acidos nucleicos

5/10/2018 acidos nucleicos

1/22

8A cid os n ucleico s

COMPOSICION QUIMICA DE LOS ACIDOS NUCLEICOS

Los acidos nucleicos son compuestos nitrogen ados de elevado peso molecularque se encuentran en las celulas asociados con protein as. Los complejos aci-do nucleico-proteina se conocen con el nombre de nucleo-proteinas, quepueden separarse en sus componentes (proteinas y acid os nucleicos) alsertratados con acidos 0 con concentraciones altas de sales. Las protein as tienen

DesoxirribonucleoproteinaI

Acido nucleicoProteinabasica I Disminuci6n depeso molecular!Nucle6tidos!

Acido fosf6rico Nucle6sidos

Bases purinicas 0adeninaguaninaBases pirimidinicascitosinatimina

Pentosadesoxirribosa

Figura 8.1 Relacion entre desoxirribonucleoproteinay sus componentes de bajo peso molecular.

208


2/22

Acldol nucieicol 209

caracter basico mientras que los acidos nuc1eicos, como su nombre 10indica,son acidos. Se conocen dos grupos principales de acidos nucleicos: el acidoribonucleico (ARN)* y el acido desoxirribonucleico (ADN)*. La hidrolisiscontrolada de ADN yARN produce nucleotuios, que pueden considerarsecomo unidades basicas de los acidos nucleicos en la misma forma que losaminoacidos son las unidades basicas de las proteinas y los monosacaridos, delos polisacaridos. Si se prosigue la hidrolisis, los nucleotidos dan nucieosulos yfinalmente fosfatos, azucares y bases purinicas y pirimidinicas. La relacionentre estos dos componentes y las nucleoproteinas de ADN se muestran en lafigura B.1.El ARN tiene una composicion similar, excepto que contiene el azucar

ribosa en lugar de la desoxiribosa y uracilo en lugar de timina.A continuacion aparecen las formulas de las principales bases nitrogena-

das presentes en ADN yARN.

PurinasLa adenina y la guanina son purinas sustituidas y estan presentes en todoslos acidos nucleicos.

Purina(compuesto primario) Adenina

OHJ~:}-HH2N ,N H

Guanina

Pirimidinas

Pirimidina(compuestoprimario) Citosina Uracilo Timina

Tambien se han encontrado pequefias cantidades de otras bases en acidosnucleicos de fuentes divers as. Debe anotarse que tanto las purinas como laspirimidinas pueden existir en la forma cetonica 0 en6lica (figura B.2). Usamos ADN yARN para los compuestos que en Ingles se abrevian DNA y RNA.


3/22

210 Bloqulmlcapr.~tlc.

HForma cetonica Forma encnca

Figura 8.2 Formas cetonica y enolica de latimina

PentosasLos dos grupos principales 'de acidos nucleicos derivan su nombre del azucarque poseen, el cual puede ser ribosa 0 desoxiribosa.

5'HOH24~~O O~

H H IH 3' 2' HOH H

f3-D-Ribofuranosa f 3 -D-2-DesoxirribofuranosaLos atornos de carbono de los azucares se designan como 1',2', etc., para

diferenciarlos de los de las bases.Nucle6sidosEl C 1de los azucares se une al nitrogeno en la posicion 9de las purinas 0 en laposicion 1 de las pirimidinas para forrnar el nucleoside.

NH2

N:):NI I}-HHAN N

o)):- H

HN IO~N ""'H

OH OH OR OH

Adenosina UridinaLa mayoria de los enlaces entre el azucar y la base se hacenen 1aforma

mencionada; sin embargo, el ARN de transferencia contieneun nucleoside

,


4/22

Acldos nuclelcos 211

poco usual, la pseudouridina, en el que el C 1 de Ila ri bosa esta unido a laposicion 5 del uracilo.

t4ucleotldosLos grupos hidroxilo en posicion 2', 3' y 5' de la ri bosa pueden esterificarse conacido fosforico dando una variedad conocida de esteres. Similarmente la de-soxirri bosa puede esterificarse en las posiciones 3' y 5', dando tam bien esteresque se encuentran en la naturaleza.Los .nucleotidos y nucleosidos se nom bran de acuerdo a las bases que se

encuentran presentes en su estructura, como se indica a continuaci6n.

Base Nucleoside Nucleotideadenina adenosina acido adenilicoguanina guanosina acido guanilicouracilo uridina acido uridilicocitosina citidina acido citidilicotimina timidina acido timidilico

Si la base esta unida a la desoxirribosa, los nombres de los compuestos cam-bian; asi, un nucleoside que contiene aden ina y desoxirribosa se llarnara de-soxiadenosina. Adernas de los nucleotidos nombrados anteriormente, en lanaturaleza se encuentra en estado libre un numero de nucleotidos de impor-tancia biologica tales como adenosina di- y trifosfato (ADP y ATP), guanosinadi- y trifosfato (GDP y GTP) y nicotinamida adenina dinucleotide (NAD).

OR ORAdenosina trifosfato (ATP).


5/22

212 Bloquimlca practlea

A cid os n uc le ic osLos acidos nucleicos son macrornoleculas en las que los nucleotidos estanunidos por enlaces fosfodiester entre las posiciones 3' y 5' de los azucares.Una porcion de la molecula de ARN tendra, por 10 tanto, la estructura queaparece en la figura 8.3 en la cual la base puede ser una purina 0 unapirimidina.La mayoria de los acidos nucleicos son moleculas muy grandes y

representar la formula completa seria bastante complicado. Sin embargo,una forma uti! de mostrar abreviadamente la estructura de las bases pre-sentes es usar la primera letra de su nombre. La secuencia de las bases essupremamente importante, de modo que, un acido nucleico puede represen-tarse indicando en su orden la primera letra de las bases que 10 forman (figura8.4).ADN. El ADN esta constituido por dos cadenas de polinucleotidos entrelaza-das en forma de espiral y estabilizadas mediante enlaces de hidrogeno entre

IO=P-OHIo/r~ rOHIO=P-OHIo/~'~o OH/O=P-OHIo. /.~".o OH/O=P-OHIo/

Figura 8.3 Parte de una molecule de ARN


6/22

Acldos nuclelcos 213p/ I/ 7 A AP IL G Gp/ I/ 7 c cp 0 IL 7 T TP I/ 7 A AP I -L. T T7 I/

Figura 8.4 Anotacion abreviada para mostrar lasecuencia de base de un acidonucleicodeterminados pares de bases. La estereoquimica de las bases es tal que la ade-nina se aparea con la timina y la guanina con la citosina, en forma tal que loscocientes A/T =1YG/C =1(figura (8.5). Este aspecto de la estructura del ADNfue propuesto por Watson y Crick en 1953basados en los datos de la cristalo-grafia de Rayos X obtenidos por Wilkins y se conoce como la hipotesis deWatson y Crick. Esta hipotesis fue confirmada posteriormente y ha servido debase para explicar algunas de las propiedades biologicas del ADN.

Timina Aoenma

H HH ~ ~'H.1/ I( "0/ N Y ' H : : t J C } - H

'HN N NI ICitosina H Guanina

Figura 8.5 Apareamiento de bases a traves de enlacesde hidrogeno (- - - -) comoocurre en el ADN


7/22

214 BloqulmlcapractlcaLa mayoria de las moleculas del ADN son helices dobles; sin embargo,

algunos virus contienen ADN de una sola cadena y el ADN mitocondrial esuna estructura cerrada en forma de bucle.Dado que los metodos usados para la purificacion delADN pueden romper

la molecula, es dificil dar un valor exacto para su peso molecular; sin em bargo,se han obtenido experimentalmente valores de 109 daltones.ARN. Puesto que, con muy pocas excepciones, la molecule deARN consta deuna sola banda de acido nuclei co que forma un espiral flexible y tiene soloun as pocas regiones donde las bases se aparean, la relacion simpleA/U = G/C. = 1 no es necesariamente cierta para la mayoria de las diferentesformas de ARN. El peso molecular del ARN de transferencia es aproximada-mente 25000, perootras formas de ARN pueden tener pesos moleculares quellegan hasta un millen. ' -

PAPEL BIOLOGICO DE LOS ACIDOS NUCLEICOSEsta parte de la bioquimica ha tenido un desarrollo tan vertiginoso en estosultimos afios y no es posible resumirlo adecuadamente en unas pocas lineas.Sin embargo, nos parece apropiado en este punto hacer un somero recuentodel papel que juegan estas moleculas en los organismos vivos.ADNEl ADN esta intimamente asociado con el material genetico de las celulas, Enalgunos microorganismos el ADN de una sola cadena parece ser el materialque almacena la informacion genetica; sin embargo, en los organismossuperiores el ADN se encuentra formando parte de la nucleo-proteina de loscromosomas. La cantidad de ADN en las celulas de una especie determinadaes constante; sin embargo, las celulas germinales, que tienen la mitad delnumero de cromosomas, contienen la mitad del ADN presente en otrascelulas, El ADN se encuentra casi exelusivamente en el nucleo y solo en muypoca cantidad en las mitocondrias y en los cloroplastos.La funcion del ADN es almacenar informacion genetica y servir de mol de

a traves del ARN, para el ordenamiento de los aminoacidos.en las proteinas.Replicacum celular. Las caracteristicas hereditarias son transmitidas a lascelulas hijas a traves de la replicacion del ADN. El proceso es complicado einvolucra un gran numero de enzimas y proteinas. Sin embargo, basicamentela replicacion parece efectuarse en una serie de etapas cortas durante lascuales segment os de doble helice se separan y el nuevo ADN se formasimultanearnente sobre cada cadena a partir de nucleotidos libres. Las nuevascadenas son sintetizadas de acuerdo a las reglas de apareamiento de las bases,de tal manera que eventualmente se forman dos moleculas identicas al ADNoriginal.


8/22

j

Acldolnuc'.'col 215Control de la sintesis de proteinas. Gracias a un variado numero deexperimentos se sabe ahora que la secuencia de las bases en el ADN nucleardetermina las protein as que se sintetizan en el citoplasma de las celulas. El'c6digo genetico' es de tal tipo que tres bases que forman una unidad conocida .como tripleta de codificacion, que no admite superposici6n con bases de otrastripletas similares codifica la presencia y posicion de cada uno de losamino acidos en una proteina. El codigo es 'degenerado' puesto que mas deuna tripleta puede codificar un aminoacido dado. El mensaje genetico esllevado del nucleo al sistema de sintesis de proteina situado en los ribosomas. por una rnolecula intermediaria, el ARN mensajero (mARN). Esta moleculetiene una secuencia de bases complementarias a la del ADN nuclear; el grupode 3 bases del mARN correspondiente a la triplet a de codificacion del ADN seconoce como codon. Asi pues, el ADN actuaen primera instancia como un'molde' sobreel cual se sintetiza el mARN.ARNMientras que el ADN se encuentra casi exclusivamente en el nucleo, el ARNse distribuye por toda la celula, La mayoria del ARN se encuentra en elcitoplasma como ARN soluble y ARN ribosomal, pero aproximadamenteel10%se encuentra en el micleo y una poca cantidad se halla tambien en lasmitocondrias. En las celulas de organismos superiores hay tres tipos de ARN:ARN mensajero (mARN), ARN ribosomal (rARN), yARN de transferencia(tARN), todos los cuales participan activamente en la sintesis de proteinas.ARN mensajero (mARN). Como se menciono anteriormente, la primeraetapa en la sintesis de proteinas es la transferencia del mensaje genetico delADN al mARN: este proceso se conoce con el nombre de transcripcum. ElmARN migra al citoplasma y es precisamente alli donde, con la participacionde ribosomas y tARN, las.4 bases nucleotidicas se convierten en el codigo deveinte tripletas que llevan la clave de la ordenacion de los aminoacidos en lasproteinas. Esta etapa se conoce como traduccion. Unicamente se transcribeparte de la cadena del ADN y por 10 tanto el mARN es mas pequefio que elADN nuclear. EI peso molecular real de un mARN dado depende del numerode residuos de aminoacidos en la protefna que codifica, y con frecuencia esdel orden de un millon (*); EI mARN difiere de otras formas de ARN en que esmetabolicamente inestable.ARN ribosomal (rARN). Los ribosomas son particulas microsc6picas de lacelula, visibles unicarnente bajo el microscopio electronico, con una com-posici6n bastante uniforme de aproximadamente 60%de protelna y 40%deARN.Los ribosomas 80 S de las celulas eucarioticas estan constituidos por Ndel T. Ya que existen funciones de reconocimiento ycontrol que no se traducen, el mimero debases en un mARN es generalmente mayor que el estrictamente necesario para codificar losaminoacidos de una proteina.


9/22

216 Bloqulmlcapractice

dos subunidades, una de 60 S y la otra de 40S, que difieren en cuanto a com-posicion quimica. Los ribosomas 70 Sson ligeramente mas pequeiios y estanformados por dos subunidades, Ia 50 S Y la 30 S. Varios ribosomas puedenunirse a una cinta de mARN para formar un polisoma que se asemejabastante a las cuentas de un collar de perlas.

Ribosoma

C6dones X, Y Z en elARN mensajeroAnticodon

ARNmensajero

.... ---- Aminoacido1. EI ARN mensajero se une al ribosoma 2. EI tARN que lIeva el aminoacido 1se une al codon X del mARN

3. EI segundo tARN se une al codon Y-irecci6n del rnovimiento del ribosoma~ .. ,. libre

- Cadena peptfdica en crecimiento4. EI enlace peptfdico se forma entre los aminoacidos C D y @ y el primer tARN es

liberado. .

Flgur.8.6 Representaci6n esquematica.de 1a sintesis de proteina


10/22

Acldol nucieicol 217

ARN de transferencia (tARN). Existe un tARN especifico para cadaaminoacido cuya funci6n es transportar el aminoacido activado allugar desintesis de proteina. A diferencia de las otras formas de ARN, los tARN,tienen un peso molecular bajo y gracias a esto la secuencia de nucleotidosha sido determinada para muchos de ellos. Una parte de la moleculacontiene una tripleta de bases, el anticodon, que reconoce y se une alcodondel mARN. Todos los tARN tienen el mismo grupo terminal de bases, CCAy la adenina final reacciona con el aminoacido activado. Otras secuenciasde bases en el tARN conforman lugares de reconocimiento que tienen quever con la uni6n al ribosoma y la interacci6n con la aminoacil sintetasaespecifica.

Sintesis de proteina. El ARN mensajero y el 'tARN que transporta unarnmoacido activado se un en a los ribosomas en la forma indic.ada(j) ..Una vezque el primer tARN se ha unido al mARN en el codon (X), otro tARN quetransporta un segundo aminoacido se une al codon vecino (Y). El grupoamino del arninoacido del segundo tARN reacciona con el grupo carboxiloterminal activado del primer tARN formando un dipeptide. El primer tARNes entonces liberado y el ribosoma se mueve a 10 largo del mARN paraexponer el codon siguiente (Z) que se halla listo pararecibir el tARN quetransport a el tercer aminoacido (figura 8.6).El proceso se repite hasta que secomplete la cadena peptidica. Varias moleculas de proteina se sintetizansimultaneamente sobre el mismo mARN por ribosomas que se mueven aintervalos a 10 largo de lacinta de ARN(figura 8.7).El proceso es mucho mas complejo de 10 que se ha esbozado y requiere un

numero diverso de 'factores' en las diferentes etapas. La sintesis neeesitaenergia que es suministrada por la hidr6lisis del GTP. .Acidos nucleicos de virus. Todos los virus eontienen acido nucleico, el eualpuede consti tuir hasta e150%de la particula. Puede ser ADN 0ARN y algunasveces el ADN puede estar en forma de banda sencilla con tina estructuraterciaria definida. EI acidonucletco esta rodeado por una envoltura deproteina y esta ultima es la responsable de la especificidad inmunol6gica delvirus, mientras que el acido nuc1eico constituye la parte infectante de laparticula. Algunos virus se adhieren a la membrana de la celula e inyectan supropio ADN dentro de ella; entonces usan la maquinaria sintetica de la celulapara producir proteinas y acidos nucleicos virales. Los virus de plantascontienen ARN en vez de ADN y en estos casos el ARNactua como materialgenetico, a la vez que ejecuta las funciones ya conocidas en la sintesis deproteinas."

N. del T. El proceso descrito se refiere a la sintesis de proteina en procariotes. Existen algunasdiferencias en celulas eucari6ticas.


11/22

218 Bioquimica practice

'if-tARNa hbre ARN mensajeroIB _ R " , , , w m o

libre

i-cadena" polipeptidicacompleta

Cadenas polipeptidicas en crecimiento -

Figura 8.7 Sintesis de varios peptidos sobre un mismo polisoma

EXPERIMENTOS CON ACIDOS NUCLEICOSEXPERIMENTO 8.1 Aislamiento del ARN de levaduraFundamentoEI ARN de levadura se obtiene extrayendo un homogenizado de celulas confenol. La solucion concen trada de fenol rompe los enlaces de hidrogeno en lasmacromoleculas, causando desnaturalizacion de la proteina. La suspensionturbia se centrifuga y aparecen dos fases: la fase inferior de fenol contieneADN y la fase superior acuosa contiene carbohidratos yARN. La proteinadesnaturalizada se hall a presente en am bas fases y puede removerse porcentrifugacion. EIARN se precipita luego con etanol. El producto obtenido nocontiene ADN pero generalmente esta contaminado con polisacarido. Sepuede obtener mayor puriflcacion tratando esta preparacion con amilasa.Materiales

1. Levadura seca2. Solucion de fenol (900gil).3. Acetato de potasio (200gil, pH 5).4. Etanol absoluto.

10200g11

5. Eter etilico,6. Bafio de agua a 37C.

MetodoSuspenda 30g de levadura seca en 120ml de agua a 37C.Deje por 15minutos aesta temperatura y agregue 160ml de solucion concen trada de fenol. (Precau-cion: muy corrosivo). Agite mecanicamente la suspension durante 30minu-tos a temperatura ambiente; luego centrifuge en frio a 3000 9 durante 15minutos para romper la emulsion. Con una pipeta Pasteur remueva cuidado-

200ml3 1500ml5


12/22

Acldosnuclelcos 219

samentela capa superior acuosa y centrifugue a 10000 9 durante 5minutosen una centrifuga refrigerada para separar la protein a desnaturalizada.Agregue acetato de potasio al sobrenadante hasta obtener una concentracionfinal de 20 gil Yprecipite el ARN afiadiendo 2 volumenes de etanoI. Enfrie lasolucion en hielo y dejela alli por 1hora. Recoja el precipitado por centrifuga-cion en frio a 2000 9 por 5 minutos. Lave el ARN con una mezcIa etanol-agua(3:1), luego con etanol y finalmente con eter: deje secar al aire y pese. Nota: elcontenido de ARN en levadura es alrededor de 4% de su peso seco.Compare su producto con- una preparacion comercial midiendo el

contenido de pentosa, fosforo y ADN Y determinando e1 espectro de absor-cion. Guarde su preparacion para usarla en experimentos futuros.EXPERIMENTO 8.2 Electroforesis de nucleotulos de ARNFundamentoLos enlaces ester de ARN son hidrolizados facilmente debido a la presenciadel hidroxilo 1ibre 2' de la ribosa. Esto permite 1aforrnacion de fosfodiesteresloscuales se hidrolizan dando nucleotidos 2' Y3'. E1ADN no contiene un gru pohidroxilo en 1aposicion 2' yes por 10tanto re1ativamente estab1e al alcali di-luido. Los nucleotidos hidrolizados pueden ser luego separados por electrofo-res is en amortiguador de citrato, pH 3.5, en el que poseen varias cargasnegativas.Materiales 10

5. Acido cIorhidrico (0.01 molll).6. Incubadoras a 37C.7. Espectrofotometro uItravioleta.8. Patrones de nucleotidos (AMP, GMP, CMP Y UMP).9. Equipo para electroforesis en acetato de celulosa.10. Lampara ultravioleta,

100 ml2 s

100ml5 veces lacapacidaddel tanquede electro-foresis200 ml35

1. Hidroxido de potasio (0.3 molll)., 2 . Acido ribonucleico.3. Acido perclorico (200 gil).4. Amortiguador de citrato (0.02 mol/I, pH 3.5).

53

MetodoDisuelva el ARN en 5ml de hidroxido de potasio 0.3moIll (20-30 mg/ml) eincube a 37 C durante 18horas. Al dia siguiente coloque la solucion en unbafio de hielo y titule hasta obtener un pH de 3.5con acido perclorico 200gil.


13/22

"

220 Bloquimlca pr6ctlca

Rernueva cualquier precipitado que se forme por centrifugacion y use elsobrenadante para la separacion electroforetica.Remoje las tiras de acetato de celulosa en el amortiguador, seque el excesode agua y coloquelas teniendo cuidado de que los extremos esten dentro del

amortiguador. Aplique los nucleotidos en el extremo de la tira cercano alcatodo y corra la electroforesis a 10V/cm, Se puede observar facilmente eltranscurso de la separacion examinando las tiras con luz ultravioleta, ya queel acetato de celulosa fluoresce bajo la irradiacion mientras que los nucleoti-dos absorben fuertemente en el ultravioleta y aparecen como manchas os-curas.Eluya cada uno de los nucleotidos con 4 ml de Hel 0.01moll 1y haga un

grafico del espectro de absorcion obtenido en 1aregion entre 220-320nm. Usecomo blanco fracciones eluidas de una tira que ha side corrida en la mismaforma pero a la cual no se le habia agregado nucleotidos.Identifique los nucleotidos hasta donde sea posible usando los datos de

extincion que aparecen en la tabla 8.1. Use los valores de pK de los gruposlonicos presentes en los nucleotidos que se dan en la tabla 8.2para predecir elorden de separacion,Tabla 8.1 Absorci6n de los nucle6tidos de ARN en ultravioleta a pH 2

Coeficiente de extinci6nmilimolar a 260 nmNucle6tido (E260) E250/ E260 E280/ E260acido adenilico 14.3 0.85 0.22acido guanilico 11.8 0.92 0.68acido citidilico 6.8 0.47 1.90acido uridilico 9.8 0.78 0.30

Tabla 8.2 Valores de pK de los grupos ionizables de los nucle6tidos de ARNGru,Eos ionizablesFosfato Fosfatoprimario Amino secundario Hidroxilo

acido adenilico 0.9 3.7 5.9acldo guanilico 0.7 2.3 5.9 9.5acido citidilico 0.8 4.3 6.0 13.2acido uridilico 1.0 5.9 9.4


14/22

Acldo8nuclelco8 221

E X P E R I M E N T O 8.3 Separacuni de nucleotulos del ARN por cromatografia deintercambio ionicoFundamentoComo en el experimento anterior, el ARN es hidrolizado por alcali paraseparar los nucleotidos que 10 constituyen. Los productos de la hidrolisis sonluego separados en una columna de intercambio ionico fuertemente acida sson identificados por su espectro de absorcion ultravioleta caracteristico(tabla 8.1). El UMP y el GMP salen de la columna como dos picos definidos,mientras que el AMP y el CMP salen combinados en un solo pico, debiendousarse en este caso una formula empiric a para ca1cular las cantidades relati-vas de los dos nucleotidos.Materlale.

1. Acido ribonucleico de fuentes animales 0 bacterianas.2. Hidroxido de potasio (0.3 mol/I),3. Acido perclorico (200 gil).4. Acido clorhidrico (0.05 mol/I),5. Acido clorhidrico (1 mol/I).6. Columna de cromatografia Dowex 50W (15 em x 1.5 em).7. Espectrofotometro ultravioleta.8. Frascos volumetricos (10 ml).9. Frascos volumetricos (25 ml).

102g

100 ml100 ml500 ml50ml55105MetodoHidrolice 0.2g de ARN con KOH 0.3mol/l y neutralice con acido perclorico talcomo se indico en el experimento anterior. En un tubo de ensayo pipetee3.8ml de la solucion y agregue 0.2 ml de HCI 1 mol/l hasta obtener unaconcentracion final de acido de 0.05 mol/I. Mida la extincion de la solucion a260 nm diluyendo una alicuota con HCI 0.05molll y aplique entre 5 y 12unidades de extincion a la parte superior de una columna de Dowex 50 Wpreviamente equilibrada con HCl 0.05mol/I, Eluya con HCl 0.05 mol/I yrecoja el eluido en un frasco volumetrico de 10ml. Mida la extincion del eluidoa 260 nm a medida que sale de la columna y una vez que hay a salido de ella elprimer nucleotido, coloque bajo la columna un segundo frasco de 10ml quecontenga 0.5 ml de HCl1 moll 1y eluya con agua hasta que haya salido todo elGMP. Incremente entonces el flujo de la columna y recoja el AMP y CMP enun frasco de 25ml que contenga 1.25 ml de acido clorhidrico 1 mol/I.Llene hast a la marca el primer frasco con HCl 0.05 molll y los otros dosfrascos con agua. Mezcle fuertemente y haga grafieos del espectro ultravioletaentre 220 y 320 nm tomando muestras de cada frasco. Explique por que losnucleotidos salen de la columna en el orden que 10 hacen y use la formula quese da a continuacion para calcular la cantidad de cad a nucleotide presente. ;,Semantiene la relacion AMP/UMP = GMP/CMP = 1 para ARN?


15/22

222 Bloquimlcapractlca

Pico 1: UMP (umol) = (E260 X 10)/9.8.GMP (,umol) = (E2 5 7 X 10)/11.8.

Si [X] = (2.32 X E2 5 7 - E2 79)2.08,AMP (,umol) = ([X] X 25)14.3,CMP (,umol) = E2 79 - (0.24 X [X] X 25)132.

Pico 2:Pico 3:

EXPERIMENTO 8.4 Composicum de bases en el ARNFundamentoLos acidos ribonucleico y desoxiribonucleico pueden hidrolizarse con acidoperc16rico al 72%por 1hora hasta liberar las bases que 10 forman. El metodo noes completamente cuantitativo, puesto que se pierde algo de timina. Las basesresultantes se separan luego por cromatografia de papel y se detectan con luzultravioleta.Materlales

1. Acido ribonuc1eico.2. Acido perclorico (72%).3 . Bases marcadoras (adenina, guanina, citosina, uraciloy timina, 5 mmol/l).4. Bafio de agua hirviendo.

5. Lampara de luz ultravioleta.6. Acido clorhidrico (0.1 mol/I),7. Espectrofotometro ultravioleta.8. Acido clorhidrico (conc.)9. Isopropanol.10. Equipo de cromatografia de papel.11. Solventes para cromatografia (isopropanol: agua:aci cone. 130:37:33).

101g

20 ml1ml55250 ml5

55veces lacapacidaddel tanque

MetodaMezcle el acido nucleico (100mg) con 1ml de acido percl6rico y caliente por 1hora en un bafio de agua hirviendo. Tape el tuba con una bola de vidrio 0 unaampolleta para evitar la evaporacion. Ya que existe el peligro de explosion,esta hidrolisis debe efectuarse en un extractor de gases protegido por unamalla metalica. No caliente hasta la sequedad.Enfrie el tubo, agregue 1 ml de agua y centrifugue el contenido: use el

sobrenadante claro y haga cromatografia descendente en papel Whatman No.1de un dia para otro. Se deben correr como marc adores bases puras paralela-mente a las muestras.


16/22

Acldos nucleicos 223

Tabla 8.3 Absorci6n de las bases de purina y pirimidina en acidoclorhidrico 0.1 moll ILongitud de onda Coeficiente demaxima extincion milimolarases

adenina .guaninauracilotiminacitosina

260 13.0250 11.2'260 7.9265 7.9275 10.5

Seque el cromatograma en una corriente de aire seco durante 4horas; lue-go localice las bases con luz ultravioleta. Corte las manchas y coloquelas en 5ml de HCl 0.1mol/l de un dia para otro para eluir el contenido. Haga un grafi-co del espectro de absorcion de la solucion. Identifique las bases comparandoel espectro de absorcion con patrones de purinas y pirimidinas y determinelas cantidades relativas de las bases en los acidos nucleicos a partir de loscoeficientes de absorcion dados en la tabla B.3.Compare la relacion de las bases col}los valoresobtenidos por hidrolisis

alcalina seguida de electroforesis de los nucleotidos,

EXPERIMENTO 8.5 Aislamiento del ADN a partir del bazo de cerdoFundamentoCasi todas las celulas contienen ADN,pero la cantidad presente en algunostejidos es pequeiia y por 10 tanto no son buen material para su extraccion.Adernas, algunos tejidos contienen actividades altas de la enzima desoxiribo- .nucleasa (DNasa) la cual fragmenta el ADN. Una fuente adecuada para laextraccion de ADN debe, por 10 tanto, contener cantidades altas de estematerial y tener muy baja actividad de desoxiribonucleasa. EI tejido linfoidees muy bueno; el timo es la mejor fuente, pero el bazo puede usarse conbuenos resultados.EI ADN se desnaturaliza facilmente y debe trabajarse con cui dado paraobtener un producto estructuralmente semejante al encontrado en la celula ..Debe evitarse la tension mecanica y condiciones fisicas y quimicas extremas ydeben inhibirselas nucleasas. Se puedeagregar citrato de sodio para ligarCa++yMg++loscuales son cofactores de las DNasa. Aquellas etapas del proce-dimiento anteriores ala separacion de las proteinas deben hacerse tan rapida-mente como sea posible y en frio.Las nucleoprotein as son solubles en agua y soluciones de alta concentra-cion ionica, pero son insolubles en soluciones de baja concentracion ionica

(0~05-0.25mol/l) y esta propiedad es usada en su extraccion. Primero el tejidoes homogenizado en solucion salina isotonica amortiguada con citrato de

.'


17/22

224 Bloqulmlcapractlca

sodio, pH 7, en la que se solubilizan la mayoria de las otras moleculas,mientras que las desoxirtbonucleoproteinas permanecen insolubles peropueden solubilizarse luego en solucion salina 2 mol/I.La proteina se separa tratando la solucion con una mezcla de cloroformolalcohol amilico y el ADN se precipita con etanoI. El producto se disuelve enamortiguador salina diluido y se guarda congelado. En esta forma es establepor varios meses.MateRalel

1. Bazo de cerdo.2. Amortiguador salina (NaCl 0.15mol/l amortiguado concitrato de sodio 0.015molll, pH 7).

3. Cloruro de sodio (2 mol/I).4. Cloroformo/alcohol amilico (6:1).5. Alcohol absoluto.6. Eter.7. Licuadoras.

10300g31612121

500 ml5MetodoPiq ue en pedazos muy peq uefios 50g de bazo de cerdo y homogenice en 200mlde amortiguador salino.durante 1minuto. Centrifugue la suspension a 5000gpor 15min utos y rehomogenice el precipi tado en 200ml de amortiguador sali-no. Deseche el sobrenadante; combine y suspenda los sedimentos en NaC12mol/l hasta obtener un volumen final de 11,en el que la mayoria del materialdebe disolverse. Remueva los sedimentos por centrifugaciori y agite la solu-ci6n continuamente con una varilla de vidrio afiadiendo al mismo tiempo unvolumen igual de agua destilada. Envuelva el precipitado fibroso en elextremo de la varilla de vidrio y dejela secar en un vasa de precipitados por 30minutos. Durante este tiempo el grumo se deshidratara parcialmente y elliquido remanente se debe secar con papel de filtro.Disuelva la desoxiribonucleoproteina en aproximadamente 100 ml de

NaC12 molll, agregue un volumen igual de la mezcla de cloroformo/alcoholamilico (6:1), y homogenice por 30 s. Centrifugue la emulsion a 5000g durante10-15 minutos yrecoja la capa superior acuosa (opalescente). La recolecci6ndebe hacerse por succion cuidadosa en forma tal que no se agite laproteinapresente en la interfase de los dos liquidos. Repita dos veces maseltratamiento con solvente organico y recoja el sobrenadante en un vasa de 500ml.Precipite el ADN agitando lentamente el sobrenadante con dos veces su

volumen de alcohol enfriado en hielo y rote una varilla de vidrio hasta que lasfibras se enrollen. Saque la varilla y presione cuidadosamente el ADN fibrosocontra las paredes del vasa de precipitados para exprimir el solvente. Lavefinalmente el precipitado metiendo la varilla en una serie de solventes yexprimiendo el exceso en la forma descrita. Loscuatro solventes usados son


18/22

AcldoBnuclelcOB 225

70%V Iv) etanol, 80%(vIv) etanol, etanol absolutoy eter, Deje evaporar el eterremanente colocando el ADN en un vidrio de reloj aproximadamentedurante 10minutos.Pese elADNsecoy disuelvalo agitandolo en amortiguador salina diluido 1a 10con agua destilada (2mg/ml); almacenese congelado hasta cuando senecesite.

E X P E R I M E N T O 8.6 AbsoTcion ultravioleta de los dcidos nucleic osFundam e nt oDebido al sistema de dobles enlaces conjugados presentes en la molecula delas purinas y pirimidinas, los acidos nucleicos absorben fuertemente en laregion ultravioleta del espectro. Presentan un maximo caracteristico a 260nm y un minimo a 230nm.Nose conocegeneralmente el contenido deagua de losacidosnucleicos, asi.que los coeficientes de extincion no pueden calcularse en base a su peso. Sinembargo, la extincion puede expresarse adecuadamente como E p, que es laextincion de una solucion que contiene 1mol/l de fosforo. Pero aun asi, elcoeficiente de extincion de un acido nucleico no es una constante sino quedepende del tratamiento previo del material, 10 mismo que del pH y de lafuerza ionica del medio. Los valores tipicos de Ep se dan a continuacion:

Ep paraADN= 6000-8000,Ep paraARN = 7000-10 000.

El coeficiente de extincion de un acido nucleico puede incrementarse pordegradacion 0 hidrolisis hasta un 40% y esto se conoce como efectohipercromico. Los enlaces de hidrogeno y las interacciones 'IT_"" en lamacromolecula de los acidos nucleicos alteran el comportamiento resonantede las bases, asi que la extincion de losacidosnucleicos es menor que la sumade las extinciones de los nucleotidos que los componen.Cuando se calienta lentamente una solucion de ADN de doble banda, laextincion no cambia apreciablemente hasta alcanzar un punto que se conocecomo la 'temperatura de fusion' (Tm ); en este punto la absorbancia suberapidamente hasta un valor determinado el cual no cambia apreciablementesi se aumenta mas la temperatura. A la temperatura de fusion se rompen losenlaces de hidrogeno entre las bases de las cadenas opuestas y las dos bandasde ADNse separan. Si la solucion de ADNse enfria luego lentamente, las dosbandas se recombinan y la 'curva deenfriamiento' puede superponerse so-. bre la 'curva de fusion'. Sin embargo, sielADNseenfria rapidamente, ocurrecierta recombinacion entre las doscadenas, pero de una manera desordenada,asi que la extincion de la solucion es mas alta que la de la solucion de ADNantes de calentarse (figura 8.8).


19/22

226 Bloquimlcapractlca

Ec:sN


20/22

Acldosnuclelcos 227Ejecta del calor sabre ADN. Prepare tres soluciones de ADN en amortigua-dar salina diluido (0.1), normal (1) y concentrado (5x), hasta un valor deextincion inicial entre 0.3 y 0.5 (0.1 mg/rnl). Coloque las soluciones en trescubetas en un espectrofotometro que contenga una celda para cubetastermostaticamente controlada y anote los cambios en la extincion a medidaque se aumenta la temperatura hasta 900C. La temperatura de la celda esusualmente mas alta que la de la cubeta misma, asi que debe medirse latemperatura de la solucion de ADN directamente en la cubeta si es posible.Mida tambien el cambio en la extincion a medida que las cubetas se enfrian .

lentamente desde 900C hasta la temperatura ambiente. Repita el experimen-to, pero esta vez enfrie las solur.iones rapidamente.Compare las curvas de enfriamiento y fusion para los dos experimentos y

comente el efecto de la fuerza i6nica en la temperatura de fusi6n.EXPERIMENTO 8.7 Determinacum del ADN par la reaccion de diJenilaminaFundamentoCuando se trata ADN con difenilamina en condiciones acidas, se forma uncompuesto azul con una absorci6n definida maxima a 595nm. Esta reacci6n ladan en general las 2-desoxipentosas y no es especifica para ADN. En soluci6nacida, la cadena lineal de una desoxipentosa se convierte a la forma {3-hidro-xilevulinoaldehido altamen te reacti va y que reacciona con difenilamina paradar un complejo azul. En el ADN unicamente reacciona la desoxiribosa delnucleotide de purina, asi que el valor obtenido representa la mitad del total dedesoxiribosa presente.Materlales

1. ADN (muestra comercial).2. ARN (muestra comercial).3. Solucion de bazo de cerdo del experimento 8.5.4. Soluci6n de ARN de levadura del experimento 8.1.5. Amortiguador salina (NaCl 0.15molll; citrato de sodio0.Q15moll 1,pH 7).6. Reactivo de difenilamina. (Disuelva 10 g de difenilaminapura en 1 1de acido acetico glacial y agregue 25ml deacido sulfurfco concentrado. Esta solucion debe prepa-rarse fresca).

7. Banos de agua hirviendo.MetodoDisuelva 10mg de acido nucleico en 50ml de amortiguador salino, saque 2ml yagreguele 4ml de reactivo de difenilamina. Caliente en un bafio de agua hir-viendo durante 10minutos, enfrie y lea la extinci6n a 595nm. Lea la muestray los patrones contra un blanco de agua. Ensaye los acidos nucleic os prepara-,dos por usted y las muestras comerciales de ADN.

10mg10mg10mg10mg500ml

1 1

5


21/22

228 Bloqulmlcapr.ctlcaEXPERIMENTO 8.8 Determinacion del ARN por la reaccion de orcinolFundamentoEsta es una reaccion general para las pentosas y se debe a la forrnacion defurfural cuando se calienta la pentosa con acido clorhidrico concentrado. EIorcinol reacciona con furfural en presencia de cloruro ferrico comocatalizador, dando una coloracion verde. Solamente los nucleotidos de purinadan una reaccion considerable.Materlale.

1. Soluciones de ADN y ARN preparadas tal como en elexperimento 8.7 (0.2 mg/ml).

2. Reactivo de orcinol (disuelva Ig de cloruro ferrico)(FeCI3 6H20) en 11 deHtl concentrado y agregue 35mlde orcinol en alcohol 6% ply).3 . Banos de agua hirviendo.

10250ml

1 1

5M6todoMezcle 2 ml de la soluclon de acido nuclei co con 3 ml del reactivo de orcinol.Caliente en un bafio de agua hirviendo por 20minutos, enfrie y determine laextincion a 665 nm contra un blanco de orcinol.EXPERIMENTO 8.8 Determinacion del contenido de fosforo en un acidonucZeicoFundamentoEl acido nucleico se oxida con acido perclorico dan do fosfato inorganico, elcual puede ser determinado por los metodos convencionales.M a 'e rla l ..

1. Reactivos para la determinacion de fosfato inorganico(experimento 4.3) .2. Acido perclcrico (60% v/v).3. Frascos para digestion y soportes.

10ml20

M6.odoPipetee 2 ml de una solucion de actdo nucleico (0.1 mg/ml) en un frasco dedigestion. Agregue 0.5ml de actdo perclorico y digiera la muestra usando unallama debil durante 1 hora hasta que todo el material .inorgantco hayadesaparecido. (Precaucum: puede ocurrir explosion; ver experimento 8.3).Despues de enfriar, agregue 1 ml de agua destilada a cada frasco y mida elcontenido de fosforo como se describio en el experimento 4.3.


22/22

Acldosnuclelcos 229

BlbllografiaAdams, R. R. P., Bunder, R. H. Campbell, A. M. y Smellie, R. M., Davidson's

The Biochemistry of the Nucleic Acids, 8a ed., Londres, Chapman yHall, 1976.Grossman, L y Moldave, K., Methods in enzymology, Vol. 12, Nucleic Acids,Nueva' York, Academic Press, 1968.Parish, J. H., Principles and Practice of EXperiments with Nucleic Acids,Londres, Longmans, 1972.Watson, J. D., The Double Helix, Londres, Weidenfeld y Nicolson, 1968.

acidos nucleicos

Documents

los acidos nucleicos

en laposicion

nitrogeno en

azucar y

son acidos

proteinas y los monosacaridos

y trifosfato adp y atp

las protein