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8/2/2019 A Truncated Intracellular HER2neu Receptor Produced by Alternative RNA Processing Affects Growth of Human Carci

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MOLECULAR A ND C E L L U L A R B I O L O G Y , A p r . 1 9 9 3 , p . 2 2 4 7 - 2 2 5 70 2 7 0 - 7 3 0 6 / 9 3 / 0 4 2 2 4 7 - 1 1 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 9 3 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

A T r u n c a t e d I n t r a c e l l u l a r H E R 2 / n e u R e c e p t o r Produced byA l t e r n a t i v e RNA P r o c e s s i n g A f f e c t s Growtho f Human C a r c i n o m a C e l l sGARY K. S C O T T , 1 ROBERT ROBLES,' JOHN W. P A R K , " 1 2 PAMELA A. MONTGOMERY,' JANICE DANIEL,'WILLIAM E . HOL M ES,2 JAMES LEE,2 G I L B E R T A . K E L L E R ,2 WEN-LU L I , 2 BRIAN M . FENDLY,2WIL L I A M I . WOOD,2 H . MICHAEL SHEPARD,2 AND CHRISTOPHER C . B E N Z ` *

C a n c e r R e s e a r c h I n s t i t u t e , U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a , San F r a n c i s c o , C a l i f o r n i a 9 4 1 4 3 - 0 1 2 8 , 'a n d G e n e n t e c h , I n c . , S o u t h San F r a n c i s c o , C a l i f o r n i a 9 4 0 8 0 2R e c e i v e d 1 7 S e p t e m b e r 1 9 9 2 / R e t u r n e d f o r m o di f i ca t i o n 2 3 O c t o b e r 1 9 9 2 / A c c e p t e d 3 0 December 1 9 9 2

C l o n e d sequences e n c o d i n g a t r u n c a t e d f o r m o f t h e HER2 r e c e p t o r w e r e o b t a i n e d f r o m c DN A l i b r a r i e sd e r i v e d f r o m t w o H E R 2 - o v e r e x p r e s s i n g human b r e a s t cancer c e l l l i n e s , B T - 4 7 4 and S K - B R - 3 . Th e 5 ' 2 . 1 k bo f t h e e n c o d e d t r a n s c r i p t i s i d e n t i c a l t o t h a t o f f u l l - l e n g t h 4 . 6 - k b H E R2 t r a n s c r i p t and would b e e x p e c t e d t op r o d u c e a s e c r e t e d f o r m o f HER2 r e c e p t o r c o n t a i n i n g o n l y t h e e x t r a c e l l u l a r l i g a n d b i n d i n g domain ( E C D ) . The3 ' e n d o f t h e t r u n c a t e d t r a n s c r i p t d i v e r g e s 6 1 n u c l e o t i d e s b e f o r e t h e r e c e p t o r ' s t r a n s m e m b r a n e r e g i o n , r e a d st h r o u g h a consensus s p l i c e d o n o r s i t e c o n t a i n i n g an i n - f r a m e s t o p c o d o n , a n d c o n t a i n s a p o l y ( A ) a d d i t i o n s i t e ,s u g g e s t i n g t h a t t h e t r u n c a t e d t r a n s c r i p t a r i s e s b y a l t e r n a t i v e RNA p r o c e s s i n g . S i n u c l e a s e p r o t e c t i o n a s s a y ss h o w a 4 0 - f o l d v a r i a t i o n i n t h e a b u n d a n c e o f t h e t r u n c a t e d 2 . 3 - k b t r a n s c r i p t r e l a t i v e t o f u l l - l e n g t h 4 . 6 - k bt r a n s c r i p t i n a p a n e l o f e i g h t H E R 2 - e x p r e s s i n g tumor c e l l l i n e s o f g a s t r i c , o v a r i a n , a n d b r e a s t cancer o r i g i n .E x p r e s s i o n o f t h i s t r u n c a t e d t r a n s c r i p t i n COS-1 c e l l s p r o d u c e s b o t h s e c r e t e d a n d i n t r a c e l l u l a r f o r m s o f HER2ECD; h o w e v e r , i m m u n o f l u o r e s c e n t l a b e l i n g o f HER2 E C D p r o t e i n i n MKN7 tumor c e l l s t h a t n a t i v e l yoverexpress t h e 2 . 3 - k b t r a n s c r i p t s u g g e s t s t h a t t r a n s c r i p t i o n a i l y g e n e r a t e d HER2 E C D i s c o n c e n t r a t e d w i t h i nt h e p e r i n u c l e a r c y t o p l a s m . M e t a b o l i c l a b e l i n g a n d e n d o g l y c o s i d a s e s t u d i e s s u g g e s t t h a t t h i s HER2 E C D ( 1 0 0k D a ) u n d e r g o e s d i f f e r e n t i a l t r a f f i c k i n g b e t w e e n t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m a n d G o l g i c o m p a r t m e n t s c o m p a r e dw i t h f u l l - l e n g t h ( 1 8 5 - k D a ) HER2 r e c e p t o r . T r a n s f e c t i o n s t u d i e s i n d i c a t e t h a t excess p r o d u c t i o n o f HER2 E C Di n human tumor c e l l s o v e r e x p r e s s i n g f i l l - l e n g t h HER2 r e c e p t o r c an r e s u l t i n r e s i s t a n c e t o t h e g r o w t h - i n h i b i t i n ge f f e c t s o f a n t i - H E R 2 m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s s u c h as muMAb4D5. T h e s e f i n d i n g s d e m o n s t r a t e a l t e r n a t i v ep r o c e s s i n g o f t h e HER2 t r a n s c r i p t a n d i m p l i c a t e a p o t e n t i a l l y i m p o r t a n t g r o w t h r e g u l a t o r y r o l e f o ri n t r a c e l l u l a r l y s e q u e s t e r e d HER2 E C D i n H E R 2 - a m p l i f i e d human t u m o r s .

The HER2 ( n e u , c - e r b B - 2 ) p r o t o - o n c o g e n e e n c o d e s a1 8 5 - k D a t r a n s m e m b r a n e p r o t e i n t y r o s i n e k i n a s e r e c e p t o rw i t h e x t e n s i v e h o m o l o g y t o t h e e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r( E G F ) r e c e p t o r , HER1 ( 4 , 6 , 2 0 , 3 6 ) . The n e e d t o u n d e r s t a n dt h e r o l e o f t h e H E R2 r e c e p t o r , a n d i t s g r o w t h - r e g u l a t i n gl i g a n d ( s ) ( 1 5 , 2 7 , 3 2 ) , i s u n d e r s c o r e d b y t h e p r e v a l e n c e o fHER2 DNA a m p l i f i c a t i o n i n a v a r i e t y o f human e p i t h e l i a lcancers, i n c l u d i n g t h o s e o f o v a r i a n , g a s t r o i n t e s t i n a l , a n dmammary o r i g i n , i n w h i c h t h e o v e r e x p r e s s e d r e c e p t o r con-t r i b u t e s t o a g g r e s s i v e tumor g r o w t h a n d r e d u c e d p a t i e n ts u r v i v a l ( 1 3 , 3 7 ) . M o r e o v e r , n e w l y d e v e l o p e d a n t i - H E R 2m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t h a t b i n d w i t h h i g h a f f i n i t y t o t h er e c e p t o r ' s e x t r a c e l l u l a r d o m a i n ( E C D ) r e s u l t i n b o t h i n v i t r oa n d i n v i v o g r o w t h i n h i b i t i o n o f H E R 2 - o v e r e x p r e s s i n g t u -mors ( 1 0 , 1 4 , 1 7 , 3 1 , 3 8 ) . One o f t h e s e m u r i n e m o n o c l o n a la n t i b o d i e s , muMAb4D5, i s now i n v o l v e d i n c l i n i c a l t e s t i n gf o r t h e t r e a t m e n t o f p a t i e n t s w i t h H E R 2 - o v e r e x p r e s s i n gb r e a s t a n d o v a r i a n cancers ( 3 1 ) .Tumors a n d c e l l l i n e s o v e r e x p r e s s i n g t r a n s m e m b r a n eg r o w t h f a c t o r r e c e p t o r s o f t e n r e l e a s e t r u n c a t e d r e c e p t o rECD. T h e t r u n c a t e d f o r m s o f t h e s e r e c e p t o r s may a r i s e b yp r o t e o l y t i c c l e a v a g e o f t h e f u l l - l e n g t h r e c e p t o r , as f o r c o l o -n y - s t i m u l a t i n g f a c t o r 1 a n d i n t e r l e u k i n - 2 r e c e p t o r s ( 7 , 2 6 ,3 4 ) , a n d / o r b y a l t e r n a t e s p l i c i n g o f r e c e p t o r t r a n s c r i p t i n t o af o r m t h a t e l i m i n a t e s t h e t r a n s m e m b r a n e a n d c y t o p l a s m i c

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .

d o m a i n s , as h a s b e e n s h o w n f o r i n t e r l e u k i n - 4 , F c , a n d E G Fr e c e p t o r s ( 2 9 , 3 0 , 3 3 ) . S o l u b l e HER2 E C D i s r e l e a s e d f r o mH E R 2 - o v e r e x p r e s s i n g tumor c e l l s i n v i t r o a n d i n v i v o ( 1 , 2 4 ,4 1 ) , a n d t h e m e c h a n i s m f o r t h i s i s t h o u g h t t o i n v o l v e s u r f a c ep r o t e o l y s i s o f t h e 1 8 5 - k D a r e c e p t o r ( 4 1 ) . L a r g e l y u n e x p l o r e dar e t h e p o t e n t i a l p h y s i o l o g i c a l e f f e c t s o f t r u n c a t e d g r o w t hf a c t o r r e c e p t o r s , w h i c h m i g h t i n v o l v e e x t r a c e l l u l a r compe-t i t i o n f o r c o g n a t e l i g a n d ( 5 ) o r i n t r a c e l l u l a r d o m i n a n t - n e g a -t i v e s u p p r e s s i o n o f r e c e p t o r f u n c t i o n b y h e t e r o d i m e r f o r m a -t i o n ( 1 1 , 2 0 ) .We r e p o r t h e r e t h e i s o l a t i o n o f c l o n e s e n c o d i n g a t r u n -c a t e d E C D f o r m o f t h e HER2 r e c e p t o r f r o m c DN A l i b r a r i e sp r e p a r e d f r o m two H E R 2 - o v e r e x p r e s s i n g human b r e a s t can-c e r c e l l l i n e s , B T - 4 7 4 a n d S K - B R - 3 . T h e t r u n c a t e d HER2E C D t r a n s c r i p t appears t o b e p r o d u c e d b y an a l t e r n a t i v eRNA p r o c e s s i n g m e c h a n i s m i n w h i c h an e x o n e x t e n d st h r o u g h a s p l i c e s i t e u t i l i z e d b y t h e f u l l - l e n g t h t r a n s c r i p t ,p r o v i d i n g an i n - f r a m e s t o p c o d o n a n d an a l t e r n a t e p o l y ( A )a d d i t i o n s i t e . T h e 2 . 3 - k b t r u n c a t e d HER2 t r a n s c r i p t i s v a r i -a b l y e x p r e s s e d i n a p a n e l o f human e p i t h e l i a l c an c e r c e l ll i n e s a n d p r o d u c e s i n t r a c e l l u l a r HER2 E C D p r o t e i n o f a b o u t1 0 0 k D a . T r a n s f e c t i o n s t u d i e s s u g g e s t t h a t e x c e s s p r o d u c -t i o n a n d i n t r a c e l l u l a r r e t e n t i o n o f 1 0 0 - k D a HER2 E C D i ntumor c e l l s o v e r e x p r e s s i n g 1 8 5 - k D a HER2 r e c e p t o r r e s u l t si n r e s i s t a n c e t o t h e g r o w t h - i n h i b i t i n g e f f e c t s o f t h e a n t i -H E R2 m o n o c l o n a l a n t i b o d y muMAb4D5. T h e s e f i n d i n g sd e m o n s t r a t e a p o t e n t i a l l y i m p o r t a n t g r o w t h r e g u l a t o r y r o l ef o r a l t e r n a t i v e p r o c e s s i n g o f t h e HER2 t r a n s c r i p t a n d t h e

2 2 4 7

V o l . 1 3 , N o . 4


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2 2 4 8 SCOTT ET AL.i n t r a c e l l u l a r p r o d u c t i o n o f HER2 E C D i n H E R 2 - o v e r e x -p r e s s i n g h u m a n t u m o r s .

MATERIALS A ND METHODSC e l l l i n e s . Human b r e a s t c a r c i n o m a l i n e s S K - B R - 3 , B T -4 7 4 , M C F - 7 , M D A - M B - 4 5 3 , M D A - M B - 4 6 8 , a n d T47D a n d

t h e o v a r i a n c a r c i n o m a c e l l s S K - O V - 3 w e r e o b t a i n e d f r o mt h e A m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n ( R o c k v i l l e , M d . ) a n dm a i n t a i n e d a s r e c o m m e n d e d . T h e h u m a n g a s t r i c c a r c i n o m ac e l l l i n e M K N 7 w a s p r o v i d e d b y T . Yamamoto ( 4 0 ) . C e l lg r o w t h a s s a y s i n t h e p r e s e n c e o f t h e a n t i - H E R 2 m u r i n em o n o c l o n a l a n t i b o d y muMAb4D5 w e r e p e r f o r m e d a s p r e v i -o u s l y d e s c r i b e d ( 3 5 ) .cDNA c l o n i n g a n d s e q u e n c i n g . cDNA l i b r a r i e s w e r e p r e -p a r e d f r o m p o l y ( A ) RNA d e r i v e d f r o m t h e H E R 2 - o v e r e x -p r e s s i n g h u m a n b r e a s t c a n c e r c e l l l i n e s B T - 4 7 4 a n d S K -B R- 3 . R e v er s e t r a n s c r i p t i o n o f R NA i n t o cDNA w a sp e r f o r m e d a s d e s c r i b e d b y G u b l e r a n d H o f f m a n n ( 1 2 ) . B l u n t -e n d e d cDNA f r o m B T - 4 7 4 p o l y ( A ) RNA w a s l i g a t e d t oh e m i p h o s p h o r y l a t e d E c o R I a d a p t o r s ( P r o m e g a , M a d i s o n ,W i s . ) a n d c l o n e d i n t o t h e A g t l O p h a g e v e c t o r s y s t e m . B l u n t -e n d e d cDNA f r o m S K - B R - 3 w a s l i g a t e d t o B s t X I a d a p t o r sa n d c l o n e d i n t o p R K 5 , a n e x p r e s s i o n p l a s m i d u s i n g t h ec y t o m e g a l o v i r u s p r o m o t e r / e n h a n c e r w i t h s i m i a n v i r u s 4 0( S V 4 0 ) t e r m i n a t i o n a n d p o l y a d e n y l a t i o n s i g n a l s l o c a t e dd o w n s t r e a m o f t h e i n s e r t e d cDNA. C l o n e s f r o m t h e B T - 4 7 4A g t l O l i b r a r y w h i c h h y b r i d i z e d t o t h e 5 ' HER2 cDNA p r o b eX M A C 1 4 - 1 ( 2 1 ) , b u t d i d n o t h y b r i d i z e t o a 3 ' HER2 cDNAp r o b e ( 8 0 0 - b p P s t I - E c o R I f r a g m e n t b e g i n n i n g 4 5 b p d o w n -s t r e a m f r o m t h e t r a n s m e m b r a n e c o d i n g d o m a i n ) , w e r e s e -l e c t e d f o r f u r t h e r a n a l y s i s . From t h e S K - B R - 3 pRK5 e x p r e s -s i o n l i b r a r y , p o o l s o f cDNA c l o n e s w e r e t r a n s f e c t e d b y u s i n gD E A E - d e x t r a n i n t o C O S - 1 c e l l s . C o n d i t i o n e d m e d i a w e r ec o l l e c t e d , c o n c e n t r a t e d 4 0 - f o l d i n 1 0 - k D a - c u t o f f M i c r o s e pf i l t e r s ( F i l t r o n T e c h n o l o g y C o r p . , N o r t h b o r o u g h , M a s s . ) ,a n d s c r e e n e d f o r i n h i b i t i o n o f S K - B R - 3 c e l l b i n d i n g t oi o d i n a t e d muMAb4D5, w h i c h r e c o g n i z e s o n l y t h e e x t r a c e l -l u l a r d o m a i n o f HER2 ( 1 7 ) . F r o m o n e p o o l t h a t p r o d u c e d am a r k e d r e d u c t i o n i n c e l l s u r f a c e a n t i b o d y b i n d i n g , s u c c e s -s i v e r o u n d s o f s e r i a l d i l u t i o n r e s u l t e d i n t h e i s o l a t i o n o f as i n g l e c l o n e , p W 5 9 7 . 3 A , w h o s e s e c r e t e d p r o t e i n p r o d u c tr e p r e s s e d muMAb4D5 b i n d i n g t o t h e HER2 r e c e p t o r o nS K - B R - 3 c e l l s . E c o R I i n s e r t s f r o m cDNA c l o n e s w e r es u b c l o n e d i n t o pBSKS- ( S t r a t a g e n e , L a J o l l a , C a l i f . ) a n ds e q u e n c e d b y t h e d i d e o x y t e c h n i q u e ( S e q u e n a s e ; U . S . B i o -c h e m i c a l , C l e v e l a n d , O h i o ) , w i t h e i t h e r s i n g l e - s t r a n d e dp h a g e o r d o u b l e - s t r a n d e d p l a s m i d ( p r e p a r e d b y M a g i c M i n iP r e p s ; P r o m e g a ) a s t h e t e m p l a t e a n d u s i n g i n s e r t f l a n k i n gp r i m e r s ( M 1 3 f o r wa r d a nd r e v e r s e p r i m e r s ) a n d p r i m e r sp r e p a r e d f r o m t h e HER2 cDNA s e q u e n c e ( 6 ) .P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) a n a l y s i s . DNA s a m p l e s( 0 . 1 , u g o f B T - 4 7 4 DNA a n d 1 , u g o f h u m a n p l a c e n t a DNA)w e r e c o m b i n e d w i t h 5 0 p m o l o f b o t h a 3 ' p r i m e r ( 5 ' -CCTl'17ATAGTAAGAGCCCC-3') d e s i g n e d t o p r i m e 7 8 b p3 ' o f t h e d i v e r g e n c e a n d a 5 ' p r i m e r (5'-TGAGGAGGGCGC A T G C C A - 3 ' ) d e s i g n e d t o p r i m e 4 5 b p 5 ' o f t h e d i v e r g e n c ei n a 5 0 - , u l r e a c t i o n v o l u m e c o n t a i n i n g 1 0 mM T r i s ( p H 8 . 3 ) ,1 . 5 mM M g C l , 5 0 mM K C l , 0 . 0 0 1 % g e l a t i n , 2 0 0 , u M e a c hd e o x y n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e a n d 1 U o f A m p l i T a q ( P e r k i n -E l m e r / C e t u s ) , a n d s a m p l e r e a c t i o n s w e r e s u b j e c t e d t o 3 4t h e r m a l c y c l e s ( 1 m i n a t 9 4 C , 1 . 5 m i n a t 4 8 C , a n d 1 m i n a t7 2 C ) . A l i q u o t s ( 7 , u l ) w e r e t h e n e l e c t r o p h o r e s e d t h r o u g h a12% p o l y a c r y l a m i d e g e l i n l x TB E ( 0 . 0 9 M T r i s , 0 . 0 9 Mb o r i c a c i d , 0 . 0 0 2 M E D T A ) . A f t e r e l e c t r o p h o r e s i s , t h e g e lw a s t r e a t e d w i t h 5 0 mM NaOH f o r 1 0 m i n ( 8 ) , n e u t r a l i z e d i n

l x T B E , a n d t h e n e l e c t r o b l o t t e d t o Hybond ( A m e r s h a m ,A r l i ng t o n H e i g h t s, I l l . ) i n l x T B E . T h e DNA w a s UVc r o s s - l i n k e d t o t h e f i l t e r a nd p r o b ed w i t h t h e 3 ' - t e r m i n a ls e q u e n c e s f r o m t h e t r u n c a t e d HER2 cDNA. F i n a l f i l t e rw a s h i n g w a s a t 6 8 C i n 0 . 2 x SSC ( l x SSC i s 0 . 1 5 M N a C lp l u s 0 . 0 1 5 M s o d i u m c i t r a t e ) - 1 % s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e( S D S ) .R NA a n a l y s i s b y N o r t h e r n ( R N A ) b l o t t i n g a n d S 1 n u c l e a s ep r o t e c t i o n . T o t a l RNA w a s p r e p a r e d b y t h e g u a n i d i n i u mi s o t h i o c y a n a t e - C s C l s t e p - g r a d i e n t t e c h n i q u e a n d N o r t h e r nb l o t t e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 2 5 , 3 6 ) . T e n m i c r o g r a m s o ft o t a l RNA w a s e l e c t r o p h o r e s e d t h r o u g h 1 . 0 % a g a r o s e f o r m -a l d e h y d e g e l s , t r a n s f e r r e d t o a H y b o n d m e m b r a n e ( A m e r -s h a m ) , a n d UV c r o s s - l i n k e d , a n d t h e f i l t e r s w e r e t h e n p r o b e di n 50 % f o r m a m i d e - 5 x SSC - 1% S DS a t 4 2 C . F i l t e r s w e r eg i v e n f i n a l w a s h e s a t 6 8 C i n 0 . 2 x SSC-1% S D S . P r e p a r a -t i o n o f s i n g l e - s t r a n d e d DNA p r o b e s f o r S 1 n u c l e a s e p r o t e c -t i o n a s s a y w e r e g e n e r a t e d b y u s i n g a v a r i a t i o n o f t h ep r o c e du r e b a s e d o n p r i m i n g s i n g l e - s t r a n d e d p h a g e DNA. A1 9 6 - b p P p u M I - X h o I I f r a g m e n t f r o m p W 5 9 7 . 3 A , i n w h i c h t h ePpuMI s i t e w a s f i l l e d b y K l e n o w e n z y m e p r i o r t o X h o I Id i g e s t i o n , w a s c l o n e d i n t o H i n c I I - B a m H I - d i g e s t e d p t z 1 8 R

( P h a r m a c i a ) t o p r o d u c e p t z l 8 R W 5 ; t h i s f r a g m e n t w a s t h e nd i g e s t e d w i t h H i n d I I I , p u r i f i e d , a n d s u b j e c t e d t o e x o n u c l e -a s e I I I d i g e s t i o n t o u n c o v e r t h e r e v e r s e p r i m i n g s i t e 2 8 1 b pd o w n s t r e a m o f t h e H i n d I I I c u t s i t e . To 0 . 1 j i g o f e x o n u c l e a s eI I I - d i g e s t e d p t z 1 8 R W 5 , 1 p m o l o f M1 3 r e v e r s e p r i m e r ( 1 7 -m e r ; B o e h r i n g e r M a n n h e i m B i o c h e m i c a l s , I n d i a n a p o l i s ,I n d . ) w a s a n n e a l e d ( 5 0 C , 3 0 m i n ) a n d t h e n e x t e n d e d w i t hK l e n o w e n z y m e , u s i n g [ a - 3 2 P ] d C T P ( 8 0 0 C i / m m o l ) a s t h er a d i o l a b e l e d n u c l e o t i d e . T h e r e a c t i o n w a s t h e n b o i l e d i n a ne q u a l v o l u m e o f f o r m a m i d e l o a d i n g b u f f e r ( 9 5 % f o r m a m i d e ,1 mM EDTA [ p H 8 . 0 ] ) a n d e l e c t r o p h o r e s e d o n a 5% p o l y -a c r y l a m i d e - 8 M u r e a g e l . T h e 2 8 1 - n u c l e o t i d e ( n t ) s i n g l e -s t r a n d e d DNA b a n d w a s e x c i s e d ( o t h e r r a d i o l a b e l e d b a n d sw e r e > 2 . 7 k b ) a n d p u r i f i e d , a n d a p p r o x i m a t e l y 5 x 1 0 4 cpmo f t h e s i n g l e - s t r a n d e d DNA p r o b e w a s a d d e d t o 3 0 j i g o fs a m p l e RNA. T h e s a m p l e m i x t u r e w a s p r e c i p i t a t e d w i t he t h a n o l , r e s u s p e n d e d i n h y b r i d i z a t i o n b u f f e r [ 4 0 mM p i p e r -a z i n e - N , N ' - b i s ( 2 - e t h a n e s u l f o n i c a c i d ) ( P I P E S ; pH 6 . 4 ) , 0 . 4M N a C l , 1 mM EDTA, 8 0 % f o r m a m i d e ] , a n d i n c u b a t e d f o r1 5 h a t 5 8 C ; 3 0 0 , u o f S 1 n u c l e a s e b u f f e r ( 5 0 mM s o d i u ma c e t a t e [ p H 4 . 6 ] , 0 . 3 M N a C l , 4 . 5 mM Z n S O 4 ) c o n t a i n i n g 2 0 0U o f S 1 e n z y m e p e r m l w a s a d d e d t o e a c h h y b r i d i z a t i o nr e a c t i o n , a n d t h e m i x t u r e w a s i n c u b a t e d a t 2 3 C f o r 3 0 m i n .T h e S 1 d i g e s t i o n w a s t e r m i n a t e d b y p h e n o l - c h l o r o f o r me x t r a c t i o n , e t h a n o l p r e c i p i t a t e d i n t h e p r e s e n c e o f 3 j i g o fs h e a r e d s a l m o n s p e r m DNA, r e s u s p e n d e d i n 1 0 V I o f f o r m a -m i d e l o a d i n g b u f f e r , b o i l e d , a n d e l e c t r o p h o r e s e d o n a 5%p o l y a c r y l a m i d e - 8 M u r e a g e l . T h e g e l was t h e n d r i e d a n da u t o r a d i o g r a p h e d , a n d b a n d s ( 2 8 1 , 1 8 1 , a n d 1 2 5 n t ) w e r eq u a n t i t a t e d b y s c a n n i n g d e n s i t o m e t r y t o d e t e r m i n e t h e r a t i oo f f u l l - l e n g t h t o t r u n c a t e d HER2 t r a n s c r i p t ( 1 2 5 - n t b a n d /1 8 1 - n t b a n d ) . B e c a u s e o f t h e a d d e d l e n g t h a n d r e s u l t a n ts i g n a l i n t e n s i t y o f t h e p r o t e c t e d 1 8 1 - n t f r a g m e n t , t h e s ed e n s i t o m e t r y r a t i o s w e r e c o r r e c t e d b y a f a c t o r o f 1 . 6 t oc a l c u l a t e t h e t r u e HER2 t r a n s c r i p t r a t i o s .C e l l t r a n s f e c t i o n , p r o t e i n e x p r e s s i o n , a n d i m m u n o b l o t t i n g .E x p r e s s i o n p l a s m i d p W 5 9 7 . 3 A was t r a n s i e n t l y t r a n s f e c t e di n t o C O S - 1 c e l l s b y D E A E - d e x t r a n ; 3 d a y s a f t e r C O S - 1t r a n s f e c t i o n , t h e m e d i u m was r e p l a c e d w i t h s e r u m - f r e em e d i u m a n d i n c u b a t i o n c o n t i n u e d f o r a n o t h e r 2 4 h . T h ec o n d i t i o n e d m e d i u m w a s t h e n c o l l e c t e d a n d c o n c e n t r a t e d3 5 - f o l d b y u s i n g 1 0 - k D a - c u t o f f M i c r o s e p f i l t e r s . C e l l l y s a t e so f t h e t r a n s f e c t e d C O S - 1 c e l l s ( C - p W 5 9 7 . 3 A ) w e r e p r e p a r e db y r i n s i n g t h e c e l l s i n l x p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e ( P B S )

MOL. C E L L . B I O L .


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E CT OD O M AI N P R O D U C E D BY TRUNCATED HER2 TRANSCRIPT 2 2 4 9a n d t h e n h a r v e s t i n g t h e c e l l s i n c e l l l y s i s b u f f e r ( 2 0 M T r i s[ p H 8 . 0 ] , 1 3 7 mM N a C l , 0 . 1 % S D S , 1 % N o n i d e t P - 4 0 ) .MDA-MB-453, S K - B R - 3 , a n d B T - 4 7 4 c u l t u r e s w e r e p e r m a -n e n t l y t r a n s f e c t e d w i t h p W 5 9 7 . 3 A b y c a l c i u m p h o s p h a t ep r e c i p i t a t i o n ( 2 5 ) . MDA-MB-453 a n d S K - B R - 3 c e l l s w e r ec o t r a n s f e c t e d w i t h a c o n t r o l ( s e l e c t a b l e ) e x p r e s s i o n p l a s m i dc o n t a i n i n g a n e o m y c i n p h o s p h o t r a n s f e r a s e g e n e ( n e o ) u n d e rSV40 p r o m o t e r c o n t r o l ( 5 , u g o f p W 5 9 7 . 3 A p l u s 0 . 5 , u g o fSV40 n e o ) , a n d t r a n s f e c t a n t s ( M D A - 4 5 3 / M 8 , M D A - 4 5 3 /M 1 2 , a n d S K - B R - 3 / S 3 ) were s e l e c t e d b y c o n t i n u o u s c u l t u r ee x p o s u r e t o 8 0 0 , u g o f G 4 1 8 ( G e n e t i c i n ; GIBCO) p e r m l .T r a n s f e c t e d B T - 4 7 4 c u l t u r e s w e r e n o t c o t r a ns f e ct e d w i t hS V 4 0 n e o b u t were i n s t e a d s u b j e c t e d 2 4 h a f t e r t r a n s f e c t i o nt o s e l e c t i o n c y c l e s c o n s i s t i n g o f 1 0 d a y s o f c o n t i n u o u se x p o s u r e t o 2 , g o f muMAb4D5 p e r m l , t r y p s i n i z a t i o n , a n dp a s s a g e i n f r e s h ( m u M A b 4 D 5 - f r e e ) medium f o r 2 4 h , f o l -l o w e d b y r e s u m p t i o n o f t h e muMAb4D5 s e l e c t i o n p r e s s u r e .A f t e r t h e t h i r d s e l e c t i o n c y c l e a n d r e l a t i v e t o u n t r a n s f e c t e dB T - 4 7 4 c e l l s , c o l o n i e s r e s i s t a n t t o t h e m a r k e d g r o w t h - i n h i b -i t i n g e f f e c t o f muMAb4D5 w e r e o b s e r v e d . Tw o s e p a r a t ep o o l s o f r e s i s t a n t c o l o n i e s ( B T - 4 7 4 / p W - 1 a n d B T - 4 7 4 / p W - 2 )w e r e s p l i t f r o m t h e p r i m a r y c u l t u r e a f t e r t h e t h i r d s e l e c t i o nc y c l e a n d were s u b c u l t u r e d a c c o r d i n g t o t h e samemuMAb4D5 t r e a t m e n t r e g i m e n f o r t w o a d d i t i o n a l c y c l e sb e f o r e t e s t i n g . C o n c e n t r a t e d c o n d i t i o n e d m e d i a a n d c e l ll y s a t e s f r o m w i l d - t y p e a n d t r a n s f e c t e d t u m o r c e l l l i n e s(MKN7, M D A - M B - 4 5 3 , S K - B R - 3 , a n d B T - 4 7 4 ) w e r e p r e -p a r e d i d e n t i c a l l y t o t h e t r a n s f e c t e d C O S - 1 c e l l s i n o r d e r t oe x a m i n e p r o t e i n e x p r e s s i o n . A l i q u o t s o f c o n ce n t r a t e d c o n -d i t i o n e d m e d i a a n d c e l l l y s a t e s w e r e m i x e d i n a n e q u a lv o l u m e o f l o a d i n g b u f f e r ( 0 . 1 2 5 M T r i s [ p H 6 . 8 ] , 20 %g l y c e r o l , 2% S D S ) e i t h e r w i t h o r w i t h o u t 1 0 mM d i t h i o t h r e -i t o l ( D T T ) a s i n d i c a t e d , e l e c t r o p h o r e s e d o n a 7 % p o l y a c r y l -a m i d e - S D S d e n a t u r i n g g e l , a n d e l e c t r o b l o t t e d o n t o a p o l y -v i n y l i d e n e d i f l u o r i d e m e m b r a n e ( I m m o b i l o n - P ; M i l l i p o r e ,B e d f o r d , M a s s . ) . S i z e m a r k e r s a s i n d i c a t e d i n f i g u r e s w e r ed e t e r m i n e d b y c o m p a r i n g t h e r u n n i n g p o s i t i o n s o f p r e s t a i n e da n d u n s t a i n e d p r o t e i n m o l e c u l a r w e i g h t s t a n d a r d s ( B e t h e s d aR e s e a r c h L a b o r a t o r i e s , G a i t h e r s b u r g , M d . ) . A f t e r p r e h y -b r i d i z a t i o n i n T r i s - b u f f e r e d s a l i n e ( T B S ; 1 0 mM T r i s [ p H8 . 0 ] , 1 5 0 mM N a C l , 0 . 5 % Tween 2 0 ) c o n t a i n i n g 1 . 5 % n o n f a td r y m i l k p o w d e r , m e m b r a n e s w e r e p r o b e d w i t h e i t h e r ag u i n e a p i g p o l y c l o n a l a n t i b o d y r a i s e d a g a i n s t t h e E C D o fHER2 r e c o m b i n a n t l y p r o d u c e d i n m a m m a l i a n c e l l s o r a n -o t h e r g u i n e a p i g p o l y c l o n a l a n t i b o d y r a i s e d a g a i n s t t h eC - t e r m i n a l 1 7 a m i n o a c i d s o f HER2 ( 9 , 1 0 ) . P o l y c l o n a la n t i b o d i e s r a i s e d a g a i n s t t h e HER2 E C D w e r e p r o t e i n Ap u r i f i e d f r o m g u i n e a p i g s e r u m a n d u s e d a t a c o nc en t r a t i o n o f2 p , g / m l , w h i l e g u i n e a p i g a n t i s e r u m a g a i n s t t h e HER2 Ct e r m i n u s was u s e d a t a 1 : 1 , 0 0 0 d i l u t i o n . A f t e r s e v e r a l w a s h e si n T B S , m e m b r a n e - b o u n d a n t i b o d i e s w e r e d e t e c t e d b y u s i n g1 2 5 I - p r o t e i n A (NEN R e s e a r c h P r o d u c t s , B o s t o n , M a s s . ) .M e m b r a n e s were t h e n w a s h e d a g a i n i n T B S , d r i e d , a n df i l m e d .M e t a b o l i c l a b e l i n g , i m m u n o p r e c i p i t a t i o n , a n d e n d o g l y c o s i -d a s e d i g e s t i o n . T h e d i f f e r e n t i a l p r o c e s s i n g a n d t u r n o v e r o fHER2 E C D was s t u d i e d b y u s i ng p r e v i o us l y d e s c r i b e dt e c h n i q u e s f o r t h e m e t a b o l i c l a b e l i n g a n d e n d o g l y c o s i d a s e( e n d o - H o r e n d o - F ) t r e a t m e n t o f i m m u n o p r e c i p i t a t e d HER2r e c e p t o r ( 1 6 ) . C e l l s w e r e g r o w n t o 80 % c o n f l u e n c e i n 3 5 - m m -d i a m e t e r c u l t u r e d i s h e s , t h e n p u l s e - l a b e l e d i n c y s t e i n e - f r e emedium c o n t a i n i n g [ 3 5 S ] c y s t e i n e ( 1 m C i / m l ) f o r 3 0 m i n , a n di n c u b a t e d f o r v a r i o u s t i m e s ( c h a s e ) i n 10% f e t a l c a l f s e r u m -s u p p l e m e n t e d m e d i u m . A f t e r t h e c h a s e p e r i o d , c e l l s w e r ew a s h e d t w i c e i n P B S , l y s e d , a n d i m m u n o p r e c i p i t a t e d w i t ha n E C D - s p e c i f i c p o l y c l o n a l a n t i b o d y i n c o m b i n a t i o n w i t h

p r o t e i n A - a g a r o s e ( S i g m a ) . F o r e n d o - H ( B o e h r i n g e r M a n n -h e i m ) d i g e s t i o n , t h e i m m u n o p r e c i p i t a t e d p r o d u c t s w e r e f i r s tr e s o l u b i l i z e d i n l y s i s b u f f e r c o n t a i n i n g 1 % SDS a n d h e a t e df o r 2 m i n . T h e s u p e r n a t a n t was d i l u t e d 1 0 - f o l d w i t h l y s i sb u f f e r c o n t a i n i n g e n d o - H ( 2 5 0 m U / m l ) a n d i n c u b a t e d a t 3 7 Cf o r 4 h . D i g es t i o n p r o d uc t s w e r e r e i m m u n o p r e c i p i t a t e d a n dt h e n e l e c t r o p h o r e s e d ( a l o n g w i t h u n d i g e s t e d p r o d u c t s ) o n a nS D S - 7 . 5 % p o l y a c r y l a m i d e g e l .I m m u n o f l u o r e s c e n c e o f t u m o r c e l l s . C u l t u r e d H E R 2 - o v e r -e x p r e s s i n g t u m o r c e l l s w e r e g r o w n t o s u b c o n f l u e n c e o nc o v e r s l i p s , f i x e d w i t h 3 % f o r m a l d e h y d e , a n d p e r m e a b i l i z e dw i t h 1% T r i t o n X - 1 0 0 . C e l l s w e r e t h en i n c ub at e d w i t hp r i m a r y a n t i - H E R 2 a n t i b o d i e s . E i t h e r a g u i n e a p i g a n t i -HER2 E C D a n t i s e r u m o r mu M A b4D5 was u s e d t o l a b e lHER2 ECD. E i t h e r a g u i n e a p i g a n t i s e r u m , a r a b b i t a n t i -s e r u m , o r a mouse m o n o c l o n a l a n t i b o d y , e a c h d i r e c t e da g a i n s t t h e HE R2 C t e r m i n u s , was u s e d t o l a b e l f u l l - l e n g t hHER2. F o l l o w i n g w a s h e s i n P B S , t h e c e l l s w e r e i n c u b a t e dw i t h a n a p p r o p r i a t e s e c o n d a r y g o a t a n t i b o d y d i r e c t e da g a i n s t e i t h e r r a b b i t , m o u s e , o r g u i n e a p i g i m m u n o g l o b u l i nG . T h e s e c o n d a r y a n t i b o d y was c o n j u g a t e d t o e i t h e r f l u o -r e s c e i n o r r h o d a m i n e . T h e c e l l s w e r e a g a i n w a s h e d ,m o u n t e d , a n d t h e n e x a m i n e d b y u s i n g a L e i t z A r i s t o p l a nf l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e .

RESULTSI s o l a t i o n a n d s e q u e n c i n g o f HER2 E C D c l o n e s . T h r e ec l o n e s e n c o d i n g t h e t r u n c a t e d HER2 ECD w e r e i s o l a t e df r o m c DNA l i b r a r i e s d e r i v e d f r o m t h e H E R 2 - o v e r e x p r e s s i n gc e l l l i n e s B T - 4 7 4 a n d SK-BR-3 ( F i g . 1 ) . The DNA s e q u e n c e so f t h e s e c l o n e s m a t c h e d t h e known 5 ' u n t r a n s l a t e d a n dc o d i n g s e q u e n c e o f HER2 t h r o ug h b as e 1 8 9 8 ( f r o m t h ei n i t i a t i n g A TG c o d o n i n e x o n 1 ) a n d t h e n d i v e r g e d i n t o ar e g i o n o f u n i q u e s e q u e n c e t e r m i n a t i n g i n a p o l y a d e n y l a t i o ns t r e t c h ( 1 3 A ' s i n c l o n e X 5 A ) . The c l o n e s e n c o d e a r e a d i n gf r a m e t h a t i n c l u d e s t h e f i r s t 6 3 3 a m i n o a c i d s o f HER2 a n dd i v e r g e s 2 0 a m i n o a c i d s 5 ' o f t h e HER2 t r a n s m e m b r a n e

d o m a i n . T h e d i v e r g en t r e g i o n b eg i n s w i t h t h e s e q u e n c eGTGAG, a c o n s e n s u s s p l i c e d o n o r s i t e , s u g g e s t i n g t h a t t h et r u n c a t e d t r a n s c r i p t f a i l s t o s p l i c e a t t h e 3 ' e n d o f t h e e x o na n d r e a d s t h r o u g h f o r 1 6 5 b p t o a n a l t e r n a t i v e p o l y ( A ) s i t e .T h e TG A i n t h e p u t a t i v e s p l i c e s i t e b e c o m e s t h e s t o p c o d o nf o r t h e t r u n c a t e d t r a n s c r i p t .C h a r a ct e r i z at i o n o f t h e d i v e r g e n t e x o n . To d e t e r m i n ew h e t h e r t h e d i v e r g e n t s e q u e n c e i s c o n t i g u o u s i n t h e genomew i t h t h e i m m e d i a t e l y 5 ' common s e q u e n c e , DNA f r o mhuman p l a c e n t a a n d B T - 4 7 4 c e l l s was s u b j e c t e d t o P C Ra n a l y s i s u s i n g p r i m e r s f l a n k i n g t h e p o i nt o f d i v e r g e n ce . Am a j o r P C R b a n d o f 1 2 3 b p t h a t h y b r i d i z e d t o p r o b e f r o m t h e3 ' r e g i o n o f t h e t r u n c a t e d HER2 cDNA c l o n e was o b t a i n e df r o m b o t h p l a c e n t a a n d B T - 4 7 4 g e n o m i c DNA ( F i g . 2 ) . T h i sa m p l i f i e d 1 2 3 - b p b a n d i s t h e s i z e e x p e c t e d i f t h e t w o s e -q u e n c e s a r e c o n t i g u o u s i n t h e g e n o m e , s ub s t a nt i a t i n g t h er e a d - t h r o u g h o f t h e HER2 s p l i c e s i t e a s t h e s o u r c e o f t h ed i v e r g e n t s e q u e n c e . T h e s i g n i f i c a n c e o f t h e m i n o r h y b r i d i z -i n g b a n d o c c u r r i n g b e l o w t h e p r e d o m i n a n t 1 2 3 - b p b a n d i su n k n o w n , a n d P C R a n a l y s i s u s i n g o n l y o n e f l a n k i n g p r i m e ry i e l d e d n o 3 ' t r u n c a t e d HER2 h y b r i d i z i n g b a n d ( d a t a n o ts h o w n ) .P r e v a l e n c e a n d c e l l u l a r a b u n d a n c e o f t r u n ca t e d HER2t r a n s c r i p t . P r e v i o u s N o r t h e r n a n a l y s e s h a d d e t e c t e d a 2 . 3 - k bHER2 t r a n s c r i p t i n RNA i s o l a t e d f r o m t h e human g a s t r i cc a n c e r c e l l l i n e MKN7 t h a t h y b r i d i z e d t o 5 ' b ut n o t 3 ' H E R 2cDNA p r o b e s ( 4 0 ) . B l o t h y b r i d i z a t i o n s o f RNA f r o m B T - 4 7 4a n d MKN7 c e l l s u s i n g p r o b e s s p e c i f i c f o r t h e 5 ' common a n d

V O L . 1 3 , 1 9 9 3


4/11

2 2 5 0 SCOTT E T AL.

F u l l - l e n g t hHER2 5 '0 1 2 3

I OCD4 5 k b

A A ( n )p W 5 9 7 . 3 A 4x i CX 5 A

I E CDIJ( 5 )A.3

T h r H I s S o r i oA C C C C CGG:U Al T TIt;L T 1 C T F 1 G T f l U T A T G AC A A 6 A A A T A & L 4 A C A 1 T G 1 T A A M T E G T A A M M T M A . * A A T G M A M A T A A A 1 T A ( 1 3 )

F I G . 1 . S c h e m a t i c d i a g r a m o f t r u nc at e d human HER2 cDNA c l o n e s c o n t a i n i n g 3 ' s e q u e n c e s d i v e r g e n t f r o m f u l l - l e n g t h HER2 cDNA.T h r e e c l o n e s w e r e i s o l a t e d f r o m c DNA l i b r a r i e s f r o m S K - B R - 3 ( p W 5 9 7 . 3 A ) a n d B T - 4 7 4 ( X 1 C a n d X 5 A ) h u m a n b r e a s t c a n c e r c e l l s . H o r i z o n t a ll i n e s r e p r e s e n t u n t r a n s l a t e d r e g i o n s f r o m t h e 5 ' a n d 3 ' r e g i o n s o f t h e f u l l - l e n g t h HER2 cDNA. O p e n b o x e s r e p r e s e n t e i t h e r t h e E CD o r t h ei n t r a c e l l u l a r d o m a i n ( I C D ) o f n o r m a l HER2; t h e s t i p p l e d b o x r e p r e s e n t s t h e n o r m a l HER2 t r a n s m e m b r a n e d o m a i n . S o l i d b o x e s i n d i c a t e t h ed i v e r g e n t r e g i o n o f t h e 3 ' e n d o f t h e t r u n c a t e d HER2 cDNAs, t h e f u l l s e q u e n c e o f w h i c h i s s h o w n i n t h e e x p a n d e d b r a c k e t h i g h l i g h t i n g t h er e t a i n e d 5 ' s p l i c e d o n o r s i t e ( G T G A G ) , t h e i n - f r a m e s t o p c o d o n ( T G A ) , a n d t h e p o l y ( A ) a d d i t i o n s i g n a l (ATTAAA).

3 ' d i v e r g e n t r e g i o n s o f t h e f u l l - l e n g t h a n d t r u n c a t e d HER2t r a n s c r i p t s s h o w t h a t a 4 . 6 - k b b a n d c o r r e s p o n d i n g t o t h ef u l l - l e n g t h t r a n s c r i p t i s f o u n d i n b o t h c e l l l i n e s , w h i l e a no b v i o u s 2 . 3 - k b b a n d c o r r e s p o n d i n g t o t h e t r u n c a t e d t r a n -s c r i p t i s f o u n d o n l y i n MKN7 RNA ( F i g . 3 ) . F i v e f o l do v e r e x p o s u r e r e v e a l s t h e p r e s e n c e o f t h e 2 . 3 - k b t r u n c a t e dHER2 t r a n s c r i p t i n B T - 4 7 4 c e l l s a s w e l l ( d a t a n o t s h o w n ) .P r e v i o u s d e t e c t i o n o f t h e 2 . 3 - k b t r a n s c r i p t i n o t h e r c e l l l i n e s ,p r i m a r i l y t h o s e o f h u m a n b r e a s t c a n c e r o r i g i n , h a s b e e n

A B3/

F I G . 2 . G e n o m i c c o n t i g u i t y o f d i v e r g e n t c DNA s e q u e n c e r e f l e c t -i n g a l t e r n a t i v e l y p r o c e s s e d HER2 t r a n s c r i p t . Human p l a c e n t a a n dB T - 4 7 4 g e n o m i c DNAwas P CR a m p l i f i e d b y u s i n g p r i m e r s f l a n k i n gt h e p o i n t o f d i v e r g e n c e ( 4 5 b p o f common e x o n i c s e q u e n c e a n d 7 8 b po f p u t a t i v e i n t r o n i c s e q u e n c e ) . A l i q u o t s o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e weree l e c t r o p h o r e s e d i n a 1 2 % p o l y a c r y l a m i d e g e l w i t h (X174 r e p l i c a -t i v e - f o r m D N A / H a e I I I ( B e t h e s d a R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s ) r e s t r i c -t i o n f r a g m e n t s a s m a r k e r s , s t a i n e d w i t h e t h i d i u m b r o m i d e , a n dp h o t o g r a p h e d ( B ) . DNA was t r a n s f e r r e d t o a n y l o n m e m b r a n e a n dp r o b e d w i t h a f r a g m e n t f r o m t h e 3 ' r e g i o n o f t h e t r u n c a t e d HER2c DNA c l o n e ( A ) .

e q u i v o c a l b e c a u s e o f t h e much g r e a t e r a b u n d a n c e o f t h e4 . 6 - k b HER2 b a n d a n d t h e l a c k o f a s p e c i f i c p r o b e r e c o g n i z -i n g t h e 3 ' d i v e r g e n t s e q u e n c e u n i q u e t o t h e t r u n c a t e d t r a n -s c r i p t ( 1 , 2 1 , 4 1 ) .T h e r e l a t i v e a m o u n t s o f t h e t r u n c a t e d a n d f u l l - l e n g t hHER2 t r a n s c r i p t s w e r e m o r e r e a d i l y q u a n t i t a t e d b y S in u c l e a s e a s s a y . A 2 8 1 - n t s i n g l e - s t r a n d e d f r a g m e n t c o n t a i n -i n g s e q u e n c e s s p a n n i n g t h e p o i n t o f d i v e r g e n c e f r o m t h et r u n c a t e d HER2 c l o n e s was u s e d a s a p r o b e . T h e t r u n c a t e dt r a n s c r i p t was e x p e c t e d t o p r o t e c t 1 8 1 n t o f t h i s p r o b e , w h i l ef u l l - l e n g t h t r a n s c r i p t w o u l d p r o t e c t 1 2 5 n t . R e s u l t s o f t h e S 1n u c l e a s e a s s a y u s i n g RNA f r o m c e l l l i n e s M K N 7 , S K - O V - 3 ,a n d B T - 4 7 4 a r e s h o w n i n F i g . 4 A . Q u a n t i t a t i o n o f t h e s e d a t ag a v e r a t i o s o f 1 . 1 , 1 6 , a n d 4 0 ( f u l l - l e n g t h t o t r u n c a t e dt r a n s c r i p t l e v e l s ) f o r t h e M KN7, S K - O V - 3 , a n d B T - 4 7 4RNA s a m p l e s , r e s p e c t i v e l y . S i m i l a r a s s a y s w e r e p e r f o r m e dt o c o m p a r e t h e r e l a t i v e a b u n d a n c e o f t h e f u l l - l e n g t h a n dt r u n c a t e d HER2 t r a n s c r i p t s p r e s e n t i n human b r e a s t c a n c e r

5 ' H E R 2 3ECD 3HER2

Ori>i;_28S ~ -18S am w

*I

F I G . 3 . S p e c i f i c i t y o f t h e 3 ' r e g i o n o f t r u n c a t e d HER2 cDNA f o rt h e 2 . 3 - k b RNA t r a n s c r i p t . I d e n t i c a l N o r t h e r n m e m b r a n e s c o n t a i n -i n g B T - 4 7 4 a n d MKN7 t o t a l RNA a t 1 0 , u g p e r l a n e were p r o b e d w i t ha 5 ' HER2 cDNA p r o b e ( 5 ' H E R 2 ) , a 3 ' HER2 cDNA p r o b e ( 3 'H E R 2 ) , a n d a p r o b e p r i m a r i l y s p e c i f i c f o r t h e 3 ' r e g i o n o f t h et r u n c a t e d HER2 cDNA ( 3 ' E C D ) . P o s i t i o n s o f 1 8 S a n d 2 8 S r R N A s ,d e t e r m i n e d f r o m t h e e t h i d i u m b r o m i d e - s t a i n e d RNA g e l s , a r e i n d i -c a t e d .

-.All.



5/11

ECTODOMAIN P R O D U C E D BY TRUNCATED HER2 TRANSCRIPT

Q C O AAAa . -__W _l b

Lu ZL u+ ) + ) -

2 8 1 n t --

B

DTT + + -pW597.3A + + -2 0 0 Kd-

*: 4i, . x .

2 8 1 n t - a ' - *1 8 1 n t - _ -

1 81 n t _ - i - : . 1 :9 7 . 4 Kd- U"-

6 8 K d -43 Kd-1 2 5 n t _ - a -

1 2 5 n t - a -

F I G . 4 . S i n u c l e a s e p r o t e c t i o n a s s a y q u a n t i t a t i n g r e l a t i v e tumorc e l l a b u n d a n c e o f 2 . 3 - k b HER2 E C D mRNA. A s i n g l e - s t r a n d e dDNA f r a g m e n t c o n t a i n i n g s e q u e n c e s s p a n n i n g t h e p o i n t o f d i v e r -g e n c e i n t h e t r u n c a t e d HER2 c DNA c l o n e s was p r i m e d b y a n M1 3r e v e r s e p r i m e r t o g e n e r a t e t h e r a d i o l a b e l e d 2 8 1 - n t p r o b e u s e d i n t h eS l p r o t e c t i o n a s s a y c o n d i t i o n s a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h -o d s . T h i r t y m i c r o g r a m s o f t o t a l R NA f r o m t h e i n d i c a t e d c e l l l i n e swas s u b j e c t e d t o S 1 a s s a y , a n d t h e p r o t e c t e d p r o d u c t s were s e p a -r a t e d b y e l e c t r o p h o r e s i s o n 5% p o l y a c r y l a m i d e - 8 M u r e a g e l s .Arrows i n d i c a t e g e l p o s i t i o n s o f t h e i n t a c t 2 8 1 - n t p r o b e , t h e 1 8 1 - n tf r a g m e n t p r o t e c t e d b y t h e s e q u e n c e d i v e r g e n c e w i t h i n t h e t r u n c a t e dHER2 t r a n s c r i p t , a n d a 1 2 5 - n t e x o n i c p o r t i o n o f t h a t p r o b e f r a g m e n tp r o t e c t e d o n l y b y f u l l - l e n g t h HER2 t r a n s c r i p t . T h e more p r o l o n g e da u t o r a d i o g r a p h e x p o s u r e s h o w n i n p a n e l B was n e c e s s a r y t o d e t e c tt h e HER2 E C D - d e r i v e d b a n d ( 1 8 1 n t ) f r o m MCF-7 a n d T47D c e l l s ;a n e v e n l o n g e r a u t o r a d i o g r a p h e x p o s u r e was n e c e s s a r y t o d e t e c tt h i s t r u n c a t e d t r a n s c r i p t f r o m MDA-468 c e l l s ( n o t s h o w n ) .

c e l l l i n e s known t o g r e a t l y o v e r e x p r e s s ( B T - 4 7 4 a n d SK-BR-3 ) , m o d e r a t e l y o v e r e x p r e s s ( M D A - M B - 4 5 3 a n d T 4 7 D ) , o rn o r m a l l y e x p r e s s ( M C F - 7 a n d MDA-MB-468) HER2 r e c e p -t o r ( F i g . 4 B ) . I r r e s p e c t i v e o f HER2 r e c e p t o r l e v e l v a r y i n g3 0 - f o l d among t h e s e b r e a s t c a n c e r c e l l l i n e s , t h e r a t i o o ff u l l - l e n g t h t o t r u n c a t e d HER2 mRNA l e v e l s was e s s e n t i a l l yc o n s t a n t a n d e q u a l t o 4 0 .C e l l u l a r e x p r e s s i o n o f t r u n c a t e d HER2 p r o t e i n . I m m u n o -b l o t t i n g o f C O S - 1 c e l l s t r a n s f e c t e d w i t h t h e HER2 E C De x p r e s s i o n c l o n e ( p W 5 9 7 . 3 A ) was p e r f o r m e d t o e x a m i n e t h es i z e a n d p a t t e r n o f e x p r e s s i o n o f t h e t r un c at e d HER2p r o t e i n . S a m p l e s f r o m t h e c o n c e n t r a t e d s e r u m - f r e e c o n d i -t i o n e d m e d i u m a n d C O S - 1 c e l l e x t r a c t w e r e a n a l y z e d b yS D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d s t a i n e d w i t ha n t i - H E R 2 E C D a n t i b o d i e s ( F i g . 5 A ) . U n d e r r e d u c i n g c o n -d i t i o n s , c o n d i t i o n e d medium s h o w e d a 1 1 0 - k D a b a n d , w h i l et h e b a n d f r o m t h e c e l l e x t r a c t m i g r a t e d a t a p p r o x i m a t e l y 1 0 0k D a . S i n c e t h e m o l e c u l a r s i z e o f t h e p r o t e i n b a s e d o nt r a n s l a t i o n o f t h e HER2 E C D cDNA s e q u e n c e i s a b o u t 7 0k D a , b o t h t h e s e c r e t e d a n d c y t o s o l i c f o r m s a p p e a r e d t o b eg l y c o s y l a t e d t o v a r i o u s e x t e n t s ( 6 , 4 0 ) . I n a g r e e m e n t w i t h t h eknown d i s u l f i d e - l i n k e d c y s t e i n e s i n t h e HER2 ECD, t h eu n r e d u c e d a n d more c o m p a c t f o r m o f t h e t r u n c a t e d p r o t e i n

g

CM C EE C D C - T e r m

7/ /# k C 3 t e C 9 ) , S E & k#N. A Q &

2 0 0 K d -

9 7 . 4 Kd-6 8 K d - a-' a4 3 K d -

. u . < j , .F I G . 5 . S i z e a n d p a t t e r n o f e x p r e s s i o n o f t r u n c a t e d HER2 p r o -t e i n . ( A ) R e d u c e d (DTT + ) a n d n o n r e d u c e d (DTT - ) a l i q u o t s o fc o n d i t i o n e d m e d i a ( C M ) o r c e l l e x t r a c t ( C E ) f r o m C O S - 1 c e l l st r a n s i e n t l y t r a n s f e c t e d w i t h t h e HER2 E C D e x p r e s s i o n v e c t o rp W 5 9 7 . 3 A w e r e e l e c t r o p h o r e s e d i n a n S D S - 7 % p o l y a c r y l a m i d e g e l ,t r a n s f e r r e d t o a p o l y v i n y l i d e n e d i f l u o r i d e m e m b r a n e , p r o b e d w i t hp o l y c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t t h e HER2 ECD, a n d d e t e c t e d b y2 5 I - p r o t e i n A . ( B ) D T T - r e d u c e d a l i q u o t s o f c o n d i t i o n e d m e d i a ( C M )o r c e l l e x t r a c t s ( C E ) f r o m t h e i n d i c a t e d c e l l l i n e s ( i n c l u d i n g t h et r a n s f e c t e d C O S - 1 c e l l s , C - p W 5 9 7 . 3 A ) w e r e e l e c t r o p h o r e s e d , t r a n s -f e r r e d t o a m e m b r a n e , p r o b e d w i t h e i t h e r p o l y c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s tt h e HER2 E C D ( E C D ) o r p o l y c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s t t h e HER2 Ct e r m i n u s ( C - T e r m ) , a n d d e t e c t e d b y " 2 I - p r o t e i n A . T h e i m m u n o r e -a c t i v e b a n d s a t 6 0 t o 7 0 kDa i n MKN7 a n d S K - B R - 3 c e l l e x t r a c t s , a sw e l l a s t h e o t h e r l o w e r - m o l e c u l a r - w e i g h t b a n d s , r e p r e s e n t n o n s p e -

c i f i c ( n o n - H E R 2 p r o t e i n ) d e t e c t i o n b y p o l y c l o n a l a n t i b o d y , s i n c et h e s e b a n d s a r e p r e s e n t w i t h n e a r - e q u a l i n t e n s i t y i n MCF-7 c e l le x t r a c t ( n o t s h o w n ) . P r o t e i n m o l e c u l a r w e i g h t s t a n d a r d s w e r e u s e d t od e t e r m i n e t h e p o s i t i o n s o f s i z e m a r k e r s s h o w n o n t h e l e f t .

m i g r a t e d more r a p i d l y t h a n d i d t h e r e d u c e d HER2 ECD ( F i g .5 A ) .I m m u n o b l o t t i n g o f c e l l l i n e s ( MKN7 a n d S K - B R - 3 ) w i t hg r e a t l y o v e r e x p r e s s e d H E R2 r e c e p t o r a n d d i f f e r e n t r a t i o s o ff u l l - l e n g t h t o t r u n c a t e d HER2 t r a n s c r i p t was p e r f o r m e d t oc o m p a r e t h e s i z e a n d p a t t e r n o f t h e n a t i v e HER2 p r o t e i ne x p r e s s e d i n t h e s e t u m o r c e l l l i n e s . E x t r a c t s f r o m b o t h c e l l

2 2 5 1V O L . 1 3 , 1 9 9 3A A

jM .

T4

Ai


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2 2 5 2 SC OTT E T AL.

F I G . 6 . D o u b l e i m m u n o f l u o r e s c e n c e l a b e l i n g o f MKN7 c e l l s o v e r e x p r e s s i n g f u l l - l e n g t h HER2 ( 1 8 5 k D a ) a n d HER2 E C D ( 1 0 0 k D a )d e m o n s t r a t i n g d i f f e r e n t i a l c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f t h e t r u n c a t e d a n d f u l l - l e n g t h r e c e p t o r p r o t e i n s . As d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ,c u l t u r e d MKN7 c e l l s were l a b e l e d w i t h b o t h a n a n t i b o d y d i r e c t e d a g a i n s t t h e HER2 E C D d o m a i n a n d a n a n t i b o d y d i r e c t e d a g a i n s t t h ec y t o p l a s m i c C - t e r m i n a l d o m a i n o f HER2. D i f f u s e c e l l s u r f a c e membrane f l u o r e s c e n c e f r o m r h o d a m i n e - l a b e l e d f u l l - l e n g t h HE R2 r e c e p t o r i ss e e n i n p a n e l s B ( l o w p o w e r ) a n d D ( h i g h p o w e r ) . I n c o n t r a s t , p a n e l s A ( l o w p o we r ) a n d C ( h i g h p o w e r ) show t h e s a m e c e l l s w i t h i n t e n s ep e r i n u c l e a r a s w e l l a s d i f f u s e s u r f a c e m e m b r a n e f l u o r e s c e n c e f r o m f l u o r e s c e i n - l a b e l e d HER2 ECD. T h e b ar s r e p r es e n t 1 0 r m .

l i n e s c o n t a i n e d e q u a l a n d a b u n d a n t l e v e l s o f i n t a c t ( 1 8 5 - k D a )HER2 r e c e p t o r when p r o b e d w i t h a n t i - H E R 2 E C D a n t i b o d y( F i g . 5 B ) . As w e l l , t h e c o n ce n t r a t e d c o n d i t i o ne d mediumf r o m S K - B R - 3 c e l l s ( h a v i n g l o w 2 . 3 - k b t r a n s c r i p t l e v e l sr e l a t i v e t o 4 . 6 - k b HER2 mRNA) c o n t a i n e d a s much 1 1 0 - k D ai m m u n o r e a c t i v e p r o t e i n a s d i d t h a t f r o m MKN7 c e l l s ( w i t hh i g h l e v e l s o f 2 . 3 - k b HER2 mRNA), i m p l i c a t i n g p r o t e o l y s i so f t h e a b u n d a n t c e l l s u r f a c e r e c e p t o r a s o n e m e c h a n i s m f o rs o l u b l e HER2 E C D p r o d u c t i o n ( s e e D i s c u s s i o n ) . I n c o n -t r a s t , o n l y t h e MKN7 c e l l e x t r a c t c o n t a i n e d a b u n d a n t 1 0 0 -kDa HER2 E C D p r o t e i n l i k e t h a t f o u n d i n t r a n s f e c t e d C O S - 1c e l l s ( F i g . 5 B ) . As e x p e c t e d , when p r o b e d w i t h a n t i b o d ys p e c i f i c f o r t h e C - t e r m i n a l r e g i o n o f t h e i n t a c t HER2 p r o t e i n ,t h e 1 0 0 - k D a HER2 E C D b a n d f r o m t h e MKN7 c e l l e x t r a c twas n o l o n g e r d e t e c t a b l e ( F i g . S B ) . T h u s , t h e a b u n d a n c e o f1 0 0 - k D a HER2 E C D p r o t e i n i n t h e MKN7 c e l l e x t r a c tc o r r e s p o n d s t o t h e amount o f t r u n c a t e d 2 . 3 - k b HER2 mRNAe x p r e s s e d i n t h e s e c e l l s .Tw o d i f f e r e n t p r o c e d u r e s were p e r f o r m e d t o d e m o n s t r a t et h e i n t r a c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f 1 0 0 - k D a HER2 E C D i nMKN7 c e l l s : ( i ) c u l t u r e d c e l l s were s u b j e c t e d t o t r y p s i n i z a -

t i o n p r i o r t o HER2 i m m u n o b l o t a s s a y o f c e l l e x t r a c t s , a n d( i i ) c e l l s w e r e d o u b l e i m m u n e l a b e l e d w i t h C - t e r m i n u s - a n dE C D - s p e c i f i c a n t i - H E R 2 a n t i b o d i e s . T r y p s i n t r e a t m en t o fMKN7 c u l t u r e s ( 0 . 5 a n d 2 . 5 mg o f t r y p s i n p e r m l i n 1 mMEDTA a t 3 7 C f o r 1 5 t o 3 0 m i n ) p r o d u c e d p a r t i a l c l e a v a g ef o l l o w e d b y c o m p l e t e l o s s o f i n t a c t ( 1 8 5 - k D a ) HER2 r e c e p -t o r w i t h n o s i g n i f i c a n t d e c l i n e i n e x t r a c t l e v e l s o f t r u n c a t e d( 1 0 0 - k D a ) HER2 p r o t e i n ( d a t a n o t s h o w n ) , i n d i c a t i n g t h a tt h e i n t r a c e l l u l a r l o c a t i o n o f MKN7 HER2 E C D p r o t e c t e d i tf r o m e x p o s u r e t o a p r o t e o l y t i c a t t a c k c a p a b l e o f c o m p l e t e l yd e g r a d i n g c e l l s u r f a c e HER2 r e c e p t o r . To l o c a l i z e i n t r a c e l -l u l a r HER2 E C D r e l a t i v e t o f u l l - l e n g t h HER2 i n MKN7c e l l s , d o u b l e i m m u n o f l u o r e s c e n c e s t u d i e s were p e r f o r m e dw i t h a n t i b o d i e s r e c o g n i z i n g f i v e d i f f e r e n t e p i t o p e s w i t h i ne i t h e r t h e e x t r a c e l l u l a r o r c y t o p l a s m i c d o m a i n o f HER2: twod i f f e r e n t a n t i b o d i e s s p e c i f i c f o r s e p a r a t e H E R2 C - t e r m i n u se p i t o p e s i n t h e c y t o p l a s m i c d o m a i n a n d t h r e e d i f f e r e n ta n t i - E C D a n t i b o d i e s s p e c i f i c f o r d i s t i n c t N - t e r m i n u se p i t o p e s . As s h o w n ( F i g . 6 A a n d C ) , MKN7 c e l l s l a b e l e dw i t h e i t h e r a p o l y c l o n a l a n t i s e r u m o r a m o n o c l o n a l a n t i b o d y( m u M A b 4 D 5 ) d i r e c t e d a g a i n s t t h e HER2 E C D s h o w e d d i f -



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ECTODOMAIN P R O D U C E D BY TRUNCATED HER2 TRANSCRIPT 2 2 5 3

F I G . 7 . D o u b l e i m m u n o f l u o r e s c e n c e l a b e l i n g o f S K - B R - 3 c e l l s o v e r e x p r e s s i n g f u l l - l e n g t h HER2 b ut n o t HER2 ECD. C u l t u r e d S K - B R - 3c e l l s w e r e l a b e l e d w i t h t h e s a m e E C D - s p e c i f i c a n t i b o d y ( A a n d C ) a n d a n t i b o d y d i r e c t e d a g a i n s t t h e HER2 c y t o p l a s m i c d o m a i n ( B a n d D )a s d e s c r i b e d f o r F i g . 6 ; f l u o r e s c e n c e was v i s u a l i z e d u n d e r l o w - p o w e r ( A a n d B ) a n d h i g h - p o w e r ( C a n d D ) m a g n i f i c a t i o n . W i t h t h e s e c o n t r o lc e l l s , b o t h a n t i b o d i e s d e m o n s t r a t e m e m b r a n e l a b e l i n g w i t h o u t s i g n i f i c a n t i n t r a c e l l u l a r f l u o r e s c e n c e . T h e b a r s r e p r e s e n t 1 0 p , m .

f u s e s u r f a c e m e m b r a n e - l o c a l i z e d i m m u n o f l u o r e s c e n c e i n a d -d i t i o n t o a more i n t e n s e p a t t e r n o f i n t r a c e l l u l a r i m m u n o f l u -o r e s c e n c e l o c a l i z e d t o t h e p e r i n u c l e a r r e g i o n . When t h e s esame c e l l s were s i m u l t a n e o u s l y l a b e l e d w i t h e i t h e r a n t i p e p -t i d e a n t i s e r u m o r a m o n o c l o n a l a n t i b o d y d i r e c t e d a g a i n s t t h eHER2 C t e r m i n u s , d i f f u s e s u r f a c e m e m b r a n e i m m u n o f l u o -r e s c e n c e p r e d o m i n a t e d ( F i g . 6B a n d D ) . D o u b l e i m m u n o l a -b e l i n g o f c o n t r o l S K - B R - 3 c e l l s , known t o o v e r e x p r e s sf u l l - l e n g t h HER2 b u t n o t HER2 E C D , s h o w e d p r o n o u n c e dm e m b r a n e l a b e l i n g w i t h o u t s i g n i f i c a n t i n t r a c e l l u l a r f l u o r e s -c e n c e b y e i t h e r t h e C - t e r m i n u s - o r N - t e r m i n u s - s p e c i f i c a n t i -b o d i e s ( F i g . 7 ) . O f n o t e , when t r a n s f e c t e d a n d HER2 ECD-o v e r e x p r e s s i n g S K - B R - 3 c e l l s ( s e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s )w e r e s i m i l a r l y l a b e l e d , i n t r a c e l l u l a r f l u o r e s c e n c e w as o b -s e r v e d w i t h t h e N - t e r m i n u s - s p e c i f i c a n t i b o d i e s b u t n o t w i t ht h e C - t e r m i n u s - s p e c i f i c a n t i b o d i e s ( r e s u l t s n o t s h o w n ) . T h et r y p s i n i z a t i o n s t u d i e s t o g e t h e r w i t h t h e d o u b l e i m m u n o f l u o -r e s c e n c e l a b e l i n g s t u d i e s i n d i c a t e t h a t a m a j o r p o r t i o n o f t h e2 . 3 - k b t r a n s c r i p t - e n c o d e d HER2 E C D l o c a l i z e s i n t r a c e l l u -l a r l y .

M e t a b o l i c l a b e l i n g a n d e n d o g l y c o s i d a s e ( e n d o - H o re n d o - F ) t r e a t m e n t o f HER2 i m m u n o p r e c i p i t a t e s f r o mMKN7 c e l l s was p e r f o r m e d t o d e t e c t d i f f e r e n t i a l p r o c e s s i n ga n d t u r n o v e r b y i n t r a c e l l u l a r l y s e q u e s t e r e d HER2 E C D i nc o m p a r i s o n w i t h s u r f a c e m e m b r a n e - b o u n d f u l l - l e n g t h r e c e p -t o r . T h e p u l s e - c h a s e r e s u l t s h o w n i n F i g . 8A d e m o n s t r a t e st h a t HER2 E C D d o e s n o t m a t u r e b e y o n d t h e 1 0 0 - k D a f o r md e t e c t e d i m m e d i a t e l y u p o n 3 5 S l a b e l i n g , u n l i k e f u l l - l e n g t hH E R 2 , w h i c h c h a r a c t e r i s t i c a l l y s h o w s m o r e e x t e n s i v e g l y c -o s y l a t i o n a n d p r o c e s s i n g o f i t s 1 7 0 - k D a p r e c u r s o r f o r m i n t ot h e m a t u r e 1 8 5 - k D a g l y c o p r o t e i n ( 1 6 ) . F i g u r e 8B d e m o n -s t r a t e s t h a t t h e 1 0 0 - k D a HER2 E C D i s s e n s i t i v e t o e n d o - Hd i g e s t i o n f o l l o w i n g p u l s e - c h a s e ( c o n s i s t e n t w i t h h i g h - m a n -n o s e - t y p e N - l i n k e d g l y c o s y l a t i o n ) , r e s u l t i n g i n t h e 7 5 - k D aHER2 E C D d i g e s t i o n p r o d u c t s . I n c o n t r a s t , w h i l e t h e 1 7 0 -kDa HER2 p r e c u r s o r i s e n d o - H s e n s i t i v e , t h e m a t u r e 1 8 5 -kDa HER2 r e c e p t o r i s e n d o - H r e s i s t a n t , a r e s u l t o f G o l g ip r o c e s s i n g o f t h e h i g h - m a n n o s e - t y p e f u l l - l e n g t h p r e c u r s o ri n t o t h e c o m p l e x - t y p e 1 8 5 - k D a m a t u r e g l y c o p r o t e i n ( 1 6 ) .S i m i l a r r e s u l t s s h o w i n g d i f f e r e n t i a l p r o c e s s i n g o f 1 8 5 - k D a

V O L . 1 3 , 1 9 9 3


8/11

2 2 5 4 S CO TT E T AL.A . B . Endo HC h a s e ( h ) : 0 0 . 5 10 1 . 5 20 Chase ( h ) 0 0 201 8 5 K d _ 11 7 0 K d 1 6 5 K d1 7 0 Kd ~1 6 0 O K dl OOKd-iPU4PP 10K-t0d- "111* 1 0 1 0 K d - t - 0 27 5 Kd-

F I G . 8 . M e t a b o l i c l a b e l i n g o f MKN7 c e l l s a n d e n d o - H d i g e s t i o no f HER2 i m m u n o p r e c i p i t a t e s . MKN7 c u l t u r e s w e r e p u l s e d - l a b e l e dw i t h [ 3 5 S ] c y s t e i n e f o r 3 0 m i n , c h a s e d f o r v a r i o u s i n t e r v a l s u p t o 2 hp r i o r t o c e l l l y s i s , a n d t h e n i m m u n o p r e c i p i t a t e d w i t h a HER2E C D - s p e c i f i c p o l y c l o n a l a n t i b o d y . L a b e l e d i m m u n o p r e c i p i t a t e sw e r e a n a l y z e d b e f o r e ( A ) a n d a f t e r ( B ) e n d o - H d i g e s t i o n b y SDS-7 . 5 % p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d a u t o r a d i o g r a p h y . P r o -t e i n m o l ec ul a r w e i g h t s t a n d a r d s w e r e u s e d t o d e t e r m i n e t h e p o s i -t i o n s o f s i z e m a r k e r s s h o w n o n t h e l e f t .

HER2 a n d HER2 E C D w e r e o b t a i n e d w i t h e n d o - F t r e a t m e n to f MKN7 HER2 i m m u n o p r e c i p i t a t e s .I n d u c t i o n o f muMAb4D5 r e s i s t a n c e b y i n t r a c e l l u l a r o v e r e x -p r e s s i o n o f HER2 ECD. T h e o b s e r v a t i o n o f i n c r e a s e d l e v e l so f 2 . 3 - k b HER2 t r a n s c r i p t i n t u m o r c e l l l i n e s s h o w i n ga t y p i c a l r e s i s t a n c e t o t h e g r o w t h - i n h i b i t i n g e f f e c t s o f a n t i -HER2 a n t i b o d i e s s u g g e s t e d t h a t i n t r a c e l l u l a r o v e r e x p r e s s i o no f HER2 E C D m i g h t d i r e c t l y a l t e r t h e g r o w t h r e s p o n s e o fc e l l s e x p o s e d t o muMAb4D5 ( s e e D i s c u s s i o n ) . I n t h e f i r s tt e s t o f t h i s h y p o t h e s i s , MDA-MB-453 c e l l s c o t r a n s f e c t e dw i t h HER2 E C D a n d n e o e x p r e s s i o n v e c t o r s w e r e c l o n a l l ys e l e c t e d a n d a m p l i f i e d o n t h e b a s i s o f G 4 1 8 r e s i s t a n c e ,e x a m i n e d f o r c e l l e x t r a c t o v e r e x p r e s s i o n o f 1 0 0 - k D a HER2E C D p r o t e i n , a n d t h e n t e s t e d f o r s e n s i t i v i t y t o a g r o w t h -i n h i b i t i n g d o s e o f t h e a n t i - H E R 2 m o n o c l o n a l a n t i b o d ymuMAb4D5 ( 1 0 , 1 7 , 3 5 ) . I n t w o f u l l y c h a r a c t e r i z e d MDA-M B - 4 5 3 c l o n e s ( M D A - 4 5 3 / M 8 a n d M D A - 4 5 3 / M 1 2 ) , c e l l e x -t r a c t i m m u n o b l o t s c o n f i r m e d t h e p r e s e n c e o f HER2 E C Dp r o t e i n , w h i c h was o n l y f a i n t l y d e t e c t a b l e i n u n t r a n s f e c t e dMDA-MB-453 c e l l s ( F i g . 9 ) . B o t h o f t h e s e t r a n s f e c t e d c l o n e ss h o w e d r e d u c e d s e n s i t i v i t y t o a k n o w n g r o w t h - i n h i b i t i n gc o n c e n t r a t i o n o f muMAb4D5 ( F i g . 1 0 ) . I n a s e c o n d t e s t o ft h i s h y p o t h e s i s , B T - 4 7 4 c e l l s were t r a n s f e c t e d w i t h t h eHER2 E C D e x p r e s s i o n v e c t o r b u t w i t h o u t c o t r a n s f e c t i o n o ft h e G 4 1 8 - s e l e c t a b l e r e s i s t a n c e m a r k e r . T r a n s f e c t a n t s weret h e n s e l e c t e d b y e x p o s u r e t o a g r o w t h - i n h i b i t i n g c o n c e n t r a -t i o n ( 2 , u g / m l ) o f muMAb4D5 a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n dM e t h o d s . C o n t r o l B T - 4 7 4 c e l l s , w h i c h c o n t a i n m i n i m a l i n -t r a c e l l u l a r HER2 E C D b u t p r o d u c e i n t h e i r c o n d i t i o n e dm e d i u m a m o u n t s o f s o l u b l e E C D s i m i l a r t o t h o s e p r o d u c e db y MKN7 c e l l s ( d a t a n o t s h o w n ) , were a l s o s u b j e c t e d t os e l e c t i o n p r e s s u r e b y 2 , u g o f muMAb4D5 p e r m l . A f t e r moret h a n 1 5 w e e k s o f a n t i b o d y e x p o s u r e , c o n t r o l B T - 4 7 4 c e l l sc o n t i n u e d t o s h o w t h e same m a r k e d d e g r e e o f c y t o s t a s i s b ymuMAb4D5 a s p r e v i o u s l y r e p o r t e d ( 3 6 ) , w i t h no e v i d e n c ef o r t h e e m e r g e n c e o f muMAb4D5 r e s i s t a n c e . I n c o n t r a s t ,p W 5 9 7 . 3 A - t r a n s f e c t e d a n d m u M A b 4 D 5 - s e l e c t e d B T - 4 7 4c e l l s n o t o n l y o v e r e x p r e s s e d 1 0 0 - k D a HER2 E C D i n t r a c e l -l u l a r l y ( F i g . 9 ) b u t a l s o p r o l i f e r a t e d more t h a n t w i c e a s f a s ta s c o n t r o l B T - 4 7 4 c e l l s ( 0 . 7 4 d o u b l i n g p e r d a y v e r s u s 0 . 3 5

E CD C - T e r m7%K \ q \ \

~ ~ ( 3 9 , 9 ~ ' ~ k ~,'klv11atiNS i1 X b I W N l W N l a N W W N l

2 0 0 K d-9 7 . 4 K d

6 8 K d ' 443K -d

F I G . 9 . O v e r e x p r e s s i o n o f HER2 E C D i n B T - 4 7 4 a n d MDA-453t u m o r c e l l s . MDA-453 a n d B T - 4 7 4 c e l l s w e r e t r a n s f e c t e d w i t h t h eHER2 E C D e x p r e s s i o n v e c t o r ( p W 5 9 7 . 3 A ) t o y i e l d s e p a r a t e c u l -t u r e s o f p e r m a n e n t t r a n s f e c t a n t s ( M D A - 4 5 3 / M 8 , M D A - 4 5 3 / M 1 2 ,B T - 4 7 4 / p W - 1 , a n d B T - 4 7 4 / p W - 2 ) a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n dM e t h o d s . D T 1 - r e d u c e d a l i q u o t s o f e x t r a c t s f r o m u n t r a n s f e c t e d a n dt r a n s f e c t e d c e l l s , i n c l u d i n g t r a n s f e c t e d C O S c e l l s ( C - p W 5 9 7 . 3 A ) ,w e r e e l e c t r o p h o r e s e d , t r a n s f e r r e d t o a m e m b r a n e , a n d p r o b e d w i t he i t h e r HER2 ECD- o r HER2 C - t e r m i n u s ( C - T e r m ) - s p e c i f i c p o l y -c l o n a l a n t i b o d i e s , a n d p r o t e i n b a n d s w e r e i d e n t i f i e d b y 1 2 5 I - p r o t e i nA a s d e s c r i b e d f o r F i g . 5 . As s h o w n , t h e d i f f e r e n t i a l l y s t a i n e d1 0 0 - k D a HER2 E C D b a n d ( l o c a t e d b y t h e s i n g l e i n t e n s e b a n d f r o mt h e C - p W 5 9 7 . 3 A e x t r a c t ) i s o v e r e x p r e s s e d o n l y i n t h e t r a n s f e c t e dc e l l s , w h i l e f u l l - l e n g t h HER2 r e c e p t o r ( t h e i n t e n s e b a n d j u s t b e l o wt h e 2 0 0 - k D a m a r k e r ) i s o v e r e x p r e s s e d i n b o t h c o n t r o l a n d t r a n s -f e c t e d t u m o r c e l l s .

d o u b l i n g p e r d a y ) a n d d em o n s t r a t e d n o s i g n i f i c a n t g r o w t hi n h i b i t i o n o n c o n t i n u o u s c u l t u r e e x p o s u r e t o 2 , u g o fmuMAb4D5 p e r m l ( F i g . 1 0 ) .DISCUSSION

R e s u l t s p r e s e n t e d h e r e d e m o n s t r a t e t h a t a t r u n c a t e d2 . 3 - k b t r a n s c r i p t f r o m t h e HER2 p r o t o - o n c o g e n e i s p r o -d u c e d b y a l t e r n a t i v e p r o c e s s i n g o f t h e p r i m a r y HER2 r e c e p -t o r t r a n s c r i p t . T h e 5 ' 2 . 1 - k b s e g m e n t o f t h e t r u n c a t e d HER2t r a n s c r i p t i s i d e n t i c a l t o t h e 5 ' e n d o f t h e f u l l - l e n g t h 4 . 6 - k bHER2 t r a n s c r i p t ; h o w e v e r , t h e 3 ' e n d d i v e r g e s i n t h e t r u n -c a t e d t r a n s c r i p t , r e v e a l i n g a n e x o n i c e x t e n s i o n w i t h a ni n - f r a m e s t o p c o d o n a n d a p o l y ( A ) a d d i t i o n s i t e . T h u s , u n l i k et h e a l t e r n a t e e x o n i c s p l i c i n g m e c h a n i s m m o s t c o m m o n l yd e s c r i b e d f o r o t h e r t r a n s m e m b r a n e r e c e p t o r s y s t e m s , i n -c l u d i n g t h e r a t E G F r e c e p t o r ( 3 3 ) , p r o d u c t i o n o f t h e t r u n -c a t e d HER2 t r a n s c r i p t u s e s a n a l t e r n a t i v e p o l y a d e n y l a t i o ns i g n a l t h a t p e r m i t s r e a d i n g i n t o t h e HER2 i n t r o n , l i k e t h a tr e c e n t l y r e p o r t e d f o r t h e c h i c k e n E G F r e c e p t o r s y s t e m ( 1 1 ) .T h e t r u n c a t e d HER2 t r a n s c r i p t e n c o d e s a 1 0 0 - k D a f o r m o ft h e 1 8 5 - k D a t r a n s m e m b r a n e r e c e p t o r t h a t , w i t h t h e e x c e p -t i o n o f 2 0 C - t e r m i n a l a m i n o a c i d s , c o n t a i n s t h e e n t i r e HER2ECD. T h i s HER2 E C D p r o t e i n i s f u l l y r e c o g n i z e d b y N - t e r -m i n u s - s p e c i f i c a n t i - H E R 2 a n t i b o d i e s , a n d t h e a l t e r n a t i v e l yp r o c e s s e d E C D - e n c o d i n g t r a n s c r i p t i s p r e s e n t a t v a r i a b l el e v e l s i n a l l e i g h t H E R 2 - e x p r e s s i n g c a n c e r c e l l l i n e s exam-i n e d .O b s e r v a t i o n o f a 2 . 3 - k b HER2 t r a n s c r i p t i n t h e HER2-o v e r e x p r e s s i n g g a s t r i c c a n c e r c e l l l i n e MKN7 t h a t h y b r i d -i z e d w i t h 5 ' b u t n o t 3 ' HER2 c DNA p r o b e s was i n i t i a l l y



9/11

E C T O D O M A I N P R O D U C E D BY TRUNCATED HER2 TRANSCRIPT 2 2 5 5A 1.0-

- 0 .8

e , c 0. 6 . 6EU

icc a0 . 4 -0 . 2 '

0 . 0 1

Bi1

0

a.0Ez=

1

U n t r a n s f e c t e dp W 5 9 7 . 3 A T r a s f e c t e d

MDA-453

3 5

Day

BT-474

7

F I G . 1 0 . R e s i s t a n c e o f HER2-overexpressing tumor cells tomuM A b 4D5 i n d u c e d b y t h e t r a n s f e c t e d o v e r e x p r e s s i on of HER2ECD. C o n t r o l a n d p W 5 9 7 . 3 A - t r a n s f e c t e d MDA-453 ( M D A - 4 5 3 /M 1 2 ) a n d B T - 4 7 4 ( B T - 4 7 4 / p W - 1 ) c e l l s ( 1 0 5 ) were p l a t ed into t r i p l i -c a t e 2 5 - c m 2 c u l t u r e f l a s k s on d ay 0 , with o r w i t h o u t t h e addition of2, u g o f muMAb4D5 p e r m l . ( A) Flasks were h a r v e s t e d , and meant o t a l c e l l counts were d e t e r m i n e d on d ay 7 , w i t h r e s u l t s averagedf r o m d u p l i c a t e e x p e r i m e n t s and s h o w n as th e ratio ofmuMAb4D5-t r e a t e d t o u n t r e a t e d c e l l c o u n t s f o r b o t h transfected and untrans-f e c t e d tum o r c e l l s . ( B ) To compare th e d i f f e r e n t muMAb4D5 treat-ment responses over t i m e , mean c e l l c o un t s ( standard error of themean) f o r t r a n s f e c t e d and untransfected BT-474 c e l l s were deter-mined a f t e r 3 , 5 , and 7 days of growth in c u l t u r e .

r e p o r t e d b y Yamamoto e t a l . ( 4 0 ) . Evidence from othergroups f o r t h e e x i s t e n c e of a truncated HER2 transcript byN o r t h e r n b l o t t i n g o f RNA f r o m HER2-overexpressing hu-man b r e a s t cancer c e l l l i n e s h as been i n c o n c l u s i v e , in partb e c a u s e o f t h e predominance o f t h e normal 4.6-kb HER2t r a n s c r i p t ( 1 , 2 1 , 4 1 ) . Th e r e l a t i v e abundance of the f u l l -l e n g t h versus t h e truncated HER2 transcri p t varies greatly int h e d i f f e r en t b r e as t , ovarian, and gas tr i c cancer cell lines. InMKN7 c e l l s , t h e r a t i o of f u l l - l e n g t h to truncated transcript is1 . 1 . By c o m p a r i s o n , a l l s i x o f the b r e as t cancer cell lines( i r r e s p e c t i v e o f t h e i r 3 0 - f o l d v ar i at i o n i n overall HER2e x p r e s s i o n ) e x h i b i t a r a t i o of 40 , while the SK-OV-3 ovariancancer c e l l s have a r a t i o o f 1 6 . At present, the cellularf a c t o r s g o v e r n i n g t h e r e l a t i v e amounts of the two HER2t r a n s c r i p t s are unkno wn.

C l i n i c a l a na l y s i s h a s d e t e c t e d HER2 ECD protein in theb l o o d o f p a t i e n t s with H E R 2 - o v e r e x p r e s s i n g tumors (23),and s e v e r a l reports have characterized t h e soluble HER2

E C D p r o t e i n f o u n d i n m e d i a c o n d i t i o n e d b y H E R 2 - o v e r e x -p r e s s i n g S K - B R - 3 a n d B T - 4 7 4 c e l l s ( 1 , 2 4 , 4 1 ) . H o w e v e r , t h em e c h a n i s m a c c o u n t i n g f o r t h i s s o l u b l e HER2 E C D p r o t e i nh a s n o t b e e n f u l l y e s t a b l i s h e d . P u l s e - c h a s e e x p e r i m e n t ss u g g e s t t h a t t h e HER2 m e m b r a n e r e c e p t o r o n S K - B R - 3 c e l l si s p r o t e o l y t i c a l l y c l e a v e d t o r e l e a s e s o l u b l e E C D ( 4 1 ) . F u r -t h e r m o r e , t h e f a c t t h a t s o l u b l e HER2 E C D c an b e s h e d b yp r o t e o l y t i c c l e a v a g e o f s u r f a c e r e c e p t o r may b e d e d u c e df r o m s t u d i e s u s i n g H E R 2 - n e g a t i v e NIH 3 T 3 c e l l s t r a n s f e c t e dw i t h a f u l l - l e n g t h HER2 cDNA e x p r e s s i o n v e c t o r ( 2 2 ) .A l t h o u g h f u l l - l e n g t h HER2 cDNA s h o u l d n o t g e n e r a t e at r u n c a t e d HER2 t r a n s c r i p t o f t h e t y p e t h a t we h a v e i d e n t i -f i e d , e x t r a c e l l u l a r HER2 E C D i s a b u n d a n t l y p r o d u c e d b yH E R 2 - t r a n s f e c t e d NIH 3 T 3 c e l l s . T h u s , i t i s p o s s i b l e t h a tt h e m a j o r p r o p o r t i o n o f e x t r a c e l l u l a r HER2 E C D p r o t e i n i sp r o d u c e d b y p r o t e o l y t i c c l e a v a g e o f o v e r e x p r e s s e d 1 8 5 - k D as u r f a c e r e c e p t o r .I n c o n t r a s t t o e x t r a c e l l u l a r HER2 E C D g e n e r a t e d b yp r o t e o l y t i c s h e d d i n g o f s ur f ac e r e c e p t o r , i n t r a c e l l u l a r 1 0 0 -kDa HER2 E C D p r o d u c e d b y t r u n c a t e d ( 2 . 3 - k b ) HER2t r a n s c r i p t a p p e a r s t o u n d e r g o d i f f e r e n t i a l t r a f f i c k i n g b e t w e e ne n d o p l a s m i c r e t i c u l u m a n d G o l g i , l e a d i n g t o i t s p e r i n u c l e a ra c c u m u l a t i o n . T h i s c o n c l u s i o n i s s u p p o r t e d b y f o u r d i f f e r e n to b s e r v a t i o n s : ( i ) W e s t e r n i m m u n o b l o t s s h o w t h a t w h i l eMKN7, B T - 4 7 4 , a n d S K - B R - 3 c e l l s a l l p r o d u c e c o m p a r a b l eamounts o f s o l u b l e HER2 ECD, MKN7 c e l l s p r o d u c e i n -c r e a s e d l e v e l s o f c e l l - a s s o c i a t e d 1 0 0 - k D a HER2 ECD, con-s i s t e n t w i t h t h e i r near 4 0 - f o l d e x c e s s l e v e l o f t r u n c a t e dHER2 t r a n s c r i p t r e l a t i v e t o B T - 4 7 4 a n d SK-BR-3 c e l l s ; ( i i )MKN7 c e l l s t r y p s i n i z e d u n t i l t h e i r s u r f a c e 1 8 5 - k D a HER2receptor i s no l o n g e r d e t e c t a b l e b y W e s t e r n b l o t t i n g s t i l lc o n t a i n e x c e s s l e v e l s o f 1 0 0 - k D a HE R2 ECD i n t h e i r c e l le x t r a c t s ; ( i i i ) d o u b l e i m m u n o f l u o r e s c e n c e l a b e l i n g o f MKN7c e l l s u s i n g C - t e r m i n u s - a n d E C D - s p e c i f i c a n t i - H E R 2 a n t i -b o d i e s s h o w s t h a t t h e o v e r e x p r e s s e d HER2 E C D i s i n t r a c e l -l u l a r a n d c o n c e n t r a t e d w i t h i n t h e p e r i n u c l e a r r e g i o n ; a n d ( i v )m e t a b o l i c l a b e l i n g a n d e n d o g l y c o s i d a s e d i g e s t i o n i n d i c a t et h a t HER2 E C D i s c o m p o s e d o f h i g h - m a n n o s e - t y p e N - g l y -can, i n c o n t r a s t t o t h e c o m p l e x - t y p e N - g l y c a n p r e s e n t i nmature 1 8 5 - k D a HER2. T h i s e n d o - H s e n s i t i v i t y a n d a r r e s t e dm a t u r a t i o n a n d p r o c e s s i n g o f HE R2 ECD N - g l y c a n mays i g n i f y t h a t n e w l y s y n t h e s i z e d 1 0 0 - k D a HE R2 ECD u n d e r -goes d i f f e r e n t i a l t r a f f i c k i n g b e t w e e n t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u -l u m a n d G o l g i compartments compared w i t h f u l l - l e n g t hr e c e p t o r . O f i n t e r e s t , t h e apparent p e r i n u c l e a r s i t e o f s e q u e s -t r a t i o n f o r H E R 2 ECD i s s i m i l a r t o t h e i n t r a c e l l u l a r s i t e o fr o u t i n g f o r 1 8 5 - k D a s u r f a c e receptor f o l l o w i n g b i n d i n g b ye i t h e r l i g a n d o r any one o f s e v e r a l g r o w t h - i n h i b i t i n g ( b u t n o tg r o w t h - s t i m u l a t i n g ) a n t i - H E R 2 a n t i b o d i e s ( 2 , 3 ) ; t h i s a l s oappears t o b e t h e i n t r a c e l l u l a r r o u t i n g f o r r e c e p t o r - b o u n dm u M A b 4 D 5 ( d a t a no t s h o w n ) . T o g e t h e r , t h e s e f i n d i n g s noto n l y i n d i c a t e t h a t 1 0 0 - k D a HE R2 ECDmay b e d i f f e r e n t i a l l yr o u t e d b e t w e e n t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m and G o l g i com-partments c o m p a r e d w i t h newly s y n t h e s i z e d f u l l - l e n g t hH E R 2 b u t a l s o p o i n t t o a p o s s i b l e s u b c e l l u l a r s i t e o f i n t e r -a c t i o n b e t w e e n n e w l y s y n t h e s i z e d HER2 ECD a n d mem-b r a n e - a c t i v a t e d a n d i n t e r n a l i z e d 1 8 5 - k D a HER2 r e c e p t o r .Th e p o s s i b l e b i o l o g i c a l s i g n i f i ca nc e o f t h i s o v e r e x p r e s s e di n t r a c e l l u l a r HER2 ECD was f i r s t s u g g e s t e d b y t h e a t y p i c a lr e s i s t a n c e p r o f i l e s o f c u l t u r e d MKN7 and S K - O V - 3 c e l l se x p o s e d t o g r o w t h - i n h i b i t i n g c o n c e n t r a t i o n s o f m u M A b 4 D 5 .E x c e p t f o r t h e s e c e l l l i n e s , t h e a b i l i t y o f anti-HER2 mono-c l o n a l a n t i b o d i e s s u c h as muMAb4D5 t o i n h i b i t growth o fHER2-overexpressing tumor c e l l s appears to c o r r e l a t e w e l lw i t h 1 8 5 - k D a HER2 r e c e p t o r l e v e l s ( 1 0 , 1 7 , 3 5 ). Fo r exam-p l e , t u m o r c e l l s BT-474 and SK-BR -3, with a p p r o x i m a t e l y

1 4 --.--oBT-474"W-1

1 2 - B T - 4 7 4 / p W - 1 + 4 D 5- B T 4 7 4

1 0 - *- B T 4 7 4 + 4 D 5

8 *

6

4

20 pn -

VOL. 1 3 , 1 9 9 3


10/11

2 2 5 6 SC O TT E T AL.2 5 - f o l d - g r e a t e r HER2 s u r f a c e r e c e p t o r l e v e l r e l a t i v e t oM C F - 7 , e x p e r i e n c e 67% g r o w t h i n h i b i t i o n i n t h e p r e s e n c e o fa n t i - H E R 2 m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s ( m e a n r e s p o n s e s t o t h r e ed i f f e r e n t g r o w t h - i n h i b i t i n g m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s [ 4 D 5 ,3 H 4 , a n d 7 F 3 ] r e l a t i v e t o c o n t r o l c e l l r e s p o n s e s ) . T h i ss e n s i t i v i t y t o d i f f e r e n t a n t i - H E R 2 m o n o c l o n a l a n t i b o d i e so c c u r s d e s p i t e e x c e s s i v e e x t r a c e l l u l a r s h e d d i n g o f s o l u b l eHER2 E C D b y t h e s e c e l l s . G r o w t h o f MCF-7 a n d o t h e rl o w - H E R 2 - e x p r e s s i n g c e l l l i n e s ( e . g . , MDA-MB-468) i s e s -s e n t i a l l y u n a f f e c t e d b y t h e s e a n t i - H E R 2 m o n o c l o n a l a n t i -b o d i e s . I n c o n t r a s t , SK-OV-3 a n d MKN7 c e l l s , w i t h t h e i r1 5 - f o l d o v e r e x p r e s s i o n o f HER2 s u r f a c e r e c e p t o r ( b u t 2 . 5 - t o4 0 - f o l d r e l a t i v e e x c e s s o f t r u n ca t ed HER2 t r a n s c r i p t l e v e l sc o m p a r e d w i t h B T - 4 7 4 a n d S K - B R - 3 c e l l s ) , r e s p o n d l i k el o w - e x p r e s s i n g c e l l s a n d s h o w o n l y 1 6 a n d 0 % g r o w t hi n h i b i t i o n , r e s p e c t i v e l y , o n e x p o s u r e t o t h e s e s a m e a n t i -HER2 a n t i b o d i e s . T h e o v e r e x p r e s s e d 1 8 5 - k D a r e c e p t o r o na n t i - H E R 2 - r e s i s t a n t MKN7 c e l l s i s b o u n d a n d i n t e r n a l i z e db y t h e s e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s much l i k e t h a t o f S K - B R - 3a n d B T - 4 7 4 c e l l s ( 3 5 ; d a t a n o t s h o w n ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e i rr e s i s t a n c e i s n o t a c c o u n t e d f o r b y l a c k o f r e ce p t o r a v a i l a b i l -i t y o r a b i l i t y t o i n t e r n a l i z e . To d e t e r m i n e w h e t h e r t h e r e i s am e c h a n i s t i c a s s o c i a t i o n b e t we e n a n t i - H E R 2 r e s i s t a n c e a n do v e r e x p r e s s e d i n t r a c e l l u l a r HER2 ECD, t r a n s f e c t i o n s t u d i e sw e r e p e r f o r m e d .H E R 2 - o v e r e x p r e s s i n g b r e a s t c a n c e r c e l l l i n e s s e n s i t i v e t omuMAb4D5 w e r e t r a n s f e c t e d w i t h t h e HER2 ECD. T h e t w oHER2 E C D - t r a n s f e c t e d a n d - o v e r e x p r e s s i n g MDA-MB-453c l o n e s a s s a y e d a f t e r G 4 1 8 s e l e c t i o n w e r e f o u n d t o h a v ea c q u i r e d s i g n i f i c a n t r e s i s t a n c e t o muMAb4D5. T o t e s t m o r er i g o r o u s l y f o r a d e p e n d e n t r e l a t i o n s h i p b e t w e e n HER2 E C Do v e r e x p r e s s i o n a n d muMAb4D5 r e s i s t a n c e , B T - 4 7 4 c e l l s( t h e m o s t s e n s i t i v e o f o u r H E R 2 - o v e r e x p r e s s i n g c e l l s ) w e r es e l e c t e d a f t e r t r a n s f e c t i o n b y e x p o s u r e t o a c o m p l e t e l yc y t o s t a t i c d o s e o f muMAb4D5 ( 2 , u g / m l ) . T h e r e s u l t i n gB T - 4 7 4 t r a n s f e c t a n t s n o t o n l y o v e r e x p r e s s e d i n t r a c e l l u l a r1 0 0 - k D a HER2 E C D b u t a l s o d e m o n s t r a t e d m o r e r a p i dg r o w t h i n c u l t u r e a n d c o m p l e t e r e s i s t a n c e t o g r o w t h i n h i b i -t i o n b y muMAb4D5. T h e s e t r a n s f e c t i o n r e s u l t s s u g g e s t t h a tt h e i n t r a c e l l u l a r o v e r e x p r e s s i o n o f t r u n c a t e d HER2 t r a n -s c r i p t a n d 1 0 0 - kD a HER2 E C D c a n i n h i b i t t h e n o r m a lc y t o s t a t i c r e s p o n s e o f H E R 2 - o v e r e x p r e s s i n g c e l l s t omuMAb4D5 a n d p r o v i d e a l i k e l y e x p l a n a t i o n f o r t h e o b -s e r v e d n a t u r a l r e s i s t a n c e o f S K - O V - 3 a n d M K N 7 c e l l s t oa n t i - H E R2 m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s .I n o u r s t u d i e s , i t i s n o t l i k e l y t h a t e i t h e r t h e a c q u i r e d o rn a t i v e r e s i s t a n c e o f H E R 2 - o v e r e x p r e s s i n g c a n c e r c e l l s t omuMAb4D5 i s p r o d u c e d b y t h e p r e s e n c e o f o r i n t e r a c t i o nw i t h h e r e g u l i n , a s p e c i f i c h i g h - a f f i n i t y l i g a n d f o r t h e 1 8 5 - k D aHER2 r e c e p t o r t h a t h a s b e e n r e c e n t l y d e s c r i b e d ( 1 5 , 3 2 ) ,a l t h o u g h i t w o u l d b e o f i n t e r e s t t o l e a r n w h e t h e r a n yi n t e r a c t i o n c a n o c c u r b e t w e e n h e r e g u l i n a n d t h e 1 0 0 - k D aHER2 ECD. S i n c e h e r e g u l i n t r a n s c r i p t s a r e n o t d e t e c t a b l e i nt h e e i g h t d i f f e r e n t b r e a s t , o v a r i a n , a n d g a s t r i c c a n c e r c e l ll i n e s u s e d f o r t h i s s t u d y ( d a t a n o t s h o w n ) , t h e p r e s e n c e o fh e r e g u l i n c a n n o t e x p l a i n a n y o f o u r r e p o r t e d f i n d i n g s . T h emechanism b y w h i c h HE R2 ECD o v e r e x p r e s s i o n r e s u l t s i nr e s i s t a n c e t o m uMA b 4D5 r e m a i n s u n c l e a r . O n e h y p o t h e s i si s t h a t t h e p e r i n u c l e a r a c c u m u l a t i o n o f HER2 E C D , a sd e m o n s t r a t e d i n MKN7 c e l l s , somehow i n t e r f e r e s w i t hi n t e r n a l i z e d c o m p l e x e s c o n s i s t i n g o f muMAb4D5 a n d 1 8 5 -kDa HER2. O t h e r d a t a f r o m r e l a t e d r e c e p t o r s y s t e m s a l s os u p p o r t a b i o l o g i c a l r o l e f o r HER2 ECD.T h e f i n d i n g o f s o l u b l e E C D f o r m s i n many t r a n s m e m b r a n er e c e p t o r s y s t e m s g e n e r a t e d b y p r o t e o l y t i c c l e a v a g e a n d / o ra l t e r n a t i v e t r a n s c r i p t i o n a l p r o c e s s i n g h a s p r o m p t e d t h e s u g -

g e s t i o n t h a t t h e s e p r o t e i ns s h a r e a c ommon p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n . A v i a n , r o d e n t , a n d h u m a n E C D f o r m s o f t h e E G Fr e c e p t o r h a v e b e e n i d e n t i f i e d a n d f o u n d o v e r e x p r e s s e d i ne m b r y o n i c a n d a d u l t t i s s u e s ( 5 , 1 1 , 3 3 ) . A t p r e s e n t , h o w e v e r ,o n l y t h e a v i a n f o r m i s known t o b e g e n e r a t e d b y t h e s a m eu n u s u a l a l t e r n a t e p o l y a d e n y l a t i o n m e c h a n i s m t h a t p r o d u c e st h e t r u n c a t e d HER2 t r a n s c r i p t t h a t w e f i n d i n human t u m o rc e l l s ( 1 1 ) , a n d t h e r e h a v e b e e n n o p r i o r r e p o r t s o n t h ee x i s t e n c e a n d s i g n i f i c a n c e o f i n t r a c e l l u l a r l y l o c a l i z e d HER2E C D i n a n y mammalian s p e c i e s . S t u d i e s i n p r o g r e s s a r el o o k i n g f o r e v i d e n c e o f a p h y s i c a l i n t e r a c t i o n b e t w e e n1 0 0 - k D a HER2 ECD a n d 1 8 5 - k D a HER2 r e c e p t o r w i t h i nH E R 2 - o v e r e x p r e s s i n g c e l l s , s i n c e t r u n c a t e d a n d n o r m a lE G F r e c e p t o r s a r e known t o h e t e r o d i m e r i z e a n d d o m i n a n t l ys u p p r e s s t h e a c t i v a t i o n a n d s i g n a l i n g o f n o r m a l E G F r e c e p -t o r h o m o d i m e r s ( 5 , 1 1 , 1 9 ) . T h e i n t r a c e l l u l a r f o r m a t i o n o fs u c h h e t e r o d i m e r s i n H E R 2 - o v e r e x p r e s s i n g t u m o r c e l l s t h a to v e r p r o d u c e a 2 . 3 - k b t r a n s c r i p t , l i k e MKN7 c e l l s , m i g h te x p l a i n t h e a b i l i t y o f muMAb4D5 t o b i n d a n d i n t e r n a l i z e t h e1 8 5 - k D a HER2 r e c e p t o r b u t n o t t r a n s d u c e i t s g r o w t h i n h i b -i t o r y e f f e c t . O u r r e s u l t s u n d e r s c o r e t h e u r g e n c y f o r a b e t t e ru n d e r s t a n d i n g o f t h e p h y s i o l o g i c a l r o l e o f t h e HER2 r e c e p t o rs y s t e m a n d p r o v i d e e v i d e n c e t h a t i n t r a c e l l u l a r s e q u e s t r a t i o no f HER2 E C D may a l t e r t h e g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s o fH E R 2 - e x p r e s s i n g human t u m o r s .

A C KN OW LED G M ENTST h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y g r a n t s C A - 4 4 7 6 8 a n d C A - 3 6 7 7 3 f r o mt h e N a t i o n a l C a n c e r I n s t i t u t e a n d i n p a r t b y t h e H a z e l P . M o n r o eM e m o r i a l F u n d a n d t h e UCSF B r e a s t C a n c e r R e s e a r c h F u n d .We t h a n k H a l e h A s g a r i , J a n e e n W y a t t , a nd X i a o H u i X i o n g f o re x c e l l e n t t e c h n i c a l a s s i s t a n c e .

REFERENCES1 . A l p e r , O . , K . Y a m a g u c h i , J . H i t o m i , S . H o n d a , T . M a t s u s h i m a ,a n d K . A b e . 1 9 9 0 . T h e p r e s e n c e o f c - e r b B - 2 g e ne p r o d u c t -r e l a t e d p r o t e i n i n c u l t u r e m e d i u m c o n d i t i o n e d b y b r e a s t c a n c e rc e l l l i n e S K - B r - 3 . C e l l G r o w t h D i f f e r . 1 : 5 9 1 - 5 9 9 .2 . B a c u s , S . S . , E . H u b e r m a n , D . C h i n , K . K i g u c h i , S . S i m p s o n , M.L i p p m a n , a n d R . L u p u . 1 9 9 2 . A l i g a n d f o r t h e e r b B - 2 o n c o g e n i cp r o d u c t ( g p 3 O ) i n d u c e s d i f f e r e n t i a t i o n o f h u m a n b r e a s t c a n c e rc e l l s . C e l l G r o w t h D i f f e r . 3 : 4 0 1 - 4 1 1 .3 . B a c u s , S . S . , I . S t a n c o v s k i , E . H u b e r m a n , D . C h i n , E . H u r w i t z ,G . B . M i l l s , A . U l l r i c h , M . S e l a , a n d Y . Y a r d e n . 1 9 9 2 . Tumori n h i b i t o r y m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t o t h e H E R - 2 / N e u r e c e p t o ri n d u c e d i f f e r e n t i a t i o n o f h u m a n b r e a s t c a n c e r c e l l s . C a n c e r R e s .5 2 : 2 5 8 0 - 2 5 8 9 .4 . B a r g m a n n , C . I . , M . - C . H u n g , a n d R . W e i n b e r g . 1 9 8 6 . T h e n e uo n c o g e n e e n c o d e s a n e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r - r e l a t e dp r o t e i n . N a t u r e ( L o n d o n ) 3 1 9 : 2 2 6 - 2 3 0 .5 . B a s u , A . , R . M . R a g h u n a t h , S . B i s h a y e e , a n d M. D a s . 1 9 8 9 .I n h i b i t i o n o f t y r o s i n e k i n a s e a c t i v i t y o f t h e e p i d e r m a l g r o w t hf a c t o r ( E G F ) r e c e p t o r b y a t r u n c a t e d r e c e p t o r f o r m t h a t b i n d s t oE G F : r o l e f o r i n t e r r e c e p t o r i n t e r a c t i o n i n k i n a s e r e g u l a t i o n .M o l . C e l l . B i o l . 9 : 6 7 1 - 6 7 7 .6 . C o u s s e n s , L . , T . L . Y a n g - F e n g , Y . - C . L i a o , E . C h e n , A . G r a y , J .M c G r a t h , P . H . S e e b u r g , T . A . L i b e r m a n n , J . S c h i e s s i n g e r , U .F r a n c k e , A . L e v i n s o n , a n d A . U l l r i c h . 1 9 8 5 . T y r o s i n e k i n a s er e c e p t o r w i t h e x t e n s i v e h o m o l o g y t o E G F r e c e p t o r s h a r e sc h r o m o s o m a l l o c a t i o n w i t h n e u o n c o g e n e . S c i e n c e 2 3 0 : 1 1 3 2 -1 1 3 9 .7 . D o w n i n g , J . R . , M . F . R o u s s e l , a n d C . J . S h e r r . 1 9 8 9 . L i g a n da n d p r o t e i n k i n a s e C d o w n m o d u l a t e t h e c o l o n y - s t i m u l a t i n gf a c t o r 1 r e c e p t o r b y i n d e p e n d e n t m e c h a n i s m s . M o l . C e l l . B i o l .9 : 2 8 9 0 - 2 8 9 6 .8 . E n g e l h o r n , S . , a n d R . W. R a a b . 1 9 9 1 . R a p i d e l e c t r o b l o t t i n g o fs m a l l f r a g m e n t s f r o m p o l y a c r y l a m i d e g e l s . B i o T e c h n i q u e s 1 1 :5 9 4 - 5 9 6 .9 . F e n d l y , B . M . , C . K o t t s , D . V e t t e r l e i n , G . D . L e w i s , M. W i n g e t ,



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E CTO D O M A IN P R O D U C E D BY TR U N C ATE D HER2 TRANSCRIPT 2 2 5 7M. E . C a r v e r , S . R . W a t s o n , J . S a r u p , S . S a k s , A . U l l r i c h , a n dH . M. S h e p a r d . 1 9 9 0 . The e x t r a c e l l u l a r d o m a i n o f H E R 2 / n e u i sa p o t e n t i a l immunogen f o r a c t i v e s p e c i f i c i m m u n o t h e r a p y o fb r e a s t cancer. J . B i o l . R e s p o n s e M o d i f . 9 : 4 4 9 - 4 5 5 .1 0 . F e n d l y , B . M . , M. W i n g e t , R . M. H u d z i a k , M. T . L i p a r i , M. A .N a p i e r , a n d A . U l l r i c h . 1 9 9 1 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f m u r i n e mono-c l o n a l a n t i b o d i e s r e a c t i v e t o e i t h e r t h e human e p i d e r m a l g r o w t hf ac t o r r e c e p t o r o r H E R 2 / n e u gene p r o d u c t . C a n c e r R e s . 5 0 :1 5 5 0 - 1 5 5 8 .1 1 . F l i c k i n g e r , T . W . , N . J . M a i h l e , a n d H . - J . K u n g . 1 9 9 2 . A na l t e r n a t i v e l y p r o c e s s e d mRNA f r o m t h e a v i a n c - e r b B genee n c o d e s a s o l u b l e , t r u n c a t e d f o r m o f t h e r e c e p t o r t h a t can b l o c kl i g a n d - d e p e n d e n t t r a n s f o r m a t i o n . M o l . C e l l . B i o l . 1 2 : 8 8 3 - 8 9 3 .1 2 . G u b l e r , U . , a n d B . J . H o f f m a n n . 1 9 8 3 . A s i m p l e a n d v erye f f i c i e n t method f o r g e n e r a t i n g cDNA l i b r a r i e s . Gene 2 5 : 2 6 3 -2 6 9 .1 3 . G u l l i c k , W. J . , L . B . L o v e , C . W r i g h t , D . M. B a r n e s , B .G u s t e r s o n , A . L . H a r r i s , a n d D . G . A l t m a n . 1 9 9 1 . c - e r b B - 2p r o t e i n o v e r e x p r e s s i o n i n b r e a s t cancer i s a r i s k f a c t o r i np a t i e n t s w i t h i n v o l v e d a n d u n i n v o l v e d l y m p h n o d e s . B r . J .C a n c e r 6 3 : 4 3 4 - 4 3 8 .1 4 . H a n c o c k , M . C . , B . C . L a n g t o n , T . C h a n , P . T o y , J . J . M o n a h a n ,R i . P . M i s c h a k , a n d L . K . S h a w y e r . 1 9 9 1 . A m o n o c l o n a l a n t i b o d ya g a i n s t t h e c - e r b B - 2 p r o t e i n e n h a n c e s t h e c y t o t o x i c i t y o f c i s -d i a m i n e d i c h l o r o p l a t i n u m a g a i n s t human b r e a s t a n d o v a r i a n t u -mor c e l l l i n e s . C a n c e r R e s . 5 1 : 4 5 7 5 - 4 5 8 0 .1 5 . H o l m e s , W. E . ,

a truncated intracellular her2neu receptor produced by alternative rna processing affects growth of...

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