hplc basic theory

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Macam-macam HPLC

• fase normal

• fase terbalik

• fase terbalik + pasangan ion

• penukar ion

• SEC ( GPC / GFC )

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Fase Normal

Petroleum etherPetroleum ether

CaCOCaCO33

Chlorophyll'sChlorophyll's

ChromatoChromatograph

ColorColor

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Fase Normal

• Kromatografi pertama

– kolom pemisahan: CaCO3

– fase gerak : Petroleum ether

• Kombinasi ini dikenal

fasefase normalnormalKolomKolom :: polar propertypolar property

Fase gerakFase gerak : : non polar propertynon polar property

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Kolom HPLC fase normal

• Silica gel : pemakaian umum

• Cyano : pemakaian umum

• Amino : analisa gula

• Diol : analisa protein

Silica gel

Si

Si

-Si-CH2CH2CH2CN

-Si-CH2CH2CH2NH2

-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)

Modifikasi Si

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Interaksi?

Silica gel (polar)

Ikatan hidrogenIkatan hidrogenNon-polar

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Ikatan Hidrogen

• Jika sampel memiliki gugus– -COOH : gugus karboksil

– -NH2 : gugus amino

– -OH : gugus hidroksil

Ikatan Hidrogen menjadi lebih kuatIkatan Hidrogen menjadi lebih kuat..

• Jika sampel memiliki gugus yang besar,

karena hambatankarena hambatan stereo (stereo (ruangruang))

Ikatan Hidrogen menjadi lebih lemahIkatan Hidrogen menjadi lebih lemah..

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Waktu retensi dan Ikatan Hidrogen

OH

HO

SiOH

SiOH

kuatkuat

lemahlemah

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Peningkatan polaritas solven

0 % 2 % 5% /0 % 2 % 5% / MeOH MeOH

1 : Dioctyl phthalate

2 : Dibutyl phthalate

3 : Diethyl phthalate

4 : Dimethyl phthalate Solven : Hexane

PT DITEK JAYA SHIMADZU

HPLC fase Terbalik

• C18 (ODS)

• C8 (octyl)

• C4 (butyl)

• Phenyl

• TMS

• Cyano

-Si-C18H35

Si

SolvenSolven : : Polar propertyPolar propertyair / metanol / asetonitril

KolomKolom : : Non polar propertyNon polar property

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Bagaimana interaksi?

InteraksiInteraksi

hidrofobikhidrofobik

Non-polar

Solven polar

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Hidrofobisitas

• Jika sampel memiliki

– CH3CH2CH2--- : rantai karbon

– : gugus aromatis

• Jika sampel memiliki

– -COOH : gugus karboksil

– -NH2 : gugus amino

– -OH : gugus hidroksil

HidrofobisitasHidrofobisitas

Jadi lebih kuatJadi lebih kuat..

Hidrofobisitas Hidrofobisitas

jadi lebih lemahjadi lebih lemah..

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Waktu retensi dan Hidrofobisitas

OH

OH

C18 (ODS)

kuat

lemah

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Peningkatan polaritas solven

20 % 30 % 40% / H2O20 % 30 % 40% / H2O

1 : p-Hydoxymethylbenzoate

2 : p-Hydoxyethylbenzoate

3 : p-Hydoxypropylbenzoate

4 : p-Hydoxybutylbenzoatesolven : MeOH

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Pengaruh fase diam

C18 (ODS)

kuat

C8

sampel

sampel

sampel

C4

Medium

lemah

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Pengaruh fase diam

� Kondisi analisa

� Kolom : Shim-pack CLC-ODS

� Fase gerak : MeOH : H2O = 7 :3

� Kec. alir : 1.0 mL/min

� Temperatur : 40 C

� Vol. suntik : 10 uL

� Deteksi : UV-254 nm

� Puncak

1. Methyl benzoate

2. Ethyl benzoate

3. n-Propyl benzoate

4. n- Butyl benzoate

ODS C8 TMS ODS C8 TMS

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Fase Normal vs Terbalik

Parameter Normal Phase Reverse Phase

Polarity of Column High Low

Polarity of Solvent Low High

Elution Sequence Low Polarity First High Polarity First

Increase Solvent Polarity Faster Elution Slower Elution

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Kromatografi Fase Terbalik dengan pasangan ion

Ion-Pair Reagent

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Reagen Ion-Pair

• Anion

– Tetra-n-butylammonium hydroxide (TBA)

• Cation

– Butanesulfonic acid sodium salt (C4)

– Pentanesulfonic acid sodium salt (C5)

– Hexanesulfonic acid sodium salt (C6)

– Heptanesulfonic acid sodium salt (C7)

– Octanesulfonic acid sodium salt (C8)

– Decanesulfonic acid sodium salt (C10)

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Ion PairingSeparation of Carboxylic Acids

Column: Bonded C18

Mobile Phase: H2O/MeOH

1:1 with Tetrabutyl-

Ammonium Hydroxide

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Ion-pair Hal yang penting diperhatikan

• Tipe reagen Ion-Pair

• Konsentrasi reagen Ion-Pair

• pH solven

R-COOH RCOO- + H+

(pKa=4.5)

R-NH2 + H+ R-NH3+

(pKa=6.0)

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Tipe reagen ion-pair

Mobile Phase: H2O/MeOH

1:1,with 0.005M ion pairing

reagent and 1% HOAc

1 Maleic Acid

2 Phenylephrine

3 Phenylpropanolamine

4 Naphazoline

5 Phenacetin

6 Pyrilamine

Hexane Sulfonate Pentane Sulfonate

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Konsentrasi reagen ion-pair

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Penukar ion

N+R

R

R

Sampel

SO3- Sampel

+

++

++

++

+

++++

+

Kekuatan antar ion

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Penukar ion

• Lingkungan biologi

(protein, peptide, amino acid analysis)

• Kromatografi ion

– Penukar kation

• Strong Cation Exchange (SCX) (R-SO3-)

• Week Cation Exchange (WCX) (R-COO-)

– Penukar anion• Strong Anion Exchange (SAX) (R4N

+)

• Week Anion Exchange (WAX) (DEAE)

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Hal yang perlu diperhatikanpada Kromatografi Penukar ion

• pH larutan dapar

• Konsentrasi larutan dapar

• Metoda elusi

– Elusi Isokratik

– Elusi gradien pH

– Elusi gradien peningkatan kekuatan ionik

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Apakah SEC ?

•• Size Exclusion Chromatography Size Exclusion Chromatography

(SEC)(SEC)

– GPC (Gel Permeation Chromatography)

• terutama untuk lingkungan polimer

– GFC (Gel Filtration Chromatography)

• terutama untuk lingkungan biologi

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Prinsip SEC

•• Tidak ada kekuatan interaksiTidak ada kekuatan interaksi

•• Perbedaan waktu tempuhPerbedaan waktu tempuh

PT DITEK JAYA SHIMADZU

Hubungan antara MW dan RT

Berat molekul(LogMW)

Kolom

GPC

Batas eksklusi

Batas permeasi

Waktu