1998 association of genetic variation of the transforming growth

7/29/2019 1998 Association of Genetic Variation of the Transforming Growth

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A m . J . H u m . G e n e t . 4 5 : 3 4 8 - 3 5 3 , 1 9 8 9

A s s o c i a t i o n o f G e n e t i c V a r i a t i o n o f t h e T r a n s f o r m i n g GrowthF a c t o r - A l p h a Gene w i t h C l e f t L i p a n d P a l a t eH o l l y H . A r d i n g e r , * K e n n e t h H . B u e t o w j G r a e m e 1 . B e l l , J a n u z B a r d a c h tD u a n e R . V a n D e m a r k , t a n d J e f f r e y C . M u r r a y *' D i v i s i o n o f M e d i c a l G e n e t i c s , D e p a r t m e n t o f P e d i a t r i c s , a n d T D e p a r t m e n t o f O t o l a r y n g o l o g y , U n i v e r s i t y o f Iowa, I o w a C i t y ;V F o x C h a s e C a n c e r C e n t e r , P h i l a d e l p h i a ; a n d S H o w a r d H u g h e s M e d i c a l I n s t i t u t e , D e p a r t m e n t s o f B i o c h e m i s t r y a n d M o l e c u l a r B i o l o g ya n d o f M e d i c i n e , U n i v e r s i t y o f C h i c a g o , C h i c a g o

SummaryC o m p l e x s e g r e g a t i o n a n a l y s i s o f p e d i g r e e s h a v i n g n o n s y n d r o m i c c l e f t l i p w i t h o r w i t h o u t c l e f t p a l a t e( C L / P ) ( C h u n g e t a l . 1 9 8 6 ; M a r a z i t a e t a l . 1 9 8 6 ) h a s s h o w n t h a t a m a j o r - l o c u s m o d e l b e s t e x p l a i n s t h eo b s e r v e d recurrence o f CL/P i n C a u c a s i a n f a m i l i e s . T o i d e n t i f y t h i s m a j o r gene, we c o m p a r e d t h e f r e q u e n -c i e s o f 1 2 R F L P s a t f i v e l o c i - e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r , t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - a , e p i d e r m a l g r o w t hf a c t o r r e c e p t o r , g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r , a n d e s t r o g e n r e c e p t o r - i n b o t h a g r o u p o f 8 0 s u b j e c t s w i t h non-s y n d r o m i c C L / P a n d 1 0 2 c o n t r o l s . T h e s e c a n d i d a t e genes w e r e s e l e c t e d b e c a u s e s t u d i e s i n r o d e n t s h a d sug-g e s t e d t h e i r p o s s i b l e i n v o l v e m e n t i n p a l a t o g e n e s i s . A s i g n i f i c a n t a s s o c i a t i o n was o b s e r v e d b e t w e e n t w oR F L P s a t t h e t r a n s f o r m i n g - g r o w t h - f a c t o r - a ( T G F A ) l o c u s a n d t h e o c c u r r e n c e o f c l e f t i n g ( P = . 0 0 4 7 a n d P= . 0 0 5 2 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t e i t h e r t h e TGFA ge n e i t s e l f o r DNA seq u e n c es i n an a d j a c e n t r e g i o n c o n t r i b -u t e t o t h e d e v e l o p m e n t o f a p o r t i o n o f cases o f C L / P i n h u m a n s a n d p r o v i d e s an o p p o r t u n i t y t o b e g i n t oe x a m i n e t h e m o l e c u l a r e v e n t s u n d e r l y i n g l i p a n d p a l a t e f o r m a t i o n .

I n t r o d u c t i o nC l e f t l i p w i t h o r w i t h o u t c l e f t p a l a t e ( C L / P ) i s o n e o ft h e m o s t common b i r t h d e f e c t s , a f f e c t i n g 1 / 7 0 0 - 1 / 1 , 0 0 0C a u c a s i a n s . S i n c e t h e r i s k o f r e c u r r e n c e o f C L / P w i t h i na f a m i l y i s 2 8 - 4 0 - f o l d g r e a t e r t h a n t h a t f o r t h e g e n e r a lp o p u l a t i o n , g e n e t i c f a c t o r s a r e t h o u g h t t o c o n t r i b u t et o t h e d e v e l o p m e n t o f t h i s d i s o r d e r . I t h a s b e e n s u g -g e s t e d t h a t n o n s y n d r o m i c c l e f t i n g i n h u m a n s i s m o s tl i k e l y d u e t o a c o m b i n a t i o n o f g e n e t i c a n d e n v i r o n m e n t a lf a c t o r s a s d e s c r i b e d b y t h e m u l t i f a c t o r i a l t h r e s h o l dm o d e l ( C a r t e r 1 9 6 9 ; F r a s e r 1 9 7 6 ) .R e c e n t l y , C h u n g e t a l . ( 1 9 8 6 ) a n d M a r a z i t a e t a l .( 1 9 8 6 ) r e a n a l y z e d p u b l i s h e d D a n i s h p e d i g r e e d a t a o nC L / P b y u s i n g n e w m e t h o d s o f c o m p l e x s e g r e g a t i o na n a l y s i s . S e v e r a l a l t e r n a t i v e m o d e l s o f c l e f t i n g e t i o l o g yw e r e e x a m i n e d , i n c l u d i n g s p o r a d i c , m u l t i f a c t o r i a l , m a -

R e c e i v e d F e b r u a r y 3 , 1 9 8 9 ; r e v i s i o n r e c e i v e d May 1 , 1 9 8 9 .A d d r e s s f o r c o r r e s p o n d e n c e a n d r e p r i n t s : H o l l y H . A r d i n g e r , M . D . ,D i v i s i o n o f M e d i c a l G e n e t i c s , D e p a r t m e n t o f P e d i a t r i c s , U n i v e r s i t yo f I o w a , I o w a C i t y , I A 5 2 2 4 2 . 1 9 8 9 b y T h e A m e r i c a n S o c i e t y o f Human G e n e t i c s . A l l r i g h t s r e s e r v e d .0 0 0 2 - 9 2 9 7 / 8 9 / 4 5 0 3 - 0 0 0 2 $ 0 2 . 0 0

j o r g e n e a l o n e , a n d a m i x e d m o d e l . T h e p e d i g r e e d a t ab e s t f i t t e d t h e m o d e l o f a c t i o n o f a m a j o r g e n e w i t ha u t o s o m a l r e c e s s i v e i n h e r i t a n c e m o d i f i e d b y a d d i t i o n a lg e n e t i c a n d / o r e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s . T h i s m a j o r g e n ew a s p r e d i c t e d t o h a v e a f r e q u e n c y o f 3 . 5 % a n d t o a c -c o u n t f o r a b o u t o n e - t h i r d o f t h e C L / P c a s e s i n t h e D a n -i s h p o p u l a t i o n ( C h u n g e t a l . 1 9 8 6 ) .T o i d e n t i f y t h i s m a j o r g e n e , w e p e r f o r m e d a n a s s o c i -a t i o n s t u d y c o m p a r i n g g e n e t i c v a r i a t i o n a t c a n d i d a t eg e n e l o c i i n a g r o u p o f u n r e l a t e d c l e f t e d i n d i v i d u a l s w i t ht h a t o f a g r o u p o f c o n t r o l s . O u r h y p o t h e s i s w a s t h a to n e s p e c i f i c m u t a t i o n a l e v e n t i n a c a n d i d a t e g e n e m i g h tu n d e r l i e a s u b s t a n t i a l p o r t i o n o f c l e f t i n g i n C a u c a s i a n s .S u c h a m u t a t i o n c o u l d b e i d e n t i f i e d t h r o u g h i t s n o n -r a n d o m a s s o c i a t i o n w i t h n e a r b y R F L P s . T h e c a n d i d a t eg e n e s w e i n v e s t i g a t e d w e r e s e l e c t e d o w i n g t o t h e i r r o l ei n n o r m a l a n d a b n o r m a l p a l a t o g e n e s i s i n r o d e n t s ( P r a t te t a l . 1 9 8 0 ; F e r g u s o n 1 9 8 7 ) . T h e y i n c l u d e d t h e g l u c o -c o r t i c o i d r e c e p t o r ( G R L ) a n d e s t r o g e n r e c e p t o r ( E R ) ,w h i c h s h a r e b o t h s e q u e n c e a n d f u n c t i o n a l h o m o l o g y ,a n d e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r ( E G F ) a n d t r a n s f o r m i n gg r o w t h f a c t o r - a a n d t h e i r common r e c e p t o r , t h e EGFr e c e p t o r ( E G F R ) .

3 4 8


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T G F - A l p h a a n d C l e f t L i p a n d P a l a t eM a t e r i a l a n d MethodsP a t i e n t s

E i g h t y u n r e l a t e d C a u c a s i a n p a t i e n t s were r e c r u i t e dt h r o u g h t h e U n i v e r s i t y o f I o w a C l e f t P a l a t e C l i n i c a n dt h e I o w a R e g i o n a l G e n e t i c C o u n s e l i n g S e r v i c e . T h e s ep a t i e n t s , who w e r e b o r n b e t w e e n 1 9 5 6 a n d 1 9 8 7 , h a di s o l a t e d C L / P b u t no o t h e r a b n o r m a l i t i e s . T h e d i s t r i -b u t i o n o f d e f t t y p e was 29% b i l a t e r a l C L + P , 54%u n i l a t e r a l C L + P , 2% b i l a t e r a l C L , a p n d 15% u n i l a t e r a lC L . F a m i l y h i s t o r i e s f o r C L / P , as weff avp l e s , were c o l l e c t e d f r o m e a c h case a f t e r s i g n e d i n f o r m e dconsent was o b t a i n e d . A c o n t r o l group c o m p r i s e d ( 1 )6 3 u n r e l a t e d C a u c a s i a n s , w i t h o u t c l e f t i n g , who h a db e e n b o r n i n o r a r o u n d t h e s t a t e o f I o w a b e t w e e n 1 9 1 4a n d 1 9 8 7 a n d on whom b l o o d s a m p l e s w e r e a v a i l a b l ea n d ( 2 ) 3 9 u n r e l a t e d C a u c a s i a n s , b o r n a t U n i v e r s i t yo f I o w a H o s p i t a l d u r i n g O c t o b e r a n d N o v e m b e r , 1 9 8 7 ,on whom p l a c e n t a s w e r e a v a i l a b l e . S e v e n t y percent o ft h e cases w e r e m a l e , a n d 45% o f t h e c o n t r o l s w e r e m a l e .DNA A n a l y s i sDNAwas e x t r a c t e d f r o m e i t h e r l e u k o c y t e s o r p l a c e n -t a l t i s s u e b y u s i n g a m o d i f i c a t i o n o f t h e p r o c e d u r e o fP o n c z e t a l . ( 1 9 8 2 ) . F i v e m i c r o g r a m s DNA was d i g e s t e d

w i t h t h e r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e k n o w n t o y i e l d RFLPw i t h t h e p r o b e s b e i n g s t u d i e d , a c c o r d i n g t o m a n u f a c -t u r e r ' s i n s t r u c t i o n s ( N e w E n g l a n d B i o l a b s o r B e t h e s d aR e s e a r c h L a b o r a t o r i e s ) . DNA f r a g m e n t s w e r e s e p a r a t e db y e l e c t r o p h o r e s i s on 0 . 8 % o r 1 . 2 % agarose g e l s . DNAwas t r a n s f e r r e d t o Z e t a b i n d t m n y l o n f i l t e r s ( A M F - C u n o ) .P r o b e s u s e d ar e s h o w n i n t a b l e 1 a n d ar e d e s c r i b e d i nt h e c o r r e s p o n d i n g r e f e r e n c e s . T h e y w e r e l a b e l e d b y u s i n g

t h e r a n d o m p r i m e r m e t h o d o f F e i n b e r g a n d V o g e l s t e i n( 1 9 8 3 ) , w i t h [ a 3 2 - P ] d C T P . F o l l o w i n g h y b r i d i z a t i o na n d w a s h i n g , a u t o r a d i o g r a p h y was c a r r i e d out b y u s i n gi n t e n s i f y i n g screens a t -8 0 C . T h e r e s u l t i n g f i l m s w e r es c o r e d f o r t h e presence or a b s e n c e o f t h e v a r i o u s p o l y -m o r p h i c a l l e l e s ( t a b l e 1 a n d f i g . 1 ) .S t a t i s t i c a l A n a l y s i s

A l l e l e - f r e q u e n c y d i f f e r e n c e s b e t w e e n cases a n d c o n -t r o l s w e r e e v a l u a t e d b y x 2 a n a l y s i s . H a p l o t y p e s werevmi&jid ( Q v m u l t i p l e RFLPs d e t e c t e d a t t h e sajel o c u s w h e r e oneo r more o t t h e i n d c v f c f u a f IUtf s h o w e ds i g n i f i c a n t a s s o c i a t i o n . H a p l o t y p e s w e r e d e r i v e d b y i n -s p e c t i o n o f f u l l y h o m o z y g o u s i n d i v i d u a l s o r i n d i v i d u -a l s h e t e r o z y g o u s a t a s i n g l e s i t e a n d were r e a n a l y z e du s i n g l o g i s t i c r e g r e s s i o n a n d l o g - l i n e a r m o d e l s . A f r e -qu e n c y b i a s i n t h e h a p l o t y p e s i s c r e a t e d b y not b e i n ga b l e t o i d e n t i f y h a p l o t y p e s f o r a l l cases a n d c o n t r o l s ,b u t we h a v e no reason t o expect s u c h a b i a s i s d i f f e r e n tf o r CL/P cases a n d c o n t r o l s .R e s u l t s

T a b l e 2 g i v e s t h e RFLP d i s t r i b u t i o n i n cases a n d c o n-t r o l s . R a r e a l l e l e s f o u n d f o r E G F R / H i n d I I I , E G F R / P s t I ,EGFR/MboI, E G F / H i n c I I , a n d TGFA/BamHI w e r ee x c l u d e d f r o m a n a l y s i s b u t account f o r t h e o d d num-b e r s o f c h r o m o s o m e s s h o w n i n some case a n d c o n t r o ls a m p l e s . C o m p a r i s o n s o f t h e RFLP common a l l e l e f r e -q u e n c i e s a t t h e G R L , E R , E G F , a n d EGFR l o c i e a c hr e v e a l e d no s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n cases a n dc o n t r o l s ( P > . 0 5 ) .

T a b l e IR F L P s S t u d i e d

P o l y m o r p h i s m S i z eG e n e P r o b e L o c a t i o n E n z y m e ( 1 ) A l l e l e / ( 2 ) A l l e l e R e f e r e n c eGR L ....... OB7 5 q 1 1 - q 1 3 B c 1 I 4 . 5 k b p / 2 . 3 k b p M u r r a y e t a l . 1 9 8 7ER ........ OR8 6 q 2 4 - q 2 7 P v u I I 1 . 5 k b p / 0 . 7 k b p C a s t a g n o l i e t a l . 1 9 8 7EGF ........ p h E G F 1 2 1 4 q 2 5 - q 2 7 H i n c I l 8 . 0 k b p / 4 . 5 k b p M u r r a y e t a l . 1 9 8 6 b

S a c l 1 2 . 0 k b p/ 1 1. 0 k b p M u r r a y e t a l . 1 9 8 6 bEGFR ...... HER-A64 7 p l 3 - p l 2 H a e I I I 2 . 6 k b p / 1 . 7 k b p S m i t h e t a l . 1 9 8 7H i n d I I I 1 2 . 5 k b p / 1 0 k b p S m i t h e t a l . 1 9 8 7M b o I 2 . 6 k b p / 2 . 3 k b p S m i t h e t a l . 1 9 8 7P s t I 1 0 . 0 k b p / 8 . 0 k b p S m i t h e t a l . 1 9 8 7S t u I 2 0 . 0 k b p / 1 3 . 0 k b p S m i t h e t a l . 1 9 8 7TGFA ...... p h T G F 1 - 1 0 - 3 3 5 0 2 p l 3 T a q I 3 . 0 k b p / 2 . 7 k b p H a y w a r d e t a l . 1 9 8 7p h T G F 1 - 1 0 - 9 2 5 BamHI 7 . 0 k b p/ 4 .0 k p b M u r r a y e t a l . 1 9 8 6 aR s a I 1 . 5 k b p / 1 . 2 k b p M u r r a y e t a l . 1 9 8 6 a

349


3/6

A r d i n g e r e t a l .

Taql/TGFA BamHI/TGFA1 2 3 - 4

3 . 0 k b- 2 . 7 k b

R s a l / T G FA1 2 3

7 . 0 k b-4.0kb

-1.5 k b- 1 . 2 k b

F i g u r e I T G F A R F L P s u s e d i n t h e p r e s e n t s t u d y . R e s t r i c t i o n enzymes u s e d a n d p o l y m o r p h i c b a n d s i z e s ar e i n d i c a t e d . A l l e l e s d e s i g n a t e das ' 1 " i n t h e t e x t a r e t h e l a r g e r b a n d i n e a c h p a i r o f t wo p o l y m o r p h i c b a n d s .H i g h l y s i g n i f i c a n t a s s o c i a t i o n s w e r e o b s e r v e d , h o w -

e v e r , f o r t w o o f t h r e e R F L P s d e t e c t e d b y t h e TGFAp r o b e s a n d t h e presence o f c l e f t i n g ( t a b l e s 2 a n d 3 ) .T h e TGFA T a q I 2 . 7 - k b p a l l e l e ( C 2 ) a n d t h e TGFABamHI 4 . 0 - k b p a l l e l e ( A 2 ) s h o w e d s i g n i f i c a n t a s s o c i a -t i o n w h e n s t a n d a r d c r i t e r i a w e r e u s e d w i t h P v a l u e so f . 0 0 4 7 a n d . 0 0 5 2 , r e s p e c t i v e l y . T h e y a p p r o a c h e d s i g -n i f i c a n c e w h e n t h e r e j e c t i o n c r i t e r i a w e r e a d j u s t e d f o r

T a b l e 2RFLP D i s t r i b u t i o n a n d A n a l y s i s

N o . o f CL/P N o . o f C o n t r o lG e n e P r o b e E n z y m e A l l e l e a C h r o m o s o m e s C h r o m o s o m e s X 2 P V a l u eG R L .Bc1 A l 6 1 5 0 . 5 0 6 NSA2 9 7 9 4E R . P v u I I A l 6 9 5 8 . 1 1 3 NSA2 8 1 7 4EGF .HinclI A l 6 7 5 2 1 . 0 1 3 NSA2 8 9 8 8S a c l B I 1 4 2 1 2 3 . 5 2 0 NSB 2 1 4 9EGFR .HaeIII A l 9 5 . 9 3 6 NSA2 1 4 7 1 3 7H i n d I I I C l 1 4 4 1 2 4 . 0 8 2 NSC2 1 6 1 5M b o l E l 7 4 . 1 3 0 NSE 2 1 1 6 5 5P s t I B I 1 4 2 1 2 7 . 0 8 2 NS

B 2 1 6 1 6S t u I D l 4 4 3 1 1 . 7 9 9 NSD2 1 1 4 1 1 1TGFA .......... T a q I C l 1 3 5 1 8 6 7 . 4 9 7 . 0 0 4 7C2 2 1 1 0B a m H I A l 7 2 5 7 . 4 8 3 . 0 0 5 2A2 1 5 0 1 7 0R s a I B l 4 4 5 4 . 0 3 9 NSB 2 1 1 6 1 4 8

a D e s i g n a t i o n s a r e a s f o u n d i n Human G e n e M a p p i n g 9 ( 1 9 8 7 ) .

3 5 0


4/6

T G F - A l p h a a n d C l e f t L i p a n d P a l a t eT a b l e 3T GFA A l l e l e a n d G e n o t y p e F r e q u e n c i e sS u b j e c t s C a t e g o r y ( N ) A l l e l e a F r e q u e n c y G e n o t y p e F r e q u e n c y

C l C2 ClCl C1C2 C2C2C L / P ( 7 8 ) .......... . 8 6 5 . 1 3 5 5 9 ( 7 6 % ) 1 7 ( 2 2 % ) 2 ( 2 % )C o n t r o l ( 9 8 ) ......... . 9 5 . 0 5 8 9 ( 9 1 % ) 8 ( 8 % ) 1 ( 1 % )

A l A2 AlAl A1A2 A2A2C L / P ( 7 7 ) .......... . 0 5 . 9 5 0 ( 0 ) 7 ( 9 % ) 7 0 ( 9 1 % )C o n t r o l ( 9 6 ) . . . . . . . . . . 1 3 . 8 7 1 ( 1 % ) 2 3 ( 2 4 % ) 7 2 ( 7 5 % )

B i B 2 B l B i B 1 B 2 B 2 B 2C L / P ( 8 0 ) .......... . 2 7 5 . 7 2 5 6 ( 7 . 5 % ) 3 2 ( 4 0 % ) 4 2 ( 5 2 . 5 % )C o n t r o l ( 1 0 1 ) . . . . . . . . . 2 7 . 7 3 1 1 ( 1 1 % ) 3 2 ( 3 2 % ) 5 8 ( 5 7 % )

a T G F A / T a q I : C 1 - 3 . 0 k b p , C 2 - 2 . 7 k b p ; T G F A / B a m H I : A 1 - 7 . 0 k b p , A 2 - 4 . 0 k b p ; T G F A /R s a I : B 1 - 1 . 5 k b p , B 2 - 1 . 2 k b p .t h e 1 2 t e s t c o m p a r i s o n s m a d e ( a l p h a = . 0 5 / 1 2 =. 0 0 4 2 ) . No s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e was o b s e r v e d i n f r e -quency o f t h e TGFA R s a I RFLP a l l e l e s ( X 2 = 0 . 0 3 , P= 0 . 4 8 1 5 ) b e t w e e n cases a n d c o n t r o l s .H a p l o t y p e s a t t h e TGFA l o c u s , c o n s i s t i n g o f t h e T a q I ,B a m H I , a n d R s a I R F L P s , w e r e d e r i v e d a n d c o m p a r e db e t w e e n cases a n d c o n t r o l s ( t a b l e 4 ) . D e t a i l e d e x a m i -n a t i o n o f t h e h a p l o t y p e d i s t r i b u t i o n s s h o w e d t h a t as i g n i f i c a n t p o r t i o n o f t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n cases a n dc o n t r o l s was d u e t o t h e o v e r r e p r e s e n t a t i o n o f t h eC2A2B2 h a p l o t y p e i n cases. F o r t y - e i g h t p e r c e n t ( x 2 =5 . 6 2 ) o f t h e t o t a l P e a r s o n x 2 ( 1 1 . 6 4 ) was c o n t r i b u t e db y t h e C2A2B2 h a p l o t y p e . A l i k e l i h o o d - r a t i o t e s t i n d i -c a t e d t h a t t h e C2A2B2 h a p l o t y p e was s i g n i f i c a n t l yo v e r r e p r e s e n t e d i n c ase s as c o m p a r e d w i t h c o n t r o l s( l i k e l i h o o d r a t i o x 2 = 5 . 7 3 7 , P = 0 . 0 1 7 ) . No o t h e r

h a p l o t y p e s h o w e d a s i g n i f i c a n t i n d i v i d u a l d i f f e r e n c e b e -t w e e n cases a n d c o n t r o l s . H o w e v e r , t h e QA2B1 h a p l o -t y p e was a l s o o v e r r e p r e s e n t e d i n c a s e s , b u t i t c o n t r i b u t e do n l y 12% o f t h e t o t a l P e a r s o n x 2 . S i m i l a r r e s u l t s w e r eo b s e r v e d w h e n TGFA genotypes c o m p o s e d o f t h e f i v eo b s e r v e d h a p l o t y p e s w e r e c o m p a r e d ( t a b l e 5 ) . O f t h e6 7 genotypes t h a t c o u l d b e d e r i v e d f o r t h e c a s e s , 16%w e r e h e t e r o z y g o u s a n d 3 % w e r e h o m o z y g o u s f o r t h eC2A2B2 h a p l o t y p e . I n t h e 8 0 c o n t r o l g e n o t y p e s , 5%w e r e C 2 A 2 B 2 h e t e r o z y g o t e s a n d 1% w e r e h o m o z y g o t e s .T h e C2A2B2 genotypes a c c o u n t e d f o r 3 8% o f t h ed i f f e r e n c e b e t w e e n cases a n d c o n t r o l s .S u b d i v i d i n g t h e d a t a b y se x s h o w e d no s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e i n h a p l o t y p e d i s t r i b u t i o n b e t w e e n m a l e a n df e m a l e cases ( x 2 = 2 . 1 1 , P = 0 . 3 4 9 ) o r c o n t r o l s ( X 2= 1 . 3 0 ) , P = 0 . 5 1 9 ) . No s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e was o b -

T a b l e 4TGFA H a p l o t y p e D a t a

N o . O F CL/P C H R O M O S O M E S , B YF A M I L Y HISTORY No . OF CONTROL

H A P L O T Y P E a P o s i t i v e b N e g a t i v e T o t a l C H R O M O S O M E SC2A2B2 . . . . . . . . 1 0 5 1 5 6C 1 A 2 B 2 . . . . . . . . 3 2 5 5 8 7 1 1 7C 1 A 2 B 1 . . . . . . . . 1 4 1 5 2 9 2 5C l A l B 2 . . . . . . . . 0 0 0 2C l A l B l . . . . . . . . 2 2 4 1 1

T o t a l ......... 5 8 7 7 1 3 5 1 6 1a D e r i v e d f o r e a c h o f a n i n d i v i d u a l ' s t w o c h r o m o s o m e s , f r o m a l l e l e s p r e s e n t f r o m T a q I , B a m H I , a n d

R s a I d i g e s t s .b R e f e r s t o a n y r e l a t i v e i d e n t i f i e d a s h a v i n g C L / P .

3 5 1


5/6

A r d i n g e r e t a l .T a b l e 5T GFA G e n o t y p e D a t a

G e n o t y p e a N o . o f C L / P C a s e s N o . o f C o n t r o l sC2A2B2/C2A2B2 .... 2 1C l A 2 B 2 / C l A 2 B 2 .... 2 7 4 7ClA2B1/CA2B .... 2 1C l A l B l / C l A l B l .... 0 2C l A 2 B 2 / C l A 2 B .... 2 1 1 6C l A 2 B 1 / C l A l B l .... 4 7C2A2B2/C1A2B2 .... 1 1 4C1A2B2/ClAB2 .... 0 2

T o t a l . . . . . . . . . . . . 6 7 8 0a D e r i v e d b y c o mb i n i n g a n i n d i v i d u a l ' s TGFA h a p l o t y p e s ( s e e t a -b l e 3 ) .

s e r v e d i n h a p l o t y p e d i s t r i b u t i o n ( X 2 = 4 . 5 0 , P =0 . 3 4 3 ) w h e n b i l a t e r a l C L I P w a s c o m p a r e d w i t h u n i -l a t e r a l C L / P o r w i t h u n i l a t e r a l C L a l o n e . H o w e v e r , as i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n h a p l o t y p e d i s t r i b u t i o n w a s o b -s e r v e d w i t h r e s p e c t t o f a m i l y h i s t o r y o f c l e f t i n g ( X 2 =6 . 4 2 , P = 0 . 0 4 ) . F i f t y - e i g h t p e r c e n t o f t h e P e a r s o n x 2r e s u l t e d f r o m t h e o v e r r e p r e s e n t a t i o n o f t h e C 2 A 2 B 2h a p l o t y p e i n c a s e s r e p o r t i n g a n y f a m i l y h i s t o r y o f C L / P .T h e h a p l o t y p e d i s t r i b u t i o n s i n c a s e s w i t h a n d w i t h o u tf a m i l y h i s t o r i e s w e r e t h e n i n d e p e n d e n t l y c o m p a r e d w i t ht h e c o n t r o l h a p l o t y p e d i s t r i b u t i o n s . No s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e i n h a p l o t y p e d i s t r i b u t i o n w a s o b s e r v e d b e -t w e e n c a s e s w i t h o u t a f a m i l y h i s t o r y a n d c o n t r o l s ( X 2= 2 . 8 4 , P = 0 . 4 1 7 ) . A h i g h l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e w a so b s e r v e d , h o w e v e r , b e t w e e n c a s e s w i t h a p o s i t i v e f a m -i l y h i s t o r y a n d c o n t r o l s ( X 2 = 1 3 . 7 1 , P = 0 . 0 0 3 ) . A sb e f o r e , t h e d i f f e r e n c e i n t h e C 2 A 2 B 2 h a p l o t y p e f r e -q u e n c y c o n t r i b u t e d t h e l a r g e s t c o m p o n e n t t o t h e P e a r -so n X 2 ( 6 6 % ) .D i s c u s s i o n

T o i d e n t i f y t h e m a j o r g e n e p r o p o s e d b y C h u n g e ta l . a n d M a r a z i t a e t a l . t o b e i n v o l v e d i n a p o r t i o n o fC L / P c a s e s i n C a u c a s i a n s , w e c o n s i d e r e d t w o p o s s i b l ea p p r o a c h e s . L i n k a g e s t u d i e s r e q u i r e a n u m b e r o f m u l -t i g e n e r a t i o n a l f a m i l i e s o r m u l t i p l e a f f e c t e d s i b p a i r s ,a r e m o s t s u c c e s s f u l w h e n t h e d i s o r d e r u n d e r s t u d y i sh o m o g e n e o u s , a n d d o n o t i m p l y c a u s a l i t y b e t w e e n t h em a r k e r a l l e l e b e i n g s t u d i e d a n d t h e d i s e a s e . B e c a u s eo f d i f f i c u l t i e s i n o b t a i n i n g l a r g e n u m b e r s o f f a m i l i e s w i t hn o n s y n d r o m i c C L I P , w e u s e d a n a s s o c i a t i o n s t u d y t ol o o k f o r t h e p r e v a l e n c e , a c r o s s a w e l l - d e f i n e d p o p u l a -t i o n , o f a g i v e n d i s o r d e r ( C L / P ) a m o n g i n d i v i d u a l s w i t h

d i f f e r e n t g e n e t i c m a r k e r s . S u c h s t u d i e s l o o k f o r t h e d i s -o r d e r a n d a p a r t i c u l a r m a r k e r t o b e f o u n d t o g e t h e r w i t ha g r e a t e r f r e q u e n c y t h a n e x p e c t e d b y c h a n c e a l o n e , i m -p l y i n g a c a u s a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e m a r k e r a n dt h e d i s o r d e r i n q u e s t i o n . T h e c l a s s i c p a r a d i g m f o r t h i sa r e t h e s t u d i e s t h a t h a v e s h o w n t h e a s s o c i a t i o n o f p a r -t i c u l a r HL A a n t i g e n s w i t h a h i g h e r r i s k o f d e v e l o p i n gd i a b e t e s m e l l i t u s .O u r s t u d y d e m o n s t r a t e s a s i g n i f i c a n t a s s o c i a t i o n b e -t w e e n ( 1 ) t h e 2 . 7 - k b p T a q I a n d t h e 4 . 0 - k b p BamHI f r a g -m e n t s o f t h e T G F A p r o b e a n d ( 2 ) n o n s y n d r o m i c C L / P .T h i s a s s o c i a t i o n s u g g e s t s t h a t a n a b n o r m a l i t y i n t h i sg e n e m a y u n d e r l i e a p r e d i s p o s i t i o n f o r c l e f t i n g i n s o m ei n d i v i d u a l s o r t h a t a n a s y e t u n i d e n t i f i e d c l e f t i n g g e n em a y b e t i g h t l y l i n k e d t o t h e T G F A l o c u s .T h e d e v e l o p m e n t o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e , o r r o o fo f t h e m o u t h , i n v o l v e s p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o no f p a l a t a l e p i t h e l i a l c e l l s a s w e l l a s p r o g r a m m e d c e l ld e a t h ( P r a t t e t a l . 1 9 8 0 ) . T h e o c c u r r e n c e o f c e l l d e a t hw i t h i n t h e m e d i a l e p i t h e l i a l l a m i n a b e t w e e n t h e f u s i n gp a l a t a l p r o c e s s e s a s s i s t s i n t h e r e m o v a l o f t h e m e d i a lp a l a t a l e p i t h e l i u m . E G F / T G F - a a n d g l u c o c o r t i c o i d s a r eb e l i e v e d t o r e g u l a t e t h e p r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t i a -t i o n o f p a l a t a l e p i t h e l i a l c e l l s b o t h i n v i t r o a n d i n v i v o .M o r e o v e r , t h e c o n t i n u e d p r e s e n c e o f EGF i n h i b i t s t h ef u s i o n p r o c e s s ; T G F - a l i k e l y h a s s i m i l a r e f f e c t s . T h e s el a t t e r b i o l o g i c a l s t u d i e s s u g g e s t t h a t m u t a t i o n s i n t h eT G F A g e n e m i g h t c o n t r i b u t e t o t h e d e v e l o p m e n t o fC L / P , e s p e c i a l l y f o r t h o s e m u t a t i o n s t h a t a f f e c t t h e t i m -i n g o f t h e t i s s u e - s p e c i f i c e x p r e s s i o n o f t h i s g e n e .

W h i l e c u r r e n t l y n o s i n g l e TGFA a l l e l e , h a p l o t y p e ,o r g e n o t y p e i s c o m p l e t e l y c o n s i s t e n t w i t h t h e C h u n ge t a l . ( 1 9 8 6 ) m o d e l p r e d i c t i o n s , i t i s i n t e r e s t i n g t o n o t et h a t t h e f r e q u e n c y f o r t h e C2A2B2 h a p l o t y p e i n c o n -t r o l s i s . 0 3 7 , w h i c h i s s i m i l a r t o t h e . 0 3 5 p r e d i c t e d b yt h e C h u n g e t a l . m o d e l . T h e h o m o z y g o t e f r e q u e n c y f o rt h i s h a p l o t y p e i n c a s e s , h o w e v e r , i s s i g n i f i c a n t l y l e s s t h a np r e d i c t e d b y t h e a u t o s o m a l r e c e s s i v e m a j o r - l o c u s m o d e lo f C h u n g e t a l . T h e I o w a p o p u l a t i o n m a y h a v e a h i g h e rp r o p o r t i o n o f c a s e s n o t a t t r i b u t a b l e t o t h e m a j o r l o -c u s . S e g r e g a t i o n a n a l y s i s o f p e d i g r e e d a t a f r o m o u r I o w aC L / P c a s e s m a y d e t e r m i n e t h e c o n t r i b u t i o n t h a t a m a -j o r l o c u s m a k e s t o c l e f t i n g i n t h i s p o p u l a t i o n .I t i s a l s o p o s s i b l e t h a t m o r e t h a n o n e m u t a t i o n t h a tc a n c a u s e C L / P h a s o c c u r r e d a t t h e TGFA l o c u s . E x -a m i n a t i o n o f t h e h a p l o t y p e d i s t r i b u t i o n s s h o w t h a t , i na d d i t i o n t o t h e o v e r r e p r e s e n t a t i o n o f t h e C 2 A 2 B 2 h a p l o -t y p e , t h e C 1 A 2 B 1 h a p l o t y p e i s a l s o f o u n d i n e x c e s s i nc a s e s . I f o n e s p e c u l a t e s t h a t f a m i l i a l a g g r e g a t i o n o f C L / Pi s c a u s e d b y h o m o z y g o s i t y f o r e i t h e r o f t h e s e t w o i n -d i v i d u a l h a p l o t y p e s o r b y h e t e r o z y g o s i t y ( C 2 A 2 B 2 /

352


6/6

T G F - A l p h a a n d C l e f t L i p a n d P a l a t e 3 5 3C l A 2 B 1 ) , t h e p r o p o r t i o n o f a f f e c t e d s a t t r i b u t a b l e t oT G F A v a r i a t i o n i s m u c h m o r e c o n s i s t e n t w i t h t h e p r e d i c -t i o n s o f t h e C h u n g e t a l . m o d e l .A s n o t e d p r e v i o u s l y , s e g r e g a t i o n a n a l y s i s s u g g e s t e dt h a t o n l y o n e - t h i r d o f n o n s y n d r o m i c C L / P c a s e s w o u l db e e x p l a i n e d b y a s i n g l e m a j o r g e n e . O t h e r c a s e s m a yb e d u e t o d i f f e r e n t g e n e ( s ) , t o e n v i r o n m e n t a l a g e n t s ,o r t o t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e m . T h e s e c a s e s w o u l db e e x p e c t e d t o b e d i s t r i b u t e d r a n d o m l y w i t h r e s p e c tt o t h e TGFA h a p l o t y p e s .T h e a s s o c i a t i o n r e p o r t e d h e r e i d e n t i f i e s a p o p u l a t i o no f i n d i v i d u a l s g e n e t i c a l l y a t - r i s k f o r C L / P . I t s h o u l db e n o t e d t h a t m o r e a c c u r a t e e s t i m a t e s o f h a p l o t y p e f r e -q u e n c i e s w i l l r e q u i r e b o t h a d j u s t m e n t f o r b i a s ( r e s u l t -i n g a s a c o n s e q u e n c e o f d e r i v a t i o n b y h o mo z y go s i t y )a n d l a r g e r s a m p l e s i z e s . T h e o v e r a l l c o n t r i b u t i o n o f t h eTGFA l o c u s t o c l e f t i n g i n o u r p o p u l a t i o n r e m a i n s t ob e d e t e r m i n e d , a n d c o n f i r m a t i o n i n o t h e r g r o u p s i s i m -p o r t a n t . D e m o n s t r a t i o n o f l i n k a g e o f t h e TGFA g e n et o t h e C L / P p h e n o t y p e b y u s i n g a f f e c t e d s i b p a i r s w o u l ds u b s t a n t i a t e t h i s a s s o c i a t i o n , a s w e l l a s i n d i c a t e t h a tt h i s l o c u s i s i n d e e d a m a j o r g e n e t i c r i s k f a c t o r f o r t h i sd i s o r d e r .T h e i d e n t i f i c a t i o n o f a d d i t i o n a l R F L P s w i t h i n t h eTGFA l o c u s - a n d t h e i r a n a l y s i s i n t h e s t u d y p o p u l a -t i o n t h a t w e h a v e d e s c r i b e d h e r e - w o u l d f a c i l i t a t e t h ei d e n t i f i c a t i o n o f s u s c e p t i b i l i t y a l l e l e s , w h i c h c o u l d t h e nb e i s o l a t e d . T h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f m u t a t i o n s c o n -t r i b u t i n g t o C L / P w o u l d p r o v i d e i m p o r t a n t i n s i g h t i n t ot h e r e g u l a t i o n o f c r a n i o f a c i a l d e v e l o p m e n t .A c k n o w l e d g m e n t sWe a r e g r a t e f u l t o N a n c y C o x f o r h e r r e v i e w o f s t a t i s t i c a la n a l y s i s , t o S h i r l e y M a x e y f o r h e r h e l p i n p a t i e n t a s c e r t a i n -

m e n t , a n d t o t h e p a t i e n t s a n d t h e i r f a m i l i e s who m a d e t h i ss t u d y p o s s i b l e . T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y NIH g r a n t sD E 0 5 5 0 6 ( H . H . A . ) , D E 0 8 5 5 6 ( J . C . M . ) , a n d D E 0 5 8 3 7 ( J . B .a n d D . R . V . ) . T h i s w o r k w a s p r e s e n t e d i n p a r t a t t h e 1 9 8 8m e e t i n g s o f t h e S o c i e t y f o r P e d i a t r i c R e s e a r c h , W a s h i n g t o n ,D C .R e f e r e n c e sC a r t e r C O ( 1 9 6 9 ) G e n e t i c s o f common d i s o r d e r s . B r MedB u l l 2 5 : 5 2 - 5 7

C a s t a g n o l i A , M a e s t r i I , B e r n a r d i F , D e l S e n n o L ( 1 9 8 7 ) P v u I IRFLP i n s i d e t h e h u m a n e s t r o g e n r e c e p t o r g e n e . N u c l e i cA c i d s R e s 1 5 : 8 6 6C h u n g C S , B i x l e r D , W a t a n a b e T , K o g u c h i H , F o g h - A n d e r s e nP ( 1 9 8 6 ) S e g r e g a t i o n a n a l y s i s o f c l e f t l i p w i t h o r w i t h o u tc l e f t p a l a t e : a c o m p a r i s o n o f D a n i s h a n d J a p a n e s e d a t a .Am J H um G e n e t 3 9 : 6 0 3 - 6 1 1F e i n b e r g A P , V o g e l s t e i n B ( 1 9 8 3 ) A t e c h n i q u e f o r r a d i o l a b e l -l i n g DNA r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e f r a g m e n t s t o h i g h s p e c i f i ca c t i v i t y . A n a l B i o c h e m 1 3 2 : 6 - 1 3

F e r g u s o n MWJ ( 1 9 8 7 ) P a l a t e d e v e l o p m e n t : m e c h a n i s m s a n dm a l f o r m a t i o n s . I r J Med S c i 1 5 6 : 3 0 9 - 3 1 5F r a s e r FC ( 1 9 7 6 ) T h e m u l t i f a c t o r i a l t h r e s h o l d c o n c e p t - u s e sa n d m i s u s e s . T e r a t o l o g y 1 4 : 2 6 7 - 2 8 0H a y w a r d NK , N a n c a r r o w D J , B e l l G I ( 1 9 8 7 ) A T a q I p o l y -m o r p h i s m f o r t h e h u m a n t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r a l -p h a g e n e ( T G F A ) . N u c l e i c A c i d s R e s 1 5 : 5 5 0 3Human G e n e M a p p i n g 9 ( 1 9 8 7 ) N i n t h I n t e r n a t i o n a l W o r k -s h o p o n Human G e n e M a p p i n g . C y t o g e n e t C e l l G e n e t4 6 : 1 - 4M a r a z i t a ML, S p e n c e MA, M e l n i c k M ( 1 9 8 6 ) M a j o r g e n ed e t e r m i n a t i o n o f l i a b i l i t y t o c l e f t l i p w i t h o r w i t h o u t c l e f tp a l a t e : a m u l t i r a c i a l v i e w . J C r a n i o f a c G e n e t D e v B i o l2 : 8 9 - 9 7

M u r r a y J C , B u e t o w KH, B e l l G I ( 1 9 8 6 a ) R F L P s f o r t r a n s -f o r m i n g g r o w t h f a c t o r a l p h a ( T G F A ) g e n e a t 2 p l 3 . N u c l e i cA c i d s R e s 1 4 : 5 1 1 7M u r r a y J C , D e h a v e n C R , B e l l G I ( 1 9 8 6 b ) R F L P s f o r e p i d e r -m a l g r o w t h f a c t o r ( E G F ) , a s i n g l e c o p y s e q u e n c e a t4 q 2 5 - 4 q 2 7 . N u c l e i c A c i d s R e s 1 4 : 5 1 1 7M u r r a y J C , S m i t h R F , A r d i n g e r HH, W e i n b e r g e r C D ( 1 9 8 7 )RFLP f o r t h e g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r ( G R L ) l o c a t e d a t5 q l l - 5 q l 3 . N u c l e i c A c i d s R e s 1 5 : 6 7 6 5

P o n c z M, S o l o w i e j c z y k D , H a r p e l B , Mory Y , S c h w a r t z E ,S u r r e y S ( 1 9 8 2 ) C o n s t r u c t i o n o f h u m a n g e n e l i b r a r i e s f r o ms m a l l a m o u n t s o f p e r i p h e r a l b l o o d : a n a l y s i s o f I - l i k e g l o b i ng e n e s . H e m o g l o b i n 6 : 2 7 - 3 6P r a t t R M, Y o n e d a T , S i l v e r M H, S a l o m o n DS ( 1 9 8 0 ) I n v o l v e -m e n t o f g l u c o c o r t i c o i d s a n d e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r i ns e c o n d a r y p a l a t e d e v e l o p m e n t . I n : P r a t t RM a n d C h r i s -t i a n s e n RL ( e d s ) C u r r e n t t r e n d s i n p r e n a t a l c r a n i o f a c i a l d e -v e l o p m e n t . E l s e v i e r / N o r t h H o l l a n d , Ne w Y o r k , p p 2 3 5 -2 5 2

S m i t h R F , A r d i n g e r HH, M u r r a y J C ( 1 9 8 7 ) M u l t i p l e R F L P sd e m o n s t r a t e d f o r e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r ( E G F R )o n c h r o m o s o m e 7 . N u c l e i c A c i d s R e s 1 5 : 6 7 6 4

1998 association of genetic variation of the transforming growth

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