a.a. 2014/2015 dispense del corso metodi analitici e ... ripristino_2014_15.pdf · colonna...

Dispense di Laboratorio di Metodi Analitici e Ripristino Ambientale, Laurea in STAMT. Dipartimento di Scienze Chimiche dell’Università di Padova Sara Bogialli, Gabriella Favaro A.A. 2013/14

1

A.A. 2014/2015

DISPENSE DEL CORSO

METODI ANALITICI E

RIPRISTINO AMBIENTALE

(LABORATORIO)

corso di Laurea in STAmT

Sara Bogialli

Gabriella Favaro


2

Sommario

Determinazione di anioni inorganici presenti in acque potabili o particolato su filtro tramite

cromatografia ionica e rivelazione conduttimetrica soppressa ............................................................ 3

Determinazione di cationi inorganici in acque potabili tramite cromatografia ionica e rivelazione

conduttimetrica soppressa .................................................................................................................... 6

Metodo Ufficiale di Dosaggio del Fosfato Solubile nelle Acque D-011 marzo 1981 ........................ 9

Determinazione del mercurio (e di piombo e cadmio) tramite assorbimento atomico ...................... 14

Analisi HPLC-UV di neonicotinoidi .................................................................................................. 18

IPA o PAH: Analisi del benzo[a]pirene nel particolato ..................................................................... 22

Determinazione di tricloroetilene e tetracloroetilene in un campione di acqua ................................. 25


3

DETERMINAZIONE DI ANIONI INORGANICI PRESENTI IN ACQUE POTABILI O

PARTICOLATO SU FILTRO TRAMITE CROMATOGRAFIA IONICA E RIVELAZIONE

CONDUTTIMETRICA SOPPRESSA

Questa esperienza vuole introdurre lo studente alla cromatografia ionica (IC). Questa tecnica

riveste oggi un ruolo estremamente importante in quanto con essa è stato possibile determinare

specie non facilmente analizzabili per altra via come ad esempio gli ioni solfato, ammonio,

fluoruro, e fosfato. La grande versatilità della tecnica è data sia dall’odierna tecnologia delle resine

a scambio ionico che dalla possibilità di utilizzare la tecnica conduttimetrica per la rivelazione degli

analiti. Quest’ultima circostanza è dovuta alla possibilità di sopprimere la conducibilità del fondo

dovuta all’eluente utilizzato, aumentando nel contempo la conducibilità e quindi il segnale degli

analiti.

In questa esperienza la IC viene usata per la quantificazione degli anioni inorganici presenti

nell’acqua potabile (o in un’acqua oligominerale o in un acqua di scarico, in quest’ultimo caso

previa filtrazione ed eventuale diluizione, oppure in filtri di campionamento del particolato) ed in

particolare di Cl–, NO3

–, (PO4

3–) e SO4

2–, per mezzo di una calibrazione esterna.

Procedimento sperimentale

Reagenti, frasi di rischio e di sicurezza

carbonato di sodio (Xi, R36, S22, S26)

bicarbonato di sodio (-)

acido solforico (C, R35, S26, S30, S45)

cloruro di sodio (-)

nitrato di sodio (O, Xn, R8, R22, R36/37/38, S17, S26, S27, S36/37/39)

fosfato biacido di potassio (S22, S24/25)

solfato di sodio (-)

Strumentazione e attrezzatura

cromatografo ionico (inerte) dotato di rivelatore conduttimetrico

colonna analitica anionica DIONEX AS4A-SC 250x4 mm con precolonna AG4A-SC 50x4

mm o AS22 250x4 mm con precolonna AG22 50x4 mm

soppressore anionico a micromembrana DIONEX ASRS ULTRA II 4 mm, o AMMS 300

4mm


4

2 spatoline

2 vetrini da orologio

4 imbuti

2 propipette

1 matraccio tarato da 1000 mL per l’acido solforico per il soppressore, se necessario

1 matraccio tarato da 1000 mL per l’eluente

4 matracci tarati da 100 mL


4 pipette graduate da 1 mL, 4 pipette graduate da 2 mL

oppure micropipette a volume variabile e relativi puntali

Procedimento

1. Utilizzando i matracci tarati da 100 mL preparare tre soluzioni madre contenenti 1000 ppm

(mg/L di ione, non di sale!) di Cl–, NO3

–, PO4

3– e SO4

2– partendo dai rispettivi sali disponibili

come standard primari, e diluire con acqua milliQ.

2. Se non disponibile, preparare la soluzione eluente costituita da una miscela di

carbonato/bicarbonato di sodio rispettivamente 1.8/1.7 mM per una colonna AS4A-SC ed

invece 4.5/1.4 mM per una colonna AS22 (ICS900). Tale soluzione va preparata in acqua

milliQ.

3. Se il soppressore non è di tipo elettrochimico, preparare una soluzione di H2SO4 25 mM per la

rigenerazione della membrana di soppressione (ICS900).

4. In 5 matracci tarati da 25 mL preparare le soluzioni standard miste contenenti tutti gli anioni,

rispettivamente in concentrazione:

Cl– (ppm) NO3

– (ppm) PO4

3– (ppm) SO4

2– (ppm)

soluzione 1 1 1 1 1

soluzione 2 5 5 2 2

soluzione 3 10 10 5 5

soluzione 4 20 20 10 10

soluzione 5 50 50 20 20

portando a volume con acqua milliQ.

5. Accendere il cromatografo e tutti i suoi moduli, innescare la pompa (PRIME/PURGE);

impostare una velocità di flusso di 1.5 mL/min per lo strumento di DX ed invece 1.2 mL/min

per l’ICS900, ed azionare la pompa stessa;


5

- subito dopo avviare la rigenerazione del soppressore impostando un valore di corrente di 50

mA per il soppressore elettrochimico (strumento a DX);

Fare stabilizzare il segnale di fondo, lasciando fluire l’eluente per almeno una decina di minuti

(conducibilità di fondo minore di 25 S).

6. Accendere il computer e caricare il software di gestione dei dati (Chromeleon a SX e PeakNet a

DX); creare una propria cartella (per esempio gruppo_1) nella directory opportuna.

7. Avvinare 3 volte la siringa di iniezione con la soluzione da iniettare. Si inizi con il bianco

(acqua milliQ) e si proceda con la soluzione standard più diluita.

8. Introdotta la siringa nell’apposito alloggiamento dell’iniettore si riempia il «loop» (inserire

almeno 3 volte il suo volume) assicurandosi di essere nella posizione LOAD.

9. ICS900 (a SX): scegliere o costruire un metodo con le condizioni cromatografiche, un metodo

di quantificazione e preparare una sequenza di iniezioni;

far partire la corsa e attivare l’acquisizione, premendo il tasto BATCH/START

Software PeakNet (a DX): aprire e caricare il metodo ISOCRATICASTUDENTI2 e premere

RUN/START; nominare il campione o lo standard in modo riconoscibile e progressivo, anche

nella seconda riga dove compare la directory (ad esempio std1a) e premere OK;

in entrambi i casi la valvola verrà commutata automaticamente.

10. Lasciare eluire i picchi e poi ripetere l’iniezione dello stesso standard per altre 2 volte.

11. Costruire una tabella riportando le aree dei picchi di ogni ione per i diversi livelli di

concentrazione.

12. Analizzare con la stessa procedura i campioni incogniti preoccupandosi di filtrare, se richiesto,

la soluzione (acque di scarico o superficiali). Per il filtro sonicare un quarto del filtro in 2.5

mL di acqua MilliQ per circa 30 min.

Elaborazione dati

Costruire le rette di calibrazione per ciascun ione, riportando i singoli punti; per ciascuna

retta riportare i parametri richiesti (cfr. dispense statistica).

Determinare il contenuto di ogni ione nel campione per interpolazione sulla retta di

calibrazione. Riportare i valori finali con il loro intervallo di confidenza.

Nella relazione inserire come esempio almeno un cromatogramma del campione e uno delle

soluzioni standard.

Condurre dei test statistici di confronto tra ciascun valore trovato e quello tabulato (se

disponibile) o riportato in etichetta.


6

DETERMINAZIONE DI CATIONI INORGANICI IN ACQUE POTABILI TRAMITE

CROMATOGRAFIA IONICA E RIVELAZIONE CONDUTTIMETRICA SOPPRESSA

Questa esperienza vuole introdurre lo studente alla cromatografia ionica (IC). Questa tecnica

riveste oggi un ruolo estremamente importante, grazie sia all’odierna tecnologia delle resine a

scambio ionico, che alla possibilità di utilizzare la tecnica conduttimetrica per la rivelazione degli

analiti. Quest’ultima circostanza dipende dalla possibilità di sopprimere la conducibilità di fondo

dovuta all’eluente utilizzato, ma non quella degli analiti, il cui segnale viene anzi aumentato.

In questa esperienza la IC viene usata per la quantificazione dei cationi inorganici presenti

nell’acqua potabile (o in un’acqua oligominerale o in un acqua di scarico, in quest’ultimo caso

previa filtrazione ed eventuale diluizione, oppure in un filtro di campionamento del particolato) ed

in particolare di Ca2+

, Mg2+

, Na+, K

+ e NH4

+ per mezzo di una calibrazione esterna.

Procedimento sperimentale

Strumentazione e attrezzatura

cromatografo ionico (inerte) dotato di rivelatore conduttimetrico

colonna analitica cationica DIONEX CS12A 250x4 mm con precolonna CG12A 50x4 mm

soppressore cationico a micromembrana DIONEX CMMS III 4 mm, o CSRS ULTRA 4

mm

2 spatoline

2 vetrini da orologio

4 imbuti

2 propipette

1 matraccio tarato da 1000 mL per l’idrossido di tetrabutilammonio per il soppressore, se

necessario (con CMMS III)

1 matraccio tarato da 1000 mL per l’eluente



4 pipette graduate da 1 mL

4 pipette graduate da 2 mL

oppure micropipette a volume variabile e relativi puntali


7


acido metansolfonico (C, R34, S26, S36, S45) o acido solforico (C, R35, S26, S30, S45)

(idrossido di tetrabutilammonio (C, R34; S26, S36/37/39, S45))

cloruro di sodio (-)

cloruro di potassio (S22, S24/25)

cloruro di calcio (Xi, R36, S22, S24)

cloruro di magnesio (S22, S24/25)

(cloruro di ammonio (Xn, R22; R36, S22))

Procedimento

1. Se non disponibile, preparare la soluzione eluente costituita da acido metansolfonico 20 mM

(o, in alternativa, H2SO4 11 mM) in acqua milliQ, per una colonna CS12A.

2. Se il soppressore non è di tipo elettrochimico, preparare una soluzione idrossido di

tetrabutilammonio 100 mM per la rigenerazione della membrana di soppressione (ICS900).

3. Utilizzando i matracci tarati da 100 mL preparare quattro soluzioni madre contenenti 1000

ppm (mg/L di ione, non di sale!) di ciascun catione, ottenute da NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2

(NH4Cl) per analisi, essiccati in stufa (oppure soluzioni standard commerciali), in acqua

milliQ.

4. In 5 matracci tarati da 25 mL preparare le soluzioni standard miste contenenti tutti i cationi,

rispettivamente in concentrazione:

NH4+ (ppm) Na

+ (ppm) K

+ (ppm) Ca

2+ (ppm) Mg

2+ (ppm)

soluzione 1 0.1 0.1 0.1 5 1

soluzione 2 1 1 1 10 5

soluzione 3 5 5 5 20 10

soluzione 4 10 10 10 50 20

soluzione 5 20 20 20 100 50

portando a volume con acqua milliQ.

5. Accendere il cromatografo e tutti i suoi moduli, innescare la pompa (PRIME/PURGE);

impostare una velocità di flusso di 1.2 mL/min ed azionare la pompa stessa;

6. subito dopo avviare la rigenerazione del soppressore impostando un valore di corrente di 50

mA per il soppressore elettrochimico (strumento a DX);

7. Fare stabilizzare il segnale di fondo, lasciando fluire l’eluente per almeno una decina di

minuti (conducibilità di fondo minore di 1-2 S).


8

8. Accendere il computer e caricare il software di gestione dei dati (Chromeleon a SX e

PeakNet a DX); creare una propria cartella (per esempio gruppo_1) nella directory

opportuna.

9. Avvinare 3 volte la siringa di iniezione con la soluzione da iniettare. Si inizi con il bianco

(acqua milliQ) e si proceda con la soluzione standard più diluita.

10. Introdotta la siringa nell’apposito alloggiamento dell’iniettore si riempia il «loop» (inserire

almeno 3 volte il suo volume) assicurandosi di essere nella posizione LOAD.

11. ICS900 (a SX): scegliere o costruire un metodo con le condizioni cromatografiche, un

metodo di quantificazione e preparare una sequenza di iniezioni;

12. far partire la corsa e attivare l’acquisizione, premendo il tasto BATCH/START

13. Software PeakNet (a DX): aprire e caricare il metodo CATIONI_2010_2011 e premere

RUN/START; nominare il campione o lo standard in modo riconoscibile e progressivo,

anche nella seconda riga dove compare la directory (ad esempio std1a) e premere OK;

14. in entrambi i casi la valvola verrà commutata automaticamente.

15. Lasciare eluire i picchi e poi ripetere l’iniezione dello stesso standard per altre 2 volte.

16. Costruire una tabella riportando le aree dei picchi di ogni ione per i diversi livelli di

concentrazione.

17. Analizzare con la stessa procedura i campioni incogniti preoccupandosi di filtrare, se

richiesto, la soluzione (acque di scarico o superficiali). Per il filtro sonicare un quarto del

filtro in 2.5 mL di acqua MilliQ per circa 30 min.

Elaborazione dati

Costruire le rette di calibrazione per ciascun ione, riportando i singoli punti; per ciascuna

retta riportare i parametri richiesti (cfr. dispense statistica).

Determinare il contenuto di ogni ione nel campione per interpolazione sulla retta di

calibrazione. Riportare i valori finali con il loro intervallo di confidenza.

Nella relazione inserire come esempio almeno un cromatogramma del campione e uno delle

soluzioni standard.

Condurre dei test statistici di confronto tra ciascun valore trovato e quello tabulato (se

disponibile) o riportato in etichetta.


9

METODO UFFICIALE DI DOSAGGIO DEL FOSFATO SOLUBILE NELLE ACQUE

D-011 MARZO 1981

Il fosforo nelle acque naturali e di scarico è presente quasi esclusivamente come fosfato, in

particolare ortofosfato, fosfato condensato (piro-, meta-, polifosfato) e fosfato legato a composti

organici. Queste specie possono trovarsi in forma solubile o non solubile. Non si può comunque

escludere la presenza di composti del fosforo con più basso numero di ossidazione.

Nella determinazione del fosforo totale è necessario trasformarlo tutto in ortofosfato. Ciò viene

effettuato con un attacco ossidante per i composti organici e per quelli in cui il fosforo è presente

con numero di ossidazione inferiore a +5, e con idrolisi acida per i polifosfati.

Il metodo spettrofotometrico al blu di molibdeno descritto di seguito viene utilizzato per la

determinazione dell'ortofosfato solubile e del fosforo totale.

Determinazione dell'ortofosfato solubile

Principio del metodo

Il metodo prevede la reazione degli ioni PO43–

con il molibdato di ammonio

((NH4)6Mo7O24·4H2O) e il tartrato di ossido di antimonio e potassio (K(SbO)C4H4O6·1/2 H2O) in

ambiente acido per formare un etero poliacido che viene ridotto a blu di molibdeno con acido

ascorbico.

Il metodo è applicabile alle acque naturali (anche di mare) e può essere impiegato in un

intervallo di concentrazioni compreso tra 0.03 e 0.3 mg/L di fosforo (come P).

Interferenze

Il Cu(II) e il Fe(III) non interferiscono se presenti in quantità rispettivamente inferiori a 10 e 50

ppm (mg/L). Gli arseniati interferiscono in quanto danno la stessa reazione dei fosfati. Il Cr(VI) e i

nitriti danno interferenza negativa dell'ordine del 3 % se presenti in concentrazione superiore a

1 mg/L. Solfuri e composti del silicio non interferiscono se presenti in concentrazioni inferiori a 1.0

e 10.0 ppm (rispettivamente mg/L di S e SiO2).


10

Parte sperimentale


eptamolibdato di esammonio tetraidrato ((NH4)6Mo7O24·4H2O) (Xi, R36/37/38, S26)

acido solforico (C, R35, S26, S30, S45)

acido ascorbico (C6H8O6) (-)

tartrato di ossido di antimonio e potassio (K(SbO)C4H4O6·1/2 H2O) (Xn, N, R20/22,

R51/53, S61)

diidrogenofosfato di potassio anidro (KH2PO4, standard primario) seccato a 105°C (-)

Attrezzatura

spettrofotometro UV-Visibile

cuvette di vetro da 1 cm

bilancia analitica

bilancia tecnica

vetrini da orologio

pinza e spatolina

imbuto

1 bottiglia di polietilene da 500 mL

1 bottiglia di polietilene da 250 mL

bottiglia da 500 mL

bottiglia da 1 L

bottiglia scura da 1 L (250 mL)

pipetta tarata da 10.0 mL

9 matracci da 100 mL

Di seguito sono riportate le istruzioni per preparare la quantità minima di reagenti necessari per

entrambi i gruppi di laboratorio.

Soluzione di molibdato d'ammonio

Si sciolgono 3 g di eptamolibdato di esammonio tetraidrato in 100 mL di acqua MilliQ (la

soluzione, conservata in bottiglie di polietilene al riparo dalla luce, è stabile per molti mesi).

Soluzione di acido solforico

Si versano cautamente sotto cappa 35 mL di H2SO4 concentrato in 220 mL di acqua MilliQ

(per 1 L: 140 mL di H2SO4 conc. in 900 mL di acqua) in bottiglia di vetro.


11

Soluzione di acido ascorbico

Si sciolgono 5.4 g di acido ascorbico in 100 mL di acqua MilliQ (la soluzione conservata in

frigorifero in bottiglie di polietilene è stabile per molti mesi, mentre a temperatura ambiente si

conserva per due o tre giorni).

Soluzione di tartrato di ossido di antimonio e potassio

Si sciolgono 67 mg di tartrato di ossido di antimonio e potassio in 50 mL di acqua MilliQ,

scaldando se è necessario.

Reagente misto

Si mescolano: 100 mL della soluzione di molibdato d'ammonio

250 mL di soluzione di acido solforico

100 mL di soluzione di acido ascorbico

50 mL di soluzione di tartrato di antimonio e potassio

in bottiglia di plastica.

Il reagente misto, preparato al momento dell'uso, non può essere conservato per più di 6 ore,

per cui va eliminato alla fine dell’esperienza.

Soluzione standard di fosforo

Si sciolgono 0.1075 g di diidrogenofosfato di potassio anidro in acqua milliQ e si diluisce a 250

mL in matraccio tarato (soluzione contenente 300 ppm (mg/L) di PO43–

). Annotare la quantità esatta

pesata e calcolare la concentrazione esatta (Se si conserva la soluzione bisogna trasferirla in

bottiglia scura).

Si prepara una soluzione diluita prelevando 10.0 mL della soluzione concentrata e diluendo a

100 mL con acqua MilliQ in matraccio (concentrazione 30 ppm, cioè 30 mg/L di PO43–

).

Procedimento

Procedure preliminari

1. Preparare 100 mL di reagente misto.

2. Preparare la soluzione del bianco, come descritto in seguito (in un matraccio da 100 mL

introdurre 10.0 mL del reagente misto e portare a volume con acqua milliQ).

3. Preparare una soluzione standard mettendo in un matraccio da 100 mL 3.0 mL di soluzione

standard di fosfato diluita, 10 mL di reagente misto e portando a volume. Dopo 10 minuti

registrare lo spettro dell’assorbanza in funzione della lunghezza d’onda nell’intervallo 400-

900 nm, contro il bianco. Annotare il valore del massimo di assorbimento.

Determinare la cinetica di reazione procedendo come segue.


12

1. Per seguire la cinetica di reazione, scegliere l’opzione “cinetica” e, dopo aver impostato la

di misura e aver azzerato l’assorbanza col bianco, inserire una cuvetta contenente 3 mL di

acqua milliQ, 300 L di reagente misto e 5 L di soluzione standard di fosfato diluita,

mescolare rapidamente la cuvetta servendosi del tappo e registrare l’assorbanza nel tempo

per circa 10-15 minuti, fino a che rimane costante per qualche minuto.

2. Ripetere l’operazione dopo aver risciacquato la cuvetta, con volumi di soluzione standard di

15 e 30 L. Valutare i tempi di attesa per fare l’analisi.

Analisi del campione

1. Introdurre in un matraccio da 100 mL 10.0 mL di reagente misto, 2 mL di acqua MilliQ e

portare a volume col campione (il campione risulta diluito 88:100). Leggere l'assorbanza a 885

nm contro il bianco, dopo il tempo stimato con la cinetica di reazione trascorso dalla

preparazione della soluzione stessa.

2. Valutare se la soluzione rientra nell’intervallo di linearità del metodo, meglio se si colloca a

metà della retta di calibrazione (0.025-0.25 unità di assorbanza): Se così non fosse modificare

opportunamente la concentrazione del campione.

3. Per verificare l’effetto dell’interferenza, preparare in un altro matraccio il campione con la

stessa modalità vista sopra ma aggiungendo, prima di portare a volume, 2 mL di soluzione di

NaNO2 alla concentrazione di 100 ppm (interferenza negativa) o 2 mL di soluzione di silice

(come metasilicato, Na2SiO3) alla concentrazione di 3500 ppm (interferenza positiva) e leggerne

l’assorbanza.

Quantificare l’effetto dell’interferenza

Retta di calibrazione

1. In 7 matracci da 100 mL si introducono con una pipetta o una micropipetta a volume variabile,

rispettivamente 0.0 (per il bianco), 0.3, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 mL di soluzione standard diluita di

fosfato. Si aggiunge a ciascun matraccio acqua milliQ e 10.0 mL del reagente misto,

mescolando, e si porta a volume. Appena preparato il bianco, azzerare lo strumento.

2. Azzerare lo strumento ponendo il bianco in entrambe le celle.

3. Misurare l'assorbanza del bianco ad una “ fissa” pari a 885 nm usando come riferimento acqua

milliQ. L'assorbanza del bianco non deve superare 0.005. Se il valore fosse più alto si dovranno

controllare i reattivi ed in particolare il molibdato di ammonio.

4. Misurare l'assorbanza di ogni soluzione ad una “ fissa” pari a 885 nm (a 710 nm si ottengono

valori di assorbanza del 20 % circa), usando come riferimento la soluzione del bianco. La

misura di assorbanza per ogni soluzione andrebbe fatta dopo i 10 e non oltre i 15 minuti

successivi alla preparazione della soluzione stessa.


13

Elaborazione dati

Si costruisce la retta di calibrazione ponendo in diagramma i valori di assorbanza letti in

funzione della concentrazione delle soluzioni. Riportare i parametri richiesti per tale retta (cfr.

dispense statistica).


14

DETERMINAZIONE DEL MERCURIO E DI PIOMBO E CADMIO TRAMITE

SPETTROSCPIA DI ASSORBIMENTO ATOMICO

Un rischio potenziale della dieta a base di pesce è il contenuto di metalli pesanti in alcuni di essi.

Gravi problemi di saluti possono derivare dall’assunzione di mercurio, piombo, cadmio, arsenico.

Questi elementi tendono ad accumularsi nell’organismo sia dei pesci che degli esseri umani

portando a gravi disturbi. La concentrazione di tali elementi nei pesci è regolata dalla Comunità

Europea e dalla USFDA.

Il mercurio viene determinato col metodo dei vapori freddi con un particolare sistema di

immissione del campione con cella di reazione (riduzione a Hg(l)) o con uno strumento dedicato. Il

piombo (e il cadmio) viene determinato per aspirazione diretta del campione solubilizzato nella

fiamma (aria-acetilene) di uno spettrofotometro ad assorbimento atomico. Dalla misura del segnale

di assorbanza a 283,3 nm (per Cd 228.8 nm) si ricava la concentrazione mediante confronto con una

curva di taratura ottenuta con soluzioni a concentrazioni note di analita, comprese nel campo di

indagine analitico.

Il metodo consente la determinazione del piombo e del cadmio in campioni di acqua o estratti

nell’intervallo di concentrazione da 1.0 a 20 mg/L per Pb2+

e Cd2+

e 0.02-1.0 ppb per Hg2+

(A

0.0005-0.005). Per concentrazioni superiori a 20 mg/L è possibile rientrare nell’intervallo indicato

ricorrendo alla diluizione del campione oppure facendo ricorso ad una lunghezza d’onda meno

sensibile. I livelli di piombo riscontrati in alcuni pesci sono dell’ordine di 30-50 ppb (µg/kg) e

quelli di cadmio 1-5 ppb.

Interferenze e cause di errore

L’utilizzo della correzione del fondo consente di minimizzare gli assorbimenti aspecifici

eventualmente presenti. Nel caso in cui si debba determinare l’analita in una matrice sconosciuta o

scarsamente caratterizzata è consigliabile ricorrere al metodo delle aggiunte standard. Tale metodo

permette di minimizzare le interferenze di matrice di tipo fisico e/o chimico (variazioni di densità,

viscosità, tensione superficiale) eventualmente presenti.

Campionamento e conservazione del campione

Si consiglia di conservare i campioni in bottiglie di polipropilene, o altro materiale caratterizzato da

scarse proprietà di cessione o adsorbimento di metalli, precedentemente trattate con HNO3 1 M per

una notte e successivamente neutralizzate con acqua ad elevato grado di purezza. Per determinare

soltanto il piombo disciolto, il campione viene filtrato dopo il prelievo su membrana da 0.45 μm

(acetato di cellulosa o policarbonato) e acidificato fino a pH < 2 con HNO3. L’analisi deve essere


15

effettuata prima possibile. Comunque il campione acidificato rimane stabile per almeno una

settimana dal prelievo.

Apparecchiature

Strumento LabAnalyzer 254 dedicato per l’analisi del mercurio

Spettrofotometro peri assorbimento atomico, corredato di bruciatore standard per aria-acetilene e di

dispositivo per la correzione del fondo

Lampada a catodo cavo o altra sorgente capace di emettere lo spettro dell’elemento in esame (Pb,

Cd)

Reattivi

Tutti i reattivi e l’acqua utilizzata per i lavaggi e la preparazione delle soluzioni di riferimento

devono essere ad elevato grado di purezza.

acido nitrico concentrato (d=1,40)

soluzione concentrata di Pb2+

(1000 mg/L)

soluzione concentrata di Cd2+

(1000 mg/L)

soluzione concentrata di Hg2+

(1000 mg/L)

soluzione di KMnO4

soluzione di idrossilammina, NH2OH·HCl (10 g in 100 mL)

soluzione di SnCl2·2H2O (10 g di in 30 mL di acqua + 30 mL di HCl conc. diluiti a 100 mL in

matraccio)

Procedimento

Campione. Utilizzare guanti ed occhiali e lavorare sotto cappa aspirante. Per l’analisi del mercurio

mineralizzare in capsula in bagno a sabbia 2.5 g di tonno umido con 10 mL di acido nitrico

concentrato. Ridurre a circa metà volume, lasciar raffreddare. Aggiungere 2 mL di HClO4 conc. e

scaldare ancora fino ad ottenere un volume di 2-3 mL. Lasciar raffreddare e trasferire

quantitativamente in matraccio tarato da 100 mL. Portare a volume con acqua milliQ. Filtrare con

filtro da HPLC in cellulosa rigenerata.

Mercurio

Preparare una soluzione di mercurio alla concentrazione di 1 ppm per diluizione dalla soluzione

concentrata a 1000 ppm, e da questa 5 soluzioni alla concentrazione di 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ppb

portando a volume con HNO3 1:100 (assorbanza 0.006-0.030). Per effettuare la misura inserire 10

mL di soluzione nell’apposito recipiente, aggiungere 1-2 gocce di KMnO4 fino a debole colorazione

rosa. Aggiungere alcune gocce di soluzione di idrossilammina fino a scomparsa della colorazione.

Aggiungere poi 0.5 mL di soluzione di SnCl2. Far partire il gorgogliamento dell’aria nella soluzione


16

ed effettuare la misura di assorbanza. Annotare i valori. Effettuare allo stesso modo la misura del

campione. Effettuare una diluizione se il valore di assorbanza ottenuto per il campione è superiore

all’intervallo di linearità della retta di calibrazione.

Piombo e cadmio

Ottimizzazione dei parametri strumentali. Per migliorare le prestazioni analitiche

dell’apparecchiatura e per minimizzare eventuali interferenze, procedere all’ottimizzazione dei

parametri strumentali seguendo le indicazioni riportate nel manuale d’uso dello strumento o in altri

protocolli standardizzati (allineamento della lampada, ecc.).

Lunghezza d’onda per Pb 283.3 nm (Cd 228.8 nm)

Fenditura 0,7 nm

Correzione del fondo attivata

Fiamma aria-acetilene

Intensità di corrente della lampada (mA) come da specifica

Analisi - Determinazione diretta

Preparare 5 soluzioni standard di Pb2+

(Cd2+

)a concentrazione 1.0, 2.0, 5.0, 10.0 e

20.0 mg/L in acqua milliQ, diluendo opportunamente la soluzione da 1000 mg/L e

aggiungendo in ogni matraccio 100 L di acido nitrico. (Se fosse necessario

preparare prima una soluzione intermedia da 100 mg/L)

Impostare i parametri strumentali e costruire la curva di taratura utilizzando le

soluzioni standard preparate, in modo tale da coprire l’intero campo di indagine

analitico (e l’eventuale bianco dei reattivi).

Ripetere la misura di ogni soluzione di riferimento compreso il bianco almeno tre

volte.

Quindi, eseguire l’analisi dei campioni effettuando almeno tre letture per ogni

soluzione da analizzare. Si considerano accettabili i valori che forniscono una

deviazione standard inferiore al 5 %.

Le analisi dei campioni, delle soluzioni di riferimento e del bianco dei reattivi devono essere

effettuate nelle stesse condizioni strumentali. Se la risposta del campione incognito analizzato cade

al di fuori dell’intervallo di linearità, diluire opportunamente il campione per riportarlo nel campo

di linearità. Qualora risulti necessaria una diluizione del campione talmente elevata da esaltare gli

errori connessi alla suddetta operazione è preferibile ripetere sia la taratura che l’analisi ricorrendo

ad un’altra riga analitica meno sensibile.

Calcoli


17

Determinazione diretta. La retta di taratura si ottiene tramite il calcolo della regressione lineare, con

le concentrazioni (mg/L) delle soluzioni di riferimento in ascissa e le assorbanze corrispondenti,

corrette del bianco, in ordinata. La regressione può essere considerata accettabile ai fini analitici se

la deviazione standard della retta stimata è inferiore al 5 %. Calcolare quindi la concentrazione del

piombo (cadmio) nel campione utilizzando l’equazione ottenuta dalla regressione lineare, tenendo

conto dell’eventuale diluizione effettuata.


18

ANALISI HPLC-UV DI NEONICOTINOIDI

(C. Giorio, A. Tapparo, V. Girolami, M. Mazzon, 2009)

Il “Colony Collapse Disorder” (CCD) è una sindrome che si manifesta con un improvviso

spopolamento degli alveari che porta alla perdita, in media, del 40-50% delle colonie con punte fino

al 60%. Le segnalazioni di CCD provengono principalmente da Europa, Australia e Stati Uniti. Le

grandi morie di api si manifestano in primavera in concomitanza con le semine del mais. Anche in

altri periodi dell'anno si registrano delle morie di api, ad esempio in estate. Le morie invernali

invece presentano delle caratteristiche diverse e non vengono sempre associate al CCD.

Sono state formulate diverse ipotesi sulle cause del fenomeno, ma attualmente nessuna di

queste è stata confermata o smentita. L'attenzione è puntata su virosi, insetticidi, e dosi sub-letali di

insetticidi in sinergia con funghi parassitari. Gli insetticidi che destano maggiore preoccupazione

sono l’Imidacloprid, il Clothianidin, il Thiamethoxam e il Fipronil. I primi tre sono degli insetticidi

sistemici appartenenti alla classe dei Neonicotinoidi e vengono impiegati nella concia dei semi di

mais, colza, patata, barbabietola, e a spruzzo contro gli afidi su varie tipologie di verdure e alberi da

frutto. Sono degli agenti neurotossici e agiscono da agonisti dell'acetilcolina, legandosi ai recettori

nicotinici nel sistema nervoso centrale degli insetti. Impediscono la trasmissione di impulsi nervosi,

provocano uno stato di iperattività (perenne eccitazione), con morte per paralisi. Il fipronil invece è

un fenilpirazolo, insetticida non sistemico, utilizzato nella concia dei semi di mais, barbabietola,

girasole, pomodoro, patata, melanzana, sorgo e tabacco.

La maggior parte degli apicoltori ha segnalato consistenti perdite di colonie di api nel

periodo primaverile, concomitanti ai periodi di semina del mais.

Sono stati valutati due possibili meccanismi di diffusione ambientale dei neonicotinoidi di

concia al fine di valutare e quantificare l'effettiva esposizione delle api e la loro reale tossicità in

campo. Il primo meccanismo di diffusione è attraverso il particolato prodotto durante la semina, il

secondo invece attraverso le guttazioni del mais. Questo è un meccanismo innovativo, ipotizzato

per la prima volta dal gruppo di entomologi del prof. Girolami dell'Università di Padova. Le

guttazioni sono degli essudati di linfa che fuori escono dagli idatodi, aperture che si trovano ai

margini delle foglie, per effetto della pressione radicale. Il mais emette guttazioni per circa 20

giorni a partire dalla germogliazione.

Al fine di quantificare la dispersione ambientale dei neonicotinoidi attraverso le guttazioni, è

stato messo a punto un metodo di analisi diretta delle gocce di guttazione, in HPLC a fase inversa

con rivelatore UV-DAD. Le analisi hanno dimostrato la presenza dei neonicotinoidi di concia nelle


19

gocce di guttazione in concentrazione di diverse decine di mg/L per l'imidacloprid, il clothiandin e

il thiamethoxam. La loro concentrazione diminuisce nei primi l0 giorni dalla germogliazione e torna

a crescere negli ultimi giorni quando, a causa della riduzione del volume di guttazioni, si ha una

concentrazione del principio attivo. Il fipronil, invece, non è presente nelle guttazioni in quanto

scarsamente solubile in acqua.

Le concentrazioni più alte riscontrate nelle guttazioni superano a volte anche di molto i 100

mg/L. Considerando i dati di tossicità e il fatto che un’ape beve qualche decina di L di acqua, tali

concentrazioni risultano essere letali per le api. Ciò è stato verificato sperimentalmente facendo

assumere le guttazioni per via orale alle api.

N

O

N

N

CH3

N

SCl

O2N

thiamethoxam (Mr 291.71, max di assorbimento 251 nm)

N

S

CH

2

Cl

NH

CH3NH

N

O2N

clothianidin (Mr 249.68, max di assorbimento 266 nm)

NCl

N

NHN

NO2

imidacloprid (Mr 255.69, max di assorbimento 269 nm)

NCl

N

CH3

N CN

CH3

acetamiprid (Mr 222.70, max di assorbimento 245 nm)


20

NCl

N

SN

CN

thiacloprid (Mr 252.75, max di assorbimento 241 nm)

N

N

S

NH2

F3C

Cl

CN

CF3

Cl

O

fipronil (Mr 437.17, max di assorbimento 215 nm, )

Parte sperimentale

La determinazione viene effettuata su soluzioni acquose o miste acqua/metanolo o

acqua/acetonitrile tramite HPLC-UV (rivelatore spettrofotometrico multi-lunghezza d’onda, o a

serie di diodi). L’acetonitrile sarebbe preferibile al metanolo perché meno viscoso, con maggior

forza eluente e con intervallo di trasparenza nell’UV maggiore, però è molto più costoso.

Apparecchiatura

cromatografo per HPLC con rivelatore spettrofotometrico

colonna a fase inversa C18

Reagenti

soluzione standard concentrata (100 mg/L) dei nicotinoidi considerati (thiamethoxam, Mr

291.71, clothianidin, Mr 249.68, acetamiprid, Mr 222.70 e thiacloprid, Mr 252.75) in

miscela metanolo/acqua.

eluenti: acqua milliQ 100%

acetonitrile 100%

Procedimento

- verificare che le bottiglie degli eluenti ne contengano a sufficienza

- preparare circa 200 mL di miscela metanolo/acqua 50:50 v/v

- preparare (se non è disponibile) una soluzione concentrata dei singoli composti (o mista) in

metanolo/acqua 50:50 v/v (bassa solubilità in acqua) per esempio da 25 mg/L (ppm)

- preparare in matracci da 5 o 10 mL, 5 soluzioni miste, contenenti tutti i composti, alla

concentrazione di 0.05 0.25, 0.5, 1.0, e 2.5 mg/L in metanolo/acqua 50:50 v/v

- accendere il computer


21

- accendere i vari moduli dello strumento

- innescare la pompa con una siringa da 5-10 mL

- avviare la pompa con un flusso di 0.6 mL/min (strumento di dx) o di 1.0 mL/min (strumento

di sx) al 32% della miscela acetonitrile/acqua

- attendere almeno 10 minuti per la stabilizzazione del segnale

- aprire il programma di gestione dello strumento (TCNav a dx e Chromeleon a sx)

creare una cartella personale nella directory studenti

scegliere il metodo

scegliere la lunghezza d’onda di assorbimento 270 nm (252, 244, 215

nm)

preparare una sequenza di iniezioni

- inserire nel loop con una siringa (un volume di almeno 3 volte il loop) ed iniettare

progressivamente il bianco e poi le soluzioni standard a concentrazione crescente, ripetendo

la corsa per almeno due volte (ripetibilità)

- se richiesto, estrarre i nicotinoidi da un seme di mais conciato, con metanolo per 10 min in

bagno ad ultrasuoni

- per l’analisi delle guttazioni, dopo averle raccolte dalle piantine appena seminate,

effettuare l’analisi diluendo 1:10. Se i valori di area ottenuti fossero troppo elevati (al di

fuori della retta di calibrazione) diluire opportunamente.

- inserire nel loop ed iniettare il campione incognito almeno per due volte

Elaborazione dati

- riportare in una tabella i risultati (tempi di ritenzione ed aree dei picchi per ogni composto e

livello di concentrazione)

- costruire una retta di calibrazione, area vs. concentrazione

- dall’equazione della retta interpolante ricavare il valore medio di concentrazione del

campione e, se questo è stato diluito, la sua concentrazione originale

- se richiesto calcolare l’intervallo di fiducia del risultato


22

IPA O PAH: ANALISI DEL BENZO[A]PIRENE NEL PARTICOLATO

naftalene antracene

fenantrene benzo[a]pirene

crisene fluorantene

benzoperilene

Gli IPA (idrocarburi policiclici aromatici) o PAH (polycyclic aromatic hydrocarbons) sono

composti solidi, poco volatili, persistenti e bioaccumulabili in quanto liposolubili.

Sono prodotti dalla combustione del legno, di idrocarburi pesanti, della pece, del carbone, di rifiuti,

del fumo di sigaretta, ecc.. Sono cancerogeni o sospetti tali.

Dal punto di vista analitico sono composti fluorescenti. Uno dei metodi per la loro determinazione è

l’HPLC a fase inversa su colonna C18 con rivelazione spettrofotometrica nell’UV o fluorimetrica.


23

Parte sperimentale Strumentazione

- UHPLC Shimadzu Prominence UFLC-XR con rivelatore fluorimetrico

- Colonna analitica Phenomenex Kinetex 2.6 m C18 100A (150 x 2.10 mm) con pre-filtro Krud

Katcher HPLC In-Line Filter

- Bagno a ultrasuoni

- Vetreria da laboratorio (provette, siringhe, filtri, becker)

Reagenti

- Acqua Milli-Q

- Acetonitrile

- Soluzioni standard IPA

IPA Concentrazione / ppm

Pirene 9.8

Crisene 13.0

Benzo [ghi]perilene 21.1

Benzo [a]pirene 8.7

Fluorantene 35.2

Analisi dei campioni di PM10

Con un bisturi, tagliare a metà il filtro e inserirlo in una provetta. Aggiungere 5 mL di CH3CN,

sonicare per 60 minuti. Filtrare con filtro RC Membrane da 0.2 m e sottoporre ad analisi

utilizzando il metodo di eluizione ottimizzato: IPA_kinetex8_metodo ottimizzato.lcm


24

T colonna = 30 °C; flusso = 0.3 mL/min; V iniezione = 2 L

Ordine di eluizione: Fluorantene, Pirene, Crisene, benzo[a]pirene, benzo[ghi]perilene

Rivelazione:

IPA eccitazione emissione

Fluorantene 330 430

Pirene 381 392

Crisene 270 390

Benzo [a]pirene 290 430

Benzo [ghi]perilene 370 460

Calibrazione:

Calibrare il metodo (funzione analitica di calibrazione – standard esterno) mediante l’analisi di

soluzioni standard di calibrazione (10, 20, 50 100 ppb) in CH3CN.


25

DETERMINAZIONE DI TRICLOROETILENE E TETRACLOROETILENE IN UN

CAMPIONE DI ACQUA

La determinazione di solventi organici alogenati, in particolare clorurati, è spesso richiesta in tutte

le normative ambientali, dal momento che rivestono un ruolo di primo piano nelle contaminazioni

di terreni e falde acquifere. Tenuto conto della loro scarsa biodegradabilità e del rilevante impatto

tossicologico, sono inseriti tra i parametri di qualità nel D.lgs 152/2006.

Sono analiti facilmente determinabili con GC accoppiato a rivelatori a cattura di elettroni (ECD) o

spettrometri di massa (MS).

Nei metodi ufficiali Istisan per le acque potabili, la loro determinazione è descritta nella sezione dei

composti organoalogenati volatili (VOX): COMPOSTI ORGANOALOGENATI VOLATILI:

METODO GASCROMATOGRAFICO APPLICATO ALL’ESTRATTO PENTANICO, ALLO

SPAZIO DI TESTA STATICO O ALLO SPAZIO DI TESTA DINAMICO. (ISS.CAA.036.REV00).

Nella esperienza di laboratorio si utilizzerà lo spazio di testa dinamico (purge&trap), che consiste

nell’analisi GC delle sostanze selezionate, estratte da un gas inerte, preconcentrate in una trappola

adsorbente ed eventualmente focalizzate criogenicamente.

I composti organici volatili, inizialmente presenti nel campione, vengono “strippati” dalla fase

acquosa mediante gorgogliamento di un gas inerte (azoto) a temperatura ambiente (purging). Il

vapore così prodotto è convogliato all’interno di una trappola adsorbente capace di ritenere

quantitativamente le sostanze estratte dal campione (trapping). Al termine della fase estrattiva la

trappola viene riscaldata ad alte temperature, mentre un flusso di gas la percorre in senso inverso

(termodesorbimento in backflushing). Se dotati di una trappola criogenica, i composti desorbiti dalla

trappola per azione della temperatura sono focalizzati criogenicamente in una pre-colonna in silice

fusa (interfaccia capillare) raffreddata a -150 °C da azoto liquido. In una fase successiva

l’interfaccia viene riscaldata a 200-250 °C consentendo il rapido deflusso, nella colonna GC delle

sostanze precedentemente focalizzate.

Il recupero di ciascun composto dal campione acquoso dipende dalla temperatura della fase liquida,

dalla tensione di vapore dell’analita e dal tempo di purge.


26

Parte sperimentale:

Campionamento e pre-trattamento

Nel caso di acque condottate si procede, innanzi tutto, ad un lavaggio sommario del rubinetto e si

lascia defluire l’acqua fino a temperatura costante (circa 5 min). Si riempie il contenitore

completamente fino all’orlo con l’acqua da analizzare facendola fluire lungo le pareti interne.

Qualora l’acqua contenga cloro residuo, introdurre 10 mg di tiosolfato di sodio per 100 ml di

campione immediatamente prima del prelievo. Nel caso in cui l’acqua contenga anidride carbonica

disciolta, neutralizzare la CO2 con l’aggiunta di una quantità sufficiente (fino a 2 g per 100 mL di

campione) di sodio carbonato. Anche questa aggiunta deve essere effettuata prima di introdurre il

campione nel contenitore.

Chiudere ermeticamente la bottiglia avendo cura di allontanare l’eccesso di acqua senza che si

formino bolle o sacche di gas. Agitare il contenitore per uniformarne il contenuto e conservare al

buio alla temperatura di 1-10 °C in luoghi sufficientemente lontani dai solventi organici. Effettuare

l’analisi non oltre 7 giorni dal prelievo.

Per ottenere maggiore accuratezza dei risultati analitici, è consigliabile utilizzare un standard

interno (IS) all’inizio della procedura analitica. Nell’esperienza si utilizza triisopropylbenzene alla

concentrazione di 5ppb in matrice (5 µg/L).

Procedimento

- le condizioni strumentali sono state precedentemente ottimizzate. Non é quindi necessario

impostare valori, che saranno comunque registrati per l’elaborazione della relazione.

- Preparazione del bianco: preparare un soluzione acquosa (acqua MQ) addizionando lo IS

alla concentrazione di 5 µg/L.

- Preparazione delle soluzioni di calibrazione: preparare in matracci da 5 o 10 mL, 4 soluzioni

miste, contenenti tutti i composti presenti in un Mix commerciale contenenti anche

tricloroetilene e tatracloroetilene, alla concentrazione di 0.1 0.2, 1.0, e 10 µg/L più IS alla

concentrazione di 5 µg/L in acqua MQ.

- Preparazione del campione incognito: campionare acqua da conduttura ed eventualmente

un’acqua minerale ed aggiungere lo IS alla concentrazione di 5 µg/L .

- La sequenza di analisi potrebbe essere:

a) standard di calibrazione alla concentrazione più bassa

b) Bianco


27

c) Campione incognito 1

d) Campione incognito 2

e) Sequenza crescente dei rimanenti standard di calibrazione.

Elaborazione dati

- riportare in una tabella i risultati (tempi di ritenzione, segnale ionico ed aree dei picchi per

ogni composto e livello di concentrazione)

- Tracciare i grafici di taratura per tutti i composti in esame riportando in ascisse i valori delle

concentrazioni, espresse in μg/L, degli standard di calibrazione e in ordinate i valori medi

dell’area o dell’altezza dei corrispondenti picchi cromatografici. In alternativa, nel caso in

cui siano stati aggiunti uno o più IS, riportare in grafico, per ogni VOX ricercato, la sua

concentrazione in funzione del rapporto tra l’area o l’altezza del picco associato e l’area o

l’altezza dello standard interno caratterizzato da un tempo di ritenzione prossimo a quello

dell’analita.

- dall’equazione della retta interpolante ricavare il valore (medio in caso di più ripetizioni) di

concentrazione dei campioni incogniti.

- Confrontare i valori ottenuti con quelli della rispettiva normativa vigente

- Confrontare i valori ottenuti con quelli dichiarati rispettivamente dai gestori dell’acqua

potabile campionata e del distributore di acqua minerale.

a.a. 2014/2015 dispense del corso metodi analitici e ... ripristino_2014_15.pdf · colonna...

Documents