7b. identifikacija osoba pomo_u dnk analize

8/17/2019 7b. Identifikacija Osoba Pomo_u DNK Analize

1/86


2/86

Procesi prenošenja i razmene naslednih informacija

Gubitak genetske informacije znači biološku smrt


3/86


4/86

Votson i Krik otkrivaju strukturu DNK (Watson, J.D. andF.H. Crick, “Molecular Structure of Nucleic Acids: AStructure for Deoxynucleic Acids”, Nature 171 (1953) 738)

Doprinosi razumevanju finih molekulskih strukturaDNK, RNK i virusa

James D. Watson Francis H. Crick Maurice H. F. Wilkins

Rosalind Franklin?


5/86

Jedro

Sadrži nasledni materijal (nuklearna DNK) Citoplazma

Sadrži ćelijske organele▪ Mitohondrije (mitohondrijalna DNK)

Jedro

Goldžijevaparat

Hromozom

i DNK

Mitohondrije

Endoplazmatičniretikulum

Ribozomi


6/86

Građa organizma

U ljudskom telu postoji 1017 ćelija

Gen je osnovna jedinica naslednosti

Genom je skup svih gena u organizmu

Ljudski organizam ima 46 hromozoma


7/86

Hromozomi – strukture ukoje sadrže genetskimaterijal

Genski lokus – pozicijagena na hromozomu

Genski aleli – različitioblici jednog gena

Hromozom

Hromozomi

Genskilokus

Genskialeli


8/86

22 autozomna hromozoma + polni

hromozomi


9/86

Ženski i muški kariotip


10/86

Struktura makromolekula DNK

DNK je dvostruki heliks Lanac DNK (polinukleotid)

linearne strukture činenukleinske kiseline povezane

fosfodiestarskim vezama

Izuvijane merdevine “Ram” merdevina je

sačinjen od šećera ifosfata

“Prečke” merdevina susačinjene od nukleotida


11/86

Zavojnica

Širina zavojnice je svuda ista - 2 nm

Zavoj čini 10 parova nukleotida ukupne dužine 3,4 nm

2nm

3,4 nm

http://en.wikipedia.org/wiki/Image:DNA_Overview.pnghttp://en.wikipedia.org/wiki/Image:DNA_Overview.pnghttp://en.wikipedia.org/wiki/Image:DNA_Overview.pnghttp://en.wikipedia.org/wiki/Image:DNA_Overview.pnghttp://en.wikipedia.org/wiki/Image:DNA_Overview.png


12/86

Nukleotidi

4 nukleinske kiseline (nukleotida) ulaze u sastav DNK

(A)denin

(T)imin

(G)uanin (C)itozin

Adenin

Pirimidini

Purini

Citozin Timin

Guanin

A

C

G

T

Nukleotid čini Molekuli šećera

Atomi fosfora

Atomi azota


13/86

Sparivanje nukleotida

Ako se zna redosled

nukleotida u jednomlancu DNK, može seodrediti redosleddrugog lanca

A i C se ne mogu poravnatikako bi formirali H vezu

G i T se ne mogu poravnatikako bi formirali H vezu

A i T se mogu poravnatikako bi formirali dvostrukuH-vezu

G i C se mogu poravnatikako bi formirali trostrukuH-vezu

Sparivanje baza se vrši po pravilu komplementarnosti A-T (dvostruke H veze)

G-C (trostruke H veze)


14/86

RNKRibonukleinska kiselina

Pentoza koja ulazi u sastav RNK je riboza

U sastavu RNK se umesto timina javlja uracil

Jednolančani molekul

Nasledni materijal kod nekih virusa


15/86


16/86

Univerzalnost

Jedinstvenost??? Nepromenljivost

Dostupnost???

Praksa korišćenja u forenzici


17/86

Identifikacija žrtava i počinioca krivičnih dela

Utvrđivanje očinstva

Utvrđivanje rodbinskih veza u imigracionim slučajevim Identifikacija nestalih osoba

Utvrđivanje osobe u automobilskim nesrećama

Nezakonito ubijanje divljači


18/86

Opipljiv uzorak Poređenje/utvrđivanje

identiteta se ne obavlja urealnom vremenu i sve fazeprocesa nisu automatizovane

Ne postoje šabloni iekstrakcija karakteristika


19/86

Identifikacija se zasniva na poređenju DNK profiladobijenog iz biološkog traga sa DNK profilom osobe zakoje se sumnja da je ostavila taj trag

Često iz vrlo male količine biološkog materijala


20/86

1980 Ray White opisuje prvi polimorfni RFLP marker

1985 Alec Jeffreys otkriva multilokusne VNTR probe

1985 Prvi rad o PCR-u

1986 DNK prvi put u kriminalističkoj istrazi (UK)

1988 FBI koristi DNK1991 Prvi rad o STR-u

1995 U UK formirana DNK baza podataka

1998 FBI formira CODIS bazu podataka


21/86

DNK analiza počinje nakon pregleda dokaznog

materijala i pozitivne identifikacije uzoraka Da li je DNK ista u svakoj ćeliji u telu i tokom života?

Forenzička DNK analiza obrađuje mali procenat

sekvence DNK koji se razlikuje među ljudima (VNTRs)


22/86


23/86


24/86

Telesne tečnosti: Krv

Sperma

Pljuvačka

Urin

Feces

Vosak iz ušiju Povraćeni sadržaj

Vaginalni bris

Znoj

Tkiva:

Koža

Kosti

Kosa

Nokti


25/86

Sterilni bris (štapići) u epruveti

Obeležiti epruvetu imenom ili šifrom osobe čiji će sebukalni bris uzeti tim brisom

Bris se izvadi iz epruvete i protrlja sa leve i desne

unutrašnje strane obraza 5-6 puta


26/86

Sterilni uslovi

Bez pušenja, jela, pića i bacanja đubreta

Što manji broj ljudi koji barata biološkim materijalom

Osoba koja prikuplja dokazni materijal mora imati minimalnilični kontakt sa telesnim tečnostima, materijalima i biološkimuzorcima

Oprema

Sterilne lateks rukavice

Maske za lice, natikače, kapa, jednodelni kombinezon

Sterilni forcepsi za prikupljanje opušaka i sl.


27/86

Otisci prstiju Oružje Ugrizi

Žvakaća guma Paketići droge koji su

prethodno držani u ustima Opušci cigareta Maramice, posteljina Korišćene koverte i

markice Escajg Odeća

Korišćene čaše, flaše ikonzerve

Četke za kosu

Četkice za zube Obuća, čarape Hanzaplast Korišćeni špricevi Odbačeni kondomi Cucle Konac za zube Brijači Znojave majice


28/86

Tečni uzorci Krv, sperma, pljuvačka

Pokupiti delom vate sa brisa

Osušeni uzorci Pokupiti vlažnim brisem

Oguliti

Iseći

Podići lepljivom trakom


29/86

Kako?

Pakovanje osušenih materijala

Svaki predmet sa biološkim tragom treba upakovatiposebno u papirnu kesu/kesu sa ventilacijom

Izbeći pakovanje u plastične i vakumirane kese

Gde?

Svi paketi koji sadrže biološki materijal bi trebalo da stojeu frižideru ili na hladnijem mestu


30/86

Problemi sa izmešanim uzorcima i degradacijomDNK rezultiraju u parcijalnim DNK profilima

Biološki tragovi mogu biti od presudne važnostikao dokaz u sudskom postupku

Procedure za otkrivanje, dokumentovanje,prikupljanje i čuvanje bioloških tragova


31/86


32/86


33/86

Tokom amplifikacije (replikacije)dve niti DNK se odvoje

Nove komplementarne niti segrade koristeći ogoljenenukleotide kao matricu


34/86

Lančana reakcija polimeraze (Kary Mullis, 1980)

Enzimska reakcija koja omogućava amplifikaciju

segmenata DNK kroz termalne cikluse Osetljiva

Brza

• Denaturacija (94-97 °C)

•Vezivanje prajmera (50-60 °C)

•Kopiranje (70-72

°C)


35/86


36/86

Razdvajanje naelektrisanih DNK fragmenata

po njihovoj veličini putem propuštanja strujekroz pufer

Amplifikovana DNK se propušta kroz gel

PAGE

SDS-PAGE


37/86

Razdvajanje fragmenata DNK na osnovu odnosa njihoveveličine i naelektrisanja u unutrašnjosti kapilare sa elektrolitom

Amplifikovana DNK se propušta kroz genetski analizator

A, T, G i C fluorescentno obeleženi

Pod dejstvom električnog polja DNK migrira i prolazi krozlasersku svetlost, a laser očitava svaki nukleotid


38/86


39/86

99,7% ljudske DNK je isto kod svih ljudi 0,3% ljudske DNK je jedinstveno za svaku osobu Pouzdana identifikacija

Minisateliti (ponovljena sekvence, 10-100 baznih parova)

Kratki tandemski ponovci (STR) (2-9 baznih parova)

Pojedinačne polimorfizmi nukleotida (SNP)


40/86

Šta su STR?

Visoko varijabilni nekodirajući segmenti DNK koji seponavljaju

Stabilni kod pojedinaca

Različiti među pojedincima

Postoji oko 2000 različitih STR u ljudskoj populaciji 13 se rutinski koristi u forenzičkoj praksi za identifikaciju

osoba


41/86

Isključen Upoređeni DNK profili se ne podudaraju

Uključen Upoređeni DNK profili se podudaraju

Mora se predstaviti verovatnoća slučajnog podudaranja

Svi aleli analiziranih lokusa iz spornog uzorka moraju biti isti

kao aleli za te lokuse iz referentnog uzorka profila iz baze Nemoguć zaključak

Nedovoljna količina materijala za analizu

Uzorci više osoba (više učinilaca)


42/86

Određena učestalost pojedinačnih STR lokusa Množenjem statističkih podataka o učestalosti svakog

od 13 STR regiona dobija se visoko jedinstven rezultat

Verovatnoća slučajnog podudaranja


43/86

Rezultat PCR analize DNK

Testirani muškarac nije biološki otac deteta, pošto ne dele genetske markere

9 od 15 genskih identiteta se ne poklapa


44/86


45/86

Vrši se preko Jedarne (nuklearne) DNK

Mitohondrijalne DNK


46/86

Jedinstveni segmenti DNK na Y hromozomu imitohondrijalnoj DNK

Y hromozom nasleđuju muškarci od oca

Mitohondrijalnu DNK nasleđuju i muškarci i žene odmajke

MtDNK senasleđuje od

majkeNuklearna

DNK senasleđuje odoba roditelja

Potomak ćelija


47/86

Srodstvo po majčinoj liniji se može utvrditi generacijamaunazad

Nuklearna DNK se nasleđuje od svihpredaka

MtDNK se nasleđuje po jednoj liniji

DNK analizom muškekomponente genetskog

materijala (Y hromozom)moguće je utvrditi idaleka srodstva pomuškoj liniji


48/86

RFLP analiza

PCR analiza STR analiza

Analiza Y hromozoma (Y-STR)

Analiza mitohondrijalne DNK (MtDNA)


49/86

Nedostaci

Zahteva velike količine DNK

Degradacija uzoraka

Tehnika za analiziranjevarijabilnih dužina DNK

fragmenata koji surezultat divergiranja DNKuzorka restrikcionimendonukleazama


50/86

Umnožavanje segmenta molekula DNK

Sekvenciranje gena i dijagnoza naslednih poremećaja,detekcija i dijagnoza infektivnih oboljenja i kreiranje

DNK profila

Primena PCR omogućava analizu genetskog materijalaiz samo jedne ćelije

Prevencija kontaminacije drugim biološkim materijalima


51/86

Razlike po prisustvu i odsustvu STR na određenimlokusima, kao i po broju ponovaka unutar određenoglokusa

STR se nasleđuju kombinacijom ovih genetskih

elemenata oba roditelja Krvni srodnici imaju sličan, ali ne i isti profil osim u

slučaju jednojajčanih blizanaca

Pri analizi DNK koristi se 10-15 STR lokusa


52/86

Geni sadrže određene ponavljajuće sekvence

različitih dužina Ponavljajuće sekvence od 2 do 5 baza se nazivaju

mikrosateliti ili STR Sistemi

Pogodni za forenzičke analize

PCR reakcije i metoda kapilarne elektoforeze

Kada je jedan dovoljno veliki broj STR sistemaobuhvaćen analizom, dobija se tzv. DNK otisak


53/86

GeniGeni Y Y hromozomahromozoma kodkod ččovekaoveka

1A1A1A1B

1A 1 B 2 1C 1D 1 E 2A 2 B2C 3A 3 B 3C 3D 3 E 3F 3G 4A 5A 5 B 5C 5D 5E 5F 5G 5H 5I 5J 5K 5 L 5M 5N 5O5 P 5Q 6A 6 B 6C 6D 6E 6F

GeniGeni

(familije)(familije)

specifispecifiččni zani za

testisetestise

F e n

o t i p o v i

F e n o t i p o v i

pter pter

R P S 4 Y

R P S 4 Y

Z F Y

Z F Y

A M E L Y

A M E L Y

D F F R Y

D F F R Y

D B Y

D B Y

U T Y

U T Y

I B 4 Y

I B 4 Y

S M C Y

S M C Y

E I F 1 A Y

E I F 1 A Y

heterohromatinheterohromatin

S R Y S R Y

T T Y 1

T T Y 1

T S P Y

T S P Y

T T Y 1

T T Y 1

T T Y 2

T T Y 2

T S P Y

T S P Y

P R Y

P R Y

B P Y 1

B P Y 1

C D Y

C D Y

X K H Y

X K H Y

R B M

R B M

P R Y

P R Y

I I Y 2

I I Y 2

R R M

R R M

D A Z

D A Z

B P Y 2

B P Y 2

P H Y

P H Y

C D Y

C D Y

DeterminacijaDeterminacija

pola pola

AZFa AZFa

SpermatogenezaSpermatogeneza

GonadoblastomGonadoblastom

RastRast

AZFc AZFc

SpermatogenezaSpermatogeneza

SpermatogenezaSpermatogeneza AZFb AZFb

NerekombinujuNerekombinujućći regioni region

X X - - h o m o l o g i g e n i

h o m o l o g i g e n i

qqterter

P A R

P A R

Analiza markera sa Y hromozoma

Nasleđuju se preko muške predačko-potomačke linije


54/86

Genetski materijal koji se nalazi u mitohondrijamanasleđuje se isključivo od majke

Identifikacija Romanovih i njihove dece


55/86

Od 1985.godine najmoćniji alat za identifikaciju osoba

Identifikacija osoba i utvrđivnje očinstva su dvenajzastupljanije forenzičke DNK analize

Za identifikaciju se skenira 13 delova DNK (STR) uzkreiranje DNK profila osobe

Izuzetak su jednojajčani monozigotni blizanci

Razlike u DNK profilima osoba


56/86

Identifikacija počinilaca krivičnih dela

U Srbiji se DNK analize primenjuju od 1997. godine

Biološki tragovi na mestu zločina i na predmetima

Utvrđuje se DNK profil iz biološkog traga i DNKprofil iz uzorka uzetog od osumljičenog


57/86

Identifikacija potencijalnih osumnjičenih

Identifikacija žrtava katastrofa

Utvrđivanje očinstva i drugih srodničkih veza Identifikacija ugroženih i zaštićenih vrsta

Pronalaženje odgovarajućeg donatora i recipijentapri transplantaciji


58/86


59/86

Evropska – nacionalni DNK registri Prvi put napravljene u SAD i Engleskoj

Tehničko-tehnološki, pravni i etički aspekt


60/86

Baze podataka (skladištenje DNK profila individua)

Referentni DNK profili

DNK profil okrivljene osobe

DNK profil osumnjičene osobe DNK profil oštećene osobe

DNK profili tragova (biološki tragovi)

▪ Krv

▪ Pljuvačka

▪ Sperma

▪ Meko tkivo

▪Kosti


61/86

Sjedinjene Američke Države (FBI)

Februar 2010

Preko 8 miliona profila

300 000 profila iz uzoraka sa MKD

13 STR lokusa


62/86

Nezavisni STR (na različitim hromozomima) obezbeđujuveliku moć diskriminacije

13 CODIS STR lokusa, amelogenin i njihove hromozomske pozicije

Obrađuje

DNK profile osuđenika Nerazrešene zločine

Nestale osobe

Testira (13 + 1) markeraza unos u CODIS

FBI i CODIS


63/86

1. Baza osuđenih prestupnika Svaka država određuje za koja krivična dela

2. Baza uhapšenih/baza osumnjičenih

U nekim državama SAD3. Baza nestalih, neidentifikovanih (humani ostaci) i

referentna baza nestalih osoba (rođaci nestalih)

4. Forenzička baza


64/86

Kontrola profila na saveznom nivou FBI, tajna lokacija

180 laboratorija, 50 država Kontrola profila na državnom nivou

Kontrola profila na lokalnom nivou


65/86

Unos i menadžment DNK profila

Pretraga baza DNK profila

Statističke kalkulacije

Komunikacija između CODIS laboratorija i centralnogFBI sistema


66/86

Velika Britanija

7 STR lokusa

3 miliona profila 50 000 profila uzoraka sa MKD godišnje

Obrada istih lokusa u različitim zemljama

Omogućava međunarodnu saradnju


67/86

Formiranje Agencije za vođenje DNK registra

Nekoliko DNK baza podataka

DNK profili dobijeni analizom bioloških tragova koji se

pronađu na mestu zločina DNK profil svih ljudi koji su pravosnažnom sudskom

presudom osuđeni na zatvorske kazne zbog učinjenihodređenih krivičnih dela


68/86


69/86

Poređenje forenzičke baze sa njom samom

Potencijalna veza između dva ili više slučaja

Identitet potencijalnih prestupnika

Nacionalni DNK registri od izuzetnog značaja zasvaku državu

Međunarodna saradnja


70/86

Belgija

Osuđeni za teška krivična dela

Velika Britanija

Osumljičeni i osuđeni za sva krivična dela i većinu

prekršaja, dobrovoljci

Švajcarska

Osuđeni na zatvorske kazne


71/86

1. Profili osuđenih prestupnika Za sve zločine ili za posebno označene zločine

Za sve ili samo za određene dužine kazne

Sa presudom i specifičnim sudskim nalogom ili bez ovih

dokumenata2. Profili osumničenih

Bilo koje krivično delo ili samo određena


72/86

Britanska baza DNK podataka sadrži podatke 5 000000 građana (8% stanovništva) Rutinska hapšenja

“Crnačka” baza DNK podataka Specijalna Komisija traži od Vlade da izvrši reviziju

baze podataka


73/86

Od 5 000 000 ljudi u Britanskoj DNK bazi podataka,oko 860 000 nema policijski dosije

Da li treba izbrisati DNK profil iz baze podataka ukoliko se

dokaže da je osoba nevina? Povodom odluke donete 2008. godine u Evropskom sudu za

ljudska prava, Velika Britanija 2009. godine briše ~800 000DNK profila iz svoje baze podataka


74/86

1. Profili osuđenih prestupnika Neograničena dužina

Do smrti osuđenog

Do isteka dodeljene kazne

2. Profili osumnjičenih/uhapšenih Uklanjanje nakon oslobađajuće presude ili odbacivanja optužbi


75/86

Kako tretirati biološki materijal iz koga je dobijenDNK profil?

Biološki uzorak se u nekim zemljama uništava nakonanalize Belgija

Danska


76/86

NARANDŽASTO - DA, BELO - NE,ŽUTO - NE POSTOJE PODACI 188 zemalja članica

INTERPOLA – većinaradi forenzičku analizu

DNK


77/86

INTERPOL - DNK BAZE PODATAKA

54 zemlje - postoji DNK baza 29 zemalja - DNK baza je u fazi formiranja

LJUBIČASTO - DA, BELO - NE,ŽUTO - NE POSTOJE PODACI


78/86

Policija zemalja članica unosi DNK profile prestupnika,

sa MDK, nestalih lica, neidentifikovanih tela Kreirana 2002. godine

Preko 82 000 DNK profila (kraj 2008. godine)


79/86


80/86

Colin Pitchfork je prvo veštačenje metodom DNK Velika Britanija (1987)

Rasvetljena ubistva i silovanja dve devojke pomoću DNKprofila (ne uz pomoć krvnih grupa)

Srbija

Prva veštačenja 1997. godine


81/86

Ubistva

Silovanja

Teški slučajevi razbojništva i razbojničkih krađa Teška dela protiv bezbednosti javnog saobraćaja

Krivična dela protiv opšte sigurnosti ljudi i imovine


82/86

2002. godine u Zakonik o krivičnom postupku SRJ se

uvode biološka veštačenja Republika Srbija preuzima određene odredbe ovog

Zakonika, ali nedostaju odredbe koje se specifičnoodnose na biološka veštačenja


83/86


84/86

Putem krvnih grupa (pouzdanost 80-99 %)

DNK analize Nerođene dece

▪ 2. mesec trudnoće – uzorci iz horionskih čupica

▪

Poodmakla trudnoća – uzorci iz amniona ili fetalne krvi Rođene dece

▪ Bukalni bris

▪ Dlake

▪ Krv


85/86

Porast preciznostirezultata

Očinstvo nije isključeno

Očinstvo jeste isključeno

Poređenje DNK profila deteta i potencijalnog oca

Utvrđivanje očinstva na bazi DNK analiza 15 genetskihlokusa


86/86

7b. identifikacija osoba pomo_u dnk analize

Documents