des Biacore 3000 entspricht

der von Con A. Die Sensorgramme der Interaktionsstudien sind im Anhang in Abb. 89B

dargestellt. Im Gegensatz zu Con A zeigt sich eine stabile Basislinie in allen vier

Flusszellen nach der Immobilisierung, dass als Indiz für die nicht vorhandene kovalente

Bindung von RCA zum SAM gesehen werden kann. Die Injektion einer 1 mg/mL ASF-

Lösung führt zu einem deutlichen Anstieg des Resonanzsignals. Die Desorption mit

0,1 M Lactose-Lösung zeigt jedoch erneut nur eine Teildesorption. Nach diesem Schritt

sind noch ca. 45 % ASF auf der Chipoberfläche. Bei der Immobilisierung innerhalb des

Gerätes liegt der Wert bei 30 %. Bessere Desorptionsergebnisse lassen sich erzielen,

wenn geringer konzentrierte ASF-Lösungen verwendet werden. Beispielsweise können

72 % desorbiert werden, wenn eine Konzentration von 0,1 mg/mL verwendet wird. Im

Gegensatz zu Con A können die Versuche mit RCA auf bereits verwendeten Chips

auch nach 24 h reproduziert werden.

5.6 Rückschlüsse Autarke chemische Sensormesssysteme stellen hohe Anforderungen an die

verwendeten Materialen. Bedingt durch den hohen Salzgehalt fördert Meerwasser die

Korrosion metallischer Werkstoffe. Biofouling stellt ein weiteres Problem dar.

Chemisch-sensitive Schichten, die selektiv mit Schadstoffen interagieren, müssen von

Bewuchs freigehalten und ein möglicher biologischer oder chemischer Abbau


verhindert werden. In dieser Umgebung müssen Schadstoffe im Spurenbereich über

einen längeren Zeitraum durch die zu entwickelnden Sensorsysteme zuverlässig

erfasst werden.

Ein Schritt in der Entwicklung eines chemischen Sensors oder selektiven

Anreicherungsverfahrens wurde im vorangegangen Abschnitt aufgezeigt. Hier konnte

ein neuer Ligand (TBL-LC19) als potentieller Rezeptor, mit dessen Hilfe ein

chemischer Sensor für 1H-Benzotriazol entwickelt werden kann, identifiziert werden.

Dabei zeigt TBL-LC19 eine klare Präferenz gegenüber BT. 5-MeBT wird im deutlich

geringeren Maßstab adsorbiert. Es konnte auch die Eignung von Molecular Modeling

zur Entwicklung potentieller Liganden gezeigt werden. Durch Anwendung

computergestützter Verfahren kann der Syntheseaufwand auf wenige Liganden

reduziert werden.

Der erste Schritt der Generierung einer chemisch-sensitiven Schicht mittels

Self Assembled Monolayer bestehend aus 1-Octadecanthiol und 11-Mercaptoundecan-

säure konnte ebenfalls gezeigt werden. Die angewendeten Methoden führen zur Aus-

bildung des gewünschten SAMs auf einer Goldoberfläche. Die anschließende Immo-

bilisierung von Lektinen sowie SPR-Interaktionsstudien mit Glucose Oxidase und

Asialofetuin konnten ebenfalls erfolgreich durchgeführt werden. Somit steht ein Träger-

system für die Liganden zur Verfügung, welches sich auf verschiedene Sensor-

messprinzipien übertragen lässt.

Klar ist auch, dass die Synthese und Charakterisierung von TBL-LC19 nur den ersten

Schritt darstellt. Von besonderem Interesse ist die Bestimmung von Adsorptions-

isothermen um das Adsorptionsverhalten im Spurenbereich zu charakterisieren. Mit

Hilfe dieser Daten kann anschließend ein mögliches Sensormessprinzip festgelegt

werden. Hierzu sind weitere nachfolgende Arbeiten nötig.

Zusammenfassung - 110 -

6 Zusammenfassung Diese Arbeit befasst sich mit der Entwicklung affinitätsbasierter Verfahren, die zur

Aufreinigung von Glycoproteinen und Kohlenhydraten eingesetzt werden sollen. Zu

den natürlichen Liganden, die eine Affinität zu Kohlenhydraten besitzen, zählen die

Lektine. Aufgrund ihrer proteinogenen Struktur und der geringen Verfügbarkeit sind

Lektine für viele affinitätsbasierte Verfahren nur eingeschränkt nutzbar. In diesen

Fällen ist es wünschenswert sie durch kleinere, stabilere und unbegrenzt vorhandene

Verbindungen zu ersetzen, ohne dabei an Affinität zu verlieren. Zu diesem Zweck

wurden die Eigenschaften von Triazin- und Boronsäureliganden evaluiert. Weiterhin

wurden aus diesen Ergebnissen maßgeschneiderte Anwendungen für diese Liganden

entwickelt, die es erlauben, gezielt die Vorteile zu nutzen und gleichzeitig die Nachteile

bestmöglich zu umgehen.

Für Boronsäureliganden ergibt sich die Anwendung einer ligandvermittelten

Affinitätstrennung, bei der die unspezifischen Wechselwirkungen minimiert werden. Bei

Triazinliganden zeigt sich eine erhöhte Affinität zu einigen Monosacchariden in

organischen Lösungsmitteln und zu ausgewählten anthropogenen Schadstoffen

(Benzotriazole). Diese Affinität kann für umweltanalytische Messungen und Monitoring-

Anwendungen genutzt werden.

Boronsäureliganden sind in der Lage mit Molekülen, bei denen in strukturell geeigneter

Weise Hydroxygruppen angeordnet sind, reversible cyclische Ester zu bilden. Ziel-

moleküle wie Glycoproteine, Kohlenhydrate oder das in der ligandvermittelten

Affinitätsseparation eingesetzte Thiaminpyrophosphat (TPP) erfüllen diese Bedingung.

Die Reversibilität beruht auf der pH-Abhängigkeit der Esterbindung. Die Desorption der

Zielmoleküle erfolgt demnach durch einen pH-Gradienten vom Basischen ins Saure.

Bei dem verwendeten Liganden m-Aminophenylboronsäure (ABA) ist der Ester unter

basischen Bedingungen stabil. Als Trägermaterial kam zum einen kommerziell

erhältliche ABA-Sepharose zum Einsatz, zum anderen wurde ABA auf einem

Polymethacrylatträger immobilisiert.

Zunächst wurde untersucht, ob ABA geeignet ist aus Blutplasma, einem der

komplexesten Vielstoffgemische überhaupt, Glycoproteine anzureichern. Diese

Versuche wurden im Säulendurchflussverfahren durchgeführt. Um die Spezifität der

Affinitätsseparation zu untersuchen, wurde die Desorptionsfraktion mittels 2D-Gel-

elektrophorese untersucht. Die Auftrennung zeigte, dass ABA unspezifische Wechsel-

wirkungen mit mehreren Molekülen eingeht und nicht ausschließlich Glycoproteine

anreichert. Eine deutliche Abnahme hochabundanter, nicht-glycosylierter

Verbindungen z.B. von Serum Albumin konnte nicht beobachtet werden. Daraufhin

erfolgte die Reduzierung der Komplexität des Vielstoffgemischs auf wenige glyco-


sylierte und nicht-glycosylierte Proteine. Auch hier zeigt sich die Neigung von ABA zur

unspezifischen Interaktion. Die Visualisierung der Desorptionsfraktionen mittels 1D-

Gelelektrophorese zeigt, dass selbst aus einfachen Gemischen keine vollständige

Abtrennung nicht-glycosylierter Proteine erfolgt. Die unspezifischen Wechselwirkungen

von ABA sind ionogener und hydrophober Natur, verursacht durch den Phenylring,

sowie dem unter basischen Bedingungen negativ geladenem Boratom.

Um eine mögliche Anwendung von Boronsäureliganden aufzuzeigen, wurde ein

ligandvermitteltes Affinitätsseparationsverfahren für das Enzym Benzoylformiat-

decarboxylase (BFD) entwickelt. Hierbei soll die unspezifische Adsorption auf ein

Minimum reduziert werden, indem alle ABA-Bindungsstellen vor der eigentlichen

Affinitätsseparation mit einem Reinstoff (Coenzym) abgesättigt werden. Der Cofaktor

TPP, den BFD für die biologische Funktion benötigt, interagiert mit ABA und konnte

erfolgreich temporär an einem ABA-Polymethacrylatträger immobilisiert werden. Durch

den Einsatz dieses Adsorbens können die Vorteile der starken Affinität und hohen

Selektivität der Enzym-Cofaktor-Wechselwirkung zusammen mit den einfachen und

milden Desorptionsbedingungen durch Verwendung eines schwach sauren Puffers

ausgenutzt werden. Aus einem Fermentationsaufschluss konnte so BFD aufgereinigt

werden, wie nach Anfertigung von 2D-Gelen gezeigt wurde. Zwar nahm die

Komplexität der Desorptionsfraktionen gegenüber dem Fermentationsaufschluss ab, es

zeigten sich dennoch unerwünschte Spots in den Gelen. Dies lässt auch hier den

Schluss zur Neigung der ABA zu unspezifischen Wechselwirkungen zu. Wird dagegen

TPP direkt an Polymethacrylatträger immobilisiert, kann ein noch höherer

Aufreinigungseffekt erzielt werden.

Im Gegensatz zu Boronsäureliganden interagieren Triazinliganden mit ihren Ziel-

molekülen über schwache intermolekulare Wechselwirkungen. Zwei Triazinliganden,

TBL1 und TBL2, die eine Affinität zu Kohlehydraten besitzen, wurden synthetisiert und

strukturell charakterisiert. Diese Liganden zeichnen sich durch eine einstufige

Synthese aus und können für Interaktionsstudien auf Silica-Trägermaterial

immobilisiert werden. Die Ergebnisse eines neu entwickelten massen-

spektrometrischen Charakterisierungsverfahrens nach Hydrolyse und Derivatisierung

des Silicas bestätigen die erfolgreiche Immobilisierung. Für zusätzliche

Interaktionsstudien mittels Oberflächenplasmonenresonanz-Messungen (Surface

Plasmon Resonance; SPR) wird eine Aminogruppe für die Immobilisierung in das

Molekül eingeführt.

Durchgeführte Interaktionsstudien mit glycosylierten und nicht-glycosylierten Proteinen

zeigten eine nicht ausreichende Affinität für Trennprozesse. Ferner ist die Bindung

nicht zuckerspezifisch, weil keine kompetitive Desorption mit einem geeigneten


Desorptionszucker möglich war. Durchgeführte Molecular Modeling Studien bestätigen

diese Ergebnisse.

Ein Vorteil der künstlichen Liganden gegenüber den voluminösen, unstabilen Lektinen

ist die mögliche Anwendung von organischen Lösungsmitteln in Trennprozessen.

Adsorptionsexperimente im Batch-Verfahren mit Mono- und Disacchariden in dem

organischen Lösungsmittel Dimethylformamid zeigte, dass das eingesetzte Disaccharid

4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose von den Liganden TBL1 und TBL2 in

großen Mengen adsorbiert wurde. Quantifiziert wurden die Zucker mittels einer LC/MS-

Methode. In weniger stark kompetitiven Lösungsmitteln wie DMF, DMSO oder

Chloroform weisen synthetische Liganden deutlich höhere Affinitäten zu

Kohlenhydraten auf, als dies in Wasser der Fall ist. Wasser bildet selbst Wasserstoff-

brücken zu Kohlenhydraten aus und konkurriert um die Bindungsstellen der

Kohlenhydrate. Daher ist die Anwendung der Liganden in organischen Lösungsmitteln

vielversprechend. Molecular Modeling und Docking-Simulationen wurden durchgeführt,

um Daten zu Wechselwirkungsmechanismen zu erhalten, die experimentell detailliert

nicht bestimmt werden können. Ein Vergleich zu natürlichen Liganden (Lektine und

Antikörper) zeigt die noch vorhandene Überlegenheit natürlicher Liganden hinsichtlich

Affinität und Selektivität.

Des Weiteren wurden Triazinliganden neu entwickelt, um sie in der adsorptiven

Schadstoffanreicherung und als mögliche Erkennungselemente für chemische

Sensoren einzusetzen. Ziel ist die Entwicklung von Verfahren, die in situ sowie

automatisiert Schadstoffe in Oberflächengewässern, insbesondere im Meerwasser, im

Spurenbereich erfassen. Als Modellschadstoffe wurden Benzotriazole ausgewählt, die

aufgrund ihrer technischen Bedeutung als antikorrosiv wirkende Zusätze verwendet

werden. In dieser Arbeit handelte es sich um 1H-Benzotriazol (BT) und 4-Methyl-1H-

benzotriazol (4-MeBT). Diese Stoffe werden in hohem Maße in die Umwelt freigesetzt.

Triazinliganden müssen dabei hohen Anforderungen genügen. Zum einen müssen sie

eine hinreichend hohe Affinität zu den Benzotriazolen besitzen, um im Spurenbereich

eine Detektion zu gewährleisten, zum anderen müssen eine sie hohe Selektivität

aufweisen, um zwischen verschiedenen Schadstoffen unterscheiden zu können.

Zur Generierung neuer Triazinliganden wurde eine Ligandenbibliothek erstellt und nach

der Durchführung von Modeling- und Dockingstudien die drei geeignetsten Liganden

synthetisiert und auf Silica immobilisiert. Aus den Simulationen geht hervor, dass

insbesondere TBL-LC19 zwischen den strukturell sehr ähnlichen Benzotriazolen BT

und 4-MeBT unterscheiden kann, bei gleichzeitig hoher Affinität zu BT. Durchgeführte

Adsorptionsexperimente bestätigen die Simulationsergebnisse. TBL-LC19 besitzt eine

klare Präferenz zu BT. 4-MeBT wurde im deutlich geringeren Maßstab adsorbiert. TBL-


LC19 stellt einen potentiellen Rezeptor dar, mit dessen Hilfe ein chemischer Sensor

oder Anreicherungsverfahren für 1H-Benzotriazol entwickelt werden kann.

Ein erster Schritt zur Entwicklung eines chemischen Sensors ist die gezielte

Oberflächenmodifizierung. Dies kann u.a. durch Self-Assembled-Monolayer (SAM)

geschehen. SAMs aus Alkylthiolen wurden auf Goldsensorchips für die SPR

aufgebracht und durch Kontaktwinkelmessungen sowie durch Interaktionsstudien nach

Funktionalisierung der SAMs mit Lektinen charakterisiert. Der Vorteil von SAMs ist,

dass sie mit einer Reihe anderer Sensormesstechniken kompatibel sind bei denen

Massenänderungen auf einer Oberfläche detektiert werden.

Summary - 114 -

7 Summary This thesis deals with the development of affinty-based processes to be used for the

purification of glycoproteins and carbohydrates. Lectins are natural compounds which

have an affinity to carbohydrates. Because of their proteinogenic character and their

inadequate accessibility the use of lectins in affinity-based processes is limited. In

these cases it is desirable to replace lectins with smaller, more stable and readily

available compounds without loosing affinity. For this purpose the properties of

triazine ligands and boronic acid ligands were evaluated. Furthermore tailor-made

applications for the ligands were developed from these results, which allow the use of

the benefits while the disadvantages are reduced.

Boronic acid ligands can be used for the ligand mediated affinity separation in which

unspecific interactions are reduced. Triazine ligands showed an increased affinity to

some monosaccharides in organic solvents and to an anthropogenic pollutant. This

affinity can be used for environmental measurements and monitoring purposes.

Boronic acid ligands have the ability to form reversible cyclic esters with their target. In

order to ensure that the ligand interacts with the target, the compound needs to

possess a suitable arrangement of hydroxyl groups. Target molecules like glycol-

proteins, carbohydrates or thiamine pyrophosphate (TPP), which were used for ligand

mediated affinity separation, fulfill this condition. The reversibility is based on the pH-

dependence of the ester bond, which is stable under basic conditions. The ligand m-

aminophenylboronic acid (ABA) was used. In addition to commercially available ABA-

Sepharose ABA was also successfully immobilized onto a polymethacrylate support.

Initially it was investigated whether ABA is suitable to enrich glycoproteins from blood

plasma, which is known to be one of the most complex fluids. These experiments were

carried out in the dynamic mode of affinity separation. Using 2D gelelectrophoresis it

was shown that ABA tends to unspecific interactions. A significant reduction of highly

abundant, non-glycosylated compounds e.g. serum albumin was not observed.

Because of these findings the complexity was reduced to a few glycosylated and non-

glycosylated proteins. However, also for a simple mixture ABA shows a tendency

towards unspecific adsorption. The visualization of the desorption fractions using 1D

gelelectrophoresis reveals that even in simple mixtures a complete removal of non-

glycosylated proteins was not achieved. The unspecific interactions of ABA are mainly

of ionic and hydrophobic nature, caused by the phenyl moiety and the boron atom of

ABA, which is negatively charged under basic conditions.

To demonstrate a possible application of boronic acid ligands a ligand mediated affinity

separation process for the enzyme benzoylformate decarboxylase (BFD) was

developed, in which the unspecific interaction should be reduced to a minimum through

Summary - 115 -

saturation of all ABA binding sites with a pure compound (cofactor). The cofactor TPP,

which is necessary for the biological function of BFD, interacts with ABA and was

successfully temporarily immobilized onto an ABA polymethacrylate support. Through

the use of this support the advantages of a strong affinity and high selectivity of the

enzyme cofactor interaction can be combined with the simple and mild desorption

conditions by using a slightly acidic buffer. In order to evaluate the designed application

BFD from a cell disruption was purified. The successful affinity separation was revealed

through 2D gelelectrophoresis. Although the complexity of the desorption fractions was

decreased, many undesirable protein spots appeared in the gels. This shows the

tendency of ABA towards non-specific interactions again. A higher purification effect

was achieved when TPP was immobilized directly onto a polymethacrylate support

without ABA.

In contrast to boronic acid based ligands triazine ligands interact with their target

molecules through weak intermolecular forces. Two triazine ligands (TBL1 and TBL2),

which have an affinity to carbohydrates were synthesized and structurally characterized.

The one-step synthesis of both ligands was carried out, followed by their immobilization

onto a silica support. The successful immobilization was shown by a newly developed

method, in which the mass spectrometry characterization took place after hydrolysis

and derivatization. For further interaction studies using surface plasmon resonance

(SPR) a primary amino group was introduced to TBL1 and TBL2.

Interaction studies carried out with different glycosylated and non-glycosylated proteins

displayed an insufficient affinity for separation processes. Moreover, the binding is not

sugar specific, because competitive desorption with a suitable desorption sugar was

not possible. Molecular modeling studies support the experimental findings.

One advantage of synthetic ligands over large and unstable lectins is a possible

application of organic solvents in separation processes. Batch experiments of

monosacchrides and disaccharides in dimethylformamide showed that high amounts of

the disaccharide 4-O- -D-galactopyranosyl-D-mannopyranose were adsorbed by TBL1

and TBL2. Quantification of the sugars was accomplished by using a LC/MS method.

In less competitive solvents like DMF, DMSO or chloroform synthetic ligands have

much higher affinity to carbohydrates than in water. Water itself forms hydrogen bonds

with carbohydrates and competes for the binding sites of carbohydrates. Therefore the

application of the ligands in organic solvents is promising. Molecular modeling and

docking studies were carried out to obtain data on interaction mechanisms, which can

not be determined experimentally in detail. A comparison with natural ligands (lectins

and antibodies) shows the superiority of natural ligands with regard to affinity and

selectivity.

Summary - 116 -

Furthermore, triazine ligands were developed to be used for the adsorptive

accumulation of pollutants and as possible recognition elements for chemical sensors.

The goal is the development of methods which can measure pollutants at trace levels

in situ and automatically in surface waters, especially in sea water. Benzotriazoles

were chosen as model pollutants, because of their technical relevance as anti-

corrosive additives. In this thesis 1H-Benzotriazole (BT) und 4-Methyl-1H-benzotriazole

(4-MeBT) were chosen. These substances are released into the environment to a large

extent.

Triazine ligands have to meet high requirements. On the one hand they must have an

affinity to the selected benzotriazoles to ensure detection at trace level. On the other

hand the selectivity of the ligands must be high to distinguish between different

pollutants.

In order to generate new triazine ligands a ligand library was built, from which the three

most appropriate ligands were chosen, synthesized and immobilized onto silica, due to

the promising results obtained from molecular modeling and docking studies. The

simulation results indicate that particular ligand TBL-LC19 can distinguish between the

structurally very similar benzotriazoles BT und 4-MeBT with a high affinity for BT.

Adsorption experiments confirmed the simulation results. TBL-LC19 has a clear

preference towards BT. 4-MeBT was adsorbed at a significantly smaller scale. TBL-

LC19 represents a potential receptor, which could be used for the development of a

chemical sensor or for the adsorptive accumulation of pollutants.

The first step in chemical sensor development is the selective surface modification,

which can be done for example with self assembled monolayer (SAM). SAMs

consisting of alkyl thiols were deposited onto gold sensorchips for SPR. The SAM

characterization was conducted by means of contact angle measurements and

interaction studies with glycoproteins after functionalization of the SAMs using different

lectins. The advantage of SAMs is the compatibility with a large number of other sensor

measurement techniques in which a mass change will be detected on a surface.

Anhang - 117 -

8 Anhang

8.1 Ergänzende Abbildungen und Tabellen

Abb. 61: BFD-Desorptionsfraktion ohne vorhergehende Absättigung mit TPP (zu Abschnitt 3.3.6.4)

Abb. 62: BFD-Desorptionsfraktion bei Verwendung eines HEPES-Laufpuffers mit einem pH-Wert von 6.9 (zu Abschnitt 3.4).

Anhang - 118 -

Abb. 63: ESI-MS von TBL1 (zu Abschnitt 4.4.1).


Anhang - 119 -

Abb. 65: ESI-MS von NH2-TBL1 (zu Abschnitt 4.4.2).


Anhang - 120 -

Abb. 67: 1H-NMR-Spektrum von TBL1 in DMSO-D6. H-1, H-2, H-3: 7,28 ppm (breites s, 10H, CH aromatisch); H-4: 4,59 ppm (breites s, 4H, CH2 Benzylamin). Bei dem 9,05 ppm-Signal kann es sich um die sekundären Amingruppen handeln [117, Seite 127]. Bei 2,50 ppm handelt es sich um DMSO (zu Abschnitt 4.4.1).

Abb. 68: 1H-NMR-Spektrum von TBL2 in CDCl3. H-1: 7,40 ppm (s, 2H, CH aromatisch); H-2: 7,24 ppm (d, 2H, CH aromatisch, 3J(H-3) = 9,1 Hz); H-3: 7,16 ppm (d, 2H, CH aromatisch, 3J(H-2) = 8,0 Hz); H-4: 2,89 ppm (t, 8H, CH2 aliphatisch, 3J(H-5) = 7,2 Hz); H-5: 2,09 ppm (quint, 4H, CH2 aliphatisch, 3J(H-4) = 7,4 Hz) (zu Abschnitt 4.4.1).

Anhang - 121 -

Abb. 69: 1H-NMR-Spektrum von NH2-TBL1 in DMSO. H-1, H-2, H-3: 7,19-7,45 ppm (m, 10H, CH aromatisch); H-4: 4,53 ppm (breites s, 4H CH2 Benzylamin); H-5: 3,60 ppm (breites s, 2H, CH2 Ethylendiamin); H-6: 2,98 ppm (d, 2H, CH2 Ethylendiamin, J = 27,8 Hz). Bei den Signalen größer 8 ppm handelt es sich vermutlich um die Protonen der Aminogruppen [117, Seite 127]. Bei 2,50 ppm handelt es sich um DMSO (zu Abschnitt 4.4.2).

Abb. 70: 1H-NMR-Spektrum von NH2-TBL2 in DMSO. H-1: 7,49 ppm (breites s, 2H, CH aromatisch); H-2: 7,38 ppm (breites s, 2H, CH aromatisch); H-3: 7,20 ppm (breites s, 2H, CH aromatisch); H-4: 2,84 ppm (breites s, 8H, CH2); H-5: 2,02 ppm (quint, 4H, CH2,

3J(H-4) = 7,1 Hz); H-6: 3,67 ppm (s, 2H, CH2 Ethylendiamin); H-7: 3,11 ppm (s, 2H, CH2 Ethylen-diamin). Bei den Signalen größer 8 ppm handelt es sich vermutlich um die Protonen der Aminogruppen [117, Seite 127]. Bei 2,52 ppm handelt es sich um DMSO (zu Abschnitt 4.4.2).

Anhang - 122 -

Abb. 71: 13C-NMR (DEPT45) von TBL1 in DMSO. C-1: 127,9 ppm; C-2: 128,8 ppm; C-3 127,5 ppm; C-4: 44,5 ppm (zu Abschnitt 4.4.1).

Abb. 72: 13C-NMR von TBL2 in CDCl3. C-1: 117,6 ppm; C-2: 119,5 ppm; C-3: 124,4 ppm; C-4: 33,0 ppm; C-5: 25,6 ppm; C-6: 32,4 ppm (zu Abschnitt 4.4.1).

Anhang - 123 -

Abb. 73: 13C-NMR (DEPT45) von NH2-TBL1 in DMSO. C-1: 128,2 ppm; C-2: 128,7 ppm; C-3 127,9 ppm; C-4: 43,6 ppm; C-5: 44,3 ppm; C-6: 38,5 ppm (zu Abschnitt 4.4.2).

Abb. 74: 13C-NMR (DEPT45) von NH2-TBL2 in DMSO. C-1: 118,5 ppm; C-2: 120,5 ppm; C-3: 124,6 ppm; C-4: 32,8 ppm; C-5: 25,6 ppm; C-6: 32,2 ppm; C-7: n.n.; C-8: 38,8 ppm (zu Abschnitt 4.4.2).

Anhang - 124 -

Abb. 75: Fragmentspektrum von (3-Aminopropyl)-tri-(trimethylsilyloxy)-silan (Hydrolyse-produkt von APS-Silica) (zu Abschnitt 4.6.2.2).

Abb. 76: Effekt von DMSO auf die aktivierte Oberfläche eines CM5-Chips. Im oberen Teil der Abbildung ist das gesamte Sensorgramm zu sehen, im unteren Teil ist der Bereich zwischen 20500 RU und 23000 RU auf der Ordinatenachse vergrößert dargestellt. Die Oberfläche wird aktiviert (1) und anschließend mit 10 % DMSO in Acetatpuffer be-handelt (2). Kurz danach erfolgt die Deaktivierung mit Ethanolamin (3). Wie aus der vergrößerten Abbildung hervorgeht, ist nur eine minimale Änderung des Resonanz-signals zu beobachten. Die Immobilisierung wird durch DMSO demnach nicht beeinflusst (zu Abschnitt 4.6.1).

Anhang - 125 -

Abb. 77: Injektion von NH2-TBL1 (A) und NH2-TBL2 (B) auf eine nichtaktivierte CM5-Chip-oberfläche (NH2-TBL1: 5 µL, 0,31 mg/mL, 5 µL/min; 5 µL, NH2-TBL2: 0,22 mg/mL, 5 µL/min). In beiden Fällen findet eine Vorkonzentrierung auf der Dextranoberfläche des CM5-Chips statt (400 RU bei NH2-TBL1, 50 RU bei NH2-TBL2). Es wird die Differenz nach dem Injektionsende und der Basislinie gebildet. Dies ist in der Abbildung durch die Pfeile und kenntlich gemacht (zu Abschnitt 4.6.1).

Abb. 78: Sensorgramm zur Interaktion von GOD mit NH2-TBL2 bei geringer Liganden-dichte. Bedingungen: 2 mg/mL GOD, Fluss: 5 µL/min, immobilisierte NH2-TBL2-Menge: 88 RU. Die Pfeile kennzeichnen Desorptionsversuche mit Methyl- -D-mannopyranose (0,5 M in HBS-N-Puffer) (zu Abschnitt 4.7.1).

Anhang - 126 -

Abb. 79: Sensorgramme zur Interaktion von NH2-TBL1 mit GOD (A), TG (B) und BSA (C). Bedingungen: 0,8 mg/mL für jedes Protein, Fluss: 20 µL/min, immobilisierte NH2-TBL1-Menge: 100 RU. Die Pfeile markieren Anfang und Ende der Injektionen (zu Abschnitt 4.7.1).

Anhang - 127 -

Abb. 80: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 mit -Man(1 6) -Man(3 1) -Man (Trimannosylkern). Das Trisaccharid ist gelb hinterlegt. NH2-TBL1 (hoch) (A); NH2-TBL1 (mittel) (B); NH2-TBL2 (hoch) (C); NH2-TBL2 (mittel) (D) (zu Abschnitt 4.8.3.2).

Abb. 81: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 mit 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose. Das Disaccharid ist gelb hinterlegt. NH2-TBL1 (hoch) (A); NH2-TBL1 (mittel) (B); NH2-TBL2 (hoch) (C); NH2-TBL2 (mittel) (D) (zu Abschnitt 4.8.3.2).

Anhang - 128 -

Abb. 82: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von TBL1-Silica (A) und TBL2-Silica (B) mit Methyl- -D-mannopyranose. Das Monosaccharid ist gelb hinterlegt (zu Abschnitt 4.8.3.2).

Abb. 83: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von TBL1-Silica (A) und TBL2-Silica (B) mit 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose. Das Disaccharid ist gelb hinterlegt (zu Abschnitt 4.8.3.2).

Anhang - 129 -

Abb. 84: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL1 zu GOD aus A. Niger. Der obere Teil der Abbildung zeigt die an der Interaktion beteiligten Aminosäuren und Zucker zum Liganden an, die in der Abbildung in gelber Farbe hinterlegt sind. Der untere Teil zeigt die Lage der Liganden in Bezug auf die gesamte Untereinheit von GOD. Liganden und Kontaktregion zum Enzym sind hier in brauner Farbe hinterlegt. NH2-TBL1 (hoch) (A), NH2-TBL1 (mittel) (B), NH2-TBL1 (niedrig) (C) (zu Abschnitt 4.8.3.3).

Abb. 85: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL2 zu GOD aus A. Niger. Zur weiteren Erklärung vgl. Abb. 84 (zu Abschnitt 4.8.3.3).

Anhang - 130 -

Abb. 86: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von TBL2-Silica zu GOD aus A. Niger. Der linke Teil der Abbildung zeigt die an der Interaktion betei-ligten Aminosäuren und Zucker zum Liganden an, die in gelber Farbe hinterlegt sind. Der rechte Teil zeigt die Lage der Liganden in Bezug auf die gesamte Untereinheit von GOD (zu Abschnitt 4.8.3.3).

Abb. 87: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 zu GOD aus P. Amagasakiense. NH2-TBL1 (hoch) (A), NH2-TBL1 (mittel) (B), NH2-TBL2 (hoch) (C), NH2-TBL2 (mittel). Zur weiteren Erklärung vgl. Abb. 84 (zu Abschnitt 4.8.3.3).

Anhang - 131 -

Abb. 88: Immobilisierung Con A (A) und RCA (B) an einen SAM bestehend aus 11-Mercaptoundecansäure. Nach der Aktivierung (1) schließt sich die Injektion der Lektin-Lösung an (2) gefolgt von der Deaktivierung verbliebener aktivierter Carboxy-gruppen (3) (zu Abschnitt 5.5.2.1 und 5.5.2.2).

Anhang - 132 -

Abb. 89: Sensorgramme von Immobilisierungen außerhalb des Biacore 3000. In (A) ist die Injektion von GOD auf einem Con A-SAM dargestellt. Dagegen ist in (B) die Injektion von ASF auf einem RCA-SAM abgebildet. (1) Injektion der Glycoproteine. (2) Desorptions-versuche mit Methyl- -D-mannopyranose bzw. Lactose (2) (zu Abschnitt 5.5.2.1 und 5.5.2.2).

Anhang - 133 -

8.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien

Tabelle 11: Verwendete Geräte. Verfahren Geräte Hersteller

AV-300 Steuerungssoftware: Topspin 2.1

Bruker BioSpin

Auswertungssoftware: SpinWorks 3 Kirk Marat, University of Manitoba

NMR-Spektroskopie

NMR-Röhrchen 5 mm (527-PP-7) Wilmad Labglass

Elementaranalyse Vario EL III Elementar

ESI-Massenspektrometrie API 4000 Steuerungs- und Auswertungssoftware: Analyst 1.4.2

AB Sciex

Dünnschichtchromatographie Kieselgel 60 F254 DC-Platten Merck

SPR-Interaktionsstudien Biacore 3000 Verwendete Sensorchips: C1, CM5 Chips zur SAM-Herstellung: SIA Kit Au Steuerungssoftware: Biacore 3000 Control Software 3.2 Auswertungssoftware: Biaevaluation 3.2

GE Healthcare

MALDI-Massenspektrometrie Ultraflex II TOF/TOF mit MALDI MTP AnchorChip 800-384 Steuerungssoftware: flexControl 2.4 Auswertungssoftware: flexAnalysis 2.4, BioTools 3.0 (MASCOT-Suche)

Bruker Daltonics

Affinitätsseparation Econo-System Gradientenpumpe Econo Detektor Econo UV Monitor Model EM-1 Recorder Econo Model 1327 Econo-Glassäulen (5x100) mm

Bio-Rad

Isoelektrische Fokussierung Protean IEF Cell IPG-Streifen: IPG Ready Strips 7 cm, 11 cm und 17 cm (pH 3-10)

Bio-Rad

1D-SDS-PAGE Mini-Protean-System Mini-Protean 2 Cell TGX-Minigele (10 wells, Any kD) Stromversorgung PowerPac 1000

Bio-Rad

2D-SDS-PAGE Criterion-System Criterion-Cell 8-16 % Tris-HCl Gele, 10 % Tris-HCl Gele Stromversorgung PowerPac 1000

Bio-Rad

Modulares HPLC-System 1050er Serie: Degasser, Binäre Pumpe 1100er Serie: Autosampler (GA1313A) Variabeler Uv/Vis-Detektor (GA 1314A) 1200er Serie: Säulenofen (GA1316A) Steuerungs- und Auswertungssoftware: ChemStation Build 164

Agilent Flüssigchromatographie

HPLC-Säule Luna NH2 (2x100 mm 5 µm Aminosäule)

Phenomenex

Spekol UV/Vis Analytik Jena

1420 Multiabel Counter VICTOR3 PerkinElmer

Mikrotiterplatte 96well, Polystyrol Greiner Bio-One

Einmalküvetten PMMA 1,5 mL Brand

UV/Vis-Spektroskopie

Quarzglasküvetten 100-QS 1 mL Hellma

Kontaktwinkelmessung DSA 100E Krüss

Zellaufschluss Sonifier 450 Branson

Anhang - 134 -

Tabelle 12: Sonstige Geräte und Verbrauchsmaterialien. Gerät/ Verbrauchsmaterial Hersteller

Analysenwaage AG285 Mettler-Toledo

Analysenwaage R 160 P Sartorius mechatronics

Blockthermostat TCR 200 Carl Roth

Dispenser Handystep (Bradford-Test) Brand

Dodeca Stainer (Gelfärbung) Bio-Rad

Einwegspritzen Omnifix Luer Lock (10 und 5 mL) B. Braun

Feinwaage BL 3100 Sartorius mechatronics

Filtermembranen 0,2 µm (Nylon) Whatman

Filternutsche (Porosität 3 und 4) VWR

Filterpapiere Machery-Nagel

Gefriertrocknung Alpha I-5 Christ

Gelscanner Gene Genius Syngene

Inkubator MCO-17AC Sanyo

Kontaktthermometer VT 5 VWR

Laborschüttler Laboshake C. Gerhardt

Magnetrührer Mini MR Standard Ika

Magnetrührer mit Heizfunktion RCT Classic Ika

Mikropipette Reference oder Research (0,1-2,5 L; 1-10 L; 10-100 L; 100-1000 L und 500-5000 L)

Eppendorf

pH-Indikatorstreifen (pH 0-14) Merck

pH-Meter 766 Calimatic Knick

Pipettenspitzen Eppendorf

Reagenzröhren (15 und 50 mL) Sarstedt

Reinstwasser-System clear plus SG Wasseraufbereitungs- und Regenerierstation

Reinstwasser-System MilliQ Synthesis A10 kombiniert mit Elix 3 Millipore

Rotationsverdampfer Laborota 4000 Heidolph

Rotator für Reagenz- und Probenröhrchen VWR

Safe-Lock Gefäße (Vials, Reaktionsgefäße) 1,5 mL und 2 mL Eppendorf

Schott Duran Glasflaschen Schott

Spotpicker PROTEINEER spII (Gelscanfunktion) Bruker Daltonics

Spritzenpumpe 11Plus Harvard Apparatus

Spritzenvorsatzfilter 0,2 µm Whatman

Trockenschrank UT 6120 Heraeus

Ultraschallbad Sonorex RK 102 II Bandelin electronic

Vakuumtrockenschrank VT 6025 Thermo Scientific

Vakuumzentrifuge Alpha RVC mit Kondensator L-1 Christ

Vivaspin 6-, Vivaspin 20-Ultrafiltrationsröhrchen (MWCO 10 kDa) Sartorius Stedim Biotech

Vortexer Minishaker MS 2 Ika

Zentrifuge 3K1 Sigma Laborzentrifugen

Zentrifuge 5804R Eppendorf

Anhang - 135 -

8.3 Chemikalien Für die Gefährdungsbeurteilung der vewendeten Chemikalien und Zubereitungen wird

die neue GHS-Kennzeichnung (Globally Harmonized System of Classification,

Labelling and Packaging of Chemicals) verwendet. Bei kursiver Schreibweise wurde

die alte Kennzeichnung verwendet.

GHS02 GHS05 GHS06 GHS07 GHS08 GHS09 Xi/Xn F

Tabelle 13: Verwendete Chemikalien. Stoff Gefahren-

symbole Gefahren-hinweise

Sicherheits-hinweise

CAS-Nummer

Hersteller

1,3,5-Trichloro-2,4,6-triazin GHS05 GHS06

H302 H314 H317 H330

P260 P280 P284 P305+P351+P338 P310

108-77-0 Sigma-Aldrich

11-Mercaptoundecansäure GHS07 H315 H319 H335

P261 P305+P351+P338

71310-21-9

Sigma-Aldrich

1H-Benzotriazol GHS07 H302 H312 H319 H412

P273 P280 P305+P351+P338


1-Octadecanthiol GHS07 H315 H319 H335

P261 P305+P351+P338

2885-00-9 Merck

2-Aminobenzothiazol GHS07 H302 H319

P305+P351+P338 136-95-8 Sigma-Aldrich

2-Naphthalenethiol GHS07 H302 - 91-60-1 Sigma-Aldrich

2-Naphthalensulfonamid GHS07 H319 P305+P351+P338 1576-47-2 Sigma-Aldrich

4-Aminoquinaldin GHS07 H315 H319 H335

P261 P305+P351+P338


4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose

- - - 20869-27-6 Sigma

5-Aminondan GHS07 H302 H312 H332

P280 24425-40-9 Aldrich

5-Dimethylamino-1-naphthalen-sulfonamid

- - - 1431-39-6 Sigma-Aldrich

5-Methyl-1H-benzotriazol

GHS07 H302 H315 H319 H335

P261 P305+P351+P338


ABA (m-Aminophenylboronsäure)

GHS07 H315 H319 H335

P261 P305+P351+P338

206658-89-1

Aldrich

Aceton GHS02 GHS07

H225 H319 H336

P210 P261 P305+P351+P338

67-64-1 Sigma

Anhang - 136 -

Stoff Gefahren-symbole

Gefahren-hinweise


CAS-Nummer

Hersteller

Acetonitril GHS02 GHS07

H225 H302 H312 H319 H332

P210 P280 P305+P351+P338


Acetonitril (picograde) GHS02 GHS07

H225 H302 H312 H319 H332

P210 P280 P305+P351+P338


Aleuria Aurantia Lektin - - - - Vector Laboratories

Aminopropyltriethoxysilan GHS05 GHS07

H302 H314

P280 P305+P351+P338 P310


Ammoniumbicarbonat GHS07 H302 - 1066-33-7 Sigma-Aldrich

Asialofetuin Typ I - - - - Sigma-Aldrich

Benzoylformiat (Benzoylameisensäure)

GHS07 H315 H319 H335

P261 P305+P351+P338


Benzylamin GHS05 GHS07

H302 H312 H314

P280 P305+P351+P338 P310


Bovine Serum Albumin - - - 9048-46-8 Sigma-Aldrich

Cäsiumacetat - - - 3396-11-0 Sigma-Aldrich

Chloroform GHS07 GHS08

H302 H315 H319 H351 H373

P281 P305+P351+P338

Sigma-Aldrich

Chloroform-d1 GHS07 GHS08

H302 H315 H319 H351 H373

P281 P305+P351+P338


Concanavalin A Typ V GHS08 H317 H334

P261 P280 P342+P311


Dikaliumhydrogenphosphat - - - 7758-11-4 Merck

Dimethylformamid GHS02 GHS07 GHS08

H226 H312 H319 H332 H360D

P201 P280 P305+P351+P338P308+P313


Dimethylsulfoxid - - - 67-68-5 Sigma-Aldrich

Dimethylsulfoxid-d6 - - - 2206-27-1 Sigma-Aldrich

Dinatriumhydrogenphosphat - - - 7558-79-4 Merck

EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimidhydrochlorid)

GHS05 GHS07

H315 H318 H335

P261 P280 P305+P351+P338

25952-53-8

GE Healthcare

Eisessig GHS02 GHS05

H226 H314

P280 P305+P351+P338P310

64-19-7 Merck

Ethanol GHS02 H225 P210 64-17-5 Sigma-Aldrich

Ethanolamin GHS05 GHS07

H302 H312 H314 H332

P280 P305+P351+P338P310

141-43-5 GE Healthcare

Ethylacetat GHS02 GHS07

H225 H319 H336

P210 P261 P305+P351+P338

141-78-6 Merck

Ethylendiamin GHS02 GHS05 GHS07 GHS08

H226 H302 H312 H314 H317 H334

P261 P280 P305+P351+P338P310


Anhang - 137 -


Gefahren-hinweise


CAS-Nummer

Hersteller

Fetuin - - - 9014-81-7 Sigma-Aldrich

Glucose Oxidase aus A. niger GHS08 H334 P261 P342+P311

9001-37-0 Serva

Glycerol - - - 56-81-5 Sigma-Aldrich

Glycin - - 56-40-6 Bio-Rad

Harnstoff - - - 57-13-6 Bio-Rad

HEPES (2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure)


Hexan GHS02 GHS07 GHS08 GHS09

H225 H304 H315 H336 H361f H373 H411

P210 P261 P273 P281 P301+P310 P331

110-54-3 Merck

Human Haptoglobin Typ 1,1 - - - - Sigma-Aldrich

Kaliumdihydrogenphosphat - - - 7778-77-0 Merck

Kaliumhydroxyd GHS05 GHS07

H302 H314

P280 P305+P351+P338P310

1310-58-3 Scharlau

L-Fucose

Magnesiumchlorid Xi R36/37 S22-24/25 7786-30-3 Merck

Magnesiumsulfat - - - 7487-88-9 Scharlau

Meraptoethanol GHS05 GHS07 GHS09

H301 H310 H315 H317 H318 H330 H410

P260 P273 P280 P284 P301+P310 P302+P350


Methanol GHS02 GHS06 GHS08

H225 H301 H311 H331 H370

P210 P260 P280 P301+P310 P307+P311


Methanol (picograde) GHS02 GHS06 GHS08

H225 H301 H311 H331 H370

P210 P260 P280 P301+P310 P307+P311


Methyl- -D-glucopyranose - - - 97-30-3 Sigma-Aldrich

Methyl- -D-mannopyranose - - - 617-04-9 Sigma-Aldrich

N-Acetyl-D-glucosamin - - - 7512-17-6 Sigma-Aldrich

Natriumacetat - - - 127-09-3 Sigma-Aldrich

Natriumchlorid - - - 7647-14-5 Merck

Natriumhydrogencarbonat - - - 144-55-8 Merck

NHS (N-Hydroxysuccinimid)

- - - 6066-82-6 GE Healthcare

Ninhydrin GHS07 H302 H315 H319 H335

P261 P305+P351+P338


polyklonaler Anti-Human Hapto-globin Antikörper (Schaf, IgG)

- - - - abcam

Ricinus Communis Agglutinin - - - - Sigma-Aldrich

Saccharose - - - 57-50-1 Sigma-Aldrich

SDS (Natriumdodecylsulfat)

GHS02 GHS06

H228 H302 H311 H315 H319 H335

P210 P261 P280 P305+P351+P338 P312

151-21-3 Bio-Rad

Sorbitol - - - 50-70-4 Sigma-Aldrich

Thiaminhydrochlorid - - - 67-03-8 Sigma-Aldrich

Anhang - 138 -


Gefahren-hinweise


CAS-Nummer

Hersteller

Thiaminpyrophosphat - - - 154-87-0 Sigma-Aldrich

Thyroglobulin aus der Rinder-schilddrüse


Toluol GHS02 GHS07 GHS08

H225 H304 H315 H336 H361d H373

P210 P261 P281 P301+P310 P331


Trifluoressigsäure GHS05 GHS07

H314 H332 H412

P273 P280 P305+P351+P338P310


Trimethylsilylimidazol GHS02 GHS07

H225 H315 H319 H335

P210 P261 P305+P351+P338


Tris (Tris(hydroxymethyl)-amino-methan)

GHS07

H315 H319 H335

P261 P305+P351+P338


Wasser-d2 - - - 7789-20-0 Sigma-Aldrich

-Cyano-4-hydroxyzimtsäure GHS07 H315 H319 H335

P261 P305+P351+P338


DTT (Dithiothreitol)

GHS07 H302 H315 H319 H335

P261 P305+P351+P338

3483-12-3 Serva

IAA (Iodessigsäure)

GHS05 GHS06

H301 H314

P280 P301+P310 P305+P351+P338 P310


Tabelle 14: Verwendete, gebrauchsfertige Zubereitungen, Testkits und Trägermaterialen

Zubereitung Gefahren-symbole

Gefahren-hinweise


Hersteller

Laemmli-Puffer - - - Bio-Rad

Bradford-Reagenz GHS07 GHS08

H315 H319 H371

P260 P305+P351+P338

Sigma-Aldrich

Toyopearl AF-Tresyl-650M GHS07 H315 H319 H335

P261 P305+P351+P338

Tosoh

ABA-Sepharose - - - Sigma-Aldrich

Coomassie-Färbelösung - H314 - Carl Roth

Trypsin Singles (Proteomics grade)

F, Xn

11-20/21/22-36/37/38-42

23-24-26-36/37 Sigma-Aldrich

HBS-N-Puffer - - - GE Healthcare

HBS-EP-Puffer - - - GE Healthcare

Acetatpuffer pH 5 - - - GE Healthcare

Kieselgel 100 - - P260 Merck

Protein-Marker 6,5-200 kDa - - - Serva

Tabelle 15: Herstellerverzeichnis

Name des Herstellers Hersteller mit Ort und Land

AB Sciex AB Sciex Germany GmbH

abcam abcam plc, Cambridge, Vereinigtes Königreich

Agilent Agilent Technologies Deutschland GmbH, Böblingen, Deutschland

Analytik Jena Analytik Jena AG, Jena, Deutschland

Anhang - 139 -

Name des Herstellers Hersteller mit Ort und Land

B. Braun B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland

Bandelin electronic Bandelin electronic GmbH & Co. KG, Berlin Deutschland

Bio-Rad Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Deutschland

Brand BRAND GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland

Branson Branson Ultraschall, Niederlassung der EMERSON Technologies GmbH & Co. OHG, Dietzenbach, Deutschland

Bruker BioSpin Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten, Deutschland

Bruker Daltonics Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Deutschland

C. Gerhardt C. Gerhardt GmbH & Co. KG, Königswinter, Deutschland

Carl-Roth Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

Christ Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode am Harz, Deutschland

Elementar Elementar Analysensysteme GmbH, Hanau, Deutschland

Eppendorf Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

GE Healthcare GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Deutschland

Greiner Bio-One Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland

Harvard Apparatus Harvard Apparatus, Holliston, USA

Heidolph Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Kelheim, Deutschland

Hellma Hellma GmbH & Co. KG, Müllheim, Deutschland

Heraeus Heraeus Holding GmbH, Hanau, Deutschland

IKA IKA-Werke GmbH & CO. KG, Staufen, Deutschland

Knick Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co. KG, Berlin, Deutschland

Krüss A. Krüss Optronic GmbH, Hamburg, Deutschland

Machery-Nagel Machery-Nagel GmbH & Co. KG, Düren, Deutschland

Merck Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Mettler-Toledo Mettler-Toledo GmbH, Greifensee, Schweiz

Millipore Millipore GmbH, Schwalbach, Deutschland

PerkinElmer PerkinElmer Inc., Waltham, USA

Phenomenex Phenomenex Ltd., Aschaffenburg, Deutschland

Sanyo Sanyo Sales & Marketing Europe GmbH, München, Deutschland

Sarstedt Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland

Sartorius mechatronics Sartorius AG, Göttingen, Deutschland

Sartorius Stedim Biotech Sartorius Stedim Biotech S.A., Aubagne Cedex, Frankreich

Scharlau Scharlau Chemie S.A., Barcelona, Spanien

Schott Schott AG, Mainz, Deutschland

Serva SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland

SG Wasseraufbereitungs- und Regenerierstation

SG Wasseraufbereitungs- und Regenerierstation GmbH, Barsbüttel, Deutschland

Sigma Laborzentrifugen Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz, Deutschland

Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen bei München, Deutschland

Syngene Synoptics Ltd, Cambridge, Vereinigtes Königreich

Thermo Scientific Thermo Electron LED GmbH, Langenselbold, Deutschland

Tosoh Tosoh Bioscience GmbH, Stuttgart, Deutschland

Vector Laboratories Vector Laboratories Inc., Burlingame, USA

VWR VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland

Wilmad Labglass Wilmad Labglass, Buena, USA

Abbildungsverzeichnis - 140 -

9 Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Grundschema der Affinitätsseparation. Die Einteilung der Verfahrensschritte erfolgt in Adsorption (1), Waschen (2), Desorption (3) und Regeneration (4).

Abb. 2: Klassifizierung der Affinitätsseparationsverfahren auf Basis der benutzten Liganden nach Vijayalakshmi [41, Seite 71]. In den Klammern sind mögliche Zielmoleküle der aufgeführten Liganden angegeben.

Abb. 3: Schematische Darstellung des Schlüssel-Schloss-Prinzips (A) und des Induced-Fit-Modells (B)

Abb. 4: Schematische Darstellung der wichtigsten Wasserstoffbrücken, die an der Bindung zwischen Concanavalin A und eines Trimannosids beteiligt sind. Entnommen aus [57, Seite 975].

Abb. 5: Darstellung hydrophober und polarer Bereiche von Kohlenhydraten am Beispiel von -D-Glucose. In Rot dargestellt sind OH-Gruppen, in Blau die hydrophoben Bereiche der Glucose.

Abb. 6: Strukturformel von m-Aminophenylboronsäure (ABA).

Abb. 7: Bildung eines cyclischen Esters aus ABA und einem Diol. In Abb. 7A sind die gekoppelten Gleichgewichte dargestellt. Abb. 7B zeigt, dass Keq eine Kombination von Ktrigonal und Ktetraedrisch ist. Zwecks Übersichtlichkeit fehlt das koordinativ gebundene Wasser in Abb. 7B.

Abb. 8: Immobilisierung von m-Aminophenylboronsäure an einem tresylierten Träger. Im Rahmen einer nucleophilen Substitution reagiert die primäre Aminogruppe von ABA mit dem elektrophilen Kohlenstoffatom unter Abspaltung der Tresylgruppe.

Abb. 9: ABA-Affinitätsseparation von Seehundplasma mit ABA-Toyopearl AF-Tresyl-650M (A). Daneben ist eine Auftragung von Plasma auf den Träger ohne ABA-Liganden zu sehen (B).

Abb. 10: 2D-Gele des Seehundplasmas (A) und der Desorptionsfraktion (B). Der Proteinmarker ist bei (A) auf der rechten, bei (B) auf der linken Seite aufgetragen worden. Für die 2D-Gelelektrophorese werden 7 cm IPG-Streifen (pH 3-10) und entsprechende Fertiggele (Tris-HCl, 8-16 %) für die Mini-Protean-Zelle verwendet.

Abb. 11: Affinitätschromatogramme der Einzelaufgaben von GOD (A), Fetuin (B) und BSA (C) und als Gemischaufgabe der drei Proteine (D).

Abb. 12: 1D-Gel der Standards und Proben. Belegung der Gel-Taschen: 1. Marker, 2. BSA, 3. GOD, 4. Fetuin, 5. Durchlauffraktion, 6. Desorptionsfraktion, 7. leer, 8. Ausgangsprotein-gemisch, 9. Laemmli-Puffer, 10. Marker.

Abb. 13: Darstellung einer Untereinheit der BFD als Stick-Modell (links) und als Ribbon-Modell (rechts); TPP (1), Mn2+ (2), Ca2+ (3). PDB-Datei 1bfd aus [98].

Abb. 14: Allgemeines Reaktionsschema der durch BFD katalysierten C-C-Kupplungsreaktion zwischen einem Aldehyd und einem -Ketocarbonsäure [99, Seite 312].

Abb. 15: Schematischer Trennzyklus der ligandvermittelten Aufreinigung von BFD. 1: Absättigung mit TPP. 2: Aufgabe des BFD-haltigen Gemisches. 3: Adsorption von BFD an TPP und Ausspülen der unerwünschten Stoffe. 4: Desorption von TPP und damit auch der daran gebundenen BFD. 5: Regeneration.

Abb. 16: Strukturformel von Thiaminpyrophosphat.

Abb. 17: Chromatogramm eines typischen Versuches mit TPP. 1: Entfernen des Überschusses von TPP durch Waschen mit Laufpuffer. 2: Desorption von TPP

Abb. 18: Strukturformel von Thiamin.

Abb. 19: 31P-NMR-Spektren von TPP (A) und TPP und ABA (B).

Abb. 20: Mögliche binäre Komplexe von ABA mit TPP.

Abb. 21: Beispielchromatogramm für die ligandvermittelte Affinitätsseparation mit TPP nach Aufgabe von 2 mL E. coli-Aufschluss. Durchlauffraktion während des Adsorptionsschrittes (1), Desorptionsfraktion (2).


Abb. 22: 2D-Gele des Zellaufschlusses (1) (8-16 % Tris-HCl Gel), der ABA-TPP-Desorptions-fraktion (2) (8-16 % Tris-HCl Gel) und der TPP-Desorptionsfraktion (3) (10 % Tris-HCl Gel).

Abb. 23: Beispiel zur Identifizierung von BFD in 2D-Gelen. Die Gelspots werden ausgeschnitten, tryptisch verdaut und der peptide mass fingerprint gemessen. Auf der linken Seite ist das MS-Spektrum des peptide mass fingerprints von BFD zu sehen. Rechts die nachfolgende MASCOT-Suche zeigt eine erfolgreiche Identifizierung (75 % Sequenzhomologie) von BFD an. Übereinstimmende Peptide sind in roter Farbe dargestellt.

Abb. 24: Darstellung von polaren Regionen (rot) und unpolaren Regionen (grau) im ABA-Molekül

Abb. 25: Schematischer Aufbau (A) und Struktur (B) des durch Ferrand et al. synthetisierten macrocyclischen Liganden. Beide Abbildungen sind aus [133, Seite 3185] entnommen.

Abb. 26: Darstellung der in dieser Arbeit verwendeten Triazinliganden. Im unteren Teil der Abbildung ist der Triazinkern orange hinterlegt. Die Substituenten des Triazinkerns sind in roter Farbe hervorgehoben. Im Fall von NH2-TBL1 ist der Substituent Benzylamin und für NH2-TBL2 ist es 5-Aminoindan (vgl. Abschnitt 4.4). Blau hinterlegt ist der Molekülteil, an dem die Immobilisierung an das Trägermaterial erfolgt.

Abb. 27: Strukturformel von Cibacron Blue F3GA (A); optimierte Struktur von Cibacron Blue F3GA als Ligand für alkalische Phosphatase (B) und Pferdeleber-Alkoholdehydrogenase (C). Rot hinterlegt sind bei (B) und (C) die strukturellen Änderungen gegenüber Cibacron Blue F3GA. Blau hinterlegt ist der Molekülteil, an dem die Immobilisierung erfolgt.

Abb. 28: Strukturformeln der triazinbasierten Liganden für humanes IgG (A) und für den monoklonalen anti-HIV Antikörper 4E10 (B). Blau hinterlegt ist der Molekülteil, an dem die Anbindung an das Trägermaterial erfolgt.

Abb. 29: Temperaturgesteuerte, nucleophile Substitution der Chloratome durch Aminogruppen.

Abb. 30: Vereinfachte Darstellung der Resonanzbedingung. Keine Resonanz findet statt, wenn die Komponente des Lichtvektors, die parallel zur Metallschicht verläuft, hinsichtlich Energie und Richtung mit der Anregungsenergie und Richtung des Verlaufs der Oberflächen-plasmonenwelle übereinstimmt (A). Dagegen ist in (B) die Resonanzbedingung erfüllt.

Abb. 31: Schematischer Aufbau eines SPR-Biosensors mit Prismenkoppler (A). Ändert sich der Brechungsindex der Lösung im Fließkanal, ändert sich der Resonanzwinkel (B), Wird die Änderung des Resonanzwinkels, ausgedrückt in Resonanzeinheiten, in Abhängigkeit von der Zeit graphisch dargestellt, erhält man das Sensorgramm (C). Schematische Darstellung des optischen Systems des Biacore 3000 (D, C) [175, Seite 19-22].

Abb. 32: Zusammenhang zwischen der SPR und der Affinitätsseparation. Im oberen Teil der Abbildung sind die Schritte der Affinitätsseparation dargestellt. Im Sensorgramm sind die Schritte grau hinterlegt. Adsorption (1), Waschen (2), Desorption (3) und Regeneration (4).

Abb. 33: Reaktionsmechanismus der Aktivierung gefolgt von der Immobilisierung der Triazinliganden auf einer CM5-Chipoberfläche (R = Dextranmatrix). Nach der Reaktion mit EDC und NHS bildet sich ein aktivierter NHS-Ester aus, der in der Lage ist, mit den synthetischen Liganden unter Ausbildung einer Carbonsäureamid-Gruppe zu reagieren.

Abb. 34: Immobilisierung von NH2-TBL1 (A) und NH2-TBL2 (B) auf CM5-Sensorchips. Der obere Teil der Abbildung von A und B zeigt bezüglich der Ordinatenachse das gesamte Sensorgramm, während der untere Teil der Abbildung den Bereich zwischen 21000 und 27000 RU vergrößert darstellt. Experimentelle Bedingungen zu A: (1) Aktivierung, (2) NH2-TBL1-Injektion (7 µL, 2,2 mg/mL), (3) Ethanolamin-Injektion (50 µL), (4) Ethanol-Injektion (70 %, 2x5 µL), (5) Ethanolamin-Injektion (25 µL). Experimentelle Bedingungen zu B: (1) Aktivierung, (2) NH2-TBL2-Injektion (3 µL, 0,2 mg/mL), (3) Ethanolamin-Injektion (50 µL), (4) Ethanol-Injektion (70 %, 5 µL). Der Doppelpfeil in (B) zeigt graphisch die Immobilisierungsausbeute an.

Abb. 35: Zur Bestimmung der theoretischen Ligandendichte wird die Konformation von NH2-TBL2 gewählt, bei der der größtmögliche Abstand der 5-Aminoindan-Substituenten auftritt. Die Konformation wird einer Energieminimierung unterzogen, und der Abstand zwischen beiden am weitesten voneinander entfernten Kohlenstoffatomen von 5-Aminoindan bestimmt (A). Drauf-sicht mit skizzierter Kreisfläche (B). Hexagonal dichteste Kreispackung der Liganden unter der Annahme, dass sich die Kreisflächen nicht überlappen (C). Überlappung der Kreisflächen (D).


Abb. 36: Hydrolyse und Derivatisierung der TBL-Liganden.

Abb. 37: Massenspektren der derivatisierten Hydrolyseprodukte von TBL1- (A), TBL2- (B) und APS-Silica (C) nach Hydrolyse und Derivatisierung. Die Molekülpeaks der Liganden und von APS-Silica sind schwarz eingerahmt.

Abb. 38: Fragmentspektren der Hydrolyseprodukte nach Derivatisierung von TBL1- (A) und TBL2-Silica (B).

Abb. 39: Schematische Darstellung einer SPR-Interaktionsmessung.

Abb. 40: Sensorgramme zum Einfluss von HBS-N-, HBS-EP- und Tris-Puffer auf das Adsorptionsverhalten von NH2-TBL2 zu GOD. Bedingungen: 1 mg/mL GOD, Fluss: 5 µL/min, immobilisierte NH2-TBL2-Menge: 1629 RU.

Abb. 41: Sensorgramme der Interaktion von NH2-TBL2 mit BSA. Bedingungen für (A): 1 mg/mL BSA, Fluss: 5 µL/min, immobilisierte NH2-TBL2-Menge: 3599 RU. Bedingungen für (B): 1 mg/mL BSA, Fluss: 30 µL/min, immobilisierte NH2-TBL2-Menge: 1634 RU.

Abb. 42: Sensorgramme zu den Desorptionsversuchen von NH2-TBL2 mit GOD (A) und TG (B). Zur besseren Übersicht ist nur die Ligandenflusszelle dargestellt. Bedingungen und Bemerkungen: (A): 1 mg/mL GOD, Fluss: 5 µL/min, immobilisierte Ligandenmenge: 3599 RU. (B): 1 mg/mL TG, Fluss: 10 µL/min, immobilisierte Ligandenmenge: 3599 RU. Verwendete Desorptionsreagenzien: 1. Methyl- -D-mannopyranose (0,5 M in HBS-N-Puffer), 2. Ethanol/Wasser (7:3, v/v), 3. Natriumdodecylsulfat (0,5 % in Wasser w/v).

Abb. 43: Adsorptionsisothermen von GOD mit TBL1-Silica, TBL2-Silica und APS-Silica (A). Darstellung eines Desorptionsversuches (B). Bei (1) erfolgt die Injektion von 0,5 mL einer GOD-Lösung in Tris-Puffer (10 mM Tris-HCl, 0,1 M NaCl, pH 7). Die Injektion von Methyl- -D-mannopyranose (0,5 M in Tris-Puffer) bei (2) zeigt zwar einen Anstieg der Intensität durch die Eigenabsorption von Methyl- -D-mannopyranose, jedoch keinen Desorptionspeak. Bei (3) wird der Tris-Puffer über das Adsorbens gefördert und die Intensität sinkt wieder. Erst nach Waschen mit Ethanol/Wasser (2:8, v/v) konnte GOD desorbiert werden (4).

Abb. 44: Beispielchromatogramm eines Zuckergemisches bestehend aus Methyl- -D-mannopyranose, N-Acetyl-D-glucosamin und Saccharose

Abb. 45: (A) Methyl- -D-mannopyranose-Kalibrierung ohne internen Standard. (B) Methyl- -D-mannopyranose-Kalibrierung mit internem Standard (Saccharose). Jede Verdünnungsstufe ist zweimal injiziert worden. Auf der Abszissenachse ist die absolute injizierte Masse von Methyl- -D-mannopyranose angegeben. Unter Verwendung eines internen Standards wird die Peakfläche von Methyl- -D-mannopyranose durch die Peakfläche des internen Standards Saccharose dividiert.

Abb. 46: Adsorption verschiedener Mono- und Disaccharide gelöst in Wasser oder DMF an TBL1-, TBL2- und APS-Silica. Die Zuckermischungen bestehen aus Methyl- -D-mannopyranose und N-Acetylglucosamin. (1) Methyl- -D-mannopyranose in Wasser, (2) Methyl- -D-mannopyranose in DMF, (3) Methyl- -D-mannopyranose-Gemisch in Wasser, (4) Methyl- -D-mannopyranose-Gemisch in DMF, (5) N-Acetylglucosamin in Wasser, (6) N-Acetylglucosamin in DMF, (7) N-Acetylglucosamin-Gemisch in Wasser, (8) N-Acetylglucosamin-Gemisch in DMF, (9) 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose in Wasser, (10) 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose in DMF, (11) Methyl- -D-glucopyranose in Wasser, (12) Methyl- -D-glucopyranose in DMF.

Abb. 47: Spezifische Desorption von TG durch Fucose. Nach dem Ende der Injektion einer 0,15 µM TG-Lösung bei einem Fluss von 10 µL/min (1) genügt zur vollständigen Desorption ein kurzer Impuls einer 100 mM Fucose-Lösung (2).

Abb. 48: Bestimmung der Dissoziationskonstanten von AAL und TG (A und B) sowie zwischen dem polyklonalen Antikörper und Haptoglobin (C und D). In A und C der Abbildung sind die Sensorgramme der Konzentrationsreihen dargestellt. Die Konzentrationen von TG und Haptoglobin sind in µmol/L angegeben. Das Resonanzsignal im Gleichgewicht (grau hinterlegter Bereich in A und B) wird gegen die jeweilige Konzentration zum Erhalt der Adsorptionsisothermen aufgetragen (C und D). Experimentelle Bedingungen: Fluss 10 µL/min; Injektionsvolumen 110 µL; Kontaktzeit 660 s, Puffer HBS-EP.


Abb. 49: Strukturformeln der Ligandenmodelle am Beispiel von NH2-TBL2 mit hoher (A), mittlerer (B) und geringer Ligandendichte (C). Orange hinterlegt ist die Dextranmatrix. Um die Berechnungszeit zu verringern, ist bei hohen und mittleren Ligandendichten auf einen größeren Ausschnitt der Dextranmatrix verzichtet worden.

Abb. 50: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL2 (Dextranmodell) mit Methyl- -D-mannopyranose. Die Struktur des Zuckers ist gelb hinterlegt. In (A) ist NH2-TBL2 (hoch), in (B) NH2-TBL2 (mittel) und in (C) NH2-TBL2 (niedrig) abgebildet. In (D) ist die Orientierung einer CH- -Wasserstoffbrücke zwischen NH2-TBL2 (mittel) und Methyl-

-D-mannopyranose dargestellt. Farbliche Zuordnung der Atome: Kohlenstoff grau; Wasserstoff hellgrau; Sauerstoff rot; Stickstoff blau. Wasserstoffbrücken zwischen zwei Atomen sind als grün gepunktete Linie dargestellt.

Abb. 51: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten G-Werten von NH2-TBL1 mit Methyl- -D-mannopyranose, dessen Struktur gelb hinterlegt ist. NH2-TBL1 (hoch) (A), NH2-TBL1 (mittel) (B), NH2-TBL1 niedrig (C).

Abb. 52: Strukturformeln der verwendeten Benzotriazole.

Abb. 53: Schematische Darstellung der Messverfahren sowie Verdeutlichung der Herausforderung bei Messungen im Spurenbereich. (A) Schematische Darstellung eines Anreicherungsverfahrens. (B) Schematische Darstellung eines chemischen Sensors. (C) Bei Messungen im Spurenbereich mittels chemischer Sensoren muss KD hinreichend klein sein, damit das Gleichgewicht weit auf der Seite des Ligand-Schadstoff-Komplexes (LM) liegt. (D) Des Weiteren steigt der Messfehler, hier verdeutlicht durch die Horwitzfunktion [236, Seite 68A], je geringer die Konzentration des Analyten ist.

Abb. 54: Strukturen der verwendeten Liganden. TBL-LC11 (A); TBL-LC19 (B); TBL-LC02 (C); TBL-LC20 (D).

Abb. 55: Simulationsergebnisse von BT und 5-MeBT gegenüber TBL-LC02, TBL-LC11, TBL-LC19, TBL-LC20 und APS-Silica (A). Orientierung von TBL-LC19 gegenüber BT bei der Konformation bei der niedrigsten Freien Bindungsenergie (B). BT ist in der Abbildung gelb hinterlegt. Die Linien zwischen TBL-LC19 und BT deuten die - -Wechselwirkung an [206].

Abb. 56: Ergebnisse der Adsorptionsversuche. BT (1), 5-MeBT (2).

Abb. 57: Schematische Darstellung eines SAMs aus 11-Mercaptoundecansäure (A). Zur Definition des Kontaktwinkels (B).

Abb. 58: Tropfenbild nach Aufbringen eines SAMs aus 1-Octadecanthiol (A) und 11-Mercaptoundecansäure (B)

Abb. 59: Beispielsensorgramme von Injektionen von GOD (A) und BSA (B) auf Con A beschichtete SAMs. Injektion von GOD oder BSA bei (1 in Abb. 59A und Abb. 59B). Desorption mit Methyl- -D-mannopyranose bei (2 in Abb. 59A und Abb. 59B).

Abb. 60: Beispielsensorgramme von Injektionen von ASF (A) und BSA (B) auf RCA beschichtete SAMs. Injektion von ASF oder BSA bei (1 bei Abb. 60A und Abb. 60B). Desorption mit Lactose bei (2 bei Abb. 60A und Abb. 60B).

Abb. 61: BFD-Desorptionsfraktion ohne vorhergehende Absättigung mit TPP (zu Abschnitt 3.3.6.4)

Abb. 62: BFD-Desorptionsfraktion bei Verwendung eines HEPES-Laufpuffers mit einem pH-Wert von 6.9 (zu Abschnitt 3.4).





Abb. 67: 1H-NMR-Spektrum von TBL1 in DMSO-D6. H-1, H-2, H-3: 7,28 ppm (breites s, 10H, CH aromatisch); H-4: 4,59 ppm (breites s, 4H, CH2 Benzylamin). Bei dem 9,05 ppm-Signal kann


es sich um die sekundären Amingruppen handeln [117, Seite 127]. Bei 2,50 ppm handelt es sich um DMSO (zu Abschnitt 4.4.1).

Abb. 68: 1H-NMR-Spektrum von TBL2 in CDCl3. H-1: 7,40 ppm (s, 2H, CH aromatisch); H-2: 7,24 ppm (d, 2H, CH aromatisch, 3J(H-3) = 9,1 Hz); H-3: 7,16 ppm (d, 2H, CH aromatisch, 3J(H-2) = 8,0 Hz); H-4: 2,89 ppm (t, 8H, CH2 aliphatisch, 3J(H-5) = 7,2 Hz); H-5: 2,09 ppm (quint, 4H, CH2 aliphatisch, 3J(H-4) = 7,4 Hz) (zu Abschnitt 4.4.1).

Abb. 69: 1H-NMR-Spektrum von NH2-TBL1 in DMSO. H-1, H-2, H-3: 7,19-7,45 ppm (m, 10H, CH aromatisch); H-4: 4,53 ppm (breites s, 4H CH2 Benzylamin); H-5: 3,60 ppm (breites s, 2H, CH2 Ethylendiamin); H-6: 2,98 ppm (d, 2H, CH2 Ethylendiamin, J = 27,8 Hz). Bei den Signalen größer 8 ppm handelt es sich vermutlich um die Protonen der Aminogruppen [117, Seite 127]. Bei 2,50 ppm handelt es sich um DMSO (zu Abschnitt 4.4.2).

Abb. 70: 1H-NMR-Spektrum von NH2-TBL2 in DMSO. H-1: 7,49 ppm (breites s, 2H, CH aromatisch); H-2: 7,38 ppm (breites s, 2H, CH aromatisch); H-3: 7,20 ppm (breites s, 2H, CH aromatisch); H-4: 2,84 ppm (breites s, 8H, CH2); H-5: 2,02 ppm (quint, 4H, CH2,

3J(H-4) = 7,1 Hz); H-6: 3,67 ppm (s, 2H, CH2 Ethylendiamin); H-7: 3,11 ppm (s, 2H, CH2 Ethylendiamin). Bei den Signalen größer 8 ppm handelt es sich vermutlich um die Protonen der Aminogruppen [117, Seite 127]. Bei 2,52 ppm handelt es sich um DMSO (zu Abschnitt 4.4.2).

Abb. 71: 13C-NMR (DEPT45) von TBL1 in DMSO. C-1: 127,9 ppm; C-2: 128,8 ppm; C-3 127,5 ppm; C-4: 44,5 ppm (zu Abschnitt 4.4.1).

Abb. 72: 13C-NMR von TBL2 in CDCl3. C-1: 117,6 ppm; C-2: 119,5 ppm; C-3: 124,4 ppm; C-4: 33,0 ppm; C-5: 25,6 ppm; C-6: 32,4 ppm (zu Abschnitt 4.4.1).

Abb. 73: 13C-NMR (DEPT45) von NH2-TBL1 in DMSO. C-1: 128,2 ppm; C-2: 128,7 ppm; C-3 127,9 ppm; C-4: 43,6 ppm; C-5: 44,3 ppm; C-6: 38,5 ppm (zu Abschnitt 4.4.2).

Abb. 74: 13C-NMR (DEPT45) von NH2-TBL2 in DMSO. C-1: 118,5 ppm; C-2: 120,5 ppm; C-3: 124,6 ppm; C-4: 32,8 ppm; C-5: 25,6 ppm; C-6: 32,2 ppm; C-7: n.n.; C-8: 38,8 ppm (zu Abschnitt 4.4.2).

Abb. 75: Fragmentspektrum von (3-Aminopropyl)-tri-(trimethylsilyloxy)-silan (Hydrolyseprodukt von APS-Silica) (zu Abschnitt 4.6.2.2).

Abb. 76: Effekt von DMSO auf die aktivierte Oberfläche eines CM5-Chips. Im oberen Teil der Abbildung ist das gesamte Sensorgramm zu sehen, im unteren Teil ist der Bereich zwischen 20500 RU und 23000 RU auf der Ordinatenachse vergrößert dargestellt. Die Oberfläche wird aktiviert (1) und anschließend mit 10 % DMSO in Acetatpuffer behandelt (2). Kurz danach erfolgt die Deaktivierung mit Ethanolamin (3). Wie aus der vergrößerten Abbildung hervorgeht, ist nur eine minimale Änderung des Resonanzsignals zu beobachten. Die Immobilisierung wird durch DMSO demnach nicht beeinflusst (zu Abschnitt 4.6.1).

Abb. 77: Injektion von NH2-TBL1 (A) und NH2-TBL2 (B) auf eine nichtaktivierte CM5-Chipoberfläche (NH2-TBL1: 5 µL, 0.31 mg/mL, 5 µL/min; 5 µL, NH2-TBL2: 0.22 mg/mL, 5 µL/min). In beiden Fällen findet eine Vorkonzentrierung auf der Dextranoberfläche des CM5-Chips statt (400 RU bei NH2-TBL1, 50 RU bei NH2-TBL2). Es wird die Differenz nach dem Injektionsende und der Basislinie gebildet. Dies ist in der Abbildung durch die Pfeile und kenntlich gemacht (zu Abschnitt 4.6.1).

Abb. 78: Sensorgramm zur Interaktion von GOD mit NH2-TBL2 bei geringer Ligandendichte. Bedingungen: 2 mg/mL GOD, Fluss: 5 µL/min, immobilisierte NH2-TBL2-Menge: 88 RU. Die Pfeile kennzeichnen Desorptionsversuche mit Methyl- -D-mannopyranose (0.5 M in HBS-N-Puffer) (zu Abschnitt 4.7.1).

Abb. 79: Sensorgramme zur Interaktion von NH2-TBL1 mit GOD (A), TG (B) und BSA (C). Bedingungen: 0,8 mg/mL für jedes Protein, Fluss: 20 µL/min, immobilisierte NH2-TBL1-Menge: 100 RU. Die Pfeile markieren Anfang und Ende der Injektionen (zu Abschnitt 4.7.1).

Abb. 80: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 mit -Man(1 6) -Man(3 1) -Man (Trimannosylkern). Das Trisaccharid ist gelb hinterlegt. NH2-TBL1 (hoch) (A); NH2-TBL1 (mittel) (B); NH2-TBL2 (hoch) (C); NH2-TBL2 (mittel) (D) (zu Abschnitt 4.8.3.2).


Abb. 81: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 mit 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose. Das Disaccharid ist gelb hinterlegt. NH2-TBL1 (hoch) (A); NH2-TBL1 (mittel) (B); NH2-TBL2 (hoch) (C); NH2-TBL2 (mittel) (D) (zu Abschnitt 4.8.3.2).

Abb. 82: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von TBL1-Silica (A) und TBL2-Silica (B) mit Methyl- -D-mannopyranose. Das Monosaccharid ist gelb hinterlegt (zu Abschnitt 4.8.3.2).

Abb. 83: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von TBL1-Silica (A) und TBL2-Silica (B) mit 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose. Das Disaccharid ist gelb hinterlegt (zu Abschnitt 4.8.3.2).

Abb. 84: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL1 zu GOD aus A. Niger. Der obere Teil der Abbildung zeigt die an der Interaktion beteiligten Aminosäuren und Zucker zum Liganden an, die in der Abbildung in gelber Farbe hinterlegt sind. Der untere Teil zeigt die Lage der Liganden in Bezug auf die gesamte Untereinheit von GOD. Liganden und Kontaktregion zum Enzym sind hier in brauner Farbe hinterlegt. NH2-TBL1 (hoch) (A), NH2-TBL1 (mittel) (B), NH2-TBL1 (niedrig) (C) (zu Abschnitt 4.8.3.3).

Abb. 85: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL2 zu GOD aus A. Niger. Zur weiteren Erklärung vgl. Abb. 84 (zu Abschnitt 4.8.3.3).

Abb. 86: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von TBL2-Silica zu GOD aus A. Niger. Der linke Teil der Abbildung zeigt die an der Interaktion beteiligten Aminosäuren und Zucker zum Liganden an, die in gelber Farbe hinterlegt sind. Der rechte Teil zeigt die Lage der Liganden in Bezug auf die gesamte Untereinheit von GOD (zu Abschnitt 4.8.3.3).

Abb. 87: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 zu GOD aus P. Amagasakiense. NH2-TBL1 (hoch) (A), NH2-TBL1 (mittel) (B), NH2-TBL2 (hoch) (C), NH2-TBL2 (mittel). Zur weiteren Erklärung vgl. Abb. 84 (zu Abschnitt 4.8.3.3).

Abb. 88: Immobilisierung Con A (A) und RCA (B) an einen SAM bestehend aus 11-Mercaptoundecansäure. Nach der Aktivierung (1) schließt sich die Injektion der Lektin-Lösung an (2) gefolgt von der Deaktivierung verbliebener aktivierter Carboxygruppen (3) (zu Abschnitt 5.5.2.1 und 5.5.2.2).

Abb. 89: Sensorgramme von Immobilisierungen außerhalb des Biacore 3000. In (A) ist die Injektion von GOD auf einem Con A-SAM dargestellt. Dagegen ist in (B) die Injektion von ASF auf einem RCA-SAM abgebildet. (1) Injektion der Glycoproteine. (2) Desorptionsversuche mit Methyl- -D-mannopyranose bzw. Lactose (2) (zu Abschnitt 5.5.2.1 und 5.5.2.2).

Tabellenverzeichnis - 146 -

10 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Zusammenstellung der intermolekularen Kräfte.

Tabelle 2: Gesamtassoziationskonstanten Keq von Glucose und Fructose mit Phenylboronsäure bei verschiedenen pH-Werten [87, Seite 11208].

Tabelle 3: Zusammenstellung Parameter und Ergebnisse der Bindungsstudien von TPP an ABA-Toyopearl

Tabelle 4: Immobilisierungsexperimente von NH2-TBL1 und NH2-TBL2. Die Differenz der Resonanzsignale wird nach 10 min bestimmt, nachdem die Injektion von Ethanol oder Ethanolamin abgeschlossen ist.

Tabelle 5: Ergebnisse der Elementaranalyse.

Tabelle 6: Massenspektrometereinstellungen

Tabelle 7: Lamarckian-genetic-Algorithmus Parameter

Tabelle 8: Ergebnisse der Docking-Simulationen bei Verwendung des Dextranmodells.

Tabelle 9: Ergebnisse der Docking-Simulationen bei Verwendung des Silicamodells.

Tabelle 10: Konzentrationen ausgewählter Benzotriazole in verschiedenen Gewässern und Abwässern.

Tabelle 11: Verwendete Geräte.

Tabelle 12: Sonstige Geräte und Verbrauchsmaterialien.

Tabelle 13: Verwendete Chemikalien.

Tabelle 14: Verwendete, gebrauchsfertige Zubereitungen, Testkits und Trägermaterialen

Tabelle 15: Herstellerverzeichnis

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