OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE BIOSEPARACIÓN DEPIGMENTOS ORGANICOS A PARTIR DE DOS VARIEDADES DEROSA DE JAMAICA (nova y reina real) y CEREZO BELICEÑO PARA LAINDUSTRIA DE ALIMENTOS ACIDOS.

BIOSEPARATION PROCESS OPTIMIZATION OF ORGANICPIGMENTS FROM TWO VARIETIES OF JAMAICA ROSE (Real Queenand nova) and BELIZEAN CHERRY FOR ACID FOOD INDUSTRY.

Rafael Armando Zaldaña DerasUniversidad Nueva San Salvador, Facultad de Ciencias de la Salud, Escuela de

Química y Farmacia. San Salvador – El Salvador, Centro Americarahzeldet@hotmail.com.

Resumen

La investigación en el campo de los pigmentos naturales provenientes de flores y frutos,permite establecer el potencial de estos como alimento con propiedades biofuncionales y eldesarrollo de productos con valor agregado que puedan ser usados como colorantes naturales.Se cuantificaron dichos pigmentos y se evaluó la estabilidad a diferentes valores detemperatura (5 ºC 45 ºC, 86 ºC y 100 ºC T) y pH (3 y 5) condiciones de iluminación utilizandoespectrofotometría ultravioleta-visible. Esto se realizó para determinar si poseían lascaracterísticas para ser utilizados como alternativas naturales de consumo de colorantessintéticos como el Rojo No.40 que se utiliza en la industria de alimentos de carácter ácido comolas salsas o los jugos de frutas. Los Extractos etanólicos de las dos variedades de rosa dejamaica y del fruto del árbol de cerezo beliceño se liofilización y se adicionaron enconcentraciones de 0.02, 0.05, 0.10, 0.25 y 0.30g en sistemas modelo de bebidas en base abebidas comerciales con el fin igualar parámetros de color y pH para poder ser utilizados comoalternativa de colorantes. Se determino por un método cromatográfico que permitió laidentificación del compuesto antociánico por medio de la técnica HPLC-DADSe determinó que únicamente los pigmentos presentes en la rosa de jamaica variedad reinareal pH 3 y 5 presentan las características para ser utilizados como alternativas naturales delcolorante artificial Rojo No.40 para alimentos ácidos,

Abstract

Research in the field of natural pigments from flowers and fruit sets the potential of these asfood with biofunctional properties and the development of value added products that can beused as natural dyes. These pigments were measured, the stability was evaluated at differenttemperatures (5 ° C 45 ° C, 86 ° C and 100 ° C T) and pH (3 and 5) lighting conditions usingUV-visible spectrophotometry. This was done to determine whether the characteristics had tobe used as natural alternatives to use of synthetic dyes such as Red No.40 used in the foodindustry as acidic sauces or fruit juices. The ethanolic extracts of both varieties of hibiscus pinkand the fruit of the cherry tree Belize is lyophilization and were added at concentrations of 0.02,0.05, 0.10, 0.25 and 0.30g in model beverage systems on commercial drinks to matching colorand pH parameters to be used as an alternative to dyes. It was determined by achromatographic method that allowed the identification of anthocyanin compound by HPLC-DAD technique It was determined that only the pigments in jamaica rose queen royal variety pH3 and 5 have the characteristics to be used as natural alternatives to artificial colors Red No.40acidic foods

I. Introducción

El color es la primera sensación que se percibe de un alimento, y la que determina elprimer juicio sobre su calidad. Es también un factor importante en el conjunto desensaciones que aporta el alimento y tiende, a veces, a modificar subjetivamente otrassensaciones como el sabor y el olor. Gran parte de estos efectos está unido a que losconsumidores esperan, exigen y prefieren colores determinados en alimentosespecíficos, además de esperar que éstos sean constantes entre lotes de fabricación,así como estables en el tiempo de conservación.

Las antocianinas son colorantes naturales permitidos por la Comunidad EconómicaEuropea pero no por la Administración de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos deEstados Unidos (FDA). Estos compuestos proporcionan un amplio espectro debeneficios a la salud, debido a su capacidad antioxidante, presentan la propiedad deprevenir y combatir enfermedades del corazón y varias formas de cáncer, por sercolorantes naturales no requieren certificación.

La Rosa de jamaicaEs una planta anual, herbácea, de la familia de las Malváceas, que generalmentealcanza de 1 a 2 mts de altura. La rosa de jamaica tiene los tallos, pecíolos de lashojas y cálices de un color rojo oscuro o claro, tendiendo a morado o lila y lasvariedades que generalmente son productoras de fibra tienen una coloración verde oamarillenta.En la mayoría de variedades las hojas son verdes con nervaduras rojas, siendo lasinferiores enteras y lanceoladas y las superiores palmeadas.

El nombre botánico o científico de la rosa de jamaica es Hibiscus sabdariffa L.Los nombres comunes, populares o sinónimos son: rosa de jamaica, flor de dardo,rosa de Jericó, té rojo, rosella, flor de jamaica, flor roja, de sus tallos, especialmente lavariedad Altísima, se obtiene una fibra de mejor calidad que la del Kenaf (Hibiscuscannabinus), que puede sustituir al yute en la fabricación de cordeles y sacos paraenvasar productos agrícolas. (1)

El Cerezo beliceño (Syzygium cumini Lamarck), también conocido como Jambolanpertenece a familia Myrtaceae.Originario de la India, Es un frondoso árbol que produce pequeños frutos ovoides decolor púrpura al madurar, como una aceituna. El sabor es suave, sin aroma fuerte,aunque un poco astringente al paladar. (2).

En la India, además de ser consumido la pulpa fresca de jambolan también se utilizaen la producción de pasteles. Las hojas en té y las semillas como especies, tambiénes bien conocido en la medicina popular de la India, principalmente por los efectoshipoglucemiantes. Por otra parte diversos estudios reportan que el tratamiento conextracto de semilla de jambolan reduce los niveles de glucosa en sangre en ratasdiabéticas. Sin embargo, de acuerdo con Oliveira y colegas (2005) el extracto de lashojas de jambolan no tiene el mismo efecto, la corteza se usa contra la disentería,leucorrea y sangrado, en forma de decocción.

Los colorantes naturales han sido ampliamente utilizados en la preparación dealimentos y bebidas, y siguen siendo a nivel mundial una contribución significante enla preparación y procesamiento de los mismos.Aunque el término colorante natural pueda prestarse a confusión, normalmente seaplica a productos de origen animal, vegetal o incluso mineral en los cuales seencuentra de forma también natural. (3).

Los alimentos naturales tienen su propio color y lo ideal sería que se mantuvieraa lo largo del proceso de manipulación e industrialización, pero la mayoría de veces noes así. Sin embargo, los consumidores prefieren en determinados alimentos un colorconstante, que no varíe en los diferentes lotes de fabricación de un producto y estosolo puede obtenerse modificándolo de forma artificial

Los flavonoides son un amplio grupo de sustancias vegetales que fueron descubiertaspor el Dr. Albert Szent-Gyorgi, premio Nobel en Bioquímica, quien les denominó como"vitamina P". El Dr. Szent-Gyorgi descubrió que los flavonoides favorecen la función dela vitamina C, mejorando su absorción y protegiéndola de la oxidación. Comprendenvarias clases de sustancias naturales, entre las cuales están muchas de las que lesconfieren colores amarillos, naranja, rojo, violeta y azul, a muchas flores, hojas yfrutos, especialmente.

Su esqueleto básico es el difenilpropano (C6-C3-C6), consta de dos grupos fenilo (A yB) unidos por un puente de tres carbonos que forma un anillo heterocíclico oxigenado(anillo C) (Fig. Nº 1)

Estructura química del esqueleto básico de los flavonoides. (Fig. Nº 1)

AntocianinasGeneralidadesLas antocianinas (del griego anthos flor y kyanos azul), son el grupo más importantede pigmentos solubles al agua visibles para el ojo humano. Las antocianinas formanparte de la familia de los polifenoles y se definen como flavonoides fenólicos. Loscolores rosa, rojo, azul, malva violeta de las flores, frutas y verduras se deben a lapresencia de estos pigmentos. Estructuralmente son glicósidos de polihidroflavilio enlos cuales la unión glicosídica esta principalmente en C-3.

Las antocianinas representan un factor importante en la industria alimenticia debido alas restricciones sanitarias hacia el uso de colorantes sintéticos, además sonhidrosolubles, por lo que su incorporación en sistemas acuosos alimentarios.

Figura 2. Purificacion del colorante por medio de Columnas Hypersep C18

2. Materiales y Métodos

2.1 Extracción (20), (21), (19)

Realizar la extracción por Maceración usando los solventes: (agua), (agua, etanol al30%, relación 50:50 v/v) (agua, etanol al 70% relación 70:30 v/v), y (etanol al 90%-HCL 1.0 % 85:15 v/v).

Se utilizarán 2.0g de material vegetal; se sumergirán en las soluciones de losdiferentes solventes y se mantendrá en refrigeración durante una noche.Las mezclas se cubrirán, con papel aluminio y se mantendrá en agitación atemperatura ambiente durante dos horas; posteriormente, se filtra en un embudoBüchner a través de papel Whatman No 1, de acuerdo al mejor rendimiento delsolvente ese será utilizado para experimentación.

2.2 Purificación del pigmento (20), (21), (19)

El extracto obtenido anteriormente contiene la antocianina de interés pero a su vezcontiene interferencias para su análisis tales como fenólicos, azúcares y ácidos por loque para eliminarlas se utiliza el siguiente método:

1. Resina PVPP (Polivinil-poli-pirrolidona).- Su uso principalmente seenfoca alaislamiento de compuestos polares no fenólicos. Esteprocedimiento consisteen colocar en un embudo Buchner un filtroWhatman No.1 junto con una capade 1 cm de la resina. Ésta se activa por medio de agua acidificada al 1.0 % deHCl seguido de etanol acidificado al 1.0 %. El extracto se pasa por la resinarecuperando la antocianina con el etanol acidificado. Posteriormente seconcentra la antocianina purificada evaporando en Rotavapor Büchi a 40°Cpara eliminar la porción etanólica.

2. Cartuchos fase reversa C18. Su propósito es separar compuestosrelativamente hidrofóbicos como las antocianinas, de azúcares y ácidos.Seacondiciona el cartucho con 10 ml de agua acidificada seguido de 25 mL deetanol acidificado y 10 mL de agua acidificada de nuevo, para remover eletanol restante. Se filtra el extracto obtenido de la PVPP y se lava el cartuchocon etanol acidificado en un matraz Kitasato; en seguida se eluye laantocianina por el cartucho por medio de etanol acidificado en otro kitasato.Como siguiente paso, se remueve el etanol para obtener el extracto puro pormedio de un rotavapor Büchi a 40 grados centígrados.

2.3. Evaluación de la Estabilidad de los Pigmentos Naturales.

2.3.1. Efecto Temperatura. (13), (18)

Para la evaluación de la estabilidad térmica del pigmento a partir de los extractosetanólicos se preparan las siguientes soluciones:Se toma con una pipeta volumétrica 10 mL de extracto de cada muestra, se pasa a unbalón volumétrico de 100 mL y se afora con agua destilada.

Procedimiento:En 5 tubos de ensayo Pyrex®Se ponen 10 ml de solución al 10 % de extracto etanólicos muestra A: Rosa dejamaica variedad Nova

Y se rotulan de la siguiente forma:

Se someten de acuerdo a las temperaturas y los diferentes intervalos de tiempo enuna estufa Tabla Nº 1

Cuando se termina el intervalo de tiempo de los tubos, fueron retirados y rápidamenteenfriados en un baño de hielo, realizar el análisis del contenido de pigmentoantociánico monomérico (CPAM mg/L) para determinar la estabilidad (degradación)del pigmento por temperatura.Se efectúa el mismo procedimiento para las muestras:B: rosa de jamaica variedad reina realC: cerezo beliceño

2.3.2. Efecto del pH (15) , (17)

Evaluar las muestras a dos valores de pH (3 y 5) y temperatura de 35 º C para ello seutiliza una estufa calibrada para mantener dicha temperatura. Esta debe de estarconectada durante todo el proceso experimental. Analizar las muestras en elespectrofotómetro UV-Vis a una longitud de onda de 540 nm

Procedimiento:

Añadir 20 mL de solución buffer pH 3 a 9 tubos de 30 mL y seidentificaron como TpH3Mx.

Añadir 20 mL de solución buffer pH 5 a 9 tubos de 30 mL y se identifican como TpH5Mx.

Se agrega 5 ml del extracto de cada muestra. Determinar las absorbancia para cadauno de los tubos diariamente (excepto sábado y domingo) durante 10 días

A continuación se presenta la Tabla Nº 2 Efecto del pH para las diferentes muestras.

Evaluar el colorante sintético Rojo Nº 40 FD&C como se tratan las muestras hacer unacurva de calibración de 1 ppm a 10 ppm.

2.3.3. Iluminación y Oscuridad (14), (16)

La estabilidad de los pigmentos depende de factores como, pH, temperatura,oxígeno, luz, etc.Investigaciones recientes demostraron que existen pigmentos con ciertascaracterísticas, presentando una mayor estabilidad y otros con menor estabilidad.La luz afecta a los pigmentos en dos formas diferentes: la luz es esencial parala biosíntesis de estos, pero también acelera su degradación.

Procedimiento:

En 3 botellas PET de 200 mL se agrega 150 mL de buffer pH 3, y se agregan50 ml de extracto etanólico de las 3 muestras en análisis. Se homogeniza la solución yse almacena en la oscuridad a temperatura de 8 º C por 10 días se cuantifica el(CPAM mg/L) para observar la degradación del pigmento.

En 3 botellas PET de 200 mL se agrega 150 mL de buffer pH 5, y se agregan

50 ml de extracto etanólico de las 3 muestras en análisis. Se homogeniza la solución yse expone a la luz solar y a temperatura ambiente por 10 días se cuantifica el (CPAMmg/L) para observar degradación del pigmento.

2.4. Ensayos físicos y químicos preliminares.

2.4.1. Determinación de un espectro de absorción (9), (23)

Se determinó, con ayuda del espectrofotómetro, la medida de la transmitancia.Las mediciones de las transmitancias se realizaron a diferentes longitudes de ondaque van desde 450nm a 700nm (intervalo correspondiente al rango visible).

2.4.2 Espectro infrarrojo de la fraccion colorante (9), (23)

Para obtener el espectro infrarrojo de los extractos de las muestras se uso un FT-IR,marca Perkin-Elmer modelo FT-IR spectrum RX-1 ATR accessories; la muestra seanalizó directamente.Del extracto obtenido con etanol + HCL 1% se realizara la lectura de la muestra en elinfrarrojo de la siguiente manera:1. Se realizara un barrido de Background desde 4,500 cm-1 a 450 cm-1Colocar una cubierta de acero inoxidable sobre el ATR

HomogenizarColocar la muestra de extracto colorante en un ATR (placa seleniuro de zinctransparente al Infrarrojo). Correr el espectro e imprimir.

2.4.3 Determinación de la concentración de antocianinas por medio del métodode pH diferencial (CPAM mg/L) (12), (17)

- Calentar el equipo, encendiéndolo 30 min antes de iniciar las lecturas.- Calibrar el equipo usando agua destilada.- Tomar 300 μL del extracto etanólico y mezclar con 600 μL de buffer pH:1.0, depositaren una cubeta- Tomar 300 μL del extracto etanólico y mezclar con 600 μL de buffer pH:4.5, depositaren una cubeta.- Se lee la absorbancia de cada una de las mezclas colocadas en las cubetas en unrango de 400- 700 nm, de tal manera que la absorbancia sea menor de0,8 UA.- Se toma la lectura de los picos más altos a pH. 1.0 y a pH: 4.5, así como las lecturasa 700 nm.La concentración de antocianinas se calcula mediante la siguiente ecuación:

A= (Aλ vis-máx - Aλ 700nm) pH: 1.0 - (Aλ vis-máx - Aλ 700nm) pH: 4.5Aλ vis-máx: Es la lectura del pico más alto a pH: 1.0 y a pH: 4.5Aλ 700nm: Es la lectura a 700 nm tanto a pH: 1.0 y a pH: 4.5La concentración de la antocianina expresada como cianidina- 3,5- diglucósido en lamuestra original se determina con la siguiente fórmula.C = (mg/L) = (A) * PM * (1000/ε)FD

Donde:PM 646.70: Es la masa molecular de la cianidína-3,5 -diglucósido.ε: Es la absortividad molar. (41120 g/mol. cm)FD: Es el factor de dilución.

2.4.4 Análisis Cualitativos

Investigaciones de taninos (8)

Se extraerá 10.0g de material vegetal pulverizado con 30mL de etanol o metanol al80%; se filtrara y evaporara a sequedad. Se añadirá 25mL de agua caliente al residuoy se agitara con varilla de vidrio y se dejara enfriar. Agregar 1mL de solución decloruro de sodio al 10 % y se filtrara. Se adicionara 3mL del filtrado a 4 tubos deensayo:Tubo 1: testigo.Tubo 2: agregar 4 a 5 gotas de solución de gelatina al 1 % (p/v).Tubo 3: agregar 4 a 5 gotas de gelatina-sal (1 % de gelatina y cloruro de sodio al10%).Tubo 4: agregar 3 a 4 gotas de solución de cloruro férrico al 10 % (p/v).

Detección:Observar la formación de precipitado y/o cambio de coloración.Con cloruro férrico: grisáceo-negro: catecol; negro-azulado: pirogalol.

2.4.5 Investigaciones de flavonoides y antocianinas. (8),

Ensayos macro y semimicro:Extraer 2.0g de material vegetal pulverizado con 10mL de etanol o metanol al 80 %,filtrar y concentrar. Enfriar a temperatura ambiente y hacer lavados en una ampolla deseparación con 15mL de éter de petróleo hasta que la extracción sea incolora.Concentrar el extracto etéreo en hot plate hasta que el éter se evapore, disolver elresiduo en 30mL de metanol al 80 %, filtrar y dividir en 6 tubos:

Tubo 1: agregar 0.5mL de ácido sulfúrico concentrado.Tubo 2: agregar 3 a 5 gotas de cloruro férrico al 10 % (p/v).Tubo 3: agregar 0.5mL de ácido clorhídrico concentrado y calentar en baño de maríapor 5 minutos (prueba para leucoantocianinas).Tubo 4: agregar magnesio metálico y 0.5mL de ácido clorhídrico concentrado.Tubo 5: agregar un álcali a un extracto acuoso.Tubo 6: agregar solución de ácido bórico en anhídrido acético.Tubo 7: testigo.

Detección:Evaluar las reacciones, cambios de color y/o formación de precipitado comparadoscon el testigo.Desarrollo inmediato de color flavonas y flavonoles (amarillo a rojo),flavanonoles (rojo a magenta), flavanonas (rojo, magenta, violeta, azul),isoflavonas (amarillo); isoflavononas, chalconas y auronas no dan coloración.

2.4.6 Análisis Cuantitativos. (7)

Análisis cuantitativo por espectrofotometría UV-VIS.

Tratamiento de muestraPese 1g de muestra seca y molida en un balón volumétrico de 50 mL, añada 20 mL deetanol al 80%. Lleve al ultrasonido por 30 minutos a temperatura de 60° C (o utilice unhot plate). Filtre, recogiendo el extracto en un balón volumétrico de 25 mL y lleve avolumen con etanol al 80%.

En una balón volumétrico de 10 mL coloque 100 µL del extracto, 200 µL de soluciónde acetato de potasio 1M y 200 µL de nitrato de aluminio al 10% y lleve a volumen conetanol al 80%.

Deje reposar por 40 minutos y proceda a leer a 415 nm.Preparación de curva de calibraciónPese 2,7 mg de quercetina en un balón volumétrico de 10 mL y lleve a volumen conetanol al 80%. Tome 700 µL, 350 µL, 175 µL y 100 µL en 4 balones volumétricos de 10mL, y añada en cada uno 200 µL de acetato de potasio 1M y200 µL de nitrato de aluminio al 10% en cada uno; finalmente lleve a volumen conetanol al 80%.Proceda a leer a 415 nm cada solución y elabore la curva estándar.Calcular el contenido de flavonoides totales, según la ecuación:

Q = Flavonoides totales, expresados como quercetina (%)A = Absorbancia de la solución muestram = Peso de la droga vegetalPd = Porcentaje de humedad (%).

Fenoles totales. (24), (7)

Procedimiento:1 En el caso de extractos se efectúa una dilución de 10 mL de muestra a 100 mL conagua. Se emplea 1 mL de esta dilución.2. En un matraz de 100 mL se vierte 1 mL de la solución anterior.3. Se añaden 60mL de agua destilada y se agita.4. A continuación se adicionan 5 mL del reactivo de Folin- Ciocalteu, se agita bien y sedeja en reposo unos 2-3 minutos.5. Se añaden 15 mL de solución de carbonato sódico, se completa a volumen conagua y se deja en reposo 2 horas a 20 º C6. Se determina la absorbancia a 765 nm, en cubetas de 10 mm de paso de luz.7. Conviene preparar una curva de calibración, empleando la solución stock de ácidogálico. Para ello, en matraces de 100 mL se vierten: 0, 1, 2, 3, 4, 5 y 10 mL de lasolución stock de fenol y se completa el volumen con agua destilada.La concentración de fenol en estos matraces, expresada como equivalente en ácidogálico, es de 0, 50, 100, 150, 250 y 500 μg/mL.8. Con estas soluciones patrón se opera como se indica en el paso 2) y sucesivos.

Con base en la curva patrón se obtuvo la siguiente ecuación de la recta:

Al obtener los Eq de ácido gálico se calculó los valores de Eq ácido gálico por mililitrode jugo, de la siguiente forma:

2.4.7 Acidez Titulable (6)

Tratamiento de muestraSe determinó en beakeres de 250ml con una muestra de 5.0g diluida en 25 mL deagua destilada, adicionándose 4 gotas de fenolftaleína y homogenizándose todo. Lamezcla se tituló con hidróxido de sodio valorado 0.1N, hasta alcanzar (vire defenolftaleína). El % de acidez de expresó como porcentaje de ácido cítrico,calculándose con la siguiente fórmula:

3. Resultados y Discusión

3.1 Extracción

El análisis de la selección del solvente de acuerdo a sus diferentes fases dieron lossiguientes resultados: (Grafico 1)

De acuerdo al CPAM mg/L el solvente que mejor da resultado en la obtención depigmentos es el Etanol 90º + HCL 1.0 % (85:15).

3.2 Evaluación de la Estabilidad de los Pigmentos Naturales

Efecto de la Temperatura

Al evaluar la estabilidad del pigmento en los extractos de las dos variedades deRosa de jamaica y del Árbol de Cerezo beliceño, se observo que hubo un cambio decolor de los extractos sometidos a diferentes temperaturas, se procedió a ladeterminación de CPAM de los extractos por la técnica espectrofotométrica de pHdiferencial.

En la Tabla Nº 1 se muestran los datos de CPAM analizado por el método de pHdiferencial para la determinación de estabilidad térmica de los extractos que contienepigmentos de las dos variedades de Rosa de jamaica y del Árbol deCerezo beliceño.El efecto de la temperatura en la estabilidad de antocianinas influye notoriamente en ladestrucción del pigmento por el calor durante el procedimiento realizado en lasmuestras de los extractos de las dos variedades de rosa de jamaica y del árbol decerezo beliceñoCuando los extractos de pigmentos antociánicos se someten a temperaturas mayoresa 100°C, ocurre una degradación más rápida del color, mientras que alas temperaturaspor debajo de los 90°C resulta en una degradación mínima.

Con respecto a la temperatura los pigmentos antociánicos se presentan inestables,existe una degradación de color por temperaturas mientras que a menor temperatura(5º C) permanecen con menor pérdida de color.

3.3 Efecto del pH

El modelo matemático que mejor encajó para el comportamiento de Absorbanciarespecto al tiempo fue: logarítmico (Absorbancia = a * Ln (tiempo) + b, donde a y b sonconstantes) para los extractos acuosos provenientes de las dos variedades de rosa dejamaica y el fruto de cerezo beliceño y lineal (Absorbancia = m * (tiempo) + b, donde mes la pendiente y b constante) para el colorante artificial Rojo No.40 FD&C.Para poder comparar la estabilidad de los diferentes extractos, se procedió a calcularla primera derivada de cada una de las ecuaciones, así se determinó el cambio de laabsorbancia (∆Absorbancia) respecto al tiempo (∆tiempo), es decir la estabilidad quepresenta cada extracto. Y utilizando el valor de la pendiente para el colorante artificialRojo No.40 FD&C (m= ∆Absorbancia/∆tiempo).

Se determinó que el orden de estabilidad de los extractos acuosos provenientes de lasdiferentes variedades de rosa de jamaica y del fruto del cerezo beliceño es elsiguiente:Rosa de jamaica reina real pH 3, 35 Cº > Rosa de jamaica reina real pH 5, 35Cº > Cerezo beliceño pH 3, 35 Cº > Rosa de jamaica nova pH 3, 35 Cº > Rosa dejamaica nova pH 5, 35 Cº > Cerezo beliceño pH 5, 35 C º.

Se puede afirmar que los diferentes extractos acuosos provenientes de las diferentesespecies de estudio a pH indicado, pueden utilizarse como opciones de consumonatural del colorante artificial Rojo Nº 40 FD&CDe los resultados obtenidos sobre la estabilidad de los pigmentos, podemosmencionar que la muestra de Rosa de jamaica reina real pH 3, 35 Cº (extracto másestable) es 4.16 veces más estable que el extracto de Cerezo beliceño pH5, 35 C º (extracto más inestable).Acerca de la estabilidad del colorante artificial Rojo No.40 FD&C a los diferentesvalores de pH y a 35º C de temperatura en la investigación, se determinó que el gradode degradación de este pigmento sintético es menor en comparación con los extractosde los diferentes frutos, esto se pudo observar tanto en el modelo matemático que rigela degradación de los colorantes (lineal para el Rojo No.40FD&C y logarítmico para los extractos de los de las dos variedades de rosa de jamaicay del cerezo beliceño. Algo interesante de mencionar es que a una misma temperatura(35 ºC) y diferente pH (3 y 5) el colorante Rojo No.40 FD&C.

3.4 Iluminación y Oscuridad

El contenido de pigmento antociánico monomérico (CPAM) valorado a los extractosetanólicos de antocianinas a diferentes tiempos de almacenamiento es presentado enlas tablas siguientes.

El contenido de pigmento monomérico de los EEA de antocianinas es mostrado en lasTablas, como se puede observar bajo oscuridad pH 3 y 5 º C fue la condición quepresento menor cambio de concentración de pigmento antociánico monoméricodurante todo el almacenamiento. Bajo estas condiciones son más estables lasantocianinas al sufrir menos reacciones de degradación.La pérdida de pigmento por el efecto de la luz se debe a que tanto la radiaciónelectromagnética como el oxígeno aceleran las reacciones para que se rompa la

estructura de resonancia de los pigmentos, los cuales son las responsables de impartirel color y existe una degradación de los pigmentos a pH 5

3.5. Ensayos físicos y químicos preliminares.

3.5.1. Determinación de un espectro de absorción

Se determino el espectro de absorción de la muestra de rosa de jamaica variedadnova que la cianidína-3,5 –diglucósido es la antocianina presente en esta muestra.

También se encuentra en la muestra de rosa de jamaica variedad reina real.

No hay presencia de cianidina-3,5 – diglucósido en la muestra de cerezo beliceño.

3.5.2 Espectro infrarrojo de la fraccion colorante

Se obtuvo los espectros infrarrojos, en donde se pueden observar varias señales degrupos funcionales entre las que destacan: un pico a 3402 cm-1 (OH), un pico a 1.609cm-1 (grupo carbonilo), los cuales son característicos de los compuestos de tipoflavínico en los extractos de las muestras a estudio.

3.5.3 Determinación de la concentración de antocianinas por medio delmétodode pH diferencial (CPAM mg/L)

En la cuantificación de antocianinas por la técnica de pH diferencial, se analizaron sololos extractos con el solvente Etanol 90º + HCL 1 % (85:15 v/v) ya que este solventeasegura el mayor contenido de las antocianinas en las diferentes muestras.

En la cuantificación de antocianinas por la técnica de pH diferencial, se analizaron losextractos. En la Tabla se muestran los resultados de las tres muestras en análisis. Elextracto de Rosa de jamaica variedad reina real tiene una mayor contenido depigmento antociánico monomérico de 708.75 mg/L

3.5.4 Investigaciones de taninos

Se puede observar tanto en las dos variedades de Rosa de jamaica y del árbol deCerezo beliceño presentaron presencia de taninos dentro de su composición, tras elanálisis macro y semimicro de coloración y precipitación, lo cual se observo cambio decolor negro-azulado que cambio a un color amarillo determinando presencia del taninopirogalol.

3.5.5 Investigaciones de flavonoides y antocianinas.

Se muestra los resultados del análisis macro y semimicro para la detección deflavonoides y antocianinas en las dos variedades de Rosa de jamaica y del árbol de

Cerezo beliceño los cuales fueron positivos en las flores de las dos variedades deRosa de jamaica y en el fruto del árbol de Cerezo beliceño los cuales presentaroncambio de color y formación de precipitados comparados con el testigo.En la prueba de Shinoda da positivo la presencia de antocianinas con un cambio decolor rojo intenso.

3.5.6 Análisis cuantitativo por espectrofotometría UV-VIS.Flavonoides Totales

En la Tabla se expresan los resultados para la cuantificación de flavonoidestotales expresados como porcentaje de quercetina mediante espectrofotometríaUV-VIS, de los extractos de las dos variedades de Rosa de jamaica y del árbolde Cerezo beliceño estos resultados reflejan que los frutos de Cerezo beliceñotiene una presencia mayor de flavonoides totales expresados como porcentajede quercetina.

Fenoles totales

Se demuestra que todos los extractos contienen compuestos fenólicos encantidades significativas.En la Tabla se expresan los resultados de fenoles totales expresados comomicrogramos de ácido gálico mediante espectrofotometría UV-VIS, de losextractosde las dos variedades de Rosa de jamaica y del árbol de Cerezo beliceño debido asu polaridad los compuestos fenólicos permiten su separación por solubilidad asolventes polares, como sucede con el etanol. El etanol permite la extracción deestos compuestos, la concentración de fenoles totales más alta la posee la Rosade jamaica variedad reina real 14.71 microgramos de acido gálico / volumen demuestra en mL, por su gran cantidad de antocianinas. La Rosa de jamaicavariedad nova es la que contiene una menor concentración de fenoles totales.

3.5.7 Acidez Titulable

En la Tabla se muestran los datos de acidez de los extractos de las dos variedades derosa de jamaica y del árbol de Cerezo beliceño, la acidez esta directamenterelacionada con la cantidad de ácidos presentes en las diferentes muestras de losextracto de las especies en estudio.

En el caso de las dos variedades de Rosa de jamaica presentan los diferentes ácidosen su composición: ácido cítrico, ascórbico, málico y el protocatecuico los que leproporcionan una acidez expresada como porcentaje de acidez como ácido cítrico. Enel caso del Árbol de cerezo beliceño presenta los diferentes ácidos en su composición:ácido elágico, ácido gálico, ácido ferúlico, y el ácido cafeico. El Árbol de Cerezobeliceño es el que posee el mayor porcentaje de acidez: 11.73 % de acidez comoacido cítrico, la Rosa de jamaica variedad nova es la que presenta menor porcentajede acidez: 9.92 % de acidez como acido cítrico.

4. Liofilización. (10), (11)

El liofilizado involucra la remoción de agua u otro solvente de un producto congeladopor un proceso llamado sublimación. La sublimación ocurre cuando un líquidocongelado pasa directamente al estado gaseoso sin pasar por la fase líquida. Encontraste, el secado a temperatura ambiente de la fase líquida, usualmente resulta encambios en el producto y puede ser deseable solamente para algunos materiales. Sinembargo, en el liofilizado, el material no pasa por la fase líquida y esto permite lapreparación de un producto más estable que es más fácil de usar y estético enapariencia.

Cuando se reúnen todos los extractos etanólicos purificados de las dos variedades dede rosa de jamaica y del cerezo beliceño se concentra en un RotavaporBuchi para eliminar el etanol.

Se toman 100 mL de extracto concentrado de cada muestra y se pasan a (PROPERFLASK) que son parte del equipo liofilizador.

Los Extractos concentrados en los viales se llevan a un congelador de nitrógenoThermo Forma Thermo Scientific a temperatura de – 70 º C.

Los extractos congelados se liofilizaron en un equipo

Se requiere que el liofilizador se mantenga a una presión de vacío de 1.33 x 10-3mBar. La temperatura alcanza hasta – 40 °C y es en este momento en que el modoautomático del liofilizador empieza a funcionar.

El producto final es un polvo fino de color rojo fuerte

5. Detección de antocianinas (HPLC DAD). (4), (5)

Se realizó el análisis de antocianinas usando un Agilent Technologies serie 1200HPLC (Agilent, Palo Alto, CA, USA) que fue equipado con un detector modelo G1315Darreglo de diodos (DAD), un desgasificador G1379B modelo, una bomba de gradientebinaria modelo G1312A, un modelo G1329A thermo auto muestrador y un horno decolumna modelo G1316A. La separación de fase inversa fue realizada en una columnade identidad simetría C18 250 x 4,6 mm, partículas tamaño 5 µm (Waters, MA, USA)con una Nova-Pak 4 µm C18 guard column 3,9 × 20 mm operando a 35 ° C y con uncaudal de 1,0 mL/min. Los compuestos fueron separados con gradiente elución de (A)4,5% ácido fórmico acuoso y (B) 80% acetonitrilo en solución A. El programa degradiente fue: 0-15% B (9 minutos), 15-45% B (22 min), 45-100% B (6 minutos), 100-0% B (1 min), min 2 0% B. El volumen de inyección era 10 uL. La supervisión fuerealizada a 520 nm y el detector de arreglo de diodos se fijó en un rango de 200 nm a700 nm a un radio de espectro de 1.25 escaneo s-1 (anchura del pico 0,2 min). Lacuantificación se realizó por LC-DAD con calibración externa utilizando un conjunto desiete diluciones estándar de cianidina-3,5-di-O-glucósido a 520 nm. Una solución de 1mg/mL en un 80% metanol en acuosa 0.1% de ácido fórmico se preparó y almaceno a20 ° C. Las curvas de calibración fueron lineales en el rango de 1 a 200 µg/mL con uncoeficiente de correlación de ≥ 0.99. Para la cuantificación, áreas de pico fueroncorrelacionadas con las concentraciones de acuerdo con las curvas de calibración. Losdatos se informaron como medio ± desviación estándar de análisis independientes portriplicado.

Figura 1. Separación de antocianinas del extracto de la Flor de Jamaica ReinaReal y Nova por HPLC-DAD (520 nm).

6. Conclusiones

Las tres muestras de estudio contienen pigmentos de origen antociánico.Las antocianinas son pigmentos que dan color a las frutas, flores y algunas verduras,como el rojo de la rosa de jamaica y el fruto del cerezo beliceño, la Rosa de jamaicavariedad reina real posee la mayor cantidad de antocianinas, fenoles totales.El método de extracción de antocianinas de las muestras en análisis con etanolacidificado es mas alto, menos complicado y con menos tiempos de esperacomparado con el método de extracción con agua.

El fruto del cerezo beliceño contiene una mayor cantidad de flavonoides totales en sucomposición fitoquímica.El pH es muy importante un pH 3 hay una estabilidad del color, en el caso de pHmayores a 4 existe una degradación lo que con lleva a una perdida de color.

Las mejores condiciones de almacenamiento en oscuridad de los extractos etanólicosacidificados de antocianinas de las dos variedades de rosa de jamaica y del fruto decerezo beliceño son a pH 3 y temperatura de 5 º C.Los pigmentos antociánicos presentes en la Rosa de jamaica variedad reina realHibiscus sabdariffa pH 3 y pH 5 poseen las características para ser utilizados comoalternativas naturales de consumo del colorante sintético Rojo Nº 40 en alimentos depH ácido.

La aplicación como pigmento en alimentos ha estado limitado por su susceptibilidad,entre otros factores, al pH y a la temperatura, por lo que es viable colorear alimentosde bajo pH.

Por medio de la técnica de HPLC-DAD se determino la identificación de la antocianinapresente en los extractos en estudio.

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