1 facolta’ di scienze ff mm nn – laboratorio di chimica analitica iii biosensore : definizione...

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BIOSENSORE : definizione

ANALITA TARGET T

RA

SD

UTTO

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ELEM

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BIO

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GIC

OSEGNALE MISURABILE

Membrana selettiva

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•1. Relevance of output signal to measurement environment•2. Selectivity and repeatability•3. Sensitivity and resolution•4. Dynamic range•5. Speed of response•6. Insensitive to temperature (or temperature compensation) •7. Insensitive to electrical and other environmental interference •8. Amenable to testing and calibration•9. Reliability and Self-Checking Capability•10. Physical robustness•11. Service requirements and price•12. Life time and Reusability

Requisiti di un biosensore

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• “A biosensor is a self-contained integrated device which is capable of providing specific quantitative or semi-quantitative analytical information using a biological recognition element which is in direct spatial contact with a transducer element.

• A biosensor should be clearly distinguished from a bioanalytical system, which requires additional processing steps, such as reagent addition.

• Furthermore, a biosensor should be distinguished from a bioprobe which is either disposable after one measurement, i.e. single use, or unable to continuously monitor the analyte concentration”.

According to a recently proposed (1999) IUPAC definition:

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Elemento biologico di riconoscimento molecolare

• Enzimi (biosensore catalitico)

-transformazione dell’analita in un prodotto misurabile -inibizione dell’ enzima da parte dell’ analita

-modifiche dell’enzima indotte dall’analita

• Antigene-anticorpo

-legame ad alta affinità con un tracciante che produce il segnale o direttamente reazione Ab-Ag senza tracciante

• DNA: -reazioni di ibridazione ad alta affinità

• Sensori Biomimetici - molecole ad alta affinità (singole catene di anticorpi,..) - polimeri imprintati •Biosensori cellulari

-inibizione della vitalità cellulare(respirazione,.. -proteine di transporto di membrana -neurorecettori (producono il signale attraverso i canali ionici -cellule (batteri, lieviti,..) geneticamente modificati per esprimere l’elemento di riconoscimento molecolare (recettore, proteina di legame,..)e un gene reporter per la trasduzione in un segnale misurabile (luc, lux, GFP,..)

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ii Il segnale che viene prodotto dalla interazione dell’ analita con l’ elemento biologico può essere:

Potenziometrico modifiche nella distribuzione delle cariche che produce un potenziale

elettrico Amperometrico movimento di elettroni in una reazione redox Calorimetrico produzione o assorbimento di calore dal processo chimico Ottico assorbimento, emissione, rifrazione, “scattering” ..della luce nella reazione Piezoelettrico variazioni di massa dovuti al legame dell’analita Foto-acustico,..……

BIOSENSORE : Trasduzione

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Principio dei biosensori

AnalyteAnalyte

Electricsignal

Enzyme

Antibody

Micro-Organism

Cell

Enzyme

Antibody

Micro-Organism

Cell

Electro-activesubstancepH Changes

Heat

Light

Mass changes

Electro-activesubstancepH Changes

Heat

Light

Mass changes

ElectrodepH electrodeSemiconductor

Thermistor

Photon counter

Piezoelectric Dv

ElectrodepH electrodeSemiconductor

Thermistor

Photon counter

Piezoelectric Dv

RECOGNITION LAYER TRANSDUCER

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Per Riassumere:

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Cenni storici del Biosensori

Concetto e principio -- Leland Clark (1956) Sensore per l’ urea -- Guibault & Montalvo (1969) Glucosio - Yellow Springs Instr. Co. (1973) Termistore enzimatico – Mosbach (1974) Electrodo a microorganismi – Divis (1975) Sensore per l’ Ossigeno a fibra-ottica – Lubbers &

Opitz (1975) Immnosensore – Liedberg et al. (1982) Elettrodo enzimatico – MediSense Inc. (1987) BIAcore – Pharmacia, Sweden (1990) Nanosensore – Vo-Dinh (2000)

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Potenziali campi di applicazione

farmaci, residui,tossine,.. negli alimenti microinquinanti nell’acqua e nell’aria monitorare un processo biologico virus, bacteria,.. ions composti organici analiti di interesse chimico-clinico e diagnostico……………

Sistemi complementari ai sistemi analitici tradizionali con l’obiettivo principale di

ottenere una risposta rapida o in tempo reale

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Biosensori Elettrochimici

Potenziometrici : Viene misurato il potenziale di una cella a valore di corrente zero.

Amperometrici : Si misura l’Intensità di corrente dovuto ad un processo Ox-red.

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Elettrodo di riferimento

Elettrodo indicatore

Risultato:Differenza di

potenzialeProcessore di segnale

Biosensori potenziometrici

I corrente = 0

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Ecell = Eind – Eref + Elj semplificata: Ecell = K + Eind

ISE(elettrodo indicatore)

Elettrodo di riferimento (esterno)

Membrana[ai]campione

Elettrodi ionoselettivi ISEElettrodi ionoselettivi ISE

Equazione di Nernst

Ecell = K + 2.3 RT log [ai]campione

zF

log [ai]campione

Ecell

Curva Standard

Dove:

E = Potenziale elettrochimico K = costanteR = Costante dei gas (8.314 joules/(mole)(°K))T = Temp. assolutaZ = Numero di elettroni trasferitiF = Costante di Faraday (96,487 coulombs/mole di elettroni)ai = Attività della specie ionica (ai = Cifi; dove C è la

concentrazione dello ione ed f ilcoefficiente di attività .

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Elettrodo per il Sodio Elettrodo per il Sodio

Esempi di elettrodi ionoselettivi

Elettrodo a vetroElettrodo a vetro

Variazione di carica dovuta al legame di H+ alla membrana

Risultato: variazione di potenziale

ISFET

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ElettrodoElettrodo per il Potassio per il Potassio

Valinomicina

ElettrodoElettrodo per la CO per la CO22

Esempi di elettrodi ionoselettivi

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(a) Membrana semi-permeabile (b) Biocatalizzatore (c) Membrana di vetro (d) Probe per il pH (e) Potenziale elettrico generato(f) Elettrodo interno Ag/AgCl (g) HCl diluto(h) elettrodo esterno di riferimento

Esempio di biosensore potenziometrico

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Vantaggi

•Disponibilità di un elevato numero di enzimi utilizzabili.

•Elevata tecnologia disponibile e conoscenze scientifiche

•Facile installazione, misure semplici e dirette .

•Diverse configurazioni ( Statica, a flusso , micro ).

•Facile automazione e applicabilità

•Bassi costi.

Svantaggi

•Scarsa selettività di alcuni biosensori.

• Il numero di biosensori disponibili è molto limitato

Vantaggi e svantaggi dei Biosensori Potenziometrici

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Immagini di alcuni Biosensori ISFET

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Elettrodo di riferimento

Elettrodo dilavoro

Risultato:Intensità di

correnteProcessore di segnale

Biosensori amperometrici

Differenza di potenzialeprefissata

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Il biosensore amperometrico più semplice utilizza l’elettrodo ad ossigeno di Clark.Questo è costituito da un catodo di Pt al quale l’O2 si riduce ed un elettrodo di riferimento Ag/AgCl.

.

Ag anodo     4Ag0 + 4Cl- 4AgCl + 4e-  Pt catodo     O2 + 4H+ + 4e- 2H2O 

Collegamentoamplificatore

Filo di Agricoperto con AgCl

Tubo di plexiglas

Membrana permeabile

all’O2

introduzione elettrolita

KCl 100 mM

Elettrodo ad Ossigeno

Filo di Pt forgiato per essere sigillato da vetro ed avere una

superficie piatta esposta all’analita

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Biosensori amperometrici di I generazione

I biosensori amperometrici di prima generazione monitorano il consumo di O2 o la produzione di H2O2 associate

all’ossidazione di un substrato da parte di un enzima ossidasi

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.

La glucosio ossidasi catalizza la seguente reazione in due passaggi:

Glucosio + FAD + H2O ———> Acido gluconico +FADH2

FADH2 + O2 ———> H2O2 + FAD

La glucosio ossidasi è immobilizzata sulla membrana a gas del sensore così l’elettrodo di lavoro compete con l’enzima per l’ossigeno molecolare.

Biosensore amperometrico per il glucosio

glucosio

Membrana permeabile

all’O2

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Tipica risposta del biosensore amperometrico per il glucosio

Biosensore amperometrico per il glucosio

•Misure batch

•Misure in flusso

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Biosensore amperometrico per il glucosio

•Misure FIA (flow injectio analysis)

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La stessa reazione catalizzata dalla glucosio ossidasi può essere utilizzata per monitorare la produzione di acqua ossigenata.

L’acqua ossigenata è ossidata all’elettrodo di lavoro secondo la seguente reazione:

H2O2 —-——> O2 + 2H+ + 2e-

L’enzima è immobilizzato e tenuto il più vicino possibile l’elettrodo di lavoro. E’ prodotta una corrente proporzionale alla concentrazione del metabolita da analizzare.

Un fattore limitante di questi sensori è che sono dipendenti dalla solubilità dell’ossigeno nelle soluzioni campione.

Biosensore ad acqua ossigenata

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Si utilizzano dei “mediatori” che trasferiscono gli elettroni direttamente all’elettrodo bypassando la riduzione dell’ossigeno.

I ferroceni rappresentano il gruppo di mediatori più utilizzati .

Biosensori amperometrici di II generazione

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Biosensori amperometrici di III generazione

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Biosensori Amperometrici

Vantaggi

1. Non influenzato dal drift dell’elettrodo di riferimento2. Risposta lineare.3. Sono più sensibili di quelli potenziometrici. E’ possibile

miniaturizzarli

Svantaggi

1. La corrente amperometrica consuma l’analita e la sua diffusione influenza la risposta.

2. La misura amperometrica viene eseguita ad un particolare potenziale di lavoro dove altre sostanze potrebbero reagire ed interferire.

3. Il materiale all’anodo si consuma riducendone il tempo di utilizzo, paricolarmente quando si utilizzano film sottili di Ag/AgCl .

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Sensori Piezoelectrici

Microbilancia al quarzo QCM

Sistemipiezoelettrici

Cristallo di quarzoElettrodo

d’oro

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Microbilancia al quarzo (QCM)

Modifiche nell’intorno del cristallo

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Biosensori Piezoelettrici

Transduttore: microbilancia cristallo di quarzo (QCM)

probe immobilizato

DNA Target, Ag, Ligando

Si forma un duplex, Ab-Ab, Complesso lig-recettore

la massa aumenta

Cala la frequenza di risonanza del cristallo

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Biosensori Piezoelettrici

La relazione tra massa m e frequenza f è data dalla nota relazione di Sauderbery:

Dove: -Δf è la variazione di frequenza (Hz),-Δm è la variazione di massa della sostanza assorbita sulla superficie (g),- K è una costante che dipente dalla densità e dal tipo di cristallo (taglio), -A è la superficie (cm2)

Cris

tallo

di

qu

arz

o

Oscilla

tore

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Analita in soluzione

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Biosensori Piezoelettrici

Sensitive coating

elemento biospecificoimmobilizzato

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Tecniche di immobilizzazione

1)Immobilizzazione fisica: operativamente semplice ma meno stabile.

2)Immobilizzazione chimica: operativamente complessa, ma più stabile

Schema di reticolazione conBSA-gluteraldeide

Schema di reticolazione su membranecarbossiliche con carbodimmide

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L’obiettivo è quello di minimizzare interazioni aspecifiche e quindi sviluppare un immunosensore specifico e con il vantaggio di non utilizzare un tracciante e quindi misurare direttamente l’interazione Ab—Ag

Si può utilizzare per esempio: sistema avidin-biotin, thiol-dextran, DSP, silanizzazione e assorbimento.

Immobilizzazione di una proteina

Sviluppo di immunosensori

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re

Riv

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Ott

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Segnale Elettrico

Pro

cess

ore

Risultato

Riconoscimentomolecolare

Biosensore Ottico

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Biosensore Ottico: Principi

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Biosensore Ottico: Principi

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Biosensore a fluorescenza

Es: biosensori basati su esteri del boro

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Biosensore a fluorescenza

DETERMINAZIONE DI SUBSTRATI ENZIMATICI

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Fiber-optic cholesterol sensor

Biosensore a fluorescenza

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T. Vo-Dingh et al., Sensors and Actuators B, 2001

Sistema ottico per misure intracellulari

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Sistemi ottici basati di misura della luce evanescente

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Biosensori a risonanza di superficie plasmonica (SPR)

SPR, fenomeno che avviene quando la luce è riflessa da un film sottile di un metallo

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Biosensori a SPR: applicazioni

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Biosensore ottico ad onda evanescente

n1 > n2

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Substrati analizzabili con biosensori enzimatici

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Biosensore calorimetrico

Q = –(n/M)/ΔΗ ΔΤ= Q/Cs=-n ΔΗ/M Cs

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Biosensore calorimetrico

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Biosensori a DNA

DNA a doppia elica

Elettrodo di

lavoro

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Tipi di biosensori a DNA

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Biosensori piezolelettrici a DNA

Quartz crystal microbalance (QCM) transducers

Immobilized DNA probe

Target DNA

Form duplex---mass increase

Decrease in crystal’s resonance frequency

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Immobilizzazione del DNA sulla QCM

Immobilizzazione di DNA-biotina su di un elettrodo QCM modificato

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ii

Il DNA probe viene immobilizzato su di un cristallo piezoelettrico di quarzo ricoperto di streptavidina.

La Streptavidina viene legata covalentemente ad uno strato monolayer costituito da 11-mercaptoundecanolo.

Probe: oligonucleotide biotinilato

Oro

11-mercaptoundecanolo

Destrano

Biotina(Strept)avidina Strept)avidina

Tempo (sec)

Fre

qu

en

za H

z(Strept)avidina

Probe biotinilato

Attivazione con EDC e NHS

Immobilizzazione del DNA sulla QCM

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Biosensori Cellulari: potenziale d’azione

Potenziale di azione dato dalla differenzadi concentrazione di specie ionicheattraverso la membrana cellulare

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• Misura del potenziale d’azione con un elettrodo

Biosensori Cellulari: potenziale d’azione

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ii Valutazione della sensibilità ad un agente tossico

Biosensori Cellulari: potenziale d’azione

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Nutriente O2

CO2 + H2O

Schema della respirazione di cellule di lievito (Saccharomyces cerevisiae) immobilizzate, microfotografia al SEM.

Esempio di confronto tra curve respirometriche

IAR%= 1-ppm(O2)E ppm(O2 )B 100

Respirazione di cellule

Biosensori Cellulari: biosensori respirometrici

• Misura della variazione di O2 con elettrodo di Clark

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ii ASSEMBLAGGIO BIOSENSORE(Dettaglio dell’ancoraggio delle cellule sull’estremità del sensore)

Prelievo delle cellule Prelievo delle cellule immobilizzate in terreno immobilizzate in terreno

agarizzatoagarizzato

(A) cappuccio elettrodo di Clark; (B) soluzione interna; (C) membrana gas permeabile; (D) dischetto con le cellule immobilizzate; (E) e (F) supporti per l’ancoraggio del dischetto.

(A) cappuccio elettrodo di Clark; (B) soluzione interna; (C) membrana gas permeabile; (D) dischetto con le cellule immobilizzate; (E) e (F) supporti per l’ancoraggio del dischetto.

Biosensori Cellulari: biosensori respirometrici

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Biosensori Cellulari

Receptor

Responsive

Element LUCIFERASE

AnalyteAnalyte

SignalSignal

BiosensorBiosensor

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The Bacterial Process:

Catalyst: LuciferaseDecanalFMNH2 O2

Decanoic acid, FMN*, H2O, Light, (490 nm)

The Firefly Process:

Catalyst: LuciferaseLuciferin, ATP, O2 Oxyluciferin, AMP+Ppi, Light (560 nm)

Biosensori bioluminescenti

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Bioluminescence decreases in direct proportion to the level of toxicity present

Light output is directly proportional to the metabolic activity of a cell

Increasing Toxicity

LightOutput

Biosensori bioluminescenti

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Active Cell

Damaged Cellfollowing exposure

to toxin

Normal levels of FMNH2due to Active RespirationBioluminescent cells

Reduced levels of FMNH2due to Reduced Respiration Bioluminescence Reduced or stopped

Biosensori bioluminescenti

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Multidisciplinarietà dei biosensori

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Biosensori futuri

Elemeno di bioriconoscimento

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Ultime pubblicazioni sui biosensori

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World Biosensor Market

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