201103 bioquímica- guia lab 2014 (1)

5/20/2018 201103 Bioqu mica- Guia Lab 2014 (1)

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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD

ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIAGUIA COMPONENTE PRCTICO DEL CURSO: 201103 BIOQUMICA

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y ADISTANCIA

ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA

GUA COMPONENTE PRCTICO

201103 BIOQUMICA

BUCARAMANGA2014


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1. ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO

El presente material en primera instancia fue diseado por el Ingeniero Rubn

Daro Munera en el 2008, quien en ese entonces era el director de curso, era y estutor de la UNAD Cead Palmira. El ingeniero Rubn Munera recopilo adems lasguas de laboratorio que estn contenidas en el material impreso de la UnisurBioqumica de Gerardo Prez y Yolanda Navarro publicado en 1992.

Este material ha tenido tres actualizaciones, la primera en el 2008 el IngenieroRubn Daro Munera, la segunda en el 2009 r y la tercera en agosto de 2010por Q.A de alimentos Golda Meyer Torres, tutor de la UNAD del Cead de

Duitama, y quien se desempea actualmente como directora del curso.

El proceso de revisin de estilo del material y aportes disciplinares, didcticos ypedaggicos en el proceso de acreditacin de material didctico desarrollado en elmes de JULIO de 2009, ENERO y AGOSTO de 2010 se hizo por parte delBilogo Alberto Garca, tutor del Cead de Bucaramanga y se mantiene la vigenciapara el 2011.


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3. INDICE DE CONTENIDO

INTRODUCCIN 7

JUSTIFICACIN 7

PRCTICA No. 1: METODOS CUALITATIVOS PARA LA IDENTIFICACION DEAMINOCIDOS Y PROTEINAS

11

PRCTICA No. 2: FRACCIONAMIENTO DE PROTENAS EN SEMILLAS DELEGUMINOSAS Y CEREALES POR SOLUBILIDAD

22

PRCTICA No. 3: ENSAYOS ENZIMATICOS CUALITATIVOS 33

PRCTICA No. 4 :ESTUDIO CINTICO DE LA UREASA 48PRCTICA No. 5: DETERMINACIN DE VITAMINA C 64

PRCTICA No. 6: AISLAMIENTO DEL ARN EN LEVADURA 71

PRCTICA No. 7: AISLAMIENTO Y DETERMINACION DE CIDOS NUCLEICOS 76

PRCTICA No. 8- PROPIEDADES FISICOQUMICAS DE LOS CARBOHIDRATOS 84

PRCTICA No. 9- HIDRLISIS DE POLSACARIDOS, MTODO DEL REACTIVO3,5-DINITROSALICILATO

91

PRCTICA No. 10: RECONOCIMIENTO CUALITATIVO DE CARBOHIDRATOS:RECONOCIMIENTO DEL GLUCGENO A PARTIR DEL ALMIDN.

99

PRCTICA No. 11- RECONOCIMIENTO CUALITATIVO DE LPIDOS 110

PRCTICA No. 12- FRACCIONAMIENTO DE TEJIDOS EN SUS PRINCIPALESCONSTITUYENTES: CARBOHIDRATOS, LPIDOS, PROTENAS Y CIDOSNUCLEICOS (Opcional, puede hacerse en lugar de las prcticas #1, 6, 7, 8,10 y11.

119

FUENTES DOCUMENTALES 143

ANEXOS

SEGURIDAD INSUTRIAL 144

PREPARACIN DE REACTIVOS 147


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4. LISTADO DE TABLAS

Tabla 1: reactivos prctica 114

Tabla 2: Marcha de la prctica 1.19

Tabla 3: Rbrica de la prctica 121


Tabla 5: batera de tubos mtodo Biuret para la cuantificacin de protenas...28

Tabla 6: batera de tubos mtodo Folin Lowry cuantificacin de protenas...29

Tabla 7: Rbrica de la prctica 2...31


Tabla 9: Marcha de la prctica 3.37

Tabla 10: Marcha de la prctica 3 alfa- amilasa..........40

Tabla 11: batera de tubos efecto de la concentracin, alfa-amilasa...42

Tabla 12: batera de tubos efecto del pH, alfa-amilasa..43

Tabla 13: batera de tubos efecto de la temperatura, alfa-amilasa..44

Tabla 14: Rbrica de la prctica 3.46

Tabla 15: bateras de tubos pH ptimo de la ureasa tubos blanco...52

Tabla 16: bateras de tubos pH ptimo de la ureasa, tubos problema.53

Tabla 17: resultados pH ptimos de la ureasa, tubos problema.......53

Tabla 18: resultados pH ptimos de la ureasa, mtodo espectrofotomtrico.54

Tabla 19: bateras de tubos pH ptimo de la ureasa tubos blanco mtodo 2.56

Tabla 20: bateras de tubos pH ptimo de la ureasa tubos problema mtodo 256

Tabla 21: expresin de resultados pH de la ureasa tubos problema mtodo 2..57

Tabla 22: bateras de tubos variacin concentracin de sustrato, tubos problema58

Tabla 23: expresin de resultados variacin concentracin de sustrato..58


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Tabla 24: bateras de tubos variacin de la temperatura60

Tabla 25: bateras de tubos extraccin de ureasa de leguminosas.61


Tabla 27: reactivos prctica 5..66

Tabla 28: bateras de tubos cuantificacin de vitamina C..68




Tabla 32: reactivos la prctica 778




Tabla 36: reactivos de la prctica 9..93

Tabla 37: bateras de tubos cuantificacin de glucosa DNS hidrlisis qumica..95

Tabla 38: bateras de tubos cuantificacin de glucosa DNS hidrlisis enzimtica.96


Tabla 40: reactivos de la prctica 10.101

Tabla 41: Marcha de la prctica extraccin de glicgeno103

Tabla 42: Marcha de la prctica extraccin de disacridasas105

Tabla 43: Marcha de la prctica accin de disacridasas106

Tabla 44: Rubrica prctica 10..108

Tabla 45: Reactivos prctica 11.112





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4.1 LISTADO DE GRFICOS Y FIGURAS

Figura 1: fraccionamiento de protenas en semillas de leguminosas y cereales porsolubilidad 27

Figura 2: Extraccin de biomolculas.132

Figura 3: Extraccin de lpidos de la tema de huevo..135

Figura 4: Montaje para destilacin en el mtodo de Micro Kjeldahl..138


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5. CARACTERSTICAS GENERALES

Introduccin Uno de los cursos fundamentales es la Bioqumica, el cual permite comprendermecanismos de formacin y transformacin de los nutrientes que componen

determinado alimento.

La presente gua de prcticas de laboratorio contiene una serie de experimenbsicos que complementan los conceptos fundamentales.

El trabajo de laboratorio utiliza como materiales de experimentacin, mateprimas de uso comn como harinas de cereales y leguminosas, fculas, frutaverduras, tejidos de origen animal, que ayudan al estudiante a asimilar las tcnde uso comn en la investigacin bioqumica con fuentes alimenticiaspotencialmente alimenticias.

La investigacin no es completa sino se divulgan los resultados obtenidos enexperiencia. Es importante que el estudiante aprenda la forma de reportar datos y a saber interpretar las conclusiones obtenidas por otros investigadores, el fin de evaluar su propia investigacin. Esto hace necesario que elaboreinforme donde presente sus datos, resultados y conclusiones obtenidos durantetrabajo experimental.

En esta gua de prcticas de laboratorio, equivales a 125/500 que correspond25% de la nota. En la gua se describen 12 prcticas, pero las mismas se pueajustar a las prcticas 1, 6, 7, 8,10 y 11. Todo disponiendo de los recursos de cCEAD, de las indicaciones que d el tutor encargado de la prctica.

La prctica de laboratorio del curso de bioqumica, se programindependientemente en cada uno de los centros, en donde el estudiante realizmatricula, por eso se requiere estar pendiente de la programacin de eactividad.

Justificacin Un curso de bioqumica sin experiencia prctica es un curso incompleto, slo el desarrollo de laboratorios, los estudiantes asimilan los complejos conceptos encierra una bioqumica general.

EL desarrollo de los laboratorios, conlleva a los estudiantes adquirir competenacadmicas al argumentar en los anlisis de resultados, al interpretar resultados y a proponer aplicacin de dichas experiencias en los contexregionales.


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Intencionalidadesformativas

PROPSITOS

Reconocer mediante el uso de reacciones coloreadas y cualitativas la presenciaaminocidos, protenas, carbohidratos, cidos nucleicos y lpidos, comoconstituyentes de las biomolculas.

Cuantificar fracciones proteicas y glcidos mediante las tcnicas de aninstrumental, volumtrico y gravimtrico.

Interpretar los resultados obtenidos en cada observacin para argumentar resultados en el anlisis de resultados y proponer posibles aplicaciones en contextos regionales.

Reconocer a las biomolculas como unidades fundamentales y su importancialos diferentes procesos metablicos

Complementar con cada prctica los conceptos fundamentales de las 45 lecciodel mdulo.

OBJETIVOS

Que el estudiante reconozca mediante el uso de reacciones coloreadacualitativas la presencia de aminocidos, protenas, carbohidratos, cinucleicos y lpidos, como constituyentes de las biomolculas.

Que el estudiante cuantifique fracciones proteicas y glcidos mediante las tcn

de anlisis instrumental, volumtrico y gravimtrico.Que el estudiante interprete los resultados obtenidos en cada observacin pargumentar los resultados en el anlisis de resultados y proponer posibaplicaciones en los contextos regionales.

Que el estudiante reconozca a las biomolculas como unidades fundamentalesu importancia en los diferentes procesos metablicos

Que el estudiante complemente con cada prctica los conceptos fundamentaleslas 45 lecciones del mdulo.

COMPETENCIAS

El estudiante reconoce mediante el uso de reacciones coloreadas y cualitativaspresencia de aminocidos, protenas, carbohidratos, cidos nucleicos y lpidcomo constituyentes de las biomolculas.

El estudiante cuantifica fracciones proteicas y glcidos mediante las tcnicas


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anlisis instrumental, volumtrico y gravimtrico.

El estudiante interpreta los resultados obtenidos en cada observacin pargumentar los resultados en el anlisis de resultados y proponer posibaplicaciones en los contextos regionales.

El estudiante reconoce las biomolculas como unidades fundamentales yimportancia en los diferentes procesos metablicos.

METAS

El estudiante presentar y sustentar un informe personal (pre informe) y un trabgrupal (informe de laboratorio) como resultado del estudio, aplicacin y ansistemtico del desarrollo de cada prctica de laboratorio, presentando un ande resultados utilizando un lenguaje amplio relacionado con la temtica.

El estudiante describir a las diferentes biomolculas identificadas en las pruecualitativas cuantitativas.

El estudiante resolver los cuestionarios planteados en cada una de las prctide laboratorio.

El estudiante aprender el manejo de las principales tcnicas bioqumigenerales para la identificacin de biomolculas.

Denominacin de practicas

1. Prctica 1. Mtodos cualitativos para la identificacin de aminocidos y

protenas.2. Prctica 2: fraccionamiento de protenas en semillas de leguminosas ycereales por solubilidad.3. Se Unen en una sola la prctica 3 y 4: Ensayos enzimticos cualitativos yestudio cintico de la ureasa.4. Hidrlisis de polisacridos, mtodo del reactivo 3,5-Dinitrosalisilico.5. Reconocimiento cualitativo de carbohidratos.6. Reconocimiento cualitativo de lpidos.

Nmero dehoras

18 H

Porcentaje 25% que equivale a 125/ 500 puntos

Curso Evaluadopor proyecto

SI x NO_

Seguridadindustrial

El trabajo en el laboratorio requiere la observacin de una serie de normas de de seguridad eviten posibles accidentes debido a desconocimiento de lo que se est haciendo. (Ver Anexo).


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6. DESCRIPCIN DE PRCTICAS

PRCTICA No. 1: METODOS CUALITATIVOS PARA LA IDENTIFICACION DE

AMINOACIDOS Y PROTEINAS

Tipo de practica Presencial X Autodirigida Remota

Otra Cul

Horas de la practica 2 HTemticas de la prctica Unidad 1: Biomolculas, especficamente el captulo 1, aminocidos y captulo

pptidos y protenas.Intencionalidadesformativas

Propsitos

Reconocer a los aminocidos como unidades estructurales de las protenas y simportancia en los diferentes procesos metablicos.

Analizar, mediante reacciones cualitativas coloreadas la presencia de aminocidosenlaces peptdicos en las muestras.

Establecer relaciones entre la estructura y la funcin de las proteinas y prdida de esal variar su pH y solubilidad (precipitacin y desnaturalizacin).

Objetivos

Que el estudiante reconozca los aminocidos como unidades estructurales de laprotenas.

Que el estudiante analice, mediante reacciones cualitativas coloreadas la presencia daminocidos y enlaces peptdicos en las muestras.

Que el estudiante establezca la relacin entre la estructura y la funcin de las proteinay prdida de esta al variar su pH y solubilidad (precipitacin y desnaturalizacin).

COMPETENCIAS

El estudiante describe y analiza de manera eficiente los resultados observados en cadprueba cualitativa y relaciona el marco terico y los resultados para dar el respectivanlisis.

El estudiante conceptualiza en forma precisa la relacin que tiene cada prueba y

estructura de aminocidos y protenas.

El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a a travs de la elaboracin dinformes escritos.

Metas

Al finalizar la prctica #1:


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El estudiante obtendr su calificacin del respectivo pre informe personal comresultado del estudio independiente.

El estudiante resolver los respectivos cuestionarios dados.

El estudiante presentar en forma escrita el informe del respectivo laboratorio en form

grupal en donde sobresalga el anlisis de resultados.

Fundamentacin Terica

El estudiante como parte de su autogestin en el desarrollo de su aprendizaje autnomo, se servir investigar antesla prctica y a manera de pre informe los siguientes temas:

1. Captulo 1 y 2 de la Unidad 1: Biomolculas del mdulo del curso, enfatizando en: Clasificacin de aminocidEnlace peptdico, Niveles de estructuracin, Solubilidad de protenas: desnaturalizacin por calor y pH extremPrecipitacin por metales pesados, Precipitacin acdica

2. Pruebas cualitativas: enfatizar en las reacciones qumicas que tienen lugar y el principio del mtodo: Reaccin de

ninhidrina, Reaccin xantoproteica, Reaccin de milln, Reaccin del cido glioxlico, Prueba de Pauly, Prueba Nitroprusiato, Reaccin de Sakaguchi prueba de Biuret.

Bibliografa de Consulta:

Baynes, J. Dominiczak, M (2011). Bioqumica Mdica. Tercera Edicin.. Barcelona, Espaa.: Elsevier, Mosby. UbicacGoogle libros.

Voet, V. (2004). Bioqumica, tercera edicin. Montevideo, Uruguay.: Editorial Mdica panamericana. Ubicacin: Goolibros/ biblioteca virtual UNAD.

Baynes, J. Dominiczak, M (2011). Bioqumica Mdica. Tercera Edicin.. Barcelona, Espaa.: Elsevier, Mosby. UbicacGoogle libros.

Campbell, M. Farrell, S. (2003). Bioqumica. Mxico. Thomson Editores. Cuarta Edicin.

Ubicacin: Google libros/ biblioteca virtual UNAD.

Descripcin de la practica:

En esta prctica mediante pruebas coloreadas, se identifica los aminocidos que componen las protenas de extractos utilizados basados en las reacciones de los grupos R cadena lateral.

Se desarrolla pruebas para analizar el comportamiento y la solubilidad de protenas en tratamientos de precipitacidesnaturalizacin.

Estas prcticas corresponde a los temas que se tratan en la Unidad 1: Biomolculas, especficamente el captuloaminocidos y captulo 2, pptidos y protenas.

Es de vital importancia para los estudiantes de la formacin profesional y tcnica de los programas de ingenieraalimentos, agroforestal, agronmica, zootecnia, produccin animal y regentes de farmacia, el desarrollo de esprcticas, ya que profundizan y analizan la relacin e importancia que guardan los aminocidos y la funcin biolgicalas proteinas en los tejidos biolgicos.


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Recursos a utilizar en la prctica (Equipos / instrumentos)

Material de vidrio Material biolgico y otros(estudiantes)

Reactivos Equipos

Tubos de ensayo Alimento de origen vegetal oanimal: concentrados, protenacrnica, hgado, huevo, etc.

Reactivo de milln Estufas ( 5)

gradillas tapabocas Agua destilada, Solucin de CuSO41%

pHmetro (1)

esptulas Libros de bioqumica Solucin NaOH 30% y 40%, Solucinsaturada de NaCl

Centrifuga

Pipetas 1, 5 y 10ml

Marcador de vidrio HNO3 concentrado, Cristales desacarosa

Balanza analtica

Mallas de asbesto Cinta para rotular HCl concentrado, Acido triclorcetico10%

Termmetros 120C

Papel filtro Cuaderno de laboratorio Solucin cido pcrico saturada,Etanol 95%

mecheros

Embudos Bata blanca Solucin de (NH4SO4) al 50%,acetona

Agitador de vidrio Marcador para vidrio Solucin de acetato de plomo 0.5 %

Erlenmeyers 100

y 250 ml

Reactivo de sakaguchi, cido actico

glacial

Vasos deprecipitado 250 ml

HSO4 concentrado, Acido actico al30%

Vasos precipitado500 ml

Aminocidos: glicina, tirosina,triptfano, aminocidos azufrados,leucina

Probeta 100 ml Ninhidrina (2 g/l) preprese en fresco,Hidrxido de amonio.

Pinzas para tubosen madera

cido sulfanilico (10 g/l en solucinde HCl 1 mol/l).

Vidrios relojgrandes

Nitrito de sodio, Carbonato de sodio

Mortero conmango

Acetato de plomo, Nitrato de mercurio.


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Soporte paraembudos

Nitroprusiato de sodio (20 g/l,preprese fresco).

Pinzas para tubosde ensayo

metlicas

Alfa- naftol, Agua de bromo

Vasos deprecipitado de1000 ml plstico

cido fosfrico, Molibdato de sodio

Vasos deprecipitado de 600plstico

Tungsteno de sodio, Sulfato de cobre,Nitrato de sodio

Tabla 1: reactivos prctica 1.

Software a utilizar en la prctica u otro tipo de requerimiento para el desarrollo de la prctica

Video Tutorial. Dar clic en los archivos Index html. Descargarlo en:

https://dl.dropboxusercontent.com/u/51764879/Parte%201_%20proteinas.zip

https://dl.dropboxusercontent.com/u/51764879/Parte%202_proteinas.zipObjeto de Aprendizaje (OA): pruebas cualitativas para determinar aminocidos y protenas partes 1 y 2.

Ubicacin: Aula Virtual del Curso.

Seguridad Industrial

REACTIVO PROTECCION RIESGO

cidos inorgnicosconcentrados.

Gafas de seguridad, tapabocas. Loque estipula el reglamento delaboratorio.

Metodologa

Conocimiento previo para el desarrollo de la prctica:

Se requiere que el estudiante tenga conocimiento de las temticas de la Unidad 1 : Captulo 1 y 2 del mdulocurso.

Forma de trabajo: Estimado estudiante a continuacin encontrar los pasos a seguir para el desarrollo de la prctica del curso.

La metodologa es la siguiente:

Preinforme:

1. Observe los siguientes recursos dando Clic sobre el enlace:


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Presentacin aminocidos.

https://dl.dropboxusercontent.com/u/51764879/Presentaci%C3%B3nAminoacidos.ppsx

Pruebas cualitativas de aminocidos parte 1:

https://dl.dropboxusercontent.com/u/51764879/Parte%201_%20proteinas.zip

Pruebas cualitativas de aminocidos parte 2:

https://dl.dropboxusercontent.com/u/51764879/Parte%202_proteinas.zip

2. Desarrolle el siguiente taller ( despus de revisar el punto 1) y entrguelo a su tutor de laboratorio en formaWord ( no se debe evidenciar copias tcitas de internet) a mano alzada.

3. Defina aminocido: Que grupos funcionales estn presentes en los aminocidos? Cmo ellos esrelacionados con las propiedades cido bsicas.

1. Algunos autores clasifican los aminocidos de varias formas, por ejemplo, en esenciales y no esencialesalifticos y aromticos, o quiz la ms acertada; de acuerdo a la polaridad, presencia de cargas y composicqumica de la cadena lateral R de los aminocidos. De un argumento vlido de sta ltima clasificacin dnde se explique el porqu de esta.

2. Qu implicaciones tiene la Cadena lateral de los aminocidos en sus propiedades qumicas y en los mtodosidentificacin en el laboratorio?

3. En este laboratorio, Usted va a identificar algunos aminocidos que estn dentro de la composicin de un tebiolgico. Explique brevemente, que pruebas usara para identificar los siguientes aminocidos y porque?:

Tirosina, Fenilalanina, Aminocidos aromticos, Triptfano, Metionina y cistena, Grupos aminos libres.

4. Que es el enlace peptdico, represntelo. qu prueba usa en el laboratorio para identificarlos? en qu

fundamenta?

5. Que es un protena

6. Complete el siguiente cuadro, relacionada con protenas

Niveles de estructuracin que puede tener una protena Clasificacin de las protenas segn susolubilidad

7. Cul es la diferencia de precipitar y desnaturalizar una protena.

8. Elabore el diagrama de flujo de la marcha de la prctica y tablas de resultados en blanco.

Trabajo grupal

En grupo de trabajo (mximo 4 estudiantes), todos los estudiantes realizan la prctica #1 de laboratorio, para previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que el desempeo individual como grusern tenidos en cuenta en la rbrica de evaluacin del informe de laboratorio.

Producto a entregar:


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Hay dos formas de presentar el informe de laboratorio. La forma definitiva deber ser concertada entre el tasignado y el grupo de estudiantes:

Informe escrito: mediante entrega personal al tutor de laboratorio: el contenido ser: objetivos, introduccmarco terico (mximo 2 hojas), resultados (tabulados, se puede incluir registros fotogrficos), anlisis

resultados, conclusiones, bibliografa.

Sustentacin Oral con ayudas audiovisuales: el contenido ser: objetivos, resultados (tabulados, se puede incregistros fotogrficos), confrontacin de resultados y marco terico para dar el respectivo anlisis de resultadconclusiones, bibliografa.

Procedimiento:

1. Pruebas Cualitativas

1. 1 Obtencin de los Extractos:

-En el caso de alimentos en polvo, coloque unos 30 gramos en un vaso de precipitado, agregue 100 ml de agua destila

agite durante 10 minutos y filtre a travs de tela limpia. Conserve el lquido (filtrado) para las pruebas de las protenas.

-En el caso de los alimentos concentrados slidos, mulala o macrelas por separado y recoja el molido en vasos precipitado. Agregue 100 ml de agua destilada, agite durante 10 minutos y filtra a travs de tela. Recoja los filtradosvasos de precipitado o en Erlenmeyers previamente marcados. Deseche los residuos.

-En el caso de la solucin de clara de huevo: Haga un pequeo orificio en uno de los extremos del huevo y vierta por clara en un vaso precipitado, dejando dentro la yema. Luego agregue a la clara 100 ml de agua destilada y agite con ede disolverla.

Marcha de la prctica parte 1:

prueba procedimientoen un tubo de ensayo colocar:

cantidad aadicionar: Anote aqu elresultadoObtenido.

Realice aqu apuntesimportantes para elanlisis deresultados.

Biuret

extracto problema 2 ml

NaOH al 30% (cuidado, provocaquemaduras).

2 ml

Mezclar e ir aadiendo gota a gota elsulfato cprico al 1% (CuSO4), agitandodespus de cada adicin, hasta laaparicin de un color violeta, azul oamarillo. El color violeta indica la reaccinpositiva.

milln


Reactivo de milln 0.5 ml


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Llevar a bao de agua hirviendo por5min.Un color rojo oscuro es resultadopositivo.

xantoproteica


HNO3 concentrado por las paredes deltubo, (cuidado, provoca quemaduras).

1m

Mezclar bien, calentar a la bao mara yobservar un color amarillo claro.

Adicionar solucin de NaOH al 40%lentamente sin agitar y observar unnaranja intenso como resultado positivo.

2 ml

Lieberman


Cristales de sacarosa Una pizca

HCl concentrado, (cuidado, provocaquemaduras).

5 ml

Calentar a en bao de agua hirviendopor 5 a 7 min. Un color rojo intenso, esprueba positiva.

GruposS

H


Hidrxido de sodio al 40 % (NaOH),(cuidado, provoca quemaduras).

1ml

Acetato de Plomo al 0.5 % 1 ml

Mezclar bien, calentar a bao de aguahirviendo por 4 min, un precipitado negroes prueba positiva.

sakachi


Reactivo de sakaguchi 0.5 ml

Mezcla bien y observar.

reaccin

delcido

glioxlico


cido actico glacial, (cuidado, provocairritacin en piel y fosas nasales).

2 ml


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H2SO4 concentrado, (cuidado, provocaquemaduras). Dejar caer lentamente porlas paredes del tubo inclinado, hasta quese formen dos capas. NO AGITE.Observe el cambio de color en la

interfase. Si se forma un anillo violeta enla interfase de los dos lquidos, lareaccin se considera positiva

2 ml

reaccinde

laninhidrina

Extracto problema, ajustar pH a 7.0 1 ml

Solucin de ninhidrina, hervir a baomara por 2 min. Observar coloracinvioleta o morado intenso.

1 ml

pruebadePauly

Acido sulfanlico 1 ml

Extracto problema 2 ml

Enfriar en hielo

Agregar solucin de NaNO2 y dejarenfriar por 3 min.

1 ml

Adicionar Na2CO3. Anotar coloresformados.

2ml

pruebadel

Nitroprusiato

Solucin de nitroprusiato de sodio 0.5 ml

Mezclar con el extracto problema 2 ml

Adicionar Hidrxido de amonio (cuidado,provoca quemaduras y es irritante parapiel y fosas nasales), deje reposar por 5min.

0. 5 ml

Marcha de la prctica parte 2:

prueb

a

procedimiento

en un tubo de ensayo colocar:

cantidad

aadicionar:

Anote aqu el

resultadoObtenido.

Realice aqu apuntes

importantes para elanlisis deresultados.

Precipit

acin


cido pcrico saturado 1 ml


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Agite y observe la formacin precipitado(enturbamiento)

Precipitacinacdica


cido actico al 30% 0.5 ml


Solucin saturada de Cloruro de sodio (NaCl) 1 ml

Mezclar bien y calentar a la llama por 1 min. sepresenta un enturbamiento ms o menos intensoque persiste al enfriamiento, tambin puedeobservarse pequeos grumos en las paredes deltubo. Observe el tubo sobre un fondo oscuro.

precipitacin

acdica

extracto problema 2ml

cido tricloroacetico al 10% 2 ml


Solventes

orgnicos


Etanol al 95%. 2 ml

Observe la formacin de precipitado

(enturbamiento)

Solventes

orgnicos


Acetona 2 ml

Observe la formacin de precipitado(enturbamiento)

Sulfatodeamonio


Solucin de Sulfato de amonio al 50 % 2 ml

Mezclar bien. Dejar en reposo durante 10 min.Observe si se forma un Precipitado. Centrifugara 3000 r.p.m. por 10 min., observar. La reaccinpositiva se manifiesta por la formacin de unprecipitado, dependiendo directamente de laconcentracin de albmina presente en lamuestra.


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Desnaturalizacin

porcalor


Caliente en agua hirviendo durante 10 minutosasegurndose que la temperatura interna lleguea los 95 100C. Observe la formacin de

precipitado (enturbamiento).

Metales

pesados

Extracto problema 2 ml

Gotas del metal 5 gotas

Calentar suavemente a bao mara si noobserva reaccin inmediata.

Tabla 2: Marcha de la prctica 1.

Cuestionamientos que sirven de gua para la redaccin del anlisis de resultados:

1. Cules son los fundamentos qumicos de las pruebas estudiadas para el reconocimiento de aminocidos. Enesta parte Usted tiene que analizar el fundamento terico de la prueba y el resultado obtenido ( de donde seobtiene el color obtenido, que indica cada prueba?.

2. Qu relacin qumica tiene la cadena R de los aminocidos y las pruebas realizadas?.

2. Explique con argumentos vlidos el comportamiento observado de las proteinas en cada una de las pruebas deprecipitacin. Que indica la presencia de precipitado?

3. Determine mediante graficas el extracto que ms pruebas positivas obtuvo y analice esta situacin.

Sistema de Evaluacin

Evaluacin individual:

cada estudiante debe presentar en forma escrita lo solicitado en el preinforme.

Asistencia, desempeo y desenvolvimiento durante la sesin de laboratorio

Evaluacin grupal:

el grupo de trabajo debe presentar un informe de laboratorio en la fecha acordada por el tutor. (verdescripcin de producto a entregar.

Informe o productos a entregar

Hay dos formas de presentar el informe de laboratorio. La forma definitiva deber ser concertada entre el tasignado y el grupo de estudiantes:

Informe escrito: mediante entrega personal al tutor de laboratorio: el contenido ser: objetivos, introduccmarco terico (mximo 2 hojas), resultados (tabulados, se puede incluir registros fotogrficos), anlisisresultados, conclusiones, bibliografa.

Sustentacin Oral con ayudas audiovisuales: el contenido ser: objetivos, resultados (tabulados, se puede inc


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registros fotogrficos), confrontacin de resultados y marco terico para dar el respectivo anlisis de resultadconclusiones, bibliografa.

PRACTICA No. 2 FRACCIONAMIENTO DE PROTENAS EN SEMILLAS DE

LEGUMINOSAS Y CEREALES POR SOLUBILIDAD1

Tipo de practicaPresencial X Autodirigida Remota

Horas de la practica 4 HTemticas de la prctica Unidad 1: Biomolculas, especficamente el captulo 2, pptidos y

protenas, leccin 10: Clasificacin y Propiedades Fisicoqumicas.

Intencionalidades formativas Propsitos

Comprobar la teora con la prctica en relacin al comportamiento

segn la solubilidad de protenas.

Obtener las fracciones de albminas, globulinas, prolaminas yglutelinas a partir de tejidos biolgicos.

Calcular mediante espectrofotometra, la concentracin de proteinasen cada una de las fracciones anteriores.

Objetivos

Que el estudiante compruebe la teora con la prctica en relacin alcomportamiento segn la solubilidad de protenas.

Que el estudiante obtenga las fracciones de albminas, globulinas,prolaminas y glutelinas a partir de tejidos biolgicos.

Que el estudiante calcule mediante espectrofotometra, laconcentracin de proteinas en cada una de las fracciones anteriores.

COMPETENCIAS

El estudiante describe y analiza de manera eficiente los resultados delfraccionamiento de protenas con cada uno de los solventes utilizados.

El estudiante conceptualiza en forma precisa la relacin que tiene

cada fraccin de protena y el solvente usado.El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a travs de laelaboracin de informes escritos.

Metas

1 Prez, G. Navarro, Y. (1992). Bioqumica. Santa Fe de Bogot DC: Unisur.


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El estudiante obtendr su calificacin del respectivo pre informepersonal como resultado del estudio independiente.


El estudiante presentar en forma escrita el informe del respectivolaboratorio en forma grupal en donde sobresalga el anlisis deresultados.


El estudiante como parte de su autogestin en el desarrollo de su aprendizaje autnomo, se servir investigantes de la prctica y a manera de pre informe los siguientes temas, enfatizando en la reacciones qumicas qutienen lugar y el principio del mtodo:

1. Solubilidad y precipitacin de las protenas

2. Clasificacin de Osborne de las protenas, por el criterio de solubilidad

3. Mtodos cuantitativos para la determinacin de protenas (Biuret, Folin- Lowry, Bradford).

Nota: algunas de las temticas las encuentra en el mdulo del curso.

Como fuentes documentales consulte:

Prez, G. (1992). Ciclo de krebs. En G. Prez, BIOQUIMICA (pg. 163). Bogot DC: Unisur.

Rodney, B. (1999). El ciclo del cido ctrico. En B. Rodney, Conceptos de Bioqumica (pgs. 489-494). Mxic

International Thomson Editores S.A de C.V.

Rawn, J (2005). Bioqumica. Madrid: Interamericana-McGraw_Hill.

Descripcin de la practica

En esta prctica mediante prueba cuantitativa, se identifica y se calcula la extraccin fraccionada de locomponentes protenicos de las semillas de leguminosas y cereales, utilizando para ello la diferencia dsolubilidades de los diferentes tipos de protenas.

Cuantificar cada una de las fracciones obtenidas utilizando el mtodo de Folin- Lowry Biuret.

Se desarrolla pruebas para analizar el comportamiento y la solubilidad de protenas en tratamientos dprecipitacin y desnaturalizacin salina.

Esta prctica corresponde a los temas que se tratan en la Unidad 1: Biomolculas, especficamente el captulo pptidos y protenas, leccin 10: Clasificacin y Propiedades Fisicoqumicas.

Es de vital importancia para los estudiantes de la formacin profesional y tcnica de los programas de ingeniera dalimentos, agroforestal, agronmica, zootecnia, produccin animal y regentes de farmacia, el desarrollo de esprctica, ya que identifican a partir de un tejido vegetal los diferentes tipos de protenas de acuerdo a s


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solubilidad y analizar a partir de ello, la relacin que guarda dicho comportamiento y su funcin biolgica.


Material de vidrio Material biolgico y otros(estudiantes)

Reactivos Equipos

Tubos de ensayo Harinas de diferentescereales y leguminosas:soya, arveja, trigo y frijol.

Reactivo de folin. Estufas ( 5)

gradillas tapabocas Solucin de sulfato de cobre tartratosdico de potasio (5g/l deCuSO4.5H2O en tartrato sdicopotsico 10 g/l).

Espectrofotmetro

esptulas Libros de bioqumica Carbonato de sodio en NaOH 0.1 mol/l. Centrifuga

Pipetas 1, 5 y 10ml

Marcador de vidrio NaCI al 1%, Balanza analtica

Balones aforadosde 25 ml

Cinta para rotular Etanol al 75%,

Vasos deprecipitado de1000 ml plstico

Cuaderno de laboratorio NaOH 0.1 N,

Vasos deprecipitado de 600

plstico

Bata blanca Solucin patrn de albmina de huevode concentracin conocida. (0.25

mg/ml).

Agitador de vidrio Marcador para vidrio Reactivo de Biuret.

Erlenmeyers 100y 250 ml

Vasos deprecipitado 250 ml

Vasos precipitado500 ml

Probeta 100 ml

Vidrios relojgrandes



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Software a utilizar en la practica

Documento tutorial sobre el procedimiento de obtencin del a ecuacin de la recta a partir de la curva patrn dBSA.

https://dl.dropboxusercontent.com/u/51764879/ORIENTACIONES%20%20PARA%20EL%20DESARROLLO%20EERCICIO%20FRACCIONES.pdf

Se recomienda observar el siguiente video sobre el uso del espectrofotmetro u otro material multimedsemejante:

http://www.youtube.com/watch?v=4KU8eqcjNeQ


Las situaciones o eventos de peligrosidad se pueden presentar en el manejo del reactivo de Folin, se recomiend

usar guantes, tapabocas y gafas de seguridad.

Metodologa

Conocimiento previo para el desarrollo de la prctica.

Unidad 1: Biomolculas, especficamente el captulo 2, pptidos y protenas, leccin 10: Clasificacin Propiedades Fisicoqumicas. Mtodos cuantitativos para la determinacin de protenas (Biuret, Folin- LowrBradford).

Forma de trabajo: Estimado estudiante a continuacin encontrar los pasos a seguir para el desarrollo de prctica #2 del curso.


Quiz de laboratorio individual #1:

En esta prctica no hay preinforme, en su lugar el estudiante se prepara para un Quiz escrito.

La temtica a evaluar es: Modulo: Leccin 10: Clasificacin y Propiedades Fisicoqumicas 10.1 Clasificacin dprotenas (albminas, globulinas, prolaminas y glutelinas).

El contenido y forma de pregunta queda a disposicin del tutor asignado de los laboratorios del curso.

Trabajo grupal

Hay dos formas de presentar el informe de laboratorio. La forma definitiva deber ser concertada entre el tutasignado y el grupo de estudiantes:

Informe escrito: mediante entrega personal al tutor de laboratorio: el contenido ser: objetivointroduccin, marco terico (mximo 2 hojas), resultados (tabulados, se puede incluir registrofotogrficos), anlisis de resultados, conclusiones, bibliografa.

Sustentacin Oral con ayudas audiovisuales: el contenido ser: objetivos, resultados (tabulados, se puedincluir registros fotogrficos), confrontacin de resultados y marco terico para dar el respectivo anlis


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de resultados, conclusiones, bibliografa.

Procedimiento:

Preparacin de la muestra

Pesar 2.0 g de muestra (en cada caso ser una de las harinas de: arveja, soya, frjol, haba, trigo, cebada, etcpasarla a un tubo de ensayo, agregar 10 ml de H2O desmineralizada, agitar manualmente durante 10 minutos centrifugar la suspensin a 2500 rpm por 3 minutos. Vaciar el sobrenadante a un baln aforado de 25 ml. Al residuagregar de nuevo otros 10 ml de H2O desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior.

Despus de centrifugar, el sobrenadante de esta segunda extraccin se adiciona al baln que contiene al primsobrenadante. Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase. As se tiene separada fraccin de las albminas:

figura 1: fraccionamiento de protenas en semillas de leguminosas y cereales por solubilidad

Sobre el residuo que queda de la separacin de las albminas, se repite ahora todo el proceso anterior, peragregando esta vez NaCl al 1%. Despus de centrifugar, los sobrenadantes de la primera y segunda extracci


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con NaCl al 1%, se llevan a otro baln aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1%Esta es la fraccin de las globulinas.

Sobre el residuo anterior se extrae en idntica forma la fraccin de las prolaminas, usando esta vez alcohol etlical 75% y una temperatura de extraccin cercana a 60C.

Por ltimo sobre el mismo residuo, con la adicin de solucin de NaOH 0.1 N y aplicando el mismo procedimiengeneral, se separa la fraccin de las glutelinas.

Mtodo de Biuret :

Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo proceder a la determinacide protenas, aplicando el mtodo de Biuret.

La curva de calibracin se har utilizando como patrn una solucin de albmina de huevo de concentraciconocida.

Para las muestras de soya, arveja y frjol, de las fracciones de albminas y glutelinas deber tomarse para cad

una y por aparte, una alcuota de 0,5 ml y llevarse a un volumen de 5 ml (dilucin 1 a 10) con agua desmineralizadpara las albminas y con NaOH 0,1 N para las glutelinas. Estas diluciones se usarn como extractos problemapara dichas fracciones.

En 15 tubos de ensayo rotulados pipetear en c/u las cantidades de reactivos que se indican en el siguiente cuadro

CondicionesTubos

B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Sol. patrnalbumina, ml

0.1

0.3

0.5

0.7

0.9

1.2

Fraccinalbuminas, ml

0.5

1.0

Fraccinglobulinas, ml

0.5

1.0

Fraccinprolaminas, ml

0.5

1.0

Fraccin glutelinas,ml

0.5

1.0

H2O destilada, ml 2 1.9

1.7

1.5

1.3

1.1

0.8

1.5

1.0

1.5

1.0

1.5

1.0

1.5

1.0

Reactivo de Biuret en todos los tubos: 4 ml

Tabla 5: batera de tubos mtodo Biuret para la cuantificacin de protenas

Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o introducir los tubos en un bao de agua 30C durante 10 minutos para desarrollo del color. Leer en cada tubo porcentaje de transmitancia a 540 nm usand


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el tubo B para ajustar el 100% de transmitancia.

2. Clculos y resultados

Consultar tablas de conversin para pasar porcentajes de transmitancia a los correspondientes valores dabsorbancia o calclelos utilizando la frmula:

A = 2 - log (%T)

Trazar en papel milimetrado la grfica de calibracin (absorbancia en ordenadas vs. concentracin (mg/mI) eabcisas) e interpolar las Absorbancias de los tubos problemas; proceder, teniendo en cuenta las diluciones de cadcaso, a calcular los porcentajes de cada fraccin protenica.

Debern compararse los valores obtenidos con los que se hallen en la literatura consultada.

Mtodo de Foln- lowry :

Preparacin de los reactivos:

1. Solucin alcalina de carbonato de sodio (Na2CO3 20 g/l en NaOH 0.1 mol/l).Se debe preparar primero el NaOHal 0.1 M y luego el carbonato se debe disolver en este, preparar 200 ml.

2. Solucin de sulfato de cobre tartrato-sdico potsico: Preparar una solucin de sulfato de cobre SO4Cu entartrato sdico potsico 10 g/l) preparar de esta solucin 300 ml.

3. El da de la prctica se debe preparar la solucin salina: mezclar 50 ml de (1) y 1 ml (2).

4. El reactivo de Folin se debe diluir: en un volumen igual de agua, el mismo da que se va a utilizar. 1:1

5.Patrn de protena: 0.25 mg/ml

Procedimiento: a 1 ml de muestra agregue 5 ml de una solucin alcalina (mezclar 50 ml de la solucin alcalina dcarbonato de sodio ms 1 ml de solucin de sulfato de cobre tartrato sdico potsico). Mezcle vigorosamente ydeje reposar a temperatura ambiente por 10 min o ms. Agregue 0. 5 ml del reactivo de Folin en forma rpida ymezclando inmediatamente. Despus de 30 minutos lea la Absorbancia a 750 nm. Utilice un blanco de reaccin.

REACTIVO BLANCO T1 T2 T3 T4 T5 T6 M1 M2

H2O 1 ml0.9ml

0.8 ml 0.7ml0.6ml

0.5

ml-0

PATRON ml --- 01 0.2 0.3 0.4 0.5 1 ---- ---

PROBLEMA ------ --- --- --- --- --- -- 1ml 1ml

SOLUCIONALCALINA ( Folin A+C)

5 ml en todos los tubos: agitar bien y esperar 10 minutos.

REACTIVO DEFOLIN DILUIDO

0.5 ml, esperar 30 minutos en la oscuridad luego leer la absorbancia a 500 750 nm.


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1:1

1:2

Tabla 6: batera de tubos mtodo Folin Lowry para la cuantificacin de protenas .

Determine la concentracin de protenas de una solucin problema despus de preparar una curva patrn conBSA (albmina srica bovina).

Expresin de resultados:

Complete la siguiente tabla:

tubo Absorbancia(nm= )

Concentracin de protena (mg/ml)

T1T2T3T4T5T6M1M2

Tabla 7: presentacin de resultados prctica 2.

Para hallar la concentracin del patrn en mg/ml, debe realizar el respectivo anlisis de la concentracin de solucin patrn: 0.25 mg/ml y el volumen que se toma de la solucin patrn.

5. Con los valores de Absorbancia y Concentracin graficar:

Concentracin de protena en las abscisas (X) y Absorbancia en la ordenadas (Y).

6. Obtenga la ecuacin de la recta por regresin lineal y el coeficiente de regresin. Ecuacin del tipo y = m x+ b. Se recomienda que el valor del coeficiente de correlacin sea como mnimo de 0.995.

La ecuacin encontrada, servir para realizar los clculos de concentracin de protena en mg/ml de M1 y M

Sistema de Evaluacin


cada estudiante debe presentar en forma escrita u oral lo solicitado en el pre informe.

desempeo y desenvolvimiento durante la sesin de laboratorio

Evaluacin grupal:

El grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor , que contenga: portada,introduccin, objetivos, tabla de resultados, anlisis y confrontacin de resultados, desarrollo de cuestionarios.Conclusiones y bibliografa.


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Informe o productos a entregar

Pre informe antes de la prctica e Informe de laboratorio finaliza da la prctica.

Rbrica de evaluacin

Tabla 7: Rbrica de la prctica 2.

Nota: La puntuacin anterior puede ser ponderada de acuerdo al # de sesiones en cada Cead, de acuerdo a losrecursos disponibles, para lo cual dicha ponderacin debe guardar relacin proporcional con los tems de larbrica general que se presenta.

Retroalimentacin

El tutor de la prctica tendr diez (10) das hbiles para enva o entregar la respectiva retroalimentacin dinforme de laboratorio siguiendo lo estipulado en la rbrica de evaluacin.


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PRACTICA No. 3 ENSAYOS ENZIMATICOS CUALITATIVOS

Tipo de practica

Presencial X Autodirigida Remota

Horas de la practica 1HTemticas de la prctica Unidad 1: Biomolculas, especficamente el captulo

Enzimas.Intencionalidades formativas Propsitos

Entender el papel de las enzimas como catalizadores de lodiferentes procesos bioqumicos y su importancia en lodiferentes procesos metablicos.

Analizar, mediante reacciones cualitativas la actividaenzimtica de la sacarasa y alfa-amilasa.

Establecer relaciones entre la estructura y la funcin de laenzimas y prdida de esta al variar al variar su temperaturptima de trabajo.

Objetivos

Que el estudiante entienda el papel de las enzimas comcatalizadores de los diferentes procesos bioqumicos y simportancia en los diferentes procesos metablicos.

Que el estudiante analice mediante reacciones cualitativala actividad enzimtica de la sacarasa y alfa-amilasa.

Que el estudiante establezca relaciones entre la estructura

la funcin de las enzimas y prdida de esta al variar al variasu temperatura ptima de trabajo.

COMPETENCIAS

El estudiante describe y analiza de manera eficiente loresultados observados en cada prueba cualitativa y relacionel marco terico y los resultados para dar el respectiv


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anlisis.

El estudiante conceptualiza en forma precisa la relacin qutiene la prueba para carbohidratos y la actividad enzimtica

El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a travde la elaboracin de informes escritos.

Metas


El estudiante obtendr su calificacin del respectivo prinforme personal como resultado del estudio independiente.


El estudiante presentar en forma escrita el informe delrespectivo laboratorio en forma grupal en donde sobresalgael anlisis de resultados.


El estudiante como parte de su autogestin en el desarrollo de su aprendizaje autnomo, seservir investigar antes de la prctica y a manera de pre informe los siguientes temas:

1. Captulo 3: enzimas, de la Unidad 1: Biomolculas del mdulo del curso. Adicionalmenterealizar la siguiente investigacin:

2. Qu es la sacarasa, cual es su sustrato, a qu clase de enzima pertenece, cules son susproductos de hidrlisis. En qu consiste la prueba de Fehling y para qu clase de carbohidratoses indicativa, Por que se usa la prueba anterior en la actividad de la sacarasa?

3. Estructura qumica del substrato para la alfa-amilasa., enlaces que rompe o hidroliza la -

amilasa, clase de enzima que es la - amilasa, Productos de la hidrlisis de la - amilasa. En

qu consiste la reaccin de lugol el almidn? que entienden por temperatura ptima de unaenzima, en el cuerpo humano donde se encuentra esta la - amilasa?, que se entiende con pHptimo de una enzima?.

4. estructura del almidn y su mecanismo de hidrlisis: enzimas implicadas.



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En esta prctica mediante pruebas coloreadas, se identifica los productos de hidrlisis de laaccin de la sacarasa sobre la sacarosa, y la accin de la alfa- amilasa sobre el almidn.

Inicialmente se debe eatraer la enzima sacarasa o sucrasa de la levadura mediante mtodosutilizados en la separacin de protenas y determinar tanto su presencia como su actividad

enzimtica.

Demostrar que en la saliva existe actividad - amilsica. Comprobar el efecto de laconcentracin de la enzima sobre la velocidad de la reaccin. Determinar el pH ptimo de laenzima - amilasa Comprobar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica.

Estas prcticas corresponde a los temas que se tratan en la Unidad 1: Biomolculas,especficamente el captulo 3, Enzimas.

Es de vital importancia para los estudiantes de la formacin profesional y tcnica de losprogramas de ingeniera de alimentos, agroforestal, agronmica, zootecnia, produccin animal y

regentes de farmacia, el desarrollo de estas prcticas, ya que profundizan y analizan la relacine importancia que guardan las enzimas, las cuales son de naturaleza protena, por lo tanto sula funcin biolgica debe ser afectada por los mismos factores que las protenas.


Material de vidrio Material biolgico (estudiantes)

Reactivos Equipos

Vaso de precipitado de 50ml

Vaso de precipitado de 50ml( para el grupo 2)

Levadura granuladacomercial. (No sirve

pulverizada).

300 ml Acetona Estufa a 38C

Mortero con mango Solucin de saliva. Agua destilada Balanzas (5)

esptula 100 ml de Solucin desacarosa al 5%

Estufas (4)

Vidrio reloj Reactivo de Fehling Mallas (4)


Hielo Termmetros (4)


100 ml TCA al 10% Bao termostatado a 38Cpreviamente.


200 ml Solucin dealmidn 2%.

Papel filtro ( 5 para cadagrupo)


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Vaso de precipitado plsticode 1000 ml

100 ml de KCl al 1.0% pHmetro ( 2)

Vaso de precipitado plsticode 600 ml

100 ml de solucin delugol.

hielo

Agitador de vidrio 50 ml Solucin cidotartrico al 1%

Termmetro de mercurio(grupo 2)

Pipeta pasteur 50 Solucin deNaOH al 0.1 N

Equipo de filtracin al vacio.

Probeta de 100 ml 50 Solucin deNaOH al 0.5 N

Embudos y soporte 50 ml de buffer fosfato pH 6.9-7.0

Erlenmeyers 250 ml 50 ml de cidoclorhdrico al 10%

Erlenmeyers 50 ml 100 ml de solucin deglucosa al 5%

Tubos de ensayo Reactivo deselliwanoff

gradillas 150 ml de acidotartrico al 1%

Pipetas 1, 5,10 ml 150 ml de NaOH 0.1M

Pinzas para tubos deensayo

Solucin de HCl al5%, Solucin deNaOH al 5%

Pinzas de madera paratubos de ensayo

Hielo y agua caliente



Ninguno.




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cidos inorgnicosconcentrados

Gafas de seguridad, tapabocas.

Metodologa

Conocimiento previo para el desarrollo de la prctica:

Captulo 3: enzimas, de la Unidad 1: Biomolculas del mdulo del curso.

Forma de trabajo:

Estimado estudiante a continuacin encontrar los pasos a seguir para el desarrollo de laprctica #3 del curso.


Trabajo individual: el estudiante obtiene las guas de laboratorio, prepara un pre informe quecontenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la prctica ytabla de resultados en blanco.

Trabajo grupal: En grupo de trabajo, todos los estudiantes realizan la prctica #3 de laboratorio,para ello previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que edesempeo individual como grupal, sern tenidos en cuenta en la rbrica de evaluacin deinforme de laboratorio.

Producto a entregar: Informe escrito de laboratorio mediante entrega personal al tutor.

Procedimiento:

1. Experimento No. 1 Sacarasa

1.1 extraccin de la enzima:

Tome 17 gramos de levadura granulada (no utilice levadura molida) en un mortero y tritrela.Una vez reducida a polvo, transfirala a un vaso de precipitado que contenga 100 ml de aguadestilada y agite durante 10 minutos. Filtre a travs de tela y luego a travs de papel de filtro enun embudo.

Vierta el filtrado en un vaso de precipitado y agregue 50 ml de acetona. Mezcle bien y deje lamezcla quieta durante 10 minutos. Decante parte del lquido cuidando de no perder elprecipitado porque es donde esta la enzima sucrasa, colquela en hielo para evitar ladesnaturalizacin. Marque el recipiente como SOLUCIN DE ENZIMA.

1.2 marcha de la prctica:


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prueba PROCEDIMIENTO


V (ml) RESULTADO

ANALISIS

DE

RESULTADOS

actividadenzimtica

enzimahervida

Solucin de enzima 3 ml

Agua destilada 3 ml

Disuelva el precipitado y lleve aebullicin a 95 C internamente por10 minutos. a bao mara.

Deje enfriar, adicionar sacarosa ensolucin fresca.

2 ml

Colocar el tubo a 38C durante 30

minutos

Realizar prueba de Fehling

prueba deFehling

En un tubo aparte colocar:

Solucin A de Fehling 1 ml

Solucin B de Fehling 1 ml

Agua destilada 3 ml

Solucin enzima hervida 3 ml

Colocar el tubo en una solucin deagua hirviendo por 5- 10 minutos

Observar

seliwanoff Enzima hervida 5 ml

Reactivo de selliwanoff 5 ml

Caliente a bao Maria

Observar.

actividadenzimtica

enzimacruda

Solucin de enzima 3 ml

Agua destilada 3 ml

adicionar sacarosa 2 ml

Colocar el tubo a 38C durante 30


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minutos

Realizar prueba de Fehling

prueba de

Fehling




Agua destilada 3 ml

Solucin enzima hervida 3 ml

Colocar el tubo en una solucin deagua hirviendo por 5- 10 minutos

Observar ..

Repita la prueba de Fehling usandoen vez de la solucin de enzimacruda glucosa al 5%

Observar

seliwanoff Enzima cruda 3ml

Reactivo de seliwanoff 1 ml

Caliente a bao Mara y observar

Repetir el procedimiento de laprueba de selliwanoff pero en lugarde la enzima hervida colocarfructosa al 5%

3 ml

Observar en los dos tubos si hayformacin de un color rojo intensoindicativo de cetosas comofructosa proveniente de la Hidrlisisde la sacarosa.

l

Tabla 9: Marcha de la prctica 3.

Cuestionario:

1. Por qu se utiliza acetona para precipitar la enzima?2. Diga cules son los fundamentos qumicos de las pruebas estudiadas para e

reconocimiento de la hidrlisis de la sacarosa. En esta parte Ud tiene que analizar elfundamento terico de la prueba y el resultado obtenido ( de donde se obtiene el colorobtenido, que indica cada prueba?


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3. Qu le sucede a la sacarosa al ser tratada con la enzima sucrasa?

2. Experimento No. 2: -amilasa

2.1 Obtencin de la enzima:

Se debe recolectar una muestra de saliva para obtener una solucin de enzima. Para elloenjuguese varias veces con agua de bolsa y proceda a recoger en un beaker de 50 maproximadamente 10 ml de saliva.

Adicione a la saliva 10 ml de agua destilada y mezcle bien. Filtre la solucin de saliva y rotule e

erlenmeyer como SOLUCIN DE ENZIMA - AMILASA, mantngala incubada a 37 - 38C.

2.2 Marcha de la prctica

Pruebas PROCEDIMIENTO


V(ml) RESULTADO ANALISIS DE

RESULTADOS

Preparacin dela solucin dereaccin

Alistar cuatro tubos de ensayo( marcar del 0-4):

Adicionar Acido tricloroaceticoal 10%

0.5 ml

Aparte en un beaker de 50 mlPreparara r una solucin dereaccin:

Solucin de almidn (hervirdurante 2 minutos).

Enfriar y agregar aguadestilada

6.0 ml

2.0 ml

Cloruro de potasio 1.0 % eincubar a 38C.

2.0 ml

ACTIVIDADENZIMATICA

DE LA

- AMILASA.tiempo : cincominutos

Solucin de reaccin* 10 ml Agitar y tomar inmediatament

esolucin alfa- amilasa* 6 ml

tomar de esta solucin 3 ml

Colocarla en el tubo 0 concido tricloroacetico

Gotas reactivo de lugol gota agota hasta coloracin rojiza o

Gotas


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caf.

ACTIVIDADENZIMATICADE LA

- AMILASA.tiempo : 10minutos

Solucin de reaccin+ amilasa*( la misma cantidad dearriba)

tomar de esta solucin a los 10minutos

3 ml


Gotas reactivo de lugol Gotas



Solucin de reaccin+ amilasa*( la misma de arriba)

tomar de esta solucin a los 20

minutos

3 ml


Gotas reactivo de lugol gota agota hasta coloracin rojiza ocaf.

Gotas5



Solucin de reaccin+ amilasa*( la misma de arriba)

tomar de esta solucin a los 30minutos 3ml


Gotas reactivo de lugol gota agota hasta coloracin rojiza ocaf.

Gotas

Prueba deFehling




Agua destilada 2 ml

Solucin restante de reaccin+ amilasa*

3ml


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38



Colocar el tubo en unasolucin de agua hirviendopor 5- 10 minutos

Observar

Tabla 10: Marcha de la prctica 3 alfa- amilasa.

Cuestionario:

Explique y analice los resultados obtenidos cuando reacciona con el lugol, que resultados se obtiene? Que coloracin produce los productos de la hidrlisis del almidn y cuales son?

2.2 preparacin de la solucin de enzima y Efecto de la concentracin de la enzimasobre la velocidad de reaccin

Se debe recolectar una muestra de saliva para obtener una solucin de enzima. Para elloenjuguese varias veces con agua de bolsa y proceda a recoger en un beaker de 50 maproximadamente 10 ml de saliva.

Adicione a la saliva 10 ml de agua destilada y mezcle bien. Filtre la solucin de saliva y rotule e

erlenmeyer como SOLUCIN DE ENZIMA - AMILASA e incube a 38C.

Prepare cuatro tubos de ensayo de la siguiente forma:

Tubo

reactivo

1 2 3 4

Cloruro depotasio

0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml

Solucin dealmidn

0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

Agua destilada 1.2 ml 1.1ml 1.0 0.9

Tabla 11: batera de tubos efecto de la concentracin, alfa-amilasa.

Adicione a cada tubo: (no se olvide agitar)Tubo

reactivo1 2 3 4

enzima 0.5ml 2 ml 3.5 ml 5 ml


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Coloque cada tubo a incubar a 38C por 20 minutos. Transcurrido 20 minutos en cada tubo deensayo adicionar 0.2 ml de acido triclorcetico al 10% y adicione de manera inmediata a cadatubo (o hasta el 4) t gotas del reactivo de lugol.

Cuestionario:

Cul es la relacin del efecto de la concentracin de la enzima sobre la velocidad dereaccin en la enzima segn el experimento?

Cul es el papel del acido tricloroacetico?2.3 Determinacin del pH ptimo de la - amilasa salival

Mida el pH de:

cido tartrico al1%. Tomar pH ________

Acido clorhdrico al 10%. Tomar pH

NaOH al 0.1 N Tomar pH ____

NaOH al 0.5 N Tomar pH ____

Prepare cinco tubos de ensayo as:

Tuboreactivo

1 2 3 4 5

cidoclorhdrico al10%

1.0 ml

cidotartrico al1%

1.0 ml

Buffer fosfatopH 6.9

1.0 ml

NaOH 0.1 N 1.0 ml

NaOH 0.5 N 1.0 ml

KCl 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml

Solucin dealmidn

0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

Agua 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml


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destilada

Tabla 12: batera de tubos efecto del pH, alfa-amilasa.

Adicione a cada minuto a cada tubo: (no se olvide agitar)

Tuboreactivo

1 2 3 4 y 5

enzima 4 ml 4 ml 4 ml 4 ml

Coloque cada tubo a incubar a 38C por 20 minutos. Transcurrido 20 minutos en cada tubo deensayo colocar 0.2 ml de acido triclorcetico al 10% y adicione de manera inmediata a cadatubo (o hasta el 4) tres gotas del reactivo de lugol.

Cuestionario:

Explique y analice los resultados obtenidos Cul es el papel del lugol en la reaccin de acuerdo a los resultado grafique el comportamiento de la enzima frente a los

cambios de pH. Escriba el valor ptimo de pH de la enzima y explique como llega Ud. A esa

conclusin.

2.4 efecto de la temperatura sobre el efecto de la actividad enzimtica.

Prepare tres tubos de ensayo as:

Tuboreactivo

1 2 3

Agua destilada 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml

KCL 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml

Solucin de almidn 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml

Tabla 13: batera de tubos efecto de la temperatura, alfa-amilasa.

Coloque el tubo #3 en bao con hielo por 20 minutos

Coloque el tubo # 1 por 10 minutos a 90C

Coloque el tubo # 2 a temperatura ambiente.

Anote las temperaturas respectivas en cada tubo. Despus de este tiempo aada a cada tubo:


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Tuboreactivo

1 2 3

enzima 2 ml 2 ml 2 ml

Coloque cada tubo a incubar a 38C por 20 minutos. Transcurrido 20 minutos en cada tubo deensayo aadir 0.2 ml de acido triclorcetico al 10% y adicione de manera inmediata a cada tubo(o hasta el 4) tres gotas del reactivo de lugol.

Cuestionario:

Cul es el papel de cloruro de potasio (KCL) presente en todo los experimentos al igualque el cido tricloroacetico?

de acuerdo a los resultado grafique el comportamiento de la enzima frente a loscambios de temperatura.

Escriba el valor de la temperatura ptima de la enzima y explique cmo llega Ud. A esa

conclusinExperimento No. 3: Degradacin Enzimtica De Polisacridos2

1. Coloque 3.0 mL de solucin de almidn y 2 gotas de saliva en tres tubos de ensayopreviamente marcados A, B y C.

2. Determine el pH en cada tubo, utilizando un pHmetro o papel indicador universalRegistre los resultados.

3. Agregue al tubo A 1.0 mL de cido clorhdrico al 5%; al tubo B 1.0 mL de NaOH al 5%; yal tubo C 1.0 mL de agua.

4. Prepara un bao Mara con una temperatura de 37 C y coloque los tres tubos de ensayodurante 10 minutos.

5. Retire los tubos de ensayo del bao Mara y aada cinco gotas de lugol a cada unoRegistre los cambios de color, olor, temperatura, etc. En otros tres tubos de ensayo,previamente marcados como D, E y F, adicione tres mL de almidn y dos gotas de saliva,a cada uno.

6. Durante diez minutos coloque el tubo D en hielo, el tubo E en el bao Mara a 37 C y etubo F en agua hirviendo.

7. Retire los tubos de ensayo D, E y F de las anteriores condiciones y agregue cinco gotasde lugol a cada uno. Registre todos los cambios que observe.

Cuestionario:

1. En qu situacin se registr la mayor actividad enzimtica y como la evidencia?Sistema de Evaluacin


2 Munera, R: (2008). GUA PARA PRCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUMICA. Palmira: UniversidadNacional Abierta y a Distancia.


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cada estudiante debe presentar en forma escrita u oral lo solicitado en el pre informe.

desempeo y desenvolvimiento durante la sesin de laboratorio

Evaluacin grupal: El grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada

por el tutor, que contenga: portada, introduccin, objetivos, tabla de resultados, anlisis yconfrontacin de resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografa.


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PRACTICA No. 4 ESTUDIO CINTICO DE LA UREASA3

Tipo de practica

Presencial X Autodirigida Remota

Horas de la practica 1 HTemticas de la prctica Unidad 1: Biomolculas, especficamente el captulo

Enzimas.Intencionalidades formativas Propsitos

Entender el papel de las enzimas como catalizadores de lodiferentes procesos bioqumicos y su importancia en lodiferentes procesos metablicos.

Evaluar la capacidad enzimtica de la ureasa frentecambios de pH, concentracin de enzima y temperatura.

Comparar mediante dos mtodos (espectofotometrico volumtrico), la capacidad enzimtica de la ureasa frente cambios de pH.

Objetivos

Que el estudiante entienda el papel de las enzimas comcatalizadores de los diferentes procesos bioqumicos y simportancia en los diferentes procesos metablicos.

Que el estudiante evale la capacidad enzimtica de ureasa frente a cambios de pH, concentracin de enzima temperatura.

Que el estudiante compare mediante dos mtodo

(espectrofotomtrico y volumtrico), la capacidad enzimticde la ureasa frente a cambios de pH, concentracin denzima y temperatura.

3 Prez, G. Navarro, Y. (1992). Bioqumica. Santa Fe de Bogot DC: Unisur.


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COMPETENCIAS

El estudiante describe y analiza de manera eficiente loresultados obtenidos en cada mtodo de anlis((espectrofotomtrico y volumtrico) y relaciona el marcterico y los resultados para dar el respectivo anlisis.

El estudiante conceptualiza en forma precisa la relacin qutiene cada prueba y el mecanismo enzimtico de la ureasa.

El estudiante comunica los conocimientos adquiridos travs de la elaboracin de informes escritos.

Metas


El estudiante obtendr su calificacin del respectivo prinforme personal como resultado del estudio independiente.


El estudiante presentar en forma escrita el informe delrespectivo laboratorio en forma grupal en donde sobresalgael anlisis de resultados.


El estudiante como parte de su autogestin en el desarrollo de su aprendizaje autnomo, sservir investigar antes de la prctica y a manera de pre informe los siguientes temas:

1. Captulo 3: enzimas, de la Unidad 1: Biomolculas del mdulo del curso. Adicionalmentrealizar la siguiente investigacin:

ureasa

2. presencia de grupos SH.

3. Oxidacin de los grupos SH


En esta prctica, se va a evaluar la presencia de la ureasa en leguminosas y tortas doleaginosas midiendo su actividad biolgica, mediante la hidrlisis de la urea. Se determinar sactividad, a travs de dos mtodos: el espectrofotomtrico y por titulacin con HCl


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En esta seccin de laboratorio hay dos prcticas: ensayos cualitativos y ensayos cuantitativos

De los ensayos cualitativos, el tutor de prctica tomar la decisin de realizar la prctica 1 o 2

Esta decisin estar basada en el tiempo y recursos disponibles.

En las experiencias cuantitativas, el tutor de prctica tomar la decisin de realizar la prctica1 o 2. Esta decisin estar basada en el tiempo y recursos disponibles.

Es importante que durante la sesin se realice un ensayo cualitativo y un ensayocuantitativo.


100 gramos de habas verdes (grupo 1)

100 gramos de frijoles verdes (grupo 2)

100 gramos de habichuelas verdes (grupo 3)

100 gramos de frijol de soya (grupo 4).

Hojas de papel milimetrado, regla, borrado y lpiz.

Buffer fosfato, a pH 5.0; 6.0; 7.2; 8.0 y 10.0 a 0.05 M

Solucin de Urea 0.25 M

Solucin de HgCI2 1%

Indicador de tashiro

Solucin de HCI 0.1 N

Buffer fosfato, a pH 4.0, 5.5, 7.0, 8.5,10.0 0.1 M 50 ml de c/u

Solucin de NaCl 1%

Solucin fenol nitroprusiato de sodio : 4,7g fenol y 6mg de nitroprusiato de sodio en 100ml deagua desionizada

Disolver 2g de NaOH en 100ml de agua desionizada y agregar 7,5ml de hipoclorito de sodcomercial al 5%. Guardar en frasco mbar.


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Solucin de HCI 1.0 M (titulada exactamente). Mortero con mango

Agitadores de vidrio, Tubos de ensayo, gradillas, Baln aforado de 25 ml , Vasos de precipitad,1000 ml de vidrio , Vasos de precipitado, 50 ml , 200,600., Vasos de precipitado, 200, 600,100ml plsticos., Pipetas 1, 10 y 5 ml, Probetas 100 ml y 50 ml, Estufas con mallas, esptulaespectrofotmetro, Centrifuga, Erlenmeyers de 50 y 250 , Incubadora o estufa entre 50-60CVidrio reloj, Balanzas analticas, Tablas de diseccin, Bureta de 25 ml , Pinzas y soporte partitulacin


Programa Excel.



cidos inorgnicosconcentrados

Gafas de seguridad, tapabocas.

Metodologa

Conocimiento previo para el desarrollo de la prctica.

Captulo 3: enzimas, de la Unidad 1: Biomolculas del mdulo del curso.

Forma de trabajo:

Estimado estudiante a continuacin encontrar los pasos a seguir para el desarrollo de prctica #4 del curso.


Trabajo individual: el estudiante obtiene las guas de laboratorio, prepara un pre informe qu

contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la prctica tabla de resultados en blanco.

Trabajo grupal: En grupo de trabajo, todos los estudiantes realizan la prctica #4 de laboratoripara ello previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que desempeo individual como grupal, sern tenidos en cuenta en la rbrica de evaluacin dinforme de laboratorio.


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Producto a entregar: Informe escrito de laboratorio mediante entrega personal al tutor.

Procedimiento:

Extraccin de la ureasa

Pesar 5 g de muestra (en cada caso ser una de las harinas de leguminosas o de las tortas doleaginosas), pasarla a un erlenmeyer, agregar 10 ml de NaCl 1%; agitar mecnicamendurante 15 minutos y centrifugar la suspensin a 2.500 rpm por 15 minutos; transferir sobrenadante a un baln aforado de 25 ml. Al residuo agregar de nuevo otros 10 mI de NaC1% y repetir exactamente el procedimiento anterior.

Reunir los dos sobrenadantes y completar a 25 ml con NaCI 1%. Este es el extracto qucontiene ureasa. Dejar en bao con hielo

Determinacin de la actividad a diferentes pH: pH ptimo de una enzima:

Mtodo 1:

Preprese 2 series de 5 tubos: 5 servirn como blanco y 5 para determinar el efecto de pH(Tubos p) rotulados claramente. Agregue lo indicado en el cuadro, incubndolos como se indicaTerminada la incubacin transfiera el contenido de cada tubo a un erlenmeyer diferentagregando a cada uno 3 gotas de indicador de tashiro; finalmente titule con HCI de normalidaconocida.

Primera Serie TUBOS BLANCO

CondicionesTubo

1 2 3 4 5

Urea 0.25 M, ml 5 5 5 5 5

Buffer Fosfato pH 5, ml 4.5


Buffer Fosfato pH 7.2, ml 4.5

Buffer Fosfato pH 8, ml 4.5 Buffer Fosfato pH 10, ml 4.5

HgCl2 1%, gotas 4 4 4 4 4

Incubar a 50 C durante cinco minutos agitando.

Extracto de Ureasa, ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5


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Incubar a 50 C durante 25 minutos. Titular con HCl 0.1 N

Volumen de HCl gastado en la titulacin

Tabla 15: bateras de tubos pH ptimo de la ureasa tubos blanco

Segunda Serie TUBOS PROBLEMA

CondicionesTubos P

1p 2p 3p 4p 5p

Urea 0.25 M, ml 5 5 5 5 5








HgCl2 1%, gotas 4 4 4 4 4

Titular con HCl 0.1N

Tabla 16: bateras de tubos pH ptimo de la ureasa, tubos problema

Expresin de resultados

Tabular los resultados obtenidos as:

Tubo nmero ml de HCl gastado Titulacin corregida Micromoles /ml deHCl gastado

1p

2p

3p

4p

5p


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Tabla 17: resultados pH ptimo de la ureasa, tubos problema

El valor corregido de la titulacin es la diferencia entre el volumen de HCl 0.1 N gastado en eblanco y el gastado en el problema (p) al mismo pH.

Tubo nmero Micromoles de urea hidrolizada pH correspondiente

1p

2p

3p

4p

5p

Tabla 17: resultados pH ptimo de la ureasa, tubos problema

Determinacin de la actividad a diferentes pH: pH ptimo de una enzima:

Mtodo 2:

Extracto enzimtico de material vegetal:

El extracto que contenga la ureasa se puede obtener de una serie de leguminosas, larecomendadas son: frijol, habas, habichuela y frijol soya. Pese aproximadamente 5,0 g dmaterial vegetal a utilizar, colquelo en un mortero y macere con 20ml de NaCl 1% previamentenfriado en un bao de hielo-agua y realice la extraccin por 15 minutos; luego Centrifuge po10min a 2500 rpm.

Transfiera el sobrenadante a un baln aforado de 50ml y el residuo transfiralo nuevamente mortero y realice una segunda extraccin con 10ml de NaCl al 1% y fro, por 15 min. Centrifuga 2500 rpm por 10 min y coloque el sobrenadante en el baln aforado y complete a volumen coNaCl al 1%. Guarde el extracto enzimtico refrigerado en un bao agua-hielo.

Marque doce tubos de ensayo y adicione a cada uno las siguientes soluciones:


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Tabla 18: resultados pH ptimos de la ureasa, mtodo espectrofotomtrico.

Mezclar bien el contenido de los tubos de ensayo y colocarlos en un bao termostatado entre 5y 60o C por 10 min para el desarrollo del color. Dejar enfriar y leer la absorbancia a 630 nm; si labsorbancia es mayor a 2.0, realizar la dilucin adecuada y volver a leer.

Cuestionarios:

Del mtodo 1: exprese grficamente en papel milimetrado, los micromoles de urea hidrolizado(en las ordenadas Y) Vs el pH en las abscisas (X). , para ello debe buscar resultados dgrupo que realice dicha determinacin.

Del mtodo 2: Haga una grfica de pH vs Absorbancia y de temperatura vs Absorbancia identifique el pH ptimo de la ureasa, para ello debe buscar resultados del grupo que realicdicha determinacin.

Compare los resultados del mtodo 1 y 2 y realice su propio anlisis y conclusiones.

Que efecto tiene el pH sobre la actividad biolgica de una enzima?

Mtodo 3:

El trabajo experimental se har en dos sesiones consecutivas de laboratorio as:

En la primera sesin se determinar el efecto del pH, concentracin de sustrato, temperatursobre la velocidad de la reaccin enzimtica.

En la segunda sesin se determinar la presencia de ureasa en leguminosas y tortas doleaginosas midiendo su actividad por el mismo mtodo utilizado en la sesin anterior.

1. Primera sesin


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1.1 Determinacin de la actividad a diferentes pH

Preprese 2 series de 5 tubos: 5 servirn como blanco y 5 para determinar el efecto de pH(Tubos p) rotulados claramente. Agregue lo indicado en el cuadro, incubndolos como se indicTerminada la incubacin transfiera el contenido de cada tubo a un erlenmeyer diferentagregando a cada uno 3 gotas de indicador de tashiro; finalmente titule con HCI de normalidaconocida.

Primera Serie TUBOS BLANCO

CondicionesTubo

1 2 3 4 5

Urea 0.25 M, ml 5 5 5 5 5






HgCl2 1%, gotas 4 4 4 4 4

Incubar a 50 C durante cinco minutos agitando.



Volumen de HCl gastado en la titulacin

Tabla 19: bateras de tubos pH ptimo de la ureasa tubos blanco mtodo 2

Segunda Serie TUBOS PROBLEMA

Condiciones Tubos P

1p 2p 3p 4p 5p

Urea 0.25 M, ml 5 5 5 5 5



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HgCl2 1%, gotas 4 4 4 4 4

Titular con HCl 0.1N

Tabla 20: bateras de tubos pH ptimo de la ureasa tubos problema mtodo 2

1.1.1 Expresin de resultados

Tabular los resultados obtenidos as:

Tubo nmero ml de HCl gastado Titulacin corregida Micromoles/ml deHCl gastado

1p

2p

3p

4p

5p

Tabla 21: expresin de resultados pH de la ureasa tubos problema mtodo 2

El valor corregido de la titulacin es la diferencia entre el volumen de HCl 0.1 N gastado en eblanco y el gastado en el problema (p) al mismo pH.

Exprese grficamente (grfica 1 de su informe) en papel milimetrado, los micromoles de ure

hidrolizados (en las ordenadas) vs el pH (en las abscisas). De acuerdo con los resultados de sgrfica, deduzca el pH ptimo, con el cual va a trabajar en las siguientes etapas.

Tubo nmero Micromoles de urea hidrolizada pH correspondiente

1p

2p


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3p

4p

5p

1.2 E

201103 bioquímica- guia lab 2014 (1)

Documents

reactivos prctica

bioqu mica

director de curso

material impreso

material didctico

reconocimiento cualitativo

preparacin de reactivos

fraccionamiento de protenas