INTRODUCCIÓN.

Las casas comerciales suministradoras de animales de experimentación ofrecen ratones albinos para estudios en neurociencias. Habitualmente los neurocientíficos utilizan dichos animales asumiendo que sus funciones sensoriales son normales. Estudios preliminares nos han permitido observar que un elevado porcentaje de dichos animales sufren de anomalías en su función visual, que podría comprometer algunos de los resultados obtenidos en ciertos test conductuales. En el presente trabajo mostramos los resultados de un estudio de la capacidad visual realizado en ratones albinos de cepas (NMRI, CD1) habitualmente proporcionadas por distribuidores comerciales.

MATERIALES Y MÉTODOS.

ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN:

ELECTRORRETINOGRAFÍA:

INMUNOHISTOQUÍMICA:

En el presente trabajo hemos utilizado ratones albinos de dos cepas diferentes (NMRI y CD1) procedentes de las casas comerciales HARLAN Laboratories (Laboratorios HARLAN, www.harlan.com) y JANVIER (Laboratorios JANVIER, www.janvier-europe.com). El total de animales analizados ha sido de 40 ratones albinos distribuidos en cuatro grupos. Estos grupos son: CD1-Harlan (n=8); CD1-Janvier (n=15); NMRI-Harlan (n=9) y NMRI-Janvier (n=17).

Todos los animales antes referidos fueron sometidos al análisis de su capacidad visual mediante la prueba no invasiva del Electrorretinograma (ERG) de Campo lleno. Mediante el ERG analizamos los cambios de potencial eléctrico que acontecen en la retina en condiciones de oscuridad (escotópicas) y de luz (mesópicas y fotópicas). En los 40 animales se procedió al registro de las cinco respuestas electrorretinográficas recomendadas por la ISCEV (International Society for the Clinical Electrophysiology of Vision), además de la Respuesta Umbral Escotópica (STR). Para el análisis de las respuestas fotópicas añadimos a la fuente de estimulación de luz blanca, diodos emisores de luz (LED) a longitudes de onda correspondientes al Azul, Verde y Rojo. El estudio de sensibilidad cromática se vio reforzado por el uso de técnicas de inmunohistoquímica con anticuerpos específicos para cada una de las opsinas presentes en los distintos fotorrecepotores clásicos (conos y bastones).Los ratones fueron anestesiados con iluminación roja de poca intensidad, realizando una inyección i.p. de una solución de Ketamina (70 mg/kg) y Xilazina (7 mg/kg). Una vez dormidos se mantuvieron a la temperatura de 37ºC mediante una manta de agua caliente. Las pupilas fueron dilatadas aplicando un colirio que contenía 1% Tropicamida (Colicursí Tropicamida, Alcan Cursí, SA El Mosnou, Barcelona, Spain). Se aplicó topicamente gotas de 2%Methocel (Ciba Vision AG, 8442 Hetlingen, Switzerland) en cada ojo para proceder a la colocación del electrodo corneal. Los animales anestesiados fueron colocados en una caja de Faraday para la realización de los experimentos en las condiciones fotópicas y escotópicas. Las respuestas ERG inducidas por los destellos de la fuente de estimulación fueron registradas en el ojo derecho de los animales. De cinco a diez repuestas escotópicas (STR y Bastones), con un intervalo de 30 segundos entre cada una, fueron promediadas por el programa informático. Después el animal fue adaptado a las condiciones de luz durante 10 minutos con un fondo de iluminación de ~30cd/m2.Las señales del ERG fueron amplificadas y filtradas en una banda entre 1 y 1000 Hz con un amplificador Grass (CP511 AC amplifier, Grass instruments, Quinay, MA). Las señales electricas fueron digitalizadas a 10Hz con el programa de Power (AD instruments, CA). Los cambios de potencial electrico fueron registrados con una lente corneal (Burian-Allen electrode, Hansen Ophtalmic Development Lab Coralville, IA), con un electrodo de referencia localizado dentro de la boca del animal y un electrodo de tierra en la cola del mismo.

El análisis histológico fue realizado sobre los animales CD1 y NMRI con posterioridad al análisis

electrorretinográfico. Los ratones fueron sacrificados mediante inyección i.p. de Pentobarbital. Tras la enucleación de ambos ojos se sumergieron en PBS con PFA4% y posteriormente se crioprotegieron en baños saturados con Sacarosa. Las secciones de 14 mm de retina fueron obtenidas con un criostato(MARCA). Después de tres lavados en PBS las secciones fueron bloqueadas durante 1 hora con suero de burro 2% y tritón X100 0,2% disueltos en PBS 0,1M. Posteriormente las secciones fueron incubadas en PBS, que contenía los anticuerpos primarios, suero al 2% y tritón al 0,2% durante toda la noche. Al día siguiente, las secciones fueron lavadas nuevamente por tres veces en PBS 0,1M. A continuación se procedió a la incubación de los anticuerpos secundarios, también acompañados de suero y tritón, durante 90 minutos.

Los anticuerpos primarios utilizados para el marcaje de los conos fueron la Opsina Azul (Milipore, AB-5407 y St. Cruz, OPN1SW sc-14363) y la opsina Roja/Verde

(Milipore, AB-5405); para el marcaje de los bastones la Rodopsina (Milipore MAB-5356). Como marcador de contraste se utilizó un intercalador de DNA, el 4',6-diamidino-2-fenil indol o DAPI. En todos los casos las imágenes fueron captadas en la zona media de la retina. Se utilizó un microscopio de Epifluorescencia Olympus BX, con cámara DP-71 en color. Se utilizó un objetivo20x para la obtención de todas las fotografías.

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STR+ STR- BASTONES a-MIX b-MIX PO CONOS FLICKER

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Todos

PO Sano

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NMRI Harlan NMRI Janvier CD-1 Harlan CD-1 Janvier

ESTUDIO DE LA CAPACIDAD VISUAL EN RATONES ALBINOS. ¿SON LOS ANIMALES ALBINOS UTILES PARA TODOS LOS EXPERIMENTOS EN NEUROCIENCIAS? 1-2 3,4 2 2 2 1 3,4 2Vicente-Tejedor, J. ; Zurita, E. ; Marchena, M. ; Ramírez, L. ; Germain, F. ; Sánchez-Ramos, C. ; Montoliu, L. ; de la Villa, P.

1 2 3 4 Alta Eficiencia Tecnológica, S.L. Escuela de Óptica. Universidad Complutense de Madrid, Spain. Departamento de Fisiología. Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá, Alcalá de Henares, Spain; Centro Nacional de Biotecnologia, CSIC, Madrid, Spain; CIBER de Enfermedades Raras (CIBERER), ISCIII, Madrid, Spain.

NMRI Harlan CD-1 Harlan

SANOS

AFECTADOS

LEYENDA DE FIGURAS.

(I)

(II)

Representación de los registros electrorretinográficos estándar más STR de los animales Sanos (trazo negro) y Afectados (trazo rojo). De izquierda a derecha se muestran los registros de la Respuesta Umbral Escotópica (STR), Bastones, Mixta, Potenciales Oscilatorios, Conos y Flicker. El eje de abscisas representa el tiempo en milisegundos; el eje de ordenadas la amplitud de las respuestas en microVoltios. Por debajo de cada uno de estos registros se representa el estímulo luminoso aplicado (trazo azul), ofreciendo información del momento en el que se aplica (ms, en abscisas) y la intensidad (Voltios, en ordenadas).

Análisis de los registros electrorretinográficos y su representación de todos los grupos sometidos a estudio. En la parte izquierda de la figura se muestran las gráficas obtenidas del análisis de la cepa NMRI, tanto de la casa Harlan como de la casa Janvier. En la parte derecha se muestran las gráficas obtenidas del análisis de la cepa CD1 (de ambas casas). En una línea superior de esta figura aparecen los histogramas de barras para la comparación de los individuos Sanos (barras negras) con los Afectados (barras grises) para cada uno de los grupos. En cada caso se representa la media con la Desviación Estandar. La distribución de los animales Sanos/Afectados de cada grupo en el histograma de barras es: NMRI-Harlan (5/4); NMRI-Janvier (13/4); CD1-

+Janvier (10/5); CD1-Harlan (1/4/3 ). Se representa con ns la no existencia de diferencias estadísticas y con * cualquier diferencia significativa entre los valores de cada grupo. Se realizó un análisis estadístico utilizando la prueba ANOVA de dos vías, con el análisis posterior de Bonferroni; además se utilizó la t de student.En una línea inferior de esta figura se representan las gráficas Intensidad/Respuesta para los registros fotópicos con diferente longitud de onda en la fuente de estimulación. Con círculos representamos las diferentes respuestas, a intensidad creciente de estimulación, de los individuos sanos; siguiendo un código de colores para los distintos LEDs (negro= luz blanca; rojo= 650nm; verde= 540nm; azul= 450nm). Con triángulos se representan los individuos afectados ( con el mismo código de colores para los LEDs). La distribución Sanos/Afectados en este caso es: NMRI-Harlan (5/4); NMRI-Janvier (8/2); CD1-Janvier (7/1); CD1-Harlan

+(1/4/3 ). . Se realizó un análisis estadístico utilizando la prueba ANOVA de dos vías, con el análisis posterior de Bonferroni (estadística no representada).

(

(I)

(II)

CONCLUSIONES.

• Los animales albinos habitualmente suministrados por casas comerciales pueden presentan un significativo número de individuos con defectos en la función visual fotópica.

• El porcentaje de animales Sanos y Afectados varía de unas partidas a otras, pudiéndos estimar un valor de 20-40% de animales afectos.

• El defecto fotópico se da tanto en cepas albinas CD1 como NMRI.

• Los defectos de función visual no son debidos a una pérdida designificativa del número de conos.

• Especulamos que la alteración de la transmisión sináptica entre conos y células bipolares de cono podrían ser causa de esta alteración.

567/84

SANOS

AFECTADOS

Inmunorreactividad a opsinas y marcaje nuclear (DAPI) en animales Sanos y Afectados para la cepa NMRI. Se muestran cuatro fotografías de la retina media. En este bloque de cuatro fotografías encontramos una línea superior, donde se muestran secciones de animales Sanos y una línea inferior, donde se muestran las secciones de animales Afectados. Las instantáneas de la izquierda del cuadro muestran la inmunorreactividad a la Opsina Roja/Verde (color rojo), mientras que las instantáneas de la derecha del cuadro muestran la inmunorreactividad a la Opsina Azul (color verde).

Inmunorreactividad a opsinas y marcaje nuclear (DAPI) en animales Sanos y Afectados para la cepa Cd1. Se muestran cuatro fotografías de la retina media. En este bloque de cuatro fotografías encontramos una línea superior, donde se muestran secciones de animales Sanos y una línea inferior, donde se muestran las secciones de animales Afectados. Las instantáneas de la izquierda del cuadro muestran la inmunorreactividad a la Opsina Roja/Verde (color rojo), mientras que las instantáneas de la derecha del cuadro muestran la inmunorreactividad a la Opsina Azul (color verde).

AGRADECIMIENTOS.

Este trabajo ha sido posible por el soporte del Programa Torres Quevedo (PTQ-03588) y la Empresa ALTA EFICACIA TECNOLOGÍA, S.L. Mi agradecimiento personal al Dr. Nicolás Cuenca y la Dra. Violeta Gómez-Vicente por su generosidad.

Opsina Roja/Verde Opsina Azul

Opsina Roja/Verde Opsina Azul Opsina Roja/Verde Opsina Azul

Opsina AzulOpsina Roja/Verde