24. März 2010

Vorteile eines colorimetrischen „Array-in-Well“ Assays, dargestellt am Beispiel der

Multiplexed Diagnostik der Atemwege.

Forum Biotech, Analytica 2010

Dr. Hanswilly MüllerSensovation

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24. März 2010

Gliederung

Einführung, Begriffserklärung, Motivation

Geräte-Evaluierung und Technologie Vergleich• Colorimetrische Fluoreszenz Detektion• Multiplex Modell – Assay

Colorimetrischer Assay zum Nachweis von Grippeviren• Assay-Entwicklung und Validierung

an Patientenproben

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24. März 2010

Gliederung

Einführung, Begriffserklärung, Motivation

Geräte Evaluierung und Technologie Vergleich• Colorimetrische Fluoreszenz Detektion• Multiplex Modell – Assay

Colorimetrischer Assay zum Nachweis von Grippeviren• Assay Entwicklung und Validierung

an Patientenproben

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24. März 2010

Multiplexing

Trend zur personalisierten Medizinerfordert bessere, mehr und häufigere diagnostische Untersuchungen

Simultane Messung verschiedenerParameter in einer ProbeProteine, DNA

Etablierte Multiplexing Techniken:Planare Microarrays hoher Dichte: DNA arraysBead-basierter Ansatz mit Durchflusszytometrie (bis zu100-plex)

Unser Ansatz: Planare Microarrays in 96 Well PlattenArrays geringer Dichte (z.B. 9 bis ca. 144 Spots pro Microarray)Ideal für den Nachweis von Protein-Markern, Genotypisierung

Colorimetrische- und Fluoreszenz Detektion

Multiplexed Diagnostics

24. März 2010

CLAIR®: Colorimetric Array Imaging Reader für Microarrays

CCD-basierter Imaging ReaderGeeigent für IVD

Eigenständiges GerätMit eingebautem Rechner, Kontroll-Software, Touch-Screen und integrierter Spot Auswertung

Für die quantitative Auswertung von Microarrays

Spot Größen von 50 – 500 µm

Schnelle BildaufnahmeCa. 2 Minuten pro Mikroplatte

Flexible Probenformate96-well Platte, Strip-well Platte, Objektträger

24. März 2010

Gliederung

Einführung, Begriffserklärung, Motivation

Geräte-Evaluierung und Technologie Vergleich• Colorimetrische Fluoreszenz Detektion• Multiplex Modell – Assay

Colorimetrischer Assay zum Nachweis von Grippeviren• Assay Entwicklung und Validierung

an Patientenproben

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Durchgeführt in Zusammenarbeit mit

VTT, Turku, Finland

24. März 2010

„Arrays in Well“ Plattformmit fluorogenen oder colorimetrischen Substraten

(C) 2009 Sensovation AG 10

Arrays in Well (AIW)

• Microarrays in 96-Well Platten • Multi-Analyt basierte Bioassays im einfachen und

vertrauten Mikroplatten Format

24. März 2010

Prinzip: Array in Well

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Prinzip von Fluoreszenz, Verstärkte Fluoreszenz und Colorimetrie

Fänger Antikörper

Antigen

Markierter Antikörper

Direkte Fluoreszenz

Protein Array, „Multiplexed Sandwich ELISA“

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H202

HRP

HRP

HRP

Fänger Antikörper

Antigen

Markierter Antikörper

CY3

CY3

CY3CY3CY3CY3CY3

CY3CY3

CY3

Verstärkte (Amplified) Fluoreszenz (Tyramide)

Protein Array, „Multiplexed Sandwich ELISA“

Prinzip von Fluoreszenz, Verstärkte Fluoreszenz und Colorimetrie

24. März 2010

TMB

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H202

HRP

HRP

HRP

TMB TMB TMB TMB

TMB

TMBTMB

TMBTMB

TMB

Fänger Antikörper

Antigen

Markierter Antikörper

Colorimetrie

Protein Array, „Multiplexed Sandwich ELISA“

Prinzip von Fluoreszenz, Verstärkte Fluoreszenz und Colorimetrie

24. März 2010

Technologie Vergleich anhand eines Modell Assays: CLAIR vs. Confocal Scanning

Färbe Technik: Colorimetrie im Vergleich zu direkter Fluoreszenz im Vergleich zu verstärkter FluoreszenzReader Technologie: CLAIR Tecan LS400

=>CCD-Imager Laser ScannerModell Assay

Adenovirus Hexon Protein (Virus Antigen)Verdünnungsreihe von 156 ng/mlbis 0.0009 ng/ml, plus LeerwertMultiplexed Sandwich ELISADoppelbestimmung

Jedes Näpfchen enthielt eine Anordnung von 3 x 3 Spots

Array Layout

24. März 2010

CLAIR Konfokaler Scanner, BilderDirekte Fluoreszenz Verstärkte FluoreszenzColorimetrische Detektion

24. März 2010

Verstärkte Fluoreszenz (Cy3) ist die empfind-lichste Methode, Detektionsgrenze: 0.016 ng/ml Direkte Fluoreszenz (Dy633) ist etwa 2x weniger empfindlich TMB Assay Detektions-grenze: 0.041 ng/ml.

Schlussfolgerung: Cy3/TECAN doppelt so empfindlich wie Dy633/TECAN welche doppelt so empfindllich ist wie TMB/CLAIR.

Vergleich Färbung / Reader

CLAIR Konfokaler Scanner, S / N

24. März 2010

CLAIR Konfokaler Scanner, Diskussion

Empfindlichkeit:Colorimetrischer TMB-Assay ist nur ca. 2-mal bzw. 4-mal weniger empfindlich als direkte / verstärkte Fluoreszenz

Dynamischer Bereich: Colorimetrischer Assay hatte eine sehr gute Linearität über 2 GrößenordnungenVerstärkte Fluoreszenz hatte einen geringeren dynamischen Bereich als die colorimetrische MessungDirekte Fluoreszenz hatte eine gute Linearität über 3 Größenordnungen

Beachte: Dieser Vergleich beinhaltet Färbetechnik, kombiniert mit Detektionstechnik: High End Forschungs - Scanner (Fluoreszenz) gegenüber einem Routine-Reader (Colorimetrie)

24. März 2010

Gliederung

Einführung, Begriffserklärung, Motivation

Geräte Evaluierung und Technologie Vergleich• Colorimetrische Fluoreszenz Detektion• Multiplex Modell – Assay

Colorimetrischer Assay zum Nachweis von Grippeviren• Assay Entwicklung und Validierung

an Patientenproben

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Durchgeführt in Zusammenarbeit mit

VTT, Turku, Finland

24. März 2010

Multiplexed Virus Assay

Test von GrippevirenMultiplexed Analyse von 7 GrippevirenSandwich ELISA AssayColorimetrisches Auslesen mit CLAIR ReaderVerdünnungen von Virus-Infiziertem Zell-Lysat

Array Layout

Adenovirus, Respiratory Syncytial Virus (RSV), Influenza A (InfA), Influenza B (InfB), Parainfluenza 1 (PIV1), Parainfluenza 2 (PIV2) und Parainfluenza 3 (PIV3)

24. März 2010

Multiplexed Virus Assay, Bilder

Schlussfolgerung:Mit dem multiplex Assay konnten alle 46 analysierten Virus-Proben detektiert und korrekt klassifiziert werden.Das Auslesen und die Auswertung mit CLAIR war schnell und einfach. Die Analytik ist einfach automatisierbar.

Beispiele

24. März 2010

Analyse klinischer Proben

Analyse der genannten Grippeviren in 88 klinischen Patientenproben mittels eines multiplex AssayDie Patientenproben wurden parallel analysiert

Mittels colorimetrischer TMB-Detektion (CLAIR)Mittels verstärkter Fluoreszenz (Laser Sanner, TECAN)

Die Pateintenproben waren zuvor mittels TR-FIA getestet worden: 44 Proben waren Antigen-negativ, 44 waren Antigen-positiv:

Adenovirus, Respiratory Syncytial Virus (RSV), Influenza A (InfA), Influenza B (InfB), Parainfluenza 1 (PIV1), Parainfluenza 2 (PIV2) und Parainfluenza 3 (PIV3)

24. März 2010

Analyse klinischer Proben

Jeder Fänger-Antikörper wurde 6 mal gespottet:

Drei Spots mit hoher Antikörper- DichteDrei Spots mit geringerer Antikörper- Dichte

Erhöhung des dynamischen Bereichs, da einige Proben mit hoher Antigen Konzen-tration Kreuzreaktion zeigten

Positive Kontrollen in allen vier Ecken

Dienen auch als Referenz-Spots für das Grid bei der automatischen Auswertung

Array Layout

24. März 2010

Analyse klinischer Proben, BilderDirekter Vergleich TMB/CLAIR und Cy3/TECAN

24. März 2010

Analyse klinischer Proben, Ergebnisse

Colorimetrische Detektion (CLAIR) lieferte vergleichbare Ergebnisse zu dem Fluoreszenz-Test (verstärkte Fluoreszenz), gemessen mit dem Tecan LS400

Tecan / Fluoreszenz charakterisierte 82 von 88 Proben richtig (gemessen an der TR-FIA Referenzmethode) CLAIR / Colorimetrie charakterisierte 77 von 88 Proben richtig (gemessen an der TR-FIA Referenzmethode) Alle falsch charakterisierte Proben waren PIV 3 Proben, die offenbar mit der Zeit degradiert waren (TR-FIA Messungen fanden mehrere Wochen früher statt)

Mit Fluoreszenz wurden die Proben gerade über dem “Cut-Off” gemessenMit Colorimetrie wurden die Proben gerade unter dem “Cut-Off” gemessen

Die genaue Antigen-Konzentration zum Zeitpunkt dieses Experi-mentes ist unbekannt und könnte unter dem “Cut-Off” gelegen haben

24. März 2010

Zusammenfassung

Colorimetrische Detektion ist im Ergebnis vergleichbar mit Fluoreszenz-Detektion (verstärkte Fluoreszenz)

Vergleichbare Empfindlichkeit und Linearität

Fluoreszenz Assays können einfach in colorimetrische Assays “umgebaut” werdenColorimetrische Assays und die dafür notwendigen Geräte sind weniger komplex und preisgünstiger als die entspechenden Fluoreszenz-GeräteColorimetrische Assays sind ideal für die Routineanalytik in klinischen Labors, Veterinärmedizin und Lebensmittel-analytik

24. März 2010

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Danke für Ihr Interesse!

Halle 2, Stand 524