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Lic. Jesús Zambrano Rojas

ASIGANTURAS DE BIOQUIMICA – ODONTOLOGIA

PRACTICA N°1

VOLUMETRIA 1: PREPARACION DE SOLUCIONES

INTRODUCCION.

a) Volumetría.

La volumetría es un método analítico que consiste en determinar el volumen de una solución de concentración desconocido, que sea equivalente, a un volumen dado de una solución de concentración conocida llamada “solución estándar”. De esta manera, se determina en forma indirecta la concentración de una sustancia problema utilizando soluciones de concentración conocida.

Este es un aspecto que trataremos en la siguiente práctica, por ahora vamos a familiarizarnos con los cálculos y procedimientos necesarios utilizados para preparar soluciones, un aspecto de suma importancia en Bioquímica, considerando que la reacciones que ocurren en el organismo requieren que las moléculas de los reaccionantes se encuentren en solución.

b) Soluciones.

Una solución es una mezcla de diferentes sustancias químicas la cuál es homogénea con respecto a sus propiedades físicas y químicas. Al referirnos a las soluciones es conveniente llamar a uno de los componentes “el solvente” y a los otros “los solutos”. El componente de una solución cuyo estado físico es preservado cuando la solución es preparada, es conocido como es solvente. Por ejemplo, cuando NaCI (un sólido) es mezclado con agua, la solución resultante es un líquido. Consecuentemente, el agua es referida como el solvente y el NaCI como el soluto. Si todos los componentes de una solución estén en el mismo estado, aquel presente es mayor cantidad es llamado el solvente.

Considerando el tamaño de las moléculas del soluto, las soluciones pueden ser coloidales y verdaderas. La soluciones caloidales tiene partículas de soluto (llamadas micelas) de un tamaño comprendido entre 1 a 100 mu (1 mu=10−9m).En el caso de las soluciones de proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos. Las soluciones verdaderas tienen soluto de un tamaño menor a 1 mu. Las biomolecular y bioiones de bajo peso molecular dan soluciones de esta clase.

c) Concentración de soluciones.

La concentración de una solución se expresa como la cantidad de soluto por unidad de volumen de soluciones. Para tal fin, en Bioquímmica se emplea más frecuentemente los siguientes tres sistemas: el sistema PORCENTUAL, el sistema MOLAR, y el sistema NORMAL, de acuerdo a las unidades empleadas para apreciar la cantidad de una sustancia disuelta.

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Una solución PORCENTUAL (%), es aquella que contiene un determinado número de gramos de sustancia en 100 g de solución (P/P) o en 100 ml de la solución (P/V); por ejemplo, una solución concentrada de HCI al 36% (P/P) contiene 36 g de HCI en 100 g de solución, y una solución salina fisiológica al 0.9 % (P/V) contiene 0.9 g de NaCI en 100 ml de solución.

Una solución MOLAR (M), es aquella que contiene un determinado número de moles de la sustancia por litro de solución. Definiendo al mol, como la cantidad de sustancias en gramos numéricamente igual a su peso molecular. Así, una solución 1M de NaOH contiene 1 mol (40g) de NaOH por litro de solución y una solución 1M de H2SO4 contiene 1 mol (98g) del ácido por litro de solución.

Una solución NORMAL (N), es aquella que contiene un determinado número de equivalentes gramo de la sustancia por litro de solución. Definiéndose al Equivalente gramo, como la cantidad de la sustancia en gramos que puede reaccionar con un átomo gramos de hidrogeno, oxhidrilo o medio átomo gramo de oxígeno, Así, una solución 1 N de HCI contiene 1 Equivalente gramo (36.5 g) de HCI por litro de solución y una solución 1N de H2SO4 contiene 1 Equivalente gramos (40g) del ácido por litro de solución.

EXPERIMENTO 1.1. Preparación de 100 ml de una solución 0.1 N de Acido, Oxálico.

Objetivos:

1. Capacitar al alumno para realizar los cálculos necesarios para preparar una solución Estándar Primaria (*)

2. Propiciar que el alumno utilice adecuadamente el material de laboratorios puesto a su disposición para la preparación de soluciones.

Procedimientos:

1. Calculada la cantidad de ácido oxálico requerida para preparar 100 ml de solución 0.1 N, pesar con mucha exactitud dicha cantidad.

2. Colocar la sustancia pesada en un beaker de 100 ml y añadir aproximadamente 50 ml de agua destilada.

3. Mezcla con una bagueta de vidrio hasta que se disuelva completamente el ácido oxálico.4. Transferir el contenido a un frasco volumétrico (fiola) de 100 ml y completar hasta la marca

(enrasar) con agua destilada. Tapar la fiola y mezclar.5. Transferir la solución a un frasco limpio y rotularlo adecuadamente.

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------(*) Un estándar primario es un sustancia de composiciones química conocida, de alto grado de pureza, muy estable a las condiciones ambientales, que puede pesarse fácilmente y cuyas soluciones sirven para la titulación exacta de otras soluciones. Un ejemplo lo tenemos de un ácido divalente, su equivalente gramo es 126.08/2 = 63:04 g que será el peso que 1000 ml debe contener una solución 1N de ácido oxálico. Otro estándar primario muy utilizado, es el talato ácido de potasio (PM=204.22).Resultados:

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Anote en el espacio siguiente la cantidad de ácido oxálico calculado para preparar 100 ml de una solución 0.1 N.

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EXPERIMENTO 1.2. Preparación de 100 ml de una solución 0.1 N de ácido Clorhídrico.

Objetivos:

1. Capacitar al alumno para realizar los cálculos necesarios para preparar una solución más diluida de un ácido fuerte a partir de soluciones concentradas de la misma sustancia.

2. Propiciar que el alumno utilice adecuadamente el material de reactivos de laboratorios puestos a su disposición para la preparación de soluciones de ácidos fuertes.

Procedimientos:

1. Calcular el volumen (ml) que debe medirse de la solución concentrada de HCI (con una concentración de 36% y una densidad de 1.19 g/ml), para preparar 100 ml de solución 0.1 N.

2. Medir en una fiola de 100 ml aproximadamente 50 ml de agua destilada.Pipetear con sumo cuidado el volumen calculado del ácido concentrado y vaciarlo lentamente sobre el agua contenida en la fiola.

3. Completar hasta la marca con agua destilada, tapar el frasco y mezclar.4. Transferir la solución a un frasco limpio y rotulado adecuadamente.

Resultados:

Anote en el espacio siguiente el volumen de HCI concentrado, calculado para preparar los 100 ml de la solución 0.1 N:

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Calcule y anote la concentración NORMAL o NORMALIDAD de la solución concentrada de HCI:

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Calcule y anote la concentración PORCENTUAL (P/V) de la solución concentrada de HCI:

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EXPERIMENTO 1.3. Preparación de 100 ml de una solución 0.1 M de ácido sulfúrico.

Objetivos:

1. Capacitar al alumno para realizar los cálculos necesarios para preparar una solución más diluida de un ácido fuerte a partir de soluciones concentradas de la misma sustancia.

2. Propiciar que el alumno utilice adecuadamente el material de reactivos de laboratorios puestos a su disposición para la preparación de soluciones de ácidos fuertes.

Procedimientos:

1. Calcular el volumen (ml) que debe medirse de la solución concentrada de H 2 SO4 (con una concentración de 94 % y una densidad de 1.84 g/ml), para preparar 100 ml de solución 0.1 M.

2. Medir en una fiola de 100 ml aproximadamente 50 ml de agua destilada.Pepitear con sumo cuidado el volumen calculado del ácido concentrado y vaciarlo lentamente sobre el agua contenida en la fiola.

3. Completar hasta la marca con agua destilada, tapar el frasco y mezclar.4. Transferir la solución a un frasco limpio y rotulado adecuadamente.

Resultados:

Anote en el espacio siguiente el volumen del H 2 SO4 concentrado, calculado para preparar los 100 ml de una solución 0.1 M:

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Calcule y anote la concentración NORMAL o NORMALIDAD de la solución concentrada de H 2 SO4:

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Calcule y anote la concentración PORCENTUAL (P/V) de la solución concentrada de H 2 SO4:

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EXPERIMENTO 1.4. Preparación de 100 ml de una solución 0.1 N de ácido Hidróxido de sodio.

Procedimientos:

1. Calcular el volumen (ml) que debe medirse de la solución saturada de Na OH (aproximadamente 19N), para preparar 100 ml de solución 0.1 N.

2. Pipetear con sumo cuidado el volumen calculado de la solución saturada de NaOH y vaciarlo en una fiola de 100 ml.

3. Completar hasta la marca (enrasar) con agua destilada libre de CO2 (**).

4. Tapar el frasco y mezclar.

5. Transferir la solución a un frasco limpio y rotularlo adecuadamente.

Resultados:

Anote en el espacio siguiente el volumen calculado de la solución saturada de NaOH necesario para preparar los 100 ml de solución 0.1 N:

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INTERROGANTES.

1. ¿Qué volumen de ácido sulfúrico 17.65 M debemos tomar para preparar?:

a) Un litro de solución 0.02N:

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b) Un litro de solución con 6 umoles por ml:

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c) Un litro de solución con 10 miliequivalentes por 100 ml:

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(*) Solución saturada es aquella en la que la capacidad del solvente para aceptar mayor cantidad de soluto ha llegado al máximo, y al agregar más sustancia esta ya no se disuelve.

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(**) Para Obtener agua libre de Anhídrido Carbónico CO2 hacer hervir el agua destilada y luego para el recipiente que la contiene. Dejar enfriar antes de usar.

2. Son rigurosamente exactas las concentraciones de las soluciónes preparadas en 1.2, 1.3 y 1.4? Si su respuesta es NO, fundamente su respuesta:

------------------------------------------------------------------------------------------------------------

3. Siendo actualmente recomendable el sustituir las concentraciones de las biomoleculares en los líquidos biológicos del organismo expresadas en forma porcentual, por las concentraciones expresadas en el sistema molar, hagas las conversiones correspondientes para los compuestos químicos que a continuación se señalan:

COMPUESTO PM CONCENTRACION % CONCENTRACION Mm(P/V) (mmoles/litro)

Glucosa (sangre) 180 70 – 110 mg/dl _______________________

Urea (sangre) 60 21 – 43 mg/dl _______________________

Creatina (suero) 113 0.6 – 1.5 mg/dl _______________________

Colesterol (suero) 387 150–240 mg/dl _______________________

Lácteo (suero) 140 3-7 mg/dl _______________________

Hierro (suero) 56 50 -150 ug/dl _______________________

Calcio (suero) 40 8.5 -10.5 mg/dl _______________________

Fosforo (suero) 31 3.0 – 4.5 mg/dl _______________________

APELLIDOS……………………………………………NOMBRES……………………………

FECHA………………/………………/…………….

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BIOQUIMICA - ODONTOLOGIA

PRACTICA N° 2. VOLUMETRIA 2: TITULACION DE SOLUCIONES (ACIDIMETRIA Y ALCALIMETRIA)

INTRODUCCION.

a) Titulación Acido – Base.

Con frecuencia es necesario determinar el contenido ácido de los líquidos biológicos (jugo gástrico, saliva, orina, etc.) Esto se realiza mediante la técnica analítica volumétrica (Titulación Acido-Base), que se estidiará en esta pr+actica en la forma más sencilla.

La titulación Acido – Base es un método sensible y preciso que, como habíamos referido, consiste en determinar el volumen de una solución de concentración desconocida que sea equivalente a un volumen dado de una solución de concentración exactamente conocida llamada “solución estándar”.

Como se habrá deducido, las soluciones preparadas en los experimentos 1.2, 1.3, y 1.4 de la práctica anterior, no tienen una concentración exacta, sino aproximada. Con los ácidos y bases comúnmente empleados (HCI, H2SO4, NaOH, KOH) es prácticamente imposible preparar directamente soluciones estándar. Asi el HCI concentrado es volátil, el H2SO4 es además higroscópico, y los álcalis sólidos absorben CO2 y agua. Por estas razones, se preparan soluciones aproximadamente 0.1 N de esta sustancia y luego se determina la concentración exacta de la solución diluida por “titulación” con un “estándar primario” como el ácido oxálico.

Las soluciones problema, así tituladas, podrá entonces ser empleadas (por breve tiempo debido a su inestabilidad) como un “estándar secundario”; o su concentración, ahora ya conocida, puede ser corregida para un uso particular (se entiende que en este caso, en más conveniente que la concentración sea algo mayor que la esperada para hacer la corrección añadiendo agua destilada). Se enfatiza que diversas determinaciones y experiencias realizadas en Bioquímica, requieren el uso de soluciones de concentración rigurosamente exacta.

b) Fundamento.

La Titulación Acido-Base se fundamente en el siguiente principio: “soluciones de ácidos y bases de igual normalidad se neutraliza exactamente volumen a volumen”. En otras palabras, para la titulación estequiométrica de un ácido debe añadirse una cantidad igual de una base:

N° de mEq de ACIDO = N° de mEq de Base

Dado que, N° de mEq = ml x NORMALIDAD, podemos entonces escribir:

ml (del ACIDO) x N ( del ACIDO) = ml (de la BASE) x N (de la BASE)

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Entonces se comprende porque las soluciones de ácidos y bases de igual normalidad se neutraliza exactamente volumen a volumen: 5ml (ACIDO) x 0.1 N (ACIDO) = 5ml (BASE) x 0.1 N (BASE)

Lo que no es válido para soluciones de diferente normalidad:5ml (ACIDO) x 0.1 N (ACIDO) = 4 ml (BASE) x 0.125 N (BASE)

Por lo cual, la siguiente expresión está plenamente justificada:

N x V = N´ x V´ y N´ N x V

V ´ (1)

Dónde: N = Normalidad de la solución estándar.V = Volumen de las soluciones estándar.N´= Normalidad de la solución a titular.V´= Volumen de las soluciones a titular.

Recordar que los ACIDOS reaccionan de las BASES se han “neutralizado”

El punto final de la neutralización puede ser determinado por el cambio de color de un INDICAR como la Fenoltaleína. Una solución que contenga esta sustancia es incolora en un medio ácido y se vuelve de un color rojo grosella cuando se ha neutralizado.

EXPERIMENTO 2.1 Titulación de la solución de NaOH aproximadamente 0.1 N preparada en el experimento 1.4

Objetivos:

1. Capacitar al alumno para una correcta utilización de método volumétrico de titulación que le

permitan preparar soluciones alcalinas de concentración exactamente conocida.

2. Capacitar al alumno para el correcto empleo de la ecuación (1), utilizada en la titulación de

ácidos y bases.

3. Familiarizar al alumno en el uso y aplicación de los indicadores.

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Procedimiento:

1. En un Erlenmeyer colocar 5ml de las solución estándar de ácido oxálico 0.1 N y añadir 2

gotas del indicador fenoltaleína al 1% Mezclar.

2. Llenar y enrasar una bureta de 10 ml con la solución de NaOH aproximadamente 0.1 N

preparada en el experimento 1.4.

3. Dejar caer lentamente la solución de NaOH sobre la solución de ácido oxálico contenida en el

Erlenmeyer, agitando éste permanentemente hasta que se aprecie un color rosado estable.

4. Leer en la bureta el volumen gastado de NaOH aproximadamente 0.1 N.

5. Realizar los cálculos correspondientes empleando la ecuación NaOH. Esta solución así

titulada puede luego ser utilizada como estándar secundario para la titulación de ácidos.

Resultados:

1. El volumen de NaOH aproximadamente 0.1 N gastado es: ___________________________

2. La concentración exacta de la solución de NaOH así titulada es: _______________________(Anote en el espacio en blanco todos sus cálculos realizados)

3. Si la solución resulta ser más concentrada que 0.1 N, calcular el volumen de agua destilada libre de CO2 que será necesario añadir a la solución ya preparada, para ajustarla a una concentración exactamente 0.1 N:

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4. Si la solución resulta ser más diluida que 0.1 N, ¿cuál sería el procedimiento a emplear para ajustarla a una concentración exactamente 0.1 N?

EXPERIMENTO 2.2 Titulación de la solución de HCI aproximadamente 0.1 N preparada en el experimento 1.2

Objetivos:

1. Capacitar al alumno para una correcta utilización del método volumétrico de titulación que le

permitan preparar soluciones de ácidos de concentración exactamente conocida.

2. Capacitar al alumno para el correcto empleo de la ecuación (1), utilizada en la titulación de ácido

y bases.


Procedimiento:

1. En un Erlenmeyer colocar 5ml de la solución problema de HCI a titular y añadir 2 gotas del

indicador fenoltaleína al 1% Mezcalar.

2. Llenar y enrasar una bureta de 10 ml con la solución estándar de NaOH (de concentración

exactamente conocida), preparada en el experimento 1.4.

3. Dejar caer lentamente la solución de NaOH sobre la solución de HCI contenida en el

Erlenmeyer, agitando éste permanentemente hasta que se aprecie un color rosado estable.

4. Leer en la bureta el volumen gastado de la solución estandar de NaOH.

5. Realizar los cálculos correspondientes empleando la ecuación (1), para determinar el título o

concentración exacta de la solución de HCI. Esta solución así titulada, puede entonces ser

utilizada para un fin específico, como por ejemplo, el estudio del efecto del pH sobre la

velocidad de una reacción enzimática, etc.

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Resultados:

1. El volumen gastado de la solución estándar de NaOH es: _______________________________

2. La concentración exacta de la solución de HCI así titulada es:____________________________

3. Si la solución de HCI resulta ser más concentrada que 0.1 N, calcular el volumen de agua destilada libre de CO2 que será necesario añadir a esta solución para ajustarla a una concentración exactamente 0.1 N:

EXPERIMENTO 2.3 Titulación de la solución de H2SO4 aproximadamente 0.1 M preparada

en el experimento 1.3

Objetivos:

1. Capacitar al alumno para una correcta utilización del método volumétrico de titulación que le

permitan preparar soluciones de ácido de concentración exactamente conocida.

2. Capacitar al alumno para el correcto empleo de la ecuación (1), utilizada en la titulación de ácido

y bases.


Procedimiento:

1. En un Erlenmeyer colocar 5 ml de la solución problema de H2SO4 a titular, y añadir 2 gotas de

indicador fenoltaleína al 1%. Mezclar.

2. Llenar y enrasar una bureta de 10 ml con la solución estándar de NaOH (de concentración

exactamente conocida), preparada en el experimento 1.4.

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3. Dejar caer lentamente la solución de NaHO sobre la solución de H2SO4 contenida en el

erlemeyer, agitando este permanentemente hasta que se aprecie un color rosado estable.

4. Leer en la bureta el volumen gastado de la solución estándar de NaOH.

5. Realizar cálculos correspondientes empleando la ecuación (1), para determinar al o

concentración exacta de la solución de H2SO4. Esta solución así titulada, puede entonces ser

utilizada para un fin específico, como por ejemplo, la determinación de la concentración de ácido

úrico en el suero sanguíneo, etc.

Resultados:

1. El volumen gastado de la solución estándar de NaOH es:_______________________________

2. La concentración exacta de la solución de H2SO4 así titulada es:__________________________

(Anote en el espacio en blanco todos sus cálculos realizados)

3. Si la solución H2SO4 resulta ser más concentrada que 0.1 N, calcular el volumen de agua

destilada libre de CO2 que será necesario añadir a esta solución a una concentración exactamente

0.1 N:

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4. ¿Por qué al titular la solución de H2SO4 no se gastó un volumen similar de la solución estándar

de NaHO, al gastado cuando se tituló la solución de HCI?

INTERROGANTES.

1. ¿Las soluciones de ácidos y bases de igual molaridad se neutralizan exactamente volumen a volumen?

SI __________________NO _____________ NO NECESARIAMENTE_______________

Fundamente su respuesta:

2. ¿Cuántos ml de NaOH 2.5 N será necesarios para neutralizar 10 ml de ácidos sulfúrico concentrado de D = 1.98 y al 98% (P/P)?

3. Si 30 ml de NaOH 0.5 N neutralizan 25 ml de ácido sulfúrico ¿Cuál es la concentración molar del ácido sulfúrico?

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4. El principal producto de la fermentación de los carbohidratos de la dieta por lo microorganismos de la placa dental es ácido láctico. Este ácido orgánico es el principal determinante de la acidez de la saliva y de la placa dental, especialmente después de la ingesta de carbohidratos. Las concentraciones elevadas del ácido desmineralizan el esmalte adyacente e inicia la caries dental.

Aplicando la información y la experiencia ganada en esta práctica, señale brevemente como procedería para determinas la acidez, titulable de una muestra de saliva:

Procedimientos similares son empleados para la terminación de la acidez titulable de la orina (expresada como el número de ml de NaOH 0.1 N necesario para titular el volumen de orina de 24 horas, hasta un pH de 7.4), y la acidez del juego gástrico (expresada como el número del mililitro de NaOH 0.1 N necesarios para neutralizar la acidez de 100 ml de jugo gástrico).

APELLIDOS………………………………………….NOMBRES……………………………..

FECHA………………../…………………../…………………

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PRACTICA N° 3 Ph y pK: SU DETERMINACION

INTRODUCION.

a) La concentración de iones hidrógeno ([ H+¿¿] y el concepto de pH.

La [H+¿¿] es de considerable importancia para todos los organismos vivos, y normalmente ésta bajo un riguroso control a fin de asegurar la eficiencia de todos los procesos vitales. Así pequeños cambios en dicha concentración, pueden producir marcados efectos metabólicos y fisiológicos capaces de afectar la salud y la vida.

El principal determinante de la pequeña pero efectiva [H+¿¿] en los organismos vivos en el agua. El

agua es un electrolito débil pues se disocia escasamente en iones hidronio ( H 3 O+¿¿) e OH, que en

forma simplificada puede expresarse así:

H 2O H+¿¿ + OH (1)

Aunque el agua tiene solo una muy buena ligera tendencia a disociarse, sus productos, los iones H+¿¿ e OH, tienen profundos efectos biológicos. Por esta vez nosotros debemos ser capaces de expresar dicho grano de disociación en términos cuantitativos, para lo cual consideramos la constante de equilibrio para la reacción (1):

K eq¿¿¿ de donde Kep [ H ¿¿2O ]=¿¿

El valor para la Kep ha sido cuidadosamente estimada midiendo la conductividad eléctrica de agua pura a 25°C y es igual a 1.8 x 10−16. Por otro lado, la concentración del agua es relativamente alta, 55,56 M (55.56 moles de agua en un litro), y constante en relación a la muy baja concentración, 1 x

10−7 M, de iones H+¿ eOH ¿. Por lo que Kep x [ H ¿¿2O ]¿ = 1 x10−14. Este es denominado producto

iónico del agua (Kw).+Cuando la ¿, como el agua pura, se dice que la solución es neutra. Bajo estas condiciones, la concentración de H+¿ yOH ¿ puede ser calculada del producto iónico del agua:

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Kw=¿

[H+¿¿] = √1x 10−14=1 x10−7 y [OH ] =

Kw

H+¿=1 X 10−14

1 X 10−7 =1 X 110−7¿

Siendo el producto iónico del agua constante, siempre que la concentración de iones H+¿¿ es mayor a

1 x10−7, la concentración de iones OH debe ser menor que 1 x10−7 y viceversa. Por lo tanto, cuando

la concentración de H+¿¿ es muy alta, como una solución de HC1 1M, la concentración de iones OH debe ser muy baja, 1 x10−14 M .Inversamente, cuando la concentración de iones OH es muy alta

como en una solución de NaOH 1M, la concentración de iones H+¿¿ debe ser muy baja , 1 x10−14.

Kw, el producto iónico del agua, es así el fundamento de la escala de pH, diseñada por Sorenser (un bioquímico danés) para expresar la real concentración de iones H+¿¿ (y la de los iones OH) de cualquier solución acuosa, en un gramo de acidez entre 1M DE H+¿¿ y 1M de OH.

Sorensen definió el término pH así:

pH = log1

¿¿¿ ¿ = -log ¿¿

Por lo tanto, siendo ¿ para una solución neutra a 25°C su pH será igual a 7.0.

[H+] M pH [OH-] M pOH1.0 0 0.000 000 000 000 01 140.1 1 0.000 000 000 000 1 130.01 2 0.000 000 000 001 120.001 3 0.000.000 000 01 110.000 1 4 0.000 000 000 1 100.000 01 5 0.000.000 001 90.000 001 6 0.000 000 01 80.000 000 1 7 0.000 000 1 70.000 000 01 8 0.000 001 60.000.000 001 9 0.000 01 50.000 000 000 1 10 0.000 1 40.000.000 000 01 11 0.001 30.000 000 000 001 12 0.01 20.000 000 000 000 1 13 0.1 10.000 000 000 000 01 14 1.0 0

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b) Medición del pH.

La ¿¿ no puede ser media por métodos titimétricos ordinarios como lo demuestra el siguiente ejemplo: volúmenes iguales de ácido acético 0.1 N o de HCI 0.1 N dan los mismos valores de titulación con NaOH 0.1 N, cuando usamos fenoltaleína como indicador de neutralización. En otras palabras, el ácido 0.1 N y el HCI 0.1 N tiene la misma “acidez titulable o capacidad de conbinacion con iones hidroxilo”. Sin embargo, la ¿¿ del HCI 0.1 N es también 0.1 N (pH = 1), mientras que la ¿¿ del ácido acético es de solamente 0.001342 N (pH = 2.8724). Es decir, aunque ambos ácidos tienen la misma “normalidad o acidez titulable”, ellos tienen diferente “acidez real o pH”, siendo la diferencia atribuible al hecho que el HCI 0.1 N (un ácido fuerte) está completamente disociado mientras que el ácido acético 0.1 N (un ácido débil) esta apenas disociado (0.001342 N es apenas el 1.3 % de 0.1 N).

Los ácidos como el HCI, H 2 SO4 y el HNO3 comunmente llamados ácidos fuertes, éstan completamente disociados en soluciones acuosas diluidas; las bases fuertes como el NaOH y KOH también están completamente disociados.

En bioquímica estamos más interesados en el comportamiento de los llamados ácidos y bases débiles, los cuales están débilmente disociados cuando son disueltos en agua. Un ejemplo de ácido débil es el ácido acético (CH 3−¿COOH ¿, el cual le da al vinagre el sabor ácido. Un ejemplo de una base débil es el

amoniaco (NH 3. Acidos y bases débiles son comunes en sistemas biológicos y juegan roles importantes en el metabolismo y su regulación.

Recordemos que los ácidos son definidos como “donadores” de protones o iones H+¿¿ y las bases como “aceptores”. Un donador de protones y su correspondiente aceptor forma un “par conjugado

ácido - base”. Por ejemplo, CH 3−¿COOH ¿, un donador de protones, y el acetado CH 3−¿CO O−¿¿ ¿ el

correspondiente aceptor de protones, constituye un par conjugado ácido – base relacionados entre sí por la reacción reversible:

CH 3−¿COOH ¿ H+¿¿ + CH 3−¿CO O−¿¿ ¿ (1)

Cada ácido tiene una tendencia característica a perder un protón. La tendencia de cualquier ácido débil, HA, a perder su protón su base conjugada A−¿¿ .Es definida por la constante de disociación a menudo llamada Ka (a por ácido). Así, para la reacción reversible:

HA H+¿+A−¿¿ ¿, la Ka es:

Ka = ¿¿¿

A mayor capacidad de disociación del ácido, mayor será su Ka y viceversa.

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Al igual que el pH facilita la expresión de la ¿¿, el pKa definido como el –log Ka facilita la expresión de Ka. A mayor capacidad de disociación de un ácido, menor será su pKa y viceversa.

ACIDO Ka Kb pKa pKbHCOOH (fónico)CH 3−¿COOH ¿ (acético)CH 3−¿CH2−¿CH

3¿ ¿ (propionico)

CH 3−¿CHOH−COOH ¿(láctico)H 3 PO 4

−¿¿ (fosfórico)

H 2 PO 42−¿

¿ (fosfór.

Monobásico)HPO4 (fosfórico dibásico)H 2 CO 3

−¿¿ (carbónico)

HCO 3+¿

¿ (ion bicarbonato)

NH 4+¿ ¿ (ion amonio)

1.78 x 10−4

1.75 x 10−5

1.35 x 10−5

1.38 x 10−1

7.25 x 10−3

1.38 x 10−7

3.98 x 10−13

1.70 x 10−4

6.31 x 1011

5.62 x 10−10

3.754.764.873.862.146.86

12.403.7710.22

9.25

Complete en la tabla los correspondientes valores de Kb y pKb, considerando las siguientes relaciones.

Kw=1 x10−14=Ka x Kb y pKw=14=pKa+ pKb

Estas ecuaciones hacen posible colocar la capacidad relativa de ionización de ácido y bases en la misma escala, más comúnmente como Ka o pKa. Esto es fundamentalmente valioso para el estudio de moléculas como los aminioacidos y proteínas, las cuales tienen grupos ácidos y básicos débiles, cuya capacidad de disociación es más fácil de estudiar cuando se compraran por el mismo patrón. Por ejemplo, se comprende mejor que el grupo R-COOH del aminoácido glicica, con un pKa = 2.34, es más ácido que el grupo R-NH3+¿ ¿, con un pKa = 9.6, que si comparamos este último con el valor pKb = 11.66 del primero.

Ahora si estamos en condiciones de comprender mejor el fundamento de los métodos colorimétrico para la determinación del pH. Estos métodos se basan en el empleo de INDICADORES, los cuales son ácidos o bases débiles con capacidad de cambiar de colo cuando están ionizados:

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HInd H+¿+ Ind¿

COLOR A COLOR B

Cada indicador tiene un característico valor de pKa. Cuando el pH de una solución coincide con el valor de pKa del indicador, el 50% de sus moléculas estarán ionizadas y de un color B, y el otro 50% estarán sin disociar y de un color A. En están condiciones el color del indicador (y por lo tanto de la solución que lo contiene) será intermedio entre ambos colores.

La tabla siguiente muestra la característica de los indicadores más comúnmente utilizados:

INDICADOR LIMITES DE Ph pKaCAMBIO DE COLOR

A B

Azul de timol 1.2 a 2.8 2.0 Rojo Amarillo

Azul de Bromofenol3.0 a 4.6 3.8

Amarillo Azul

Anaranjado de metilo 3.1 a 4.4 3.4 rojo Amarillo

Verde de Bromocresol3.8. a 5.4 4.7

Amarillo Azul

Rojo de clorofenol5.1 a 6.7 6.0

Amarillo Rojo

Azul de Bromotimol6.1 a 7.7 6.8

Amarillo Azul

Rojo de fenol6.8 a 8.4 7.6

Amarillo Rojo

Azul de timol8.0 a 9.6 8.8

Amarillo Azul

Fenoltaleína 8.3 a 10.0 9.2 Incoloro Rojo

A valores de pH diferentes pero en las proximidades de pKa (dentro del rango del indicador) la solución cambiará de color según predomine la forma ionizada o no del indicador. Se puede entonces determinar el pH de soluciones problema, comparando los colores de esta solución, con los colores de solución patrón (de pH conocido) que tenga el mismo indicador.

Un método más exacto para la terminación del pH de las soluciones en el laboratorio clínico y químico, es el método potenciométrico. En un instrumento llamada pH metro, la señal de un electrodo espacial de vidrio (electrodo explorador) selectivamente sensible a la [H+¿¿], es amplificada y comparada con la señal generada por una solución el pH exactamente conocido.

c) Cálculo teórico del pH.

pH DE ACIDOS FUERTES: dado que están completamente disociados, la concentración molar de iones H+¿¿será igual a la concentración normal del ácido por lo que se aplica directamente la expresión:

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pH=log1

¿¿¿

Ejemplos:

¿Cuál será el pH de una solución de HCI 0.00634 N ?Siendo un ácido fuerte la ¿¿¿Cuál será el pH de una solución de H 2 SO4 0.0003 M (y por lo tanto 0.0006 N?Siendo un ácido fuerte la ¿¿ (numéricamente igual a la normalidad del ácido) y su pH = -log de 0.0006, ó sea pH = 3.2218.

pH DE ACIDOS DEBILES: dado que esta débilmente disociados, la ¿¿ no será igual a la del ácido, pero es posible calcular de ¿¿despejando su valor de la ecuación (2):

Ka [ HA ]=¿¿

Considerando que la ¿¿

Conocida la ¿¿ y el pH se calcula aplicando el –log ¿¿ o alternativamente la siguiente ecuación:

pH= pKa−log C2

Ejemplo: ¿Cuál será el pH de una solución de ácido acético 0.2 N?

¿¿

pH=−log 0.001871=2.728

ó pH=4.757−(−0.699)

2=2.728

pH DE LA SAL DE UN ACIDO DEBIL Y UNA BASE FUERTE: como para el caso del acetato de sodio (CH3 – COONa) en solución acuosa, se emplea la siguiente ecuación:

pH= pKw+ pKa+ logC2

Donde: pKw = log Kw, pKa = -log Ka;pKa = -log Ka y C = concentración de la sal.

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d) Curva de titulación de ácido débil. La ecuación de Henderson.Hesselbach.Acción Buffer.

De la titulación de un ácido débil se obtiene mucha más información que la sola determinación de su concentración, si medimos cuidadosamente el pH del ácido que está siendo titulado después de cada incremento de NaOH, hasta el punto de neutralización, Una gráfica del pH de la solución vs. La cantidad de NaOH añadido es lo que se llama “una curva de titulación”.

La forma de la curva de titulación de cualquier acido débil es determinada por la denominada ecuación de Henderson – Hasselbach, la cual es fundamental para comprender la “acción buffer” implícita en los mecanismos que mantienen el equilibrio ácido – básico de la sangre y tejidos de los organismos vivos.

Los Buffers o amortiguadores, son sistemas acuosos que tienden a resistir cambios en su pH cuando pequeñas cantidades de ácido ¿¿ o base ¿¿son añadidos. Un sistema buffer consiste de un ácido débil (el donador de protones) y su base conjugada (el aceptor de patrones), como se muestra en el siguiente esquema:

La ecuación de Henderson – Hesselbach, es simplemente otra forma de expresar la Ka de un ácido débil. De la ecuación (2):

Ka=¿¿¿

Y aplicando el –log : −log¿¿

Tenemos que: pH = pKa+ log ¿¿¿

La cual en forma general puede escribirse así: pH=pKa+log ¿¿

Así, la ecuación de Henderson – Hasselbach establece las relaciones cuantitativas entre el pH, la acción buffer de una mezcla de una acido débil con su base conjugada, y el pKa de ácido débil.

EXPERIMENTO 3.1 Acidez Real y Acidez Titulable.

Objetivos:

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CH3 - COOH

OH

H+¿¿

CH 3−COO−¿¿

H2O


1. Demostrar el diferente comportamiento de los ácidos fuertes (HCI) y de los ácidos débiles (CH3 – COOH), en lo que se refiere a su capacidad de disociación.

2. Establecer la diferencia existente entre la acidez real (pH) y la acidez titulable (normalidad), mediante titulación, uso del papel indicador de pH y mediante el cálculo teórico del pH.

3. Demostrar que soluciones de ácidos débiles o fuertes de la misma normalidad o acidez titulable, tienen diferente acidez real o pH.

4. Demostrar que soluciones de ácidos débiles o fuertes con igual acidez real o pH, tienen diferente normalidad o acidez titulable.

Procedimiento:

1. Uds. Dispondrán de una solución de HCI 0.01 N, y otra de ácido acético 0.01 N.2. Medir en el Erlenmeyer 5ml de la solución de HCI 0.01 N, añadir 2 gotas de indicador

fenoltaleína al 1% y titular con NaOH 0.01 N en la forma indicada anteriormente en el experimento 2.2.

3. Lea en la bureta el volumen gastado de NaOH 0.01N.4. De la misma forma proceda a la titulación de 5ml de ácido acético 0.01 N con el NaOH.5. Lea en la bureta el volumen gastado de NaOH 0.01N.6. Utilizando papel indicador, mida el pH de la solución de HCI 0.01 N y el de la solución de

ácido acético 0.01 N.7. Mediante las expresiones que estime conveniente, calcule el pH teórico de ambas soluciones

de ácido.

Resultados: anote los resultados en la siguiente tabla:

ml gastados de NaOH 0.01 N

pH estimado pH calculado

Solución de ácido HCI 0.01 N

Solución de ácido acético 0.01 N

¿Cómo explica Ud. Estos resultados? ………………………………………………………………...

…………………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………………

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¿Cuál será la concentración de una solución de HCI para que su pH sea igual al pH de la solución de ácido acético 0.01 N que Ud. a usado?

…………………………………………………………………………………………………………

EXPERIMENTO 3.2. Curva de titulación de un ácido débil y determinación de su pKa.

Objetivos:

1. Estudiar la titulación de un ácido débil con una base fuerte.2. Construir y analizar la curva de titulación de un ácido débil y determinar su pKa.3. Establecerlas relaciones cuantitativas existentes entre el pH, el pKa, y la relación sal/ácido,

mediante la aplicación de la ecuación de Henderon – Hasselbarh.4. Demostrar la acción amortiguadora del pH de un sistema buffer.

Procedimiento:

1. En cada uno de 5 tubos de ensayo rotulado del 1 al 5, medir 10 ml de la soluciones de ácido acético 0.2 N.

2. Añadir 2.5 ml, 5 ml y 10 ml de NaOH 0.2 N a los tubos 2,3,4 y 5 respectivamente.3. Mezclar y estimar con papel indicador el pH de cada tubo.4. Mediante cálculos estime el pH de cada tubo.

Resultado: complete la siguiente tabla.

TUBOS 1 2 3 4 5Relación Sal / Acido

pH estimado

pH calculado

mEq de NaOH añadidos

Construya en papel milimetrado la curva de titulación del ácidos acético y señale en la gráfica el pKa aproximado. Para ello, anote ene l eje de ordenadas los pH y el eje de abscisas los mEq de NaOH añadidos.

Adjuntar dicha gráfica en este protocolo.

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NOMBRE………………………………………………FECHA……………………………………

BIOQUIMICA ODONTOLOGIA

PRACTICA N° 4. PROTEINAS: PROPIEDADES FISICOQUIMICAS

INTRODUCCION.

Las proteínas son compuestos de alto peso molecular formados por la unión de aminoácidos a través de enlaces peptídicos. Dependiendo del número, la clase y la secuencia variable de los aminoácidos que la constituyen, las proteínas tendrán un tamaño, forma, carga y función definida.

En la presente práctica realizaremos algunos experimentos relacionados con las propiedades fisicoquímicas de las proteínas, que son de importancia biológica y que derivan de su carácter macromolecular.

a) Solubilidad de las proteínas.

Las proteínas en solución muestran profundos cambios en su solubilidad en función del pH, fuerza iónica

(μ), propiedades dieléctricas del solvente (D), y la temperatura. En los organismos vivos un pH fisiológico de 7.4, una fuerza iónica moderada correspondiente a una solución salina diluida, la alta constante dieléctrica del agua y una temperatura moderna, son determinantes de la solubilidad de las proteínas presentes en los líquidos biológicos. Por otro lado, estos factores pueden ser usados a separar mixtura de proteínas, desde que cada proteína con una característica composición de aminoácidos, puede tener un comportamiento diferencial frente a cambios en cada uno de los factores mencionados. b) Las proteínas como electrolitos.

Ya dijimos que las proteínas están compuestas de una cadena de aminoácidos, los cuales pueden ser separados por hidrólisis (ácida, alcalina y enzimática).

La fórmula general de los aminoácidos es: (donde R = resto de la molécula)

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(1)C COO−¿ ¿

H

NH+¿3

R


Como puede verse, los aminoácidos poseen funciones ácidas y básicas, lo que hace que se comporten en soluciones de ambas maneras, dependiendo ello del pH del medio. Este tipo de electrolitos se conocen como electrolitos enfóteros o anfolitos.

A un pH determinado, el anfolito (sea un proteína o un aminoácido) puede estar en la “forma isoeléctrica” indicada en (1). Esta forma estructural se denomina “zwitterion”, ion híbrido o dipolar, y el pH que determina su presencia se denomina “punto isoeléctrico” (pI).

Al agregar iones H+¿¿, estos se asociarán al grupo COO−¿ ¿ (que así se comportan como una base débil) y el zwitterion se transformará a la forma catiónica (cargada positivamente). Si en vez de hacer esto agregamos iones OH−¿¿, estos se cambiarán como los H+¿¿ del grupo NH 3+¿¿ (que así se comporta como un ácido débil), obteniéndose así la forma “aniónica” (cargada negativamente).

Podemos entonces afirmar, que a un pH por debajo del pI, los aminoácidos y por lo tanto la proteínas, estarán en su forma catiónica, y al contrario, a un pH encima del pI estarán en su forma aniónica.

Si bien cierto que en las proteínas gran parte de los grupos α COOH y α N H 3+¿¿

están ligados formando uniones peptídicas y por tanto no pueden ionizarce, existirán sin embargo los grupos α COOH y α N H 3

+¿¿ terminales, además de los grupos ionizables en cadena lateral (R):

Todos los grupos se ionozan en función del pH del medio y su número y de su grado de ionización dependerá la carga neta de la proteína. Es evidente que en el pI las proteínas y los aminoácidos se comportan como eléctricamente neutras, por tener igual número de cargas positivas y negativas y por lo tanto no migraran en un campo eléctrico. Sin embargo, en su forma catiónica migraran al polo negativo a CATODO, y en su forma aniónica migraran al polo positivo o ANODO. Este es el fundamento para la separación de aminoácidos y especialmente y proteínas por “electroforesis”.

Además, en el pI no hay repulsión electrostática entre las moléculas de proteínas y ellas tienden a coalecer y precipitar. Sin embargo, a valores de pH por debajo o encima del pI, todas las moléculas de proteína tienen una carga neta del mismo signo, positiva o negativa, por lo cual se repelen entre si favoreciendo su solubilidad.

Por otro lado, todos los grupos se comportan como ácidos y base débiles y confieren a las proteínas propiedades importantes, como por ejemplo, la capacidad de actuar como amortiguadores del pH

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C COO−¿ ¿

H

NH 2

RC COO−¿ ¿

H

NH+¿3

RC COOH

NH+¿3

R

H+¿¿ O H−¿¿

N H 33−Lis−Glu−Arg−Cis−Asp−His−Tir−Ala−COO−¿¿

C H 3−N H+¿¿SHCOO−¿ ¿

OHCOO−¿ ¿NH 2+¿ ¿NH 33


celular y extracelular, o la capacidad de actuar como enzimas en el mecanismo de catálisis general ácido – base.

Como sabemos, la diferente capacidad de disociación de estos grupos está mejor expresada por su valor de pKa, un concepto de vital importancia para el estudio y comprensión de la estructura y propiedades de la proteínas. Los valores de pKa y pI de los diferentes aminoácidos se muestran en la siguiente tabla.

Valores de pKa y pI de los aminoácidosAminoácidos pKa (α COOH ¿ pKa ¿ pKa (R) pI

GRUPO I. Con grupo R NO POLAR (hidrofóbico)Alamina (Ala) 2.3 9.7 6.0Leucina (Leu) 2.4 9.6 6.0Isoleucina (Iso) 2.4 9.7 6.1Valina (Val) 2.3 9.6 6.0Prolina (Pro) 2.0 10.6 6.3Fenilalanina (Fen) 1.8 9.1 6.5Triptófano (Tri) 2.4 9.4 5.9Metionina (Met) 2.3 9.2 5.8GRUPO II. Con grupo R POLAR sin carga a pH 7.0Glicina (Gli) 2.3 9.6 6.0Serina (Ser) 2.2 9.2 5.7Treonina (Tre) 2.6 10.4 6.5Cisteína (Cis) 1.7 10.8 8.3 5.0Tirosina (Tir) 2.2 9.1 10.1 5.7Glutamina (Gln) 2.2 9.1 5.7Asparragina (Asn) 2.0 8.8 5.4

Amino pKa (αCOOH ¿ pKa ¿¿ pKa (R) pIGRUPO III. Con grupo R POLAR cargado negativamente a pH 7.0Glutamato (Glu) 2.2 9.7 4.3 3.2Aspartato (Asp) 2.1 9.8 3.9 3.0GRUPO IV. Con grupo R POLAR cargado positivamente a pH 7.0Histidina (His) 1.8 9.2 6.0 7.6Lisina (Lis) 2.2 9.0 10.5 9.8Arginina (Arg) 2.2 9.0 12.5 10.8

Aquellas proteínas con un alto contenido de aminoácidos básicos (del grupo IV) tienen valores altos de Ip, como las historias (pI = 10), el citocromo c (pI = 10.6) y la lysozyna (pI = 11.0). Las proteínas con un alto contenido de aminoácidos ácidos (del grupo III) tienen valores bajos de pI, como la pepsina (pI = 1). La mayoría de las proteínas globulares como las proteínas de plasma sanguíneo, tienen valores de pI que van de 4.8 para la seroalbúmina a alrededor de 7.0 para las γ

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globulinas, con un contenido similar de aminoácidos básicos y ácidos. Al pH fisiológico 7.4 las proteínas del plasma están como aniones.

EXPERIMENTO 4.1. Acción amortiguadora del pH de las proteínas del suero.

Objetivos:

1. Demostrar la propiedad amortiguadora del pH de las proteínas del suero sanguíneo.

Procedimiento:

1. Medir en un erlenmeyer 2 ml de suero sanguíneo diluido al medio y titular con NaOH 0.01 N hasta un pH aproximado de 8.4 usando 2 gotas de fenoltaleina comoindicador.Anotar el volumen de base gastado.

2. Medir en otro erlenmeyer 2 ml de suero sanguíneo diluido al medio y titular con HCI 0.01 N hasta un pH de 3.4, usando 2 gotas de anaranjado de metilo como indicador. Para apreciar el color producido a este pH, preparar un erlenmeyer 2 ml de un buffer acetato de pH 3.4 con 2 gotas del anaranjado de metilo. Anotar el volumen de ácido gastado.

3. Repetir los pasos 1 y 2 con suero desproteinizado (o agua destilada). Anotar los volúmenes de base y ácido gastado.

Resultados:

1. Con los datos obtenidos en este experimento complete la siguiente tabla:

CON EL SUERO CON EL AGUAml μmoles Ml μmoles

Gasto de NaOH 0.01 NGasto de HCI 0.01 N

2. Calcular los mEq de ácidos y base necesarios para producir un cambio de una unidad de pH del suero y del agua.

mEq ACIDO mEq ABASESueroAgua destilada

Interrogantes:

1. ¿Cuántos grupos ionizables tiene el péptido Arg – Lis- Asp – His – Glu - Cis?

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2. ¿Qué carga eléctrica predominante tiene este péptido a pH 7.4?

3. ¿Cuál es su forma isoeléctrica y su pI?

EXPERIMENTO 4.2. Estudio de la solubilidad de la caseína a diferentes pH y la determinación de si pI.

Objetivos:

1. Estudiar el efecto del pH sobre la solubilidad de las proteínas.2. Determinar el pI de una proteína.

3. Estudiar el comportamiento de las proteínas en su pI.

Procedimiento:

1. Preparar una serie de 9 tubos.2. En el tubo 1 medir 9 ml de las solución de ácido acético 0.178 N.3. En el tubo 2 medir 9 ml de la solución de ácido acético preparada mezclando 10 ml del ácido

acético preparada mezclando 10 ml del ácido acético 0.178 N con 10 ml de agua.4. En el tubo 3 medir 9 ml de la solución de ácido acético obtenida me mezclar 10 ml de la solución

anterior con 10 ml de agua destilada.5. Proceda en la misma forma hasta completar los 9 tubos.6. A cada tubo añadir 1 ml de la solución de caseína al 0.5 % en acetato de sodio 0.1 N.7. Mezclar bien y observar la turbidez o el precipitado, a 1 y 10 minutos.8. Con papel indicador estime el pH de cada uno de los tubos.

Resultados:1. Complete la siguiente tabla y anote los resultados de turbidez o precipitado con 0 a 5+

TUBO N°NORMALIDAD RELACION

SAL/ACIDOpH TURBIDEZ O PRECIPITADO

SAL ACIDO Teórico Práctico 1 min. 10 min.12

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3456789

Interrogantes:

1. ¿Cuál es él pI de la caseína?

2. ¿Por qué precipita la caseína en si pI?

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ASIGNATURA DE BIOQUIMICA – ODONTOLOGIA

PRACTICA N° 5BIOCATALISIS

INTRODUCCION.

Las enzimas son proteínas que intervienen en las reacciones químicas de los organismos vivos, incrementando la velocidad de esta hasta alcanzar su punto de equilibrio.

En una reacción bioquímica catalizada por una enzima, a medida que progresa la reacción, aumenta la concentración de los productos a expresas de la desaparición de los correspondientes substratos, en tanto que en enzima permanece inalterable.

La actividad enzimática usualmente es expresada por:

a) La desaparición del sustrato (P).b) La aparición del producto (P).c) La modificación de los cofactores.

Diversos factores modifican la actividad enzimática:

a) El pH del medio.b) La concentración de la enzima.c) La temperatura de la reacción.d) La concentración del sustrato.e) La fuerza iónica ambiental.f) El tiempo de reacción.g) El efecto de inhibidores y activadores.

En la presente práctica se estudiará algunas de las propiedades de las reacciones enzimáticas. Para ello utilizaremos como modelo experimental, la acción hidrolítica de la pepsina sobre la proteína albúmina de huevo.

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La ovoalbúmina es una proteína globular presente en altas concentraciones en la clara de huevo, apareciendo en el huevo fresco como una solución viscosa y legeramente opalescente. Esta proteína en su estado natural tiene las dimensiones de 13mμ, y esta constituida de 584 residuos de aminoácidos dispuestos en una sola cadena polipeptídica, con un PM de 64500 y un pI de 4.6. Esta es la proteína que será utilizada como sustrato de la pepsina, previa desnaturalización. La desnaturalización de laalbúmona de logra hirviendo el huevo por algunos minutos; entonces, se extrae la clara, se la licúa con agua destilada y esta solución se la filtra a travez de una gasa. Se obtiene así, una solución no viscosa pero turbia. Ud. tiene que observar cuidadosamente esta solución antes y después de añadirle pepsina.

Recuerde usted que la pepsina es una enzima proteolítica secretada por las células principales del estómago al estado de zimógene o “proenzima” (pepsinógeno). Su activación requiere de un pH muy ácido e implica la remoción de un péptido bloquear de su extremo amino terminal.

La enzima así activada digiere a las proteínas hidrolizando loa enlaces peptídicos situados hacia el lado amino de los residuos de fenilalanina, tirosina y triptófano, además de aspartato, glutamato y leucina (R2). No actua si el aminoácido anterior es prolina.

Pepsina

EXPERIMENTO 5.1 Efecto del pH sobre la velocidad de una reacción enzimática.

Objetivos:

1. Estudiar la influencia del pH sobre la velocidad de una reacción enzimática.

2. Determinar el pH óptimo para la actividad de la pepsina.

Procedimientos:

1. Preparar 5 tubos de prueba de acuerdo al siguiente cuadro:

1 2 3 4 5

Solución de ovoalbúmina 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 mlHCI 1.0 N 2.0 0.5 0.0 0.0 0.0 mlNaCO3 10% 0.0 0.0 0.0 0.5 2.0 mlAgua destilada 0.0 1.5 2.0 1.5 0.0 ml

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CIIO

R2

ICIH

H IN H

ICIR1

N IH

OIIC


2. El otro 5 tubos de prueba pequeños, medir 3 ml de una solución de pepsina al 1%

3. Preincubar los 10 tubos en baño maria a 37° por 5 minutos.

4. Agregar rápidamente a cada uno de los 5 primeros tubos, los 3 ml de la solución de pepsina reincubada en cada uno de los segundos tubos.

5. Mezclar bien y continuar la incubación a 37°C por 10 minutos. Observar cuidadosamente cada tubo antes y después de agregar la enzima.

6. Expresar el aclaramiento (la actividad enzimática) de cada uno de los tubos, con 0 a 5 cruces, al final de 1, 5 y 10 minutos.

7. Haga el cálculo teórico del pH de los tubos 1 y 2 y compruebe con papel indicador el pH de todos los tubos.

Resultados:

1. En papel milimetrado, haga una gráfica con los resultados obtenidos, colocando en el eje de abscisas el pH y en el eje de ordenadas la actividad enzimática.

2. El pH óptimo de la pepsina es…………………………………………………………………..

Interrogantes:

1. ¿Por qué se debe cocer un huevo antes de comerlo?

...........................................................................................................................................................

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2. ¿Por qué la solución de ovoalbúmina que Ud. utiliza como sustrato tiene un aspecto tan diferente a la clara de huevo?

…………………………………………………………………………………………………..

3. ¿Cómo define la “desnaturalización” de una proteina? ¿Puede esta ser irreversible?

…………………………………………………………………………………………………….

……………………………………………………………………………………………………

4. ¿Habrán diferencia en las dimensiones de las moléculas de ovoalbúmina contenidas en la clara de huevo y en la solución sustrato? Si las hubiera, ¿Cuál es la razon?

……………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………….…………

5. ¿Por qué ocurre aclaramiento de la solución sustrato de ovoalbímina cuando se le añade pepsina?

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………..………

…………………………………………………………………………………………………….

6. ¿Por qué el pH afecta la actividad de las enzimas?

……………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………….………..

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EXPERIMENTO 5.2 Efecto de la [E] sobre la velocidad de una reacción enzimática.

Objetivos:

1. Estudiar la influencia de la [E] sobre la velocidad de una reacción enzimática.

Procedimientos:


1 2 3 4

Solución de ovoalbúmina 5.0 5.0 5.0 5.0 mlHCI 1.0 N 0.5 0.5 0.5 0.5 mlAgua destilada 1.5 3.5 4.2 4.2 ml

Preincubar los 4 sistemas como en la experiencia anterior y luego añadir:

Pepsina al 1% preincubada 3.0 1.0 0.3 0.0 mlPepsina al 1% hervida 0.0 0.0 0.0 0.3 ml

2. Mezclar bien y continuar la incubación a 37°C por 10 minutos. Observar cuidadosamente cada tubo antes y después de agregar la enzima.

3. Expresar el aclaramiento (la actividad enzimática) de cada uno de los tubos, con 0 a 5 cruces, al final de 1, 5 y 10 minutos.

4. Calcule la concentración de la pepsina en cada uno de los tubos en miligramos por tubo.

Resultados:

1. En papel milimetrado, haga una gráfica con los resultados obtenidos, colocando en el eje de abscisas la [E] y en el eje de ordenadas la actividad enzimática.

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APELLIDOS………………………………………………………………..NOMBRES………………………

FECHA………………/ ………../……………

BIOQUIMICA ODONTOLOGIA

PRACTICA N° 6. OXIDACIONES BIOLOGICAS

INTRODUCCION.

1. Reacciones de oxidoredución

Para Lavoisier y contemporáneos, oxidación significaba adicción de oxígeno a la sustancia destinada a oxidarse. Reducción por el contrario era la pérdida de oxígeno. Ejemplo, la oxidación de un aldehído a ácido.

R−CHO+1/2O2 R−COOH

Posteriormente se reconoció como oxidación el proceso de pérdida de hidrógenos y por reducción el proceso contrario; la oxidación de un alcohol sería un ejemplo de este caso:

R−C H 2OH R−CHO+H 2

En la actualidad se entiende por oxidación la pérdida de electrones y por reducción la ganancia de los mismos, como en el siguiente ejemplo:

OxidaciónFe2+¿¿ Fe+3−e−¿¿

Reducción Es muy importante remarcar que las oxidaciones y reducciones no se llevan a cabo en la forma anteriormente anotada, pues así escrita ellas son reacciones incompletas; es decir, los electrones no permanecen al estado libre. De hecho, cada sustancia que se oxida (el agente reductor) esta necesariamente acompañada de una substancia que se reduce (el agente oxidante) y viceversa; es el “par redox conjugado”.

Los diferentes agentes reductores difieren en su tendencia a perder electrones. La tendencia de un agente reductor a perder electrones (o a la de un agente oxidante a ganarlos) esta dad por el “potencial de óxidoreducción estandar” (Eó).

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2. Significado del potencial de óxidoreduccion o potencial REDOX

El potencial de óxidoreducción estándar se define como la fuerza electromotriz en voltios dad por una “semicelda”, en la cual están presentes tanto el reductante y el oxidante a una concentración 1M, a 25°C y un pH 7.0, en equilibrio con un electrodo que puede reversiblemente aceptar electrones de las especies reductantes. Por convención se usa como un potencial de referencia el Eó de la reacción del electrodo de hidrógeno.

H+¿+2 e−¿2. ¿¿ H 2

Que tiene un valor de 0.0 voltios, cuando la presión del gas hidrógeno es de 1 atm, el pH 0 y a 25°C. Este valor corregido a pH 7 es de -0.41 voltios.Así tenemos que:

1) El agente reductor (que cede electrones), tiene un Eó negativo. Un Eó negativo significa que una sustancia tiene una menor afinidad por los electrones que el H 2.

En tanto el Eó sea más negativo, menor será la afinidad del sistema por los electrones.

2) El agente oxidante (que quita electrones), tiene un Eó positivo. Un Eó positivo significa que una substancia tiene una mayor afinidad por los electrones que el H 2.En tanto el Eó sea más positivo, mayor será la afinidad del sistema por los electrones.

OXIDANTE REDUCTOR N Eó (v)NAD+¿¿

PiruvatoFADFumaratoCoQCit b oxidCit c1 oxid.Cit c oxid.Cit a oxid.1/2O2+2H +¿¿

NADH + H+¿¿

LactatoFADH 2

SuccinatoCoQ H 2

Cit b redCit c1 redCit c redCit a redH 2 O

2222222222

-0.32-0.19-0.06+0.03+0.04+0.07+0.23+0.25+0.29+0.82

De esta forma los valores Eó nos permiten predecir la dirección de flujo de electrones de un par redox a otro cuando ambos está bajo condiciones estándar y en presencia de un catalizador. Bajo tales condiciones los electrones tienden a fluir de un par de redox a otro en la dirección del sistema más positivo, hasta la formación de agua.

3. El ∆ G ° ´ de una reacción de óxidoreducción.

La tendencia de los electrones a fluir desde los sistemas electronegativos a los sistemas electropositivos, es el resultado de la perdida de energía libre (G). Por ello, el cambio de energía libre estándar o ∆ G ° ´ de una reacción de óxidoredección, puede calcularse fácilmente a partir de la diferencia de potencial redox de los reactantes o ∆ G ° ´ , empleando la siguiente ecuación.

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∆ G ° ´ = -n.F. ∆ Eó

Donde: n es el número de electrones transferidosF o Faraday = 23062 cal/vol.mol, y∆ Eó= Eó del par aceptor de e−¿¿ - Eó del par donador e−¿¿

Por ejemplo, si consideramos la reacción:

Piruvato + NADH + H+¿¿ Lactato + NAD+¿¿

Tenemos las siguientes ecuaciones de electrodo:

Piruvato + 2 H+¿¿ + 2 e−¿¿ Lactato Eó = -0.19v

NAD+¿¿ 2 H+¿+2 e−¿¿¿ NADH + H+¿¿ Eó = -0.32v

Y la diferencia de potencial redox (∆ Eó) será:∆ Eó = -0.19v – (-0.32v) = + 0.13v

Por lo que, el cambio de energía libre estándar (∆ G ° ´ ¿ de la reacción de óxidoreducción (1) será:

∆ G ° ´ = -2 (23062 cal/v.mol) x (+0.13v) = -6000 cal/mol o – 6 Kcal/mol

Si consideramos toda la amplitud de la cadena respiratoria tendremos la siguiente reacción:O2+NADH + H+¿

1/2 ¿ H 2 O+NAD+¿¿

¿Cuáles serán las ecuaciones de electrodo para esta reacción de óxidorediccion?

¿Cuál será el ∆ G ° ´ de la reacción?

4. La cadena respiratoria.

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En los organismos vivos las reacciones de oxidoreduccion cumplen el importante rol de proveer energía. De hecho, las grandes cantidades de energía producidas en las oxidaciones biológicas son la principal fuente de energía indispensable para impulsar las diferentes formas de trabajo celular.

Las enzimas que catalizan estas reacciones de oxidoreduccion se denominan oxidoreductasas. Un grupo importante de ellas son las dishidrogenasas. Los electrones de los átomos de H sustraídos de los substratos por las deshidrogenasas, son tranasportados a la “cadena mitocondrial de transporte de electrones” o “cadena respiratoria”. La secuencia de eslabones de esta cadena va en orden creciente de su Eó, y la reacción general es:

SUBSTRATONAD+¿¿ Flavina (FMN) CoQ Cit b Cit c1 Cit c Cit oxidasa O2

Donde el substrato se oxida y finalmente el oxígeno se reduce para formar agua. Otros substrato como el Succinato son la excepción a este esquema, ya que los 2 H+¿¿ y los 2 e−¿¿ son transferidos a una flavina (FAD) como primer eslabón, en el lugar de NAD+¿¿, debido a que el Eó del par Fumarato/Succinato es más alto que el Eó del par NAD+¿NADH +H +¿¿ ¿.

Aquellas deshidrogenasas que transfieren el potencial reductor desde el substrato al oxígeno en forma indirecta, a través de la cadena respiratoria, se denomina deshidrogenasas “anaeróbicas”; a esta clase pertenecen la Lactato Deshidrogenasa y la Succinato Deshidrogesana. Otras deshidrogenasas transportan el potencial reductor directamente desde el substrato al oxígeno sin que medie la cadena respiratoria, por lo que se llaman deshidrogenasas “aeróbicas”; a esta clase pertenece la Xantino Deshidrogenasa.

5. El Azul de Metileno, un aceptor artificial de electrones.

Los experimentos de la presente práctica, demuestran la actividad de deshidrogenasas de diversas fuentes, usando Azul de Metileno como el aceptor terminal de electrones y protones.

En estos experimentos es sistema de citocromos más el oxígeno como aceptor final del átomo de hidrógeno (o electrones), en condiciones fisiológicas, son reemplazados por el Azul de Metileno como un aceptor artificial de electronos. Este colorante reacciona fácilmente con los sistemas biológicos de oxidoreducción y en su forma oxidada es de color azul y cuando se reduce se vuelve incoloro; entonces, la ocurrencia y velocidad de estas reacciones se pueden apreciar fácilmente observando la desaparición de color de la forma oxidada.

El azul de Metileno reducido es fácilmente reoxidado por el oxígeno del aire, y de allí que en estos experimentos es necesario cubrir los componentes del sistema como parafina líquida, para lograr condiciones anaeróbicas.

6. Inhibidores específicos de ciertas enzimas y de la cadena respiratoria.

Diversos inhibidores son frecuentemente utilizados para el estudio de la actividad enzimática y la dilucidación de las vías metabólicas. El malonato por ejemplo, es un inhibidor competitivo de la Succionato Deshidrogenasa que ha contribuido al conocimiento de la especificidad de substrato de la

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enzima, la naturaleza de los grupos funcionales en el sitio activo de la enzima, y los mecanismos de actividad catalítica.

De la misma forma, diversos inhibidores que actúan en ciertos puntos de la cadena respiratoria han contribuido grandemente al estudio del transporte electrónico. Los más importantes son:

1).La rotenona, un producto vegetal extremadamente tóxico utilizando por los indios Sud Americanos para pescar por envenenamiento. Este compuesto bloquea la transferencia de e−¿¿ de NADH a ubiquinona.

2).El antibiótico tóxico, Antimicina A, aislado de una cepa de Steptomyces, el cual bloquea la transferencia de e−¿¿ de ubiquinona a citocromo c.

3).Amital, un barbitúrico el cual bloquea la transferencia de e−¿¿ al mismo nivel que la retonona.

4).Cianuto, conocido como uno de los venenos más letales, el cual bloquea la reducción del oxigeno, catalizada por citocromo oxidasa (o Citaa3), uniéndose a la forma férrica (Fe3+¿¿) de este,

5).El monóxido de carbono, CO, el cual también bloquea la transferencia de e−¿¿ de citocromo oxidasa al oxígeno, pero uniéndose a la forma ferrosa Fe2+¿¿ de este.

Por otro lado, las consecuencias dramáticas de estas substancias se deben al hecho de que al inhibir la cadena respiratoria, bloquean la generación de la energía necesaria para la producción de ATP por fosforilación oxidativa y por lo tanto la muerte celular.

EXPERIMENTO 6.1 Estudio de la oxidación del Succinato por una preparación enzimática de corazón.

Objetivos:

1. Estudiar las reacciones de oxidoreducción es sistemas biológicos.2. Demostrar la inhibición a nivel del sustrato, de los fenómenos óxidoreductivos.3. Estudiar la acción de los aceptores artificiales de electrones.4. Demostrar la actividad de la deshidrogenasa succínica en un preparado de músculo cardiaco.

Procedimiento:

1. Preparar 4 tubos de acuerdo a la siguiente tabla:

REACTIVOS 1 2 3 4Azul de Metileno (gotas)Succinato 0.1 M (ml)Succinato 0.3 M (ml)Malonato 0.2 M (ml)Agua (ml)

3---4

32--2

32-2-

3-22-

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ENZIMA * (ml) 1 1 1 1

* Preparación enzimática de músculo cardiaco: Extraer el corazón de un conejo y lavarlo con agua destilada (dejarlo allí siempre que sea

posible). Con tijera desmenezarlo y colocarlo en un mortero para homogenizarlo en 25 ml de buffer

fosfato pH 7.4, 0.1 M. Mantener la preparación en hielo hasta ser utilizada.

2. Mezclar bien cada tubo y añadir a cada uno 1 ml de parafina líquida, lentamente y por las paredes del tubo.

3. Incubar los tubos en baño maría a 37°C.

4. Expresar el aclaramiento de cada uno de los tubos, con 0 a 5 cruces, a los 5, 10 y 15 minutos de incubación.

5. Después de anotar los resultados agitar por inversión todos los tubos y observar que ocurre con la coloración de cada tubo.

Resultados:

1. ¿Cuál es el tubo en el que ha ocurrido mayor oxidación del succinato?¿Cuál es el fundamento de su respuesta?

2. ¿Cómo explica el efecto del malanato en los tubos 3 y 4? ¿A qué se debe la diferencia en ambos tubos?

3. ¿Es necesario agregar NAD+¿¿ para que el succinato se oxide?¿Cuál es el fundamento de su respuesta?

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4. ¿Si al tubo 3 Ud. le agrega cianuro en lugar de malonato, que ocurrirá con el aclaramiento del tubo?

5. Podría Ud. sugerir algún otro método para evidenciar la actividad de la Succinato Deshidrogenasa?

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PRACTICA N° 7 GLICOLISIS

INTRODUCCION.

La glicólisis es la vía central del catabolismo dela glucosa que ocurre en todas las células del organismo con la finalidad de producir la energía necesaria para la actividad celular. La glicólisis es una vía metabólica que consiste en una secuencia de reacciones a través de las cuales la glucosa se convierte en piruvato (CH3 –CO-COO−¿ ¿) con la concomitante producción de ATP y la reducción del NAD+¿¿ a NADH +H+¿¿. En condiciones de anaerobiosis, es decir en ausencia de oxígeno, el piruvato es reducido lactato CH3 – CHOH - COO−¿ ¿) a expresas del NADH + H+¿¿. En cambio, en presencia de oxígeno los tejidos pueden oxidar exhaustivamente el piruvato formado hasta CO2 y H 2O.

Glucosa Fructosa 1,6-difosfato

ADP2 Fosfoenolpiruvato2. Gliceroaldehido3−fosfato2

ATP2 H 3−CO−CO O−¿2 ¿ CH 3−CHOH−CO O−¿

2 ¿

Así, la molécula de glucosa, la cual tiene 6 átomos de carbono, es degradada en una secuencia de 10 reacciones (resumidas en el esquema anterior) catalizadas enzimáticamente, a producir 2 moléculas de piruvato, la cual tiene 3 átomos de carbono. Durante las reacciones secuenciales de la glicólisis mucho de la energía libre liberada de la glucosa es conservada en la forma de ATP, de modo que el proceso global que ocurre en las células podría representarse así:

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O2

CO2+H 2O

ATP2ADP2

NADH 22 NAD+ ¿2 ¿


Glucosa

Las enzimas de la vía glicolítica se encentran en el citoplasma, existiendo un estrecha relación con las mitocondrias, donde ocurren:

La descarboxilación oxidativa del piruvato a formar Acetil CoA, Las reacciones del ciclo de Krebs a oxidar al Acetil CoA y producir el “potencial reductor”

NADH +H + y FADH2) para la síntesis de ATP, y La oxidación de este potencial reductor a través de la cadena respiratoria, con la

concomitante síntesis de ATP para fosforilacion oxidativa acoplada a la cadena respiratoria.En la presente práctica se demostrara el consumo de glucosa y la producción de ácido láctico durante el proceso catalítico.

Para la determinación de la glucosa se utilizará el método de Nelson y Smogy cuyo fundamento es el siguiente: el filtrado libre de proteínas conteniendo a la glucosa de calienta en presencia de una solución cúprica alcalina, obteniéndose la reducción del Cu++¿¿ a Cu2O, el cual actúa luego sobre el arsenomolibdato produciendo un complejo de molibdeno reducido de color azul cuya intensidad se mide en el fotocolorímetro (fotocolorimetría).

El ácido láctico se determinará por titulación con una solución de KOh 0.02 N utilizando el indicador Rojo de fenol.

EXPERIMENTO 7.1. Glicólisis anaeróbica en el músculo de conejo.

Objetivos:

1. Demostrar como la glucosa en ausencia de oxígeno se transforma en ácido láctico, utilizando como fuente enzimática un homogenizado de músculo de conejo.

2. Comprobar el consumo de glucosa durante el proceso.

3. Comprobar la producción de ácido láctico en condiciones de anaerobiosis.

Procedimiento:

a) Degradación de la glucosa:

1. En un Erlenmeyer del 125 ml limpio y seco medir 10 ml de una solución de glucosa al 1% en solución de Krebs Ringer Fosfato (*) conteniendo nicotinamida 0.03M, NAD+¿¿ 0.2% Y ATP 0.2%.

2. Incubar la solución en baño maría a 37°C por 10 minutos.

3. Agregar al Erlenmeyer 50 de un homogenizado de músculo al 10% (P/V), preparado previamente en solución Krebs Ringer Fosfato.

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4. Mezclar y tomar un volumen de 20 ml en una probeta y colocarlo inmediatamente en hielo. Esta muestra incluye la muestra basal a tiempo cero.

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------(*) Solución de Krebs Ringer Fosfato:

NaCI 0.154M 10.0 ml KCI 0.154M 0.4 ml CaCI2 0.10 M 0.1 ml MgSO4 0.154M 0.1 ml Buffer fosfato pH 7.4 0.1 M 21.0 ml

5. Después de haber tomado la muestra basal, añadir el erlemneyer un volumen adecuado de parafina liquida para aislar el sistema de reacción del oxígeno del aire y así, establecer las condiciones de anaerobiosis. Proseguir entonces con la incubación a 37°C durante 60 minutos. Esta será la muestra incubada.

6. Tanto en la muestra basal como en la muestra incubada por 60 minutos realizar las determinaciones de glucosa y ácido láctico.

b) Preparar el filtrado libre de proteínas para la determinación de la glucosa en las muestras basal e incubada por 60 minutos.

1. Para cada muestra, medir en un tubo de ensayo 4ml de agua destilada y agregar 2ml de muestra respectiva.

2. Agregar 2ml de ZnSO4 al 5%, agitar y dejar en reposo por 5 minutos.

3. Añadir 2 ml de Ba¿ 0.3 N, agitar y dejar en reposos por 3 minutos.

4. Filtrar a través de un papel de filtro colocado en un embudo de vidrio. El filtrado libre de proteínas debe ser incoloro.

c) Determinación de la glucosa.

1. Preparar 4 tubos de Folin de acuerdo a la siguiente tabla:

REACTIVOS 1 2 3 4- Filtrado muestra Basal 1ml -- -- --- Filtrado muestra Incubada -- 1 ml -- --- Solución Estándar (*) -- -- 1 ml --- Agua destilada -- -- -- 1 ml- Reactivo Cuproalcalino 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

(*) Solución Estándar de glucosa conteniendo 50 μg/ml .

2. Colocar los tubos en baño maría hirviente por 15 minutos.

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3. Enfriar los tubos en agua corriente.

4. Añadir a cada tubo 1 ml del reactivo arsenomolibdato disolviendo con suave agitación el Cu2O producido.

5. Completar con agua destilada a 25 ml y mezclar. Reposo 5 minutos.

6. Leer ene l fotocolorímetro con filtro verde y anotar.

7. Hacer los cálculos respectivos y expresar la concentración de glucosa en mg/100ml.

d) Determinación del ácido láctico.

1. En cada uno de los beakers medir 15 ml de las muestras Basal e Incubada respectivamente y hacerlas hervir por 2 minutos teniendo cuidad que no se proyecten.

2. Enfriar y filtrar a través de una gasa y luego a través de papel de filtro.

3. Proceder a la titulación de 3ml de cada muestra con KOH 0.02 N, agregando 1 gota del indicador Rojo de Fenol, hasta obtener un color naranja rosa.

4. Anotar el volumen de soda gastado y calcular la normalidad de ácido láctico.Resultados:

Anotar sus resultados en la siguiente tabla:Muestra Basal Muestra Incubada

Glucosa en mg/100 mlÁcido láctico en mEq/L

Discuta e interprete sus resultados:

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--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

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Interrogantes:

1. Defina la glicólisis anaeróbica:

2. En que célula o tejidos, la glucosa es degradada anaeróbicamente, y en cuáles aerobicamente?

3. Escriba las reacciones de la glicólisis que requieren de ATP y las producen ATP. Reacciones que requieren de ATP:

Reacciones que producen ATP:

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4. ¿Cuál es la producción neta de ATP por la oxidación anaeróbica de 1 mol de glucosa?

5. ¿Cómo se define la “fosforilación a nivel de sustrato”? ¿Qué enzimas de la glicólisis catalizan estas reacciones?

6. ¿Cuál es la producción neta de ATP por la oxidación aeróbica de 1 mol de glucosa hasta CO2y H 2 O?

7. ¿Cuál es la importancia de la glicólisis para los eritrocitos y las neuronas? Para los eritrocitos

Para la neuronas

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8. Mediante un esquema demuestre la función del NAD+¿¿ en la glicolisis:

9. ¿A qué se llama enlace fosfato rico en energía? ¿Qué intermediarios de la glicolisis lo presentan?

10. Nombre las reacciones irreversibles de la glicólisis y mencione aquellas enzimas que hacen posible que estas reacciones ocurran en sentido inverso.

11. ¿Cómo se regula la glicólisis?

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APELLIDOS……………………………………………….NOMBRES………………………………

FECHA……………………/…………………./……………………ASIGNATURA DE BIOQUIMICA – ODONTOLOGIA

PRACTICA N° 8

DEGRADACION DE LOS AMINOACIDOS: TRANSAMINACION

INTRODUCCION.

Las transaminasas son enzimas presentes en la mayoría de los tejidos animales, que catalizan una de las importantes reacciones del metabolismo de las proteínas, la transferencia reversible del grupo amino desde un aminoácido hacia un cetoácido; el aminoácido que pierde el grupo amino se convierte en un nuevo cetoácido, y el cetoácido que lo gana se convierte en el aminoácido respectivo. El cofactor de estas enzimas es el piridoxal fosfato y para casi todas las transaminasas, ∝−cetoglutarato es el aceptor del grupo amino formándose glutamato:

O sea: L – aa + ∝−cetoglutarato ================ ∝−cetoácido + L – Glu

El interés clínico está centrado especialmente de dos transaminasas: L – Alanina: ∝−¿ cetoglutarato aminotransferasa (Transaminasa Glutánico Pirúvica o TGP) y L – Aspartato: ∝−¿ cetoglutarato aminotransferasa (Transaminasa Glutánico Oxalacética o TGO). Estas enzimas tienen una acción eminentemente intracelular, por lo que la actividad sérica es condiciones normales es baja o nula. Un aumento de actividad será evidencia de un deterioro de los tejidos en que se encuentran, de los cuales resultan particularmente importantes el corazón y el hígado.

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NH 3+¿¿

I

R−CO−COO−¿¿

H I C == 0 I E

H I H–C-NH 3+¿¿

I E

NH 3+¿¿

I OOC−CH 2−CH 2−CH− COO−¿−¿¿ ¿

OOC−CH 2−CH 2−CO− COO−¿−¿¿ ¿


Se ha observado que luego de un infarto de miocardio se produce en el suero un marcado aumento de la actividad de TGO, debido a la liberación al torrente sanguíneo de esta enzima, tan abundante ene l miocardio. En este caso no existirá un aumento en la actividad sérica de TGP o será mínimo.

En hepatitis virales y otras formas de enfermedad hepática que involucren necrosis de tejido, habrá también un incremento considerable de la actividad sérica de transaminasas, incluso antes de la aparición de síntomas clínicos como ictericia. En este caso, TGP será el enzima predominante debido a su gran concentración en el tejido hepático.

Una elevada actividad de transaminansas puede detectarse también en otras condiciones como traumas accidentales o quirúrgicos, pancreatitis aguda, distrofias musculares, ect.

En la presente práctica se estudiará:

1) La transaminación de la alanina y el aspartato con el ∝−¿ cetoglutarato en presencia de un preparado enzimático de hígado de paloma, mediante un método cromatográfico.

2) La determinación de la actividad transaminásica de TGP y TGO en el suero de personas normales y con patología hepática, mediante el método colorimétrico de reitman y frankel, en el cual piruvato formado (el oxalacetato es inestable y se transforma en piruvato) reacciona con la 2.4 – dinitrofenilhidrazina produciendo, en medio alcalino, un compuesto coloreado que se mide a 505 nm.

EXPERIMENTO 8.1 Transaminación en presencia de un preparado enzimático de hígado de pichon.

Objetivos:

1. Estudiar la transaminación de alamina y aspartato, utilizando como fuente enzemática un preparado de hígado de pichón.

2. Aplicación de la técnica de cromatografía en capa fina.

Procedimiento:

1. Preparación de la fuerte inzimática (polvo acetónicos)

Los higados recientemente extraidos de 4 pichones de paloma son homogenizados en 10 volúmenes de acetona fría durante 1 minuto. Luego de filtrar y lavar varias veces, el residuo obtenido es secado a temperatura ambiente, obteniéndose así polvos secos fáciles de conservar. El día de la práctica se muele en un mortero: 700 mg de polvos acetónicos con 7 ml de agua destilada y luego de centrifuga el preparado a 2000 rpm por 10 minutos. Se decanta el sobrenadamente y se completa al volumen a 35 ml con agua destilada.

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La acetona, por su acción deshidratante facilita la extracción de enzima de los tejidos. En esta forma, la acetona reduce la desnaturalización de la proteínas y concomitantemente produce desintegración de la estructuras celulares y a disrupción de los enlaces lipoproteicos.

2. Preparación del experimento de transaminación.

En 4 tubos de prueba (13 x 100 mm), previamente lavados con HN03 concentrado, medir lo siguiente:

SISTEMAS 1 2 3 4Alamina 0.05 MGlutamato 0.05 MAspartato 0.05 M

α−cetoglutarato 0.1 MPiruvato 0.1 M“Extracto enzimático”“Extracto enzimático hervido”

0.2 ml--

0.2 ml-

0.6 ml-

-0.2 ml

--

0.20.6-

--

0.2 ml0.2 ml

-0.6-

--

0.2 ml0.2 ml

--

0.6 ml

Mezclar el contenido de cada sistema y luego incubar en baño maría a 37°, durante 1 hora.

3. Identificación de los productos de la reacción por cromatografía en capa fina:

Cada grupo dispondrá de una placa de vidrio (200 x 200 mm) con Silica Gel, en la que se ha marcado los puntos de origen a 15 mm del borde inferior, con una distancia entre ellos de 25 mm y en el siguiente orden.

MUESTRA PUNTOS DE ORIGEN

SISTEMA N° 1 2 3 4 - - -

Sol. St. de aa - - - - Ala Glu Asp

Rf x 100

Aplicar utilizando tubos capilates de vidrio y en el punto de origen que les corresponde, 4 μl de cada sistema incubado y 2μl de las soluciones estándar de aminoácidos, en alícuotas de más de 1 μl cada vez, dejando secar cada área después de cada aplicación.

Al final, colocar la placa en la cámara cromatográfica conteniendo como solvente 75 volúmenes de fenil y 25 de agua.

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La cromatografía termina cuando el solvente alcanza la línea marcada a 10 cm de los puntos de origen. Entonces sacar la placa, secarla en la estufa a 110 °C x 3 minutos, y revelar el cromatograma rociando una solución de Ninhidrina al 0.1% en n-butanol saturado en agua. Dejar secar.

Expresión de resultados:

1. Calcular los Rf x 100 de cada mancha, completrar la tabla anterior e interpretar el cromatograma con los resultados obtenidos.

2. Haga un comentario de cada uno de los sistemas preparados:

Sistema 1. _______________________________________________________________________

Sistema 2. _______________________________________________________________________

Sistema 3. ______________________________________________________________________

Sistema 4. _______________________________________________________________________

EXPERIMENTO 8.2. Determinación de la actividad de TGP y TGO colorimétricamente.

Objetivos:

1. Estudiar la actividad transaminásica en sueros normales y patológicos.

2. Demostrar la aplicación del método de Reitman y Frankel para la determinación de la actividad de TGP y TGo en sueros.

Procedimiento:

En 3 tubos de prueba marcados B (Blanco) y D (Desconocido), colocar:

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

TUBOS: B D

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Sustrato (TGO o TGP) * 0.25 ml 0.25 ml

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

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Colocar en baño de agua a 37°C x 2 minutos, luego agregar:

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Suero 50 μl

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Agua destilada 50 μl

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Mezclar por agitación suave e incubar exactamente: 60 minutos para TGO y 30 minutos para TGP y

agregar:

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Reactivo 2,4.DNFH 0.25 ml 0.25 ml

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Mezclar. Dejar 10 minutos a 37°C. luego agregar:

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

NaOH 0.4 M 0.25 ml 2.5 ml

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Mezclar por inversión y retirar del baño. Despues de 2 minutos leer en el fotocolorímetro con filtro

verde (500 – 550 nm), llevando previamente el aparato a cero D.O. con agua destilada.

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

* Sustrato TGP: Solución de L-Alamina 200 mM y α – cetoglutarato 2 mM en buffer fosfato 100 mM, a

pH 7.4.

* Sustrato TGO: Solución de L-Alamina 100 mM y α – cetoglutarato 2 mM en buffer fosfato 100 mM,

a pH 7.4.

Determinar las unidades TGO o TGP, empleado la curva la calibración correspondiente:

1. Preparación de la curva de calibración:

En 9 tubos de ensayo colocar:

Tubo ml. Sol. St de ml Sustrato Agua TGO TGP D.O.

N Piruvato TGP destilada U/L U/L1 0.00 1.00 0.2 - - 0.1652 0.05 0.95 0.2 10 6 0.2023 0.10 0.90 0.2 20 13 0.240

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4 0.15 0.85 0.2 32 19 0.2745 0.20 0.80 0.2 47 28 0.3006 0.25 0.75 0.2 67 35 0.3307 0.30 0.70 0.2 93 46 0.3608 0.40 0.60 0.2 - 66 0.4109 0.50 0.50 0.2 - 99 0.455

Mezclar y agregar a cada tubo, cada 30 segundos, 1 ml de reactivo 2.4 – DNFH. Mezclar. Incubar 10 minutos a 37°C (contados desde el agregado de 2.4 – DNFH al primer tubo). Luego agregar 10 ml de NaOH 0.4 M a cada tubo, cada 30 segundos. Mezclar cada tubo inmediatamente por inversión y retirar del baño. 10 minutos después leer en el fotocolorímetro con filtro verde. Obtener las lecturas corregidas restando a cada lectura la obtenida en el tubo 1. En el papel milimetrado contruir la gráfica correspondiente colocando en el eje Y las lecturas corregidas de D.O. y en el eje X la actividades para cada enzima.Valores de referencia:

TGP: 2 a 18 U/L (5 a 35 U Karmen/ml).

TGO: 4 s 20 U/L (8 a 40 U Karmen/ml).

2. Determinación de la actividad transaminásica en las muestras de suero. Para ello y utilizando la curva de calibración de Ud. ha graficado en papel milimetrado, complete la siguiente tabla:

SISTEMAS B DAbsorbancia Para TGP Para TGOAbsorbancia Neta o D.O.Actividad Transaminásica (U/L)

Haga un comentario de los valores de actividad transaminásica obtenidos:

INTERROGANTES.

1. ¿Cuáles son las reacciones catalizadas por TGO y TGP?

2. ¿Qué papel desempeña el piridoxal fosfato en la reacciones de transaminacion?¿Cuál es el grupo funcional del cofactor? Explique su mecanismo.

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3. ¿Participan las reacciones de transaminacion en la biosíntesis de aminoácidos?

4. ¿Qué importancia tienen las enzimas TGP y TGO para el proceso de gluconeogénesis?

5. ¿Cuál es la importancia clínica de las enzimas TGP y TGO?

6. Explique el mecanismo que permite la separación de sustancias por cromatografía en capa fina. ¿Qué se entienden por coeficientes de participación?

7. ¿Qué demuestra el sistema 2 en el experimento 1?

8. ¿Podría Ud. escribir la reacción correspondiente entre el piruvato formado, con el 2.4 – DNFH en medio alcalino?

9. ¿Qué es el Rf y para que se utiliza?

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APELLIDOS……………………………………………NOMBRES………………………………

FECHA…………………../………………/……………….

ASIGNATURA DE BIOQUIMICA - ODONTOLOGIA

PRACTICA N° 09

BIOSINTESIS Y DEGRADACION DE GLUCOGENO:

GLUCOGENESIS Y GLUCOGENOLISIS

INTRODUCCION.El hígado desempeña una función muy importante en el metabolismo glucídico del animal entero, ya que es capaz de sintetizar y degradar glucógeno de acuerdo con los requerimientos, manteniendo un nivel de glucosa sanguínea aproximadamente constante (normoglicemia).

Así, el glucógeno hepático es una forma de almacenamiento de glucosa fácilmente movilízable, que puede sintetizarse a expensa de glucosa y otros monosacáridos, por el proceso de glucogénesis y degradarse hasta glucosa por proceso de glucogenolisis:

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Pi H2O

Enzima desramificante

Glucógeno fosforilasa

Glucógeno sinteasa

Nucleósidodifosfokinasa

UDP - Glucosa

PPi 2Pi

ADP UTPG1P Uridil transferasa

[GLUCOSA] n

Fosfoglucomutasa

Glucosa 1 fosfato

Glucosa 6 fosfatasa

Glucosa 6 fosfato

PiATP

Hexoquinasa y/o Glucoquinasa

ADP

Glucosa


El hecho de que existan diferentes vías para la biosíntesis y para la degradación, hace posible que los mecanismos regulatorios actúen independientemente sobre la velocidad de los dos procesos. La glucógeno sisteasa y la glucógeno fosforilasa son las enzimas regulatorias de las sístesis y degradación del glucógeno, respectivamente. Ellas son reguladas recíprocamente por fosforilación (activada fundamentalmente por ADRENALINA Y GLUCAGON) y defosforilación (promovida por INSULINA), de forma que cuando una es activada, la otra es simultáneamente inhibida, como se muestra en el siguiente esquema:

SINTESIS DE GLUCOGENO FAVORECIDA

DEGRADACION DE GLUCOSA FAVORECIDA

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Pi H2O

O

Fosfoproteina fosfatasa INSULINA (+)

H2O

Pi

P

PO

ATP

ATP

Proteinakinasa (+)ADRENALINA

GLUCAGON

G. FOSFORILASA ACTIVA

G. SINTEASA INACTIVA

OHG. FOSFORILASA INACTIVA

OHG. SINTEASA ACTIVA


Desde un punto de vista cuantitativo, la mayor parte de glucógeno del organismo se encuentra en el hígado y en los músculos, aunque existe en todos los tejidos. En general, la dieta afectará más al contenido de glucógeno del hígado que en el músculo, mientras que el ejercicio físico afectará más el contenido del glucógeno muscular que el hépatico. Además, los depósitos de glucógeno muscular y hepático tendrá obviamente diferentes funciones; el glucógeno muscular está presente a servir como una reserva de combustible para la síntesis de ATP dentro del músculo para la contracción muscular, mientras que el glucógeno hepático funcionará como una reserva de glucosa para el mantenimiento de la concentración de glucosa en sangre, en los periodos de ayuno entre las comidas y en condiciones en las que aumenta la demanda.

En personas bien alimentadas la concentración de glucógeno hepático varía entre 2 a 8 g/100 g de tejido, con un valor prometio de 6.5 g%, siendo mayor después de la ingesta de dietas ricas en carbohidratos y menor en condiciones de ayuno, sobre todo después del ayuno nocturno, llegando a ser muy bajo en el ayuno prolongado. En cambio la concentración usual de glucógeno en el músculo esquelético es de 1.4 g/100 g de tejido. Este valor apenas si varía con el ayuno nocturno o con una dieta rica en carbohidratos; sin embargo, disminuye notablemente después del ejercicio prolongado.

Aun cuando el hígado tiene usualmente una concentración de glucógeno mayor que el músculo, el tejido muscular contiene en total la mayor reserva de glucógeno debido a su mayor masa. Así, un hombre que pesa 70 Kg tiene aproximadamente 28 Kg de músculo esquelético y sólo 1.6 Kg de hígado. Considerando las concentraciones indicadas, resulta que el contenido de glucógeno es de 392 g en los músculos y sólo 104 g en el hígado. La cantidad total de glucógeno teniendo en cuenta todos los órganos, será de algo más de 500 g en un individuo bien alimentado, y de unos 400 g después del ayuno nocturno. Esta diferencia aunque pequeña, representa el glucógeno hepático transformado en glucosa durante el ayuno, un rol de tremenda importancia fisiológica para la homeostasis de la glicemia y del organismo entero.

En la presente práctica se estudiará cuantitativamente el efecto de la dieta y el ayuno sobre el contenido de glucógeno hepático.

EXPERIMENTO 9.1 Estudio experimental en ratas de los factores que afectan el contenido del glucógeno hepático.

Objetivos:

1. Estudiar los factores que influyen en la síntesis y degradación del glucógeno hepático.

2. Estudiar el efecto de la dieta sobre el contenido de glucógeno hepático.

3. Estudiar el efecto del ayuno sobre el contenido glucógeno hepático.

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4. Señalar los fundamentos de la extracción y determinación del glucógeno hepático.

Procedimiento:

1. PREPARACION DE LOS ANIMALES EXPERIMENTALES.

1.1. Rata 1 bien alimentada (“ad libitum”).

Esta rata recibirá su alimentación habitual sin restricción alguna hasta el momento de la práctica, en que será sacrificada para realizar la extracción y determinación del glucógeno hepático.

1.2. Rata 2 en ayuno de 24 horas

Esta rata pertenecerá en estado de ayunas estricto (recibirá sólo agua), no menos de 24 horas antes de la práctica, en que será sacrificada para realizar la extracción y determinación del glucógeno hepático.

2. EXTRACCION Y DETERMINACION DEL GLUCOGENO HEPATICO.

El método empleado en el de Krisman, que asocia el procedimiento clásico de la extracción del glucógeno por tratamiento de tejido con una base fuerte (KOH) en caliente y su precipitación con etanol, con la especificidad de la reacción del glucógeno con el yodo y el aumento de la sensibilidad de esta reacción en presencia de CaCI2.

Para cada animal experimental proceder de la siguiente forma:

2.1. En un tubo de centrifuga medir 1.8 ml de KOH al 33% y colocarlo en un baño maría hirviente, brevemente por algunos segundos, antes de introducir el trozo del hígado.

2.2. Sacrificar los animales por decapitación y tan rápido como sea posible extraer el hígado y pesar 200 mg perénquina hepático. Colocar inmediatamente el trozo de hígado que se ha pesado en la solución de KOH que se encuentra en el baño hirviente y dejarlo allí por 20 minutos, mezclando de vez en cuando con una varilla de vidrio para permitir la total desintegración de tejido y teniendo mucho cuidado de que no se proyecte su contenido.

2.3. Retirar el tubo del baño y enfriar. Añadir 2.6 ml de etanol al 96%, mezclar y volver a calentar la solución hasta la ebullición teniendo siempre mucho cuidado de que no se proyecte su contenido. Reiterar y enfriar inmediatamente en baño de hielo por 5 minutos, para permitir la precipitación del glucógeno.

2.4. Centrifugar a 3500 rpm por 10 minutos. Decantar el sobrenadante suavemente y dejar el tubo invertido sobre un papel de filtro, tratando de eliminar el sobrenadante lo más posible.

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2.5. Neutralizar el exceso de base añadiendo 0.4 ml de NH4CI saturado, mezclado cuidadosamente con varilla de vidrio.

2.6. Colocar luego el tubo en baño maría hirviente durante 5 minutos. Retirar el tubo y enfriarlo completamente.

2.7. Añadir 0.4 ml de agua destilada y proceder luego a la reacción colorimétrica según el siguiente cuadro:

NOTA. Hacer diluciones si fuera necesario (en los tubos que es observe abundante precipitado) luego de neutralizar el exceso de base con NH4C1, y emplear para la reacción de color 0.8 ml de la solución diluida. Anotar el factor de dilución.

2.8. Dejar en reposo los tubos por 5 minutos. Leer la absorbancia en el fotocolorímetro con filtro verde.

Resultados:

1. Anotar el aspecto, consistencia y peso de cada hígado:

Rata 1:________________________________________________________________________

Rata 2:_______________________________________________________________________

2. Observar la cantidad de precipitado después de centrifugar:

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REACTIVOS Rat.1 Rat.2 B St.1 St.2 St.3Solución obtenida (ml) 0.8 0.8 - - - -Agua destilada - - 0.8 - - -Sol. St. de glucógeno 15 mg% - - - 0.8 - -Sol. St. de glucógeno 45 mg% - - - - 0.8 -Sol. St. de glucógeno 60 mg% - - - - - 0.8Reactivos de yodo 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2


Rata 1:_________________________________________________________________________

Rata 2:_________________________________________________________________________

3. Calcular el factor de calibración considerando las siguientes lecturas para los tubos BLANCO Y ESTANDAR:

Ab. Bruta Ab. neta [glucógeno] mg/tubo FcBLANCO 0.11 -- -- --ESTANDAR 1 0.29 0.12ESTANDAR 2 0.66 0.36ESTANDAR 3 0.85 0.48

FACTOR DE CALIBRACION (Fc) PROMEDIO

Utilizando papel milimetrado, hacer la gráfica de la curva de calibración con los datos calculados anteriormente. Incluya dicha gráfica en el presente informe.

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4. Calcular la concentración de glucógeno en el hígado de cada uno de los animales de experimentación, de acuerdo a la siguiente tabla:

Ab. bruta Ab. neta[glucógeno] en mg……………

/200 mg /100 mg / 100 gRata 1Rata 2

5. Haga la interpretación de los resultados para cada animal experimental:

Rata 1: ________________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________________

Rata 2: ________________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________________

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APELLIDOS…………………………………………………….NOMBRES……………………………….......

FECHA………………/………………………./………………………..


PRACTICA N° 10

INTEGRACION Y REGULACION DEL METABOLISMO

Diabetes Mellitus Experimental – Efectos Metabólicos de la Insulina

INTRUDUCCION.

Por lo general, las diferentes vías del metabolismo intermediario son estudiadas independientemente una de otras; sin embargo, estos diferentes procesos ocurren en nuestro organismo en forma altamente organizada, donde las diferentes vías metabólicas están enlazadas formando una verdadera red metabólica, controlada rigurosamente por diferentes mecanismos regulatorios.

Esta integración y regulación del metabolismo, permite a cada una de las células a realizar sus funciones bioquímicas, y sin duda, de ésta íntima y armoniosa organización dependerá la función integrada de todas la células que conforman un organismo, caso contrario sobrevendrá una enfermedad.

En este sentido, las hormonas cumplen un rol destacado en la integración y regulación del metabolismo. Así, el sistema endocrino es el componente fundamental de la adaptación del organismo humano a los cambios del medio ambiente externo o interno. Este sistema actúa para mantener el medio interno estable frente a cambios en el flujo de entrada a salida de nutrientes, agua, calor, etc. Células endocrinas específicas, generalmente agrupadas en glándulas, perciben el cambio y responden secretando a la circulación sanguínea las hormonas. Estas moléculas especializadas son entonces transportadas por la sangre a diversos tejidos, donde entran en contacto con las células blanco (o diana) a través de receptores específicos, y sobre la cuales ejercen sus efectos regulatorios fundamentalmente por:

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- La activación o desactivación de enzimas que ya existen dentro de la célula diana, respuesta que es mediada por un segundo mensajero generado a nivel de la membrana plasmática de dichas células, cuando la hormona se une específicamente a su receptor de membrana. Ejemplos de tales segundos mensajeros son: AMP cíclico (cAMP), GMP cíclico (cGMP), inositol trifosfato (IP3), diacilglicerol (DAG), Calcio – Calmodulina, kinasas receptoras, etc. Ninguno de los segundos mensajeros generados por la membrana es exclusivo para una determinada hormona, y una sola hormona puede actuar a través de múltiples mensajeros.

- La inducción o represión de la síntesis de enzimas. La expresión genética puede es este caso ser modulada por segundos mensajeros generados a nivel de la membrana plasmática a más generalmente por complejos hormona – receptor intracelulares. Una vez que estos se han unido al DNA, se induce o reprime la transcripción de genes específicos. Así, elevando o reduciendo los niveles de moléculas de RNA mensajero (mRNA) especificas, la hormona aumento o disminuye la concentración de determinadas proteínas celulares, como las enzimas, modulando de esta forma el metabolismo celular mantener la homeostasis.

Una de las hormonas que influencia notoriamente el metabolismo de los carbohidratos, grasas y proteínas en casi todas nuestras células, es la insulina. Esta proteína hormonal es secretada por las células β del páncreas en respuesta a la hiperglicemia, para promover los procesos anabólicos e inhibir por procesos catabólicos. Específicamente, la insulina incrementa la síntesis de glucógeno (glucogénesis), de lípidos (lipogénesis) y proteínas (proteogénesis), y también activa la glicólisis. Una acción importante de la insulina es que ella promueve la captación de glucosa y aminoácidos por diferentes tejido, especialmente músculo y tejido adiposo. Por lo tanto, el nivel de glucosa en la sangre es disminuido por la insulina (llamado el efecto hipoglicémico). La insulina inhibe la síntesis de glucosa de “novo” (gluconeogénesis) a partir de proteínas, y la síntesis de cuerpos cetónicos (categonesis). Muchos de los efectos de la insulina son contrarios a aquellos promovidos por epinefrina y glucagón. En esencia epinefrina y glucagón señala que la glucosa es escasa, mientras que la insulina indica que la glucosa es abundante.

En la presente práctica estudiaremos algunas de la acciones de la insulina, usando como modelo experimental el estado diabético provocado por aloxono.

La diabetes mellitus es una enfermedad producida por una carencia absoluta o relativa de insulina en el organismo y que afecta aproximadamente al 5% del a población general, con una prevalencia variada entre los diferentes grupos étnicos y regiones geográficas. La mayoría de casos reportados de esta enfermedad son de las denominadas Tipo I o “insulino dependiente”, y Tipo II o “no insulino dependiente”. Aunque ambos tipos comparten un fenotipo común, hiperglicemia postprandial y en ayunas, difieren en su etiología y alteraciones metabólicos.

- La diabetes mellitus Tipo I, resulta más comúnmente de la destrucción autoinmune de la células β del páncreas. Estos pacientes tienen frecuentemente como complicación metabólica grave la denominada cetosis (hiperproducción de cuerpos cetónicos), y sólo se alivia con la administración de insulina.

- En cambio, la diabetes mellitus Tipo II, se caracteriza por una deficiente acción de la insulina, como resultado de una combinación de resistencia a la insulina (la denominada resistencia

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periférica a la insulina) y la disfunción de la célula β . En este tipo los pacientes raramente hacen cetosis, y generalmente su mejoría depende del uso de antidiabéticos orales (que estimula la secreción de insulina por la células β del páncreas) y dieta.

En el presente hay diversas sustancias que pueden ser utilizadas para la producción de una diabetes mellitus experimental. Una de las sustancias más utilizadas es el aloxano (2,4,5,6 tetraoxipirimidina), la cual causa un daño permanente de la células β de los islotes de Langerhans del páncreas, produciendo así un cuadro de diabetes mellitus experimental, muy semejante al que sufre los seres humanos. Lo malo es que esta sustancia es también tóxica para otras células.

Otra sustancia utilizada a producir diabetes mellitus experimental en forma más selectiva es la estreptozotocina, un antibiótico de amplio espectro obtenido de Streptomyces achromogenes.

EXPERIMENTO 10.1 Diabetes Mellitus Experimental.

OBJETIVOS:

1. Ilustrar y discutir los mecanismos de acción hormonal, destacado su rol en el control del metabolismo.

2. Estableces y discutir las bases bioquímicas y fisiológicas de enfermedades endocrinas que ocurren comúnmente en el ser humano.

3. Demostrar mediante métodos sencillos y prácticos, algunas de las alteraciones metabólicas y fisiológicas ocasionadas por la falta de insulina.

4. Conocer el fundamento de los métodos utilizados para la determinación de la glicemia y la identificación de glucosa y cuerpos cetónicos en la orina.

PROCEDIMIENTOS

1. Preparación de los animales:

1.1. Producción de Diabetes Mellitus Experimental:

- A un grupo de ratas previamente pesadas y marcadas se les somete a un periodo de ayunas de 48 horas, después del cual (previa toma de muestras de sangre y orina basales), se les inyecta por vía subcutánea una solución de aloxano que contiene 50 mg/ml de la sustancia, a una dosis de 200 mg/kg de peso.

- A otro grupo de animales que servirá de control, se les inyecta por la misma vía, un volumen similar de solución salina fisiológica (NaCI 0.9 %).

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- Después de 48 horas se procederá a extraer muestras de sangre para realizar las determinaciones de glucosa (glicemia) por el método de Nelson – Smogy, y de orina para la determinación de glucosa (glucosuria) por el método de la glucocinta y de cuerpos cetónicos (cetonuria) por el método del nitroprusiato de sodio.

1.2. Inyección intraperitoneal de insulina

- Administrar insulina a las ratas diabéticas, por vía intraperitoneal a la dosis de 1 unidad/Kg de peso, usando una solución de inulina que contiene 1 unidad/ml.

- A las ratas control se les administrará por la misma vía un volumen similar de solución salina fisiológica.

- A la hora extraer muestras de sangre y orina y proceder a la determinación de glucemia, glucosuria y cetonuria.

2. Determinación de la glicemia (métodos de Nelson y Smogy)

- Desproteinizado. En tubos de ensayo medir:

- 3 ml de NaCI 0.9 %.- 0.2 ml de sangre.- 0.4 ml de sulfato de Zinc al 5%- 0.4 ml de hidróxido de Bario 0.3 %

Mezclar y dejar en reposo por 5 minutos, luego filtrar o centrifugar y recuperar el filtrado libre de proteínas.

- Para la reacción colorimétrica. En un tubo de Folín medir lo siguiente:

- 1 ml del filtrado libre de proteínas.- 1 ml del reactivo cúprico-alcalino (solución A+B).- Mezclar y calentar en baño maría hirviente por 15 minutos.- Enfriar en agua corriente, luego añadir 1 ml del reactivo arsenomolibdato.- Mezclar suavemente y completar con agua destilada hasta la marca de 25 ml, mezclar por

inversión, dejar en reposo por 5 minutos y leer en el fotocolorímetro con filtro verde.- Preparar un BLANCO usando 1 ml de agua destilada en lugar de filtrado y proceder como la

muetra.- Preparar los ESTANDAR de glucosa a partir de los soluciones estándar, una de 50 ug/ml y

otra de 100 ug/ml de glucosa, Para ello medir en dos tubos del Folín 1 ml de cada una de estas soluciones estándar y proceder luego como la muestra.

- Calcular la concentración de glucosas en las muestras problema en mg%

3. Determinación de glucosa en la orina:

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Para la determinación de glucosa en la orina se usará tiras de papel llamado comercialmente “glucocinta”. El método se basa en la actividad de los enzimas presentes en dicho papel, la glucosa oxidasa y la peroxidasa, y además presenta una sustancia cromógena que por su variación de color nos indica la presencia de glucosa. Las reacciones se pueden escribir de la siguiente manera:

a) β – D – Glucosa + 02 → δ−¿Gluconolactona + H2O2

b) H2O2 + Cromógeno Reducido → H2O + Cromógeno Oxidado (amarillo) (verde)

La positividad a esta prueba se evidencia a través de la presencia de color verde. El método es semicuantitativo y puede dar una idea aproximada de la cantidad de glucosa en orina. Para hacer esta prueba se debe sumergir un pedazo de papel en la muestra de orina y observar el color.

4. Determinación cualitativo de cuerpos cetónicos en la orina:

Esta prueba para cuerpos cetónicos se basa, en que la acetona y el ácido acetoacético al reaccionar con el nitroprusiato de sodio en medio alcalino forman un complejo de color violeta, indicando la positividad de la reacción.

Para esta prueba se coloca una gotas de orina sobre el reactivo, se mezcla bien y luego esperar unos minutos para observar la aparición del color.

RESULTADOS:

En las siguientes tablas se muestran los resultados típicos de esta experiencia para su discusión e interpretación:

1. Glicerina:

GLICEMIA (mg/dl)Ratas BASAL 48 post aloxano 1 h post insulinaTratadas 71.48 425.50 56.85Control 74.60 65.12 70.46

2. Glucosuria y cetonuria:

GLUCOSURIA Y CETONURIA (cualitativamente)Ratas BASAL 48 post aloxano 1 h post insulinaTratadas - + -Control - - -

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INTERPRETACIÓN:

1. Explique de efecto del aloxano:

2. Explique el efecto de la insulina:

CUESTIONARIO: (emplear hojas apartes si fuera necesario)

1. ¿Cuáles son los efectos de la insulina sobre el hígado, músculo, tejido adiposo y cerebro?

2. Mediante un esquema explique en forma conjunta el mecanismo de acción de la insulina, epinefrina y glucagón, sobre la homeostasis de la glicemia:

3. ¿Cuál es la diferencia entre la Diabetes Mellitus Insulino Dependiente y la Diabetes Mellitus No Dependiente de Insulina?

4. Si una rata pesa 250 g ¿Cuáles será el volumen de solución de aloxano que se le inyectará de acuerdo a la dosis indicada?

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5. ¿A cuál de los tipos de diabetes estudiados, se asemeja la diabetes causadas por el aloxano?

6. ¿Cómo se explica la hiperglicemia, glucosuria y cetonuria que presentan los animales tratados con aloxano?

ASIGNATURA DE BIOQUIMICA – ODONTOLOGIA

PRACTICA N° 11

EXTRACCION DE DNA E INDENTIFICACION DE SUS COMPONENTES

INTRODUCCION.

Los ácidos desoxiribonucleótidos (DNA) son compuestos complejos de elevado peso molecular, formados por estructuras más sencillas denominadas nucleótidos.

Estas unidades fundamentales del DNA están constituidas por:

a) Una base nitrogenada: PURINAS (ADENINA Y GUANINA) PIRIMIDINAS (CITOSINA Y TIMINA)

b) Un monosacárido de 5 átomos de carbono (DESOXIRIBOSA)

c) Ácido fosfórico.

De la combinación de estas sustancias resulta pues, un NUCLEOTIDO representado muy esquemáticamente así:

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Purine orPyrimidimebase


Dentro del nucleótido la combinación de la pentosa (Desoxiribosa en el DNA y Ribosa en el RNA) con una base nitrogenada, constituye el NUCLEOSIDO.

Los nucleótidos fundamentos de los DNAs son:

1. Los que poseen como base nitrogenada una PURINA.

a) Desoxiadenosina – Monofosfato (d AMP) o Desoxiadenilato.b) Desoxiadenosina – Monofosfato (d GMP) o Desoxiadenilato.

2. Los que poseen como base nitrogenada una PIRIMIDINA.

a) Desoxiadenosina – Monofosfato (d CMP) o Desoxiadenilato.b) Desoxiadenosina – Monofosfato (d TMP) o Desoxiadenilato.

En el DNA:

1. Estos 4 nucleótidos se organizan en cadenas polinucleotídicas.

2. Dos cadenas polinucleotídicas antiparalelas, muy largas y delgadas enrolladas en espiral a lo largo de un eje común, forman una DOBLE HELICE, según el modelo de Watson y Crick.

3. Las dos cadenas son complementarias de tal modo que enfrente de una base púrica se encuentra una base pirimidinica.

4. El estudiante debe tener presente que la secuencia variable de los cuatro nucleótidos a lo largo de las cadenas polinucleotídicas del DNA, constituye el fundamento de la identidad genética de cada organismo, la cual puede conservarse y transmitirse a su descendencia.

5. Para cumplir estas funciones el DNA tiene la capacidad de replicarse y de dirigir la síntesis de proteínas, de acuerdo al dogma central de la Biología Molecular.

Replicación

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D-Ribose

Transcripción TraducciónDNA PROTEINASmRNA


Todos los tejidos animales cuya células tengan núcleo, con una fuente potencial de DNA. Sin embargo en la práctica, la obtención de DNA de diversos tejidos es dificultosa por las siguientes razones.

1. El tejido posee gran actividad de Desoxiribonucleasa (DNasa) difícil de inhibir y lo suficientemente fuerte como para destruir al DNA durante las etapas extractivas (ejemplo el páncreas).

2. La alta proporción de otros constituyentes celulares (RNA, proteínas, polisacáidos, lípidos), en relación al DNA que pueden interferir con una extracción y purificación (ejemplo: huevos de aves, de peses, etc.).

3. Si hay una fuerte unión entre el DNA y las proteínas, la extracción de hace difícil (ejemplo: espermatozoides de mamíferos).

Sin duda la mejor fuente para obtener DNA es el timo. Las células del timo tienen una alta relación núcleo/citosol y tiene una baja actividad DNásica. Otras fuentes posibles son el bazo, eritrocitos de aves (pollo, pato, etc.) o peces (salmón, carpa, etc.).

En la presente práctica se extraerá, se purificará y se identificará los componentes estructurales del DNA del timo.

EXPERIMENTO 10.1. Extracción y Purificación del DNA.

Objetivos:

1. Propiciar que el alumno reconozca algunas de las propiedades fisicoquímicas del DNA.

2. Familiarizar al alumno con uno de los métodos más utilizados para la extracción y purificación del DNA de tejidos animales.

Procedimientos:

Observe cuidadosamente cada una de las etapas del procedimiento a seguir:

1. Homogenizar en una licuadora 2.0 g de timo de ternera en 25 ml de solución salina 0.15 M conteniendo EDTA 0.1 M, a pH 8.0

2. Transferir el homogeneizado anterior a una probeta de 100 ml con tapa esmerilada y añadir 2 ml del detergente aniónico Lauril Sulfato al 25 % Mezclar.

3. Colocar en baño maría a 60°C, durante 10 minutos.

4. Añadir 6.3 ml de NaCI 5 M. Mezclar.

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5. Añadir la solución de clorofono – alcohol isoamílico (24:1 v/v) en un volumen igual al obtenido en la etapa 4.

6. Centrifugar a 10000 rpm durante 10 minutos y luego separar el sobrenadante con todo cuidado para evitar la desnaturalización.

7. Al sobrenadante de la etapa 6 añadir los volúmenes de alcohol etílico al 95% para precipitar los ácidos nucleicos. Mezclar con varilla de vidrio, tratando de enrollar los ácidos nucleicos.

8. Colocar la varilla de vidrio con los ácidos nucleicos enrollados en un tubo de prueba y disolvente en 20 ml de solución salina – citrato (0.015 M – 0.0015 M respectivamente). Dejar en reposo por 30 minutos.

9. Añadir 2 ml de solución de acetato 3.0 M conteniendo EDTA 0.001 M a pH 7.0

10. Mezclar con varilla de vidrio, añadiendo simultáneamente gota a gota 0.54 volúmenes de isopropanol, para precipitar selectivamente al DNA. Seguir mezclando con la varilla de vidrio enrollando el DNA.

11. Disolver el DNA obteniendo el 20 ml de solución salina-citrato (0.015 M – 0.0015 M).

Resultados:

1. En el espacio siguiente anote todas sus observaciones:

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EXPERIMENTO 10.2 Identificación de Desoxiribosa (Reacción de Dische)

Objetivos:

1. Propiciar que el alumno identifique algunos de los componentes costitutivos del DNA,

comprendiendo los fundamentos de las técnicas utilizadas.

Procedimiento:

A. Proceder primero a la Hidrólisis Acida del DNA.


X CSolución de DNA obtenida del timo 0.5 ml ---Solución salina – citrato (0.015 M-0.0015M) ---- 0.5 mlAcido Perclórico 7.5 N 0.5 ml 0.5 ml

2. Después de colocar en cada tubo en embudo pequeño con su perla de vidrio, dejar los tubos en baño maría hirviente por 30 minutos. Enfriar luego en agua corriente.

B. Proceder a identificar el fosfato inorgánico.

1. Preparar dos tubos de prueba de acuerdo al siguiente cuadro:

X CContenido del tubo X anterior 0.5 ml ---Contenido del tubo C anterior --- 0.5 mlAgua destilada 3.5 ml 3.5 mlReactivo de Molibdato de Amonio 2.5 % 0.5 ml 0.5 mlReactivo “Reductor” 0.5 ml 0.5 ml

2. Mezclar el contenido de cada tubo. Dejar en reposos 5 minutos. Observar el color producido en cada tubo.

Resultados:

En el espacio siguiente anote todas sus observaciones:

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EXPERIMENTO 10.4. Desnaturalización del DNA y Efecto Hipercrónico.

Objetivos:

1. Estudiar los efectos del incremento de la temperatura sobre la conformación “nativa” del DNA.2. Observar las alteraciones que se producen en la Absorbancia (D.O.) del DNA en la región UV,

cuando éste se desnaturaliza.

Procedimientos:

1. Colocar en un tubo de prueba 5 ml de la solución de DNA obtenida del timo y calentarla a ebullición en baño maría hirviente por 15 minutos.

2. Enfriar y medir la absorbancia de la solución en el espectrofotómetro a longitudes de onda que van desde 240 a 300 nm.

3. Medir de la misma forma, la absorbancia de una solución de DNA que no ha sido calentada (DNA nativo).

Un experimento de este tipo dio los siguientes resultados:

Longitud de onda D.O. (DNA nativo) D.O. (DNA desnatur.)300290280270265262261260

0.0050.0130.2650.3580.4200.4500.4520.454

0.0350.1380.3400.5330.5880.6120.6180.620

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259258254250240

0.4520.4500.4400.4100.290

0.6120.6100.5900.5300.330

Resultados:

1. Construya una gráfica con los resultados anteriores, en papel milimetrado, colocando en el eje de las ordenadas la Absorvancia y en el eje de abscisas la longitud de onda. En el espacio siguiente haga un comentario de los resultados obtenidos:


PRACTICA N° 12

PROTEINAS EN SANGRE, ORINA Y SALIVA

INTRODUCCION.

La determinación de proteínas totales del suero sanguíneo es una determinación de laboratorio muy utilizada en la clínica. Esta cuantificación se suele realizar por diversos métodos, sin embargo, aquellos se utilizan ciertas reacciones de color que dan las proteínas, son los más difundidos. Uno de ellos es el que utiliza la reacción del Biuret. El nombre de la reacción deriva del hecho que por calentamiento de la urea hasta 180°C, con desprendimiento de amoniaco, se forma un compuesto denominado Biuret.

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Y el Biuret es presencia de iones cúpricos en solución alcalina produce un color violenta al formarse un complejo tetracoordinado.

Esta reacción también se produce en presencia de estructuras peptídicas que tengan como mínimo dos enlaces peptídicos adyacentes. Esto permite la aplicación de la reacción del Biuret a la determinación cuantitativa de las proteínas del suero sanguíneo y otros líquidos biológicos. Así, los valores normales de proteínas totales del suero por este método son de 6 a 8 g/dl. Por debajo de 6 g/dl se habla de hipoproteinemia y por encima de 8 g/dl de hiperproteinemia.

En muchos casos no resulta suficiente realizar la determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo, sino que es también necesario establecer la concentración de las diferentes fracciones proteicas. En este sentido, se usa un procedimiento denominado “electroforesis” de las proteínas del suero” el que nos permite aislar y cuantificar las diferentes facciones.

El procedimiento de la electroforesis está basado en el desplazamiento de moléculas eléctricamente cargadas, en un campo eléctrico. Como quiera que las proteínas pueden tener una determinada carga eléctrica según el pH del medio, pueden entonces ser susceptibles de ser separados por electroforesis. La velocidad de migración de está macromoléculas dependerá fundamentalmente, de la intensidad de su carga eléctrica, su tamaño y forma, y la naturaleza del soporte sobre el cual migran.

La electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo, como comúnmente se realiza, determina la separación de cinco fracciones proteicas, que ordenadas en función de su velocidad de migración, son las siguientes albúmina, α 1−globulina, α 2−globulina, β−glubolina y γ – globulina:

La albúmina en el más homogénea, con un peso molecular de 69000, un pI de 4.9 y en la de mayor velocidad de migración. Tiene como funciones importantes, el participar en el bilirrubina, ácidos grasos, etc. Esta proteína también enlaza una serie de drogas que son poco solubles en un medio ambiente acuoso, como los barbitúricos, digitálicos, aspirina, etc. Normalmente el 50% del calcio plasmático está unido a la albúmina y esto debe tenerse muy en cuenta para explicar las manifestaciones de hipocalcemia asociadas a situaciones en las cuales disminuye la concentración de

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albúmina y esto debe tenerse muy en cuenta para explicar las manifestaciones de hipocalcemia asociadas a situaciones en las cuales disminuye la concentración de albúmina plasmática. Esto también trae consigo la disminución de la presión coloidosmótica de la plasma sanguínea a la producción de “edema”, un signo muy frecuentemente observado en pacientes desnutridos.

Las α−globulinas incluyen dos fracciones electroforéticas, la α 1 (con un pI = 5.1) y la α 2 (con un pI de 5.5 a 5.8). Las principales α 1 – globulinas, son la Proteína C – Reactiva y las Lipoproteínas de Alta Densidad (HDL de High Density Lipoproteins); en tanto que, las principal α 2 – globulinas son la haptoglobina, ceruloplasmina y protrombina.

Las β−globulinas (pI de 5,4 a 6.3), incluye a la proteína transportada de hierro (la transferrina) y a las lipoproteínas de baja densidad (LDL de Low Density Lipoprotein).

Las γ−globulinas (pI entre 6.3 a 7.3), contienen las diferentes inmunoglobulinas IgG, IgA, IgM, IgD, y la IgE.

La técnica más comúnmente usada para la separación de las proteínas del suero por electroforesis, consiste en depositar unos microlitros de suero en una tira de papel de filtro humedecida con buffer barbital de pH 8.6. Luego los extremos de la tira son introducidos en casa uno de las dos bandejas de la cámara electroforética que contiene el mismo buffer y que contienen los electrodos. En vista de que el pI de todas las fracciones es menor que el pH de buffer, se cargarán negativamente (negatively charged proteins) y por lo tanto migrará al polo positivo. Como quiera que la intensidad de carga de las diferentes fracciones, es distinta, al igual que su tamaño, migrarán a diferente velocidad. Esto quiere decir que una vez desconectado el aparato de la fuente eléctrica, quedará separadas las fracciones y será posible su identificación si las teñimos con un colorante específico para proteínas como el Amido-Black. La cuantificación de cada fracción se hará en función de la intensidad de color que tiene cada banda y que pueda hacerse por diversos métodos, como con el uso de un aparato llamado densitómetro que nos grafica un pico para cada fracción y cuya área es proporcional a la intensidad del color.

La tabla siguiente muestra los valores que podemos consideran como normales tanto en valores absolutos (g%), como en valores relativos (porcentaje).

Albúmina α 1−globulina α 2−globulina β−globulina γ−globulinaPorcentaje 50- 58 4 -7 7 – 11 11 - 15 14 – 22g/100 ml 3.24 a 4.42 0.36 a 0.48 0.54 a 0.72 0.78 a 1.04 0.8 a 1.6

En la tabla 2 se muestra las variaciones en la concentración de la diferentes fracciones electroforéticas de las proteínas del suero sanguíneo en algunas enfermedades en donde este método es de gran ayuda en su diagnóstico.

ENFERMEDAD P.T. Albúm. α 1−glob. α 2−glob. β−glob . γ−glob .Infecciones agudas N N A (+)Endocarditis bacteriana N N A (+ +)

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Plasmocitoma Beta N N A (+ +)Artritis reumatoidea N D (+) A (+) A (++)Hipogamaglobulinemia N o D N D (++)Mieloma múltiple A N A (+++)Síndrome nefrótico D (+) D (+ + ) A (+)Desnutrición D (+) D (+)Cirrosis hepática D (+) D (+) (A +)

Diversos autores señalan que la electroforesis de las proteínas séricas (“serum protein electrophoresis”), junto con la determinación de las proteínas séricas totales debe ser considerada como un procedimiento rutinario para cualquier paciente, como ayuda en el diagnóstico y en el control de la enfermedad que tiene.

A pesar de existir una alta concentración de proteínas en el suero, normalmente no se detectan proteínas en la orina, explicable por la incapacidad de las macromoléculas de la proteínas de atravesar los poros de la membrana basal del glomérulo renal. Por esta razón, el encontrar proteínas en cantidades demostrables en la orina es una situación de mucho cuidado desde el punto de vista médico.

Las proteínas pueden ser identificadas en la orina de manera muy sencilla, al calentar una muestra de orina y apreciar la turbidez, lo cual es indicativo de la desnaturalización de la proteínas por el calor. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que los fosfatos también pueden enturbiar la orina; la distinción puede hacerse considerando que los fosfatos se solubilizan en medio ácido.La saliva está compuesta de agua (94.0 a 99.5 %) y sólidos ( 6% en saliva no estimulada 0.5 % en saliva estimulada. Entre los constituyentes orgánicos se encuentran: urea, ácido úrico, glucosa libre, aminoácidos libres, lactato, ácido grasos; así como diversas proteínas: amilasa, peroxidasa, Iysozima, inmunoglobulinas, etc. Entre los principales constituyentes inorgánicos están en Na, CI, K, Ca, Mg, F, HCO3 y NH4. Las proteínas de la saliva también pueden ser demostradas mediante la reacción del Biuret.

EXPERIMENTO 12.1. Determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo.

Objetivos:

1. Mediante el uso de la reacción del Biuret y la aplicación del método fotocolorimétrico, realizar la determinación cuantitativa de las proteínas del suero sanguíneo.

Procedimientos:

1. Preparar 3 tubos de prueba en la siguiente forma y mezclar bien:

X (Problema) B (Blanco)Suero o plasma diluído 1/20 (0.1 ml de suero o plasma con 1.9 ml de agua detiladaAgua destilada ---- 1 ml

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Reactivo de Biuret 4 ml 4 ml

2. Dejar en reposo 30 minutos y medir luego la absorbancia en el fotocolorimétrico utilizando filtro verde.

3. Durante el desarrollo de este experimento se proporcionará la lectura de un estándar (St), que se suele preparar en la misma forma que la muestra, sólo que en lugar del suero sanguíneo se usa una solución de proteínas de concentración exactamente conocida 7.0 g%.

Resultados:

1. Llenar la siguiente tabla:

2. ¿Cuál es el Factor de Calibración?_________________________________________________

3. ¿Cuál es la concentración de proteínas en la muestra problema?

4. Escriba en el espacio en blanco si el valor obtenido es normal, bajo o alto:__________________

EXPERIMENTO 12.2. Identificación de proteínas en la orina.

Objetivos:

1. Aplicar un método sencillo que permita la identificación de la presencia de proteínas en la orina.

Procedimiento:

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Lectura Bruta Lectura NetaTubo XTubo BTubo St


1. Medir 5 ml de orina en un tubo de ensayo y calentar hasta la ebullición.Observar lo que sucede. Tener cuidado de no expulsar su contenido.

2. En caso de entubamiento, añada algunas gotas de solución de ácido acético al 2%. Apreciar si la turbidez persiste o desaparece.

3. Repita el mismo procedimiento con todas las muestras de orina que le serán proporcionadas.

Resultados:

1. Llene la siguiente tabla escribiendo + cuando hay turbidez y – cuando no la hay o cuando desaparecer la turbidez.

ORINA X ORINA Y ORINA ZCalentando la muestraAñadiendo ácido acéticoDIAGNOSTICO

2. Escriba en los casilleros DIAGNOSTICO, las palabras normal, proteinuria o fosfaturia, según corresponda.

EXPERIMENTO 12.2. Identificación de proteínas en la orina.

Objetivos:

1. Demostrar la presencia de proteínas en la saliva mediante la reacción de Biuret.

Procedimiento:

1. Recolectar saliva en una beaker pequeño.

2. Preparar dos tubos de prueba de la siguiente forma:

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Tubo con saliva Tubo con aguaAñadir saliva 4 ml ----Añadir agua destilada --- 4 mlReactivo de Biuret 4 ml 4 ml

3. Dejar en reposo 5 minutos y observar la diferencia.

Resultados:

1. ¿Cuál es el resultado observado? ___________________________________________________

2. ¿Qué le indica este resultado?______________________________________________________

CUESTIONARIO:

1. ¿Cuál es la concentración normal de proteínas del suero?

2. ¿Cuándo hay hipoproteinemia?

3. ¿Cuáles son la facciones proteicas que se encuentran por electroforesis de la proteínas del suero sanguíneo?

4. Dar ejemplos de proteínas características de cada fracción:

5. ¿Qué importancia tiene el hacer la electroforesis de las proteínas del suero?

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6. ¿Qué es proteína? ¿La proteinuria es normal? ¿Cuál es el significado clínico de la proteinuria?

7. ¿Cómo podría Ud. identificar proteínas en la orina?

8. ¿Qué proteínas se encuentran en la saliva? ¿Cómo podría Ud. demostrar la presencia de proteínas en la saliva?

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3ra parte zambrano

Documents

solucin porcentual

solucin pv

solucin molar

solucin resultante

solucin concentrada

solucin normal n

concentracin de soluciones

solucin salina fisiolgica