8/8/2019 A Rapid Method for Detection of Respiratory Syncytial Virus

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JOURNAL O F C L I N I C A L M I C R O B I O L O G Y , A p r . 1 9 9 2 , p . 9 0 1 - 9 0 4 V o l . 3 0 , N o . 40 0 9 5 - 1 1 3 7 / 9 2 / 0 4 0 9 0 1 - 0 4 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 9 2 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

R a p i d D e t e c t i o n o f R e s p i r a t o r y S y n c y t i a l V i r u s i n N a s o p h a r y n g e a lA s p i r a t e s b y R e v e r s e T r a n s c r i p t i o n a n d P o l y m e r a s eC h a i n R e a c t i o n A m p l i f i c a t i o nADRIENNE W. PATON,' JAMES C . P A T O N , " * ANDREW J . LAWRENCE,'PAUL N . GOLDWATER,' A N D RAY J . HARRIS2

M i c r o b i o l o g y D e p a r t m e n t , A d e l a i d e C h i l d r e n ' s H o s p i t a l , N o r t h A d e l a i d e , S o u t h A u s t r a l i a 5 0 0 6 , 1a n d S c h o o l o f P h a n n a c y a n d M e d i c a l L a b o r a t o r y S c i en ce , U n i ve r si t y o fS o u t h A u s t r a l i a , A d e l a i d e , S o u t h A u s t r a l i a 5 0 0 0 , 2 A u s t r a l i aR e c e i v e d 1 6 A u g u s t 1 9 9 1 / A c c e p t e d 2 3 J a nu a r y 1 9 9 2

A r a p i d m e t h o d f o r d e t e c t i o n o f r e s p i r a t o r y s y n c y t i a l v i r u s ( R S V ) i n n a s o p h a r y n g e a l a s p i r a t e s , i n v o l v i n g ac o m b i n a t i o n o f r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n a n d p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n a m p l i f i c a t i o n ( R T - P C R ) , h a s b e e nd e v e l o p e d . T h e RT-PCR a s s a y e m p l o y s o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r s s p e c i f i c f o r t h e r e g i o n o f t h e R SV g e n o m ew h i c h e n c o d e s t h e F l s u b u n i t o f t h e f u s i o n ( F ) g l y c o p r o t e i n . O t h e r r e s p i r a t o r y v i r u s e s d o n o t g i v e a p o s i t i v er e a c t i o n . T h e RT-PCR a s s a y w a s t e s t e d o n 2 0 2 n a s o p h a r y n g e a l a s p i r a t e s c o l l e c t e d f r o m c h i l d r e n w i t h c l i n i c a ls i g n s o f r e s p i r a t o r y i n f e c t i o n , a n d t h e r e s u l t s f r o m RT-PCR w e r e c o m p a r e d w i t h t h o s e o b t a i n e d f r o m v i r u sc u l t u r e a n d d i r e c t d e t e c t i o n b y e n z y m e i m m u n o a s s a y ( E I A ) . RT-PCR r e s u l t s w e r e p o s i t i v e i n 1 1 8 o f 1 2 5s a m p l e s f r o m w h i c h R SV was c u l t u r e d , a s w e l l a s i n 4 o f 7 s a m p l e s w h i c h w e r e c u l t u r e n e g a t i v e b u t EIAp o s i t i v e . RT-PCR r e s u l t s w e r e n e g a t i v e i n 6 8 o f 7 0 c u l t u r e - n e g a t i v e , E I A - n e g a t i v e s a m p l e s , w h i c h i n c l u d e d 1 1s a m p l e s f r o m w h i c h o t h e r r e s p i r a t o r y v i r u s e s w e r e i s o l a t e d . T h e s p e e d , s e n s i t i v i t y ( 9 4 . 6 % ) , a n d s p e c i f i c i t y( > 9 7 % ) o f t h e RT-PCR a s s a y s u g g e s t t h a t t h i s t e c h n i q u e c o u l d b e u s e f u l f o r r a p i d d e t e c t i o n o f R SV i n c l i n i c a ls a m p l e s .R e s p i r a t o r y s y n c y t i a l v i r u s ( R S V ) i s a n i m p o r t a n t c a u s e o fa c u t e l o w e r r e s p i r a t o r y t r a c t i n f e c t i o n s i n h u m a n s , w i t hi n f a n t s a n d y o u n g c h i l d r e n b e i n g p a r t i c u l a r l y s u s c e p t i b l e .T r a d i t i o n a l l y , d i a g n o s i s o f R SV i n f e c t i o n h a s c e n t e r e d o n t h e" g o l d s t a n d a r d " t e c h n i q u e o f c u l t u r e o f t h e v i ru s f r o mn a s o p h a r y n g e a l s e c r e t i o n s . H o w e v e r , c e l l c u l t u r e m e t h o d s

a r e g e n e r a l l y s l o w , o f t e n t a k i n g u p t o a week b e f o r e a r e s u l ti s a v a i l a b l e , a n d s e n s i t i v i t y may b e a f f e c t e d b y t h e l a b i l i t y o fR SV ( 9 ) . T h e a v a i l a b i l i t y o f a n t i v i r a l t h e r a p e u t i c a g e n t se f f e c t i v e a g a i n s t R SV a n d t h e n e e d t o m i n i m i z e t h e r i s k o fc r o s s - i n f e c t i o n h a v e p r o m p t e d t h e d e v e l o p m e n t o f i m m u n o -c h e m i c a l t e c h n i q u e s f o r d i r e c t d e t e c t i o n o f v i r u s , s u c h a sd i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e a n d more r e c e n t l y , a n t i g e n - c a p -t u r e enzyme i m m u n o a s s a y s ( E I A ) ( 9 ) . T h e s e m e t h o d s a r emuch f a s t e r t h a n c u l t u r e , g i v i n g r e s u l t s o n t h e s a m e d a y , b u tt h e s e n s i t i v i t y a n d t o a l e s s e r e x t e n t t h e s p e c i f i c i t y a p p e a r t ov a r y c o n s i d e r a b l y ( 4 , 5 , 7 - 9 ) . A n a l t e r n a t i v e d i a g n o s t i ca p p r o a c h h a s i n v o l v e d i m p r o v e m e n t o f t h e s p e e d o f R SVc u l t u r e t e c h n i q u e s b y t h e u s e o f i m m u n o c h e m i c a l m e t h o d st o d e t e c t e a r l y v i r u s i n f e c t i o n o f c e l l c u l t u r e s , r a t h e r t h a nw a i t i n g f o r a c y t o p a t h i c e f f e c t t o become a p p a r e n t ( 6 ) .H o w e v e r , s u c h t e s t s s t i l l t a k e u p t o 3 d a y s .A s t u d y c a r r i e d o u t a t t h e A d e l a i d e C h i l d r e n ' s H o s p i t a li d e n t i f i e d R SV a s t h e s i n g l e m o s t commo n c a u s e o f n o s o -c o m i a l p e d i a t r i c r e s p i r a t o r y i n f e c t i o n s d u r i n g t h e w i n t e rm o n t h s ( 2 ) . T h e r e s u l t s o f t h i s s t u d y a l s o s u g g e s t e d t h a t t h ec r o s s - i n f e c t i o n r a t e m i g h t b e r e d u c ed f u r t h e r b y i m p r o v i n gt h e s e n s i t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y o f r a p i d R SV d e t e c t i o n a s s a y s .We h a v e d e v e l o p e d a r a p i d m e t h o d b as e d o n r e v e r s et r a n s c r i p t i o n ( R T ) a n d a m p l i f i c a t i o n o f v i r a l n uc l e i c a ci ds e q u e n c e s b y t h e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) . T h i s

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .9 0 1

p r o c e d u r e wa s t e s t e d o n n a s o p h a r y n g e a l a s p i r a t e s f r o mc h i l d r e n w i t h s u s p e c t e d r e s p i r a t o r y i n f e c t i o n s .MATERIALS AND METHODS

P a t i e n t s a m p l e s . N a s o p h a r y n g e a l a s p i r a t e s ( N P A s ) w e r ec o l l e c t e d f r o m 2 0 2 c h i l d r e n a g e d 1 m o n t h t o 6 y e a r s ( m e d i a na g e , 1 4 m o n t h s ) w i t h s u s p e c t e d r e s p i r a t o r y i n f e c t i o n s . T h es u c t i o n c a t h e t e r wa s f l u s h e d b y a s p i r a t i o n o f 2 m l o f v i r a lt r a n s p o r t medium i n t o a s p e c i m e n t r a p . A 0 . 5 - m l p o r t i o n o fe a c h s p e c i m e n w a s w i t h d r a w n a n d s t o r e d a t - 7 0 C f o rs u b s e q u e n t a n a l y s i s b y RT-PCR. T h e r e m a i n d e r was i m m e -d i a t e l y r e f r i g e r a t e d a n d t r a n s p o r t e d t o a n e a r b y c e n t r a lp a t h o l o g y l a b o r a t o r y w h i c h p r o v i d e s r o u t i n e d i a g n o s t i c v i -r o l o g y s e r v i c e s t o t h e A d e l a i d e C h i l d r e n ' s H o s p i t a l . T h em e d i a n d e l a y b e t w e e n c o l l e c t i o n o f a s p e c i m e n a n d r e c e i p tb y t h e c e n t r a l l a b o r a t o r y was a p p r o x i m a t e l y 1 . 5 h ( m a x i m u mo f 4 h ) . I m m e d i a t e l y a f t e r r e c e i p t , s p e c i m e n s were i n o c u -l a t e d o n t o HEp-2 a n d A 5 4 9 c e l l m o n o l a y e r s f o r v i r u s c u l t u r ea n d d i r e c t l y t e s t e d f o r t h e p r e s e n c e o f R SV b y u s i n g a ni n - h o u s e a n t i g e n - c a p t u r e E I A .V i r u s s t o c k s . R SV ( L o n g s t r a i n ) w as g r o w n i n HEp-2 c e l l s ,t i t r a t e d b y 50% t i s s u e c u l t u r e i n f e c t i v e d o s e ( T C I D 5 0 ) a s s a y ,a n d s t o r e d i n a l i q u o t s a t - 7 0 C . T h e s e s a m p l e s w e r e u s e d a sp o s i t i v e c o n t r o l s i n t h e RT-PCR a s s a y ( u n i n f e c t e d H E p - 2c e l l s w e r e u s e d a s a n e g a t i v e c o n t r o l ) . C l i n i c a l i s o l a t e s o fR SV a n d a d e n o v i r u s ( a l s o g r o w n i n HEp-2 c e l l s ) a n d p a r a i n -f l u en za v i r u s t y p e s 1 a n d 3 a n d i n f l u e n z a v i r u s A a n d B( g r o w n i n LLC-MkII c e l l s ) were k i n d l y p r o v i d e d b y P .H a l l s w o r t h .P r e p a r a t i o n o f s a m p l e s f o r RT-PCR. N P A s ( 0 . 5 m l ) o r c e l lc u l t u r e e x t r a c t s ( 0 . 1 m l ) were t h a w e d a n d i m m e d i a t e l ys u p p l e m e n t e d w i t h 2 0 U o f RNa s e i n h i b i t o r ( B o e h r i n g e r ,M a n n h e i m , G e r m a n y ) . The N P A s were d i g e s t e d b y a d d i n g 1M T r i s - H C l ( p H 7 . 6 ) t o 1 2 mM a n d p r o t e i n a s e K t o 0 . 2 m g / m l

8/8/2019 A Rapid Method for Detection of Respiratory Syncytial Virus

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9 0 2 P A T O N ET AL.a n d i n c u b a t i n g a t 6 5 C f o r 1 h . T h e d i g e s t was t h e n e x t r a c t e do n c e w i t h p h e n o l a n d t h e n o n c e w i t h c h l o r o f o r m , a n dn u c l e i c a c i d s w e r e r e c o v e r e d b y p r e c i p i t a t i o n w i t h a n e q u a lv o l u m e o f i s o p r o p a n o l a n d c e n t r i f u g a t i o n . T h e p e l l e t s w e r ew a s h e d i n 70% e t h a n o l , c e n t r i f u g e d , d r i e d , a n d f i n a l l y r e s u s -p e n d e d i n 1 0 , u l o f w a t e r c o nt a i ni n g 2 0 U o f RNase i n h i b i t o r .RT-PCR. RT-PCR was c a r r i e d o u t i n t w o s t e p s u s i n g a nRNA PC R k i t o b t a i n e d f r o m P e r k i n - E l m e r C e t u s , N o r w a l k ,C o n n . T h e R T s t e p i n v o l v e d a r e a c t i o n m i x t u r e ( f i n a l v o l -u m e , 2 0 p u l ) c o n t a i n i n g 1 0 mM T r i s - H C l ( p H 8 . 3 ) , 5 0 mMK C l , 5 mM M g C l 2 , 1 mM ( e a c h ) d A T P , d C T P , d G T P , a n dd T T P , a p p r o x i m a t e l y 1 p u M o f e a c h p r i m e r , 1 U o f RNasei n h i b i t o r p e r p , l , 3 p . 1 o f RNA s a m p l e , a n d 2 . 5 U o f a v i a nm y e l o b l a s t o s i s v i r u s r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e . The r e a c t i o nm i x t u r e s w e r e o v e r l a i d w i t h 5 0 p . 1 o f m i n e r a l o i l , i n c u b a t e d a t4 2 C f o r 1 5 m i n , a n d t h e n h e a t e d a t 9 9 C f o r 5 m i n . F o r t h eP C R s t e p , t h e r e a ct i o n v o l u m e was made u p t o 1 0 0 p . l w i t h 1 0mM T r i s - H C l ( p H 8 . 3 ) - 5 0 mM KCl a n d t h e f i n a l c o n c e n t r a -t i o n o f M g C l 2 was a d j u s t e d t o 2 mM. T a q p o l y m e r a s e ( 2 . 5 U )was a l s o a d d e d t o e a c h t u b e , a n d t h e t u b e s w e r e s u b j e c t e d t o3 5 a m p l i f i c a t i o n c y c l e s , e a c h c y c l e c o n s i s t i n g o f 1 . 5 - m i nd e n a t u r a t i o n , a n n e a l i n g , a n d e l o n g a t i o n s t e p s a t t e m p e r a -t u r e s o f 9 4 , 4 7 , a n d 7 2 C , r e s p e c t i v e l y . T h e s e q u e n c e s o f t h et w o p r i m e r s u s e d w e r e 5'-TTAACCAGCAAAGTGTlTAG A - 3 ' a n d 5 ' - T I T T G T T A T A G G C A T A T C A T T G - 3 ' . T h e s ep r i m e r s d e f i n e a 2 4 3 - b p s e g m e n t o f t h e R SV genome e n c o d -i n g t h e F l s u b u n i t o f t h e f u s i o n ( F ) p r o t e i n , a n d t h e s e -q u e n c e s t o w h i c h t h e p r i m e r s a n n e a l a r e i d e n t i c a l f o r b o t ht h e A a n d B s u b g r o u p s o f R SV ( 3 ) . T h e 2 4 3 - b p a m p l i f i e dp r o d u c t was d e t e c t e d b y e l e c t r o p h o r e s i n g 2 0 - p I a l i q u o t st h r o u g h 2% a g a r o s e g e l s i n t h e p r e s e n c e o f e t h i d i u m b r o m i d ef o r a p p r o x i m a t e l y 3 0 m i n a t 1 0 V / c m a n d p h o t o g r a p h i n g t h eg e l s u n d e r UV i l l u m i n a t i o n .

RESULTSS p e c i f i c i t y a n d s e n s i t i v i t y o f RT-PCR f o r R S V . T h e o l i g o -n uc l eo t i de p r i m e r s u s e d i n t h e RT-PCR a s s a y w e r e c h o s e n

o n t h e b a s i s o f p r e v i o u s l y p u b l i s h e d s e q u e n c e d a t a , w h i c hi n d i c a t e d t h a t t h e r e g i o n s t o w h i c h t h e s e p r i m e r s a n n e a l a r ei d e n t i c a l f o r b o t h t h e A a n d B s u b g r o u p s o f R SV ( 3 ) . As a ni n i t i a l c h e c k o n t h e s p e c i f i c i t y o f t h e s e p r i m e r s f o r R S V , t h eo l i g o n u c l e o t i d e s w e r e a n a l y z e d f o r h o m o l o g y w i t h a l l s e -q u e n c e s s t o r e d i n t h e G e n B a n k d a t a b a s e ( v e r s i o n R 6 4 . 0 )u s i n g t h e DNASIS s o f t w a r e p a c k a g e ( P h ar m ac i a L K B B i o -t e c h n o l o g y , U p p s a l a , S w e d e n ) . N o h o m o l o g i e s l i k e l y t or e s u l t i n s p u r i o u s a n n e a l i n g w e r e d e t e c t e d . S p e c i f i c i t y w ast h e n e x a m i n e d d i r e c t l y b y s u b j e c t i n g c e l l c u l t u r e e x t r a c t si n f e c t e d w i t h e i t h e r R SV ( L o n g s t r a i n ) o r c l i n i c a l i s o l a t e s o fa d e no v i r u s , p a r ai n f l u e nz a v i r u s t y p e 1 , p a r a i n f l u e n z a v i r u st y p e 3 , i n f l u e n z a A v i r u s , o r i n f l u e n z a B v i r u s t o RT-PCR( F i g . 1 ) . A PC R p r o d u c t o f t h e e x p e c t e d s i z e ( 2 4 3 b p ) w aso b s e r v e d f o r R SV b u t n o t f o r a n y o f t h e o t h e r v i r u s c u l t u r e s .T h e s e n s i t i v i t y o f t h e RT-PCR a s s a y was e x a m i n e d b ya n a l y z i n g s e r i a l 1 0 - f o l d d i l u t i o n s ( 1 0 - t o 1 0 6 - f o l d ) o f a nR S V - i n f e c t e d HEp-2 l y s a t e . T h e v i r u s t i t e r o f t h i s l y s a t e wasa p p r o x i m a t e l y 8 x i 0 7 T C I D 5 0 s p e r m l . A d i s t i n c t PC Rp r o d u c t was d e t e c t e d when 1 0 0 - p A a l i q u o t s d i l u t e d u p t o1 0 5 - f o l d w e r e t e s t e d , a n d a b a n d was f a i n t l y d i s c e r n i b l e i nt h e r ea ct i o n f r o m t h e 1 0 6 - f o l d d i l u t i o n ( F i g . 2 ) . T h e t o t a la m o u n t o f v i r u s i n t h i s r e a c t i o n was p r e d i c t e d t o b e a p p r o x -i m a t e l y 1 0 T C I D 5 O s .D e t e c t i o n o f RSV i n NPAs b y RT-PCR. I n a p r e l i m i n a r ye x p e r i m e n t , w e a n a l y z e d 2 2 N P A s w h i c h h a d b e e n p r e v i -o u s l y t e s t e d f o r R SV b y c u l t u r e a n d d i r e c t i m m u n o f l u o r e s -c e n c e a n d h a d s i n c e b e e n s t o r e d a t - 7 0 C f o r a p p r o x i m a t e l y

F I G . 1 . S p e c i f i c i t y o f R SV R T - P C R . N u c l e i c a c i d s w e r e e x -t r a c t e d f r o m c e l l c u l t u r e l y s a t e s a n d s u b j e c t e d t o RT-PCR a n a l y s i s ,a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a nd M et h o d s . L a n e s : M, DNA s i z em a r k e r s ( 5 0 0 , 4 0 4 , 3 3 1 , 2 4 2 , 1 9 0 , 1 4 7 , a n d 1 1 0 b p , r e s p e c t i v e l y , f r o mt o p t o b o t t o m ) ; - , u n i n f e c t e d HEp-2 l y s a t e ; A , a d e n o v i r u s - i n f e c t e dHEp-2 l y s a t e ; P 1 , p a r a i n f l u e n z a v i r u s t y p e 1 - i n f e c t e d LLC-MkIIl y s a t e ; P 3 , p a r a i n f l u e n z a v i r u s t y p e 3 - i n f e c t e d L L C - M k I I l y s a t e ; I A ,i n f l u e n z a A v i r u s - i n f e c t e d L L C - M k I I l y s a t e ; I B , i n f l u e n z a B v i r u s -i n f e c t e d L L C - M k I I l y s a t e ; R , R S V - i n f e c t e d HEp-2 l y s a t e .

3 y e a r s . O f t h e s e s a m p l e s , 1 1 h a d t e s t e d p o s i t i v e f o r R SVa n d 1 0 y i e l d e d a P C R p r o d u c t o f t h e e x p e c t e d s i z e i n t h eRT-PCR a s s a y ( F i g . 3 ) . N o P C R p r o d u c t s w e r e d e t e c t e dwhen t h e 1 1 R S V - n e g a t i v e N P A s w e r e s i m i l a r l y a n a l y z e d( F i g . 4 ) .A f u r t h e r 2 0 2 f r e s h l y o b t a i n e d N P A s w e r e t h e n e x a m i n e db y R T - P C R , a n d t h e r e s u l t s w e r e c o m p a r e d w i t h t h o s e f o rR SV c u l t u r e a n d EIA r e p o r t e d b y t h e c e n t r a l p a t h o l o g yl a b o r a t o r y ( T a b l e 1 ) . RT-PCR was p o s i t i v e i n 1 1 8 o f 1 2 5( 9 4 . 4 % ) N PA s f r o m w h i c h R SV w as c u l t u r e d . T h e RT-PCRt e s t a l s o y i e l d e d p o s i t i v e r e s u l t s i n a f u r t h e r f o u r o f s e v e ns a m p l e s w h i c h w e r e c u l t u r e n eg at i v e b u t EIA p o s i t i v e .RT-PCR w a s n e g a t i v e i n 6 8 o f 7 0 R SV c u l t u r e - n e g a t i v e ,E I A - n e g a t i v e s a m p l e s , w h i c h i n c l u d e d 1 1 w h i c h w e r e p o s i -t i v e b y c u l t u r e o r EIA f o r o t h e r r e s p i r a t o r y v i r u s e s ( 4 f o rp a r a i n f l u e n z a t y p e 2 , 2 f o r p a r a i n f l u e n z a t y p e 3 , 1 f o rr h i n o v i r u s , 1 f o r a d e n o v i r u s , a n d 3 f o r i n f l u e n z a B v i r u s ) .T h e EIA was c l e a r l y l e s s s e n s i t i v e t h a n R T - P C R , y i e l d i n gp o s i t i v e r e s u l t s i n o n l y 4 9 o f 1 2 5 o f t h e R SV c u l t u r e - p o s i t i v eNPAs. M i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n o f t h e N PA s h a d i n d i c a t e dt h a t i n a h i g h p r o p o r t i o n o f s a m p l e s , t h e r e w e r e f e w e r t h a n1 0 3 r e s p i r a t o r y c o l u m n a r e p i t h e l i a l c e l l s p e r m l , w h i c h m i g h th a v e c o n t r i b u t e d t o t h e p o o r s e n s i t i v i t y o f t h e E I A . I t i si n t e r e s t i n g , h o w e v e r , t h a t t h e m a j o r i t y o f R SV c u l t u r e -p o s i t i v e , E I A - n e g a t i v e s a m p l e s , w h i c h w e r e d e t e c t e d a sp o s i t i v e b y R T - P C R , y i e l d e d s t r o n g p o s i t i v e s i g n a l s . F i g u r e5 s h o w s t w o t y p i c a l c u l t u r e - p o s i t i v e E I A - n e g a t i v e N P A sw h i c h y i e l d e d RT-PCR s i g n a l s a l m o s t a s i n t e n s e a s t h o s e

F I G . 2 . S e n s i t i v i t y o f RT-PCR a s s a y f o r RSV. N u c l e i c a c i d sw e r e e x t r a c t e d f r o m s e r i a l 1 0 - f o l d d i l u t i o n s o f a n R S V - i n f e c t e dHEp-2 c e l l l y s a t e o f k now n t i t e r o r f r o m a n u n i n f e c t e d H E p - 2 l y s a t ea n d s u b j e c t e d t o RT-PCR a n a l y s i s a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n dM e t h o d s . L a n e s : M, DNA s i z e m a r k e r s ( a s i n t h e l e g e n d t o F i g . 1 ) ;- , u n i n f e c t e d HEp-2 l y s a t e ; 1 t o 7 , R S V - i n f e c t e d H E p - 2 c e l l l y s a t e sd i l u t e d 1 0 o - , 1 0 1 _ , 1 0 2 _ , 1 0 3 - , 1 0 4 - , 1 0 ' - , a n d 1 0 6 - f o l d , r e s p e c t i v e l y .

J . C L I N . M I C R O B I O L .

8/8/2019 A Rapid Method for Detection of Respiratory Syncytial Virus

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R SV DETECTION BY RT-PCR 9 0 3

F I G . 3 . RT-PCR o f e x t r a c t s o f R SV c u l t u r e - p o s i t i v e N P A s .L a n e s : M , DNA s i z e m a r k e r s ( a s i n t h e l e g e n d t o F i g . 1 ) ; + ,R S V - i n f e c t e d H E p - 2 l y s a t e ; 1 t o 1 1 , R SV c u l t u r e - p o s i t i v e N P A s ; - ,u n i n f e c t e d H E p - 2 l y s a t e .

o b t a i n e d f r o m t h e u n d i l u t e d R S V - i n f e c t e d c e l l c u l t u r e e x -t r a c t u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l .DISCUSSION

I n a p r e v i o u s s t u d y ( 1 ) , w e h a v e s h o w n t h a t PC R i s a v e r yp r o m i s i n g m e t h o d f o r t h e r a p i d d e t e c t i o n o f a b a c t e r i a lr e s p i r a t o r y p a t h o g e n ( B o r d e t e l l a p e r t u s s i s ) i n N P A s . T h ePC R t e s t f o r p e r t u s s i s i s v e r y s e n s i t i v e , p a r t i c u l a r l y s i n c e t h et a r g e t s e q u e n c e f o r a m p l i f i c a t i o n i s r e i t e r a t e d a p p r o x i m a t e l y1 0 0 t i me s p e r g e n o m e . I n t h e p r e s e n t s t u d y , w e h a v e s o u g h tt o d e t e r m i n e w h e t h e r PC R m e t h o d o l o g y c a n a l s o b e a p p l i e dt o d i r e c t d e t e c t i o n o f v i r a l r e s p i r a t o r y p a t h o g e n s , p a r t i c u -l a r l y p a t h o g e n s s u c h a s R SV w h i c h h a v e a n RNA g e n o m e ,t h e r e b y n e c e s s i t a t i n g R T b e f o r e t h e PC R a m p l i f i c a t i o n s t e p .R a p i d d e t e c t i o n o f R SV i s o f g r e a t c l i n i c a l i m p o r t a n c e i n ap e d i a t r i c h o s p i t a l , b e c a u s e i t i s a m a j o r c a u s e o f n o s o c o m i a li n f e c t i o n ; a l s o , a n t i v i r a l t h e r a p y i s e f f e c t i v e a g a i n s t t h i sp a t h o g e n ( 9 ) . T h e R SV c u l t u r e p r o c e d u r e u s e d b y t h e c e n t r a lp a t h o l o g y l a b o r a t o r y i s e x t r e m e l y s e n s i t i v e , b e c a u s e i t i n -v o l v e s t e s t i n g o f c e l l c u l t u r e s f o r v i r u s i n f e c t i o n b y EIA a n de x a m i n a t i o n f o r c y t o p a t h i c e f f e c t . H o w e v e r , t h i s i s a s l o wp r o c e d u r e ; i n t h e p r e s e n t s t u d y , i t t o o k f r o m 3 t o 1 3 d a y s( m e d i a n , 7 d a y s ) f r o m c o l l e c t i o n o f t h e NPA t o p r o d u c e ar e s u l t . T h i s t i m e l a g i s g r e a t e r t h a n t h e mean b e d s t a y o fp a t i e n t s w i t h b r o n c h i o l i t i s ( t h e m o s t commo n R SV i n f e c t i o n )a t t h e A d e l a i d e C h i l d r e n ' s H o s p i t a l ( 4 . 0 d a y s ) , a n d s o i n t h em a j o r i t y o f c a s e s t h e p a t i e n t w o u l d h a v e b e e n d i s c h a r g e df r o m t h e h o s p i t a l b e f o r e t h e c u l t u r e r e s u l t b e c a m e a v a i l a b l e .D i r e c t E T A , a l t h o u g h y i e l d i n g a r e s u l t w i t h i n 2 4 h , was o fl i m i t e d c l i n i c a l v a l u e i n t h e s e c a s e s b e c a u s e o f i t s l o ws e n s i t i v i t y ( a p p r o x i m a t e l y 4 1 % ) .R T - P C R , o n t h e o t h e r h a n d , was b o t h s e n s i t i v e a n ds p e c i f i c f o r RSV. When e x t r a c t s o f d i l u t e d R S V - i n f e c t e d c e l lc u l t u r e s were t e s t e d , t h e RT-PCR a s s a y was c a p a b l e o fd e t e c t i n g a s f e w a s 1 0 T C I D 5 0 s , b u t n e g a t i v e r e s u l t s w e r e

F I G . 4 . RT-PCR o f c u l t u r e - n e g a t i v e NPAs. L a n e s : M, DNA s i z em a r k e r s ( a s i n t h e l e g e n d t o F i g . 1 ) ; - , u n i n f e c t e d H E p - 2 l y s a t e ; 1t o 1 1 , c u l t u r e - n e g a t i v e N P A s ; + , R S V - i n f e c t e d H E p - 2 l y s a t e .

T A B L E 1 . D e t e c t i o n o f R SV i n N PA s b y R T - P C R aC u l t u r e a n d EIA N o . o f s p e c i m e n sr e s u l t ( n ) R T- PC R + RT-PCR -

C u l t u r e + , EIA + ( 4 9 ) 4 7 2C u l t u r e + , EIA - ( 7 6 ) 7 1 5C u l t u r e - , EI A + ( 7 ) 4 3C u l t u r e - , EIA - ( 7 0 ) 2 6 8

a A t o t a l o f 2 0 2 N P A s w e r e a n a l y z e d f o r t h e p r e s e n c e o f RSV b y R T - P C R ,a n d t h e r e s u l t s a r e c o m p a r e d w i t h t h o s e f o r v i r u s c u l t u r e a n d E I A . T h en u m b e r o f s p e c i m e n s y i e l d i n g a p o s i t i v e ( + ) o r n e g a t i v e ( - ) r e s u l t f o r t h ev a r i o u s a s s a y s i s i n d i c a t e d .

o b t a i n e d f o r c e l l c u l t u r e s i n f e c t e d w i t h o t h e r v i r u s e s ( a d e -n o v i r u s , p a r a i n f l u e n z a t y p e s 1 a n d 3 , a n d i n f l u e n z a v i r u s Aa n d B ) . Wh en N PA s w e r e t e s t e d , RT-PCR a n a l y s i s com-p a r e d f a v o r a b l y w i t h c u l t u r e a n d c l e a r l y o u t p e r f o r m e d E I A .M o r e o v e r , t h e s e n s i t i v i t y o f t h e RT-PCR w a s s u c h t h a tu n l i k e t h e E I A , l o w e p i t h e l i a l c e l l c o u n t s i n t h e NPA d i d n o tc o m p r o m i s e p e r f o r m a n c e r e l a t i v e t o c u l t u r e . T h e RT-PCRf a i l e d t o d e t e c t o n l y 7 o f 1 2 5 c u l t u r e - p o s i t i v e c a s e s . T h e s ef a l s e - n e g a t i v e r e s u l t s c o u l d b e d u e t o RNA s e q u e n c e v a r i a -t i o n b e t w e e n s t r a i n s o f R S V , b u t t h i s i s u n l i k e l y b e c a u s e t h es e q u e n c e s o f t h e r e g i o n s o f t h e F g e n e t o w h i c h t h e twop r i m e r s a n n e a l a r e i d e n t i c a l f o r b o t h t h e A a n d B s u b t y p e s o fR SV ( 3 ) . U n f o r t u n a t e l y , w e d i d n o t h a v e a c c e s s t o t h e t i s s u ec u l t u r e e x t r a c t s f r o m t h e R SV c u l t u r e - p o s i t i v e RT-PCR-n e g a t i v e s a m p l e s , w h i c h w o u l d h a v e e n ab l e d c o nf i r ma t i o n o ft h e r e a c t i v i t y o f t h e i s o l a t e d v i r u s i n t h e RT-PCR r e a c t i o n . Amore l i k e l y e x p l a n a t i o n f o r t h e f a l s e n e g a t i v e s , h o w e v e r , i st h a t a s m a l l p r o p o r t i o n o f c u l t u r e - p o s i t i v e N P A s c o n t a i n s of e w v i r u s p a r t i c l e s t h a t t h e y a r e b e l o w t h e s e n s i t i v i t y t h r e s h -o l d o f R T - P C R , w h i c h i s a b o u t 1 0 T C I D 5 0 s .I f t r u e p o s i t i v e s a r e d e f i n e d a s t h o s e w h i c h a r e R SVc u l t u r e p o s i t i v e o r c u l t u r e n e g a t i v e b u t a r e p o s i t i v e b y b o t hRT-PCR a n d E I A , t h e n t h e RT-PCR h a s a s e n s i t i v i t y o f9 4 . 6 % ( c . f . 9 6 . 9 % f o r c u l t u r e a n d 4 1 . 1 % f o r E I A ) a n d as p e c i f i c i t y o f 9 7 . 1 % . T h e R SV c u l t u r e - n e g a t i v e N P A s ( a l lb u t t w o o f w h i c h w e r e n e g a t i v e b y R T - P C R ) i n c l u d e ds p e c i m e n s w h i c h w e r e p o s i t i v e f o r a d e n o v i r u s , p a r a i n f l u -e n z a t y p e s 2 a n d 3 , i n f l u e n z a B v i r u s , a n d r h i n o v i r u s .I n t e r e s t i n g l y , t h e o n l y t w o N P A s w h i c h y i e l d e d a p p a r e n tf a l s e - p o s i t i v e RT-PCR r e s u l t s w e r e f r o m h o s p i t a l i z e d p a -t i e n t s f r o m w h o m n o o t h e r p a t h o g e n was i s o l a t e d b u t w h o s ec l i n i c a l symptoms ( a f e b r i l e i l l n e s s w i t h p r o n o u n c e d u p p e ra n d l o w e r r e s p i r a t o r y symptoms a n d s i g n s ) w e r e e n t i r e l yc o n s i s t e n t w i t h R SV b r o n c h i o l i t i s . I n b o t h c a s e s , t h e NPAwa s c o l l e c t e d a t l e a s t 7 d a y s a f t e r o n s e t , a n d h e n c e v i r a l

F I G . 5 . RT-PCR o f R SV c u l t u r e - p o s i t i v e , E I A - n e g a t i v e NPAs.L a n e s : M , DNA s i z e m a r k e r s ( a s i n t h e l e g e n d t o F i g . 1 ) ; - ,u n i n f e c t e d H E p - 2 l y s a t e ; 1 a n d 2 , c u l t u r e - p o s i t i v e , E I A - n e g a t i v eN P A s ; + , R S V - i n f e c t e d H E p - 2 l y s a t e .

V O L . 3 0 , 1 9 9 2

8/8/2019 A Rapid Method for Detection of Respiratory Syncytial Virus

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9 0 4 P A T O N ET AL.s h e d d i n g ma y h a v e d i m i n i s h e d b y t h i s s t a g e . A l t e r n a t i v e l y ,R SV v i a b i l i t y ma y h a v e b e e n l o s t d u r i n g t r a n s p o r t , o ri n f e c t i v i t y may h a v e b e e n c o m p r o m i s e d b y t h e p r e s e n c e o fs e c r e t o r y a n t i b o d i e s i n t h e NPA c ap ab l e o f b l o c k i n g v i r u sa d s o r p t i o n . T h e s e l a t t e r e v e n t s s e e m a d i s t i n c t p o s s i b i l i t y ,s i n c e a f u r t h e r f o u r N P A s w e r e c u l t u r e n e g a t i v e f o r R SV b u tw e r e p o s i t i v e b y b o t h EIA a n d R T - P C R . T h u s , t h e a b o v ee s t i m a t e o f t h e s p e c i f i c i t y o f RT-PCR ( 9 7 . 1 % ) m u s t b ec o n s i d e r e d a m i n i m u m .T h e m a j o r a d v a n t a g e o f RT-PCR o v e r v i r u s c u l t u r e ,h o w e v e r , i s i t s s p e e d ; a n RT-PCR r e s u l t i s a v a i l a b l e w i t h i n 8t o 2 4 h , d e p e n d i n g o n t h e t i m e o f r e c e i p t o f t h e s p e c i m e n .T h u s , RT-PCR i s a s r a p i d a s t h e a l t e r n a t i v e d i r e c t d e t e c t i o np r o c e d u r e , E I A , b u t h a s v a s t l y s u p e r i o r s e n s i t i v i t y t o E I A .T h e c l e a r o u t p e r f o r m a n c e o f EI A b y RT-PCR was u n e x -p e c t e d , b e c a u s e i t c o u l d b e a r g u e d t h a t t h e a d v a n t a g e s o fa m p l i f i c a t i o n o f v i r a l n u c l e i c a c i d m i g h t b e a t l e a s t p a r t i a l l yo f f s e t b y t h e l a b i l i t y o f t h e RNA i n t h e NPA. A l s o , e a c hv i r i o n c o n t a i n s a l a r g e n u m b e r o f EIA t a r g e t m o l e c u l e s b u to nl y o n e RT-PCR t a r g e t . N o t w i t h s t a n d i n g t h e s e c o n s i d e r -a t i o n s , t h e r e s u l t s o f t h i s s t u d y i n d i c a t e t h a t RT-PCR h a sg r e a t p o t e n t i a l f o r t h e r a p i d d i a g n o s i s o f R SV i n f e c t i o n .

A C K N O W LEDGMEN TSW e t h a n k L i n d a W u r f el f o r t e c h n i c a l a s s i s t a n c e .T h i s w o r k was s u p p o r t e d b y g r a n t s f r o m t h e C h a nn el S e v e nC h i l d r e n ' s R e s e a r c h F o u n d at i o n a n d t h e A d e l a i d e C h i l d r e n ' s H o s -p i t a l R e s e a r c h F o u n d a t i o n .

REFERENCES1 . G l a r e , E . M . , J . C . P a t o n , R . R . P r e m i e r , A . J . L a w r e n c e , a n dI . T . N i s b e t . 1 9 9 0 . A n a l y s i s o f a r e p e t i t i v e DNA s e q u e n c e f r o m

B o r d e t e l l a p e r t u s s i s a n d i t s a p p l i c a t i o n t o t h e d i a g n o s i s o f p e r -t u s s i s u s i n g t h e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n . J . C l i n . M i c r o b i o l .2 8 : 1 9 8 2 - 1 9 8 7 .2 . G o l d w a t e r , P . N . , A . J . M ar t i n , B . R y a n , S . M o r r i s , J . T h o m p s o n ,T . W. K o k , a n d C . J . B u r r e l l . 1 9 9 1 . A s u r v e y o f n o s o c o m i a lr e s p i r a t o r y v i r a l i n f e c t i o n s i n a c h i l d r e n ' s h o s p i t a l : o c c u l t r e s p i -r a t o r y i n f e c t i o n i n p a t i e n t s a dm i tt e d d u r i ng a n e p i d e m i c s e a s o n .I n f e c t . C o n t r o l H o s p . E p i d e m i o l . 1 2 : 2 3 1 - 2 3 8 .3 . J o h n s o n , P . R . , a n d P . L . C o l l i n s . 1 9 8 8 . T h e f u s i o n g l y c o p r o t e i n so f h u m a n r e s p i r a t o r y s y n c y t i a l v i r u s o f s u b g r o u p s A a n d B :s e q u e n c e c o n s e r v a t i o n p r o v i d e s a s t r u c t u r a l b a s i s f o r a n t i g e n i cr e l a t e d n e s s . J . G e n . V i r o l . 6 9 : 2 6 2 3 - 2 6 2 8 .4 . J o h n s t o n , S . L . G . , a n d C . S . S i e g e l . 1 9 9 0 . E v a l u a t i o n o f d i r e c ti m m u n o f l u o r e s c e n c e , e n z y m e i m m u n o a s s a y , c e n t r i f u g a t i o n c u l -t u r e , a n d c o n v e n t i o n a l c u l t u r e f o r t h e d e t e c t i o n o f r e s p i r a t o r ys y n c y t i a l v i r u s . J . C l i n . M i c r o b i o l . 2 8 : 2 3 9 4 - 2 3 9 7 .5 . R o t h b a r t h , P . H . , M . - C . H e r m u s , a n d P . S c h r j n e m a k e r s . 1 9 9 1 .R e l i a b i l i t y o f t w o n ew t e s t k i t s f o r r a p i d d i a g n o s i s o f r e s p i r a t o r ys y n c y t i a l v i r u s i n f e c t i o n . J . C l i n . M i c r o b i o l . 2 9 : 8 2 4 - 8 2 6 .6 . S m i t h , M. C . , C . C r e u t z , a n d Y . T . H u a n g . 1 9 9 1 . D e t e c t i o n o fr e s p i r a t o r y s y n c y t i a l v i r u s i n n a s o p h a r y n g e a l s e c r e t i o n s b y s h e l lv i a l t e c h n i q u e . J . C l i n . M i c r o b i o l . 2 9 : 4 6 3 - 4 6 5 .7 . T a k i m o t o , S . , M. G r a n d i e n , M. A . I s h i d a , M. S . P e r e i r a , T . M.P a i v a , T . I s h i m a r u , E . M. M a k i t a , a n d C . H . 0 . M a r t i n e z . 1 9 9 1 .C o m p a r i s o n o f e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y , i n d i r e c t

i m m u n o f l u o r e s c e n c e a s s a y , a n d v i r u s i s o l a t i o n f o r d e t e c t i o n o fr e s p i r a t o r y v i r u s e s i n n a s o p h a r y n g e a l s e c r e t i o n s . J . C l i n . M i c r o -b i o l . 2 9 : 4 7 0 - 4 7 4 .8 . T h o m a s , E . E . , a n d L . E . B o o k . 1 9 9 1 . C o m p a r i s o n o f t w o r a p i dm e t h o d s f o r d e t e c t i o n o f r e s p i r a t o r y s y n c y t i a l v i r u s ( R S V )( T e s t P a c k R SV a n d O r t h o R SV E L I S A ) w i t h d i r e c t i m m u n o f l u -o r e s c e n c e a n d v i r u s i s o l a t i o n f o r t h e d i a g n o s i s o f p e d i a t r i c R SVi n f e c t i o n . J . C l i n . M i cr o b i o l . 2 9 : 6 3 2 - 6 35 .9 . W e l l i v e r , R . C . 1 9 8 8 . D e t e c t i o n , p a t h o g e n e s i s a n d t h e r a p y o fr e s p i r a t o r y s y n c y t i a l v i r u s i n f e c t i o n s . C l i n . M i c r o b i o l . R e v . 1 : 2 7 -3 9 .

J . C L I N . M I C R O B I O L .