1. ms lihros de Editorial ACRIBIA, S. A., sobre IJIOLOGA MOLECULAR y BIOTECNOL06A . ( 11 ,ulI", 1ROlll 'C( ION A LA 1l10TECNOLOGi A I Y 11tH)'" ) Il ( NOI .o( iA HASICA () NJ),~I/ ' N ros DE IlJOLOGIA MOLECULAR I ~II1Ihhk J, NIJI m il DL 1AS ENZIMAS IJ v clllivn econmicamente que los mtodos de fermentacin. En 1973 la crisis d~1 petrleo, con el consiguiente incremento de los precios hizo que el mundo cnlero se interesase por combustibles renovables alternativos. Por ejemplo, Bra- .il se embarc en un programa nacional sobre el alcohol que apuntaba hacia el desarrollo de la capacidad de fermentacin que produjese en 1987 tres billa nes de galones de etanol anuales a partir de caa de azcar. El gobierno federal de USA alent el desarrollo de la produccin de alcohol a partir de la fermenta- cin del maz mediante el Gasohol Program, reduciendo los impuestos del ga- sohol (gasolina con un 10 "lo de alcohol), por lo que se establecieron un nme- ro considerable de plantas de fermentacin de pequela y gran escala que produ- can alcohol mediante procesos de fermentacin continuos y discontinuos; el objetivo de este programa era conseguir un volumen de produccin anual de 1,8 billones de galones a mitades de los ochenta. Tambin se obtiene etanol por la fermentacin del suero de leche con K/uyveromyces fragi/is, aunque el volu- men de produccin obtenido por este procedimiento es minsculo comparado con el producido por S. cerevisiae a partir de malz o caa de azcar. La fermen- tacin del lactosuero (que solo tiene aproximadamente un 5 "lo de lactosa en peso/volumen) debe llevarse a cabo en lugares prximos a las fbricas de que sos, puesto que si no los costos de transporte seran prohibitivos. Actualmente solo un pequelo nmero de productos qumicos de gran volu- men de consumo se obtienen por fermentacin, ya que prcticamente todos ellos ~e manufacturan a partir del petrleo y del gas natural. Las fluctuaciones del costo y el incierto suministro de petrleo, as como la inquietud frente al agota- miento definitivo de las fuentes no renovables han intensificado el inters del empleo de recursos no petrolferos para la produccin de energa y de compues tos qulmicos. Aminocidos Durante los ltimos treinta aos, la.m-oduccin de aminocidos mediante procesos de fermentacin aerobia ha experimentado una rpida e~ru!!lsin. El glutamato monosilico y la lisina son los que se producen en cantidades mayo- res, con niveles de produccin mundial anuales de 370.000 Tm y 40.000 Tm, res- pectivamente. Los procesos deJermentacin~re.s.ultado de un.elegnte tra- bajo de investigacin acerca de los mecanismos bioqumicos que regulan la bio- INl RODUCCION sntesis de aminocidQs por los microorganismos, consiguiendo la superproduc cin de aminocidos mediante una combinacin de mutaciones y del conl rol de los procesos de fermentacin. Las tcnicas empleadas intentan estimular a las clulas para que ingiera nuevos materiales, previniendo o impidiendo las reac- ciones laterales, as como inducir y activar a los enzimas biosintticos y reducir o inhibir la actividad enzimtica que podra degradar el producto, y finalmelllc facilitar la excrecin del aminocido. Las investigaciones clsicas utilizadas por el desarrollo de la fermentacin del cido glutmico han dado un Impetu signi- ficativo a los procesos de fermentacin para la produccin de otros metabolitos primarios, de forma que actualmente la mayora de los aminocidos se produ cen comercialmente mediante estos procesos. Se han aplicado tcnicas similares a la produccin de monofosfatos de inosina y guanosina, potenciadores del sabor. Biopolmeros En los ltimos alias se han diseado un gran nmero de fermentacionesjn- dustriales destinadas a la produccin de bio olmeros mi bjanos. La mayora de los polimeros son sintticos y por tanto son sensibles a las fluctuaciones del precio del petrleo, de forma que los biopolmeros pueden ser especialmente importantes cuando se eleve el precio del crudo. El ~6opolmerg ms importante en funcin del volumen de su produccin es la- m xan ano, titizada como gelificante o estabilizan!e de suspensiones, producida por ermentacin aero la e a actena ant omonas campes/riso Existen otras gomas microbianas de inters comercial que se obtienen-a partir de Aze/obac/er vine/andii (alginato), Aureobasidium pul/u/ans (pululano), Se/e- rotinum (escleroglucano) y Pseudomonas e/odea (gelano). Los elevados pesos moleculares y viscosidades de los polisacridos extracelulares plantean proble- mas en los procesos de mezclado y transferencia de masa y calor existentes en un fermentador, por lo que deben ser tenidos en cuenta a la hora de diselar un aparato ptimo para estos procesos. Un polmero muy prometedor que est siendo desarrollado actualmente es eI-polihidroxibutirato, poliester termoplstico que se puede acumular intracelu- larmente en algunos tipos de A/caligenes entrophus hasta un nivel del 70 "lo en peso de biomasa. Este producto podra permitir el empleo de plsticos biode- gradables en lugar de los plsticos obtenidos a partir del petrleo, no biodegradables. Vitaminas En la actualidad la mayorla de las vitaminas se producen por mtodos qul- micos. Aunque se han descrito mtodos de fermentacin ara un mn nmero de vitaminas del grupo B,comQ.l.a tiamina>biotina ~o flico, cido an.lo1C, 14. 10 11IOTECNOLOOIA DE LA FERMI'N IAl ION IIko, piridoxamina, vitamina 8 12 y ribonavina. nicamente las dos ltimas se l hll ~nCII mediante mtodos biolgicos. La sntesis qulmica de la vitamina B ' 2 C ~, I rcm adamente complicada por lo que slo se obtiene comercialmente me- d,lIIle fermentacin industrial con Pseudomonas. En la produccin de ribofla-lila lo, procesos de fermentacin compiten eficazmente con los mtodos de "(lIlcsis o de semisntesis qumica, de forma que la tercera parte del volumen lit produccin de esta vitamina se obliene por fermentacin. En 1935, se utiliz 1" ImCf'dmenle Eremolhecium ashbyii para obtener la vitamina, consiguindose UIIOS rendimientos que fueron incrementndose gradualmente hasta alcanzar los 5,3 g/I, aunque debido a la inestabilidad de la cepa, posteriormente se prefirie- ron olras especies, como Ascomyceles y Ashbya gossypii. Una patente reciente (1984) describe una cepa recombinante de Bacill"s sub/ilis capaz de producir 4,5 g de ribonavina en 24 h de fermentacin, perodo muy in feriar al necesario con los Ascomyce/es, que se aproxima a los 5 das. Insec/icidas microbianos Los insecticidas qumicos, empleados con gran xito en agricultura y para favorecer la salud pblica, han sido ampliamente utilizados este siglo. Sin em- bargo, las crlicas acerca de que pueden matar organismos distintos al blanco O de que los organismos blanco pueden volverse resistentes a ellos han conduci- do al desarrollo y comercializacin de insecticidas microbianos, de forma que la investigacin es continua en este campo. La produccin de Bacillus /hurin- giensis supera con mucho la de cualquier otro insecticida microbiano produci- do comercialmente. Las condiciones de fermentacin se disean de tal modo que se alcance un rendimiento y una bioactividad de la endotoxina, producida de forma concomitante con la esporulacin, mximos. Las distintas cepas de 8. fhuringiensis y de otros organismos capaces de sintetizar insecticidas bacte- rianos y fngicos manifiestan toxicidades diversas. Los genes de la toxina de Bacillus fJllIringiensis han sido clonados en Escherichia coli y Bacillus sublilis, mejorando potencialmente las velocidades de produccin y alterando su espec- tro de eficacia. Giberelinas Las giberelinas, diterpenoides que tienen cuatro anillos de carbono, se apli- can para la aceleracin de la germinacin de la cebada en la produccin de mal- ta. La primera giberelina fue descubierta en 1938 y en la actualidad se conocen ,esenta compuestos distintos. El cido giberlico se produjo inicialmente me- diante cultivo en superficie en una fermentacin prolongada, consiguindose rendimientos de 40-60 mg/ I de producto. Hoy en da las fermentaciones comer- ciales por cultivos sumergidos producen rendimientos significativamente mayores. IN I KOtllJ('C'ION 11 ENZIMAS MICROBIANOS La explotacin comercial de enzimas microbianos aislados fue iniciada por Jokichi Takamine, un japons que emigr a USA, y que en 1894 patent un mtodo para la preparacin de enzimas diastsicos a partir de mohos, comer- cializados con el nombre de Takadiastasa. Este mtodo, que implica el creci- miento de los mohos en la superficie de un substrato slido, como trigo o salva- do, era reflejo indudablemente de los procesos similares de preparacin de ali mentos orientales fermentados. El desarrollo de fermentaciones de enzimas in dustriales bacterianos fue iniciado por Boidin y Effront, en Francia y Alema nia, respectivamente, quienes en 1917 patentaron el empleo de Badllus subfili, y Eacillus mesenlericus para obtener amilasas y diastasas tambin mediante tc nicas de cultivo en superficie. Los mtodos de cultivo en superficie para la pro- duccin de enzimas fngicos se utilizaron en USA hacia los anos cincuenta y an hoy continan emplendose, especialmente en Japn. Las fermentaciones fngicas sumergidas se emplearon en USA y Europa para la produccin de en- zimas basndose en la experiencia conseguida con las fermentaciones sumergi- das en el desarroUo del proceso de produccin de Penicillium, en los Northern Regional Research Laboratories (NRRL) de USA. La introduccin de enzimas microbianos industriales en el mercado estable- ci el fundamento de la tecnologa para la aplicacin de enzimas, particular- mente en reas del procesado de alimentos como la produccin de cerveza y zumos de frutas y la manufactura de hidrolizados de almidn. En los aos se- senta el mercado de los enzimas industriales se expandi dramticamente al in- cluirse proteasas alcalinas en los detergentes en polvo. La produccin y empleo de glucosa isomerasa microbiana para la man ufactura de jarabes de maz ricos en fructosa represent un hito muy importante en esta dcada, producindose un gran impacto en el mercado de edulcorantes calricos, dominado hasta en- tonces por la sacarosa. En USA, la industria destinada a la elaboracin de bebi- das era el usuario industrial ms importante de azcar, pero hacia 1984 las prin- cipales compaas de fabricacin de bebidas no alcohlicas haban llevado a cabo la substitucin total de la sacarosa por los jarabes de maz ricos en fructo- sao Otro desarrollo tcnico significativo de los aos setenta consisti en la co- mercializacin de a-amilasa estable a temperaturas elevadas obtenida a partir de Bacillus licheniformis. La capacidad de este enzima para licuar el almidn a temperaturas de hasta 110 oC no slo ha hecho ms eficaz el proceso de hi- drlisis del almidn sino que tambin ha impulsado el aislamiento o modifica- cin de otros enzimas con estabilidad elevada. 15. 12 BIOTE NOLOGIA DE LA FERMI!NTACION 1-IOQUerOS DE USO MEDICO IIIflh6ficos Durante cincuenta anos, siguiendo la sugerencia de Pasteur de que los efec- to, antagonistas de unos microorganismos frente a otros podan tener potencia- les efectos teraputicos, se probaron como medicina sin xito diversas prepara- ciones microbianas. Finalmente, en el ano 1928, Alexander Fleming observ que el Prmicillium nOfacum, contaminante de los cultivos de Staphyfococcus aureus, mataba las bacterias, demostrando que el ingrediente activo, denominado peni- cilina, poda inhibir otras muchas bacterias. Una vez aislada la penicilina en una forma activa estable por Florey y Chain en 1940, se demostr su destacada actividad antibacteriana y se desarroll en USA un proceso de fermentacin co- mercial con el apoyo del NRRL (Northern Regional Research Laboratories) y la colaboracin de varias compaas farmacuticas americanas. El desarrollo con xito de la obtencin por fermentacin de la penicilina marc el inicio de la industria de los antibiticos. Muy pronto se aislaron mu- chos nuevos antibiticos, como la estreplomicina, a partir de especies de Sfrep- fomyces y se descubrieron las cefalosporinas, producidas por Cephafosporium acremonium. Las penicilinas, cefalosporinas y estreptomicinas fueron los pri- meros antibiticos ms importantes descubiertos, aunque desde los anos cua- renta hasta nuestros dlas se aislan anualmente cientos de nuevos antibiticos. El desarrollo del proceso de fermentacin de la penicilina tambin ha dado lugar a avances generales claves en la fermentacin industrial, marcando el co- mienzo de los procesos eficaces de fermentacin fngica sumergida. La edad de oro de la gentica microbiana clsica, que implicaba tcnicas de mutacin y seleccin, iniciada aproximadamente en el ao 1940, ha permitido incremen- tar, por ejemplo, los rendimientos de penicilina desde unos pocos mg por litro hasla 20 gi l de cultivo. Tambin se iniciaron estudios sobre la naturaleza del complejo proceso metablico implicado en la produccin de metabolitos secun- darios, molculas pequeas, como los antibiticos, que no lienen un papel ob- vio en el crecimiento y mantenimiento de la clula. Inicialmente se obtuvieron penicilinas modificadas (semisintticas), con ac- tividad o sensibilidad frente a la inactivacin por cidos o enzimas alterada por transformacin qumica de la penicilina natural; postedormente, algunas de las etapas de semisintesis fueron llevadas a cabo por conversiones biolgicas. Transformaciones de eSferoides El empleo de microorganismos para llevar a cabo transformaciones enzim- licas altamente selectivas y especificas de productos farmacuticos represent un avance decisivo en el desarrollo de medicamentos con hormonas esteroides. INI HOllUl ION En los aos cuarenta se estableci que la cortisona, esteroide secrclado po, lu glndula adrenal, aliviaba el dolor de los pacientes con artritis reumatoicle. pt'" lo que se dise un procedimiento de sntesis qumica que requera 37 etapa; para la produccin de cortisona, a un costo de 200$ el gramo. En 1952, los cien- tficos de Upohn Company descubrieron una cepa de Rhizopus arrhizus qlc hidroxilaba la progesterona, produciendo ll-a-hidroxiprogesterona, lo que per miti que el procedimiento de sntesis de cortisona pasase de 37 a II ctapas y se redujese su costo a 16$/g. A lo largo de los anos se han introducido mejora, constantes en el proceso, que han ido disminuyendo progresivamente los COSlu, de produccin de forma que en 1980 ste era de slo O,46$/g. Se han aplicado tcnicas de biotransformacin microbiana similares pum la sntesis de otros esteroides, particularmente a1dosterona, prednisona y p,cu nisolona. Las tcnicas son tambin importantes para la sntesis de otros cam puestos qulmicos, tanto farmacuticos como sin aplicaciones mdicas. Vacunas Existen referencias acerca de las enfermedades infecciosas en algunos unt i- guos escritos hindes y evidencias arqueolgicas de lesiones tuberculosas en las momias de las primeras tumbas egipcias. La capacidad de conferir resistencia a la enfermedad mediante vacunacin fue descrita en primer lugar por lenner, en 1798, quien observ que los indivi- duos inoculados con viruela vacuna o vaccinia eran inmunes a la viruela. El empleo de vacunas, as como la inmunologia, comenzaron hacia 1877, cuando Pasteur dirigi su atencin a las causas y forma de prevenir las enfer- medades infecciosas del hombre y los animales. En 1890 Behring y Kitasato in- munizaron animales con toxinas inactivas de difteria y ttanos, seguidamente Koch aisl el Vibrio choferae y la primera vacuna del clera fue administrada en 1894 por Ferran y Clua, mdico espaol, mediante inyeccin subcutnea de caldos de cultivo vivos a ms de 30.000 espaoles. Durante la primera Guerra Mundial los ejrcitos fueron sometidos a programas de vacunacin contra el tifus y en la segunda Guerra Mundial se introdujo un programa similar contra el ttanos. A finales de los aos treinta comenz la vacunacin masiva contra la difteria. El uso extendido de las vacunas contra la IOsferina y la poliomielitis da cuenta del xito obtenido en los ensayos realizados en 1955 con estas vacu- nas. Hacia 1936 Calmette y Ourin observaron que el cultivo en serie de bacilos tuberculosos infecciosos o virulentos en un medio artificial durante largos pe- riodos atenuaba su actividad hasta el punto de que ya no eran capaces de cau- sar la enfermedad. Tres aos ms tarde se introdujo la primera vacuna BeG (Bacilo de Calmette y Ouerin) que inmunizaba frente a la tuberculosis. El uso de vacunas atenuadas sufri un gran reves diez aos despus, en el llamado de- 16. 14 1lI011'CNOLOO IA DE l A H .RMENI'AC ION ' ''Mle de Lbcck, en el que 72 de los 240 nilos vacunados con la BCG murieron ~()"' O resullado del tratamiento Con un lote de vacunas que contenan el bacilo dc la 1ubercuJosis virulento. Las vacunas bacterianas utilizadas hoy consisten l' n cepas vivas atenuadas de los organismos productores de enfermedades o de r q)l) rtlacionadas estrechamente, cepas patgenas muenas o componentes ce- IIllare> que contienen anligenos y que son efectivos pam inducir la inmunidad I,ollle 3 las correspondientes enfermedades infecciosas. Aunque la produccin ue v'lcunas es una aplicacin importante del proceso de fermentacin, su escala de manufactura es relativamente pequea. La tecnologa de fermentacin utili- la procesos continuos o discontinuos cuyas condiciones deben ser diseadas con objeto de optimizar la produccin celular del material inmunognico. La tecnologa de las vacunas vricas fue primitiva durante muchos aos, de- bido a la necesidad de emplear animales como fuente de virus. Los embriones de pollo se utilizaron como fuente de virus hasta que, hacia 1950, se desarrolla- ron las tcnicas de cultivo celular. Con estas tcnicas, la produccin de vacunas viricas entr a formar parte del campo de la fermentacin industrial. Las clu- las de mamiferos se cultivan en un medio apropiado y, en una cierta etapa del crecimiento, se inoculan con los virus, que se multiplican en las clulas huspe- des. Esta tcnica permite preparar grandes cantidades de virus mucho menos contaminados por materiales extraos del husped, bacterias o virus, que esta- ban presentes en los obtenidos por los mtodos antiguos. Impacto de las tnologas de hibridomas y de DNA recombinante Los recientes e importantes avances en la tecnologla de hibridomas y en la ingeniera gentica han extendido el alcance y el potencial de la tecnologa de la; fermentaciones industriales. ANTICUERPOS MONOCLONALES En 1975, Kohler y Milstein fusionaron un melona de ratn (clula de cn- cer de piel) con un glbulo blanco productor de anticuerpos obteniendo una clula hibrida (hibridoma) que combinaba las distintas capacidades de las clu- las padre, la divisin celular y la produccin de anticuerpos; tambin desarro- llaron la tecnologa bsica para la produccin de anticuerpos monocionales, pre- paraciones de anticuerpos especficos individuales obtenidos a partir de clulas producidas por un nico antepasado o clan. Los anticuerpos monoclonales tie- IN I Rllllun IUN I ~ nen una elevada especificidlld uc unin a receptores individuales, moleulo' o superficies y tienen muchas aplicaciones potenciales quc aprovechan sus carac terlsticas nicas, particularmente en anlisis clnicos y en la terapia para deter- minadas enfermedades. El mercado de anticuerpos monoclonales ha crecido 1'11- pidamente y se espera que alcance el billn de dlares en 1990. La produccin de anticuerpos monoclonales se ha llevado a cabo in vivo por inyeccin del clan del hibridoma en el lquido de la cavidad abdominal del animal (usualmente ratones) o in vilro en una gran variedad de sistemas de cultivo celular. Estos sistemas permiten conseguir una mayor productividad global por lo que se han diseado y comercializado una gran variedad de reactores para cultivos celulares. TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE La ingeniera gentica implica la formacin de nuevas combinaciones de ma- terial gentico mediante la insercin de genes extraos, producidos fuera de la clula, a un organismo husped en el que no existen de forma natural. El pri- mer gen fue clonado en 1973 y desde entonces las tcnicas han avanzado tanto que en la actualidad se podran producir proteinas extraas en cantidades comerciales a partir de una gran variedad de cepas recombinantes de procario- tas y eucariotas, incluyendo clulas de animales y plantas. La industria farma- cutica ha invertido mucho en investigacin y desarrollo en este campo, siendo el primer producto que ha conseguido la autorizacin para su uso teraputico la insulina humana producida por una cepa recombinante de E. coli. 1lunbin se han preparado otras muchas protenas mediante esta tcnica, entre ellas otras hormonas humanas y varios factores de crecimiento, compuestos antitumorales y antivricos, y antgenos virales y enzimas. La primera vacuna obtenida me- diante ingeniera gentica comercializada ha sido una vacuna de uso veterinario introducida en 1986 contra la pseudorrabia, un virus tipo herpes que infecta a los cerdos. Las investigaciones pioneras sobre ingenjera gentica y los primeros pro- ductos comercializados utilizaron E. coli como husped ya que sus sistemas ge- nticos eran muy conocidos. Los caballos de batalla de la fermentacin indus- trial, Bacillus, Aspergillus y Saccharomyces pueden ser mejores huspedes a largo plazo, una vez que sus sistemas genticos se conozcan con ms profundidad. El E. coli no secreta en general proteinas, mientras que los Bacillus producen rendimientos altos de protenas extracelulares. Como los procariotas no glicosi- lan las proteinas, las diferentes especies deSaccharomyces y Aspergillus pueden ser los huspedes adecuados para la produccin de glicoprotenas animales o humanas. Se sabe que Aspergillus niger es capaz de secretar hasta 20 gi l de pro- te!na a partir de un nico gen de un enzima extracelular. Algunos productos 17. OIOTBCNOLOOIA DE ~A FERME~HA 'ION IlIrlllUCUUcos rccombinantes se han obtenido mediante S. cerevisiae. Sin embar- Hn, Ins sistemas de secrecin y sntesis proteiea son signilicativamente ms com- pleJus en e,'tos microorganismos eucariotas que en los procariotas, por lo que tltn~1I que ser investigados ms completamente para permitir el uso de estos orgunlsmos en los procesos de fermentacin, particularmente para la produc- cin de productos recombinantes no farmacuticos, por ejemplo, enzimas. Las protenas y los pptidos, productos de traduccin de los genes estructu- nllcs, son el primer objetivo obvio de produccin mediante la tecnologa de ADN recombinante. A largo plazo, podra ser posible la manipulacin del metabolis- mo primario y secundario para mejorar la produccin de metabolitos mediante la ingeniera gentica de enzimas clave en la secuencia metablica. En los siguientes capitulos se describen algunos de los aspectos ms espec- ficos de este terna. Introduccin Captulo 2 Biologa de los microorganismos de uso industrial ~~ctos comercialmente importantes de las fermentaciones industria- les e enecen a 4 categoras principales: u m'crobianas mol~~gran.:: des c~lI]oJnzi as'y polis~W, proJllcto~~olito.uecunda rios que no son necesarios para el crecimiento celular. Las clulas utilizadas pa- ra obt~r estos productos tienen una gran variedad de propiedades bioqumi- cas y fisiolgicas. La produccin comercial de productos de fermentacin ha empleado rincipalmente diversas especies de bacterias, levaduras hon os aun- que los avances recientes en el desarrollo e t COleas e cu tivo de clulas de animales lantas han perm"fIdo mtroduclr clulas ms com leas en lo ro- cesos de fermentacin En este captulo se van a tratar las propiedades de las especies ms mportantes utilizadas as! como los aspectos generales del creci- miento y metabolismo microbianos que son importantes para los procesos in- dustriales de su cultivo. Microorganismos industriales En la naturaleza existen dos clases fundamentales de clulas, as rocarlotas y las eucariotas, ambas utilizadas en los procesos de fermentacin industrial. 17 18. I~ DIOTECN01.OGIA DE LA FERMENTACION I,,~ clula~ ellcariotas tienen un ncleo diferenciado rodeado por una membra- IIlJ , 'i .su ADN nuclear est asociado a protenas y se encuentra en estructuras drli"ldas denominadas cromosomas. y adems tambin tienen otras estfUctu- '''~ 11 orgnulos con funciones bioqumicas o fisiolgicas especficas. Por el con- l,ul10. las procariotas carecen de un ncleo bien definido, de tal modo que el lIIoterial gentico, en forma de ADN en doble hlice, no est separado de los otros constituyentes de la clula por una membrana; estas clulas tambin care- cen de otros orgnulos especializados existentes en las eucariotas, como por ejem- plo las mitocondrias, y los enzimas asociados a estos orgnulos en los eucario- tas se encuentran en el protoplasma y en la membrana plasmtica de las proca- riotas. En la Tabla 2.1 se comparan las propiedades de las clulas eucariotas y procariotas. En los procesos de fermentacin se emplean clulas bacterianas. que son procariotas, y hongos, levaduras y clulas animales y vegetales, que son eucariotas. Los microorganismos tambin se distinguen en funcin de sus necesidades de oxigeno, pudiendo dividirse en los aerobios estrictos, como los Slreplomyces y la mayora de los hongos filamen tosos, que pueden llevar a cabo su metabo- lismo y crecimiento nicamente en presencia de oxigeno atmosfrico, los anae- robios estrictos, como los C/oslridia, que nicamente pueden crecer en ausen- cia de oxigeno y los organismos facultativos. entre ellos las levaduras industria- les, que pueden crecer en situaciones de aerobiosis y de anaerobiosis. Las b-cterias implicadas en los procesos de fermentacin son_principalmen- te quimoorgantrofos, esto es. pueden obtener su energla ysu carbono per oxi- dacin de los compuestos.orgnicos, En ;; Tabla 2.2 se muestran algunas de Tabla 2.1. Caractersticas que diferencian a las eucariotas de las procariotas Caracterfstica Orgdnulos Ncleo Mitocondria Rotlculo endoplsmico Genotna No. de molculas de DNA ONA en orgnulos DNA formando estructuras cromosmicas Procariotas Eucariotas + + + > 1 + + l. Las bacterias pueden contener fragmentos pequenos de DNA (plsmidos) adems del genoma principal. 1l10LOGIA DE LOS MI HOORGANISMOS DE USO INDUSTRIAL I~ Tabla 2.2. Propiedades del gnero de bacterias quimo-organotrficas de im portanda en las fermentaciones industriales Gllero Elllrrobolaia J' Il'udomUl/llS .rlllffhom01Ul;J ,Itdohacter A/rflligenes Dad/bu Clastridium LtuClJlI()sllJ( I..(l(toballus Cory11f bacterium Reaccin Gram ... + + + + Propiedades Endos- poras Forma Varilla Varilla Varilla Varilla Varilla/coco + Varilla + Varilla Esfrica Varilla Irregular Ejemp/o de especies Aerobias' (produclos) + + + + + E. coti (protelnas recombinanles) p. ovalis (cido glucnico) p. j1uorescens (2-oxoglucon.lO) X. campesr,.s (gom. xantano) A. aceti (cido aclico) A. faecatis (gom. curdlao) B. subliJis, B. licheniformis, B. amy/otiquefa- ciens etc. (enzimas extracelulares) B. coagulalls (glucosa isomerasa) B licheniformis (bacitracina) B. brevis (grarnicidin. S) B. rhuringiensis (insecticida) e acerobutylicum (acetona, bulanol) e Ihermocellum (acetato) L. mesenleroides (dextranol, _ o L. delbruckii (cido lctico) + C. gluramicum (aminocidos) C. simple.x (conversin de oSlcrolde) 19. 20 BlarE NOLOOIA DE LA FERMENTA< ION '",biD 2,2, Continuacin Reaccin alrllero Gram 1 I )'l'lIhcltrillrtl +/}ra ,-dia + + Propiedades Endos- poras Forma Filamentos ramificados Sin micelio Micelio fragmentado Micelio intacto 1. Aerobio: + = aerobio; - = anaerobio; = ambos. Ejemplo de especies Aerobios! (productos) + Mycobacterium spp. (transformacin de esteroides) + N. mediterranei (rifamicinas) Nocardia spp. (transformacin de esteroides) + S. erylhreus (eritromicina) S. aureofaciens S. rimosus (tetraciclinas) S. Iradiae (glucosa isomerasa) S. roseochromogens (hidroxilacin de esteroides) las propiedades de los gneros ms importantes de estas bacterias, as como al- gunos ejemplos de especies. Las bacterias se pueden dividir en Gram-positiva o Gram-negativa en funcin de su respuesta a la coloracin de Gram, que afec- ta a los peptidoglicanos. La envoltura celular de las bacterias Gram-positiva con- siste en su mayor parte en una capa de peptidoglicanos, de 15 a 80 nm de espe- sor, que recubre a una membrana citoplsmica sencilla. En las Gram-negativa, esta capa de peptidoglicano es de slo 2-3 nm de espesor. Las bacterias Gram- negativa tienen dos membranas, la externa y la citoplsmica, separadas por el espacio periplsmico. En la Figura 2.1 se muestran estos dos tipos de estructu- ras. Ngunos procariotas, por ejemplo, los Streptomyees productores de anti- biticos, tienen mamentos o mcelios. La reproduccin de las bacterias tiene lugar por divisin celular asexual se- gn se muestra esquemticamente en la Figura 2.2 para el E. eoli. El nico cro- mosoma de ADN circular se replica y en el centro de la clula aparece una mem- BIOLOCIA DI' I.OS MI( HOUKe'ANISMOS DE USO INDUSTR IAL OrnmpoSlllva r ..... PepHdogricano - 80 nm J ........... Membrana O O O O O cJ!oplsmlca ..... 8nm 00000000 1 000000 G/am-negatlva 00000 000000 000000 00000 uvO 0_0. 0 0000%0000 00000 Citoplasma T N8nm 1....2 nm T"-7nm +.....8nm 1 Membrana externa Peplidoglicano Membrana periplsmica Membrana citOplsmlca 21 F1g. 2.1. Comparacin esquemtica entre la composicin de las envolturas celuJares de las bacterias Gram-positiva y Gram~negativa. Ha, 2,2, Divisin asexual del Escherichia eoli. brana O septo que separa el cromosoma nuevo del viejo; despus el septo se trans- forma en pared y las clulas se separan. Las esporas se producen porlas bacte- rias formadoras de esporas usualmente en respuesta a condiciones adversas del medio, ya que stas son ms resistentes al calor y a los compuestos lxicos que las clulas vegetativas, y cuando pasan a un medio apropiado germinan dando lugar a clulas vegelativas. Los hongos tambin son quimoorgantrofos con rufas filamentosas rgidas y ramificadas cuyo dimetro est comprendido usualmente entre 2 y 18 nm, Los hongos superiores tienen tpicamente paredes trasversales o septos a intervalos dados a lo largo de la hifa, aunque en los hongos inferiores esta caracterrslica 20. 22 1l10T~ t"OLO ,lA DE LA I IlRMI't" IAl ION "'11 lluscntc. Los hongos ms importantes implicados en Ins fermentaciones in- dll,,,iales se clasificanprincipalmente en dos grupos, los Zygol11ycotina~ as9'- IlId"" c0l110 los gneros Mucor y Rhizopus, Ylos Deuteromycot ina, seplados, (l JilIlgi Impcrfecli, por ejemplo los Trichoderma, Aspergillus, I't!nicillium, IlIl'l'obasidium YFusarium (Fig. 2.3). Los Zygomycotina producen micelios vegetativos haploides. Las esporas ase- xuales se forman en el esporangio, aunque tambin se reproducen sex:ualmente. Los Dcuteromycotina producen micelios vegetativos haploides, y las esporas ase- , unles son usualmente inducidas por determinadas condiciones medioambien- tales; por ejemplo, en Aspergil/us niger se activa la formacin de esporas en los conidios cuando el contenido de nitrgeno llega a ser limitante. En los Zygomycotina los principales constituyentes de las paredes celulares son el quitosano y la quitina, en tanto que en los Deureromycina predominan el glucano y la quitina. El crecimiento vegetativo de los hongos filamentosos implica la extensin hifal, y tiene lugar en el extremo de las hifas, y tambin se produce la ramificacin con el desarrollo de nuevas zonas de extensin, de fomla que la longitud de las hifas y la cantidad de ramificaciones depende del medio de crecimiento. En los fermentadores las fuerzas de cizalla pueden oca- sionar la fragmentacin de las hUas y dar lugar a la produccin de micelios ms cortos altamente ramificados. En los hongos, el extremo rufal es la principal rea de actividad protopls- mica (Fig. 2.4). la pared celular que recubre el plasmalema tiene solamente 50 nm de espesor en la regin apical, aunque por detrs del extremo puede alcan- lar hasta 125 nm y el compartimento protoplsmico se va volviendo gradual- mente ms vacuolado a medida que est ms distante del pice. Las levaduras son microhongos que se encuentran generalmente en forma de clulas nicas y que se reproducen mediante gemacin (Fig. 2.5). Algunas levaduras estn formadas nicamente por clulas individuales y a veces cadenas cortas mientras que otras se encuentran con un cierto rango de formas celula- res, in~luyendo diversos tipos de filamentos. Una caracterstica de la poblacin en crecimiento de las clulas de levaduras es la presencia de yemas, prodUCidas cuando la clula se divide. la clula hija comienza siendo una pequefia yema, que va creciendo hasta que alcanza un tamao similar al de la madre y entonces se separa. En las levaduras, la envoltura celular incluye la membrana citopls- mica, constituida por Iipidos, protenas y mananos, el espacio pcriplsmico y la pared celular, que contiene algunas protenas y gran cantidad de glucano y manano. La levadura ms utilizada en las fermentaciones industriales es Saccharomyces cerevisiae, sobre todo en la produccin de alcohol y en panadera; esta levadura na degrada la lactosa, por lo que para producir alcoholo biomasa a partir de suero de leche se utiliza Kluyveromyces lactis, que contiene los enzimas necesa- 1l10lOl,IA 1)1' 10 MIIIIIHlIlf,ANIS/oM)S DE USO INDUSTRIAl 21 rios para transportar y ucgn,dur la lactosa. Olras levaduras importantes indu" Irialmeme son Calldlda lItilis y Elldomycopsis flbuliger. Las clulas de los mamferos son generalmente ms complejas que las de los hongos o las levaduras, y, como normalmente se encuentran en medios iso- tnicos controlados, no tienen paredes celulares exteriores resistentes. la super- ficie exierna de la membrana plasmtica tiene una capa o gcocalix consistente en cadenas de oligosacridos cortos unidas a lipidos y protenas de la membra- na intrnseca y a algunas protenas adsorbidas. En los tejidos distintos de los reproductivos, las clulas son diploides y se dividen aproximadamente cada 24 horas. Segn el tipo, las clulas animales pueden crecer en cultivos en forma de monocapas unidas a superficies (dependientes del soporte) o como clulas suspendidas (independientes del soporte) en medios agitados suavemente me- diante giro lento. Las necesidades nutritivas de las clulas de los mamferos son muy complejas, y adems son muy sensibles a las fluctuaciones de parmetros como la temperatura, el pH, el oxgeno y el C02 disueltos. Las lneas celulares preparadas directamente a partir de tejidos animales ge- neralmente no sobreviven, aunque esto puede no ser as. Usualmente tambin exhiben inhibicin por contacto, es decir, detienen su crecimiento cuando se to- can entre ellas. Sin embargo, despus de pasajes repetidos, algunas lneas celu- lares primarias pueden haberse transformado, es decir, pueden multiplicarse y crecer ms rpidamente y a mayores densidades que las clulas primarias, pue- den cultivarse ndefinidamente y perder la propiedad de inhibicin por contac- to. las lneas de clulas tumorales se transforman fcilmente. Las clulas de hibridomas se construyen fusionando una clula de mieloma con una clula productora de anticuerpos, de forma que las clulas hbridas tie- nen las caractersticas de las clulas transformadas y a la vez son capaces de sintetizar un nico anticuerpo, denominado anticuerpo monoclonal. Estas c- lulas se utilizan en cultivos celulares o se implantan en el peritoneo de animales para producir anticuerpos monoc1onales. Muchos tipos de clulas vegetales pueden crecer en un medio slido o en suspensin mediante tcnicas similares a las empleadas para el cultivo de clu- las animales. Adems de las necesidades del medio, que suele ser complejo e incluir extractos de plantas y auxinas, tambin deben aadirse carbohidratos, puesto que en las clulas cultivadas la fotosntesis no es tan eficaz como en la planta entera. Los tejidos vegetales crecen en un medio slido como un callo formado por una mezcla de clulas parenquimatosas. Mediante el subcultivo repetido, las clulas tienden a crecer ms rpidamente, necesitan un medio me- nos complejo, pueden cambiar su nmero de cromosomas y son menos capaces de diferenciarse. El cultivo en suspensin es el mtodo de cultivo de clulas ve- getales ms utilizado, y su principal ventaja es que puede conseguirse un medio homogneo a lo largo del reactor. 21. 2< BIOTECNOLOGIA DIlI..A H !RM IlN IA( ION SIOLO lA DIl LOS MI ROORGAN ISMOS DE USO INDUSTR IAL 2 .; u ~:;; ~ "-s J E ~ k ~ t~ ,~ ~ ~ u ! e o, ': '"Cu e~ i1~ .~ ti i "g ~ 5 o ~.gg n~i . -Q i.g~ 1 ~H !H &~! , ~ "u ~ u C '"1:: 8. .5 !.a o 8 ~ ~ .2.!J 3~ 11 ':: 01"'] 8 H t~.8~~ei~.'l1i8=jS: -:;: ' "52 'l"i .. g. ';~ 6 -'"~~68 -qg!l t~ ~~~ . ~~]~ .~~ -. .H dH()I{Ui NISMOS DE USO INDUSTRIAL JI a I'm" cuando la fuenle de carbono limitantc es mayor que 10 Ks o 10-100 m& dm - 3. Las concentraciones de carbohidrato elevadas pueden inhibir el creci- miento debido a los efectos osmticos que, como hemos visto antes con la acti- vidad del agua, tienen una influencia ms acusada sobre las bacterias que sobre los hongos. Se ha comprobado que la cantidad de masa celular total formada durante el crecimiento celular es frecuentemente proporcional a la cantidad de substra- to utilizado 'Y X/ S Biomasa producida (g) Substrato consumido (g) ( 10donde "YXJS coeficiente de rendimiento de biomasa Metabolismo METABOLISMO PRIMARIO El crecimiento microbiano depende de la capacidad de la celula para utili- zar los nutrientes de su medio ambiente y sintetizar los compuestos macromo- leculares de las estructuras celulares y tambin los principales compuestos de peso molecular bajo necesarios para la actividad celular. El metabolismo inter- mediario incluye las reacciones que transforman los compuestos de carbono y nitrgeno que entran a la clula en nuevo material celular o en productos que son excretados. La sintesis de estos compuestos necesita energa, y la mayora de las clulas utilizadas en las fermentaciones industriales son hetertrofas y obtienen su energa a partir de la ruptura de compuestos orgnicos. En los pro- cesos respiratorios o aerobios, los organismos son call1'ces de oxidar completa- mente algunos de los substratos a CO, y H,O, obteniendo el mximo de energa para la conversin de los substratos remanetes en nueva masa celular. En el metabolismo fermentativo o anaerobio, las clulas sonmenos eficaces--la hora de convertir los substratos orgnicos en material celular y usualmente excretan intermediarios degradados parcialmente. Las rutas productoras de energa o catablicas generan ATP y los coenzi- mas reducidos necesarios para las diversas reacciones biosintticas, e interme- diarios qumicos utilizados como puntos de partida para las reacciones de biosntesis. 25. 32 BIOTECNOI.OCIA DE LA I'ERMI'N l'Al'ION Los azcares se rompen por una de las Lres vlas, la de Embden-Meyerhof- I'amas (EMPl, la de la hexosa monofosfato (HMPl, y la de Entner-Doudoroff (1 D). La ruta EMP, que convierte la glucosa en dos molculas de piruvato a Imvs de la Iriosa fosfato est muy djfundida en las clulas de arumales, plan- tas. hongos, levaduras y bacterias, y como no produce precursores para la bio- s{ntesis de aminocidos aromticos, ADN y ARN, los microorganismos que ni- camente utilizan esta ruta para la asimilacin de la glucosa deben abastecerse de factores de crecirrtiento. UI ruta ED est relativamente restrigida, ya que la utilizan unas pocas bacterias, entre ellas las Pseudomonas, que no metabolizan la glucosa por la ruta EMP. Un ciclo de la ruta HMP da lugar a la conversin neta de glucosa en CO, con produccin de 12 molculas de NADPH + H + . Los microorganismos pueden utilizar esta ruta para producir piruvato. UI im- portancia de la ruta HMP radica especialmente en la obtencin de precursores de aminocidos aromticos y vitaminas y del NADPH y H + necesarios para muchas reacciones biosintticas. Un producto final significativo de todas estas rutas es el cido pirvico, que en el metabolismo aerobio se introduce en el ciclo de los cidos tricarboxJ1icos (TCA) siendo asirrtismo precursor de los cidos, alcoholes y otros productos fi- nales del metabolismo anaerobio. Un gran nmero de microorganismos cubren sus necesidades de energa mediante el ciclo de los cidos tricarboxlicos. El acetil CoA (2C) formado a partir del piruvato se condensa con el oxalaeetato (4C) formando citrato (6C), que a Su vez se convierte en oxalacetato siguieudo el ci- clo, con produccin de dos molculas de CO, (vase Fig. 2.9a). De este modo el piruvato se oxida a CO, con formacin de coenzimas reducidos que pueden volver a oxidarse pasando sus electrones a travs de la cadena de transporte hasta los aceptores de electrones, como el oxgeno. Durante el proceso de respiracin parte de la energa producida se utiliza para formar ATP, necesario para las biosfntesis. Los intermediarios del ciclo de los cidos tricarboxilicos (TCA) tambin sir- ven como precursores para la bios!ntesis de muchos aminocidos, algunos ci- dos orgrucos y otros productos de fermentacin. Cuando estos intermediarios se derivan de esa forma hacia procesos biosintticos, se debe mantener el nivel de oxalacetato necesario para que se condense con los grupos acetilo proveruentes del piruvato, mediante una serie de reacciones; entre ellas, la principal implica la carboxilacin del piruvato o del fosfoenolpiruvato para formar oxalacetato o malato. Los rrticroorganismos que crecen utilizando como fuentes de carbono cidos grasos y acetato, o sus precursores, utilizan el ciclo de los cidos tricar- boxlicos para la produccin de energa y de las materias primas para los prce- sos biosintticos. El acetil CoA formado se condensa con el oxalacetato para enlrar en el ciclo. El oxalacetato y el malato, convertidos en fosfoenol piruvato y piruvato, pueden utilizarse como precursores de las hexosas y las pentosas a BlOLOCIA D ' LOS Mil RO()ROANI~MOS DE USO INDUSTRIAL Fosloenolplruvalo (C,) FosloenolpiruvalO (el) IPlruvato le3) !Acetil CoA (el) _ Acetato Oxalecetal0 L Cilrato (Ct.) (C.) /~ Acet lI CcA Malato lsocitrato (Ct.) (C.) GIIOXilal0' / 2 (C~ Fumarato ~ Cetoglularato (es) (C~) Succinalo ICo) / 1Plfuvato (el) /~.JCoA (c,) I '"-l. Citrato (C.J Oxalacelalole.) Malato ( Isocitrato (e,) (C.)J Fl1marato _ O!Cetoglutaralo (e,) (Ca) Succinato (Co) 1.1 Ibl Fig. 2.9. (a) Reacciones anaplerticas en las que,interviene el ciclo?e los cidos tri~ar boxlicos cuando un organismo crece en carbohldratos. (b). ReaccIones anaplerttcas y otras reacciones claves para la sntesis de precursores de hexosa y pentosa cuando un organismo se culliva en subslratOSque generan acetato como principal fuente de carbono. travs de las reacciones reversibles de las rutas EMP YHMP. Nuevamente, en ausencia de reacciones anaplerHcas (restauradoras) los intermediarios del ci- clo TCA podrian agotarse. En este caso la introduccin de dos reacciones .enzi- mticas conduce a otro mecanismo cclico, conocido como ClelO del ghoslJato, que repone los cidos de cuatro tomos de carbono utilizando los acetil CoA que entran. En la Figura 2.9 se resumen estas reacciones anaplerticas. cl~ve. El ciclo del glioxalato tambin puede utilizar para reponer los mtermedlanos d~l ciclo de los TCA el acetil CoA producido a partir de las hexosas por la vla piruvato. , Las hexosas se convierten en protenas de organismos unkelulares (SCP) me- diante la accin de levaduras Yhongos utilizando generalmente una combina- cin de las rutas EMP YHMP, seguidas del ciclo TCA y la reSpiracin. La pro- duccin de protenas de organismos unicelulares a partir de alcanos implica la oxidacin del alcano a unidades de acetato y su asimilacin por los CIclos del glioxalato y de los TCA, mediante los enzimas de las rutas EMP YHMP utiliza- dos para la bios!ntesis de hexosas, pentosas y otros constituyentes celular.es. En la produccin de SCP a partir de metanol por las especIes. Merhylophl{~s, el substrato se convierte en formaldehdo, que a su vez es OXIdado en la vla de la ribulosa monofosfato (vase Fig. 6.4). 26. , 14 BIOTECNOIDGIA DD LA II'RM~N 1111 ION En el proceso de fermentacin para la oblencin del dci LA FERMI 'N IC ION delnu, substancias aromatizantes como la quinina y cl lll ollla del Jazmln y la l1Iel1l3, O insecticidas como las piretrinas. Es posible que algunos de estos com- ilUC~LOS puedan obtenerse en el futuro por cultivos en suspensin. Para obtener rendimientos altos de metabolitos secundarios vegetales parece ser necesario un cierto grado de agregacin y diferenciacin celular, lo que no siempre es desea- ble en una planta a gran escala ya que generalmente el perodo de cultivo nece- sario para las clulas diferenciadas es ms largo que el necesario para las no diferenciadas, lo que aumenta los costos y eleva el riesgo de contaminacin microbiana. Regulacin del metabolismo Una clula cualquiera tiene el potencial gentico necesario para producir apro- ximadamente 1.000 enzimas. Naturalmente, con tan compleja red de rutas me- tablicas operando, estos enzimas deben ser sintetizados en proporciones co- rrectas y deben trabajar en forma coordinada para permitir a la clula funcio- nar como una unidad eficiente. Los microorganismos son capaces de alterar su composicin y metabolismo en respuesta a cambios medioambientales, y los prin- cipales mecanismos reguladores que les confieren esta flexibilidad operan tanto a nivel de la sntesis de enzimas como de modificacin de su actividad. En un proceso de fermentacin dado el flujo de substrato a travs de la com- pleja red de rutas anablicas y catablicas puede verse influido por una gran variedad de mecanismos. Determinados enzimas limitantes de la velocidad es- tn situados estratgicamente en las diversas rutas, y usualmente son sensibles a mecanismos de induccin/represin Yactivacin/inhibicin (vase ms ade- lante). La sobreproduccin de metabolitos primarios se debe a las altas veloci- dades de flujo diferencial de las reacciones anteriores que dan lugar a la acu- mulacin del metabolito y tambin a las bajas velocidades de las reacciones pos- teriores que podrian causar su degradacin o utilizacin. Los procesos que re- gulan la produccin de metabolitos secundarios son ms complejos y menos conocidos, aunque es evidente que muchos de estos mecanismos son similares a los que controlan el metabolismo primario. Naturalmente, en el desarrollo de los procesos de fermentacin para la so- breproduccin de un metabolito particular, es esencial tener en cuenta los di- versos procesos de regulacin en el diseo de las condiciones medioambientales ptimas, as como en el aislamiento o manipulacin de las cepas microbianas productoras. 1JI0WJI" 1)1' J(, MI f(()()1 IANISMOS DE USO tNDUSTRti L 7 SINTESIS yOr:OI1AOACION oc ENZIMAS La concelllracin total de un enzima intracelualr particular presente en las clulas viene regulada por las velocidades relativas de sntesis y degradacin o inactivacin de tal enzima. Enlas clula.>, las Il'0tenas estn siendo degradada conti?~~baj~-'a ~c~in de los enzimasjlroteolticos, de forma que cada protelDa llene una Vida lumtada. Las protenas varan en su susceptibilidad frente al ataque proteottico, de forma que la sntesis neta de un enzima se produce cuando su velocidad de sntesis es superior a lade degradaci. En la Figura 2.11a se ilustra el mecanismo general de sintesis proteica de los procariotas. Una nica ARN polimerasa reconoce y se une a centros ADN especficos denominados promotores, iniciando la sntesis del ARNm y la Irans- cnpeln de un opern. En el extremo del gen estructural, una regin de termi- nacIn hace que la ARN polimerasa cese la transcripcin y se disocie del ADN. En los procariotas, muchas ARNm son policistrnicas, esto es; codifican cade- nas polipeptdicas mltiples, mientras que la mayora de los ARNm de los euca- riotas son monocistrnicos. La sntesis de cada protena se inicia por la unin de los ribosomas a un centro especfico del ARNm y la traduccin comienza incluso antes de que la ARN polimerasa haya alcanzado la seal para la terminacin. . En algunos casos la transcripcin bacteriana se inicia a una velocidad cons- tante (usualmente lenta), sin regulacin, en tanto que en otros la velocidad a la que el ARN inicia la sntesis est gobernada por protenas que interactan 5' 3~....l,__ Transporte Ncleo ADN Citoplasma Transcripcin primaria ~~som.Prolelna nacIente Ibl Flg. 2.11. Snte,is proteica en los procariola, (a) y eucariotas (b). 28. 38 B10TECNOLOOIA DE LA FERMENTA ION en Ilna forma especfica con las regiones del ADN denominadas operones, 10- cullladas cerca de los centros promotores. Las protenas reguladoras que se unen 11 los operones se denominan represoras o activadoras, dependiendo de si dismi- nuyen o incrementan la velocidad de iniciacin de la transcripcin. Algunos ope- Iones estn controlados por protefnas activadoras y represoras y en los proca- riotas los centros promotor-operador controlan frecuentemente la transcripcin del ADN que codifica ms de una protena. Las regulaciones de la sntesis pro- teica tienen lugar en la mayora de los casos mediante control de la velocidad de iniciacin de la transcripcin, aunque a veces la regulacin se produce en el momento de la terminacin de la transcripcin o en los pumos de iniciacin de la traduccin. En la Figura 2.11b se ilustra el mecanismo de la sntesis proteica en los euca- riotas. La transcripcin se produce en el ncleo, y el ARN primario que se trans- cribe se modifica ampliamente en el ncleo antes de que salga al citoplasma para asociarse con los ribosomas. En los eucariotas el control de la sntesis pro- teica puede ejercerse al nivel del procesado del ARN as como en la transcrip- cin o en la traduccin. En los procariotas la regulacin en la etapa de traduc- cin es muy poco importante. 13.nto en los procariotas como en los eucariotas, la estabilidad o vida media del ARNm tambin puede influir en la velocidad de sntesis proteica. Los dis- tintos ARNm tienen estabilidades diferentes, de forma que el efecto en la snte- sis proteica global es complejo. Induccin Algunos enzimas se producen siempre en cantidades substanciales cuando la clula est creciendo, mientras que otros son inducibles, es decir, se forman nicamente en presencia de determinados substratos en el medio. Los genes es- tructurales de los enzimas inducibles son normalmente inactivos u operan a ve- locidades basales>. muy bajas en ausencia de substrato. Cuando el substrato se encuentra presente, el gen estructural se pone en marcha y se produce la trans- cripcin y la traduccin; este proceso se ilustra segn el modelo de Jacob y Mo- nod para la induccin de la l3-galactosidasa del E. co/i (Fig. 2.12). En ausencia de inductor, un gen regulador sintetiza un represor que se une a un gen opera- dor, evitando que la ARN polimerasa se mueva a lo largo del ADN para trans- cribir el gen estructural. Sin embargo, en presencia del inductor, ste se une al represor, arrancndolo del gen operador y permitiendo que tenga lugar la transcripcin. Represin por el carabolito Este fenmeno se produce frecuentemente cuando la clula crece en un me- dio que contiene ms de un substrato utilizable para el crecimiento. En la repre- OIOLOOtA DE LOS MICRO ROANISMOS DE USO INDUSTRIAL o =qI~ ~n,~RNRepresor pollm."" e s ADN En ausencia de Inductor AAN poUmerasa ~ lehl Represor Represor Inactivo Con inductor I ADN '.Transcripcin , AANm 1Traduccin ~ Enzima Flg. 2.12. Representacin de un sistema enzimtico inducible. si6n por el catabolito carbono, se sintetizan enzimas que catabolizan el mejor substrato, usualmente glucosa, y nicmente cuando ste se ha agotado se pro- ducen enzimas que descomponen el substrato ms pobre. La inhibicin de la formacin de 3'-5' -adenosn monofosfato cclico (AMPc) parece ser el factor clave en la represin por el catabolito en el E. coli; esle compuesto es necesario para la sntesis de ARNm. El metabolismo de la glucosa reduce el contenido de AMPc de las clulas unas 1.000 veces. El nivel de AMPc depende de la adenil ciclasa y la AMPc fosfodiesterasa, que sintetizan y degradan el AMPo, respecli- vamente. La adenil ciclasa parece estar inhibida por el transporte de compues- tos de carbono utilizables en la clula. Aunque la represin por la glucosa se produce ampliamente en los hongos, levaduras y Bacillus, los mecanismos re- guladores an no son bien conocidos. . Muchos enzimas, por ejemplo las proleasas, son reprimidos por la presen- cIa de ammocldos o amoniaco ulilizables rpidamente (represin del cataboli- lO nitrgeno). La limitacin de amoniaco en el medio de crecimiento fermenta- tivo desreprime rpidamente la sntesis de estos enzimas. 29. 40 BlafECNOLOOIA DE LA FERMENTA I N Represin feedback Mientras que la sintesis de enzimas catablicos est controlada frecuente- mente por induccin y represin de catabolitos, la biosnlesis de enzimas ana- blicos puede estar regulada por la represin feedback producida pOI el pro- ducto final. la represin feedback se utiliza ampliamente en la naturaleza para controlar la sntesis de aminocidos, purnas, pirimidinas y vitaminas. En el mo- delo clsico de represin feedback (Fig. 2.13) el gen regulador produce una pro- lena apo-represora, que, combinada con un ca-represor (producto final), se une al centro operador y bloquea la transcripcin. En ausencia de producto final, no se produce la represin. tla. 2.13. -L--~~--ARN~~---S--~--_AD_N-- _ POllmerasa. / Apo-represor ~ ~ '--------- ""'I'!""J" Repeeso< Co-represor R ~ -Apo-represor Ca-represor presente ADN pollmerasa S ARN '.Transcripcin ~ Traduccin ARNm Sin ca-represor ~ EnZma Representaci6n de un sistema enzimtico de represin por retroinhibicin, 11101 OC11 11 11' itlS Mil IltlUltOlINISMOS DE USO INDUSTRIAl. 41 MODULI>CION OC LA ACfIVIDAD t NZIMATlCA Muchos enzimas tienen uno O ms centros distintos al cenlro activo, deno minados centros alostricos, que ligan reversiblemenle metabolitos particulares o molculas efectoras, produciendo un cambio en la configuracin del enzima y por tanto aumentando o disminuyendo su actividad. Las actividades de olros enzimas estn reguladas de forma covalente, de tal modo que la formacin o degradacin enzimtica de un enlace covalente en el enzima sirve para activarlo o inactivarlo. Compuestos como el ATP, el ADP, el AMP y los nucletidos de la nicotinamida, que reflejan el nivel de energa disponible de las clulas, mo- dulan tambin la actividad enzimtica y controlan el metabolismo ajustando el balance entre los procesos catablicos y los procesos anablicos que consu- men energa. REGULl>CION DE LAS RUTAS METABOLlCAS RAMIFICADAS Las rutas metablicas biosintticas tienen frecuentemente una secuencia de enzima comn con ramificaciones que conducen a la formacin de ms de un producto final . Los microorganismos han desarrollado mecanismos de retroali- mentacin (feedback), por los cuales la acumulacin del producto final causa un efecto en el primer enzima de la rama que conduce a ese producto. Adems, existen mecanisms en los que el producto final de una ruta ramificada produ- ce la inhibicin feedback parcial del primer enzima de la secuencia comn de forma que el flujo de substrato que pasa a travs de esta secuencia se va re- duciendo proporcionalmente. Este efecto se consigue a nivel biolgico median- te el uso de isoenzimas y mecanismos de regulacin feedback concertados y acumulativos (Fig. 2.14). Estos efectos reguladores pueden ser de dos tipos: inhibicin de la actividad enzimtica"y represin de la sntesis de enzimas. En los casos en los que estn implicados los isoenzimas (mltiples formas de un enzima capaces de catalizar la misma reaccin), la sntesis ojnhibicin de cada forma enzimtica puede estar regulada por un producto fmal distinto. En la regulacin feedback concertada, nicamente est implicado un enzima, aun- que debe haber ms de un producto que inhiba su actividad o reprima su sinte- siso En las regulaciones feedback acumulativas, cada producto fmal produce una inhibicin o represin parcial y son necesarios todos los productos finales para bloquear completamente la actividad o la sntesis. AsImilacin del substrato/secrecin del producto Para el rpido crecimiento celular son necesarios unos mecanismos eficaces de flujo de entrada de substrato y de salida de producto, as como el suministro 30. 42 U1OTECNOLOOlA DE LA FERMENTACION lSOENZIMAS r..--------------~/i E A -::::::OS- C/ ,F_G --l . ~H I , '..--------------- , ~----------- - -------------- - --' CONCERTADO E ------ -- ~ /' " O ' A -1-t> B----+ C/ .F--+ C----~~-~ 'H--------- ----./' : ~ -- ----- - -- - -- - --- - - ---- ----- - - - - - - ---' ACUMULADO r ------- - -- -------- -- [ : O...... , / A ~ . B ----+ C ~F____+ G t "'" ' I ~ ___ ___ ___ ____ __ _ H : L _ __________ ____ __ ___ _____ .J Ag. 2.14_ Mecanismo de regulacin por retroinhibicin de rutas metabijcas ramifi- cadas (reproducido con permiso de Dernaio, 1971). de substrato para su conversin en metabolitos primarios y secundarios y otros productos, y para la excreccin del producto. En los procariotas, el substrato se mueve dentro y fuera de la clula directamente atravesando las membranas asociadas con la envoltura celular. Algunas fermentaciones bacterianas han si- do manipuladas para alterar la membrana celular o la composicin de la pared con objeto de modificar los mecanismos de entrada o facilitar la excreecin (vase Capitulo 9: produccin de cido glutmico). Adems de la membrana plasm- tica externa, los eucariotas tambin tienen un extenso sistema de membranas y orgnulos internos. Algunos materiales son transportados a la clula por en- docitosis, proceso en el que una regin de la membrana plasmtica se invagina formando una vescula que contiene el material proveniente del exterior de la clula. La vescula se funde con otro orgnulo, un lisosoma primario, forman- do un Iisosoma secundario en el que gran parte del material externo es degrada- do y transportado al citoplasma. Los produclos de degradacin se almacenan en veslculas hasta ser expulsados por exocitosis (Fig- 2.15); estas vesculas estn presentes en gran nmero en los pices de las hifas de los hongos. En conse- cuencia, en los eueariotas, muchos de los procesos de transporte de substratos y productos a travs de la membrana se producen entre el protoplasma de la clula y orgnulos, como por ejemplo las vesculas y el reculo endoplsmico. Los solutos son transportados a travs de las membranas sin modificacin (a) por difusin pasiva a favor de un gradiente de concentracin, (b) por difu- 0101..00 1/ DI! LOS MICROORO/NtSMOS DE USO INDUSTRIAl. Lisosoma Membrana plasmtica Ha. 2.15. Proceso de endo y exocitosis en los eucariotas. 41 sin facilitada por un gradiente de concentracin, por medio de un sistema de transporte, que, al igual que los enzimas, presenta cinticas de saturacin, y (e) por transporte activo, que tambin implica un sistema de transporte pero que permite el movimiento del soluto contra un gradiente electroqumico. Los solu- tos tambin pueden modificarse durante la translocacin por enzimas con pro- piedades vectoriales. Las protenas de transporte especficas parecen ser responsables del trans- porte de muchos solutos a travs de las membranas, algunos de los cuales estn ligados a la energa y otros son inducibles. En la biosntesis de algunos produc- tos extracelulares microbianos el enzima biosinttico fmal puede estar asociado a la membrana y funcionando facilita la excrecin. Por ejemplo, se ha implica- do a las translocasas en la extrusin de exopolisacridos de las clulas. SECRECION DE ENZIMAS Los precariotas y eucariotas Gram-posit.ivos tienen una nica membrana plas- mtica en su superficie. Por el contrario, las paredes celulares de las bacterias Grarn-negativas tienen dos membranas separadas mediante un espacio peripls- mico. Los enzimas extraeelulares, sintetizados por las bacterias Gram-positivas, son transportados a travs de la membrana citoplsmica, difundindose por la pared celular y acumulndose en el lquido de cultivo extracelular. Los enzimas 31. 44 DIOTE NOLOOIA DE LA FHRM 'NTAI ION rXI ",celulares o protenas secretoras son sintetizados por los eucariotas en la 'lI[lcrOcie del retculo endoplsmieo y transportados a travs de la membrana ni e,pacio de dicho retculo. Las protefnas eonlenidas en estos espacios vesieu- lures se procesan posteriormente en el aparato de Golgi y en otras vesculas y ,c secretan al medio ambiente externo de la clula por fusin de las vesculas eDil la membrana plasmtica (Fig. 2.16). La glicosilaein de las protenas se pro- / '----1------+---+ Espacio cisternal Exocllosls Vesfculas secretoras Aparato Retlculo de GOIgI endoplsmlco rugoso Flg. 2.16. Ruta de secrecin de proteinas en los eucariotas. duce en el espacio vesicular del retculo endoplsmico yen los cuerpos de Gol- gi. Esta ruta secretora general parece ser similar en los eueariotas superiores y en las levaduras y probablemente se produzca en los hongos filamentosos, aun- que pueden existir variaciones en el proceso. En las bacterias Grarn-negativas muchos enzimas son transportados a travs de la membrana citoplsmica y se localizan en el espacio periplsmico. Las protenas secretadas a travs de las membranas contienen usualmente un pptido amno terminal de extensn, denominado secuencia seal. El ppti- do seal, que sobresale del ribosoma, interacciona con la superficie ms interna de la membrana plasmtica de la bacteria o con el re((culo endoplsmico de los eucariotas, formando un poro o canal. A medida que el polipptido se elon- ga pasa a travs del poro en la membrana, en un proceso conocido como secre- cin co-traduccional, y una peptidasa seal localizada en la parte externa de la membrana elimina el pptido seal, permitiendo a la protena asumir su es- tructura tridimensional normal_ En la Figura 2.17 se muestra un diagrama acer- ca de la hiptesis seal para la secrecin eo-traduccional de la protena. A1gu- OIOtOOlA UI toS MI( KIIUUOANISMOS DE USO INOUSTR IAI 1; =:-0 ~ ,92 R' -_"senal i = ~~a== r del rlbosoma Receptor ~sel'al Centro de accin de la peptidasa senal Flg. 2.17. Representacin de la secrecin cO-lranslacional (reproducido con permiso de Priest, 1984). nas protenas extracelulares son secretadas despus de que han sido sintetizadas en un proceso (que tambin implica un pptido seal) conocido como secrecin post-lraduccional. 32. Captulo 3 Sistemas de fermentacin Procesos continuos y discontinuos Las fermentaciones pueden Llevarse a cabo mediante procesos discontinuos, discontinuos alimentados a intervalos o continuos as como por variaciones de estos procedimientos. Los cultivos discontinuos..pueden considerarse como un sistema cerrado, excepto para la_aireagn., q~co~tiene ~a c;:mad hmirada- de medio, en el que el inoculado pasa a travs de un nmerode fases-;5egn se muestra en la curva tpica de crecimiento discontinuo (vase Fig. 2.6). Mien- tras que en el cultivo discontinuo todo eLsubslralQSe aade al comienzo de la fermentacin, en los procesos discontinuos alimentados el substrato se va aa- diendo a intervalos a lo largo del proceso; esta forma de trabajo elimina los efectos de represin por las fuentes de carbono uWizables rpidamente, reduce la viscosidad del medio y los efectos de los constituyentes txicos, o simplemen- te, hace que la etapa de formacin de producto sea lo ms larga posible. Los sistemas de cultivo discontinuo alimentados a intervalos, o continuos, se utili- zan en la mayora de los procesos de fermentacin industrial y estn particular- mente adaptados a los procesos de fermentacin en los que el producto se for- ma mayoritariamente despus de la fase de crecimiento exponencial. La princi- pal desventaja de las fermentaciones discontinuas cuandQ ~e util~ para la pro- duccin de productos asociados al crecimiento, es que la formacin eficiente de producto tiene lugar nicamente durante una fraccin del ciclo de fermenta- 47 33. 48 Inoculacin BIOTECNOLOGIA DE ~A FERMENTA ION Ciclo de lermentacin FOnT'Ia'cln de producto eficaz I I Proouclo Tiempo Recoleccin del producto Lavado del fermentadO! Formacin de lotes Esterilizacin Inoculacin Formacin de producto eficaz Ag. 3.1. Ciclo de fermentacin discontinuo. cin_(Fig. 3.1). Los sistemas continuos con volmenes de salida de producto 'ele- vados pueden ser, en consecuencia, mucho ms eficaces en determinadas aplica- ciones en trminos de productividad del fermentador (volumen de produccin por unidad de volumen por unidad de tiempo, Kgm - 'h - '). Las fermentacio- nes continuas pueden considerarse como un sistema abierto en que el medio se va aadiendo continuamente al biorreactor y se va eliminando simultnea- mente igual volumen de medio fermentado. Existen dos tipos principales de reac- lores continuos, los reactores de mezcla completa y los de flujo pistn. En un cultivo discontinuo, la concentracin de biomasa por unidad de tiempo (t) es: Donde x XR x- x.= Y(S. -s) concentracin celular en el tiempo t inculo o concentracin celular inicial rendimiento para el substrato limitante (g de biomasa por g de subs- trato consumido) s = concentracin de substrato en el tiempo t SR concentracin inicial del medio Por tanto x - )(R r=-- S.-s SISTEMAS DE FERMENTACION 49 La cantidad de biomasa alcanzada en la fase estacionaria depende lerica- mente de la concentracin inicial del substrato limitan!e del crecimiento y de la eficacia del organismo para convertir el substrato en material celular. Por tanto. suponiendo que el substrato limitante del crecimiento sea S = Oen la fase estacionaria r=-x-XR S. En un reactor continuo de mezcla completa en una sola etapa, la adicin de substrato a una velocidad adecuada combinada con la eliminacin a una ve- locidad volumtrica igual de medio de cultivo del recipiente produce un estado estacionario en el que la formacin de biomasa est en equilibrio con la prdi- da de clulas. En estas condiciones: (a) La velocidad de crecimiento especfico (JL) viene controlada por la ve- locidad de dilucin (D) puesto que JL = D (b) La concentracin de substrato en estado estacionario, T en el quimos- tato viene determinada por la velocidad de dilucin, segn la ecuacin: si las cinticas siguen el modelo de Manad y D < JLma, (e) La concentracin de biomasa en el estado estacionario, )( viene deter- minada por las variables operacionales SR y D, segn la ecuacin: x= r[s.- K,O J_ llm u~-j) Estas ecuaciones se deducen de la Figura 3.2. En la Figura 3.3 se muestra el efecto de la velocidad de dilucin en las con- centraciones de substrato y biomasa en estado estacionario yen la productivi- dad de biomasa. Como se ve, a medida que D se aproxima a JLm",' la concen- tracin residual del substrato timitante necesaria para soportar el aumento de velocidad de crecimiento se eleva, y por tanto la concentracin de substrato tam- bin aumenta (hasta el lmite superior s = SF) mientras que la de biomasa dis- minuye. Cuando se emplea un sistema de cultivo en continuo, por ejemplo en el proceso de fermentacin industrial de produccib de protenas de organis- mos unicelulares, la cantidad de clulas producidas por unidad de tiempo (ve- locidad de produccin) y por unidad de substrato utilizado ('Y) deben ser mxi- mas. En estado estacionario, la velocidad de produccin ser igual al producto de la velocidad de flujo por la concentracin celular. Para que la produccin 34. 50 UlOTECNOLOO IA DE LA FERM ~N IAllON I.u velocidad de dilucin D (h- 1), que representa el flujo del medio en el quimoslalo Imr unidad de volumen de liquido contenido se define como: f) = Fj J' donde V ~ volumen (m') F ~ velocidad de flujo (m' h- 1) 1:.1 cambio neto de biomasa con el tiempo, suponiendo que todas las clulas son viables, puede expresarse como: dx/dl= crecimiento - produccin =ILt- Dx En estado estacionario la concentracin de clulas en el reactor es constante, por tanto: d.{d/ = O x = D. II=D Cuando D :S;. 0,9 .umax' la velocidad de produccin celular en el fermentarlor est exacta- mente equilibrada con la velocidad de produccin celular, y en estado estacionario esta condicin se cumple (x = constante). Por otro lado, cuando el valor de D es similar al de Pomu' la produccin de clulas en el efluente es superior a su velocidad de produc- cin por crecimiento en el fermentador y se produce el colapso, siendo dx/dt negativo 1" est relacionado con la concentracin de substrato (s) medianle la ecuacin de Monod Ilm:uS 1'= - - I,+s Enestado eslacionario, lA. = D. y para el modelo cintico de Manad de crecimiento celular D= J1 mllll T K~ +T donde ses la concentracin de substrato residual en estado estacionario Ilmlu - D como D - J.Lmax' entonces s-SR La concentracin de biomasa en el quimostato en estado estacionario para el caso de una alimentacin estril (XR o X F = O), viene dado por x= reS.- $) por tanto cuando D -- J.L m ,x -- O Lo productividadde biomasa, P' para un proceso de fermentacin continuo en esta- do estacionario viene dada por c: .18. 3.1. Cln~li c8s del cultivo continuo. ~o ~ 0 E o :o ~ u ~ no ~ SIS liMAS t)l' FPRMnNTACION Velocidad de dilucin (O) p' e x ~ J s, Aa 3.3. lnftuencia de la velocidad de dilucin en las concentraciones de biomasa Ix) y substralo (S) en el estado estacionario y productividad de la biomasa (P;J. celular sea mxima, la velocidad de dilucin deber ser alta, aunque no tanto que exceda a I"max o se produzca la prdida de material. La productividad m- xima, oombinando una produccin elevada con una utilizacin de substrato efi- caz, se obtiene a una velocidad de flujo igual a la mxima velocidad de produc cin, o ligeramente inferior, y con la mayor concentracin de substrato posible prcticamente en el flujo de alimentacin. En los procesos de produccin de algunos metabolitos primarios, se pueden adoptar medidas similares para optimizar las condiciones del quimostato. Sin embargo, en el caso de metabolitos secundarios, en el que el producto no va asociado al crecimiento, no se puede utilizar un nico quimostato de mezcla perfecta, sino que deben emplearse quimostatos multietapas para permitir que prevalezcan distintas condiciones medioambientales en las etapas separadas, si las condiciones ptimas paJa el crecimiento y la formacin de producto son di ferentes. los quimostatos que incorporan procesos de reciclado de biomasa oon centrada para incrementar la concentracin de biomasa en el reactor han en- contrado aplicaciones industriales en la produccin de alcohol y en el tratamiento de efluentes. En los reactores de flujo pistn, el cultivo fluye por un reactor tubular sin mezcla en contracorriente. En la entrada del reactor se van aadiendo conti- nuamente las clulas y el medio, por lo que la composicin del medio, la con 35. 52 BIOTECNOLOGIA DE LA FERMENTA ION ~cl1lracin de biomasa y las concentraciones de producto varan con la longitud del rcactor de una forma anloga a los cambios ocurridos a lo largo del tiempo ell 1111 fermentador discontinuo. Usualmente debe incorporarse un sistema de Icriclado de la biomasa para obtener un ineulo continuo en la entrada. Bisco del fermentador La funcin principal de un fermentador es la de proporcionar un medio am- biente controlado que pennita el crecimiento eficaz de las clulas y la forma- cin de prOdUct:-EI fermentador tpico moderno de laboratorio se ha diseado como una unidad sofisticada con las caractersticas y la instrumentacin nece- sarias para llevar a cabo una gran variedad de procesos de fermentacin. A la hora de discutir acerca de los fermentadores poto, debera recordarse que los fermentadores a escala duroduccin industriilsOsualmente unidades cons- truidas a medida teniendo en cuenta los costos y objetivos esped lCOS, y disea- das parali"proceso oUa serie de procesos relaciOados, y en consecuencia, nicamente tienen las caractersticas e instrumentacI n especl- icados para un proceso de produccin particular. --- CONDICIONES PARA OPERAR EN MEDIO ASEPTICO Muchos biorreactores tienen que trabajar en condiciones aspticas utilizan- do un inculo puro del microorganismo y excluyendo los organismos contami- nantes; por consiguiente, el biorreactor, al igual que la red de tuberias asocia- das, ha sido diseado como un recipiente a presin de tal forma que tanto el ,istema como el medio que contenga puedan esterilizarse a la temperatura/ pre- sin adecuadas, un minimo de 121 C/ 15 psi durante 15-30 minutos. Las vlvu- las utilizadas en las secciones esterilizables deben ser utilizadas en condiciones aspticas. Las vlvulas de estrangulamiento y las de diafragma son particular- mente adecuadas, puesto que su mecanismo de operacin est separado del me- dio Ifquido o gaseoso por un tubo O un diafragma flexible. Los puntos de entra- da al recipiente yel proceso para aadir y eliminar gases o lquidos al/del reac- lor durante la fermentacin tambin deben estar diseilados de forma que man- tengan las condiciones aspticas (Thbla 3.1). En la Figura 3.4 se ilustra una vl- vula de muestreo asptica. No todos los procesos de fermentacin necesitan condiciones totalmente es- triles; en algunos se reduce simplemente su contaminacin por pasterizacin, mientras que otros dependen realmente de la poblacin microbiana natural, por SISI [MAS DE I'[RMENMCION Tabla 3_1. Diseno del fermelllador y operaciones relacionada, con el ",",1Ie nimiento de su eSlerilidad Componente o proceso FundamenlO 1. Recipiente 2. Entrada y salida al fermentador 3. Tuberfas 4. Vlvulas 5. Prensaestopas y cojinetes del agitador Diseftado para ser esterilizado con vapor a presin, resis~ tente a la corrosin qumica y con materiales no txicos para el organismo Esterilizables con vapor de agua Sin bolsillos o espacios muer- tos, inclinadas hacia el punto de drenaje Adecuadas para operar asp- ticamente. Los materiales de construccin deben ser ca- paces de tolerar las condi- ciones de temperatura y presin del proceso y ser resistentes a los componen- tes qumicos utilizados Sellados para trabajar en condiciones aspticas prolongadas Ejemplos o comentarios (a) Vidrio de un espesor apTO piado para fermentadores pequeftos y mirillas (b) Acero inoxidable resis- tente al pH del proceso las ....lvu1as varan en su grado de idoneidad. Las vlvulas de compresin y las de diafrag- ma son especialmente aptas para uso asptiro. pueSlo que su mecanismo est separado mediante un lubo flexible y 1.Ul diafragma, respectivamen- te, del caldo o del gas que fluye (a) Capas de asbesto o de hi- los de algodn empaque- tados contra el eje (b) Cierres: forros de metal, las condiciones aspticas se mantienen por contacto superficial uniforme de precisin entre un forro de cierre giratorio y el estacio- nario del eje del agitador. En los cierres mecnicos, el componente estacionario y el giratorio se mantienen juntos mediante resortes o fuelles que se expanden (e) Dispcsitivos de agitacin magnticos que no pene- tran en d recipiente. Un eje externo hace giw al eje de un agitador interno me- diante una fuerza magntica 36. 54 B10TECNOLOOlA DE LA FERMENTACION 'TilMa 3,1. Continuacin Componente o proceso Fundamento (,. Entrada de gas 7. Salida de gas 8. Alimentacin de aditivos 9. Alimentacin, inculo y lneas de muestreo Filtro de aire para esterilizar el aire que entra. EsteriLizable con vapor de agua. Vlvula de no retomo situada entre el difusor y el fUtro de aire para evitar el flujo en conLraCo Triente del medio a1 filtro Diseado de forma que no se produzca la contaminacin por flujo en contracorriente Alimentacin esterilizada por calentamiento o filtracin Esterilizables con vapor de agua antes y despus de su uso Ejemplos o comen/arios (a) Lana de vidrio, fibra de vi drio u otro material empa- quetado que atrapa fisi- camente las particulas (b) Filtro de membrana plega da fabricado con ster de celulosa, niln polisulfona u otros materiales El nitro de salida puede utili- zarse cuando no se desee la liberacin de organismos del cultivo al medio ambiente Acido, lcali (liquido o gaseoso), carbohidrato, .... precursor Secuencia de muestreo (vase Fig. 3.4): (a) apertura de las vlvulas 2 y 3 para esterili- lar la tuberfa, (b) cierre de la vlvula 3, (e) apertura de la vlvula 4 para enfriar la tuber!a estril caliente antes de introducir la muestra, (d) cierre de la vlvula 4, aper- tura de la vlvula 1, (e) desechar el cultivo del es- pacio muerto, (O recoger la muestra, (g) cierre de la vl- vula 1, (h) repetir (a) y (b) lo que el diseo del reactor y del equipo necesarios para cada proceso deben simplificarse de acuerdo con esto. AIAEACION y MEZCLADO El proceso de fermentacin industrial aerobio debe disponer de un sistema de aireacin y mezclado del cultivo. El reactor de tipo tanque con agitacin con- vencional incluye un sistema de agitacin mecnico consistente en un eje verti- cal con varios agitadores, en tanto que la mayora de los biorreactores de platos SISTEMAS DE FERMENTACION Vapor de agua 3 f-.....o-'-_.,. 4 2 ~Muestra 55 Fig. 3.4. Puerta de muestreo asptico. Los nmeros 1, 2 Y 3 corresponden a vlvulas. (Rushton) estn equipados con turbinas de discos localizadas a lo largo del eje y con dimensiones controladas para conseguir un buen mezclado y una buena dispersin a...travs del medio. Adems disponen de varios deflectores (usual- mente entre 4 y 6) cuya anchura representa el LO "', del dimetro del recipiente, localizados a lo largo del permetro del reactor con objeto de incrementar la turbulencia. El aire estril se introduce por la base del tanque, normalmente por un anillo pulverizador, y es dispersado eficazmente a travs del medio por la accin del sistema de agitacin. En la Figura 3.5 se esquematizan los compo- nentes del sistema de agitacin. La geometria de los fermentadores aireados debe disearse de forma que se facilite la eficacia del intercambio gaseoso. Las caractersticas finales deben tener en cuenta los fenmenos de transporte que existen en los procesos biolgicos. Flujo de fluidos Los fluidos se denominan newtonianos cuando su flujo obedece a la ley de viscosidad de Newton. Supongamos que un fluido est contenido entre dos pla- cas paralelas de seccin A separadas una distancia X; si una placa se mueve en una direccin a una velocidad constante, la capa de lquido adyacente a la placa que est en movimiento tambin se mover en esa direccin impartiendo parte de su momento a la capa ms prxima, haciendo que se mueva a una velocidad ligeramente inferior. La ley de Newton de la viscosidad establece que la fuerza 37. S6 D1OTECNOLOGIA DE LA FERMEN IA( ()N Relaciones geoml!lcas lIp1cas Dellector H V 02.5 - 3.0 f -- O 1D . w AI ~ 0.25 - 0.33H i- D I L Agitador de turbina de disco I ~ ET~- h 025 Y I 4 I+-l T d .d aw Wy 0.75 - D. 5 1---d----+l Z Entrada de aire .(fI .l!ri.,t'U' ,'("l,lllml'(!' kallam)"Cfll(U.1 /'''/1 /11111 )'(1'1 nlt'(/l f - -- - Produclo Reologlo del cultivo Hidroxilaci6n de esteroides Glucoamilasa Penicilina Estreptomicina Kanamicina Novobiocina Binghnm PscudoplSlico PseudoplSlico Bingham Bingham Bingham La velocidad de transferencia de masa entre las fases lquida y gaseosa est fuertemente influenciada por la solubilidad del gas en la fase Uquida. El oxge- no es poco soluble en soluciones acuosas, y en consecuencia, en muchos proce- sos de fermentacin aerobios el suministro de oxgeno es el factor crucial deter- minante de las velocidades metablicas por la que la transferencia de masa del oxigeno tiene un papel importante en el diseo del fermentador. Transferencia de oxrgeno La transferencia de oxgeno a la clula durante la aireacin del fermentador implica la transferencia de oxgeno desde las burbujas de aire a la solucin, la transferencia de oxgeno a travs del medio a la clula y finalmente la absorcin Jel oxgeno por la clula. La transferencia de oxigeno a partir de las burbujas de aire a la solucin, que es la etapa limitante de la velocidad en las fermenta- ciones en medios no viscosos, y que es incluso an ms limitante en las fermen- taciones en cultivos viscosos, puede ser descrita por la ecuacin: deL _ , - = ALII(C* - eLI di ' donde CL es la concentracin de oxgeno disuelto en el seno del lquido (mmol dm -') I es el tiempo (h) dCl/dl es el cambio de la concentracin de oxgeno con el tiempo (mmo les dm - 'h - 1) o la velocidad de transferencia de oxgeno (arR) Kl es el coeficiente de transferencia de masa (cm h -1) aes la superficie interfacial gas-lquido por volumen de lquido (cm' cm - ') C* es la concentracin de oxgeno disuelto en saturacin (mmol dm - '). A I atm y 30 oC la solubilidad del oxgeno en agua es de 1,16 mmoles dm -'. Kla, coeficiente de transferencia de masa volumtrica (h - 1), es una medio 'ilS II 'MAS 111 ' I ~RMCNTA ION da de la cUllndd"d de Hileacin del fermentador en las condiciones de la prueba (a mayor valor de K,u, mayor es la capacidad de aireacin). La concentracin de oxigeno disuelto en el medio del fermentador ser el balance entre el sumi nistro de oxigeno disuelto y la demanda por parte de los organismos. uando en el fermentador Kla es demasiado baja para satisfacer la demanda de oxge no de los organismos, las concentraciones de oxgeno disuelto caern por deba- jo del nivel crtico (C"it), usualmente inferior a 0,05 mmol dm - '. Por tanto, el Kla del fermentador deber ser suficientemente grande como para mante- ner la concentracin de oxigeno disuelto ptima para la formacin del produc- to. Entre los factores que influyen en el valor de Kla alcanzado en un fermen- tador de una geometra dada se incluyen la velocidad de flujo de aire, la veloci- dad de agitacin, (por ejemplo la velocidad de rotacin de los agitadores), las propiedades fsico-qumicas y reolgicas del cultivo y la presencia de agentes antiespumantes. Cuando una fermentacin se aumenta de escala es importante que en la escala mayor se utilice el valor ptimo de KLa encontrado a escala ms baja. Por consiguiente, tanto KLa como el conocimiento de los factores que influyen en su valor son importantes a la hora de disear y aumentar de escala un proceso de fermentacin. En particular, en las fermentaciones de fluidos no newtonianos la estrategia de aumento de escala intenta mantener constantes la velocidad punta y el valor de KlQ variando en el tanque ms grande el dime- tro de los agitadores frente al dimetro del recipiente. Transferencf'a de energra Para que el crecimiento, metabolismo y transferencia de masa se produzcan a las velocidades deseadas, debe suministrarse o eliminarse energa del reactor. Durante la esterilizacin y durante los procesos de control de la temperatura se intercambia calor. En el metabolismo se produce energa metablica que se d.isipa en fo:~a de calor, y tiende a elevar la temperatura del caldoje fermenta- c,n. Thmb.en se puede generar calor como resultado de la energa mecnica necesaria para los procesos de agitacin y de aireacin. Cuando los biorreacto- res funcionan a temperaturas superiores a la ambiente, se necesita una fuente de calor para mantener la temperatura. Las exigencias netas de calentamiento o enfriamiento externo del fermentador se determinarn realizando un balance entre los procesos que generen y consuman calor siendo necesario usualmente utilizar cambiadores de calor. En los fermentadores la transferencia de calor se produce mediante circulacin de agua a travs de una camisa por el exterior del recipiente o mediante serpentines situados dentro de los reactores. Las fer- mentaciones aerobias son usualmente exotrmicas durante las fases de crecimiento y metabolismo activos y exigen refrigeracin para controlar la temperatura. 39. 60 BIOTECNOLOGIA DE LA FERMENTACION Ih/('II 10- ' para las turbinas Rushton) '1 dimetro del agitador (cm) velocidad de rotacin del agitador (cm s - ') densidad del lquido (g cm - ') viscosidad del nuido Cuando se agita un liquido newtoniano no gasificado en un recipiente pro- visto de deflectores, la entrada de potencia al lquido (la potencia absorbida por el lquido) puede representarse por otro nmero adimensional, el nmero de po- tencia (Np)' P v-- -P- {J.' ' D' donde P es la potencia externa del agitador (no gasificado) En un fermentador agitado equipado con defectores, el nmero de potencia est relacionado con el nmero de Reynolds mediante la ecuacin: donde e es una conSlante dependiente de la geomtria de la vasija e indepen- diente de su tamao y z es un exponente. Por tanto _ P_ =C[(D 2 .I'Pl'] pN' D' '1 de forma que los valores de P a distintos valores de N, D, ~ Yp pueden determi- narse experimentalmente. Las potencias tpicas para fermentadores de 100,2.500 Y50.000 1de capaci- dad son de 1-2, 15 Y 100 Kw respectivamenle. OTROS DISEOS DE FERMENTADORES Sistemas de cultivo sumergidos En la produccin de vinagre se ulili.a especialmente un reactor tanque con agitacin aireado modificado, el Frings acetaton>. En este aparato el aire es SISTEMAS DE FERMENTACION (,1 aspirado y distribuido mediante un rotor de turbina de cuerpo hueco de nllo velocidad, conectado a una tubera de succin de aire. El aireador es aUloa,pi- rante y por tanto no se necesita aire comprimido (vase Fig. 7.8). El reactor de tipo tanque con agitacin es el biorreaclor ms utilizado en las fermentaciones aireadas debido a su fiabilidad y flexibilidad. No obstante, los costes de mantenimiento e inversin son relativamente elevados, y adems se plantean problemas a la hora de disear agitadores pala los fermentadores muy grandes debido a la longitud del eje del agitador. En los biorreactores sin agitacin mecnica, como los biorreactores tipo torre y los de bucle, la airea- cin y el mezclado se llevan a cabo utilizando caudales de gas elevados. En los fermentadores tipo torre (Fig. 3.7) el aire se introduce por la base del aparato y el mezclado se produce por las burbujas ascendentes, de forma que la fuerza de cizalla que sufren los organismos es mnima. Este tipo de fer- menladores se ha utilizado para producir cido ctrico, con grnulos de A. ni- Tubo de clarlflcacin Indicador de temperatura Salida de aire ~J"_ Salida de liquido Dellector Entrada de aire .. . Punto de mueSl reo Ha. 3.7. Fermentador lipo torre (reproducido con permiso de Kristiansen y Chamber- lain, 1983). 40. (,2 ulen E(;NOIOOIi DE 1i H 'HMI N 111< IoN Uf" Y~cpa> de Candida guilliermortdii, y tambin para la Ilrouucch1I ue vlna- ~IC, Illcohol industrial y cerveza. Como el mezclado vertical"" rclullvamcnte 111010 en los fermemadores de tipo torre, se puede operar de forma continua, con alimentacin por la parte baja y salida por la parte alta, consiguindose as! una retencin de biomasa elevada. En los fermentadores tipo torre no airea- dos, utilizados en la produccin de cerveza O de alcohol industrial, la retencin de biomasa es mxima cuando se emplean levaduras de fermentacin con bue- nas propiedades floculantes. El biorreactor de bucle impulsado por aire contiene un tubo interno o exter- no, a veces con deflectores, que incrementa el mezclado al forzar un flujo direc- cional en el seno del lquido (Fig. 3.8). La fuerza impulsora de la circulacin se crea por la diferencia de densidad (debida a diferencias en la cantidad de bur- bujas de aire dispersadas) entre las secciones de !lujo ascendente y descendente. En el reactor de este tipo diseado por ICI, por ejemplo, el aire se introduce por la base del fermentador y pasa a la solucin por la presin hidrosttica de la columna (vase Figs. 6.1a y 6.1e). En el captulo 6 podr verse que se han utilizado con xito diseos similares para la produccin de biomasa a partir de organismos unicelulares. En el cultivo de caldos micelianos filamentosos visco- sos para la produccin de protenas de organismos urucelulares se han desarro- llado sistemas de agitacin y tubo de recirculacin combinados (vase Fig. 6.1f). Alc. t Aire lal :;;; o '.o o o o' o Aire Ibl Jile. 3.8. Biorreactor con bucle interno (a) y externo (b) (reproducido con permiso de Smith, 1985). 'I1~11 Mil 111 1I HMI N1lit ION 111 En las fcrmcnlnckll1cs IlIdu,ltlub mn ,lulas de animales y plantas, I1lt!. MIS cepliblcs a ,ufrir donos lUI as IUCI L.1> de cizalla que las clula!> microbinllus, se han aprovcchado IU$ vcntaJas del menor efecto de cizalla de los fermentadt) res agitados por airc. En los sistemas de tratamiento de aguas residuales con lodos activados be han utilizado algunas variaciones de eslOS tipos de reactores de cultivo sumeri do. El proceso convencional se basa en la agitacin vigorosa con aire u oxige- no inyectado por difusores de burbujas, paletas, agitadores, etc. (Fig. 3.9). Tam- bin se han desarrollado sistemas de cultivo sumergido basados en los funda- mentos del fermentador de bucle impulsado por aire (Fig. 3.10). Los recientes y dramticos progresos en el cultivo de clulas de animales y en la tecnologa de hibridomas han conducido al desarrollo de nuevos proceso> de cultivo industriales para la elaboracin de productos derivados de clulas ani- males. La forma ms simple de crecimiento de clulas de mamferos es en culti vos en suspensin. La mayora de las clulas de origen leucmico u Iinfoideo crecen como clulas individuales en cultivos en suspensin estacionarios o agi- tados. Muchas clulas dependientes de anclaje pueden no crecer en cultivos en suspensin, a menos que se empleen procedimientos especiales. El mtodo ms prometedor en tales casos utiliza perlas microtransportadoras, fabricadas con polfmeros naturales o sintticos, como soportes de las clulas. Entre los proble- mas asociados con la produccin a gran escala de clulas animales en cultivos en suspensin se incluyen las densidades celulares limitadas conseguibles en los sistemas de cultivo convencionales y la sensibilidad de las clulas a las fuerzas de cizallas. Se han utilizado fermentadores agitados suavemente de forma me- cnica o por aire, as como reactores de tipos ms modernos. La encapsulacin, Q, ". ..Incorporacin " '.r .'de arre "!,~ .. .~: '. ';' :.... t } ,:,., ,.; :', ;',:...:. .:,! ;" w ,. '.. , ". :.J,', ~. "." ...... ...:.'.;.:~J: ?_r-----------------------~ ~.- . Ha. 3.9. Biorreactor de lodos activos (reproducido con permiso de Smith, 1985). 41. 1I1C)t heNOLO olA DI> LA i'l' RMI 'N IAI 'ION Airo ~ - nec!. ImJu Ju loUutl - """'>t--:--I I 'e==-- '- Y;:;:- Salid. ;., f'--- Aire inicial t I l ', ._____ II(IC l( l(loe ~ /Aire procesado ,,, I I F Descendente Ascendente .:- Revestimiento del reaClor Fig. 3.10" Planta de traramiento de efluentes del tipo de pozo profundo. (Reproducido eOIl permISO de Wheatley, 1984). de clulas de hibridoma en perlas de alginato permite emplear reactores de tipo tanque con agitacin, producindose concentraciones elevadas de clulas yan- tlc~erpos d~ntro de la cpsula. Otro mtodo implica el uso de sistemas de per- fUSin, eqUIpados can tubos porosos y membranas semip