Revista Colombiana de Entomologa 32(2): 165-171 (2006)

Interaccin de Leishmania (L.) chagasi

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Interaccin de Leishmania (L.) chagasi con la lnea celular Lulo en diferentes condiciones ambientalesInteraction of Leishmania (L.) chagasi with the Lulo cell line in different environmental conditionsVCTOR ACERO1, EDNA GALEANO1, MARTHA AYALA2, JAIME CASTELLANOS3, FELIO BELLO4

Resumen. Existen eventos desconocidos o pobremente comprendidos en las interacciones Leishmaniaclula hospedera que ameritan estudios en nuevos modelos in vitro. El propsito del presente trabajo fue evaluar, teniendo en cuenta variables de temperatura, concentracin de C02 y cambios morfomtricos de las clulas, la interaccin de Leishmania chagasi con una lnea celular (Lulo), previamente establecida, derivada de tejidos embrionarios de Lutzomyia longipalpis. La lnea celular J774 se utiliz como control positivo de la infeccin. La cepa MH/CO/84/CI-044B de L. chagasi se us para los ensayos de infeccin. Los parsitos se adicionaron a las clulas adheridas, tanto de Lulo como de J774, en una proporcin de 5:1. La incubacin se efectu a 28C y 37C, en ausencia ypresencia de CO2. Se realiz un estudio morfomtrico de las clulas antes y despus de la infeccin. Las caractersticas ultraestructurales, tanto del parsito como de las clulas, se analizaron por microscopa electrnica. El mayor porcentaje de infeccin en las clulas Lulo a 28C se registr el da seis post-infeccin (26,8%), mientras que a 37C, sin atmsfera de CO2, el mximo valor (30,4%) se obtuvo el da nueve. Los anlisis morfomtricos mostraron un aumento significativo en el tamao de las clulas infectadas de Lulo a 28C y de J774 a 37C con y sin atmsfera de CO2 respectivamente. Palabras clave: Caractersticas ultraestructurales. Temperatura y CO2. Promastigote. Porcentaje de Infeccin. Morfometra celular. Abstract. There are unknown or poorly understood events in the Leishmania-host cell interactions that merit studies in new in vitro models. The aim of the present work was to evaluate Leishmania chagasi interaction with a cell line (Lulo) previously established and derived from Lutzomyia longipalpis embryonic tissues, bearing different temperatures and CO2 concentrations in mind and morphometric changes of the cells. The J774 cell line was used as positive control of the infection. The L. chagasi MH/CO/84/CL-044B strain was used for infection assays. The parasites were added to adherent cells, in Lulo as well as J774, in a 5:1 ratio. Incubation was at 28C and 37C, in the absence and presence of CO2. A morphometric study of the cells was carried out before and after infection. Both parasite and cell ultrastructure characteristics were analyzed by electron microscope. The greatest percentage of infection in the Lulo cells at 28C (26,8%) was registered on day six post infection, while at 37C, in the absence of CO2, the maximum value (30,4%) was obtained on day nine. The morphometric analyses showed a significant increase in the size of Lulo cells infected at 28C and J774 cells at 37C with and without CO2, respectively. Key words: Ultrastructure characteristics. Temperature and CO2. Promastigote. Percentage of infection. Cell morphometry. Introduccin Los protozoos flagelados del gnero Leishmania son parsitos intracelulares obligados que asumen durante su ciclo de vida varios estados morfolgicos y funcionales (Abdulrahman et al. 1998). Sin embargo, experimentalmente se ha encontrado en el canal alimenticio del flebtomo, despus de una segunda comida de sangre y en das avanzados de infeccin, formas del parsito semejantes a amastigotes (Aez et al. 2003) esto1 2 3 4

plantea nuevos interrogantes sobre el ciclo biolgico del parsito, particularmente en el vector. El desarrollo del ciclo biolgico de los parsitos del gnero Leishmania puede ser experimentalmente estudiado in vivo e in vitro. En el primer caso se utilizan hembras de flebtomos para inducir la transformacin de especies de Leishmania, particularmente de la forma amastigota a la promastigota, mediante la ingesta de sangre que contiene amastigotes, tomada a travs de membranas artificiales. La diferenciacin de los

promastigotes ocurre en el intestino del insecto, donde adems stos se replican y pueden observarse en diferentes estados morfolgicos; luego la transmisin se realiza en condiciones de laboratorio por la picadura a ratones hmsters (Bates 1997; Killick-Kendrick 1986; Molyneux y Killick-Kendrick 1986). Experimentos in vitro emplean clulas de exudado peritoneal de ratones y hmsters, igualmente clulas macrofgicas tumorales de ratn para reproducir los mecanismos de diferenciacin,

Laboratorio de Investigaciones en Entomologa, Biologa Celular y Gentica, Departamento de Ciencias Bsicas, Universidad de La Salle, Bogot, D. C., Colombia. victoraceromv@yahoo.es Laboratorio de Parasitologa, Instituto Nacional de Salud de Colombia, Bogot, D.C., Colombia. mayalas@ins.gov.co Instituto de Virologa, Universidad El Bosque, Bogot, D.C., Colombia. castellanosjaime@unbosque.edu.co Instituto de Ciencias Bsicas, Facultad de Medicina, Universidad del Rosario, Bogot, D.C., Calle 63D No. 24-31, Telfono: (571) 3474570, extensin 257; fax: (571) 3101275. E-mail: fbello@urosario.edu.co

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replicacin y maduracin de los parsitos (Aikawa et al. 1982; Pearson et al. 1981; Chang y Dwyer 1976). De forma similar, estos eventos se han podido estudiar en lneas celulares de origen no macrofgico, principalmente en cultivos de fibroblastos (Hrvas-Rodriguez et al. 1996; Corte-Real 1995; Schwartzman y Pearson 1985; Dedet et al. 1983; Chang 1978, 1979; Mattock y Petters 1975). Por otra parte, los medios axnicos que frecuentemente se emplean para mantener estos parsitos en condiciones de laboratorio se han usado para lograr la transformacin in vitro de Leishmania, principalmente de la forma promastigote a la amastigote, mediante temperaturas elevadas y pH cidos (Aquino et al. 2002; Saar et al. 1998; Len et al. 1995; Hodgkinson et al 1996; Bates et al. 1992, 1993, 1994; Zilberstein 1991; Pan 1984). Los cultivos celulares de insectos vectores se emplean en forma extensiva para estudios in vitro de arbovirus y tambin, en investigaciones biomdicas y tecnolgicas (Crampton et al. 1997; Igarashi 1985, 1978; Kuno et al. 1985; Singh 1967; Kitamura 1965). En esta ltima lnea de accin, han empezado tambin a explorarse los usos en estudios de cocultivos con parsitos (Fampa et al. 2003; Leake 1997), cobrando esta situacin particular relevancia si se tiene en cuenta que, a pesar de los adelantos obtenidos con la implementacin de tecnologas avanzadas para el estudio in vivo e in vitro de los parsitos del gnero Leishmania, an existen procesos bioqumicos, inmunolgicos y moleculares desconocidos o pobremente conocidos en las interrelaciones parsito-hospedero y parsito-vector que ameritan la utilizacin de nuevos modelos celulares, que permitan enfocar la atencin a los eventos que ocurren entre los parsitos y las clulas derivadas del vector. En un trabajo preliminar Bello et al. (2005) describieron el proceso de infeccin experimental de L. chagasi Marques da Cunha & Chagas en la lnea celular Lulo, sustratos celulares que provienen de tejidos embrionarios de L. longipalpis, el vector primario de este parsito en su ambiente natural; Estos autores compararon este proceso con otro desarrollado paralelamente en las clulas J774, tomando como referencia de la evaluacin de ambos procesos los das post-infeccin dos, cuatro, seis, ocho y 10. Sin embargo, no se valuaron factores ambientales ni cambios morfomtricos de las clulas. En el presente trabajo se evalu la inte-

raccin de L. chagasi con la lnea celular Lulo (Rey et al. 2000) teniendo en cuenta variables de temperatura y concentracin de CO2, para determinar, mediante microscopa de luz, los porcentajes e ndices de infeccin y las modificaciones morfolgicas celulares inducidas por la interaccin con el parsito. Se analizaron adems las caractersticas ultraestructurales del parsito y de las clulas con el apoyo de microscopa electrnica. Materiales y Mtodos El trabajo se realiz en el Laboratorio de Entomologa, Biologa Celular y Gentica, de la Universidad De La Salle, tuvo una duracin de un ao y medio (20032005). Parsitos. Se utiliz la cepa MH/CO/84/ CL-044 de L. chagasi, suministrada por el laboratorio de Parasitologa del Instituto Nacional de Salud de Colombia, la cual se mantuvo en el medio NNN bifsico modificado con Schneiders y enriquecido con suero fetal bovino (SFB) (Gibco) inactivado al 10% e incubado a 26C. Cultivos celulares. Se emple la lnea celular Lulo (Rey et al. 2000) derivada de explantes de tejidos embrionarios del flebtomo L. longipalpis (Lutz y Neiva 1913), principal vector de L. chagasi (Cunha y Chagas 1937). Esta lnea celular se mantuvo in vitro en una mezcla de medio L-15 (Sigma) y Grace (Sigma), suplementado con 5% de suero fetal bovino (SFB), penicilina 100 unidades/ml y estreptomicina 100 g/ml (Gibco), a 28C. Los subcultivos se efectuaron por remocin mecnica, previa observacin de la monocapa confluente. Como control positivo de la infeccin se utiliz la lnea celular J774, aislada de clulas reticulares de un sarcoma de ratn (Mus musculus) BALB/c, establecida por Ralph et al (1975). Para el mantenimiento de estas clulas se utiliz el medio RPMI (Sigma), suplementado con SFB inactivado al 5% y la incubacin se realiz a 37C. Para los ensayos de infeccin, conteo y morfometra, una vez se alcanz la confluencia en la monocapa de ambas lneas celulares, se removieron mecnicamente las clulas y a continuacin se centrifugaron a 900 g por 10 min, el botn de clulas se resuspendi en el medio L15/Grace, se hizo conteo y se sembraron aproximadamente 2 x 105 clulas por cada pozo sobre laminillas de 12 mm de dimetro, en cajas de 24 pozos y se deja-

ron en crecimiento por 24 horas hasta lograr adherencia completa de las clulas. Infeccin. A cada pozo de la caja de cultivo se adicion 1 ml de una suspensin de parsitos en forma de promastigote (1 6 x 10 parsitos/ml), stos se tomaron en la fase estacionaria y la proporcin aproximada parsito/clula fue de 5:1 (Pessotti et al. 2004; Fampa et al. 2003). Luego, se llevaron a incubacin a 28C y a 37C por 24 horas. Rplicas exactas sin parsitos fueron incubadas al mismo tiempo como controles. Las cajas de cultivo incubadas sin CO2 a ambas temperaturas fueron selladas con Parafilm. Las cajas incubadas en ambiente de CO2 al 5% no se sellaron, para permitir el intercambio gaseoso. Despus de 24 horas de incubacin, todas las clulas fueron lavadas con solucin salina para retirar el exceso de parsitos y se adicion medio fresco L-15/Grace. Los cultivos se observaron diariamente con un microscopio invertido (Olympus CK2). Al tercer da post-infeccin, se retir el medio de cultivo de todos los pozos y se sacaron las laminillas correspondientes a ese da, al resto de pozos se les adicion medio fresco. El mismo procedimiento se realiz en los das seis y nueve post-infeccin. Las laminillas se dejaron secar al ambiente por una hora y posteriormente se fijaron con metanol absoluto (Merck) por 24 horas. Luego fueron teidas con el colorante de Giemsa (Merck) al 10% durante 10 minutos, se lavaron con agua destilada para retirar los excesos de colorante y se dejaron secar durante 24 horas. Finalmente, se les realiz un montaje permanente sobre lminas portaobjetos con Entelln (Merck). Conteos y anlisis de infeccin. Las laminillas con ambos tipos de clulas se observaron en un fotomicroscopio (Olympus BX60) con objetivo de inmersin (100X) para realizar el conteo de las clulas infectadas y el nmero de amastigotes en cada una de ellas. Se contaron en promedio 200 clulas por cada laminilla y fueron evaluadas cuatro de tres experimentos independientes. Se determin el porcentaje e ndice de infeccin; este ltimo parmetro se calcul multiplicando el porcentaje de infeccin celular por el promedio de amastigotes/ clula (Lonardoni et al. 2000). Las variables que se tuvieron en cuenta en el proceso de infeccin fueron: a) temperaturas de 28 y 37C y b) presencia o ausencia de CO2.

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Morfometra celular. A clulas no infectadas e infectadas de ambas lneas celulares (J774 y Lulo), tomadas de las monocapas confluentes, se les realiz un anlisis morfomtrico. Se capturaron imgenes de todas las condiciones experimentales, mediante una cmara Sony Hyper HAD adaptada a un microscopio de luz (Olympus CH30). Se digitalizaron aproximadamente 400 clulas por cada variable utilizada en los experimentos, con el fin de comparar el rea, eje mayor y menor de las clulas seleccionadas. El proceso de medicin se realiz con el software Image Pro-Plus (Media Cybernetics). Microscopa electrnica de transmisin. Cultivos celulares de Lulo, contenidos en cajas de 35 mm de dimetro se incubaron a 28C, en ausencia de CO2 y se infectaron con promastigotes de L. chagasi. Los cultivos celulares infectados se fijaron con glutaraldehdo fresco al 3% disuelto en buffer fosfato 0,1 M con un pH 7,2, durante una hora a 4C. Luego, se lavaron por cinco minutos tres veces inmersos en el anterior buffer y fueron post-fijadas por una hora con tetrxido de osmio al 1%. A continuacin, se lavaron de nuevo, fueron deshidratadas en una serie ascendente de alcoholes y embebidas en Epon (Polyscience). Se obtuvieron secciones ultradelgadas usando un ultramicrtomo y se tieron con acetato de uranil y citrato de plomo. Las muestras se examinaron en un microscopio electrnico de transmisin marca Zeiss EM 110 (Almeida de Faria et al. 1999). Anlisis estadstico. A los datos de las infecciones se les hizo una transformacin angular (arcoseno de la raz cuadrada de la proporcin) y fueron sometidos a un test de ANOVA de una va y a una prueba de comparaciones mltiples de Student Newman-Keuls, usando el programa Simstat para Windows (Versin 1.31). Las proporciones de infeccin a 28 y 37C y los valores obtenidos con y sin atmsfera de CO2, se compararon usando la prueba t de Student. La variable de rea celular se analiz usando un test Kolmogorov-Smirnov (Young 1977). Resultados Infeccin celular. Se registr infeccin de las clulas con el parsito en todos los ensayos. Este se observ en forma de amastigote en las vacuolas parasitforas, lo cual indica que previamente hubo internalizacin de los promastigotes, conversin a las formas amastigotes y multi-

plicacin intravacuolar. Sin embargo, la intensidad de este proceso dependi de las variables utilizadas. Hubo resistencia de los promastigotes para desprenderse de las clulas, al realizarse los lavados con solucin salina 24 horas post-infeccin, indicativo de fuerte adherencia de los parsitos a la membrana celular. En el control positivo con clulas J774 fue evidente el proceso infectivo, mediante el registro de amastigotes en las vacuolas parasitforas. En la figura 1a se muestra una clula Lulo con amastigotes intracelulares. Porcentaje de infeccin. El da seis se registr el mayor porcentaje de infeccin (26,8%), en la lnea celular Lulo infectada y mantenida a 28C sin atmsfera de CO2, mientras que en los das tres y nueve, los valores correspondieron a 10,8% y 14,1%, respectivamente. A 37C sin atmsfera de CO2, para los das post-infeccin tres y seis se determinaron porcentajes relativamente altos de infeccin (16,8% y 15,1% respectivamente); sin embargo, el da nueve mostr el mayor registro de infeccin (30,4%). El mayor porcentaje de infeccin (19,6%) en las clulas Lulo a 37C con una atmsfera de 5% de CO2 se registr el da nueve. Los experimentos con el control positivo de la infeccin (clulas J774), en ausencia de CO2, mostraron que a 37C hubo mayor infeccin celular en el da tres (44,8%). De forma similar, con 5% de CO2 el mayor porcentaje de infecA

cin (42,8%) ocurri al tercer da, presentndose una ligera disminucin a medida que el perodo post-infeccin se prolong. El test Student del porcentaje promedio de infeccin indic diferencias entre las clulas Lulo infectadas a 28C (17,2%) y las clulas infectadas a 37C (20,8%) sin atmsfera de CO 2 (P=0,0002). Igualmente, se encontraron diferencias entre las clulas Lulo infectadas a 37 C (20,7%) y los resultados a la misma temperatura de incubacin con 5% de CO 2 (14,4%) (P=0,0000002) (Tabla 1). Nmero de amastigotes por clula. En la lnea celular Lulo a 28C, observamos que al avanzar en los das de infeccin aument progresivamente el nmero de amastigotes por clula, con el valor promedio ms alto (7,6) el da nueve. Contrariamente, en las clulas Lulo a 37C sin CO2 se registraron 3,6 amastigotes/ clula en el da seis; mientras que para los das tres y nueve post-infeccin, correspondieron a valores de 2,5 y 2,9 respectivamente. Cuando las clulas Lulo se incubaron en una atmsfera de 5% de CO2 el nmero fue de 3,6 amastigotes/ clula, para el da seis al contrario de lo que ocurri el da nueve, cuyo valor fue el ms bajo (2,6). En el control positivo de la infeccin a 37C, con y sin atmsfera de CO2, se observ mayor registro de parsitos por clula para el da tres; encontrndose 11,9 para el caso de clulas incubadas con CO2 y 12,9 para las cultivadas sin CO2.B

Figura 1. A. Clula Lulo infectada con el parsito Leishmania chagasi, se observan amastigotes (flechas) al interior de vacuolas parasitforas. 100X. B. Microfotografa de una clula Lulo infectada. Se muestran dos amastigotes dentro de una gran vacuola (cabezas de flecha), en estas formas del parsito se distinguen subestructuras, tales como saco flagelar y microtbulos caractersticos (21600X, escala = 1m).

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ndice de infeccin. El mayor ndice de infeccin se registr en la lnea celular J774 con un promedio (calculado con los datos de los tres das) de 413,9 en ausencia de CO2; en la lnea celular Lulo a 28C se obtuvo un promedio de 104,5, siendo ms alto en comparacin con Lulo a 37C con atmsfera de CO2 (61,5) y sin atmsfera de CO2 (40,4) (Tabla 1). Morfometra celular. Las mediciones de rea celular para la lnea Lulo, evidenciaron el pleomorfismo de esta lnea, pues las clulas se agruparon principalmente en tres rangos de rea, las ms numero2 sas, pequeas (menores de 50 m ), las 2 intermedias (con reas entre 51 y 90 m ) y las grandes (con reas mayores a 90 m2) (Fig. 2A barras grises). Se compar entre las clulas infectadas en las diferentes condiciones y se registr un aumento significativo de la proporcin de clulas pequeas infectadas a 37C con CO 2 (65,1%) con respecto a los controles de infeccin sin CO2 a 28 C (54,8%) (Test de Kolmogorov-Smirnoff, p 90

PO RC ENTAJE DE CELU LAS

E ? ) AR ( AREAA(m 2m 2 )

A60

50

PO RCENT AJE DE CELULAS

40

30

20

10

0 16 - 30 31 - 50 51 - 702

71 - 902

91 - 110

> 110

AREA (( ? m ) AR EA m )

B Figura 2. Histograma de distribucin de frecuencias. A: Clulas Lulo segn su rea celular, bajo varias condiciones. Barra gris, anlisis morfomtrico de las clulas Lulo no infectadas, se muestra un promedio de las clulas mantenidas en dos diferentes temperaturas, pues la distribucin es la misma, independiente de la temperatura de mantenimiento (28 y 37 C). Solamente se observaron diferencias significativas en el test de Kolmogorov-Smirnoff al comparar las clulas infectadas y mantenidas a 37 C en ambiente de CO 2 con respecto al control (barras oscuras). El mantenimiento de clulas infectadas sin atmsfera de CO 2 a 28C (barra con diagonales) y a 37C (barra blanca), no produjo cambios en los rangos de rea presentes, en comparacin con las clulas sin el parsito (p>0,05). B: Clulas J774. Barra oscura, anlisis morfomtrico de las clulas J774 no infectadas. La presencia o ausencia de CO2 en estas clulas no cambi la distribucin en cada rango de rea. Las barras blancas corresponden a clulas infectadas e incubadas a 37C sin CO2. Las barras grises muestran el comportamiento de las clulas infectadas e incubadas en ambiente de CO2. Se encontr que la distribucin de las poblaciones es estadsticamente diferente entre clulas infectadas vs. clulas no infectadas y tambin si se infectaron en presencia o no de CO2 (Test de Kolmogorov-Smirnoff, p