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3 6 . COUPLED OXIDATION OF ASCORBIC ACIDAND HAEMOGLOBIN5 . STUDIES ON THE FORMATION OF BILE PIGMENTSFROM CHOLEGLOBIN AND VERDOHAEMOCHROMOGENAND ON THEIR ISOLATION FROM ERYTHROCYTES1

BY R. LEMBERG, W. H . LOCKWOOD AND J . W. L EG G EFrom t h e I n 8 t i t u t e o f M e d i c a l R e 8 e a r c h , R o y a l N o r t h S h o r e H o 8 p i t a l , S y d n e y

R e c e i v e d 3 M a r c h - 1 9 4 1 )I N a p r e l i m i n a r y p a p e r [ L e m b e r g , L e g g e & L o c k w o o d , 1 9 3 8 ] we h a v e a l r e a d yr e p o r t e d t h e i s Q l a t i o n o f b i l i v e r d i n d e h y d r o b i l i r u b i n ) a n d o f b i l i v i o l i n f r o m .c h o l e g l o b i n s o l u t i o n s . U n d e r r e m a r k a b l y m i l d c o n d i t i o n s h a e m o g l o b i n i s t h u st r a n s f o r m e d . i n t o b i l e p i g m e n t s ; t h e s e c o n d i t i o n s a r e s u c h a s a r e f o u n d i n t h ec e l l s o f o r g a n s f o r m i n g b i l e p i g m e n t , e x c e p t t h a t a c i d was u s e d f o r t h e r e m o v a lo f t h e i r o n . I t w i l l b e s h o w n i n t h e p r e s e n t p a p e r t h a t t h e b r e a k d o w n o f c h o l e -g l o b i n t o b i l e p i g m e n t s w i t h t h e r e m o v a l o f i r o n p r o b a b l y o c c u r s i n t h e l a t e rs t a g e s o f t h e r e a c t i o n w i t h a s c o r b i c a c i d a t a p h y s i o l o g i c a l p H .W e d e s c r i b e h e r e i n g r e a t e r d e t a i l t h e b i l e p i g m e n t s o b t a i n e d b y a c i d s p l i t t i n gf r o m c h o l e g l o b i n a n d v e r d o h a e m o c h r o m o g e n . T h e h o p e o f g a i n i n g i n f o r m a t i o no n t h e c o n s t i t u t i o n a l d i f f e r e n c e s b e t w e e n c h o l e h a e m a n d v e r d o h a e m b y t h es t u d y o f t h e s p l i t t i n g p r o d u c t s w a s n o t f u l f i l l e d o w i n g t o s e c o n d a r y r e a c t i q n sb y w h i c h t h e p r i m a r y s p l i t t i n g p r o d u c t s a r e a l t e r e d a n d o w i n g t o t h e c o m -p l i c a t e d n a t u r e o f t h e m i x t u r e s o f b i l e p i g m e n t s t h u s f o r m e d .G r e a t d i f f i c u l t i e s h a d , t h e r e f o r e , t o b e o v e r c o m e i n w o r k i n g o u t q u a n t i t a t i v em e t h o d s e n a b l i n g u s t o e s t i m a t e t h e y i e l d o f b i l e p i g m e n t f r o m t h e b i l e p i g m e n t -h a e m a t i n c o m p o u n d s . T h i s w a s , h o w e v e r , a c h i e v e d a n d we c a n now c o r r e l a t et h e y i e l d o f b i l e p i g m e n t s o b t a i n e d f r o m c h o l e g l o b i n s o l u t i o n s b y s p l i t t i n g w i t h 'a c i d s w i t h t h e c h o l e g l o b i n c o n c e n t r a t i o n o f t h e s e s o l u t i o n s .I n t h e a b o v e - m e n t i o n e d p r e l i m i n a r y p u b l i c a t i o n w e h a d a l s o r e p o r t e d t h ei s o l a t i o n o f b i l e p i g m e n t s f r o m e r y t h r o c y t e s . I n t h e p r e s e n t p a p e r we d e s c r i b et h e s e e x p e r i m e n t s i n g r e a t e r d e t a i l .

E X P E R I M E N T A LP r e p a r a t i o n o f b i l i v e r d i n a n d b i l i v i o l i n 8 2 f r o m h a e m o g l o b i n b yc o u p l e d o x i d a t i o n w i t h a s c o r b i c a c i d

I n e a c h o f 1 2 f l a t - b o t t o m e d c u l t u r e f l a s k s 5 O m l . o f a 1 - 5 % s o l u t i o n o fc r y s t a l l i n e h o r s e o x y h a e m o g l o b i n , b u f f e r e d t o pH 8 - 5 w i t h h y d r o g e n p h o s p h a t e ,1 T h i s w o t k w a s c a r r i e d o u t u n d e r a g r a n t f r o m t h e N a t i o n a l H e a l t h a n d M e d i c a l R e s e a r c h

C o u n c i l o f A u s t r a l i a .s A c c o r d i n g t o S i e d e l ( A n g e w . C h e m i e , 5 2 , 3 8 [ 1 9 3 9 ] ) o u r c o m p o u n d s w o u l d b e b i l i p u r p u r i n s ,n o t b i l i v i o l i n s . S i e d e l r e s t r i c t s t h e name b i l i v i o l i n s t o a v e r y s i m i l a r c l a s s o f s u b s t a n c e s , p r o -b a b l y i s o m e r i c w i t h b i l i r u b i n s , o n e o f w h i c h e . g . i s f o r m e d b y t h e o x i d a t i o n o f m e s o b i l i n o g e n b yf e r r i c c h l o r i d e ; f o r t h e p i g m e n t s o f a n o x i d a t i o n s t a g e h i g h e r t h a n t h e b i l i v e r d i n s h e u s e s t h e t e r m b i l i p u r p u r i n s . T h e e x t r a o r d i n a r y s i m i l a r i t y o f t h e p r o p e r t i e s o f b i l i v i o l i n s a n d b i l i p u r p u r i n s ,a n d t h e f a c t t h a t t h e l a t t e r c o m p r i s e a g a i n s e v e r a l p i g m e n t c l a s s e s , m a k e s i t a p p e a r m o r e p r a c t i c a lt o m a i n t a i n t h e g e n e r i c name b i l i v i o l i n s , f o r a l l t h e s e p i g m e n t s , a n d t o d i s t i n g u i s h t h e m b y f i g u r e sa n d l e t t e r s , U n t i l m o r e i s known a b o u t t h e i r c h e m i c a l c o n s t i t u t i o n . T h e t e r m a l s o t a l l i e s b e t t e rw i t h t h e a c t u a l c o l o u r o f t h e p i g m e n t s .

B i o c h e m . 1 9 4 1 , 3 5 3 6 3 ) 2 4

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FORMATION OF BILE PIGMENTS 3 6 5T a b l e 2 . C h l o r o f o r m - H O l 1 & t t o f g i l i v i o l i n l I b

T e m p e r a t u r e 1 % 5 . 10 H 1 0 10 0 N e u t r a l P a r t l y a c i d A c i d2 0 0 N e u t r a l A c i d A c i a6 0 0 A c i d A c i d A c i dA s e c o n d b i l i v i o l i n was i s o l a t e d i n s m a l l e r y i e l d f r o m t h e m o t h e r l i q u o r o fb i l i v e r d i n h y d r o c h l o r i d e . I t s h o w e d a d i f f e r e n t b e h a v i o u r i n t h e c h l o r o f o r m - H C lt e s t T a b l e 2 ) . We s h a l l c a l l i t b i l i v i o l i n I I b , T h e b i l i v i o l i n s c a n e i t h e r b e d e r i v e dd i r e c t l y f r o m c h o l e g l o b i n , o r t h e y m a y b e p r o d u c t s o f a e c o n d a r y o x i d a t i o n o fb i l i v e r d i n . I f a b o u t 2 0 0 , u g . b i l i v e r d i n a r e d i s s o l v e d i n d i l u t e ammonia a n da d d e d - t o a 0 - 7 o x y h a e m o g l o b i n s o l u t i o n a n d t h i s m i x t u r e i s t r e a t e d w i t hg l a c i a l a c e t i c a c i d , t h e b i l i v e r d i n i s t r a n s f o r m e d i n t o b i l i v i o l i n , w h i c h . a c c o r d i n gt o i t s p r o p e r t i e s i s b i l i v i o J i n l I b . T h e same b i l i v i o l i n h a d b e e n p r e v i o u s l yo b t a i n e d b y o x i d i z i n g t h e c o m p l e x z i n c s a l t o f b i l i v e r d i n w i t h t w o a t o m s o fi o d i n e p e r . m o l . a n d b y e x p o s i n g t h e u n s t a b l e b i l i v o l i n I I a , s e t f r e e f r o m , i t sz i n c s a l t , t o a t m o s p h e r i c 0 2 [ L e m b e r g & L o c k w o o d , 1 9 3 8 , a n d u n p u b l i s h e de x p e r i m e n t s ] . I t i s t h e r e f o r e l i k e l y t h a t t h i s b i l i v o l i n a r i s e s b y s e c o n d a r yo x i d a t i o n o f b i l i v e r d i n d u r i n g t h e c h o l e g l o b i n s p l i t t i n g w i t h a c i d s .T h e c h o l e g l o b i n s o l u t i o n s c o n t a i n a s c o r b i c a c i d , a n d i f a s c o r b i c a c i d i n t h es a m e c o n c e n t r a t i o n 5 0 m g . p e r 1 0 0 m l . ) i s a d d e d t o t h e m i x t u r e o f b i l i v e r d i n a n do x y h a e m o g l o b i n , t h e r e i s p r a c t i c a l l y n o o x i d a t i o n o f b i l i v e r d i n t o b i l i v i o l i n .Even i n t h e p r e s e n c e o f e x c e s s o f a s c o r b i c a c i d o r o f C O , b i l i v i o l i n I I I a w a s a l w a y sf o u n d t o a c c o m p a n y b i l i v e r d i n i n t h e s p l i t t i n g p r o d u c t s o f c h o l e g l o b i n . A s c o r b i ca c i d p r o t e c t s b i l i v e r d i n f r o m o x i d a t i o n d u r i n g t h e a c t i o n o f a c i d o n o x y h a e -m o g l o b i n ( c f . T a b l e 6 ) , b u t d o e s n o t r e d u c e b i l i v i o l i n s t o b i l i v e r d i n . T h e s e e x p e r i -m e n t s make i t l i k e l y - t h a t t h e b i l i v i o l i n I I I a i s a g e n u i n e s p l i t t i n g p r o d u c t o fc h o l e g l o b i n . I t w i l l b e s h o w n b e l o w t h a t v e r d o h a e m o c h r o m o g 6 n y i e l d s a l s o

b i l i v i o l i n b e s i d e s b i l i v e r d i n i n t h e p r e s e n c e o f a s c o r b i c a c i d , a n d t h a t t h e p r i m a r ys p l i t - p r o d u c t o f v e r d o h a e m o c h r o m o g e n i s a p p a r e n t l y o x i d i z e d b y f e r r i c i r o n t ob i l i v i o l i n . T h i s b i l i v i o l i n , h o w e v e r , i s b i l i v i o l i n I I b , t h e s a m e t h a t a r i s e s b yo x i d a t i o n o f b i l i v e r d i n , w h i l e t h e b i l i v i o l i n I I I a f r o m c h o l e g l o b i n i s - d i f f e r e n t .T h e s a m e s p l i t p r o d u c t s w e r e o b t a i n e d f r o m c h o l e g l o b i n i f t h e m e t h o d o fs p l i t t i n g w a s v a r i e d , e . g . i f a n a c e t i c a c i d - e t h y l a c e t a t e m i x t u r e 1 : 2 ) w a s u s e d ,o r a c e t i c a c i d c o n t a i n i n g H C l o r i f t h e s p l i t t i n g was c a r r i e d o u t a t 1 0 0 . W i t ha c e t i c a c i d a n d h y d r a z i n e h y d r a t e o r w i t h f e r r o u s a c e t a t e i n a c e t i c a c i d - H C l ,h o w e v e r , o n l y b i l i v e r d i n w a s i s o l a t e d . I n t h e s e r e a c t i o n s n o t r a c e o f t h e h y d r o x y -p o r p h y r i n d e s c r i b e d b e l o w was o b s e r v e d .S p l i t p r o d u c t 8 o f g r e e n p i g m e n t '

C h o l e h a e m o c h r o m o g e n o b t a i n e d f r o m c h o l e g l o b i n b y a l k a l i d e n a t u r a t i o n g a v et h e s a m e s p l i t p r o d u c t s a s c h o l e g l o b i n . T h e g r e e n p i g m e n t , h o w e v e r , w h i c hp r e c i p i t a t e d . i n t h e f u r t h e r c o u r s e o f t h e c o u p l e d o x i d a t i o n o f h a e m o g l o b i n a n da s c o r b i c a c i d b e h a v e d s o m e w h a t d i f f e r e n t l y i n s p i t e o f t h e i d e n t i t y o f i t sa b s o r p t i o n p r o p e r t i e s w i t h t h o s e o f t h e f i r s t m e n t i o n e d c h o l e h a e m o c h r o m o g e n .T h e y i e l d o f e t h e r - s o l u b l e s p l i t p r o d u c t s was v e r y s m a l l , t h e m a j o r p a r t o f t h ep i g m e n t r e m a i n i n g i n t h e d e n a t u r e d p r o t e i n w h i c h p r e c i p i t a t e d i n t h e a q u e o u sp h a s e o n a d d i t i o n o f s o d i u m a c e t a t e s o l u t i o n . N o t o n l y t h e b i l e p i g m e n t s , b u ta l s o t h e h a e m i n f r o m t h e a d m i x e d p r o t o h a e m o c h r o m o g e n w e r e t h u s l a r g e l y l o s t .T h e k i n d o f l i n k a g e o f t h e p r o s t h e t i c g r o u p s w i t h t h e p r o t e i n i n t h e g r e e n p i g -m e n t ' i s e v i d e n t l y q u i t e d i f f e r e n t f r o m t h a t i n t h e n a t i v e a n d i n t h e a l k a l i -d e n a t u r e d c h r o m o p r o t e i n s . T h i s i s t h e r e a s o n why e a r l i e r o b s e r v e r s f a i l e d t o24-2

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3 6 6 R . LEMBERG, W . H . L OCKWOOD AND J . W . LEGGEi s o l a t e b i l e p i g m e n t s . T h e g r e e n , a m y l a l c o h o l - s o l u b l e p i g m e n t s , o b t a i n e d b yt r e a t i n g g r e e n p i g m e n t ' w i t h h o t m i n e r a l a c i d s [ E d l b a c h e r & v . S e g e s s e r , 1 9 3 7 ]a r e s t i l l c o m p o u n d s o f p e p t i d e n a t u r e , r e s u l t i n g f r o m p a r t i a l d e c o m p o s i t i o n o ft h e f i r m l y a t t a c h e d p r o t e i n g r o u p s . W h i l e t h e i r p o s i t i v e z i n c a c e t a t e - i o d i n er e a c t i o n r e d f l u Q r e s c e n c e a n d a b s o r p t i o n b a n d a t 6 3 6 m,) p r o v e s t h e i r c l o s er e l a t i o n s h i p t o b i l i v e r d i n , t h e i r s o l u b i l i t y p r o p e r t i e s r e v e a l t h e p r e s e n c e o f l a r g eh y d r o p h i l i c g r o u p s . T h e y a r e i n s o l u b l e i n e t h e r a n d a b s o l u t e a l c o h o l , b u t e a s i l ys o l u b l e i n w a t e r .N e v e r t h e l e s s s m a l l a m o u n t s o f e t h e r - s o l u b l e b i l e p i g m e n t s w e r e o b t a i n e d b ys p l i t t i n g g r e e n p i g m e n t w i t h 6 6 % a c e t i c a c i d and t h e s e w e r e t h e s a m e a s t h o s ei s o l a t e d f r o m c h o l e g l o b i n . A s l i g h t l y l a r g e r y i e l d o f b i l i v e r d i n was o b t a i n e d ,when g r e e n p i g m e n t ' wa s d i s s o l v e d i n 1 % a s c o r b i c a c i d n o r e d u c t i o n o c c u r s ,t h e a b s o r p t i o n b a n d b e i n g t h a t o f a c i d f e r r i c c h o l e h a e m o c h r o m o g e n a t 1 1 0 m , u )a n d r e d u c t i o n t o t h e f e r r o u s h a e m o c h r o m o g e n c a u s e d b y t h e a d d i t i o n o f a ,minimum amount o f N a 2 S 2 0 4 b e f o r e t h e a d d i t i o n o f a c e t i c a c i d .W h i l e a c e t i c a c i d s p l i t t i n g t h u s y i e l d e d t h e s a m e p r o d u c t s a s f r o m c h o l e -g l o b i n , t h o u g h i n much s m a l l e r y . i e l d , a n o t h e r s p l i t p r o d u c t o f d i f f e r e n t n a t u r ewa s f o u n d , when t h e s p l i t t i n g wa s c a r r i e d o u t w i t h a f e r r o u s a c e t a t e - a c e t i c a c i d -HCI m i x t u r e b r w i t h g l a c i a l a c e t i c a c i d i n t h e p r e s e n c e o f h y d r a z i n e h y d r a t e .From t h e e t h e r s o l u t i o n 0 - 5 H C I e x t r a c t e d b i l i v e r d i n , a n d 5 H C I p r o t o -p o r p h y r i n a n d s m a l l amounts o f a c o m p o u n d w i t h a s h a r p a b s o r p t i o n b a n d a t6 2 7 m , u . S o m e w h a t l a r g e r a m o u n t s o f t h i s s u b s t a n c e w e r e - c o n t a i n e d i n t h e 2 0 %H C l e x t r a c t . T h e y i e l d o f a l l s p l i t p r o d u c t s w a s a g a i n s m a l l . T h e new c o m p o u n dwa s b r o u g h t b a c k i n t o e t h e r b y p a r t i a l n e u t r a l i z a t i o n o f t h e 2 0 H C I e x t r a c ta n d s e p a r a t e d f r o m t h e l a s t t r a c e s o f p r o t o p o r p h y r i n b y r e p e t i t i o n o f t h e H C If r a c t i o n a t i o n . T h e a c i d s o l u t i o n was g r e e n w i t h o u t f l u o r e s c e n c e , w h i l e t h e d i r t yy e l l o w n e u t r a l s o l u t i o n i n e t h e r - a c e t i c a c i d s h o w e d r e d f l u o r e s c e n c e . T h i s s o l u t i o ns h o w e d f o u r a b s o r p t i o n b a n d s : I 6 8 4 , I I 5 9 2 , I I I 5 4 4 , IV 5 0 4 m , u i n t e n s i t i e s : I ,I I I , I V , I I ) . T h e W i l l s t a t t e r n u m b e r was a b o u t 1 4 . T h e c o p p e r c o m p l e x s a l ts h o w e d t h e f o l l o w i n g s p e c t r u m : I 6 2 8 , I I 5 3 2 m , u i n t e n s i t i e s I , I I ) .T h e p r o p e r t i e s o f t h e s u b s t a n c e s h o w t h a t i t i s d i f f e r e n t f r o m t h e h y d r o x y -p o r p h y r i n i s o l a t e d - b y L e m b e r g , C o r t i s - J o n e s & N o r r i e [ 1 9 3 8 ] f r o m i t s h a e m a t i nw h i c h wa s o b s e r v e d a s an i n t e r m e d i a t e p r o d u c t i n t h e f o r m a t i o n o f v e r d o h a e m o -c h r o m o g e n f r o m p y r i d i n e h a e m o c h r o m o g e n w i t h a s c o r b i c a c i d . I t a p p e a r s ,h o w e v e r , t o b e a r a c l o s e r e s e m b l a n c e t o t h e o x y m e s o p o r p h y r i n s o f F i s c h e r e t a l .[ 1 9 2 7 ; 1 9 3 0 ] , ; s u b s t a n c e s o f u n c e r t a i n c o n s t i t u t i o n a r i s i n g b y t h e a c t i o n o f H 2 0 2on m e s o p o r p h y r i n . P r o b a b l y i t i s t h e c o r r e s p o n d i n g p r o t o c o m p o u n d , t h ea b s o r p t i o n b a n d s l y i n g more t o w a r d s t h e i n f r a - r e d .T h e f a c t t h a t t h i s h y d r o x y p o r p h y r i n c a n n o t b e o b t a i n e d i n t h e s a m e wa yf r o m c h o l e g l o b i n s o l u t i o n s , m a k e s i t u n l i k e l y t h a t i t s h a e m a t i n c o m p o u n d s h o u l db e f o r m e d a s i n t e r m e d i a t e p r o d u c t i n t h e f o r m a t i o n o f c h o l e g l o b i n , o r t h a t , i ts h o u l d b e d e r i v e d f r o m c h o l e h a e m a t i n i t s e l f . S o m e , t h o u g h n o t a l l o f F i s c h e r sa n a l y s e s i n d i c a t e t h e p r e s e n c e o f t w o o x y g e n a t o m s i n a d d i t i o n t o t h e f o u rp r e s e n t i n t h e two c a r b o x y l i c g r o u p s o f m e s o p o r p h y r i n . P r o b a b l y o u r new c o m -p o u n d i s a d i h y d r o x y p r o t o p o r p h y r i n , t h e h a e m a t i n o f w h i c h i s p r o d u c e d b y as i d e r e a c t i o n i n v o l v i n g t h e o x i d a t i o n o f a s e c o n d m e t h e n e g r o u p b e f o r e t h e r i n gi s o p e n e d a t t h e m e t h e n e g r o u p f i r s t o x i d i z e d .

B i l e p i g m e n t s f r o m v e r d o h a e m o c h r o m o g e n a n d v e r d o h a e m a t i nV e r d o h a e m o c h r o m o g e n was s h o w n b y L e m b e r g [ 1 9 3 5 ] t o b e t r a n s f o r m e d i n t ob i l i v e r d i n b y h o t m e t h y l a l c o h o l i c H C I . L i b o w i t z k y & F i s c h e r [ 1 9 3 8 ] h a v e

r e c e n t l y c l a i m e d t h a t t h e v e r d o h a e m o c h r o m o g e n o f t h e c o p r o s e r i e s i s n o t s p l i t

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FORMATION OF BILE PIGMENTSb y a m i x t u r e o f e q u a l p a r t s o f g l a c i a l a c e t i c a c i d a n d c o n c . H C I . From t h i so b s e r v a t i o n t h e y c o n c l u d e t h a t t h e g r e e n h a e m i n ' i s n o t a h a e m o c h r o m o g e n , b u ta f r e e f e r r i c k a e m a t i n , p r o b a b l y n o t o f b i l e p i g m e n t - h a e m a t i n n a t u r e . W a r b u r g &N e g e l e i n h a v e , h o w e v e r , a l r e a d y s h o w n t h a t t h e t y p i c a l t h r e e - b a n d e d a b s o r p t i o ns p e c t r u m d i s a p p e a r a w when t h e p y r i d i n e i s w a s h e d away f r o m t h e ' c h l o r o f o r ms o l u t i o n ; i t a l s o , d i s a p p e a r s when t h e h a e m o c h r o m o g e n i s s p l i t b y a c e t i c a c i d o rb y a l k a l i . W e c a n s h o w a l s o ( c f . T a b l e 7 b e l o w < ) t h a t v e r d o h a e m o c h r o m o g e n c a nb e s p l i t t o b i l e p i g m e n t s w i t h g o o d y i e l d u n d e r much m i l d e r c o n d i t i o n s t h a nt h o s e a p p l i e d b y F i s c h e r . T h e d a t a c o l l e c t e d i n T a b l e 7 s h o w t h a t i f t h e r e i s a n yd i f f e r e n c e i n t h e r e a c t i o n s o f f e r r i c v e r d o h a e m a t i n a n d v e r d o h a e m o c h r o m o g e nw i t h a c i d s , t h e f o i r m e r i s s p l i t m o r e e a s i l y . L i b o w i t z k y & F i s c h e r b a s e t h e i ra s s u m p t i o n a l s o o n t h e o b s e r v a t i o n t h a t h y d r a z i n e h y d r a t e d e s t r o y s t h e t y p i c a la b s o r p t i o n s p e c t r u m . T h a t h y d r a z i n e d o e s n o t d e s t r o y ' g r e e n h a e m i n s ' b yr e d u c t i o n , i s , h o w e v e r , e v i d e n t f r o m t h e f a c t t h a t i t i s u s e d i n t h e i r p r e p a r a t i o nf r o m h a e m i n s . V e r d o h a e m o c h r o m o g e n s a r e u n s t a b l e i n a l l s t r o n g l y a l k a l i n e s o l u -t i o n s w h i c h t r a n s f o r m them i n t o y e l l o w c o m p o u n d s . W e h a v e r e c e n t l y o b t a i n e df u r t h e r c o n c l u s i v e e v i d e n c e [ c f . a l s o H o l d e n & L e m b e r g , 1 9 3 9 ] f o r t h e f o r m u l a o fv e r d o h a e m o c h r o m o g e n a s a n i s o b i l i v e r d i n - h a e m o c h r o m o g e n w i t h o p e n e d r i n g b yc o n d e n s i n g i t w i t h a m m o n i a ' a n d t r a n s f o r m i n g i t t h u s i n t o t h e h a e m o c h r o m o g e no f a n a z a p o r p h y r i n w i t h n i t r o g e n - c l o s e d r i n g ( u n p u b l i s h e d e x p e r i m e n t s ) .A , F e \ , F F eI ~ ~ ~ ~ ~ I F I N / F \c / ~ ~ ~ ~ ~ ~ O H O\H V e r d o h a e m A z a - h a e m

P r o t o h a e mV e r d o h a e m o c h r o m o g e S n a p p e a r s t o u s b e s t f o r m u l a t e d a s a r e s o n a n c e s t r u c t u r ew i t h a h y d r o g e n l i n k a g e b e t w e e n o x y g e n a t o m s c l o s i n g t h e r i n g .W e h a v e no w s u b j e c t e d v e r d o h a e m a t i n , v e r d o h a e m o c h r o m o g e n a n d v e r d o -g l o b i n t o t h e s a m e m i l d s p l i t t i n g c o n d i t i o n s a s w e r e u s e d f o r c h o l e g l o b i n a b o v e .Q u a n t i t a t i v e d a t a w i l l b e g i v e n l a t e r ; h e r e we d e s c r i b e t h e s p l i t t i n g p r o d u c t s .A g a i n u n d e r a l l c o n d i t i o n s m i x t u r e s o f b i l i v e r d i n a n d b i l i v i o l i n w e r e o b t a i n e d( c f . T a b l e 6 ) , w h e t h e r a n a l k a l i n e s o l u t i o n o f f e r r i c v e r d o h a e m a t i n o r a s o l u t i o n o ft h e h a e m o e h r o m o g e n i n p y r i d i n e was t r e a t e d w i t h 6 6 a c e t i c a c i d s . On k e e p i n ga t r o o m t e m p e r a t u r e b i l i v i o l i n s w e r e o b , t a i n e d p r e d o m i n a n t l y , w h i l e on s h o r tb o i l i n g b i l i v e r d i n b e c a m e t h e m a i n p r o d u c t . M a i n l y b i l i v e r d i n was f o r m e d whent h e s p l i t t i n g was c a r r i e d o u t i n t h e p r e s e n c e o f a s c o r b i c a c i d . G l a c i a l a c e t i c a c i dp l u s h y d r a z i n e h y d r a t e a n d f e r r o u s a c e t a t e i n a c e t i c a c i d - H C l i n t h e h e a t p r o -d u c e d b i l i v e r d i n o n l y .F o r t h e i s o l a t i o n o f t h e b i l i v i o l i n s 2 v o l . o f g l a c i a l a c e t i c a c i d w e r e a d d e d t ot h e f r e s h l y p r e p a r e d s o l u t i o n o f v e r d o h a e m o c h r o m o g e n i n 2 % NaOH. A f t e r1 5 m i n . a t room t e m p e r a t u r e t h e s o l u t i o n wa s d i l u t e d w i t h an e q u a l v o l u m e o fe t h e r . W a s h i n g w i t h w a t e r r e m o v e d s o m e u n s p l i t v e r d o h a e m a t i n a n d a l i t t l eb i l i v e r d i n . From t h e r e d - v i o l e t e t h e r s o l u t i o n 2 H C I e x t r a c t e d two b i l i v i o l i n s ,o n e o f w h i c h t h e m a i n - p r o d u c t ) p a s s e d f r o m 2 % H C I i n t o c h l o r o f o r m , w h i l e t h es e c o n d was n o t e x t r a c t e d b y c h l o r o f o r m . I n t h e c h l o r o f o r m - H l I t e s t t h e f i r s ts u b s t a n c e b e h a v e d a s i n d i c a t e d i n T a b l e 3 .T h e a c i d a q u e o u s s o l u t i o n s h o w e d an a b s o r p t i o n b a n d a t 5 9 5 a u , t h e a c i dc h l o r o f o r m s o l u t i o n o n e a t 6 1 4 m , u . T h e n e u t r a l c h l o r o f o r m s o l u t i o n h a d ana b s o r p t i o n s p e c t r u m w i t h t w o b a n d s o f a b o u t e q u a l i n t e n s i t i e s I 5 5 2 , I I 5 1 2 m , u ) .

3 6 7

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3 7 0 R . L E M B E L R G , W. H . LOCKWOOD AND J . W. LEGGEF o r m e t h o d I I 5 0 m l . o f a c h o l e g l o b i n s o l u t i o n o b t a i n e d f r o m 07 - h a e m o -g l o b i n a r e r e q u i r e d . T h e y a r e w o r k e d u p a s d e s c r i b e d f o r m e t h o d I , t h e e x t r a c t i o no f t h e b i l e p i g m e n t s b e i n g c a r r i e d o u t , h o w e v e r , i n a d i f f e r e n t m a n n e r a n d w i t hr e l a t i v e l y s m a l l e r v o l u m e s o f H C I i n o r d e r t o g e t s u f f i c i e n t l y s t r o n g s o l u t i o n s .1 0 - 1 5 m l . o f 5 % HCI a r e u s e d f o r t h e e k t r a c t i o n o f b i l i v e r d i n a n d t h e s a m e

v o l u m e o f 20 H O I f o r t h e e x t r a c t i o n o f b i l i v i o l i n f o r s a m p l e s o f c h o l e g l o b i ns o l u t i o n s o b t a i n e d b y a s h o r t i n c u b a t i o n o f h a e m o g l o b i n w i t h a s c o r b i c a c i d ,w h i l e f o r s a m p l e s o f l o n g e r i n c u b a t i o n t i m e 2 5 - , 3 0 m l . o f t h e a c i d s c a n b e u s e d .S m l . o f a l c o h o l a r e a d d e d a n d t h e f i n a l v o l u m e i s m e a s u r e d . I n a l a y e r o f 4 - 5 c m .l e n g t h t h e s e b i l e p i g m e n t s o l u t i o n s g i v e e x t i n c t i o n s i n t h e o p t i m a l r a n g e o f t h es p e c t r o p h o t o m e t e r . T h e i n s t r u m e n t w a s t h e H i l g e r V i s i b l e S p e c t r o p h o t o m e t e rd e s c r i b e d i n P a r t 2 .M e t h o d I I I . I f t h e e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t s o f b o t h b i l i v e r d i n a n d b i l i v i o l i na r e known a t t w o w a v e - l e n g t h s a t w h i c h t h e y d i f f e r c o n s i d e r a b l y ; t h e c o n t e n t o fa m i x t u r e o f b o t h s u b s t a n c e s c a n b e e s t a b l i s h e d b y m e a s u r n g t h e e x t i n c t i o n s a tt h e s e w a v e - l e n g t h s . T h e w a v e - l e n g t h s o f t h e a b s o r p t i o n maxima ( A = 6 7 5 a n d5 9 5 m p A ) a r e s u i t a b l e . T h e s p e c i f i c e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t s o f b i l i v e r d i n h y d r o -c h l o r i d e w e r e f o u n d t o b e 4 6 - 5 a t 6 7 5 m , u a n d 2 1 4 a t 5 9 5 m , u , w h i l e t h o s e o fb i l i v i o l i n h y d r o c h l o r i d e w e r e 4 6 - 0 a t 5 9 5 m , u a n d 6 - 0 a t 6 7 5 m , u . I f 6 7 5 a n d E 9 .a r e t h e e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t s o f t h e s o l u t i o n i n 1 c m . d e p t h a t t h e w a v e - l e n g t h s6 7 5 a n d 5 9 5 m , u t h e f o l l o w i n g t w o e q u a t i o n s h o l d :u t g . b i l i v e r d i n p e r m l . = 2 i 9 8 7 . 6 7 e 6 7 6 r - e 5 )u g . b i l i v i o l i n p e r m l . = l 1 0 6 4 2 . 1 7 E 9 - 5 E 6 7 5 ) .

F o r t h e d e t e r m i n a t i o n w i t h t h i s m e t h o d t h e e t h e r e a l s o l u t i o n i s e x t r a c t e d t w i c ew i t h 5 m l . e a c h o f 5 % H C I a n d t h r e e t i m e s w i t h 5 m l . e a c h o f 2 0 % R C I . A f t e rt h e a d d i t i o n o f 5 m l . o f a l c o h o l t o t h e u n i t e d e x t r a c t s t h e v o l u m e i s m e a s u r e da n d t h e e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t s a t 6 7 5 a n d 5 9 5 m p a r e m e a s u r e d .T a b l e 5 s h o w s t h a t w i t h c h o l e g l o b i n m e t h o d s I I a n d I I I g i v e e s s e n t i a l l y t h es a m e r e s u l t s , w h i l e t h e d i f f e r e n c e s a r e l a r g e r when t h e b i l e p i g m e n t s f r o m v e r d o -h a e m a t i n o r v e r d o h a e m o c h r o m o g e n a r e d e t e r m i n e d ; h e r e m e t h o d I I I i s p r e -f e r a b l e .

T a b l e 5 . D e t e r m i n a t i o n o f b i l e p i g m e n t s f r o m v e r d o h a e m o c h r o m o g e na n d c h o l e g l o b i nM e t h o d I I M e t h o d I I IZ g - / A g .I L g . J s g . b i l e l s g . I g . b i l ev e r d i n v i o l i n p i g m e n t v e r d i n v i o l i n p i g m e n tV e r d o h a e m a t i n 5 2 1 0 4 1 5 6 3 3 1 3 4 1 6 6V e r d b h a e m o c h r o m o g e n + 1 6 7 4 2 2 0 9 1 6 5 1 0 6 2 7 1

a 8 c o r b i c a c i dC h o l e g l o b i n 9 5 0 2 5 1 1 2 0 1 9 7 8 2 0 3 1 1 9 1B i l e p i g m e n t y i e l d f r o m v e r d o h a z e m o c h r o m o g e n

E x p e r i m e n t s o n t h e y i e l d o f b i l e p i g m e n t s f r o m v e r d o h a e m a t i n c o m p o u n d sw e r e c a r r i e d o u t i n o r d e r t o e x a m i n e i n w h a t y i e l d b i l e p i g m e n t i s i s o l a t e d f r o mt h e s e b i l e p i g m e n t - h a e m a t i n c o m p o u n d s o f e s t a b l i s h e d c o n s t i t u t i o n u n d e r t h ec o n d i t i o n s u s e d f o r t h e s p l i t t i n g o f c h o l e g l o b i n .V e r d o h a e m o c h r o m o g e n was e i t h e r d i s s o l v e d d i r e c t l y i n 6 6 % a c e t i c a c i d a )o r i t was f i r s t d i s s o c i a t e d t o v e r d o h a e m a t i n b y d i s s o l v i n g i t i n 1 m l . o f 2%NaOH ( b ) o r d i s s o l v e d i n 1 m l . o f 2 0 % p y r i d i n e ( c ) a n d t h e s e s o l u t i o n s a d d e d t o- 2 m l . o f g l a c i a l a c e t i c a c i d . F i n a l l y a s o l u t i o n o f v e r d o h a e m a t i n i n 1 % N a 2 C O 3

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F O R l M I A T I O N OF BILE PIGMENTS 3 7 1w a s c o u p l e d w i t h n a t i v e h o r s e g l o b i n a n d 6 m l . o f t h i s s o l u t i o n o f f e r r i c v e r d o -g l o b i n d ) w e r e a d d e d t o 1 2 m l . o f g l a c i a l a c e t i c a c i d . T h e b i l e , p i g m e n t s w e r ei s o l a t e d a s f r o m c h o l e g l o b i n , t h e u n s p l i t v e r d o h a e m a t i n b e i n g r e m o v e d f r o m t h ee t h e r b y r e p e a t e d w a s h i n g w i t h w a t e r b e f o r e t h e e x t r a c t i o n o f t h e b i l e p i g m e n t sw i t h H C I . M e t h o d I I I w a s a p p l i e d t o t h e d e t e r m i n a t i o n a n d t h e r e s u l t s a r e g i v e ni n T a b l e 6 .

T a b l e 6 . B i l e p i g m e n t y i e l d s a f t e r a c i d s p l i t t i n g o f v e r d o h a e m a t i n c o m p o u n S du n d e r v a r i o u 8 c o n d i t i o n 8T o t a l b i l e p i g m e n t i n % o f t h e o r y

a V e r d o - B i l i v e r d i nS o l i d b h a e m o - d i n % o f t o t a lA d d i t i o n s t o t h e v e r d o - V e r d o - c h r o m o g e n F e r r i c b i l e - p i g m e n ts o l u t i o n b e f o r e T i m e h a e m o - h a e m a t i n i n 20 v e r d o - ,- -s p l i t t i n g S p l i t b y m i n . c h r o m o g e n i n a l k a l i p y r i d i n e g l o b i n a b c Z66 a c e t i c a c i d 1 5 1 3 . 8 2 5 - 8 6 * 1 1 4 - 7 1 6 3 8 3 5 1 96 0 1 8 * 5 3 2 - 5 1 3 * 7 2 5 4 4 1 8 5 m g . a s c o r b i c a c i d 1 5 2 5 . 6 6 . 8 1 0 7 7 4 6 2 4 96 0 2 5 . 3 3 4 . 3 1 2 * 2 5 8 8 9 5 5

S m g . a s c o r b i c a c i d 66 a c e t i c a c i d 1 5 1 7 * 0 - 1 2 - 1 6 3 4 6+CO u n d e r C 3 O 6 0 2 1 - 5 3 1 - 4 - 5 4 7 1- 6 6 % a c e t i c a c i d + 6 0 1 9 - 3 - 2 81 m l . c o n c . H C I 66 a c e t i c a c i d , 2 3 9 - 5 2 2 - 6 -23-7 1 0 - 4 7 0 5 5 8 7 5 8b o i l i n g

5 0 H C I 6 0 - 3 3 - 0 - - - 6 5 -5mg. a s c o r b i c a c i d , , 6 0 3 2 - 6 - 7 3

U n d e r t h e m i l d c o n d i t i o n s u s e d f o r t h e s p l i t t i n g o f c h o l e g l o b i n t h e i r o n f r o mv e r d o h a e m a t i n c o m p o u n d s i s n o t d e t a c h e d c o m p l e t e l y , b u t a l r e a d y t o t h e e x t e n to f 1 5 - 3 5 % a t room t e m p e r a t u r e a n d u p t o 4 0 % b y b o i l i n g a c e t i c a c i d . N e i t h e rH C I , n o r a m i x t u r e o f a c e t i c a n d h y d r o c h l o r i c a c i d s i n c r e a s e s t h e y i e l d o f b i l ep i g m e n t s s u b s t a n t i a l l y . T h e d e g r e e o f s p l i t t i n g v a r i e s a g r e a t d e a l w i t h t h e c o n -d i t i o n s . I f t h e r e i s a n y d i f f e r e n c e b e t w e e n f e r r i c v e r d o h a e m a t i n a n d f e r r o u sv e r d o h a e m o c h r o m o g e n i n t h i s r e g a r d , f e r r i c v e r d o h a e m a t i n i s s p l i t m o r e r e a d i l y .T h e d i f f e r e n c e i s , h o w e v e r , n o t l a r g e . T h u s f e r r o u s v e r d o h a e m o c h r o m o g e n - w a so b s e r v e d s p e c t r o s c o p i c a l l y t o p e r s i s t i n t h e 6 6 % a c e t i c a c i d i n t h e p r e s e n c e o fp y r i d i n e a n d a s c o r b i c a c i d o r o f p y r i d i n e , a s c o r b i c a c i d a n d C O , w h i l e i t sa , b s o r p t i o n s p e c t r u m r a p i d l y d i s a p p e a r e d i n t h e a c e t i c a c i d i n t h e a b s e n c e o fa s c o r b i c a c i d ; t h e b i l e p i g m e n t y i e l d w a s s l i g h t l y h i g h e r i n t h e a b s e n c e o f a s c o r b i ca c i d . I n t h e a b s e n c e o f e x c e s s p y r i d i n e CO r e a c t s i n t h e a c e t i c a c i d w i t h v e r d o -haem w h e n a s c o r b i c a c i d i s p r e s e n t , y i e l d i n g a c h a r a c t e r i s t i c C O - c o m p o u n d w i t ha b s o r p t i o n b a n d s a t 6 1 1 , 5 4 1 a n d 5 0 2 m p t i n t e n s i t i e s : I , I I , I I I ) , when a s c o r b i ca c i d i s a b s e n t , CO f a i l s t o f o r m t h i s c o m p o u n d . I t i s , t h e r e f o r e , C O - v e r d o h a e mw i t h f e r r o u s i r o n ; p y r i d i n e c o n v e r t s i t i n t o v e r d o h a e m o c h r o m o g e n . A g a i n t h ey i e l d o f b i l e p i g m e n t i s o l a t e d - f r o m t h e f e r r o u s C O - v e r d o h a e m i s e i t h e r t h e s a m eo r s l i g h t l y l e s s t h a n f r o m - t h e b r o w n f e r r i c v e r d o h a e m a t i n s o l u t i o n s o b t a i n e d b yt h e a c t i o n o f a c e t i c a c i d o n v e r d o h a e m o c h r o m o g e n . V e r d o g l o b i n i s s p l i t b y 6 6 %a c e t i c a c i d w i t h a y i e l d o f 1 0 - 1 5 % a n d n e i t h e r a s c o r b i c a c i d n o r CO i n f l u e n c e st h e y i e l d s i g n i f i c a n t l y . U n d e r a l l t h e s e c o n d i t i o n s b o t h b i l i v e r d i n a n d b i l i v o l i na r e o b t a i n e d , p r e d o m i n a n t l y v e r d i n f r o m f e r r o u s a n d v i o l i n f r o m f e r r i c c o m -p o u n d s . B o i l i n g a c e t i c a n d h y d r o c h l o r i c a c i d s p r o d u c e l e s s v i o l i n f r o m f e r r i c

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3 7 2 . R . L E M B E R G , W. H . LOCKWOOD AND J . W. LEGGEv e r d o h a e n i a t i n t h a n a c e t i c a c i d a t r o o m t e m p e r a t u r e . B i l i v i o l i n I I b c o n t a i n sf o u r h y d r o g e n e q u i v a l e n t s l e s s t h a n b i l i v e r d i n a n d o n e w o u l d e x p e c t , t h e r e f o r e ,a y i e l d o f 2 5 o f v i o l i n , i f o x i d a t i o n o f b i l i v e r d i n b y t h e f e r r i c h a e m a t i n i r o nc a u s e s t h e f o r m a t i o n o f t h e b i l i v i o h i n . A c t u a l l y much m o r e b i l i v i o l i n i s a l w a y sf o u n d , a l t h o u g h t h e d i f f e r e n c e i n t h e p e r c e n t a g e s o f b i l i v e r d i n i n t o t a l b i l ep i g m e n t f r o m a f e r r o u s a n d a f e r r i c c o m p o u n d i s r o u g h l y 2 5 . S i n c e b i l i v i o l i ni s n o t r e d u c e d b y a s c o r b i c a c i d , a n d b i l i v e r d i n i s n o t o x i d i z e d b y t h e s m a l l c o n -c e n t r a t i o n s o f f e r r i e a c e t a t e s e t f r e e i n t h e s o l u t i o n s , i t i s s o m e w h a t d i f f i c u l t t oe x p l a i n t h e s e r e s u l t s , u n l e s s i t i g a s s u m e d t h a t t h e u n s t a b l e i s o b i l i v e r d i n s e t f r e ef r o m v e r d o h a e m a t i n c o m p o u n d s i s m o r e r e a d i l y o x i d i z e d t h a n b i l i v e r d i n .

R e c o v e r y o f b i l i v e r d i n f r o m m i x t u r e s w i t h o x y h a e m o g l o b i nF o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e b i l e p i g m e n t y i e l d s f r o m c h o l e g l o b i n s o l u t i o n s ,w h i c h a l w a y s c o n t a i n o x y h a e m o g l o b i n , i t w a s e s s e n t i a l t o know t o w h a t e x t e n tb i l i v e r d i n c a n b e r e c o v e r e d b y o u r m e t h o d s f r o m a s o l u t i o n o f o x y h a e m o g l o b i n .A k n o w n a m o u n t o f b i l i v e r d i n d i s s o l v e d i n d i l u t e a m m o n i a w a s a d d e d t o 5 0 m l .o f a n 0 - 7 s o l u t i o n o f h o r s e o x y h a e m o g l o b i n . T h i s a m o u n t o f o x y h a e m o g l o b i na l o n e g a v e n o d e t e c t a b l e a m o u n t s o f b i l e p i g m e n t s . I n t h e m a j o r i t y o f t h er e c o v e r y e x p e r i m e n t s 5 0 m g . p e r 1 0 0 m l . o f a s c o r b i c a c i d w e r e a d d e d , t h i s b e i n ga b o u t t h e a s c o r b i c a c i d c o n c e n t r a t i o n o f t h e m a j o r i t y o f c h o l e g l o b i n s o l u t i o n s .I t h a s a l r e a d y b e e n m e n t i o n e d a b o v e t h a t a s c o r b i c a c i d p r e v e n t s t h e o x i d a t i o n o fb i l i v e r d i n t o b i l i v i o l i n d u r i n g t h e t r e a t m e n t w i t h a c i d . T h e m i x t u r e o f o x y h a e m o -g l o b i n , b i l i v e r d i n a n d u s u a l l y a s c o r b i c a c i d w a s s u b j e c t e d t o t h e t r e a t m e n t w i t h6 6 % a c e t i c a c i d a s d e s c r i b e d a b o v e , a n d t h e r e c o v e r e d b i l e p i g m e n t d e t e r m i n e db y m e t h o d I I I .T a b l e 7 s h o w s t h a t , u n d e r t h e c o n d i t i o n s o f t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e b i l ep i g m e n t y i e l d f r o m c h o l e g l o b i n , b e t w e e n 8 0 a n d 9 0 % ( a v e r a g e 84 ) o f t h e

a d d e d b i l i v e r d i n c a n b e r e c o v e r e d a n d t h a t t h e p e r c e n t a g e o f r e c o v e r y d o e s n o tT a b l e 7 . R e c o v e r y o f b i l i v e r d i n f r o m d i l u t e o x y h a e m o g l o b i n s o l u t i o n s

I n % o f a d d e d b i l i v e r d i np g . b i l i v e r d i n A s c o r b i c a c i d T o t a l b i l ea d d e d m g . p e r 1 0 0 m l . B i l i v e r d i n B i l i v i o l i n p i g m e n t

6 2 . 9 5 0 7 9 0 2 * 2 8 1 * 26 3 * 5 5 0 7 9 * 0 0 7909 5 5 0 9 0 . 7 0 f 9 0 * 71 8 9 5 0 9 5 9 0 9 5 92 2 2 5 0 8 3 f 0 0 8 3 - 02 2 2 5 0 6 8 - 5 0 5 6 9 - 02 6 2 . 5 0 9 0 * 8 0 9 0 * 84 0 8 5 0 8 3 - 0 1 . 9 8 4 * 99 5 2 5 0 7 5 * 0 0 7 5 06 2 - 9 0 8 5 * 8 8 5 . 89 5 2 - 9 . 8 6 - 4 8 9 - 3

A v e r a g e 8 4 %d e p e d o n t h e amount o f b i l i v e r d i n i n a r a n g e b e t w e e n 6 0 a n d 4 0 0 p g . p e r 5 0 m l . ,i . e . i n - t h e r a n g e o f b i l e - p i g m e n t y i e l d s o b t a i n e d f r o m c h o l e g l o b i n s o l u t i o n s . I nt h e a b s e n c e o f a s c o r b i c a c i d b i l i v e r d i n i s o x i d i z e d t o b i l i v i o l i n I I b b y t h e a c t i o no f a c i d o n o x y h a e m o g l o b i n , b u t t h e y i e l d o f b i l i v i o l i n i s t h e s a m e a s t h a t o fb i l i v e r d i n o b t a i n e d i n t h e p r e s e n c e o f a s c o r b i c a c i d .

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FORMATION OF BILE PIGMENTSB i l e p i g m e n t y i e l d f r o m c h o l e g l o b i n

W e f o u n d t h a t s p l i t t i n g a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 5 m i n . i n 6 6 a c e t i c a c i dg a v e o p t i m a l y i e l d s o f b i l e p i g m e n t f r o m s o l u t i o n s o f c h o l e g l o b i n . H e a t i n g , o rt r e a t m e n t w i t h t h e a c i d f o r a l o n g e r p e r i o d , o r t h e a p p l i c a t i o n o f s t r o n g e r a c i d s ,e . g . H C l , d e c r e a s e d t h e y i e l d . P r o b a b l y m o r e o f t h e b i l e p i g m e n t - h a e m o g l o b i ni s s p l i t , b u t a l s o m o r e i s d e n a t u r e d i n a wa y w h i c h p r e v e n t s t h e r e m o v a l o f t h eb i l e p i g m e n t f r o m t h e p r o t e i n . I n T a b l e 8 t h e y i e l d s o f b i l e p i g m e n t s o b t a i n e df r o m c h o l e g l o b i n s o l u t i o n s a f t e r v a r i o u s t i m e s o f i n c u b a t i o n o f h a e m o g l o b i n w i t ha s c o r b i c a c i d a r e c o m p a r e d w i t h t h e amount o f c h o l e g l o b i n d e t e r m i n e d s p e c t r o -p h o t o m e t r i c a l l y . A s u p e r f i c i a l e x a m i n a t i o n m a y l e a d t o t h e a s s u m p t i o n ' t h a t t h eb i l e p i g m e n t i s n o t d e r i v e d f r o m c h o l e g l o b i n , s i n c e t h e r e i s e v i d e n t l y n o p r o -p o r t i o n a l i t y b e t w e e n t h e a m o u n t o f c h o l e g l o b i n a n d t h e y i e l d o f b i l e p i g m e n t .W h i l e t h e m a x i m u m o f c h o l e g l o b i n c o n c e n t r a t i o n i n t h e s o l u t i o n i s r e a c h e d i na b o u t 3 0 m i n . a t pH 8 - 5 a n d i n a b o u t 8 0 m i n . a t pH 7 - 2 , t h e m a x i m u m o f t h eb i l e p i g m e n t f o r m a t i o n o c c u r s o n l y a f t e r a b o u t 7 h r . i n c u b a t i o n ; f o r t h e s e c a l c u -l a t i o n s we h a v e l e f t o u t o f c o n s i d e r a t i o n t h e c h o l e h a e m o c h r o m o g e n o f t h e g r e e np i g m e n t p r e c i p i t a t e , s i n c e l i t t l e b i l e p i g m e n t c a n b e i s o l a t e d f r o m g r e e n p i g m e n t ,a t l e a s t i n t h e f i r s t s t a g e s o f i t s f o r m a t i o n . I t i s a s s u m e d t h a t o n e m o l e o fc h o l e g l o b i n o f m o l . w t . 1 6 , 7 0 0 y i e l d s 5 8 4 g . b i l e p i g m e n t , 5 8 4 b e i n g t h e m o l . w t .o f b i l i v e r d i n . T h e m o l . w t . o f b i l i v i o l i n i s s o m e w h a t h i g h e r , b u t t h e e r r o r i n t r o -d u c e d b y t h i s i n t h e c a l c u l a t i o n s , i s i n s i g n i f i c a n t . T h e d a t a i n T a b l e 8 s h o w t h a ti n t h e f i r s t s t a g e s o f t h e r e a c t i o n o n l y 1 0 - 1 5 o f t h e b i l e p i g m e n t t h e o r e t i c a l l ye x p e c t e d f r o m t h e c h o l e g l o b i n c o n t e n t o f t h e s o l u t i o n s i s i s o l a t e d , w h i l e l a t e r u pt o 7 0 % c a n b e r e c o v e r e d . C h o l e g l o b i n w o u l d t h u s a p p e a r n o t t o y i e l d b i l ep i g m e n t b y t h e a c t i o n o f a c i d s , b u t t o b e a p r e c u r s o r o f b i l e p i g m e n t o r o f a b i l ep i g m e n t - h a e m o g l o b i n y i e l d i n g b i l e p i g m e n t o n t r e a t m e n t w i t h a c i d s . W h i l e s u c ha n a s s u m p t i o n w o u l d s o l v e t h e d i f f i c u l t p r o b l e m : w h a t i s t h e c o n s t i t u t i o n a ld i f f e r e n c e b e t w e e n c h o l e h a e m a n d v e r d o h a e m ? i t w o u l d c r e a t e new v e x i n gp r o b l e m s . I f t h e b i l e p i g m e n t s , w h i c h a r e o b t a i n e d f r o m c h o l e g l o b i n s o l u t i o n s b yt h e a c t i o n o f a c i d s , a r e n o t t h e i r o n - f r e e p r o s t h e t i c g r o u p o f c h o l e g l o b i n , w h a tc a n t h i s p r o s t h e t i c g r o u p b e ? A p a r t f r o m b i l e p i g m e n t s a n d p r o t o h a e m i n n oo t h e r c o m p o u n d s w e r e i s o l a t e d f r o m c h o l e g l o b i n s o l u t i o n s t r e a t e d b y a c i d s .P r o t o h a e m i n i s e x c l u s i v e l y d e r i v e d f r o m a c c o m p a n y i n g h a e m o g l o b i n , s i n c e i td e c r e a s e s e x a c t l y i n p r o p o r t i o n t o t h e h a e m o g l o b i n c o n c e n t r a t i o n ( c f . P a r t 3 ) .W e h a v e a l s o s h o w n i n P a r t 4 t h a t t h e g r e a t e r p a r t o f t h e c h o l e g l o b i n i r o n i sr e m o v e d b y i n c u b a t i o n w i t h N / 1 0 H C 1 f o r 1 6 h r .A c l o s e r e x a m i n a t i o n o f t h e d a t a i n T a b l e 8 r e v e a l s , i n d e e d , s u f f i c i e n t e v i d e n c et h a t c h o l e g l o b i n i s s p l i t t o b i l e p i g m e n t s w i t h a y i e l d o f 1 1 - 1 2 . S u c h a y i e l di s f o u n d i n t h e i n i t i a l p e r i o d s i n w h i c h a c c o r d i n g t o T a b l e 3 o f P a r t 3 ( p . 3 4 4 )c h o l e g l o b i n i s t h e o n l y p r o d u c t o f t h e r e d u c t i o n . T h i s i s e v i d e n t f r o m T a b l e 9i n w h i c h t h e y i e l d o f unknown b y - p r o d u c t o b t a i n e d f r o m T a b l e 3 o f P a r t 3 , i . e .i n i t i a l h a e m o g l o b i n m i n u s c h o l e g l o b i n + h a e m o g l o b i n + c h o l e h a e m o c h r o m o g e n +p r o t o h a e m o c h r o m o g e n ) , i s g i v e n i n t h e t h i r d c o l u m n a n d c o m p a r e d w i t h t h ep e r c e n t a g e y i e l d o f b i l e p i g m e n t i n t h e f o u r t h c o l h m n . T h e same y i e l d o f 1 1 - 1 2 %i s o b t a i n e d f r o m c h o l e g l o b i n p r o d u c e d b y c o u p l e d o x i d a t i o n o f h a e m o g l o b i n w i t hg l u t a t h i o n e o r w i t h t h i o l a c e t i c a c i d . W i t h t h e l a t t e r a g a i n n o f o r m a t i o n o f b y -p r o d u c t s w a s i n d i c a t e d b y t h e b a l a n c e s h e e t o f t h e r e a c t i o n . T h e a p p a r e n t b i l ep i g m e n t r e c o v e r y f r o m h a e m o g l o b i n i s s o m e w h a t h i g h e r , b u t s t i l l b e l o w 2 0 ,w h e r e t h e r e i s a s l i g h t f o r m a t i o n o f b y - p r o d u c t ( u n d e r 3 o f t h e i n i t i a l h a e m o -g l o b i n ) , e . g . i n e x p e r i m e n t s w i t h a s c o r b i c a c i d a t pH 8 - 5 u p t o 8 0 m i n . a n d a tpH 7 - 2 u p t o 3 0 m i n . i n c u b a t i o n t i m e . O n l y w h e r e t h e b a l a n c e s h e e t i n d i c a t e s a

3 7 3

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FORMATION OF BILE PIGMENTS 3 7 5

-CB 40.49~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~4

014 0 0 0 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~o O~~~~~~~~~~~444- '- . . I f r CCaL

H H H H H H

C iI I IlAo b .~ C B . . : . 6 C ._ - ___sI pq a t - - q t oC OC k o 1 ;* mI i > g i l

10 0 Co4 t

0~~~ ~0i0o mmc o c o:>csooooo 0 It\to- rou t- co

ct o 1 o t -o to o o -eineq -

q1 -o c

00 co ( M c _ _ to x 4

I 00c II c o c o e q t w u 0

to uo4Oo o lo , o o cC : alcc IoO O4 0 0 cOc ceC * co c q c q C 4 C qeqceqeqeq q e q

u > 0 0. 5C O

r ^ 0OcoCO CO

cq o -COq4 s P 4 CO CO

U :e s l . 1t.0 000'0 0CX e m _ - t . C qC _ __ tor- P- -4 P-

I r r I O r q

4 - 4 -4eq co .1 4 CD t

P o0 8 00

4000

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91

* A00ew eq

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0- 4............ . - q....... ...

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3 7 6 R . LEMBERG, W. H . LOCKWOOD AND J . W. LEGGET a b l e 9 . C o r r e l a t i o n b e t w e e n b y - p r o d u c t f o r m a t i o n d u r i n g c o u p l e d o x i d a t i o na n d e x c e s s b i l e p i g m e n t n o t d e r i v e d f r o m c h o l e g l o b i n

A v e r a g e y i e l dA v e r a g e y i e l d o f e x c e s s o fB y - p r o d u c t o f b i l e p i g m e n t b i l e p i g m e n tTime o f f o r m e d i n % i n % o f o v e r 1 1 5 i ni n c u b a t i o n o f c h o l e g l o b i n c h o l e g l o b i n e q u i v a l e n t %pH m i n . e q u i v a l e n t s e q u i v a l e n t s o f b y - p r o d u c t

8 5 w i t h a s c o r b i c 1 5 0 1 0 1a c i d 3 0 0 1 2 - 48 0 2 - 6 1 9 1 8 21 2 0 8 - 1 3 3 - 6 7 34 2 0 2 5 - 9 4 8 - 3 2 87 - 2 w i t h a s c o r b i c 1 5 0 4 1 3 - 5 3 8a c i d 3 0 2 - 8 1 9 - 3 4 18 0 9 5 3 4 - 2 4 81 2 0 1 2 - 4 4 8 - 3 5 94 2 0 1 1 * 4 6 7 - 0 9 77 - 2 w i t h t h i o l - 9 0 0 1 1 . 9

a c e t i c a c i dc o n s i d e r a b l e f o r m a t i o n o f b y - p r o d u c t i n t h e l a t e r s t a g e s o f t h e r e a c t i o n , muc hm o r e b i l e p i g m e n t i s o b t a i n e d . I t c a n a l s o b e s e e n f r o m T a b l e 9 t h a t t h e i n i t i a lr a t e o f b i l e p i g m e n t f o r m a t i o n a t pH 8 - 5 i s more t h a n d o u b l e t h a t a t pH 7 - 2 ,e x a c t l y a s i n t h e c a s e w i t h t h e r a t e o f c h o l e g l o b i n f o r m a t i o n . From t h e s e o b s e r -v a t i o n s we c o n c l u d e t h a t c h o l e g l o b i n i s s p l i t b y 6 6 a c e t i c a c i d t o 1 1 P 5 , i . e .t o a b o u t t h e same d e g r e e a s v e r d o g l o b i n ( c f . T a b l e 6 ) . T h i s a l s o s u p p o r t s t h ev i e w t h a t t h e t w o s u b s t a n c e s a r e c l o s e l y r e l a t e d t o e a c h o t h e r .W e h a v e a t t e m p t e d t o g a i n i n f o r m a t i o n on t h e q u e s t i o n t o w h a t d e g r e ec h o l e g l o b i n i s s p l i t b y t h e t r e a t m e n t w i t h 6 6 a c e t i c a c i d i n o t h e r w a y s , b u th a v e f a i l e d t o o b t a i n a d e f i n i t e r e s u l t . T h e u n s p l i t c h o l e g l o b i n was p r e c i p i t a t e df r o m t h e a q u e o u s s o l u t i o n r e m a i n i n g a f t e r e t h e r e x t r a c t i o n o f b i l e p i g m e n t s a n dp r o t o h a e m a t i n b y s o d i u m a c e t a t e a n d a m m o n i u m s u l p h a t e . I t wa s t h e n f i l t e r e do f f , w a s h e d f r e e f r o m s a l t s a n d r e d i s s o l v e d i n N / 1 0 NaOH. T h e a b s o r p t i o nm a x i m u m a t 6 3 0 m , t o f t h e C O - c h o l e h a e m o c h r o m o g e n wa s m e a s u r e d a n d i t ss t r e n g t h i n d i c a t e d t h a t a b o u t 7 0 % o f t h e c h o l e g l o b i n i n o n e e x p e r i m e n t 4 5 O )h a d b e e n s p l i t . The c o l o u r o f t h e r e c o v e r e d c h o l e h a e m o c h r o m o g e n i s , h o w e v e r ,r a t h e r b r o w n t h a n g r e e n , a n d i t i s l i k e l y t h a t i t h a s b e c o m e a l t e r e d a n d t h a t i t sa b s o r p t i o n h a s b e e n d i m i n i s h e d i n i n t e n s i t y . The v a l u e s f o u n d , g i v e t h e r e f o r e ,o n l y minimum v a l u e s o f r e c o v e r y o f u n s p l i t c h o l e g l o b i n . I n t h e c a s e o f c h o l e -h a e m o c h r o m o g e n s m a l l e r s a l t c o n c e n t r a t i o n s a r e r e q u i r e d f o r t h e p r e c i p i t a t i o no f t h e p i g m e n t a n d t h e e s t i m a t i o n o f r e c o v e r y i s more l i k e l y t o b e c o r r e c t . W h i l ei n c u b a t i o n w i t h N / 1 0 HCI r e m o v e d 6 6 % o f t h e i r o n f r o m g r e e n p i g m e n t 8 3 o / ow e r e r e c o v e r e d u n s p l i t a f t e r 1 5 m i n . s t a n d i n g a t room t e m p e r a t u r e i n 6 0 0 a c e t i ca c i d .The l a t e r p a r t o f t h e r e a c t i o n w i t h a s c o r b i c a c i d i s c o m p l i c a t e d b y s e v e r a lf a c t o r s . F i r s t , g r e e n p i g m e n t ' p r e c i p i t a t e s a n d w h i l e l i t t l e b i l e p i g m e n t i so b t a i n e d f r o m g r e e n p i g m e n t ' p r e c i p i t a t e d a f t e r 8 0 m i n . i n c u b a t i o n , l a t e r o n al a r g e r p a r t o f t h e b i l e p i g m e n t m a y b e d e r i v e d f r o m p r e c i p i t a t e ( c f . t h e v a l u e s o fb i l i v e r d i n o b t a i n e d f r o m t h e s o l u t i o n a l o n e l a s t c o l u m n ) w i t h t h o s e o b t a i n e df r o m t h e u n f i l t e r e d s u s p e n s i o n ( c o l u m n 6 o f T a b l e 8 ) . T h i s b i l e p i g m e n t f r o mg r e e n p i g m e n t m a y e i t h e r b e d e r i v e d f r o m a c h o l e h a e m o c h r o m o g e n , i n w h i c h t h ep r o t e i n h a s b e e n d e n a t u r e d i n s u c h a wa y t h a t n o f i r m l i n k a g e b e t w e e n p r o s t h e t i cg r o u p a n d p r o t e i n i s e s t a b l i s h e d , o r , more l i k e l y , f r o m an i r o n - f r e e b i l e p i g m e n t -p r o t e i n c o m p o u n d . I n P a r t 3 p . 3 4 2 ) we h a v e i n d e e d r e p o r t e d e v i d e n c e f o r t h e

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FORMATION O F BILE PIGMENTSo c c u r r e n c e o f s o m e i r o n - f r e e p r o t e i n - i n t h e g r e e n p i g m e n t ' . On l o n g e r i n c u b a , t i o na s c o r b i c a c i d e v i d e n t l y r e m o v e s i r o n f r o m c h o l e h a e m o c h r o m o g e n . T h e f i g u r e s i nt h e l a s t c o l u m n o f T a b l e 8 s h o w , h o w e v e r , t h a t t h e b i l e p i g m e n t r e c o v e r i e s f r o mt h e f i l t r a t e a l o n e a l s o s t i l l f a r e x c e e d t h e 1 1 - 5% d e r i v e d f r o m c h o l e g l o b i n . I n t h el a s t c o l u m n o f T a b l e 9 t h e b i l e p i g m e n t d e r i v e d f r o m c h o l e g l o b i n , a s s u m i n g ay i e l d o f 1 1 5 , i s s u b t r a c t e d f r o m b i l e p i g m e n t f o u n d , a n d t h i s e x c e s s i s g i v e ni n e q u i v a l e n t p e r c e n t a g e o f t h e u n k n o w n b y - p r o d u c t . T h i s p e r c e n t a g e c a n n o tb e e s t a b l i s h e d w i t h g r e a t a c c u r a c y , b u t t h e f i g u r e s l e a v e n o d o u b t t h a t t h e b y -p r o d u c t y i e l d s a m t i c h l a r g e r a m o u n t o f b i l e p i g m e n t t h a n c h o l e g l o b i n o r v e r d o -g l o b i n . I t i s t h e r e f o r e l i k e l y t h a t p r o l o n g e d i n c u b a t i o n o f h a e m o g l o b i n w i t ha s c o r b i c a c i d s e t s f r e e b i l e p i g m e n t f r o m c h o l e g l o b i n , a n d t h a t t h i s o c c u r s nowi n t h e s o l u t i o n s t i l l b o u n d t o p r o t e i n , b u t n o l g e r t o i r o n . T h i s e x c e s s b i l ep i g m e n t n o t d e r i v e d f r o m c h o l e g l o b i n c o n s i s t s a l m o s t e n t i r e l y o f b i l i v e r d i n .S i n c e b i l i v e r d i n i s r e d u c e d b y N a 2 S 2 O 4 t o a y e l l o w c o m p o u n d w i t h n o a b s o r p t i o ni n t h e r e d a n d g r e e n p a r t s o f t h e s p e c t r u m , t h e s p e c t r o p h o t o m e t r i c d e t e r -m i n a t i o n o f t h e c h o l e h a e m a n d p r o t o h a e m c o m p o u n d s i s n o t a f f e c t e d b y i t sp r e s e n c e , a n d i n t h e b a l a n c e s o f T a b l e 3 , P a r t 3 t h e b y - p r o d u c t a p p e a r s s i m p l ya s d e f i c i t .A d d i t i o n s o f f u r t h e r a s c o r b i c a c i d b e f o r e t h e a c i d s p l i t t i n g o f c h o l e g l o b i n o ro f CO d o n o t a l t e r t h e t o t a l y i e l d o f b i l e p i g m e n t ; t h e y i n c r e a s e t h e y i e l d o fb i l i v e r d i n s l i g h t l y a n d d e c r e a s e t h e y i e l d o f b i l i v i o l i n c o r r e s p o n d i n g l y .

I s o l a t i o n o f b i l e p i g m e n t s f r o m r e d c e l l sT h e b i l e p i g x m e n t y i e l d f r o m r e d c e l l s i s s m a l l a n d f o r i t s e s t i m a t i o n r a t h e rs t r o n g s o l u t i o n s o f h a e m o g l o b i n must b e e m p l o y e d . I t i s t o b e e x p e c t e d t h a t t h er e c o v e r y o f b i l e p i g m e n t f r o m s u c h s o l u t i o n s w i l l b e l e s s c o m p l e t e t h a n f r o md i l u t e h a e m o g l o b i n s o l u t i o n s . On t h e o t h e r h a n d t h e y i e l d o f b i l e p i g m e n t

o b t a i n e d f r o m t h e b l o o d o r f r o m s t r o n g s o l u t i o n s o f h a e m o g l o b i n c a n n o l o n g e rb e n e g l e c t e d i n t h e e s t i m a t i o n o f t h e r e c o v e r y o f a d d e d b i l e p i g m e n t . W e t h e r e -f o r e m e a s u r e d t h e amount o f b i l e p i g m e n t t h a t c a n b e i s o l a t e d f r o m r e d c e l l s i no n e s a m p l e a n d d e t e r m i n e d t h e d e g r e e o f r e c o v e r y o f a d d e d b i l i v e r d i n i n as e c o n d s a m p l e o f t h e s a m e r e d c e l l s o l u t i o n . I n o r d e r t o a v o i d o x i d a t i o n o f t h eb i l i v e r d i n , a s c o r b i c a c i d 5 0 m g . p e r 1 0 0 m l . ) w a s a d d e d i m m e d i a t e l y b e f o r ea c i d i f i c a t i o n w i t h a c e t i c a c i d .2 0 m l . o f f r e s h s h e e p c e l l s , t w i c e w a s h e d w i t h s a l i n e w e r e d i l u t e d t o 1 0 0 m l .w i t h w a t e r a n d h a e m o l y s e d . 5 0 m l . o f t h i s s o l u t i o n w e r e t r e a t e d w i t h a s c o r b i ca c i d a n d a c e t i c a c i d , w h i l e t o t h e s e c o n d l o t o f 5 0 m l . a s o l u t i o n o f 2 2 2 , u g . b i l l -v e r d i n i n 1 m l . d i l u t e ammonia was a d d e d b e f o r e t h e y w e r e t r e a t e d i n t h e s a m ew a y . B o t h s a m p l e s w e r e w o r k e d up i n t h e manner d e s c r i b e d w i t h a f e w m o d i f i -c a t i o n s . W i t h t h e h i g h p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s g r e a t c a r e h a d t o b e t a k e n t o a v o i dt h e f o r m a t i o n o f e m u l s i o n s . T h e g r e a t e r p a r t o f t h e p r o t e i n w a s p r e c i p i t a t e d b yt h e a d d i t i o n o f s o m e w h a t m o r e e t h e r t h a n was u s e d f o r t h e r e c o v e r y o f b i l ep i g m e n t f r o m d i l u t e s o l u t i o n , a n d f i l t e r e d o f f b e f o r e t h e a d d i t i o n o f s o d i u ma c e t a t e s o l u t i o n a n d w a t e r . I t was i m p o s s i b l e t o a v o i d p r e c i p i t a t i o n o f s o m eh a e m i n f r o m t h e e t h e r b e f o r e c o m p l e t e r e m o v a l o f t h e p r o t e i n ; t h i s w a s f i l t e r e do f f f r o m t h e e t h e r e a l s o l u t i o n , o r i f t h e r e wa s n o t s o much a s t o d i s t u r b t h es e p a r a t i o n o f t h e l a y e r s , f r o m t h e a c i d e x t r a c t s , w h i c h h a d t o b e f i l t e r e d i n a n yc a s e . B o t h s a m p l e s w e r e w o r k e d up i n p r e c i s e l y p t h e s a m e m a n n e r . - 6 2 , u g . b i l ep i g m e n t 4 2 u g . b i l i v e r d i n a n d 1 6 j i g . b i l i v i o l i n ) w e r e i s o l a t e d f r o m t h e f i r s ts a m p l e a n d 1 6 2 , u g . b i l i v e r d i n f r o m t h e s e c i d . From t h e a d d e d 2 2 2 p g . t h u so n l y 1 6 2 -46 = 1 1 6 j u g . =5 2 / w e r e r e c o v e r e d .

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3 7 8 R . LEMBERG, W. H . LOCKWOOD AND J . W. LEGGEI f i t i s a s s u m e d t h a t t h e same p e r c e n t a g e o f t h e b i l e p i g m e n t s e t f r e e b ys p l i t t i n g t h e b i l e p i g m e n t - h a e m o g l o b i n o f t h e r e d c e l l s i s r e c o v e r e d a s f r o m a d d e db i l i v e r d i n , a n d t h a t t h e b i l e p i g m e n t - h a e m o g l o b i n o f t h e r e d c e l l s i s s p l i t t o t h es a m e d e g r e e a s c h o l e g l o b i n o r v e r d o g l o b i n , t h e a m o u n t o f b i l e p i g m e n t f o u n d h a s

t o b e m u l t i p l i e d b y - t h e f a c t o r 1 2 0 1 . 5 . , 8 4 = 4 8 0 i n o r d e r t o o b t a i n t h e a m o u n to f b i l e p i g m e n t - h a e m o g l o b i n , f r o m w h i c h i t was d e r i v e d . 1 6 2 p g . b i l e p i g m e n tt h u s c o r r e s p o n d t o 2 9 - 8 m g . b i l e p i g m e n t - h a e m o g l o b i n . S i n c e t h e 1 0 m l . o f l a k e dc e l l s c o n t a i n e d 3 2 7 0 - m g . h a e m o g l o b i n , o n l y 0 - 9 o f t h e r e d c e l l h a e m o g l o b i nw a s b i l e p i g m e n t - h a e m o g l o b i n .I n a s e c o n d s a m p l e 8 - 7 5 m l . o f s h e e p e r y t h r o c y t e s c o n t a i n i n g 28 g . h a e m o -g l o b i n y i e l d e d 6 6 - 2 u g . b i l e p i g m e n t 4 5 . 7 p g . b i l i v e r d i n a n d 2 0 5 1 g . b i l i v i o l i n )w i t h o u t t h e a d d i t i o n o f a s c o r b i c a c i d , w h i l e w i t h a s c o r b i c a c i d o n l y 4 6 M g . 2 3 p g . b i l i v i o l i n a n d 2 3 u g . b i l i v e r d i n ) w e r e o b t a i n e d . T h e s e v a l u e s c o r r e s p o n dt o b i l e p i g m e n t c o n t e n t s o f 11 a n d 08 .I I o r s e e r y t h r o c y t e s w e r e n o t s t u d i e d q u a n t i t a t i v e l y , b u t q u a l i t a t i v e l y t h e yg a v e t h e s a m e r e s u l t s . S i m i l a r y i e l d s t o t h o s e f r o m s h e e p r e d c e l l s w e r e o b t a i n e df r o m s o l u t i o n s o f c r y s t a l l i n e h o r s e o x y h a e m o g l o b i n . 5 0 m l . o f a 5 - 7 s o l u t i o ng a v e 7 6 p g . , b i l e p i g m e n t 3 9 , u g . v e r d i n a n d 3 7 , g . v i o l i n ) , c o r r e s p o n d i n g t o ab i l e p i g m e n t - h a e m o g l o b i n c o n t e n t o f 1 - 3 , when C O - h a e m o g l o b i n w a s s p l i t i nt h e p r e s e n c e o f 5 0 m g . a s c o r b i c a c i d , w h j l e t h e s p l i t t i n g o f t h e o x y h a e m o g l o b i nw i t h o u t a s c o r b i c a c i d g a v e h e r e a . s m a l l e r y i e l d o f 3 5 M g . o f w h i c h 3 0 M u g . w e r ev i o l i n ) c o r r e s p o n d i n g t o 0 - 6 % b i l e p i g m e n t - h a e m o g l o b i n .T h e s e ' e s t i m a t i o n s a r e - n o t v e r y a c c u r a t e , b u t w h i l e p r o v i n g t h e p r e s e n c e o fs o m e b i l e p i g m e h t - h a e m o g l o b i n i n r e d c e l l s , . t h e y make i t u n l i k e l y t h a t . b i l ep i g m e n t - h a e m o g l o b i n c o n s t i t u t e s m o r e t h a n a p a r t o f t h e l a b i l e i r o n o f t h eb l o o d . S i n c e s p l i t t i n g i n t h e p r e s e n c e o f a s c o r b i c a c i d a n d o f CO d e c r e a s e s t h ey i e l d o f b i l e p i g m e n t l i t t l e , i f a t - a l l , t h e l a t t e r c a n n o t b e d e r i v e d t o a l a r g e e x t e n tf r o m o x i d a t i v e p r o c e s s e s o c c u r r i n g d u r i n g t h e a c i d i f i c a t i o n o f o x y h a e m o g l o b i ns o l u t i o n s , b u t m u s t b e d e r i v e d , a t l e a s t p a r t l y , f r o m b i l o p i g m e n t - h a e m o g l o b i np r e f o r m e d i n t h e r e d c e l l s . T h e b i l i v i o l i n o b t a i n e d a p p e a r e d t o b e o f t h e w e a k l y ,b a s i c t y p e I I I , b u t n o t s u f f i c i e n t m a t e r i a l was a v a i l a b l e t o i d e n t i f y i t w i t h t h eb i l i v o l i n I I I a o b t a i n e d f r o m c h o l e g l o b i n .

SUMMARYOn s p l i t t i n g w i t h a c e t i c a c i d c h o l e g l o b i n y i e l d s b i l i v e r d i n a n d a w e a k l y b a s i cb i l i v i o l i n b i l i v i o l i n I I I a ) . C h o l e h a e m o c h r o m o g e n g r e e n p i g m e n t ) g i v e s s m a l la m o u n t s o f t h e s a m e p r o d u c t s , b u t t h e g r e a t e r p a r t o f t h e p r o s t h e t i c g r o u p h a sb e c o m e f i r m n y a t t a c h e d t o t h e d e n a t u r e d p r o t e i n . On s p l i t t i n g w i t h f e r r o u s

a c e t a t e - a c e t i c a c i d - h y d r o c h l o r i c a c i d g r e e n p i g m e n t y i e l d s s m a l l amounts o f ah y d r o x y p o r p h y r i n . V e r d o h a e m o c h r o m o g e n i s s p l i t b y a c i d s t o b i l i v e r d i n a n d ab i l i v i o l i n o f m e d i u m b a s i c i t y b i l i v i o l i n I I b ) .Q u a n t i t a t i v e m e t h o d s a r e w o r k e d o u t a l l o w i n g t h e i s o l a t i o n o f b i l e p i g m e n t sf r o m s o l u t i o n s t h a t c o n t a i n o x y y h a e m o g l o b i n , a n d f o r t h e i r s p e c t r o p h o t o m e t r i ca n d c o l o r i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n . ' A n a v e r a g e r e c o v e r y o f 8 5 / i s o b t a i n e d . B i l i -v e r d i n i s o x i d i z e d d u r i n g t h e a c t i o n o f a c i d s on o x y h a e m o g l o b i n t o b i l i v i o l i n I I b ,a n d t h i s o x i d a t i o n i s p r e v e n t e d b y a s c o r b i c a c i d .V e r d o h a e m a t i n i s s p l i t t o b i l e p i g m e n t s b y 6 6 % a c e t i c a c i d t o a n e x t e n t o f2 5 - 3 5 , v e r d o g l o b i n t o 1 0 - 1 5 . T h e b i l e p i g m e n t y i e l d f r o m c h o l e g l o b i n i s11-12 i n t h e i n i t i a l p h a s e s o f t h e c o u p l e d o x i d a t i o n o f h a e m o g l o b i n a n da s c o r b i c a c i d , i n w h i c h n o b y - p r o d u c t i s f o r m e d . L a t e r c o n s i d e r a b l y more b i l ep i g m e n t i s o b t a i n e d . T h i s b i l e p i g m e n t , n o t d e r i v e d f r o m c h o l e g l o b i n , i s b i l i v e r d i n

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FORMATION OF BILE PIGMENTS 3 7 9a n d t h e b y - p r o d u c t i s p r o b a b l y a n i r o n - f r e e b i l i v e r d i n - p r o t e i n c o m p o u n d . P r o -l o n g e d a c t i o n o f a s c o r b i c a c i d o n c h o l e g l o b i n i s t h u s a b l e t o r e m o v e t h e i r o n h e l di n c o m p l e x c o m b i n a t i o n i n c h o l e g l o b i n a n d t o n e t f r e e b i l i v e r d i n a t a p h y s i o -l o g i c a l pH.S m a l l a m o u n t s o f b i l e p i g m e n t s b i l i v e r d i n a n d b i l i v i o l i n ) w e r e o b t a i n e d b yt r e a t m e n t w i t h a c e t i c a c i d f r o m l a k e d r e d c e l l s o f s h e e p a n d h o r s e a s w e l l a sf r o m c r y s t a l l i n e h o r s e o x y h a e m o g l o b i n . P r o v i d e d t h a t t h e b i l e p i g m e n t : h a e m o -g l o b i n , f r o m w h i c h t h e s e b i l e p i g m e n t s a r e d e r i v e d , i s s p l i t t o t h e s a m e d e g r e e a sc h o l e g l o b i n , a n d t h a t t h e p e r c e n t a g e o f r e c o v e r y o f t h e s e b i l e p i g m e n t s i s t h es a m e a s t h a t o f a d d e d b i l i v e r d i n 5 2 ) , o n l y a b o u t 1 o f t h e r e d c e l l i r o n i s b i l ep i g m e n t - h a e m o g l o b i n i r o n .

REFERENCESE d l l a c h e r & v . S e g e s s e r 1 9 3 7 ) . N a t u r w 7 i 8 e n 8 c 7 h a f t e n , 2 5 , 4 6 1 , 5 5 7 , 6 6 7 .F i s c h e r , G e b h a r d t & R o t h h a a s 1 9 3 0 ) . L i e b i g p A n n . 4 8 2 , 1 .

- H a l b i g & W a l a c h ( 1 9 2 , 7 ) . L i e b i p g A n n . 4 5 2 , 2 6 8 .H o l d e n & L e m b e r g 1 9 3 9 ) . A u s t . J . e x p . B i o l . m e d . S c i . 1 7 , 1 3 3 .L e m b e r g 1 9 3 5 ) . B i o c h e m . J . 2 9 , 1 3 2 2 .C r t i s - J o n e s & N o r r i e 1 9 3 8 ) . B i o c h e m . J . 3 2 , 1 7 1 .- - L e g g e & L o c k w o o d 1 9 3 8 ) . N a t u r e , L o n d . , 1 4 2 , 1 4 8 .& L o c k w o o d 1 9 3 8 ) . J . r o y . S o c . N . S . W . 7 2 , 6 9 .N o r r i e & L e g g e ? 9 3 9 ) . N a t u r e , L o n d . , 1 4 4 , 5 5 1 .L i b o w i t z k y & F i s c h e r 1 9 3 8 ) , H o p p e - S e y l . Z . 2 5 5 , 2 0 9 .

B i o c h e m . 1 9 4 1 , 3 5 . 2 5