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Introduction à la virologieMICROBIOLOGIE DCEM-1

ANNEE UNIVERSITAIRE 2008-2009

Nicolas LEVEQUE

CHU Robert Debré-Laboratoire de virologie

Mail : nleveque@chu-reims.fr

Introduction à la virologie

• Qu’est-ce qu’un virus ?

• La réplication virale

• Modes de transmission des infections virales

Qu’est-ce qu’un virus ?

« Les virus sont les virus » A. Lwoff 1957

20 à 200 nm

Les virus

• Entités nucléo-protéiques (ARN ou ADN)• Comprennent toujours au moins deux éléments: le

génome et la capside (boite)• L’enveloppe dérive de la membrane cellulaire• Ne se multiplient pas de manière autonome

(réplication) parasites intra-cellulaires obligatoires

• Absence de croissance

Structure Schématique

Génome(ADN ou ARN)

Capsideprotéique(capsa)

+Nucléocapside

(core)

=

Virus nus

Enveloppe(péplos)

(bicouche lipidique)

+ =Virus

enveloppés

Nucléocapside(core)

Le génome viralUn virus = information génétique limitée

• ARN = fragile d’où une taille limitée- 7 kb pour les Picornaviridae et les Astroviridae à 30 kb pour les Coronaviridae - cas du virus de l’hépatite delta (1.7 kb)

• ADN = plus complexes- de 3 à 300 kpb- capacités de codage très différentes: de 4 gènes pour le VHB à plus de 80 pour HSV

• Structure protéique d’origine virale (une ou plusieurs protéines polymérisées)

• Protège le génome nucléocapside

• 3 organisations symétriques– hélicoïdale– cubique ou icosaédrique– complexe

La capside

De symétrie hélicoïdale

Virus de la mosaïque du tabac Paramyxovirus

De symétrie cubique

De symétries complexes

Symétrie cubique

Symétrie hélicoïdale

Certains bactériophages

L’enveloppe virale ou peplos

= Bicouche lipidique provenant du système membranaire cellulaire

+ Protéines /glycoprotéines virales

Elément de fragilité (température, dessiccation, sucs digestifs…)

Enveloppe cuirasse

= tendon d’Achille

L’enveloppe virale ou peplos

Impact sur l’épidémiologie

• Grippe : Transmission directe et rapprochée

Favorisée par l’air humide et froid hiver

• Poliovirus : transmission fécale-orale (mains sales, eau ou aliments souillés)

Classification des virus

Repose sur la structure des virus et non sur le pouvoir pathogène

• Nature de l’acide nucléique (ARN ou ADN)

• Conformation de la capside (tubulaire ou cubique)

• Présence ou absence d’une enveloppe

• Rencontre virus/cellule production de nouveaux virus = réplication

• Phénomène complexe machinerie cellulaire détournée

• Certaines étapes spécifiques du virus cible pour molécule antivirale

Multiplication des virus dans la cellule

Virus = parasite intracellulaire obligatoire

• Information génétique : ARN ou ADN

• Matière première : Acides aminés, acides gras, sels minéraux

• Source d’énergie : ATP

• Accélérateurs biologiques = enzymes

Multiplication des virus dans la cellule

Les différentes étapes du cycle de réplication

Multiplication des virus :L’adsorption

• Contact virus/cellule

Protéines de la capside

glycoprotéines de l’enveloppe

• Récepteur cellulaire

tropisme d’hôte (grippe aviaire)

tropisme tissulaire (CD4 et VIH)

La pénétration :Les barrières cellulaires rencontrées

au cours de l’infection

Cytoplasme

Glycocalyx

Membrane cellulaire

Réseau d’actine

Milieu extracellulaire

• Retarder la détection par le système immunitaire

• Conditions optimales

→pH, protéases, thioloxydases

→Adressage cellulaire

• Préserver l’intégrité de la membrane cellulaire

Pénétration et décapsidation

Fusion

Virus enveloppés

Lyse/perforation

Virus non enveloppés

o

Pénétration et décapsidation

Expression et réplication du génome viral

• Réplication : duplication du matériel génétique

• Informations contenues dans génome viral traduites en

– protéines non structurales (enzymes, …)

– protéines structurales (construction de nouvelles particules virales)

Réplication des virus à ADN

Réplication des virus à ARN

Virus à ARN positif : ARN (+)

ARN génomique directement messager

synthèse protéique

ex : virus de la poliomyélite

Virus à ARN négatif : ARN (-)

ARN génomique pas directement messager

transcription de l’ARN(-) en ARN (+) nécessaire

ARN polymérase ARN dépendante (transcriptase)

ARN (+) synthétisé sert d’ARNm

Rétrovirus

ARN

ADN simple brin

ADN double brin

ADN proviral intégré

RT

RT

intégrase

ARNARN

HémagglutinineHémagglutinine

NeuraminidaseNeuraminidaseAnticorps Anticorps Acide sialiqueAcide sialique

Glissement antigénique

Multiplication des virusLa réplication

Multiplication des virus

L’assemblage Encapsidation du génome viral

La libération hors de la cellulePar éclatement cellulaire pour les virus nusPar bourgeonnement pour les virus enveloppés

Modes de transmission des infections virales

Modes de transmission des infections virales

Modes de transmission des infections virales

Modes de transmission des infections virales

Modes de transmission des infections virales

• Transmission salivaire

• Transmission par contact cutané

Lutte contre les infections virales

Mesures d’hygiène : Last but not least

Diagnostic des infections virales

Pourquoi faire du diagnostic en virologie ?

Pourquoi faire du diagnostic en virologie ?

Dons de sang, d’organes et de tissus (dépistage obligatoire)

Suivi biologique des infections (VIH, VHB, VHC)

Mesures prophylactiques et contrôle des épidémies

rota et VRS en pédiatrie - grippe

Etudes épidémiologiques (prévalence, réservoir, mode de transmission)

Preuve de l’origine virale d’une infection

+++ chez immunodéprimés

Décision thérapeutique

développement des antiviraux

• Recherche des anticorps = Sérologie = Diagnostic indirect

• Recherche du virus ou de ses constituants = Diagnostic direct

= approches complémentaires (fonction du virus recherché et de la clinique)

Plusieurs approches

L’analyse comprends plusieurs phases : Prélèvement = phase pré-analytique Choix de techniques et réalisation = phase analytique Validation et interprétation

Phase pré-analytique : le prélèvement

1. Choix des prélèvements à effectuerSelon la clinique (toute lésion accessible doit être prélevée)Porte d’entrée, sites de multiplication et/ou d’excrétion des virus recherchés

2. Réalisation des prélèvementsImportance +++ de la qualité du prélèvementDoit être réalisé le plus tôt possible après le début des signes cliniques (multiplication +++ pendant phase d’incubation)

3. Acheminement des prélèvements au laboratoireMilieux de transport pour virologie (+++ pour culture de virus)Transport rapideSécurité

Importance des renseignements cliniques transmis au virologue avec le prélèvement

Diagnostic indirect = sérologieDiagnostic indirect = sérologie

Recherche des anticorps

ELISAELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) : substrat

développé pour tous types de virus, automatisable, adapté à de grandes sériesdifférencie IgG et IgM

Diagnostic virologiqueLa séroneutralisation

SérologieSérologie

+++ Pour diagnostic des primo-infections

= apparition des Ac entre deux sérums d’un patient

2 sérums : sérum précoce (neg) – sérum tardif (pos)

Pour définir le statut immunitaire vis-à-vis d’un virus

= savoir si un patient a déjà rencontré un virus précis

(Ac pos) ou non (Ac neg)

1 sérum

Diagnostic directDiagnostic direct

Recherche du virus ou de ses constituants :

• Détection d’antigènes – techniques immunologiques

• Détection de génome (ADN ou ARN) – biologie moléculaire

• Détection du virus entier – culture virale

• Observation des particules virales (microscopie électronique)

Si résultat positif avec clinique concordante

= preuve de l’implication d’un virus dans une infection

Détection des antigènes du virus : IF, ELISA

Techniques simples et rapides à mettre en œuvre mais manque de sensibilité

Mise au point des anticorps monoclonaux en 1975-1980

Détection :

• Ag dans des cellules (immunofluorescence)

• Ag libre ou libéré (ELISA ; agglutination ; immunochromatographie) -

contrôle de la spécificité de la réaction +++

selles (rotavirus, adénovirus)

pvts respiratoires (VRS, grippe, rougeole)

lésions cutanéomuqueuses (HSV, VZV)

Diagnostic direct : Diagnostic direct : détection du génome

DNA polymerase

PCR = polymerase chain reaction= polymerase chain reaction

Très nombreuses copies de l’ADN

…

30 x 1989

Méthodes actuelles automatisation

extraction automatique de l’ARN (Easymag….)

automates de PCR (TaqMan, Light Cycler, Smart Cycler)

Diagnostic virologiqueLa RT-PCR entérovirus

Sample in, answer out

… « La Révolution GeneXpert »…

Diagnostic virologiqueLa RT-PCR entérovirus

HSV dans LCR pour méningo-encéphalite

(urgence)

CMV : PCR quantitative (greffés de rein)

VIH : PCR qualitative (dépistage chez nouveau-né)

et PCR quantitative (charge virale pour suivi

thérapeutique)

VHC : sérologie + PCR

Diagnostic direct : Diagnostic direct : détection du génomePrincipales applications

Equipement +++

• hotte à flux laminairehotte à flux laminaire

car manipulations en environnement stérile

• MicroscopeMicroscope

• Incubateur Incubateur à CO2 à CO2 … …

Diagnostic direct : Diagnostic direct : culture de virus

Technique de référence Virus = parasites intracellulaires obligatoires

Ne peuvent se multiplier que dans des cellules vivantes

animal (Coxsackievirus A types1 à 6) œuf de poule embryonné (virus de la grippe, poxvirus) cellules en culture in vitro

Importance d’un transport rapide jusqu’au laboratoire pour conserver le

pouvoir infectieux du virus

Dans milieu de transport = MEM + protéines (SVF) + tampon + ATB

Diagnostic direct : Diagnostic direct : culture de virus

Diagnostic direct : Diagnostic direct : culture de virus

Microscope électronique

Virus du SARS

Virus herpes simplex (HSV)