7/28/2019 4- Effects of a Porphyromonas gingivalis infection on inflammatory mediator response and pregnancy outcome in

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I N F E C T I O N AND I M M U N I T Y , O c t . 1 9 9 4 , p . 4 3 5 6 - 4 3 6 10 0 1 9 - 9 5 6 7 / 9 4 / $ 0 4 . 0 0 + 0C o p y r i g h t C ) 1 9 9 4 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

E f f e c t s o f a P o r p h y r o m o n a s g i n g i v a l i s I n f e c t i o n on I n f l a m m a t o r yM e d i a t o r R e s p o n s e a n d P r e g n a n c y Outcome i n H a m s t e r sJ . G . COLLINS,* H . W. WINDLEY I I I , R . R . ARNOLD, AND S . OFFENBACHER

D e n t a l R e s e a r c h C e n t e r , S c h o o l o f D e n t i s t r y , U n i v e r s i t y o f N o r t h C a r o l i n aa t C h a p e l H i l l , C h a p e l H i l l , N o r t h C a r o l i n a 2 7 5 9 9

R ec e i v e d 2 4 S e p t e m b e r 1 9 9 3 / R e t u r n e d f o r m o d i f i c a t i o n 7 D e c e m b e r 1 9 9 3 / A c c e p t e d 1 8 J u l y 1 9 9 4T h i s s t u d y e x a m i n e s t h e e f f e c t s o f v a r i o u s l o c a l i z e d , n o n d i s s e m i n a t i o n c h a l l e n g e s o f P o r p h y r o m o n a s g i n g i v a l i s

on i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r p r o d u c t i o n a n d pregnancy outcome i n t h e g o l d e n h a m s t e r . L i v e o r h e a t - k i l l e d ( H K )o r g a n i s m s were i n o c u l a t e d i n t o a p r e v i o u s l y i m p l a n t e d s u b c u t a n e o u s t i s s u e c h a m b e r on t h e 8 t h d a y o fg e s t a t i o n t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t s o n f e t a l w e i g h t , v i a b i l i t y , a n d r e s o r p t i o n . I n o ne gro u p o f a n i m a l s , HKo r g a n i s m s were i n o c u l a t e d p r i o r t o m a t i n g t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t s o f p r e vi o u s exposure on d a y - 8 g e s t a t i o n a lc h a l l e n g e s . Chamber c o n t e n t s were a s s a y e d a t 1 a n d 5 d a y s a f t e r c h a l l e n g e f o r p r o s t a g l a n d i n E 2 ( P G E 2 ) a n dt u m or n e c r o s i s f a c t o r a l p h a ( TN F - a ) . A l l P . g i n g i v a l i s c h a l l e n g e s c a u s e d a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n c h a m b e rPGE2 a n d TNF-a a t P < 0 . 0 1 i n t h e f o l l o w i n g o r d e r o f p o t e n c y : HK < L i v e < H K + L i v e . F o r e x a m p l e , f o l l o w i n gt h e HK+Live c h a l l e n g e , PGE2 l e v e l s i n c r e a s e d f r o m 4 . 7 p g / m l a t b a s e l i n e t o 3 6 2 p g / m l a t d a y 5 a n d TNF-ai n c r e a s e d f r o m 2 6 . 4 p g / m l t o 7 2 4 p g / m l a t d a y 5 . T h e same o r d e r o f p o t e n c y o f t h e v a r i o u s c h a l l e n g e s wasm a i n t a i n e d w i t h r e g a r d t o t h e t o x i c e f f e c t s o f P . g i n g i v a l i s on pregnancy o u t c o m e . F o r t h e HK+Live c h a l l e n g e ,f e t a l w e i g h t was d e c r e a s e d 2 4 % ; e m b r y o l e t h a l i t y i n c r e a s e d t o 2 6 . 5 % a n d t h e p e r c e n t f e t a l r e s o r p t i o n i n c r e a s e dt o 1 0 . 6 % c o m p a r e d w i t h c o n t r o l a n i m a l l e v e l s . T h e r e was a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t a s s o c i a t i o n b e t w e e ni n c r e a s i n g l e v e l s o f b o t h PGE2 a n d T N F - o t a n d f e t a l g r o w t h r e t a r d a t i o n a n d e m b r y o l e t h a l i t y a t P < 0 . 0 0 1 .T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t i n f e c t i o n s w i t h g r a m - n e g a t i v e p e r i o d o n t a l p a t h o g e n s can e l i c i t a d v e r s e pregnancyo u t c o m e s a n d t h a t t h e l e v e l s o f PGE2 a n d T N F - a t p r o d u c e d as a r e s u l t o f c h a l l e n g e are a s s o c i a t e d w i t h t h es e v e r i t y o f f e t a l e f f e c t .

P o r p h y r o m o n a s g i n g i v a l i s i s a g r a m - n e g a t i v e , b l a c k - p i g -m e n t e d , n o n f e r m e n t i v e a n a e r o b e o r i g i n a l l y i s o l a t e d f r o m t h eo r a l c a v i t y a n d d e s c r i b e d b y G i b b o n s a n d MacDonald ( 9 ) . P .g i n g i v a l i s h a s b e e n i m p l i c a t e d as an o r a l p a t h o g e n b e c a u s e o fi t s f r e q u e n t a s s o c i a t i o n w i t h d e s t r u c t i v e p e r i o d o n t a l d i s e a s e ( 5 ,2 0 ) . T h e f r eq u en c y o f P . g i n g i v a l i s i s o l a t i o n f r o m p e r i o d o n t a l l yh e a l t h y i n d i v i d u a l s i s s u f f i c i e n t l y rare t h a t P . g i n g i v a l i s i s n o tc o n s i d e r e d a m e m b er o f t h e n o r m a l o r a l f l o r a .P r e v i o u s i n v e s t i g a t i o n s h a v e d e s c r i b e d i n f e c t i o n m o d e l su s i n g p e r i o d o n t a l p a t h o g e n s i n r o d e n t s . G e n c o a n d c o l l e a g u e s( 7 , 8 ) d es c r i b ed t h e v i r u l e n c e p r o p e r t i e s o f P . g i n g i v a l i s A 7 4 3 6i n t h e s u b c u t a n e o u s t i s s u e c h a m b e r m o d e l . The c h a m b e r n o to n l y serves as a s i t e f o r b a c t e r i a l i n o c u l a t i o n b u t a l s o p r o v i d e sa s e r u m - f i l l e d r e se r vo i r f o r r e p ea t e d s a m p l i n g a n d a n a l y s e s o fi n f l a m m a t o r y m e d i a t o r s . I n t h i s i n v e s t i g a t i o n , we h a v e u t i l i z e da h a m s t e r t i m e d - p r e g n a n c y m o d e l t o s i m u l t a n e o u s l y e x a m i n et h e e f f e c t s on b o t h pregnancy o u t c o m e a n d m e d i a t o r p r o d u c -t i o n i n response t o a P . g i n g i v a l i s i n f e c t i o n .G e n i t o u r i n a r y t r a c t i n f e c t i o n s , w h i c h are c a p a b l e o f e l i c i t i n gl o w b i r t h w e i g h t a n d s p o n t a n e o u s a b o r t i o n s i n h u m a n s , r a r e l yi n v o l v e d i r e c t b a c t e r i a l i n v as i o n o f t h e f e t a l - p l a c e n t a l u n i t ( 1 0 ) .R e c e n t r e v i e w s on t h e p a t h o g e n i c m e c h a n i s m s b y w h i c h gen-i t o u r i n a r y i n f e c t i o n s i n d u c e l o w b i r t h w e i g h t h a v e s u g g e s t e dt h a t t h e e f f e c t s o f i n f e c t i o n on t h e f e t u s are n o t m e d i a t e dd i r e c t l y b y t h e b a c t e r i a pe r se b u t r a t h e r are m e d i a t e d b y t h em a t e r n a l c y t o k i n e s . T h e s e c y t o k i n e s a n d l i p i d m e d i a t o r s arep r o d u c e d e i t h e r a t t h e i n f e c t i o u s s i t e o r a t t h e p l a c e n t a i nresponse t o t h e i n f e c t i o n . S e v e r a l m e d i a t o r s p r o d u c e d d u r i n gg r a m - n e g a t i v e i n f e c t i o n h a v e b e e n p r o p o s e d t o e l i c i t a d e l e t e -

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r . M a i l i n g a d d r e s s : UNC-CH D e n t a l Re -s e a r c h C e n t e r , C B # 7 4 5 5 , R o o m 2 2 7 , C h a p e l H i l l , NC 2 7 5 9 9 - 7 4 5 5 .P h o n e : ( 9 1 9 ) 9 6 2- 7 08 1 . F ax : ( 9 1 9 ) 9 6 6 - 7 5 3 7 .

r i o u s e f f e c t on t h e d e v e l o p i n g f e t u s , i n c l u d i n g t u m or n e c r o s i sf a c t o r a l p h a ( T N F - o t ; c a c h e c t i n ) a n d p r o s t a g l a n d i n E 2 ( P G E 2 ) .I n v ar i o u s p r e g n a n t a n i m a l s , e x o g e n o u s t r e a t m e n t w i t h t h e s em o l e c u l e s w i l l i n d u c e r u p t u r e o f m e m b r a n e s , c e r v i c a l d i l a t i o n ,u t e r i n e c o n t r a c t i o n , a n d a b o r t i o n ( 2 , 6 ) . H o w e v e r , b o t h T N F - o ta n d PGE2 i n c r e a s e i n t h e a m n i o t i c f l u i d d u r i n g n o r m a l preg-nancy a n d are b e l i e v e d t o m e d i a t e r o u t i n e p a r t u r i t i o n . I t h a sb e e n s u g g e s t e d t h a t d u r i n g i n f e c t i o n , a b n o r m a l l y h i g h l e v e l s o ft h e s e m e d i a t o r s c an l e a d t o p r e m a t u r e t e r m i n a t i o n o f preg-nancy w i t h c o n c o m i t a n t l o w b i r t h w e i g h t . S u p p o r t i n g t h i sc o n c e p t , H e y b o r n e ( 1 1 ) h a s r e c e n t l y s h o w n a r e l a t i o n s h i pb e t w e e n i n t r a - a m n i o t i c l e v e l s o f T N F - o t a n d i n t r a u t e r i n eg r o w t h r e t a r d a t i o n i n h u m a n s .I n t h i s i n v e s t i g a t i o n we h a v e e x a m i n e d t h e e f f e c t s o f P .g i n g i v a l i s i n f e c t i o n i n a s u b c u t a n e o u s c h a m b e r on T N F - o t a n dPGE2 p r o d u c t i o n i n t h e h a m s t e r . U s i n g p r e g n a n t h a m s t e r s , weh a v e d e m o ns t r a t e d t h a t a P . g i n g i v a l i s i n f e c t i o n w i t h i n t h ec h a m b e r i s c a p a b l e o f p r o d u c i n g f e t a l g r o w t h r e t a r d a t i o n a n dc an b e e m b r y o l e t h a l . P r e t r e a t m e n t w i t h h e a t - k i l l e d ( H K )o r g a n i s m s p r i o r t o m a t i n g e n h a n c e s m e d i a t o r p r o d u c t i o n a n de m b r y o t o x i c i t y o f P . g i n g i v a l i s i n f e c t i o n d u r i n g pregnancy.T h e r e i s g o o d a g r e e m e n t b e t w e e n m e d i a t o r c o n c e n t r a t i o n sw i t h i n t h e c h a m b e r a n d a b n o r m a l pregnancy o u t c o m es( A P O s ) .

MATERIALS AND METHODSI n t h e f i r s t s e r i e s o f e x p e r i m e n t s , n o n p r e g n a n t f e m a l e ham-

s t e r s were u s e d t o s t u d y t h e e f f e c t s o f P . g i n g i v a l i s c h a l l e n g e onPGE2 a n d T N F - o t response. A f t e r p l a c i n g s u b c u t a n e o u s cham-b e r s , f o u r groups o f si x a n i m a l s r e c e i v e d o ne o f t h e f o l l o w i n gt r e a t m e n t s : ( i ) c o n t r o l ( c u l t u r e b r o t h o n l y ) , ( i i ) H K P . g i n g i v a l i s( H K ) , ( i i i ) l i v e P . g i n g i v a l i s ( L i v e ) , or ( i v ) HK P . g i n g i v a l i si n i t i a l l y , f o l l o w e d b y l i v e P . g i n g i v a l i s 2 1 d a y s l a t e r ( H K - L i v e ) .

4 3 5 6

V o l . 6 2 , N o . 1 0

7/28/2019 4- Effects of a Porphyromonas gingivalis infection on inflammatory mediator response and pregnancy outcome in

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EFFECTS O F A P . GINGIVALIS INFECTION 4 3 5 7C h a m b e r f l u i d s were c o l l e c t e d a t b a s e l i n e a n d 1 a n d 5 d a y sp o s t c h a l l e n g e f o r t h e a n a l y s i s o f P G E 2 a n d T N F - a .I n t he s e c o n d s e r i e s o f e x p e r i m e n t s , t h e s e same f o u r t r e a t -ments were p e r f o r m e d on t i m e d - p r e g n a n c y a n i m a l s . T h e e f -f e c t s o f P . g i n g i v a l i s c h a l l e n g e s on m e d i a t o r l e v e l s i n p r e g n a n th a m s t e r s w e r e d e t e r m i n e d a n d c o m p a r e d w i t h t h o s e o f n o n -p r e g n a n t a n i m a l s . I n a d d i t i o n , t h e e f f e c t s o f b a c t e r i a l c h a l l e n g eon t h r e e p r e g n an c y o u t c o m es , f e t a l w e i g h t , e m b r y o l e t h a l i t y ,a n d p e r c e n t r e s o r p t i o n s , were a s s e s s e d .B a c t e r i a . P . g i n g i v a l i s A 7 4 3 6 was u s e d i n t h e s e s t u d i e s . S t r a i nA 7 4 3 6 was i n i t i a l l y i s o l a t e d f r o m a r e f r a c t o r y p e r i o d o n t i t i sp a t i e n t a n d c h a r a c t e r i z e d b y V . R . D o w e l l , A n a e r o b i c M i c r o -b i o l o g y L a b o r a t o r y , C e n t e r s f o r D i s e a s e C o n t r o l , A t l a n t a , G a .( 7 , 8 ) . P . g i n g i v a l i s was g r o w n on a n a e r o b i c b l o o d a g a r p l a t e s i na C o y a n a e r o b i c c h a m b e r . F o l l o w i n g i n c u b a t i o n a t 3 7 C f o r 1t o 2 d a y s , t h e b a c t e r i a l c e l l s were i n o c u l a t e d i n t o W i l k i n s -C h a l g r e n a n a e r o b i c b r o t h a n d g r o w n f o r a p p r o x i m a t e l y 1 8 hu n t i l t h e c u l t u r e r e a c h e d a n A 6 6 0 o f 0 . 1 6 , a s r e a d on t h e L KBs p e c t r o p h o t o m e t e r . T h i s a b s o r b a n c e c o r r e s p o n d e d t o a p p r o x -i m a t e l y 1 0 8 C F U / m l . A l l d a t a r e p o r t e d w e r e g e n e r a t e d f r o ma n i m a l s c h a l l e n g e d w i t h P . g i n g i v a l i s A 7 4 3 6 a t a d o s a g e o f 1 0 7C F U .

T h e h a m s t e r p r e g n a n c y m o d e l h a s r e c e n t l y b e e n d e s c r i b e di n d e t a i l ( 3 ) . B r i e f l y , h a m s t e r s were m a t e d a n d t h e p r e g n a n c ywas t e r m i n a t e d a t d a y 1 5 t o a l l o w i n s p e c t i o n o f t h e u t e r u s ,f e t u s e s , a n d r e s o r p t i o n s i t e s . P . g i n g i v a l i s ( l i v e o r H K ) wasp r e s e n t e d a s a c h a l l e n g e on d a y 8 . O t h e r a n i m a l s r e c e i v e dc u l t u r e b r o t h ( n o - b a c t e r i u m c o n t r o l ) on d a y 8 , a n d o n e g r o u pr e c e i v e d a HK c h a l l e n g e 2 1 d a y s p r i o r t o m a t i n g . G o l d e nS y r i a n h a m s t e r s ( M e s o c r i c e t u s a u r a t u s ) were m a i n t a i n e d i n t h eUNC D e n t a l R e se a r c h C e nt e r i n a n A m e r i c a n A s s o c i a t i o n f o rA c c r e d i t a t i o n o f L a b o r a t o r y A n i m a l C a r e - a p p r o v e d f a c i l i t y .H o u s i n g c o n s i s t e d o f p l a s t i c , s o l i d - b o t t o m c a g e s w i t h w o o ds h a v i n g s f o r b e d d i n g . T h e m a l e h a m s t e r s f o r b r e e d i n g w e r eh o u s e d i n d i v i d u a l l y , a n d t h e n o n p r e g n a n t f e m a l e s w e r e t h r e et o a c a g e . P e l l e t e d R o d e n t L a b o r a t o r y Chow 5 0 0 1 ( P u r i n a )a n d w a t e r were p r o v i d e d a d l i b i t u m .H a m s t e r s a r e p o l y e s t r o u s a n d c a n b e b r e d y e a r - r o u n d w i t ha r t i f i c i a l l i g h t i n g c o n d i t i o n s , w i t h a 1 4 : 1 0 ( l i g h t : d a r k ) l i g h t i n gc y c l e p r o v i d i n g o p t i m a l b r e e d i n g . T h e a n i m a l s i n t h e s e s t u d i e swere m a i n t a i n e d on t h i s l i g h t i n g c y c l e , a n d b o d y w e i g h t wasu t i l i z e d t o d e t e r m i n e s e x u a l l y m a t u r e f e m a l e s . T h e s e x u a l l ymature f e m a l e s u s u a l l y h a v e a 4 - d a y e s t r o u s c y c l e . D a y 1r e p r e s e n t s o v u l a t i o n , a n d on d a y 2 , w h i c h i s p o s t o v u l a t o r y , ac h a r a c t e r i s t i c v a g i n a l d i s c h a r g e was u s e d t o s t a g e t h e c y c l e . O nt h e e v e n i n g o f t h e t h i r d d a y f o l l o w i n g t h e d i s c h a r g e , t h e f e m a l ewas i n t r o d u c e d i n t o t h e m a l e ' s c a g e . T h e p a i r w a s l e f t u n d i s -t u r b e d o v e r n i g h t , a n d t h e f e m a l e was m o v e d t o a s e p a r a t e c a g et h e n e x t m o r n i n g . T h e d a y f o l l o w i n g e v e n i n g b r e e d i n g w a sc o n s i d e r e d d a y 1 o f t h e g e s t a t i o n p e r i o d , w h i c h i s t y p i c a l l y 1 5t o 1 8 d a y s . T h e f e m a l e s were s a c r i f i c e d on t h e a f t e r n o o n o f d a y1 5 o f p r e g n a n c y . E u t h a n a s i a w a s p e r f o r m e d b y C O 2 a s p h y x i a -t i o n . T h e u t e r u s was d i s s e c t e d , a n d f e t a l w e i g h t , v i a b i l i t y , a n dr e s o r p t i o n s w e r e d e t e r m i n e d . T h e s i t e s o f i m p l a n t a t i o n a n dr e s o r p t i o n w e r e c o u n t e d . T h e v i a b i l i t y o f e a c h f e t u s w a sa s s e s s e d v i s i b l y . E a c h f e t u s was r e m o v e d f r o m t h e c h o r i o a m -n i o t i c s a c a n d w e i g h e d t o t h e n e a r e s t m i c r o g r a m . T h e meanf e t a l w e i g h t was d e t e r m i n e d f o r e a c h p r e g n a n t d a m , p o o l i n g s i xd a m s t o c o m p u t e a g r o u p m e an s t a n d a r d e r r o r . E m b r y o l e t h a l -i t y was e x p r e s s e d a s a p e r c e n t a g e o f t o t a l i m p l a n t a t i o n s i t e s p e rl i t t e r w h i c h h a d n e i t h e r a r e s o r p t i o n s i t e n o r a n o n v i t a l f e t u s ,a g a i n p o o l i n g d a m s f o r e a c h t r e a t m e n t g r o u p .S T C . We e m p l o y e d t h e s u b c u t a n e o u s t i s s u e c h a m b e r ( S T C )m o d e l a s d e s c r i b e d b y G e n c o e t a l . ( 7 ) . T h i s m o d e l p r o v i d e sf a c i l e c h a m b e r a c c e s s f o r m e d i a t o r a n a l y s e s . A t t h e l e v e l s o f P .g i n g i v a l i s u s e d i n t h i s s t u d y , c h a m b e r i n o c u l a t i o n d o e s n o t

a f f e c t m a t e r n a l w e i g h t o r c a u s e v i s i b l e s i g n s o f s y s t e m i ci n f e c t i o n o r s e p s i s . T h e m o d e l c o n s i s t s o f a c y l i n d r i c a l c o i ls p r i n g ( a p p r o x i m a t e l y 5 b y 1 0 m m ) p r e p a r e d f r o m 0 . 5 - m m -d i a m e t e r s u r g i c a l s t a i n l e s s s t e e l w i r e . C o i l s a r e i m p l a n t e d i nt h e d o r s o l u m b a r r e g i o n o f e a c h f e m a l e h a m s t e r a n d a l l o w e d t oh e a l f o r 1 0 d a y s b e f o r e t h e c h a m b e r i s i n o c u l a t e d . A n e s t h e s i af o r t h i s p r o c e d u r e c o n s i s t e d o f s o d i u m p e n t o b a r b i t a l ( 6 0 t o 9 0m g / k g o f b o d y w e i g h t ) . A f t e r 1 0 d a y s , c h a m b e r s w e r e i n o c u -l a t e d w i t h 0 . 1 m l o f l i v e P . g i n g i v a l i s , HK P . g i n g i v a l i s , o rW i l k i n s - C h a l g r e n a n a e r o b i c b r o t h m e d i a a s a c o n t r o l . P .g i n g i v a l i s w a s h e a t k i l l e d a t 9 5 C f o r 1 0 m i n ( 7 ) . A t o t a l o f 4 8h am s t e r s w e r e c h a l l e n g e d : f o u r g r o u p s o f 6 n o n p r e g n a n th a m s t e r s a n d f o u r g r o u p s o f 6 t i m e d - p r e g n a n c y ( d a y 8 )a n i m a l s . One g r o u p f r o m t h e n o n p r e g n a n t a n d p r e g n a n ts u b s e t s e a c h r e c e i v e d a p r e t r e a t m e n t w i t h HK o r g a n i s m s 2 1d a y s p r i o r t o t h e p r i m a r y c h a l l e n g e . T h u s , t h e r e w e r e f o u rt r e a t m e n t g r o u p s f o r b o t h p r e g n a n t a n d n o n p r e g n a n t a n i m a l sc o n s i s t i n g o f ( i ) c o n t r o l m e d i a , ( i i ) HK P . g i n g i v a l i s , ( i i i ) l i v e P .g i n g i v a l i s , a n d ( i v ) H K - L i v e .M e a s u r e m e n t o f m e d i a t o r r e s p o n s e . T h e c h a m b e r c o n t e n t sw e r e s a m p l e d a t b a s e l i n e ( p r i o r t o i n o c u l a t i o n ) a n d o n d a y 1a n d d a y 5 p o s t i n j e c t i o n o f t h e c h a l l e n g e . C h a m b e r f l u i d w a sa s e p t i c a l l y r e m o v e d f r o m e a c h c h a m b e r w i t h a 2 5 - g a u g eh y p o d e r m i c n e e d l e . A t o t a l o f 1 0 0 p d o f c h a m b e r f l u i d a s p i r a t ew a s d i l u t e d 1 : 1 0 w i t h r a d i o i m m u n o a s s a y b u f f e r a n d s t o r e d a t- 7 0 C f o r i n f l a m m a t o r y m e d i a t o r a n a l y s i s . T h e l i p i d m e t a b o -l i t e PGE2 w a s q u a n t i t a t e d b y r a d i o i m m u n o as s a y p r o c e d u r e sd e s c r i b e d p r e v i o u s l y b y O f f e n b a c h e r ( 1 7 ) . T h e c h a m b e r c o n -t e n t s w e r e a n a l y z e d f o r t h e r e l e a s e o f c y t o k i n e TNF-a b y ac o m m e r c i a l i m m u n o a b s o r b e n t a s s a y s y s t e m ( E n d o g e n I n c . ,B o s t o n , M a s s . ) . S c h l e n k e r a n d c o l l e a g u e s h a v e d e mo n s t r at e dc r o s s - r e a c t i v i t y w i t h t h i s m u r i n e k i t a n d h a m s t e r T NF a n t i g e n sa s w e l l a s W e s t e r n b l o t ( i m m u n o b l o t ) r e a c t i v i t y w i t h t h em u r i n e a n t i - T N F a n t i b o d y ( 1 8 a , 1 9 ) . T h e m a n u f a c t u r e r ' s i n -s t r u c t i o n s w e r e f o l l o w e d t o a s s a y d u p l i c a t e 5 0 - , u a l i q u o t s o fd i l u t e d c h a m b e r a s p i r a t e i n 9 6 - w e l l p l a t e s . T h e p l a t e s w e r er e a d a t a w a v e l e n g t h o f 4 9 0 nm o n a M o l e c u l a r D e v i c e s k i n e t i cm i c r o p l a t e r e a d e r . T h e a m o u n t o f e a c h m e d i a t o r i n t h ec h a m b e r w a s d e t e r m i n e d b y u s i n g d u p l i c a t e s a m p l e s , i n t e r p o -l a t i n g f r o m s t a n d a r d c u r v e s w h i c h w e r e g e n e r a t e d b y p l o t t i n gl o g c o n c e n t r a t i o n v e r s u s c u m u l a t i v e n o r m a l p r o p o r t i o n b o u n d .M e d i a t o r l e v e l s a r e e x p r e s s e d a s mean c o n c e n t r a t i o n s s t a n d a r d e r r o r s b y p o o l i n g s i x a n i m a l s p e r g r o u p a t e a c h t i m ep o i n t .A n a l y s e s o f d a t a . T i m e - d e p e n d e n t c h a n g e s i n i n f l a m m a t o r ym e d i a t o r l e v e l s a n d g r o u p d i f f e r e n c e s w e r e t e s t e d f o r s t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e w i t h r e p e a t e d - m e a s u r e a n a l y s i s o f v a r i a n c e . W h eng r o u p - o r t i m e - d e p e n d e n t d i f f e r e n c e s w e r e p r e s e n t , p a i r w i s ec o m p a r i s o n s w e r e made b y u s i n g n o n p a i r e d o r t h e p a i r e d t t e s t .An a l p h a l e v e l o f l e s s t h a n 0 . 0 5 w a s c o n s i d e r e d s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t . S i m p l e r e g r e s s i o n c o r r e l a t i o n s w e r e p e r f o r m e d b yu s i n g n o n t r a n s f o r m e d d a t a t o e x a m i n e f o r a n a s s o c i a t i o nb e t w e e n m e d i a t o r l e v e l a n d AP O t e s t i n g f o r s l o p e 0 0 a t P