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核酸標識・検出試薬

プロトコール

71-1752-32

AlkPhos DirectECL Direct

Direct cover.qx 04.11.11 3:50 PM ページ2

305012183

画像

核酸標識・検出試薬

AlkPhos DirectECL Direct直接標識法では、アルカリホスファターゼ（AP）、あるいは西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）酵素分子を

核酸プローブに直接共有結合させます。標識操作は簡単で、反応は30分で終了します。

直接標識法では検出に抗体を使用しないため、抗体反応やそれに伴うブロッキング・洗浄といった操作が不要で、

検出操作を短時間で行うことができます。

核酸の直接標識検出システムとしては、AlkPhos Direct（AP標識）・ECL Direct（HRP標識）の2種類があります。

CONTENTSAlkPhos Direct・ECL Directプロトコールサマリー‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥1

AlkPhos Directプロトコール ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥5

ECL Directプロトコール‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥29

ご注文情報 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥55

関連試薬 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥56

関連機器 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥57


1

AP

Substrate Signal

Probe

Target DNA/RNAMembrane

プローブの調製

ハイブリダイゼーション

洗浄

プローブの変性

標識反応

プローブ用DNAもしくはRNA（100 ng）

95 ℃、5分間0 ℃（氷中で急冷）

ブロット＋ハイブリダイゼーションバッファー

42 ºC、30～60分間振とう

42 ºC、一晩振とう

＋反応バッファー＋ラベリング溶液（AP）＋クロスリンカー希釈溶液

＋グルタルアルデヒド溶液＋ラベリング溶液（HRP）

55 ºC 、15分間以上振とう

55 ºC、一晩振とう

一次洗浄バッファー（別途調製）で洗浄

42 ºC、20分間×2 振とう

一次洗浄バッファー（別途調製）で洗浄

55 ºC、10分間×2 振とう

検出＋ECL 検出試薬＋CDP-Star 検出試薬

二次洗浄バッファー（別途調製）で洗浄

室温、5分間×2 振とう

二次洗浄バッファー（別途調製）で洗浄

室温、5分間×2 振とう

＋標識プローブ（ハイブリバッファー1 ml あたり5～10 ng）

Hyperfilm ECLにあて、露光

現像

Probe

APAP AP

Probe

TargetMembrane

APAP AP

ProbeHRP

+

+- -

- --+

HRP+

++

HRP+

++

HRP HRP HRP

Probe

Target Membrane

Probe

HRP

Hyperfilm ECL

Light

Substrate +Enhancer

37 ℃、30分 37 ℃、10分

AlkPhos Direct ECL Direct直接標識・検出プロトコール

Direct color_p1-3.qx 04.11.11 3:17 PM ページ1

2

高感度検出に

アルカリホスファターゼ（AP）をプローブに直接標識

AlkPhos DirectAPとCDP-Starの組合せで、Non-RIでは最高レベルの高感度（0.06 pg）

耐熱性アルカリホスファターゼの使用により、75 ℃までハイブリダイゼーション温度が調節可能

抗体反応不要で実験操作・時間を大幅に短縮

基質をECFに変更することによって、化学蛍光で検出可能

● 高感度を必要とするサザンハイブリダイゼーション

● ノーザンハイブリダイゼーション

● マクロアレイ

ノーザンハイブリダイゼーション4 2 1 µg

1.00 0.50 0.25 0.13 0.06 0.03 µg

サンプル：ヒト肝臓由来mRNA

プローブ：ヒトGAPDH

ハイブリダイゼーション： 50 ℃、一晩

露光時間： 2時間

メンブレン： Hybond-N+

フィルム： Hyperfilm MP

検出試薬： CDP-Star

サンプル： Hind III 消化ヒトゲノムDNA

プローブ： N-ras

ハイブリダイゼーション： 50 ℃、一晩

露光時間： 2時間

メンブレン： Hybond-N+

フィルム： Hyperfilm ECL

検出試薬： CDP-Star

サザンハイブリダイゼーション

おすすめAPPLICATION


3

リプロービングに

西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）をプローブに直接標識

ECL Directストリッピングの作業なしでリプロービングが可能

HRPとECL化学発光検出試薬の組み合わせにより、0.5 pgの核酸を検出可能

抗体反応不要で実験操作・時間を大幅に短縮

ECL検出試薬はウェスタンブロッティング用と共用可能

● サザンハイブリダイゼーション

● マクロアレイ

● コロニー/プラークハイブリダイゼーション

● ドット/スロットハイブリダイゼーション

ECLを使用したカイコBACコンティグ作製放射線医学総合研究所　第2研究グループ野畑順子先生・三田和英先生提供

米国Pieter de Jong博士の研究室との共

同研究により作製したカイコBACクロー

ンを高密度に36,864ドットブロットして

あるHDR (High Density Replica)フィル

ター21×21 cmを使用して、20回以上の

リプロービングを行っています。プロー

ブはカイコESTデータベースをもとに設

計したESTマーカーを使用しています。

イネゲノム研究プログラム　農業生物資源研究所・農林水産先端技術研究所様提供

イネF2サンプル由来のゲノムDNAを制

限酵素で消化後、ナイロンメンブレンに

ブロットし、RFLPマッピングを行いま

した。10回以上のリプロービングがプロ

ーブのストリッピングなしに行えます。

イネRFLPマップ作成におけるECL Directによるサイクル・リプロービング

おすすめAPPLICATION

1回目

1回目：

カルス由来C11818cDNA

プローブ（10 ng/ml）

リプロービング

13回目：

イネの穂由来E61814S cDNA

プローブ（20 ng/ml）

リプロービング11回目


4 AlkPhos Direct

A lkPhosDirect_p4-28. qx 04.11.11 3:19 PM ページ4

5AlkPhos Direct

AlkPhos DirectDirect labelling of DNA probes with alkaline phosphatase

for use in conjunction with

Chemiluminescent detection with CDP-Star

Chemifluorescent detection with ECF

RPN 3690

RPN 3691

RPN 3692

Hybridization bufferとBlocking reagentは15～25 ℃で、

そのほかのコンポーネントは2～8 ℃で保存してください。

このシステムは上記条件下で少なくとも3ヶ月間安定です。

Storageand

stability

Gene Images


6 AlkPhos Direct

CONTENTS

コンポーネント ..................................................................................................................................................................... 7

安全に実験を行うために ................................................................................................................................................ 8

イントロダクション ........................................................................................................................................................... 9

実験をはじめる前に..........................................................................................................................................................10

実験に必要な試薬...............................................................................................................................................................11

プロトコール実験を開始するにあたって ........................................................................................................................................12

保存・安定性・輸送 .....................................................................................................................................................12

プロトコールサマリー.................................................................................................................................................13

Protocol 1：標識プローブの調製 ............................................................................................................................14

Protocol 2：ハイブリダイゼーション ...................................................................................................................15

Protocol 3：ストリンジェンシーの調節 ...............................................................................................................16

Protocol 4：シグナルの検出

～CDP-Starを用いた化学発光による検出～ .......................................................................................................17

～ECF を用いた化学蛍光による検出～..................................................................................................................18

高感度検出を行うためのヒントプローブ標識 ..................................................................................................................................................................19

ハイブリダイゼーション ............................................................................................................................................19

ハイブリダイゼーションオーブン使用上の注意 ................................................................................................20

品質管理とコントロール試薬の使用 ......................................................................................................................20

プローブの保存..............................................................................................................................................................20

ブロットのリプロービング ........................................................................................................................................21

ベクターからのインサートDNA切り出し.............................................................................................................22

QUESTIONS & ANSWERS ...................................................................................................................................... 23

TROUBLESHOOTING .................................................................................................................................................. 25

ご注文情報 ............................................................................................................................................................................ 55

関連試薬／関連機器 ....................................................................................................................................................... 56


7AlkPhos Direct

Complete systems:Labelling moduleとDetection reagentを組み合せたキットです。

RPN3690 AlkPhos Direct Labelling and Detection System with CDP-Star

AlkPhos Direct Labelling Module (for 25 labelling) RPN 3680

CDP-Star Detection Reagent (for 2,500 cm2 membrane) RPN 3682

RPN3691 AlkPhos Direct Labelling and Detection System with CDP-Star

AlkPhos Direct Labelling Module (for 50 labelling) RPN 3680×2

CDP-Star Detection Reagent (for 5,000 cm2 membrane) RPN 3682×2

RPN3692 AlkPhos Direct Labelling and Detection System with ECF

Labelling reagents for 25 reactions and RPN 3680

ECF Detection Module (for 2,500 cm2 membrane) RPN 3685

Labelling Module:

RPN3680 Labelling reagentのコンポーネント（25反応分）

Labelling reagent (containing 0.1 % (w/v) sodium azide＊) 60 µl

Cross-linker solution (containing 4.7 % (v/v) formaldehyde＊) 0.5 ml

Reaction buffer 0.5 ml

Water 3×1 ml

Control unlabelled DNA (10 µg/ml Hind III digested lambda DNA) 0.1 ml

Hybridization buffer (containing 12 % (w/v) urea＊) 500 ml

Blocking reagent 2×25 g

RPN3681は上記RPN3680のコンポーネントが倍量（50反応分）含まれているキットです。

Detection reagents:

RPN3682 CDP-Star Chemiluminescent detection reagent for 2,500 cm2 membrane

RPN3683 CDP-Star Chemiluminescent detection reagent for 5,000 cm2 membrane RPN 3682×2

RPN3685 ECF Chemifluorescent detection reagent for 2,500 cm2 membrane

Hybridization buffer:

RPN3688 AlkPhos Direct Hybridization Buffer for 5,000 cm2 membrane

コンポーネント


8 AlkPhos Direct

この製品は、試験研究用製品ですので、人や動物への医療・臨床診断用としては使用できません。

このシステムのCross-linker solution中にはホルムアルデヒドが、Hybridization buffer中にはureaが含まれています。また、

このシステムのプロトコール中にはエチジウムブロマイドや水酸化ナトリウム、EDTAの使用が記載されています。これ

らの物質の取り扱いについては下記の記載をふまえ、各大学および研究所の該当する基準に従ってください。

ホルムアルデヒド毒性物質に該当。摂取および吸入はさけてください。

エチジウムブロマイド有害性物質に該当。

水酸化ナトリウム腐食性物質に該当。

EDTA 有害性物質に該当。

◆ 化合物の持つ危険性について基本的な知識を持つ研究者以外は取り扱わないでください。

◆ 危険物質にはMaterial Safety Data Sheetsが添付されていますので、使用前に必ず一読してください。

◆ 実験中は適切な保護服を常に着用し、試薬が皮膚や眼球等に直接ふれたり、体内に入ることのないよう注意深く取り

扱ってください。もし、そのようなことが起きた場合は大量の水で洗浄するなどし、医師の指示に従ってください。

◆ 化合物同士の反応によって危険な副産物を生じることがありますので、注意深く実験を行ってください。

◆ プロトコール小冊子等で弊社から供給されていない試薬の使用を紹介している場合は、安全性に関する適切な情報を

各試薬の供給元へお問い合わせください。

◆ 製品の保管場所・方法については、第三者による不測の事故を防ぐために十分注意してください。

安全に実験を行うために


9AlkPhos Direct

イントロダクション

AlkPhos Direct Labelling and Detection Systemは、独自に開発された耐熱性アルカリホスファターゼ＊をプローブDNAま

たはRNAに直接標識し、ジオキセタン誘導体を基質に用いた化学発光法などにより検出を行う核酸標識・検出システムで

す。このシステムでは、核酸プローブを完全に変性して一本鎖にした後、クロスリンカーを加えて酵素とプローブを共有

結合させることによりプローブを直接標識します。

標識したプローブは、メンブレン上に固定されたターゲットDNAまたはRNAを検出するために、直ちにハイブリダイゼー

ションに用いることができます。本製品には、新しいエンハンサーを含む至適化されたHybridization buffer＊＊が含ま

れており、このバッファーがハイブリダイゼーションの効率を上げるとともに、ハイブリダイゼーション中の酵素の

失活を防ぐことにより検出感度を上げます。また、ストリンジェンシーを調節するために、ハイブリダイゼーション

の温度を変えることができます。

ハイブリダイゼーション後、一次洗浄バッファーの温度によってストリンジェンシーを調節しながらメンブレンを洗浄し、

過剰のプローブを除きます。洗浄後のメンブレンは、そのまま検出操作に用いることができます。

検出法は以下の方法を選択することができます。

● 化学発光法

CDP-Star化学発光検出試薬を用いると、メンブレン上に添加されたジオキセタン誘導体基質が、プローブに結合して

いるアルカリホスファターゼにより分解されます。CDP-Star による検出では、非常に短時間で発光が始まるので、他

のジオキセタン誘導体を用いる発光法よりも早く結果が得られます。CDP-Star の発光は4時間で最大に達し、数日間

持続しますので、長時間の露光を数回繰り返すことができます。

● 化学蛍光法

化学蛍光はTyphoonやStormなどの蛍光画像解析装置を使用して検出します。ECF化学蛍光基質の最大励起波長と最大

蛍光波長は、それぞれ430 nmと560 nmです。この大きな波長のシフトが、高感度と低バックグラウンドを同時に可能

にしています。

AlkPhos Directは、サザン、ノーザン、スロット／ドットブロッティングおよびマクロアレイ解析に有効に使われていま

す。またこのシステムは、ポジティブチャージメンブレンHybond-N+で至適化されていますので、Hybond-N+のご使用を

おすすめします。

※巻末のライセンスおよび特許に関する情報をご参照ください。

※製品に同梱されるバッファー類は英語標記（Hybridization buffer）し、調製したバッファーはカタカナ標記しています。


10 AlkPhos Direct

● 標識する核酸溶液中の塩濃度は、50 mMを超えないようにできるだけ低くしてください。高塩濃度は標識反応を阻害

し、感度低下の原因になります。塩濃度が200 mMを超えると標識反応が完全に阻害されます。

● DNA濃度は標識前に正確に定量し、10 ng/µlに調製してください。標識反応はこのDNA濃度に至適化されています。

サンプルによる濃度のばらつきは、感度の低下とバックグラウンドの上昇につながります。

● すべての試薬は室温に戻してから使用してください。

● ハイブリダイゼーションバッファーと洗浄バッファーは、あらかじめ調製しておいてください。

● ハイブリダイゼーションバッファーと洗浄バッファーは、使用前に必要な温度にあたためておいてください。

● 標識効率を上げるには、DNAを一本鎖状態に保つことが重要です。

● DNAは常に、使用前にウォーターバスで変性させてください。ヒートブロックは正確な温度制御ができませんのでお

すすめしません。

● RNAも二次構造を除くために使用前に変性させてください。

● 変性させたDNAが再び二本鎖構造をとると感度が下がるため、急冷後は氷上に保存しすぐに使用してください。

● 標識後のプローブは変性処理を行わないでください。

● メンブレンの損傷はプローブの非特異的吸着の原因になります。ブロットは手袋をはめて、先の平らなピンセットを

使って慎重に取り扱ってください。

● 検出操作は、パウダーフリーの手袋をして行ってください。パウダー処理されている手袋を使用する場合は、検出操

作を行う前に手袋をしたまま手を洗い、パウダーを除去してください。

● 細菌に含まれるアルカリフォスファターゼがこのシステムにより検出され、ブロット上に斑点上のバックグラウンド

シグナルがでることがあります。Good Laboratory Practice（GLP）に従い、細菌のコンタミネーションを最低限に抑

えるべきです。洗浄バッファーは2～8 ℃に保存し、ハイブリダイゼーション後の洗浄には、ストック全体ではなく、

必要量のみを取り出して加温し、使用してください。

● 検出試薬は使用前に室温に戻し、十分撹拌して沈殿がないことを確認して使用してください。

実験をはじめる前に


11AlkPhos Direct

一次洗浄バッファー

組成添加量終濃度

urea 120 g 2 M

SDS 1 g 0.1 %

0.5 M Na phosphate pH 7.0＊ 100 ml 50 mM

NaCl 8.7 g 150 mM

1.0 M MgCl2 1 ml 1 mM

Blocking reagent 2 g 0.2 % (W/V)

adjust up to 1,000 ml

＊0.5 M Na phosphateはSodium dihydrogen phosphate (monobasic, NaH2PO4・xH2O) を使用して調製し、NaOH溶液でpHを7.0に合わ

せてください。

二次洗浄バッファー（20×ストック溶液）

組成添加量終濃度

Tris base 121 g 1 M

NaCl 112 g 2 M

＊pHを10.0に調整し、容量を1,000 mlに合わせてください。調製した溶液は2～8 ℃で4ヶ月間保存できます。

二次洗浄バッファー（ワーキング溶液）

ストック溶液を20倍に希釈し、ワーキング溶液を調製します。その際、1,000 mR当たり2 mRの1 M MgCl2溶液を加

えてください（終濃度は2 mMになります）。この溶液は保存できませんので、用時調製してください。

実験に必要な試薬

ハイブリダイゼーションバッファー

終濃度0.5 Mになるように分析グレードのNaClをHybridization bufferに加えてください。その後、マグネティックス

ターラーで攪拌しながら、終濃度4 %（w/v）になるようにBlocking reagentを加え、1～2時間、室温で混ぜ合わせ

て完全に溶解してください。

一度に多量のBlocking reagentを添加すると、非常に溶けにくくなる場合がありますので、必ず攪拌しながら少量ず

つ溶解してください。

調製後のバッファーはすぐに使用するか、-15～ -30 ℃で保存してください。

一次洗浄バッファーは2～8 ℃で1週間保存できます。


12 AlkPhos Direct

実験を開始するにあたって

実験を開始する前に、プロトコール全体を通読してください。標識反応を開始する前に、ハイブリダイゼーションバッ

ファーを調製し、メンブレンのプレハイブリダイゼーションをはじめておくとよいでしょう。

保存

● Hybridization bufferとBlocking reagentは、室温（15～25 ℃）で保存できます。Blocking reagentとNaClを

Hybridization bufferに加えた場合は、すぐに使用するか、-30～ -15℃で保存し、3ヶ月以内に使用してください。

● その他の試薬は2～8 ℃で保存してください。酵素の入った標識試薬はグリセロールを含んでいませんので、凍結

させないでください。1～2回の凍結融解でも分解が起こり感度の低下をもたらす原因になります。

● 全ての試薬は、誤って一晩室温で放置しても問題はありませんが、極力避けてください。

安定性

● キットに含まれる試薬類は、上記の推奨保存条件で保存した場合、最低3ヶ月は安定です。

● 標識済みのプローブは、氷上で最高2時間まで放置しても問題ありません。多少のバックグラウンドの上昇が見ら

れますが、プローブの塩基配列によっては6時間氷上で保存可能です。

● 標識プローブを誤って室温で放置してしまった場合、1時間以内（プローブの塩基配列に依存する）であれば使用

できます。これを過ぎた場合は、酵素の急速な分解のために、バックグラウンドの上昇が起こるため再調製するこ

とをおすすめします。

● 標識プローブを長期保存する場合は、グリセロールで希釈し（終濃度50 %）、-30～ -15 ℃で保存（6ヶ月以内）し

てください。この条件で保存したプローブは比較的安定ですが、使用期限はプローブの塩基配列に依存します。

● 標識プローブを含むハイブリダイゼーションバッファーを再利用する場合は、2～8 ℃で保存してください。繰返

し使用した場合、プローブの分解のためにいくらか感度が落ちることがあります。3回以上の再使用はおすすめし

ません。標識プローブを含むハイブリダイゼーションバッファーは、凍結させないでください。

輸送

● キットに含まれる試薬類は、不凍アイスパックを入れたポリスチレン製の容器に梱包して輸送されています。標識

試薬中の酵素の活性に影響を与えるため、凍結は避けてください。

プロトコール


13

核酸ブロットの調製

ハイブリダイゼーションバッファーの調製

Hybridization bufferを攪拌しながら、NaClとBlocking reagentを少量ずつ添加し完全に溶解する（1.5～2時間）

ブロットのプレハイブリダイゼーション

55 ℃、15～60分間

プローブの標識

変性操作10分間

標識反応30分間


55 ℃、数時間（コロニースクリーニングなど、高コピーターゲットを検出する場合）

55 ℃、一晩（シングルコピー遺伝子の検出など、高感度検出を要する場合）

ブロットの洗浄

一次洗浄バッファーでウォッシュ、10分間×2回

二次洗浄バッファーでリンス、5分間×2回

検出

・CDP-Star検出試薬による化学発光

検出試薬中でのインキュベーション、2～5分間

Hyperfilm ECLへの露光、数分間～数日間

・ECF 検出試薬による化学発光

検出試薬中でのインキュベーション、1分間

蛍光スキャナーによるスキャニング、1～24時間後

プロトコールサマリー

AlkPhos Direct


標識プローブの調製Protocol 1:

14 AlkPhos Direct

プロトコール

1. Cross-linker solution 20 µl にキットに付属のWater 80 µlを

加えて希釈します（クロスリンカー溶液）。

2. 標識するDNAやRNAをキットに付属のWaterで10 ng/µlにな

るように希釈します。

3. マイクロチューブにこの希釈したサンプルを10 µl取り、沸騰

水中で5分間熱変性します。

4. サンプルを氷中で急冷後、スピンダウンしてマイクロチュー

ブの底に集めます。

5. この冷やしたサンプルに10 µlのReaction bufferを加え、穏や

かに完全に混和します。

6. 2 µlのLabelling reagentを加え、穏やかに完全に混和します。

7. 10 µlのクロスリンカー溶液を加えて完全に混和し、スピンダ

ウンしてマイクロチューブの底に集めます。

8. 37 ℃で、30分間インキュベートします。

9. 作成したプローブはただちに使用するか、氷中に保存し、2

時間以内に使用してください。長期間保存する場合は、50 %

Glycerol溶液状態にしてください。- 30～ -15 ℃で6ヶ月間

保存できます。

注意事項

一度希釈した溶液は2～8 ℃で1週間保存することができま

す。

DNAやRNAサンプルの塩濃度はできるだけ低く（50 mM

以下）になるように調製してください。

使用する量にあわせてDNA量、Cross-linker Solution、

Reaction buffer量をスケールアップすることができます。

この操作は氷中で行ってください。

長期間保存していたプローブは、何の前処理も行わずにそ

のまま使用できます。


15AlkPhos Direct

ハイブリダイゼーションProtocol 2:

プロトコール

1. 調製したハイブリダイゼーションバッファーをあらかじめ

55 ℃に温めておいてください。必要なバッファー量はメン

ブレン1 cm2あたり0.25 mlです。プラスチックバッグで大き

なブロットをハイブリダイゼーションする場合や、ボトルを

使用する場合は0.125 ml/cm2まで減らすことができます。

2. ブロットをハイブリダイゼーションバッファーに浸し、ウォー

ターバス（1分間に60ストローク程度のスピードで振盪）、も

しくはハイブリダイゼーションオーブンを用いて、55 ℃で

最低15分間プレハイブリダイゼーションを行います。

3. 標識プローブをハイブリダイゼーションバッファーに加えま

す。通常はバッファー1 mlあたり5～10 ngのプローブが含ま

れるようにします。

4. ウォーターバスまたはハイブリダイゼーションオーブンを用

いて、55 ℃で一晩ハイブリダイゼーションを行います。

注意事項

キットに含まれるHybridization bufferは、使用前にNaClと

Blocking reagentを加えて調製してください。使用するメン

ブレンのサイズやブロットの枚数に合わせて、必要な量の

バッファーを調製してください。バッファーがブロット上に

十分に行き渡り、ブロットが自由に移動できることが重要

です。

標識プローブを直接ブロットに添加しないでください。ハ

イブリダイゼーションバッファーを少量とり、プ

ローブと混ぜてから、ブロットに添加してください。

標識プローブは絶対に熱変性させないでください。

50～75 ℃の温度範囲で、ストリンジェンシーを調節する

ことができます。


16 AlkPhos Direct

ストリンジェンシーの調節Protocol 3:

プロトコール

1. 一次洗浄バッファー（11ページ参照）をあらかじめ55 ℃に

温めておきます。必要なバッファー量はメンブレン1 cm2あ

たり2～5 mlです。

2. この一次洗浄バッファーにブロットを浸し、55 ℃で10分間

穏やかに振盪します。

3. 新しい一次洗浄バッファーを使用して再び55 ℃で10分間洗

浄を行います。

4. きれいな容器にブロットを移し替えて二次洗浄バッファー

（11ページ参照）を加え、室温で5分間穏やかに振盪します。

5. 新しい二次洗浄バッファーを使用して再び室温で5分間穏や

かに振盪します。

注意事項

一次洗浄の温度を変化させることによって、ストリンジェ

ンシーを調節することができます。

それぞれのブロットがバッファー中を自由に移動できれ

ば、複数のブロットを同時に洗浄することが可能です。

洗浄温度を至適化することが成功の重要な鍵となります。

温度のゆらぎでストリンジェンシーは変動しますので、注

意してください。

ブロットは二次洗浄バッファー中で、室温で30分間まで放

置しても構いません。


17AlkPhos Direct

シグナルの検出Protocol 4:

プロトコール

1. ブロット上の余分な二次洗浄バッファーを除き、非吸水性の

きれいな平らな場所にサンプルがブロットされている表面を

上にして置きます。ブロットは乾かないようにしてくださ

い。

2. ブロットにDetection reagentをメンブレン1 cm2あたり30～

40 µl添加し、2～5分間放置します。その後、ブロットの角

をもち余分なバッファーを取り除きます。

3. ブロットをサランラップにくるむか検出バッグに入れて、ブ

ロットした面が上になるように、フィルムカセットの中にセッ

トします。

4. ライトを消し、X線フィルム（Hyperfilm ECLなど）をブロッ

トの上に設置します。カセットを閉じ、室温で1時間露光し

ます。

5. フィルムを取り出し現像します。最大の感度を得るために、

必要であれば2枚目のフィルムを使用し、さらに長時間の露

光を行ってください。

注意事項

サランラップなどを使用してブロットした面を上にして置

いてください。

Detection reagentのコンタミネーションを避けるために、

使用する前に必要な分量を分注して保存しておくことをお

すすめします。

気泡が入った場合には、表面をなでて取り除いてください。

フィルムが濡れないように、フィルムカセットの中に余分

なDetection reagentをこぼさないよう注意してください。

検出バッグを使用する場合、長時間露光によってブロットが

乾燥することがないよう、Heat-sealして密閉してください。

フィルムのセットは暗室で行いSafe lightを利用してくださ

い。露光の途中でフィルムの位置は決してずらさないでく

ださい。

露光時間を長くすると、バックグラウンドは高くなります。

最初の露光は1時間程度をおすすめします。発光は数時間で

ピークに達しますが、シグナルは数日間残存しますので、2

回目以降の露光で時間を調節し、最適なS/N比を得ることが

できます。

～CDP-Starを用いた化学発光による検出～

注意　パウダーのついていない手袋を着用し、検出溶液が直接肌にふれないように注意してください。


標識プローブの調製Protocol 1:

18 AlkPhos Direct

プロトコール

1. ECF detection reagentのボトルにDetection bufferを全量注

ぎ、キャップをしっかり閉めて（ローラーミキサーなどを使

って）10分程度穏やかに振盪させ、ECF substrateを完全に溶

かします。

2. ブロット上の余分な二次洗浄バッファーを除き、非吸水性の

きれいな平らな場所にサンプルがブロットされている表面を

上にして置きます。ブロットは乾かないようにしてくださ

い。

3. ブロットにECF substrate溶液をメンブレン 1 cm2あたり～

25 µl添加し、1分間放置します。新しい検出バッグにブロッ

トを取り、速やかに溶液をブロット全体に均等に広げます。

4. ブロットが乾燥しないよう検出バッグをシールし、引き出し

やフィルムカセットの中などの暗所で、一定時間室温でイン

キュベートします。その実験系での最適時間はいくつか時間

を変えて検出を行って検討する必要があります。

5. 蛍光検出装置のディスプレイにサンプル側を下にして、検出

バッグごとセットします。

6. ブロットを適当な蛍光フィルターを使ってスキャンします。

使用する装置の説明書に従ってください。

注意事項

溶解させたECF substrate溶液は必要量を分注して、-30～

-15 ℃で保存してください。

サランラップなどを使用してブロットした面を上にして置

いてください。

5 mlピペットをローリングしたり、手袋をした手で溶液を

広げても簡単に溶液が広がります。

ターゲットの量が多い場合は、１時間で十分な結果が得ら

れます。ターゲットの量が少なく、より強いシグナルが必

要な場合は、基質を加えて24時間インキュベートした後に

検出を行ってください。

ディスプレイと検出バックの間にエタノールか水を挟むこ

とによって、非常に良好な画像が得られます。

ECFは幅広い励起スペクトルをもっていますが、最大励起

波長は430 nmで最大蛍光波長は560 nmです。

～ECFを用いた化学蛍光による検出～注意　パウダーのついていない手袋を着用し、検出溶液が直接肌にふれないように注意してください。

Protocol 4: シグナルの検出


19AlkPhos Direct

高感度検出を行うためのヒント


ハイブリダイゼーションに必要なDNAの量は、ブロットの面積とターゲットDNAの量に依存します。実際は、ブロ

ットの面積で用いるハイブリダイゼーションバッファーの量が決まり、ターゲットDNAの量とプローブの塩基配列

によってプローブ濃度を決定します。多くのアプリケーションにおいて、ターゲットDNAの量が多い場合を除いて、

プローブ濃度は5～10 ng/mlが適しています。化学発光以外の検出法の場合は、プローブ濃度は高くなります。例え

ばECFの場合は10～20 ng/ml、発色法の場合は50 ng/mlの濃度が必要になります。

◆ プローブには精製したインサートを使用してください。クローン全体をプローブとして使った場合、時にS/N比が

低くなることがあります。

◆ ベクターからインサートを精製するプロトコールは、22ページに記載されています。

◆ 50 bp以上の長さのプローブであれば標識できますが、単一コピーの遺伝子の検出であっても、十分な感度を得る

にはプローブの長さは300 bp以上であることを推奨します。

◆ ヒートブロックでは、標識するDNAを完全に変性させることはできません。ウォーターバスを使用してください。

RNAの場合も、二次構造を除くために変性させることをおすすめします。

◆ プロトコールはDNAプローブ用に書かれていますが、RNAプローブの標識の場合にも同様に行えます。


◆ AlkPhos DirectのHybridization bufferはこのシステムに合わせて至適化されています。ECL Gold Hybridization

Bufferとは異なりますので、相互に入れ替えて使うことはできません。最良の結果を得るには、最適なバッファーを

使うことが重要です。

◆ ブロッキング試薬が完全に溶けていないと、メンブレンのブロッキングが不十分になります。ハイブリダイゼー

ションバッファーに加えるNaClの濃度は、使用するプローブに応じて0.25～1.0 Mの間で自由に変えられます。

一般的には、0.5 M NaClで十分な結果が得られますので、はじめて行う場合にはこの条件をおすすめします。

バッファーを作りすぎた場合は、滅菌した容器に小分けし、-30～ -15℃（3ヶ月以内）で保存してください。

◆ 複数のブロットを同時にハイブリダイズさせる場合は、ブロットにバッファーを完全に浸透させ、ブロットと

バッファーの間に気泡が入らないように気をつけてください。

◆ はじめて実験を行う場合には、ハイブリダイゼーション温度は55 ℃を推奨します。ストリンジェンシーはハイブリ

ダイゼーションもしくは洗浄温度を変えることで調節できます。75 ℃までの範囲でストリンジェンシーのコント

ロールができます。50 ℃以下の低温は非常に短いプローブのみに適しています。実験中のわずかな温度変化がス

トリンジェンシーに影響しますので、ハイブリダイゼーション温度が正確にコントロールされていることは非常に

重要です。85 ℃以上の高温は酵素活性に影響しますので避けてください。

◆ ストリンジェンシーは一次洗浄温度を調節することでもコントロールできます。通常の一次洗浄温度は55 ℃です

が、50～75 ℃の間で調節することができます。

◆ 多くの場合、オーバーナイトのハイブリダイゼーションが推奨されますが、ターゲットのDNA量が多い場合、短

時間（2～4時間）でハイブリダイゼーションを完了することもできます。

◆ ハイブリダイゼーション後のブロットは、二次洗浄バッファーで湿らせたサランラップで包んで、一晩2～8 ℃で

保存することができます。この時ブロットは決して乾かさないでください。


20 AlkPhos Direct

◆ 核酸のハイブリダイゼーションと洗浄は、回転式のインキュベーターやハイブリダイゼーションオーブンで行うと

便利です。これらの装置ではバッファーが常にブロット上を移動し、必要な液量が最少で済みますので、プローブ

の節約になります。以下に、ハイブリダイゼーションオーブンの一般的な使用方法を記します。使用する装置や実

験方法に合わせて変更してください。

ハイブリダイゼーションオーブン使用上の注意

◆ ハイブリダイゼーションオーブンの使用方法は40ページを参照してください。

◆ ブロットをチューブに移します。ブロットが乾いている場合は、ブロットとチューブの間に気泡が入らないように

少量のハイブリダイゼーションバッファーを加え、ブロットを湿らせます。ブロットとチューブの間に気泡が入る

と、黒いパッチ様のバックグラウンドの原因になります。

◆ ブロットが重ならないように気をつけてください。どうしても重なる場合は、2枚のナイロンメッシュでブロット

を挟み、核酸の面がハイブリダイゼーションオーブンのチューブの内側になるようにして入れてください。ナイロ

ンメッシュは1 %SDSで洗浄し、蒸留水でリンスすれば再使用できます。ハイブリダイゼーションバッファー量と

プローブ濃度を正確に保つために、余分なバッファーを除き、新たにバッファーを加えます。ハイブリダイゼーショ

ンバッファーの量は0.063～0.125 ml/cm2が推奨条件です。必要なバッファー量はチューブのサイズによって決ま

ります（例えば直径4 cm長さ30 cmの場合は最低20 ml必要です）。一般的に、標準的なRI標識のハイブリダイゼー

ションの場合より多量のバッファーが必要になります。バッファー量が不十分な場合、バックグラウンドの上昇の

原因になります。

品質管理とコントロール試薬の使用

◆ システムの各バッチは、当社の品質管理部でCDP-Star 化学発光検出試薬を用いたサザンブロットで、120 ngの

ヒトゲノムDNAから60 fgの単一コピーの遺伝子を検出できることを確認しています。

◆ ECF化学蛍光基質を使用した場合は、サザンブロットで、500 ngのヒトゲノムDNAから250 fgの単一コピーの遺

伝子を検出できることを確認しています。

◆ 標識システムの機能は、添付されているコントロールλDNAをプローブの鋳型として用いて確認することができ

ます。

プローブの保存

◆ 標識済みのプローブはすぐに使用してください（2時間以内であれば氷上で放置できます）。長期保存する場合は、

等量のグリセロール（標準の標識反応では32 µl）を加えて-30～ -15 ℃で保存してください。凍結融解をできるだ

け避けるよう、適量に小分けして保存することをおすすめします。5回以上の凍結融解で、プローブの効率は急激

に低下します。グリセロール溶液状態で-30～ -15 ℃で保存したプローブは、そのままハイブリダイゼーション

バッファーに加えて使用することができます。特別な前処理は必要ありません。


21AlkPhos Direct

ブロットのリプロービング

◆ 検出に使用したブロットは2～3回リプローブすることができますが、2回目以降のハイブリダイゼーションではシ

グナルが低下します。2回目以降のハイブリダイゼーションを行う時には、以下のプロトコールにしたがって以前

のプローブを剥がしてください。ECF substrateを用いて検出を行った場合はステップ1から、CDP-Starを用いて

検出を行った場合はステップ2から行ってください。

1.アルコール（≧99 %エタノール）中、室温で振盪しながらインキュベート（1 ml/cm2、10分×2回）

2.0.5 %SDS（w/v）溶液中、60 ℃で60分間インキュベート

3.100 mM Tris（pH 8.0）バッファー中、室温で5分間リンス

◆ リプロービングするブロットは乾かないようにサランラップなどに包み、2～8 ℃で保存してください。また、リ

プロービングできる回数はブロットの物理的損傷の度合いによりますので、ブロットは常に慎重に取り扱ってくだ

さい。ノーザンブロットの場合、サザンブロットと比べて固定後のRNAがブロットから剥がれやすい傾向がある

ため、リプロービング後にシグナルが顕著に低下することがあります。



22 AlkPhos Direct

ベクターからのインサートDNA切出しインサートDNAの精製後、効率的な標識を行うには正確なDNA濃度を決定する必要があります。分光光度計とアガ

ロースゲル電気泳動によってDNA濃度を見積もってください。下記にその代表的な方法を記載します。

GFX（ガラス繊維マトリクス）法― GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（27-9602-01）―

インサートを含むベクターを適当な制限酵素で消化し、エチジウムブロマイドを含む1 %アガロースゲル電気泳動

を行います。目的のバンドを切り出し、キット付属のキャプチャーバッファーを入れた1.5 mlチューブに移します。

65 ℃で10分程度加熱し、ゲルを融解させます。得られた溶液をGFXカラムに添加し、遠心します。その後、洗浄バッ

ファーで洗浄後、適量の低イオン強度のバッファー（TEバッファーなど）で溶出します。この方法では、わずか15

分で100 bp～10 kbのフラグメントが60～80 %の回収率で得られます。

DEAE-セルロース紙法

インサートを含むベクターを適当な制限酵素で消化し、エチジウムブロマイドを含む1 %アガロースゲルで電気泳

動を行います。目的のバンドの上下に切れ込みを入れ、DEAE-セルロース紙をゲルの底まで完全に差し込みます。

再び電気泳動を行い、目的のバンドをDEAE-セルロース紙に捕らえます。DNAを含まない余白を切り取って、冷

やした蒸留水で洗浄します（5～10分）。タオルドライした後1.5 mlチューブに移し、300～700 mlのエクストラ

クションバッファー（下記）を加えます。ボルテックスをかけて、DEAE-セルロース紙を千切りにします。

振盪しながら37 ℃で2時間インキュベートします。24時間以内であれば、インキュベート前に2～8 ℃で保存するこ

ともできます。溶液を針で底に穴を開けた蓋なしの0.5 mlチューブに移します。このチューブを1.5 mlチューブには

め込んで5分間遠心します。さらに3分間遠心し、残存の繊維を沈殿させます。DNAを含む上清を3倍量の水飽和ブ

タノールで抽出します。2倍量のエタノールを加え、-15～-30 ℃で1時間～一晩放置しDNAを沈殿させます。遠心し

て得たDNAのペレットを70 %エタノールでリンスした後、適量の蒸留水に溶かします。この方法では、2 kb以下のフ

ラグメントが～80 %の回収率が得られます。

DEAEセルロース紙の調製： DEAE-セルロース紙（Whatman-DE81等）をゲルの高さと同じで

切れ込みの幅より少し大き目に切ります。2.5 mM NaCl溶液に数時

間浸します。蒸留水で数回ウォッシュし1 mM EDTA（pH 8.0）溶液

中、2～8 ℃で保存します。

エクストラクションバッファー（pH 8.0）: 1.5 M NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl

エレクトロエリューション法

インサートを含むベクターを適当な制限酵素で消化し、エチジウムブロマイドを含む1 %アガロースゲルで電気泳動

を行います。目的のバンドを切り出し泳動に使用したバッファーを入れた透析チューブに移します。余分なバッファー

をできるだけ除いて封をし、泳動漕にチューブを電極と平行に浸して電流をかけ、DNAを溶出させます（100 V、2時

間）。電流を逆方向にかけて（2分間）、透析チューブの内壁に付着したDNAを剥します。パスツールピペットを使

って溶出したDNAを1.5 mlチューブに回収します。2倍量のエタノールを加え、-15～-30 ℃で1時間～一晩放置し

DNAを沈殿させます。遠心して得たDNAのペレットを70 %エタノールでリンスした後、適量の蒸留水に溶かしま

す。この方法では、2 kb以下のフラグメントの場合、80 %以上の回収率が得られます。



23AlkPhos Direct

標識に必要なDNAの長さは？◆ 最低50 bp以上、最適な感度を得るには300 bp以上必要です。Oligo DNAの標識も可能です。この場合、標識反応2時

間、ハイブリダイゼーション温度42 ℃が推奨条件です。標識効率は個々のOligo DNAの構造に依存しますので、

Oligo DNAの標識効率は必ずしも保証できません。

RNAは標識できますか？◆ できます。この場合も、DNA用のプロトコールと同様にRNAの二次構造を壊すための変性のステップが必要にな

ります。

大量に標識できますか？◆ できます。それぞれの試薬量をスケールに合わせて大きくするだけで、プロトコールは全く同様です。反応時間を

長くする必要はありません。

100 ng以下のDNAを標識できますか？◆ できます。ただし感度は落ちます。

DNA濃度が10 ng/µl以下の溶液（10 µl）を用いた場合‥‥全DNA が20 ng以上あれば何らかのシグナルはえられま

す。感度の低下はフィルムに長時間感光させることで最小限に抑えられます。

DNA濃度が10 ng/µlの溶液（10 µl以下）を用いた場合‥‥DNA溶液の量に合わせて標識反応のスケールを小さく

してください。ハイブリダイゼーション時のプローブ濃度が十分であれば感度は維持できます。

プレハイブリダイゼーションのステップは省けますか？◆ 省けます。弊社で行った実験では、プレハイブリダイゼーションのステップの有無に関わらず同様な結果が得られ

ています。ただし、これはHybond N+メンブレンにフレッシュにブロットしたものを使用した最適条件下で得ら

れた結果です。

◆ 通常は、プローブを加える前に、メンブレンを完全に平衡化しプローブの非特異吸着を抑えるために、プレハイブ

リダイゼーションのステップを挟んでください。

他のハイブリダイゼーションバッファーは使えますか？◆ 使えません。AlkPhos DirectのHybridization bufferはこのシステムに合わせて至適化されています。他の標準的な

間接法を用いたシステムのバッファーでは良好な結果は得られません。

◆ 誤ってECL Gold Hybridization Bufferを使用した場合、時には良好な結果が得られるかもしれません。しかしなが

ら、多くの場合はゴールドバッファーに含まれる高濃度のureaが、AlkPhos Directにとっては高ストリンジェン

シーとなるため、シグナルの低下をもたらし良い結果は得られません。

プローブは再使用できますか？◆ 通常できますが、プローブの塩基配列に依存します。

◆ 標識したプローブを含むハイブリダイゼーションバッファーは、必ずしも全てのプローブが凍結融解に耐えられな

いので、2～8 ℃で保存してください。

◆ この場合、2回目以降のハイブリダイゼーションでは、プローブの分解や消費によっていくらか感度が低くなりま

す。3回以上の再使用はおすすめしません。

QUESTIONS & ANSWERS


24 AlkPhos Direct

ストリンジェンシーをコントロールする最も良い方法は？◆ ストリンジェンシーをコントロールする最良の方法は、ハイブリダイゼーション温度を変えることです。使用する

プローブによって、50～75 ℃の間で自由に設定できます。

◆ はじめて使うプローブは55 ℃で行い、バックグラウンドが高い場合にはさらに温度を上げて試してみるのが良い

でしょう。

◆ 洗浄温度は、65 ℃以下であれば、通常、ハイブリダイゼーション温度と同じにしますが、ストリンジェンシーを

調節するために変えることもできます。

なぜ65 ℃以上で洗浄をしてはいけないのですか？◆ 65 ℃以上での洗浄は、ブロットを剥がしてしまってシグナルが弱くなることがあります。

◆ 高温により洗浄バッファー中のマグネシウムが沈殿し、ブロット表面が粒状になってしまうことがあります。

再洗浄を行うことによってストリンジェンシーをあげることができますか？◆ どちらともいえません。一度検出を行った後、さらに高温で洗浄することによってストリンジェンシーをあげるこ

とができる場合もあります。

CDP-Star溶液中でどれくらいインキュベートしてもバックグラウンドは上がらない？◆ 推奨するイキュベート時間は2～5分です。15分以内であればバックグラウンドはそれ程高くなりませんが、多数

のブロットを処理しなければならないようなハイスループットアプリケーションを行う場合でない限りおすすめし

ません。

CDP-Star溶液は再使用できますか？◆ 試薬を節約するために、複数のブロットを1つのCDP-Star溶液で検出することはできますが、少なくとも4ブロッ

トの検出を行うと感度は低下します。

◆ 一度使用したCDP-Star溶液は2～8 ℃で1週間保存できますが、再使用した場合には感度が低下します。

ブロットが乾いてしまった！

＊いずれの場合も状況によりバックグラウンドが上がる可能性がありますので、ブロットの乾燥は極力さけてください。

ケース1. ハイブリダイゼーション後、洗浄前

通常どおり洗浄を続けてください。バックグラウンドが上がることはありません。

ケース2. 洗浄後、検出前

検出試薬を加える前にブロットを乾かしてしまった場合には、バックグラウンドが高くなるかもしれません。

ケース3. 検出後

続けて検出することができます。一度CDP-Star溶液を加えれば、バックグラウンドの上昇は通常問題ありません。

ケース4. ストリッピング前

完全に乾いてしまっても、バックグラウンドを上昇させることなく、ブロットを剥して再検出することができます。

QUESTIONS & ANSWERS


25AlkPhos Direct

バックグラウンドが高い

◆架橋剤の濃度が高すぎる

○ キットに含まれるCross-linker solutionはプローブの標識反応に使用する前に、必ず5倍に希釈してください。

◆標識反応を30分以上行った

○ 標識反応時間が長すぎると過剰に架橋され、バックグラウンドの上昇を招きます。

◆プローブ濃度が高すぎる

○ 多くの場合プローブ濃度は5～10 ng/mlが最適です。

○ ターゲットDNAの量がかなり多い場合（高コピー数のプラークやコロニーをスクリーニングする場合）はこの濃

度を下げた方が良いこともあります。

◆ハイブリダイゼーション温度が低すぎる

○ ハイブリダイゼーション温度が低すぎると、ストリンジェンシーが低くなります。

○ この温度はそれぞれのプローブの塩基配列によって至適化する必要がありますが、ほとんどの場合55 ℃で満足の

いく結果が得られます。

○ 良好な結果が得られない場合には、ハイブリダイゼーション温度は75 ℃まで上げることができますが、洗浄温度

は65 ℃以下にしなければなりません。

◆ハイブリダイゼーション時間が長すぎる

○ ほとんどの場合、ハイブリダイゼーション時間はオーバーナイトを推奨していますが、ターゲットDNAの量がか

なり多い場合（プラークやコロニーをブロッティングする場合）は2～4時間が推奨されます。

◆ CDP-Star 検出試薬に微生物のコンタミネーションが起きている

○ 使用前にストック溶液から適量を滅菌した容器に分注し、別々に保存しておくことをおすすめします。

◆過剰な検出試薬ブロット表面に残っていた

○ 検出試薬が十分に除かれていない場合、過剰のCDP-Star がフィルム表面に漏れてバックグラウンドが高くなること

があります。ブロットはバッグかサランラップで封をして、フィルムは乾いた状態にしておいてください。

◆フィルムへの感光時間が長すぎる

○ フィルムへの感光時間が長すぎると、バックグラウンドが高くなりシグナルが不明瞭になります。バックグラウン

ドが高くても短い感光時間であれば通常何らかの特異的なシグナルが現れます。

スポット状のバックグラウンドがでる

◆洗浄バッファーに微生物のコンタミネーションが起きている

○ 微生物もこのシステムで検出される量のアルカリホスファターゼを持っています。この影響はブロット上にスポッ

トとして現れます。GLPの基準を満たしている実験室であればこの影響は最小限に抑えられるでしょう。

洗浄バッファーを2～8 ℃で保存し、加熱前に分注しておいてください。

◆ハイブリダイゼーション、洗浄に用いた容器が汚れている

○ コンタミネーションは高いバックグラウンドの原因になりますので機器はきれいなものをお使いください。

◆ CDP-Star試薬に沈殿が生じている

○室温に戻して十分に撹拌後、マイクロスピンカラムなどで沈殿をろ過除去してから使用してください。

TROUBLESHOOTING


26 AlkPhos Direct

パッチ状のバックグラウンドがでる

◆メンブレンが破損している

○ メンブレンは乱暴に扱うと最終的なイメージに跡が残ることがありますので、破損しないように慎重に扱ってくだ

さい。

◆ハイブリダイゼーションバッファー量が不十分

○ ハイブリダイゼーションバッファーはメンブレン1 cm2当たり0.25 ml必要です。プラスチックバッグもしくはボト

ルで大きなブロットをハイブリダイズさせる場合には、1 cm2当たり0.125 mlまでバッファー量を減らすことがで

きます。

○ メンブレンが完全にバッファーに浸っていないと、ブロットの一部分でプローブ濃度が低下して、最悪の場合メン

ブレンが乾いてしまってバックグラウンドが高くなります。

◆洗浄バッファー量が不十分、ブロットがお互いに接触した

○ 洗浄バッファーはメンブレン1 cm2当たり2～5 ml必要です。未結合のプローブが残存していると、バックグラウ

ンド上昇の原因になります。

◆ブロットが乾燥した

○ ブロットは乾かないよう気をつけてください。バックグラウンドの上昇を招きます。

◆ハイブリダイゼーションボトル内でハイブリダイゼーションを行って、ボトルとメンブレン接触面に

気泡が入った

○ 気泡はハイブリダイゼーションバッファーとプローブがメンブレン表面に行き渡るのを妨げますので、最終的な結

果にパッチ状の跡が残る原因になります。

シグナルが弱い◆標識に用いたDNA濃度が低すぎる（10 ng/µl以下）

◆ DNA溶液中の塩濃度が高すぎる

◆クロスリンカー溶液が古すぎる

○ 希釈後のクロスリンカー溶液は不安定です、2～8 ℃で保存し、希釈後1週間以内に使用してください。

◆ 2 µl以下の標識試薬を使った

○ ピペッターが正確かどうか確認してください。

◆標識反応時間が20分以下だった

○ 最高の感度が得られるプローブ標識反応条件は、37 ℃で20～30分のインキュベートです。

◆プローブ濃度が低すぎる

○ ほとんどの場合プローブ濃度は5～10 ng/mlが最適です。

◆標識プローブを使用前に変性させた

○ 間接標識法と違って、AlkPhos Directの標識プローブは使用前に熱変性させると、酵素に不可逆的なダメージを与

えてしまうので、変性させないでください。


27AlkPhos Direct

◆ハイブリダイゼーション温度が高すぎる

○ ハイブリダイゼーション温度と一次洗浄温度を調節することによって、ストリンジェンシーがコントロールされま

す。この温度が共に高い場合には、プローブの塩基配列によりますが、ストリンジェンシーが高くなり過ぎます。

○ 洗浄温度には使用したハイブリダイゼーション温度を用いるのが一般的です。ただし洗浄温度が65 ℃以上の場合

はシグナル強度の低下につながります。

◆ハイブリダイゼーション時間が短すぎる

○ ほとんどの場合、ハイブリダイゼーション時間は一晩を推奨しています。ターゲットDNAの量がかなり多い場合

（プラークやコロニーをブロッティングする場合）のみ2～4時間で完了することができます。

◆間違ったハイブリダイゼーションバッファーを使った

○ AlkPhos DirectのHybridization bufferはこのシステムに合わせて至適化されています。ECL Gold Hybridization

Bufferとは同じではなく、相互に入れ替えて使うことはできません。最良の結果を得るには、最適なバッファーを

使うことがとても重要です。誤ってECL Gold Hybridization Bufferを使用した場合、AlkPhos Directでは高ストリ

ンジェンシーになるため、良い結果は得られません。

◆フィルムへの感光時間が短すぎる

○ CDP-Star の発光は4時間後に最大になります。最適な感光時間を得るために数日間感光させることもできます。

◆ストリンジェンシーが高すぎる

○ ハイブリダイゼーション温度と一次洗浄温度を調節することによって、ストリンジェンシーをコントロールするこ

とができます。この温度が共に高い場合には、プローブの塩基配列によりますが、ストリンジェンシーが高くなり

過ぎます。洗浄温度には使用したハイブリダイゼーション温度を用いるのが一般的です。ただし洗浄温度が65 ℃

以上の場合はシグナルの低下につながります。

ストリンジェンシーが低い

◆ハイブリダイゼーション温度、一次洗浄温度が低すぎる

○ ハイブリダイゼーション温度と一次洗浄温度を調節することによって、ストリンジェンシーをコントロールするこ

とができます。これらの温度が共に低い場合には、プローブの塩基配列によりますが、ストリンジェンシーが低く

なり過ぎます。

◆ハイブリダイゼーションバッファー中の塩濃度が不適当

○ ハイブリダイゼーションバッファー中の塩濃度は0.5 Mが推奨条件です。プローブの塩基配列によりますが、0.25

～1.0 Mの間で変えることができます。この範囲を外れた場合には良い結果は得られません。

◆洗浄バッファー中のSDS濃度が不適当

○ 一次洗浄バッファーには0.1 %SDSが含まれています。

TROUBLESHOOTING


28 AlkPhos Direct


29ECL Direct

Hybridization bufferとBlocking reagentは15～25 ℃で、

そのほかのcomponentは2～8 ℃で保存してください。

このシステムは上記条件下で少なくとも3ヶ月間安定です。

Storageand

stability

ECL DirectDirect labelling of DNA probes with

horseradish peroxidase

for use in conjunction with Chemiluminescent

detection with ECL

RPN 3000

RPN 3001

ECLDirect_p29-55.qx 04.11.11 3:20 PM ページ29

30 ECL Direct

コンポーネント ................................................................................................................................................................... 31

安全に実験を行うために.............................................................................................................................................. 32

イントロダクション ........................................................................................................................................................ 33

実験に必要な試薬 ............................................................................................................................................................ 34

プロトコール実験を開始するにあたって....................................................................................................................................... 36

保存・安定性・輸送.................................................................................................................................................... 36

プロトコールサマリー ............................................................................................................................................... 37

Section A プローブの標識～シグナルの検出

Protocol 1：標識プローブの調製..................................................................................................................... 38

Protocol 2：ハイブリダイゼーションとブロットの洗浄......................................................................... 39

Protocol 3：シグナルの検出 ............................................................................................................................. 40

Protocol 4：ハイブリダイゼーションオーブンの使用 ............................................................................. 41

Section B サザンハイブリダイゼーション

Protocol 1：アガロースゲル電気泳動............................................................................................................ 43

Protocol 2：ブロット前のゲルの処理............................................................................................................ 44

Protocol 3：キャピラリーブロッティング ................................................................................................... 45

Protocol 4：トランスファー後のブロットの処理 ...................................................................................... 46

Section C ノーザンハイブリダイゼーション ..................................................................................................... 47

Section D コロニー／プラークハイブリダイゼーション ............................................................................... 48

システムのパフォーマンスを引き出すために品質管理.......................................................................................................................................................................... 50

ブロットのリプロービング....................................................................................................................................... 50

標識プローブの保存.................................................................................................................................................... 50

ベクターからのインサート切り出し ..................................................................................................................... 50

低融点アガロースゲルで分離したプローブの標識........................................................................................... 51

TROUBLESHOOTING .................................................................................................................................................. 52

ご注文情報 ............................................................................................................................................................................ 55

関連試薬／関連機器 ....................................................................................................................................................... 56

CONTENTS


31ECL Direct

Complete systems: Labelling systemとDetection reagentを組み合せたキットです。

ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection System

RPN3000 ECL Direct Labelling and Detection System (5 µg labelling and 2,000 cm2 membrane)

ECL Direct Labelling Module (5 µg labelling) RPN3005

ECL Ditection Reagents (for 2,000 cm2 membrane) RPN3004

RPN3001 ECL Direct Labelling and Detection System (10 µg labelling and 4,000 cm2 membrane)

ECL Direct Labelling Module (5 µg labelling) RPN3005×2

ECL Ditection Reagents (for 2,000 cm2 membrane) RPN3004×2

Refill Packs:

ECL Direct Labelling Module RPN3005

Labelling reagents for 5 µg nucleic acid and

Hybridization buffer for 2,000 cm2 membrane

ECL Detection Reagents

Detection Reagents (for 2,000 cm2 membrane) RPN3004

Detection Reagents (for 4,000 cm2 membrane) RPN2105

ECL Gold Hybridization Buffer (for 4,000 cm2 membrane) RPN3006

RPN3005 ECL Direct Labelling Moduleのコンポーネント

DNA labelling reagent 0.5 ml

Glutaraldehyde solution 0.5 ml

Water 1.0 ml

λ Hind III control DNA (10 µg/ml) 0.1 ml

ECL Gold Hybridization Buffer 500 ml

Blocking agent 25 g

RPN3004 ECL Detection Reagentsのコンポーネント

ECL detection reagent 1 125 ml

ECL detection reagent 2 125 ml

RPN2105はRPN3004のコンポーネントが倍量含まれているキットです。

RPN3006 ECL Gold Hybridization Bufferのコンポーネント

ECL Gold Hybridization Buffer 2×500 ml

Blocking agent 50 g

コンポーネント


32

この製品は、試験研究用製品ですので、人や動物への医療・臨床診断用としては使用できません。

このシステムにはグルタルアルデヒドが、Hybridization buffer中にはureaが含まれています。

このシステムのプロトコール中にはエチジウムブロマイドや水酸化ナトリウム、EDTAの使用が記載されています。これ

らの物質の取り扱いについては下記の記載をふまえ、各大学および研究所の該当する基準に従ってください。

グルタルアルデヒド有害性物質に相当。

エチジウムブロマイド有害性物質に該当。

水酸化ナトリウム腐食性物質に該当。

EDTA 有害性物質に該当。

◆ 化合物の持つ危険性について基本的な知識を持つ研究者以外は取り扱わないでください。

◆ 危険物質にはMaterial Safety data sheetsが添付されていますので、使用前に必ず一読してください。

◆ 実験中は適切な保護服を常に着用し、試薬が皮膚や眼球等に直接ふれたり、体内に入ることのないよう注意深く取り

扱ってください。もし、そのようなことが起きた場合は大量の水で洗浄するなどし、医師の指示に従ってください。

◆ 化合物同士の反応によって危険な副産物を生じることがありますので、注意深く実験を行ってください。

◆ プロトコール小冊子等で弊社から供給されていない試薬の使用を紹介している場合は、安全性に関する適切な情報を

各試薬の供給元へお問い合わせください。

◆ 製品の保管場所・方法については、第三者による不測の事故を防ぐために十分注意してください。

安全に実験を行うために


33ECL Direct

イントロダクション

ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection Systemは、化学発光増幅法（enhanced chemiluminescence; ECL、参

考文献1）に基づいた標識・検出システムです。

このシステムでは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase; HRP）をプローブDNAまたはRNAに直接標

識します（参考文献2）。プローブを完全に変性して一本鎖にすることによって、この標識反応が可能となります。＋に電

荷したポリマーと結合させたHRPをプローブに加えると、－に荷電したDNAと緩く結合します。このイオン結合は、カ

ウンターイオンの存在下で妨げられるので、プローブDNAは低塩濃度溶液中にあることが重要です。Glutaraldehydeの添

加により、架橋形成が促進され、その結果、プローブはHRPで共有結合的に標識されます。

標識したプローブはメンブレン上に固定した標的DNAまたはRNAとのハイブリダイゼーションに使用できます。標識反

応以降は、HRPを失活させないために、ハイブリダイゼーション溶液の温度が必ず42 ℃以下になるよう、注意を払うこ

とが重要です。本システムには至適化されたハイブリダイゼーションバッファーが添付されています。このバッファーは

ハイブリダイゼーション効率を確保し、ハイブリダイゼーション中のHRPを保護します。また感度を上げるために、バッ

ファー中にはエンハンサーが含まれています。バッファー組成には、6 M ureaが含まれており、これは、50 % ホルムア

ミドに相当し、ハイブリダイゼーションのTmを減少させます。従ってハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを

調節する場合、変更可能な唯一のパラメーターは塩濃度です。はじめてこのシステムを使用して実験を行う場合の至適値

は、本プロトコール中に記載してあります。

ハイブリダイゼーション後、未反応のプローブを除くためにメンブレンを洗浄しますが、この時も温度を42 ℃以下に保

つように注意してください。ストリンジェンシーは一次洗浄バッファーのureaあるいはSSC濃度を変えることで調節する

ことも可能です。ureaを添加しない場合、洗浄温度は最高55 ℃まで上げることが可能ですが、洗浄は20分×2回を超えな

いようにしてください。洗浄後はすぐにECL検出のステップにすすむことができます。ECL detection reagentには、2種

類のdetection reagentがありますが、これらは使用直前に混合しなければなりません。detection reagent 1は、ペルオキ

シダーゼの基質である過酸化水素を分解します。酵素による過酸化水素の還元は、detection reagent 2による発光反応と

カップリングします。detection reagent 2は、酸化すると青色光を発するルミノールを含んでいます。発光は、エンハン

サー存在化で増強、延長されるので、青色光に感光するフィルムで検出できます。ECL Directは、サザン（文献3、4）、

ノーザン（文献5）、コロニー/プラークハイブリダイゼーション（文献6）で使用することができます。

この小冊子には、ブロッティングから検出まで、ECL Directに関わる全てのステップのプロトコールが含まれています。

ECL Directは簡単で迅速な方法ですが、良い結果を得るためには、このプロトコールに従って操作を行うことが重要です。

37ページのプロトコールサマリーは、システムの操作に要する時間を概算する上で参考になるでしょう。しかしながら、

このシステムに慣れるまでは、本文に記載されたプロトコールに従って実験することをおすすめします。

参考文献

1) WHITEHEAD, T. P. et al., Nature 305, 158-159 (1983).

2) RENZ, M. and KURZ, C., Nucl. Acids Res. 12, 3435-3444 (1984).

3) HESLOP-HARRISON, J. S. et al., Heredity 65, 385-392 (1990).

4) BELLANNE-CHANTELOT, C. et al., Cell 70, 1059-1068 (1992).

5) EINSPANIER, R. et al., J. Reprod. Fert. 90, 439-445 (1990).

6) ABE, A. et al., J. Clinical Micro. 28, 2616-2620 (1990).


34 ECL Direct

50×TAE buffer

Tris (base) 2.0 M (242 g)

EDTA (disodium salt) 0.05 M (18.6 g)

氷酢酸でpHを8に調整し、1,000 mlにメスアップします。

使用時には50倍に希釈し、Tris acetate 0.04 M、EDTA 0.001 Mとします。

DNAサンプルのローディングバッファー

Bromophenol blue 0.05 g

Xylene cyanol 0.05 g

Glycerol 5.00 g

EDTA 0.186 g

TAE bufferで10 mlにメスアップします。

RNAサンプルのローディングバッファー

Formamide 0.72 ml

10×MOPS buffer 0.16 ml

Formaldehyde (37 %) 0.26 ml

水 0.18 ml

glycerol (80 %) 0.1 ml

Bromophenol blue（飽和溶液） 0.08 ml

-15～ -30 ℃で保存してください。

10×MOPS buffer

MOPS［3- (N-morpholino) propanesulphonic acid］ 0.2 M

酢酸ナトリウム 0.05 M

EDTA 0.01 M

脱プリン溶液

塩酸 250 mM

変性溶液

NaCl 1.5 M

NaOH 0.5 M

中和溶液

NaCl 1.5 M

Tris HCl 0.5 M

塩酸でpHを7.5に調整してください。

実験に必要な試薬

核酸の電気泳動・ブロッティング・ハイブリダイゼーション後の洗浄に必要なバッファー類で、キットに含まれていない

ものの一覧です。分析グレードの試薬と2回蒸留水を使用することをおすすめします。


35ECL Direct

20×SSC

Na3 citrate 0.3 M

NaCl 3 M

pHを7.0に調整してください。

一次洗浄バッファー（urea入り）：通常はこのバッファーを使用

urea 6M (360 g)

SDS 0.4 % (4 g)

20×SSC 0.5×SSC (25 ml)

蒸留水で1,000 mlにメスアップします。2～8 ℃で3ヶ月まで保存可能です。SSCの終濃度を下げることで（例えば

0.5×SSCのかわりに0.1×SSC）、ストリンジェンシーを上げることができます。

一次洗浄バッファー（urea抜き）：高温（～55 ℃）での洗浄を行う場合使用

SDS 0.4 % (4 g)

20×SSC 0.5×SSC (25 ml)

蒸留水で1,000 mlにメスアップします。2～8 ℃で3ヶ月まで保存可能です。SSCの終濃度を下げることで（例えば

0.5×SSCのかわりに0.1×SSC）、ストリンジェンシーを上げることができます。

二次洗浄バッファー

20×SSC 2×SSC (100 ml)

蒸留水で1,000 mlにメスアップします。2～8 ℃で3ヶ月まで保存可能です。


36 ECL Direct

実験を開始するにあたって

実験を開始する前に、プロトコール全体を通読してください。キャピラリーあるいはサザンハイブリダイゼーショ

ンについてはSection B（43ページ）に、ノーザンハイブリダイゼーションについてはSection C（47ページ）に、

コロニー／プラークハイブリダイゼーションについてはSection D（48ページ）に、それぞれ記載しています。標識

反応を開始する前に、ハイブリダイゼーションバッファーを調製し、メンブレンのプレハイブリダイゼーションを

はじめておくとよいでしょう。

保存

● Hybridization bufferとBlocking agentは、室温（15～25 ℃）で保存できます。Blocking agentをHybridization

bufferに加えた場合は、すぐに使用するか、-30～ -15 ℃で保存し、3ヶ月以内に使用してください。

● その他の試薬は2～8 ℃で保存してください。酵素の入った標識試薬はグリセロールを含んでいませんので、凍結

させないでください。1～2回の凍結融解でも分解が起こり感度の低下をもたらす原因になります。

安定性

● キットに含まれる試薬類は、上記の推奨保存条件で保存した場合、3ヶ月は安定です。

● 標識プローブを長期保存する場合は、グリセロールで希釈し（終濃度50 %）、-15～ -30 ℃で保存（6ヶ月以内）し

てください。この条件で保存したプローブは比較的安定ですが、使用期限はプローブの塩基配列に依存します。

輸送

● キットに含まれる試薬類は、不凍アイスパックを入れたポリスチレン製の容器に梱包して輸送されています。標識

試薬中の酵素の活性に影響を与えるため、凍結は避けてください。

プロトコール


37

核酸ブロットの調製

ハイブリダイゼーションバッファーの調製

バッファーを攪拌しながら、塩とBlocking agentを少量ずつ添加し完全に溶解する（1.5～2時間）

ブロットのプレハイブリダイゼーション

42 ℃、15～60分間


変性操作10分間

標識反応10分間


42 ℃、数時間（コロニースクリーニングなど、高コピーターゲットを検出する場合）

42 ℃、一晩（シングルコピー遺伝子の検出など、高感度検出を要する場合）

ブロットの洗浄

一次洗浄バッファーでウォッシュ、20分間×2回

二次洗浄バッファーでリンス、5分間×2回

検出

検出試薬中でのインキュベーション、1分間

Hyperfilm ECLへの露光、数分間～2時間

プロトコールサマリー


38 ECL Direct

プロトコール1. 標識するDNA（RNA）をキット付属の水で10 ng/µlになるよ

うに希釈します。

2. 100 ngのDNA（RNA）サンプル（10 µl）を取り、沸騰水中

で5分間熱変性します。

3. サンプルを氷中で5分間急冷後、スピンダウンしてマイクロ

チューブの底に集めます。

4. 熱変性したサンプルに10 µlのDNA labelling reagentを加え、

穏やかに完全に混和します。

5. Labelling reagentと等量（10 µl）のglutaraldehyde solution

を加え、完全に混和します。かるくスピンダウンして溶液を

マイクロチューブの底に集めます。

6. 37 ℃で、10分間インキュベートします。

7. 作製したプローブはただちに使用するか、氷中に保存し、10

～15分以内に使用してください。

注意事項DNA（RNA）サンプル中の塩濃度は10 mMを超えないように

してください。Hind IIIコントロールDNAはすぐ使用できるよ

う濃度調整（100 ng/10 µl）されています。

標識するDNA（RNA）の最小量は100 ng/10 µlです。これより多

い量を標識する場合は、DNA濃度が約10 ng/µlから外れないよ

うにしてください。完全に熱変性させるために、ヒートブロック

ではなく激しく沸騰したウォーターバスを使用してください。

標識効率を高めるためには、DNAを一本鎖に保っておくこと

が重要です。RNAの場合も二次構造を破壊するために熱変性

を行うことをおすすめします。

サンプルDNA（RNA）と等量のlabelling reagentを加えてくだ

さい。例えば、10 µl中の100 ngのDNAには10 µlのlabelling

reagentが必要です。

例えば、10 µlのDNA（RNA）溶液（10 ng/µl）に10 µlの

labelling reagentを加えたサンプルには10 µlのglutaraldehyde

solutionが必要です。

DNA : labelling reagent : glutaraldehyde solutionの比を適正に

保つことで高い標識効率が得られます。この比を変更すると、

バックグラウンドが上昇し、かつ感度が低下します。

標識するDNA（RNA）が300 bp未満の場合は、インキュベート

の時間を20分まで延長することで標識効率が上昇することがあ

ります。

標識したプローブは、終濃度50 %となるようにグリセロール

を添加し、-30～ -15 ℃で最長6ヶ月間保存することができます。

このプローブを使用する際には、特に前処理は必要ありません。

Protocol 1：標識プローブの調製以下に100 ngのプローブDNAを標識するプロトコールを記載します。しかしながら、ハイブリダイゼーションに要する

プローブDNAの量は、ブロットの大きさ・標的DNAの量・標的DNAに対する標識DNA配列の割合などにより変動します。

実際は、ブロットの大きさによりハイブリダイゼーションの液量が決まり（Section A/Protocol 2、39ページ参照）標的

とプローブの配列によりプローブ濃度が決まります。通常のアプリケーションではプローブ濃度10 ng/mlが適正といえま

すが、標的DNA量が多い場合（プラークあるいはコロニーのスクリーニング）ではプローブ量を減少させた方が良い場合

があります（Section D、48ページ参照）。

ベクターに組み込まれたクローン全体よりも、インサートのみを切り出してプローブとした場合の方がシグナル：ノイズ

比が向上することが多いようです。ベクターからのインサート切り出し・低融点アガロースゲル中の標識法については50

ページに記載しています。本システムでは50 bp以上の核酸であれば標識することができますが、シングルコピー遺伝子

の検出には300 bp以上のプローブを使用することをおすすめします。

プローブの標識～シグナルの検出Section A


39ECL Direct

プロトコール1. ハイブリダイゼーションバッファーを調製します：

※バッファーをマグネティックスターラーで攪拌しながら、試薬は少量ず

つ添加してください

室温で必要量のハイブリダイゼーションバッファーをとり、

実験系にあった濃度になるようにNaCl（分析グレード）を、

終濃度5 %（w/v）となるようにBlocking agentを添加します。

Blocking agentが完全に溶解するまで1時間攪拌した後、時折

攪拌しながら42 ℃で0.5～1時間加熱します。

2. 42 ℃のハイブリダイゼーションバッファー中にブロットを

入れ、最低15分間、穏やかに振盪しながらプレハイブリダイ

ゼーションを行います。弊社ラボではこのステップは通常1

時間です。

3. プレハイブリダイゼーション後、標識プローブを添加します。

プローブがブロットに直接かからないように注意し、よく攪

拌してください。バッファーの一部をとり、プローブと混和

して戻すとよいでしょう。穏やかに振盪しながら42 ℃で一

晩ハイブリダイゼーションを行います。

4. 一次洗浄バッファー（35ページ参照）を42 ℃に温めておきま

す。必要なバッファー量は1 cm2あたり2～5 mlです。ブロッ

トを浸し、温度が42 ℃を超えないよう注意しながら20分間

穏やかに振盪します。

5. 新しい一次洗浄バッファーを使用して再び42 ℃で20分間洗

浄を行います。

6. きれいな容器にブロットを移し替えて二次洗浄バッファー

（35ページ参照）を加え、室温で5分間穏やかに振盪します。

7. 新しい二次洗浄バッファーを使用して再び室温で5分間穏や

かに振盪します。

注意事項100 cm2以下のブロットには1 cm2あたり0.25 mlを、それ以上

のサイズのブロットには1 cm2あたり0.125 mlのハイブリダイ

ゼーションバッファーを使用します。

NaCl濃度の至適値は、使用するプローブにより異なります。

通常は0.5 Mが無難です。

必要量以上のバッファーを調製した場合は、少量ずつ滅菌した

チューブに分注し、-30～-15 ℃で3ヶ月まで保存することがで

きます。

容器に十分な量のバッファーがあれば、プラスチックバッグや

タッパーウェアなどの容器を使用することができます。使用す

るブロットのサイズや枚数に合わせて、バッファー量を調節し

てください。バッファーがブロット上に十分に行き渡り、ブロ

ットが自由に移動できることが非常に重要です。バッファー量

が少ない場合にはバックグラウンドが上昇することがありま

す。バッファーでブロットを完全に飽和させ、気泡が入らない

ようにしてください。複数のブロットを1つの容器で処理する

場合にはこれらの点が特に重要です。

ハイブリダイゼーション温度が42 ℃を超えないことが重要で

す。これより高い温度では、標識プローブ中の酵素が失活します。

ハイブリダイゼーション時間を短縮することもできます。高コ

ピーの標的を検出する場合（コロニーやプラークハイブリダイ

ゼーション：Section D、48ページ参照）では、1～4時間をお

すすめします。高感度を要するアプリケーション（シングルコ

ピー遺伝子の検出など）では感度の低下につながりますので、

ハイブリダイゼーションは一晩行ってください。

一次洗浄の時間は各回とも20分を超えないようにしてください。

urea抜きの一次洗浄バッファーを使用することもできます。

バッファーは55 ℃に温めておきます。HRPの活性への影響を

最小限に抑えるため、合計の洗浄時間は20分を超えないように

してください。55 ℃で20分以上洗浄すると、感度が顕著に低

下します。

urea入り・抜きどちらの一次洗浄バッファーにおいても、SSC

濃度によりストリンジェンシーを調節できます。0.5×SSCは

低ストリンジェンシー、0.1×SSCは高ストリンジェンシーと

なります（35ページ参照）。複数のブロットでも、バッファー

中を互いに自由に移動できれば、1つの容器内で洗浄すること

ができます。

ブロットは二次洗浄バッファー中、室温で30分までは放置する

ことができます。ハイブリダイゼーション後のブロットは二次

洗浄バッファーで湿らせ、サランラップで包んで2～8 ℃で一

晩保存できます。ブロットが乾かないようにしてください。

Protocol 2.1：ハイブリダイゼーションとブロットの洗浄以下のプロトコールにより、大多数のプローブについて、非特異配列へのクロスハイブリダイゼーションをほとんど生じ

ることなく、哺乳動物のシングルコピー遺伝子を検出することができます。


40 ECL Direct

プロトコール1. ハイブリダイゼーションバッファー（Section A/Protocol 2の

1、39ページ参照）をあらかじめ42 ℃に温めておきます。

2. 適当な容器内で、5×SSC（75 mM Na3 citrate、0.75 M

NaCl、pH 7.0）にてブロットをプレウェットします。ブロッ

トをゆったりと丸めてハイブリダイゼーションボトル内に入

れます。少量の5×SSCを加え、メンブレンとボトルの内壁と

の間に気泡が入らないよう注意しながらブロットを‘巻き戻

し’ます。ブロット自身が重なり合わないようにも注意して

ください。

3. 5×SSCを捨て、適当量のハイブリダイゼーションバッファー

を添加してください。

4. ハイブリダイゼーションオーブン内で、42 ℃、最低15分間

プレハイブリダイゼーションを行います。

5. 標識プローブを調製します（Section A/Protocol 1、38ペー

ジ参照）。

6. プレハイブリダイゼーション後、標識プローブを添加します。

プローブがブロットに直接かからないようにしてください。

オーブン内で回転させながら42 ℃で一晩ハイブリダイゼー

ションを行います。

7. 適当量の一次洗浄バッファーを42 ℃に温めておきます。

8. ハイブリダイゼーションバッファーを捨て、50～100 mlの

5×SSCを添加して再びオーブン内で5分間回転させます。

注意事項

ハイブリダイゼーションボトルとメンブレンとの間の気泡を完

全に排除することが重要です。気泡は、黒いパッチ（斑点）状の

バックグラウンドの原因となります。ブロットがどうしても重

なる場合は、ナイロンメッシュを使用してください。2枚のナ

イロンメッシュでブロットをはさみ、気泡が入らないよう注意

しながら、ブロット面がボトルの中心方向を向くように丸めて

ください。オーブン内での回転で‘巻き戻される’向きにボトル

内に入れてください。

ナイロンメッシュは再利用できます。再利用する場合は1 %

SDSで洗浄し、蒸留水で十分にすすいでください。

バッファー量はブロット1 cm2あたり0.0625～0.125 mlを推奨

します。実際の使用量はボトルのサイズにより決まります。径

が4 cm、長さ30 cmのボトルなら最少バッファー量は20 mlとな

ります。一般的には、ラジオアイソトープを用いた標準的な手

法より多くのバッファー量が必要です。ハイブリダイゼーショ

ンバッファーの量が不十分だと、バックグラウンドが高くなり

ます。

urea抜きの一次洗浄バッファーを使用することもできます。

バッファーは55 ℃に温めておきます。

urea抜きの一次洗浄バッファーで洗浄を行う場合は、ハイブリ

ダイゼーションオーブン内の温度を55 ℃に上げておきます。

装置の性能にもよりますが、55 ℃まで温度を上げるのに5～10

分かかります。

Protocol 2.2：ハイブリダイゼーションとブロットの洗浄〈ハイブリダイゼーションオーブンを使用する場合〉

核酸のハイブリダイゼーションと洗浄は、回転式のインキュベーターやハイブリダイゼーションオーブンで行うと便利で

す。これらの装置ではバッファーが常にブロット上を移動し、必要な液量が最少で済みますので、プローブの節約になり

ます。以下に、ハイブリダイゼーションオーブンの一般的な使用方法を記します。使用する装置や実験方法に合わせて変

更してください。


41ECL Direct

9. 5×SSCを捨て、ハイブリダイゼーションチューブの約1/3容

の一次洗浄バッファーを添加します。オーブン内に戻し、ブ

ロットを42 ℃で20分間洗浄します。

10.新しい一次洗浄バッファーと交換し、42 ℃で10分間洗浄し

ます。このステップをもう一度繰り返します。

11.ブロットをハイブリダイゼーションボトルからとりだし、適

当な容器にいれて十分量の二次洗浄バッファーを添加しま

す。穏やかに振盪しながら室温で5分間洗浄します。

12.同量の新しい二次洗浄バッファーと交換し、穏やかに振盪し

ながら室温で5分間洗浄します。

urea抜きの一次洗浄バッファーを使用する場合、55 ℃でまず

10分間、続いて5分間で2回洗浄してください。一次洗浄の合

計時間は20分を超えないようにご注意ください。

ストリンジェンシーはSSCの濃度を調節することによって変更

できます（Section A/Protocol 2、39ページ参照）。

ブロットは二次洗浄バッファー中、室温で30分までは放置する

ことができます。ハイブリダイゼーション後のブロットは二次

洗浄バッファーで湿らせ、サランラップで包んで2～8 ℃で一

晩保存できます。ブロットが乾かないようにしてください。



42 ECL Direct

プロトコール1. detection reagent 1とdetection reagent 2を等量混合し、ブ

ロットを十分覆う量の検出試薬を調製します。ブロット1 cm2

あたり0.125 mlが推奨量です。

2. ブロット上の余分な二次洗浄バッファーを除き、サランラッ

プ等のシートの上にDNAがブロットされている面を上にして

置きます。検出試薬をブロット上に直接添加します。ブロッ

トは乾かないようにしてください。

3. 室温で1分間インキュベートします。

4. ブロットの角を持って余分な検出試薬を取り除き、気泡が入

らないようにサランラップで包みます。

5. ブロットを、サンプル面が上になるようにフィルムカセット

の中に置きます。基質中でのインキュベートとフィルムへの

露光（次項）との時間的間隔を最小限に抑えるため、操作は

できるかぎり迅速に行ってください。

6. ライトを消し、X線フィルム（Hyperfilm ECLなど）をブロッ

トの上に置きます。カセットを閉じ、30秒間露光します。

7. フィルムを取りだし現像します。結果を見て次のフィルムを

適当な時間露光します。

注意事項検出試薬は必要量のみを調製してください。混合後の検出試薬

を長期間保存することはできません。すぐに使用しない場合は、

氷上で30分程度なら保存可能です。reagent 1とreagent 2のク

ロスコンタミネーションに注意してください。

変法として、ブロットを半量（1 cm2あたり0.0625 ml）の

reagent 2に浸して平衡化した後、等量のreagent 1を添加して

穏やかに振盪する方法もあります。

余分な検出試薬は、ブロットのサンプル面を上にしてろ紙

（Hybond Blotting Paper, RPN6100Mなど）の吸水性の紙上に

数秒間置いても除くことができます。

フィルムカセット内に検出試薬が漏れていないことを確認して

ください。フィルムは決して濡らさないようにしてください。

このステップは暗室内・赤色の安全光下で操作します。露光中

のフィルムは動かさないでください。必要に応じてHyperfilm

ECLをプレフラッシュして使用することができます（Sensitize

プレフラッシュユニット、RPN2051を使用）。

ECL Directをはじめて使用し、低コピーのターゲットを検出す

る場合、露光時間は30分を推奨します。60～120分露光しても、

得られる像は30分の場合と同等となります。別法としては、1

～2分間露光して得られた像を目安とし、その後の露光時間を

決定する、という方法もあります。

コロニー・プラークハイブリダイゼーションの場合は、露光時

間を最小限に抑えることが重要です。陽性・偽陽性のシグナル

判別が容易になります。

Protocol 3：シグナルの検出操作をはじめる前にこの項を通読してください。ECLでは反応開始後すぐに発光が始まるため、最適な感度を得るために

は、ブロットにdetection reagentを添加した後、手際よく操作を行う必要があります。すべてのステップを暗室で行うこ

とは可能ですが、実際に明かりを消す必要があるのはステップ5以降です。

X線フィルムカセット、サランラップなどの密着性のフィルム、タイマー、青色光に感光するX線フィルム（Hyperfilm

ECLなど）が必要となります。手袋はパウダーフリーのものを着用してください。パウダーはECL反応を阻害し、フィル

ム上に斑点状のブランクを生じる原因となります。

以下のプロトコールで推奨している露光時間はサザンハイブリダイゼーションで哺乳動物のシングルコピー遺伝子を検出

する場合のものです。コロニー・プラークハイブリダイゼーションなど、高コピー数のターゲットを検出する場合は、露

光時間を短くすることができます。



43ECL Direct

プロトコール1. 1×TAE（34ページ参照）を用いて1 %アガロース溶液を作り

ます。

2. アガロースゲル溶液を50～60 ℃に冷まします。エチジウム

ブロマイドを添加して攪拌し、ゲル作製トレイに注ぎ込みま

す。コームを挿し、幅5 mmまでのウェルを作ります。気泡

が入らないよう注意してください。

3. ゲルを泳動装置にセットし、ゲル表面を覆うのに十分量の泳

動バッファーで満たします。

4. ゲルのウェルにDNAサンプルを添加します。マーカー用の

λDNAは、添加前に65 ℃で5分間熱変性し、cos末端を解離

させます。

5. 電流をかけます。ブロモフェノールブルーの移動度を目安に

して、サンプルを適当な距離泳動します。

注意事項アガロースを溶解するには、約90 ℃に加熱する必要がありま

す。低電気浸透度のアガロースを使用することをおすすめしま

す。分離したいDNA断片のサイズによって、0.8～2 %の幅で

アガロース濃度を調節します。

60 mlのアガロース溶液に対して1 µlのエチジウムブロマイド溶

液（10 mg/ml）を添加してください。溶液が皮膚に直接触れ

ないよう注意してください。

アガロースゲルの場合、1×TAEを泳動用バッファーとして使

用します。泳動用バッファーは新鮮なものを使用し、再使用は

しないでください。泳動槽とバッファーが汚れていると、シグ

ナル検出の際にブロットの上方に黒いバンドが生じることがあ

ります。

通常は、2～10 µgの制限酵素処理したゲノムDNAを添加すれ

ば十分です。キット添付のコントロールDNA（λHindIII

control DNA；10 µg/ml）は、ウェルあたり100 pg添加してく

ださい。DNAサンプルの希釈には1×TAEを用いることが可能

です。キシレンシアノールとブロモフェノールブルーを含む高

密度サンプルバッファー（34ページ参照）を用いて、サンプル

をウェルに沈めます。

例えば、20 cmのゲルに対し、電圧60 V・4～5時間の泳動でゲ

ノムDNAを分離することができます。オーバーナイトで泳動

する場合は、1 cmあたり1 Vの電圧をかけて泳動することをお

すすめします。

Protocol 1：アガロースゲル電気泳動

サザンハイブリダイゼーションSection B


44 ECL Direct

プロトコール1. ゲルを適当なプラスチック容器あるいはガラス／パイレック

ス容器に移します。

2. 新しい脱プリン溶液（34ページ参照）を注ぎ入れ、オービタ

ルシェイカーなどで振盪します。ゲルが容器に張り付かない

よう注意してください。ブロモフェノールブルーの青色が完

全に黄色に変わったら（10～12分）すぐに処理を終了してく

ださい。

3. 脱プリン溶液を捨て、ゲルを蒸留水ですすいでください。

4. 変性溶液（34ページ参照）を注ぎ入れて振盪を開始します。

ブロモフェノールブルーが青色に戻った後さらに25分間振盪

します。

5. 変性溶液を捨て、ゲルを蒸留水ですすいでください。

6a. Hybond-N+の場合：中和溶液（34ページ参照）を注ぎ入れ、

30分間振盪します。

6b. Hybond ECL（ニトロセルロースメンブレン）の場合：中和

溶液を注ぎ入れ、30分間振盪した後、新しい中和溶液に交換

してさらに15分間振盪を続けます。

注意事項ゲルにUVを照射して写真撮影し、サンプルとコントロール

DNAの泳動状態を確認してください。

20 cm×20 cmのゲルに対して400 ml程度を使用してください。

トランスファーするDNA断片のサイズが短い（10 kb未満）場

合は、このステップを行う必要はありません。

脱プリン溶液と同量の変性溶液を使用してください。

脱プリン溶液・変性溶液と同量の中和溶液を使用してくださ

い。ゲルの中和を行っている最中にキャピラリーブロッティン

グの準備をはじめるとよいでしょう。

Protocol 2：ブロット前のゲルの処理


45ECL Direct

プロトコール1. ガラス／パイレックス容器の一部を20×SSCで満たし、ゲル

をのせる支持台を作製します。支持台にはガラス板やゲル作

製トレイを用います。ろ紙（Hybond Blotting Paper、

RPN6100Mなど）3枚を20×SSCで飽和させ、支持台を覆い

ます。

2. ゲルをBlotting Paperの上に、気泡が入らないよう注意しな

がら置きます。SSCがペーパータオルに直接吸収されないよ

うに、サランラップなどでゲルの周囲を覆います。

3a. Hybond-N+の場合：メンブレンをゲルと同一サイズに切断

します。

3b. Hybond ECLの場合：メンブレンをゲルと同一サイズに切断

し、プレウェットを行います。蒸留水にさっと浸し、続いて

10×SSCに10分間浸してください。

4. 気泡が入らないよう注意しながら、メンブレンをゲルの上に

置きます。

5. Blotting Paper 3枚をゲルと同一サイズに切断し、10×SSCで

湿らせてからメンブレン上に置きます。ここでも気泡が入ら

ないよう注意してください。

6. Blotting Paperの上に厚さ5～6 cmになるようペーパータオル

を重ねてのせます。

7. ペーパータオルの上にガラス板を置き、重し（20 cm×20 cm

のゲルの場合は約750 g）をのせます。一晩（あるいは最低4

時間）放置します。

注意事項キャピラリーブロッティングの模式図を下に示します。重ねた

Blotting Paper上にラップをかぶせると、気泡を追い出す操作

が容易になります。ガラス棒かピペットを転がすと気泡がうま

く抜けます。以下の操作でも同様です。操作後、ラップは除い

てください。

メンブレンを素手で触って汚染させないよう注意してくださ

い。必ずパウダーフリーの手袋をして作業してください。

支持台を覆っているBlotting Paperにメンブレンが直接触れな

いようにしてください。

Protocol 3：キャピラリーブロッティング

Section B サザンハイブリダイゼーション

重し＜0.75 kg

ガラス板

吸収フィルター（ペーパータオルなど）

Blotting Paper

Hybond メンブレン

ゲル

ろ紙

ブロッティングバッファー


46 ECL Direct

プロトコール1. ペーパータオル・ろ紙を取除き、メンブレンとゲルを一緒に

取り出して、メンブレン側を下にしてきれいなろ紙の上に置

きます。ゲルを剥がして捨てます。メンブレンに印をつけて

DNAのブロットされている面がわかるようにしておきます。

2a. Hybond-N+の場合：メンブレンを6×SSCに浸して1分間穏

やかに振盪して付着したゲルを除きます。DNAの固定には

様々な変法がありますが、ECL検出にはベーキングかUVによ

る固定が推奨されます。

i) ベーキング（80 ℃、2時間）。ナイロンメンブレンの場合、

バキュームする必要はありません。

ii) UV固定。照射条件はトランスイルミネーターやクロスリ

ンカーなどの装置毎に至適化してください。

RNAブロットの固定にはベーキングをおすすめしますが、

UVによる固定も可能です。

2b. Hybond ECL（ニトロセルロースメンブレン）の場合：DNA

がブロットされている面を上にしてろ紙の上に置き、水分を

除きます。その後新たなろ紙上に置いて風乾します。

ブロットをきれいなろ紙で挟み、真空オーブン内でベーキン

グ（80 ℃、2時間）します。

注意事項芯の柔らかいグラファイトペンシルやチャイナグラフペンシル

が使用可能です。

固定化したブロットをすぐに使用しない場合は、乾燥してサラ

ンラップで包み2～8 ℃で、あるいは室温真空下で、数週間保

存できます。

温度は80 ℃を超えないようにしてください。ブロットをベー

キングしている間にプローブの標識とハイブリダイゼーション

の準備を行うとよいでしょう（Section A/Protocol 1～2、38ペー

ジ参照）。

固定化したブロットをすぐに使用しない場合は、乾燥状態で2

～8 ℃、あるいは真空下で保存できます。

Protocol 4: トランスファー後のブロット処理

この後、Section A/Protocol 1～3（38ページ参照）に従ってプローブ標識、ハイブリダイゼーション、シグナル検出を

行ってください。セクションAに記載されているプローブの濃度・バッファー量・検出時間は、サザンブロット・ノー

ザンブロットいずれの場合にも適用できます。

SectionB サザンハイブリダイゼーション


47ECL Direct

プロトコール1. ゲルの作製：以下に300 mlつくる場合を記します。

アガロース 3～4.5 g

10×MOPSバッファー 30 ml（34ページ参照）

水 219 ml

電子レンジで加熱してアガロースを溶解し、よく攪拌してか

ら50 ℃に冷まします。排気フード内でホルムアルデヒド

（37 % v/v）を16.2 ml添加して十分に混和します。続いてエ

チジウムブロマイド溶液（10 mg/ml）を20 µl加えよく振り

混ぜます。排気フード内でゲル作製トレイに注ぎ込みます。

2. RNAサンプルの調製：通常はトータルRNAを10～20 µg使用

します。発現量の多いmRNAを検出する場合はこれより少な

くできます。Poly (A)+ RNAを使用する場合は1～2 µgあるい

はそれ以下でも十分です。サンプル液量は5 µlとし、これに

RNA ローディングバッファー（34ページ参照）を15 µl添加

します。激しく沸騰したウォーターバス内で2分間熱変性し

ます。氷上で冷やし、ゲルに添加します。

3. 電気泳動：電気泳動バッファーには1×MOPSを使用します。

1 cmあたり5～7.5 Vの電圧をかけ、2～3時間、あるいはブ

ロモフェノールブルーがゲルの低分子側1/3程度まで移動す

るまで泳動します。泳動後は蛍光ものさしをあて、UV照射

下で写真撮影します。

4. トランスファー前のゲルの処理：ゲルを10×SSC中で10分

間×3回すすぎ、ゲルからホルムアルデヒドを除去します。容

器内でゲルが十分浸る量のバッファーを使用してください。

5. ブロッティング：Section B）サザンブロッティング中の

［Protocol 3. キャピラリーブロッティング（45ページ参照）］

および [Protocol 4. トランスファー後のブロットの処理（46

ページ参照）]の項に従ってトランスファーしてください。

ノーザンブロットに関する注意事項をよく読んでください。

6. プローブ標識・ハイブリダイゼーション・シグナルの検出：

Section A/Protocol 1～4（38ページ参照）に従って操作して

ください。

注意事項250 mlあれば4,000 cm2のゲルを作るのに十分です。厚いゲル

より薄いゲルの方が良い結果が得られます。

Section A/Protocol 1～4（38ページ参照）に記載されているプ

ローブの濃度・バッファー量・検出時間は、サザンブロット・

ノーザンブロットいずれの場合にも適用できます。

RNAを変性条件下で泳動します。Hybondメンブレンにはホルムアルデヒド／アガロースゲルの使用をおすすめします。

ノーザンハイブリダイゼーションSection C


以下のプロトコールは ECL Direct システムをコロニー／プラークハイブリダイゼーションに応用したものです。

ここで推奨するプローブ濃度、ハイブリダイゼーションの時間、フィルムへの露光時間などは、ガイドラインと

して使用できる一般的なものです。しかしながら実験系ごとに条件の至適化が必要になる場合もあります。

注意事項プロトコール

1. 培地へのプレーティングと培養

細菌あるいはバクテリオファージを常法に従って培

地に展開し、適当な生育温度で一晩培養します。

2. コロニー／プラークリフト

2-1 培養プレートをインキュベーターから取り出します。

ディスクタイプの Hybond-N+（RPN82B ほか）または

Hybond-NX に、チャイナマーカーなどのインクが落ち

ない筆記具で印をつけます。印をつけた面を下にして

ディスクをプレートの表面に置き、ディスクが完全に

湿るまでコロニーと接触させておきます。

2-2 メンブレンと培地に滅菌した注射針で印をつけ、培地

上のコロニー／プラークとメンブレンに転写された

それらの位置関係が対応づけられるようにしておき

ます。

2-3 １分後、メンブレンを培地からはがし、コロニー／プ

ラーク面を上にしてろ紙（Hybond Blotting Paper、

Whatman 3MM など）の上におきます。ディスク上で

コロニー／プラークの増殖を行わない場合はステッ

プ 3 にすすんでください。

レプリカが必要な場合は、次のように行います。

2-4 コロニーを含む鋳型メンブレン上に新しいメンブレ

ンを注意深く重ねます。レプリカプレート作製用の器

具を用い、メンブレンが横にずれないように注意し

て、2 枚のメンブレンをしっかりと押し付けます。鋳

型メンブレンと同様に、転写されたそれらの位置関係

が対応づけられるように滅菌した注射針で印をつけ

ます。

2-5 全てのレプリカメンブレンを新しい培地上に置き、コ

ロニーの直径が 0.5～1 mm になるまで 37 ℃でインキ

ュベートします。

2-6 クロラムフェニコール存在下で増殖するコロニーの

場合は、メンブレンのコロニー面を上にして L-アガー

／クロラムフェニコール培地上に置き、37 ℃で一晩

培養します。

2-7 メンブレンを培地からはがします。

48-a ECL Direct

ろ紙を湿らせ過ぎた状態で用いるとコロニーが拡散する原因になること

があります。

1.5 M NaCl / 0.5 M NaOH で溶出と変性を行う前に、10%（w/v）SDS 溶液

を用いた溶菌ステップを入れても良いでしょう。

3.溶出と変性

3-1 溶出変性溶液で飽和した 2 枚重ねのろ紙

（Hybond Blotting Paper、Whatman 3MM など）

上に、コロニー／プラーク面を上にしてメンブ

レンを置き、2～5 分間放置します。

溶出変性溶液： 1.5 M NaCl / 0.5 M NaOH

3-2 中和溶液で飽和した 2 枚重ねのろ紙（Hybond

Blotting Paper、Whatman 3MM など）上に、コ

ロニー／プラーク面を上にしてメンブレンを

置き、3 分間放置した後、新たに中和溶液で飽

和した 2 枚重ねのろ紙を使用し、この操作をも

う 1 回繰り返し行います。

中和溶液： 1.5 M NaCl / 0.5 M Tris-HCl (pH 7.5)

4. メンブレンのリンス

4-1 400 ml の 5×SSC を入れた容器にメンブレンを

入れ、1 分間振盪します。クロラムフェニコー

ルを添加しない培地で一晩増幅を行ったディ

スクの場合は、コロニー由来の不純物を除くた

めにより強く振盪／リンスを行う必要があり

ます。HRP 標識プローブが非特異的に吸着する

のを防ぐために、この段階で細胞の残渣を十分

に除去することが重要です。ディスクをピンセ

ットでつかんでバッファー中に入れ、手を激し

く振り動かしてください。この要領で 2 回リン

スします。

4-2 DNA 面を上にしてメンブレンをろ紙（Hybond

Blotting Paper、Whatman 3MM など）上に置き、

風乾します。

5 固定

i）ベーキング

80℃、2 時間乾熱処理を行います。

ii） UV クロスリンカー（UV 固定）

メンブレンをラップに包み、UVクロスリンカー

にセットし固定します。（Hybond-N+、NXのUV

照射条件：70mJ/cm2）

400 mlでφ82 mmのメンブレン10枚を十分にリンスできます。クロラムフ

ェニコール存在下で増幅したコロニーを処理する場合は、2回行うリンス

のそれぞれにおいて、メンブレン10枚あたり新しい5×SSCを400 ml使用

してください。オーバーナイトでコロニーを増幅したディスクの場合は、多

量の細菌残渣が生じるため、メンブレン2枚に対して400 mlの5×SSCを

使用してください。

48-b ECL Direct

49ECL Direct

5. ハイブリダイゼーションとシグナルの検出

次の範囲内で条件を至適化します。

プローブ濃度： 2～10 ng/ml

ハイブリダイゼーションの時間：1～4時間

フィルムへの露光時間： 1分間～1時間

この条件は、以下のアプリケーションで使用できます。

コロニー：オーバーナイト培養（プラスミド）

クロラムフェニコール増幅（プラスミド）

オーバーナイト培養（コスミド）

プラーク：M13およびλ

新たにスクリーニングを行う場合、まずはハイブリダイゼー

ション4時間、プローブ濃度10 ng/mlとしてみるとよいでしょ

う。ハイブリダイゼーション時間とプローブ濃度を下げると

感度は低下しますが、高コピー数プラスミドのほとんどや

M13ファージの場合、十分量の標的DNAが存在するので、感

度の低下は許容範囲内に収まります。しかしながら、コスミ

ドやλファージの場合は標的DNA量が少ないので、ハイブリ

ダイゼーション時間の短縮やプローブ濃度の低下はポジティ

ブシグナルを弱める原因となります。シグナル強度が低い場

合は、フィルムへの露光時間を長くすることで埋め合わせる

ことができます。

プローブの標識・シグナルの検出はSection A/Protocol 1～3

（38～42ページ）に記載されています。


305012183

画像

50 ECL Direct

システムのパフォーマンスを引き出すために

品質管理

◆ 各バッチは、弊社の品質管理部で、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションにおいて0.5 pgの標的DNAを検出で

きることを確認しています。

◆ 標識システムの機能は、添付されているコントロールλDNAを用いて確認することができます。

ブロットのリプロービング

◆ フィルム上にシグナルを発生させたブロットは、数回リプローブして使用できます。はじめに使ったプローブと同

じ方法で、異なった配列（あるいは同じ配列）の核酸を標識し、プローブに用います。本システムは酵素標識法を

利用しており、酵素は発光反応後失活するので、2回目以降のハイブリダイゼーションを行う前にブロットから古

いプローブを“剥がす”必要はありません。リプローブを行う前には、発光が検出限界以下に減少するように、ブ

ロットに検出試薬がかかった状態で長時間（通常一晩）放置します。リプロービングの操作は、Section

A/Protocol 1-1（38ページ参照）からはじめてください。メンブレンはリプロービング操作を行うまでの間は乾燥

しないよう、サランラップに包んで室温に保存するなどしてください。

◆ リプロービング可能な回数の限度は、ブロットの物理的なダメージに影響を受けます。従って、ブロットは常に注

意深く取り扱ってください。

◆ それぞれのリプロービング毎に、5 %（W/V）のBlocking agentを含むハイブリダイゼーションバッファーにてメ

ンブレンのブロッキングを行ってください。

標識プローブの保存

◆ 弊社ラボでは、さまざまなプローブを標識後、50 %グリセロール溶液中で-15～ -30 ℃にて保存し、最長6ヶ月ま

ではサザンハイブリダイゼーションに問題なく使用できることを確認しています。標識後のプローブはかなり安定

しておりますが、調製条件が変動すれば使用可能な期間も変化するものと考えられます。

ベクターからのインサート切出し

インサートDNAの精製後、効率的な標識を行うには正確なDNA濃度を決定する必要があります。分光光度計とアガロー

スゲル電気泳動によってDNA濃度を見積もってください。以下に代表的なインサートDNA精製法を紹介します。

◆ GFX（ガラス繊維マトリクス）法― GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (27-9602-01) ―

インサートを含むベクターを適当な制限酵素で消化し、エチジウムブロマイドを含む1 %アガロースゲル電気泳動

を行います。目的のバンドを切り出し、キット付属のキャプチャーバッファーを入れた1.5 mlチューブに移します。

65 ℃で10分程度加熱し、ゲルを融解させます。得られた溶液をGFXカラムに添加し、遠心します。その後、洗浄バッ

ファーで洗浄後、適量の低イオン強度のバッファー（TEバッファーなど）で溶出します。この方法では、わずか15

分で100 bp～10 kbのフラグメントが60～80 %の回収率で得られます。

◆ DEAE-セルロース紙法

インサートを含むベクターを適当な制限酵素で消化し、エチジウムブロマイドを含む1 %アガロースゲルで電気泳

動を行います。目的のバンドの上下に切れ込みを入れ、DEAE-セルロース紙をゲルの底まで完全に差し込みます。

再び電気泳動を行い、目的のバンドをDEAE-セルロース紙に捕らえます。DNAを含まない余白を切り取って、冷や

した蒸留水で洗浄します（5～10分）。タオルドライした後1.5 mlチューブに移し、300～700 µRのエクストラクション

バッファー（下記）を加えます。ボルテックスをかけて、DEAE-セルロース紙を千切りにします。

振盪しながら37 ℃で2時間インキュベートします。24時間以内であれば、インキュベート前に2～8 ℃で保存するこ


51ECL Direct

ともできます。溶液を針で底に穴を開けた蓋なしの0.5 mlチューブに移します。このチューブを1.5 mlチューブには

め込んで5分間遠心します。さらに3分間遠心し、残存の繊維を沈殿させます。DNAを含む上清を3倍量の水飽和ブ

タノールで抽出します。2倍量のエタノールを加え、-15～-30 ℃で1時間～一晩放置しDNAを沈殿させます。遠心し

て得たDNAのペレットを70 %エタノールでリンスした後、適量の蒸留水に溶かします。この方法では、2 kb以下の

フラグメントが～80 %の回収率が得られます。

DEAE-セルロース紙の調製： DEAE-セルロース紙（Whatman-DE81等）をゲルの高さと同じで

切れ込みの幅より少し大き目に切ります。2.5 mM NaCl溶液に数

時間浸します。蒸留水で数回洗浄し1 mM EDTA（pH 8.0）溶液中、

2～8 ℃で保存します。

エクストラクションバッファー（pH 8.0）: 1.5 M NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl

◆エレクトロエリューション法

インサートを含むベクターを適当な制限酵素で消化し、エチジウムブロマイドを含む1 %アガロースゲルで電気泳動

を行います。目的のバンドを切り出し泳動に使用したバッファーを入れた透析チューブに移します。余分なバッ

ファーをできるだけ除いて封をし、泳動漕にチューブを電極と平行に浸して電流をかけ、DNAを溶出させます

（100 V、2時間）。電流を逆方向にかけて（2分間）、透析チューブの内壁に付着したDNAを剥します。パスツールピ

ペットを使って溶出したDNAを1.5 mlチューブに回収します。2倍量のエタノールを加え、-15～-30 ℃で1時間～一

晩放置しDNAを沈殿させます。遠心して得たDNAのペレットを70 %エタノールでリンスした後、適量の蒸留水に溶

かします。この方法では、2 kb以下のフラグメントの場合、80 %以上の回収率が得られます。

低融点アガロースゲルで分離したプローブの標識

◆ ECL Directでは、精製度の高いプローブを使用することを推奨していますが、低融点アガロースゲルで電気泳動し

て分離したプローブからアガロースを除去せずに標識することもできます。0.7 %以下のゲルであれば、切り出し

た断片をプロトコール1に従って標識できます。ただし、急激な冷却（Section A/Protocol 1～3、38ページ参照）

は行わないでください。

◆ 沸騰水中で、アガロースの融解とDNAの変性を同時に行います。室温に戻し、冷めたらすぐに冷やしたLabelling

reagentを添加します。この段階でアガロースは再凝固しない濃度に希釈されています。

◆ Glutaraldehydeによる架橋反応と、37 ℃・10分間のインキュベーションは通常どおり行います。標識後のプロー

ブはそのままハイブリダイゼーションに使用できます。


52 ECL Direct

バンドが見えない◆ゲルからメンブレンへのDNAトランスファーがうまくいっていない

○ DNAが残っていないかどうか、ゲルをエチジウムブロマイドで染色してみてください。

○［Section B サザンブロッティング、43ページ参照］のプロトコールに正確に従ったかを確認してください。

○ コントロールのλDNAをサンプルとともに泳動してみてください。100 pgを泳動した場合、4番目のバンドは

4.4 kb（9 pg）、その下の2本のバンドは2.3 kb、2.0 kb（それぞれ4.8 pg、4.2 pg）となります。

◆ハイブリダイゼーションと検出の失敗

○ ハイブリダイゼーションの条件を適当なコントロール、例えばキット添付のコントロールλHind III control

DNAでチェックしてください。

○ プローブの標識は成功しているかどうかを確認してください。

プロトコールどおりの量と順序で標識試薬を添加していますか？

DNA溶液から塩を除きましたか？

DNAが標識されているかどうかは、アガロースゲル電気泳動上の移動度の変化からもチェックできます。

○ ハイブリダイゼーション温度が42 ℃を超えていませんでしたか？

○ 検出試薬が劣化していないかどうかをチェックしてください。少量（1 ml程度）のECL detection reagent 1と2

を混合し、暗所で1 µlのDNA labelling reagentを加えます。正常ならば青色光が発生します。

バンドが全体的に薄い◆シグナル強度が低い

○ フィルムをプレフラッシュすることにより、シグナルへの感度を上げ、レスポンスを均一化することができま

す。しかしながら、バックグラウンドの上昇が生じるので注意を要します。プレフラッシュとは、使用直前に

フィルムをごく短時間（約1ミリ秒）フラッシュ露光することにより、フィルム感度を増加させることです。

Wratten 6Bフィルターで減光した写真用ストロボを使用し、現像後の540 nmでの吸光度がプレフラッシュし

ていないフィルムに対して0.15上がる距離で行います。また、プレフラッシュ条件を至適化してあるSensitize

Pre-flash Unit（RPN2051）のようなシステムを使用することもできます。

○ ハイブリダイゼーション温度が42 ℃を超えていないことを確認してください。

○ 露光時間を延長してみてください（数時間）。

○ DNAのメンブレンへの転写がうまくいっていない可能性もあります。上述のようにコントロールDNAを使って

確認してください。

バックグラウンドが高い◆非特異的な発光が起きている

○ 標識に用いたDNA量や標識試薬の量に誤りがなかったかどうかをチェックしてください。

○ ハイブリダイゼーションの際、標識されたベクター部分が存在するとノイズが上昇することがあります。でき

るかぎり、ベクターから切り出して精製したインサートをプローブとして使用してください。

○ ハイブリダイゼーションの過程でブロットがハイブリダイゼーションバッファーに均一に浸っており気泡をか

んでいないことを確認してください。

○ 標識プローブがメンブレン上に直接かかっていないかどうか確認してください。プレハイブリダイゼーション

の段階でバッファーを一部取り、プローブと混ぜ、これをもとのバッファーに戻すことで回避することができ

ます。

TROUBLESHOOTING


53ECL Direct

○ 洗浄のステップが、定められた回数、温度で行われていたかどうかを確認してください。

○ フィルムの露光時間を1分間にしてください（それでもバックグラウンドが高い場合は、露光時間をより短く

してください）。

○ 高品質のメンブレンを使用してください：ナイロンメンブレンとしてはHybond N+を、ニトロセルロースメン

ブレンとしてはHybond ECLを推奨します。

○ メンブレンの損傷は、プローブが非特異的に吸着する原因となります。ブロットは、パウダーフリーの手袋を

した手あるいは先の平たいピンセットで注意深く取り扱ってください。

○ 洗浄後は、ブロットをきれいなピンセットで取り扱ってください。ハイブリダイゼーションバッファーや一次

洗浄バッファーが汚染していると、バックグラウンド上昇の原因となります。

◆メンブレンのブロッキングがうまくいっていない

○ ブロッキング試薬を濃度5 %（W/V）で十分溶解したかどうか確認してください。激しく攪拌しながら、試薬

は少量ずつ添加することが必要です。

○ ブロットをリプロービングするごとに、メンブレンはブロッキング試薬を含むハイブリダイゼーションバッ

ファーでブロッキングしなければなりません。

フィルム上の斑点状のブランク◆手袋からのパウダーが混入した

○ パウダーフリーの手袋を着用してください。


54 ECL Direct


55ECL Direct

ご注文情報AlkPhos Direct

コード番号

AlkPhos Direct Labelling and Detection System with CDP-StarLabelling reagents for 25 reactions (RPN3680) andCDP-Star Chemiluminescent detect reagents for 2,500 cm2 membrane (RPN3682) RPN3690

Labelling reagents for 50 reactions (RPN3680×2) andCDP-Star Chemiluminescent detect reagents for 5,000 cm2 membrane (RPN3682×2)

RPN3691

AlkPhos Direct Labelling and Detection System with ECFLabelling reagents for 25 reactions (RPN3680) andECF Chemifluorescent detect reagents for 2,500 cm2 membrane (RPN3685) RPN3692

AlkPhos Direct Labelling ModuleLabelling reagents for 25 reactions RPN3680

Labelling reagents for 25 reactions (RPN3680×2) RPN3681

CDP-Star Detection ReagentCDP-Star Chemiluminescent detect reagents for 2,500 cm2 membrane RPN3682

CDP-Star Chemiluminescent detect reagents for 5,000 cm2 membrane (RPN3682×2)RPN3683

ECF Detection ModuleECF Chemifluorescent detect reagents for 2,500 cm2 membrane RPN3685

AlkPhos Direct Hybridization BufferReagent for 5,000 cm2 membrane RPN3688

ECL Directコード番号

ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection SystemECL Direct Labelling Module (5 µg labelling) (RPN3005) andECL Ditection Reagents (for 2,000 cm2 membrane) (RPN3004) RPN3000

ECL Direct Labelling Module (5 µg labelling) (RPN3005×2) andECL Ditection Reagents (for 2,000 cm2 membrane) (RPN3004×2) RPN3001

ECL Direct Labelling ModuleLabelling reagents for 5 µg nucleic acid and Hybridization buffer for 2,000 cm2 membrane RPN3005

ECL Gold Hybridization Buffer for 4,000 cm2 membraneHybridization buffer and blocking agent RPN3006

ECL Detection ReagentsDetection reagents (for 2,000 cm2 membrane) RPN3004

Detection reagents (for 4,000 cm2 membrane) RPN2105


56

関連試薬

ブロッティングろ紙：Hybond Blotting Paper

Hybondメンブランに至適化された、サザン／ノーザン／ウェスタ

ンブロッティングに使用するろ紙です。厚さは約0.4 mmです。

化学発光用X線フィルム：Hyperfilm ECLCDP-StarやECLによる化学発光検出に最適なX線フィルムです。青

色化学発光に感受性の高いエマルジョンが、フィルム両面に塗布されているので、高感度でシグナルを検出することができます。また、透明なフィルムベースによって、コントラストの高い像が得られます。

Hybond-N+ Hybond-N Hybond-NXサイズ包装コード番号コード番号コード番号

φ82 mm（グリッド付） 50 discs RPN1782Bφ82 mm 50 discs RPN82B RPN82N RPN82Tφ87 mm（グリッド付） 50 discs RPN1787Bφ87 mm 50 discs RPN87B RPN87Nφ132 mm（グリッド付） 50 discs RPN1732Bφ132 mm 50 discs RPN132B RPN132Nφ137 mm（グリッド付） 50 discs RPN1737Bφ137 mm 50 discs RPN137B RPN137N11.9×7.8 cm 50 sheets RPN119B RPN119N12×10 cm 20 sheets RPN1210B RPN1210N15×10 cm 20 sheets RPN1510B RPN1510N15×20 cm 10 sheets RPN1520B RPN1520N20×20 cm 10 sheets RPN2020B RPN2020N22.2×22.2 cm 10 sheets RPN2222B RPN2222N30×50 cm 5 sheets RPN3050B RPN3050N20 cm×3 m 1 roll RPN203B RPN203N RPN203T30 cm×3 m 1 roll RPN303B RPN303N RPN303T22.2×22.2 cm 50 sheets RPN2250B22.5×22.5 cm 50 sheets RPN225B

Hybond Blotting Paperサイズ包装コード番号

46×57 cm 100 sheets RPN6100M20×20 cm 100 sheets RPN6101M23 cm×100 m 1 roll RPN6102M19 cm×100 m 1 roll RPN6103M27 cm×100 m 1 roll RPN6104M

Hyperfilm ECLサイズ包装コード番号

18×24 cm 25 sheets RPN2103K75 sheets RPN3103K

30×40 cm 25 sheets RPN2104K5×7 inches 25 sheets RPN1674K8×10 inches 25 sheets RPN2114K

75 sheets RPN3114K10×12 inches 25 sheets RPN1681K

メンブレン：Hybond

Hybond-N+:ポジティブチャージメンブレンで、Non-RIによる全てのハイブリダイゼーション実験に最

適です。通常のブロッティング操作のほか、アルカリ法でも優れた性能を示します。また、

短い核酸フラグメントでも、確実に結合させることができます。

Hybond-N: 非電荷親水性ナイロンメンブレンで、RIを用いたなブロッティングに適しています。高い物

理的強度と核酸結合能はリプロービング実験を容易にします。

Hybond-NX:Hybond-NXは、Hybond-Nと同様の特徴をもつ非電荷メンブレンです。Hybond-Nに比べて、メンブレンの厚さが薄いため少

量のバッファーでハイブリダイゼーションを行うことができます。多数のコロニー／プラークハイブリダイゼーションを行う場合に適しています。

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サザン／ノーザンブロット・ドットブロットなどを、迅速で再現性よくハイブリダイゼーションできます。回転式もしくは浸と

う式インキュベーションの選択が可能で、大変使いやすい製品です。φ35 mm×230 mm長ボトル、φ35 mm×150 mm長ボ

トル、φ70mm×230 mm長ボトルの3種類がありますので、メンブレンサイズにあったボトルを選択することができます。最

大メンブレンサイズは22 cm×23 cmです。

関連機器サブマリン電気泳動装置 HE 99X Max Submarine Unitトレイを選択することで幅15 cm、長さ 10、15、20 cmゲルに対応（15×20 cmゲルキャスティングキットは標準装備）し

ます。UV透過トレイのため、ゲルをトレイに入れたまま、UVトランスイルミネーターで検出可能です。製品コード番号

HE 99X Max Submarine Unit, Complete＊ 80-6061-57EPS 301 Power Supply 18-1131-01

＊構成：本体、15ウェル・1.5 mm厚コーム（7.1 mmウェル幅）、コームバック、

ゲルキャスティングキット（15×20 cm）、水準器

DNA／RNAのブロッティングを効率良く短時間で行うバキュームブロッティング装置です。通常はわずか30分で、巨大ジェ

ノミックDNAでも2時間で転写可能です。最大ゲルサイズは20×30 cmです。

ハイブリダイゼーションオーブン／ベーキング装置：Hybridization Oven/Shaker

製品コード番号VacuGene XL Vacuum Blotting System内訳 ― VacuGene XL Vacuum Blotting Unit＊1 80-1266-24

― VacuGene XL Vacuum Blotting Pump 80-1265-14

＊1 構成：ブロッティングユニット、ゲルサポーティングスクリーン、ガスケットマスク（5枚）、

シリコンチュービング、トラップボトル、ホースクランプ

UV固定装置：UV Closslinker

DNAおよびRNAのナイロンメンブレンへの固定に最適です。センサーにより照射時間が補

正されますので、照射時間が一定に保たれ、UV放電管の劣化による固定ミスを防ぎます。

最大メンブレンサイズは25×30 cmです。

UV製品コード番号

UVC500 UV Crosslinker 80-6222-31

※構成：本体、8ワット254 nm UV放電管5本

製品包装コード番号

Hybridization Oven/Shaker* RPN2512スペアパーツ ―φ35 mm×150 mm長ボトル 6本 RPN2517

―φ70 mm×230 mm長ボトル 2本 RPN2518―φ70 mmボトルホルダー RPN2515

※構成：本体、φ35×230 mm長ボトル6本、φ35 mmボトルホルダー（6本接続可能）付

12スロットが4列あり、48サンプルのスクリーニングが迅速かつ簡単に行えます。丈夫なアクリルプレートを使用しており、

プレートどうしをステンレス鋼スクリューで確実に密着させ、クロスコンタミネーションを防ぎます。各スロットのメンブレ

ンとの接触面積は、2.6 mm2（6.5×0.4 mm）で、サンプルは1 mlまで添加することができ

ます。また、サンプルを簡単に区別できるように各スロットに番号がついており、サンプル添加しやすいように、スロットの口は大きくなっています。

製品コード番号

PR648 Slot Blot Manifold 80-6095-58

ブロッティング装置：VacuGene XL Vacuum Blotting System

スロットブロット装置：PR648 Slot Blot Manifold


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バリアブルイメージアナライザー：Typhoon 9410

X線フィルムカセット：Hypercassetteフィルムとメンブレンがしっかり密着する設計になっており、カセットの開け閉めも簡単です。Hypercassette (Standard depth)

製品形状 X線フィルム対応サイズコード番号

Hypercassette Neutral

クリーム色スタンダード 18×24 cm RPN11642

クリーム色スタンダード 30×40 cm RPN11644

クリーム色スタンダード 5×7 inches RPN11648

クリーム色スタンダード 8×10 inches RPN11649

クリーム色スタンダード 10×12 inches RPN11650Hypercassette Red

レッドスタンダード 18×24 cm RPN12642

レッドスタンダード 8×10 inches RPN12649Hypercassette Blue

ブルースタンダード 18×24 cm RPN13642

ブルースタンダード 8×10 inches RPN13649

Hypertorch包装コード番号

3本 RPN1620

ECL Mini-Cameraコード番号

RPN2069

ECLやCDP-Star などの化学発光検出を直接イ

ンスタントフィルムに露光・検出するためのカメラです。暗室に行く必要がなく、実験台で化学発光を手軽に検出チェックすることができます。対応できる最大メンブレンサイズ

は74×93 mmです。

共焦点レーザー走査方式を用いた、蛍光検出・RI・化学発光の直

接検出可能なイメージングシステムです。共焦点レーザー走査方式のため、ブリーディング（画像にじみ）を抑えた正確な定量を

行うことができます。Double PMTシステムにより4色の蛍光を同

時に検出でき、標準7枚のフィルター装備が可能なため、多種の蛍

光試薬に対応することができます。また付属のソフトウェア

FluorSepにより、近接した波長の蛍光物質の定量も可能です。

ペンライト：Hypertorch

インスタント化学発光検出器：どこでもカメラ―ECL Mini-Camera―

暗室で作業する際に、使用する赤色LEDライト

です。ペンタイプで簡単にOn/Offでき、ハイ

パーフィルムなどを感光させません。

関連機器


AlkPhos Direct, CyDye, Gene Images, FluorImager, Storm, ECL, ECF, Hybond, Hyperfirm, Hypercassette and Hypertorch are

trademarks of Amersham Biosciences or its subsidiaries.

Amersham and Amersham Biosciences are trademarks of Amersham plc.

CDP-Star is protected by Tropix Inc. and it protected under one or more of US patent numbers 5326882 and 4931569.

SaranWrap is a trademark of Dow Chemical Company.

Whatman is a trademark of Whatman plc.

Gene Images AlkPhos Direct hybridization buffer is covered by US patent number 5512436 and foreign equivalents.

AlkPhos Direct is covered by US patent numbers 373017 and 513040 and foreign equivalents and is sold under licence from

Institut Pasteur.

ECF substrate is manufactured for Amersham Pharmacia Biotech Limited by JBL Scientific Inc. This component is covered by US

patent number 5424440 and is sold under licence from JBL Scientific Inc.

ECL Direct (RPN3000/3001/3005) is covered by European patent numbers 373017 and 513040 and foreign equivalents and is sold

under licence from Institut Pasteur.

このカタログに記載の製品は試験研究用です。人、動物への医療・診療診断用としては使用できません。

掲載されている内容は、予告なく変更される場合がありますのであらかじめご了承ください。

掲載されている社名や製品名は、各社の商標または登録商標です。


www.jp.amershambiosciences.com

本社〒169-0073 東京都新宿区百人町3-25-1 サンケンビルヂング

TEL : 03-5331-9336　FAX : 03-5331-9370 e-mail : [email protected]

お問合せ：バイオダイレクトライン ISO 9001:2000認証取得

掲載されている製品の名称、仕様、価格などは、予告なく変更される場合がありますのであらかじめご了承ください。

この機器は試験研究用です。治療、臨床診断用につながる医療診断機器としては使用できません。

この印刷物は、再生紙を使用し大豆インキにて印刷しています。


alkphos direct ecl direct...核酸標識・検出試薬 alkphos direct ecl direct...

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