laboratory chemicals-fujifilm wako chemicals …...hybridization at 68ù for 16-20 hr. hybridization...

Post on 10-Aug-2020

2 Views

Category:

Documents

0 Downloads

Preview:

Click to see full reader

TRANSCRIPT

�������� �����

� ���� �

���� ������ � �����

���� ��� ���������

������� ������� ������

���� ��� �� ��� ��� �� ����

� ����� �� ���� �� �

�� ����������������������������������

�� � ���� ���������������������������

�� �� �� � �� �� ���� ��� ��������� �� ���� ��� ��� ��

�� �� ��� ��� �� �� �� ���������������������

�� �����! ���������������������������

�� �������" #�� ��"� $ %�� �����������������

�� ���� ��� ��������� �� ���� ��� ��� ���������

&

�� �'������� ����'����������������������

&

�� (� ������� �� � �� � �� �����������������

)

*� (� ������� �� ��� � �� �����������������

+

,� -.���/��������������������������

0

� $ '���" �� �.��� �� ��� �. ���" 12�� � ��" �� ���

0

&� �'�"����� �� ������� � ���������������

�3

)� $ '���" �� � '���! �� ��� �. 41���" �� � ������3

+� 5� � �� ������� � ��� 6 �!� -�'�� ���� 7������

��

+2��4��"����� ���! �����" ! � �������������

��

+2��$ ��"�������������������������

��

�� $ � � � �������������������������

��

� 8 �� ��������������������������

��

� $ "�� � (����������������������������

��

��� ��1 6�"�� 5���� �� �� 41� �' ���7����������

�*

�� ���������������� �.���/���� ' ���� � � ��� ���" � ��%� ���� ���" �

�� � ���. �� ���' �� �� ! � � ���� �� �� ��"". 1�� �� � � ��

���� �� "" �.� �� �� � �� � ���! � �"����!� � � ��" ' ����� ��

� ���� � ���" ���9 ��������" ��� ��� � ��� � ��� � � ��" ��������

��� �� "����2�� ��� 9 �' 2����'�! ��� � ���"". � '����!�

4� � � �'' ��"". ���"��" ��������� �� � %�� � � � ��" ������ ��

�.���/���� ��� ��� � ����� , ��.�� 4�� �"". � ��� �� �� ��� � �� �

��� ��� � ���� ���' '$�� � �. �' � ��� �� �� ��"� � ��

�� � %� � � � �� � ���' �� � ����

���� ��� ��������� �� ���� � �� 1 "" �� ' ���� ��� � ��

::���" 12�� � �� � �! ����;; 6����79 ��� �� ��' � ��������"

��������� ' ������ �� �� � �� �� ���� ��� ��������� ' �����

� �� � �� � �� �!�� �� ����9 � �� � ��� ��� � ��� �� �� ��� �

���' ��� 8����. ���' �� ��� �.� � �� ���� � �� ""� � �! �'2

��� �� ��� � �.���/����9 �� �.��� �� ��� ���' � �� � ��� ��� �

���� �� �! �� � �. ���" 12�� � ��" �� � ���"".9 �� � '���!

�� ��� �� � '�� � �. 41���" �� ������� ��. ��.��" � ����2

���� ��� ' ���� �� ��". ���" � �� ��� �� ! � � ���� �� ��"".

1�� �� � � � �� � ���9 ��� � ��". ���2��. �����

� ���� �

�� ��������

� �������� � �� ��� ��� ���� ���� �� ��������

������ ��� ��� �� ��� � �������� � �� ��������� � �� �����

� ���� ���� �� ���������� ������

� �� � ���������� ��������� ��� ������� ��� � �� ������� ���

������� ��� ����������� ������ ��� ������ ���� ��� �� ������ ����

����� �� � ���� ��� ������� ������� � � ����

� ���� ����������� �� ������ ��� �����

���� ���� � �� �������� � � ��� ��� � ����� �������� ��� ��������

�� � !��� �"������ ���� �# $%&� ���� � ��� "����������

���� ��

� ���������� �� ���� !�������� �������� ��� " ���������

����������

���� '�� � �� � � ��(���� �������� �������� � � � ��� ���� �� ���

��� ������ �� ����

� ���� ������������

�� �� ������ ��� �� ���� ���� ��� � � &� ��� ���

� ��� ���� �����������

�� ������ #� $������� �� ��� � � �� ��������� %�� &�'�

���������

PrepPreparation aration of Tof Testerster ss ss cDNA cDNA PrepPreparation aration of Driver dof Driver ds cDNA cDNA

Step VII-2 ( ) Step VII-3( )

HybriHybridizization of Tation of Tester ss cDNAster ss cDNA an and Driver ds cDNAd Driver ds cDNA

Step VII-4( )

Digestion ofDigestion of hybrid ds cDNA hybrid ds cDNA

Step VII-5( )

AmAmplification of residual Tplification of residual Tester ss cDNA ster ss cDNA

Step VII-6( )

Digestion Digestion of of residuresidual ss cDNAal ss cDNA

Step VII-7( )

Subtracted cDNA Subtracted cDNA

Your cDNA library is

amplified with one-side 5'-

phosphorylated primer. The

tester ds cDNA is digested by

Lambda Exonuclease to obtain

ss cDNA for tester.

Your cDNA library is amplified

and digested by Rsa restriction

endonuclease to obtain Driver ds

cDNA.

Hybridize with Tester ss cDNA and excess amount of Driver ds cDNAs

Digest hybrid ds cDNA by duplex-specific nuclease

Amplify Tester ss cDNA with the same primer set which is used

in preparing for Tester ds cDNAs.

Digest remaining ss cDNAs by Exonuclease I

p7 p8

p9

p9

p9

p10

� ���� �

’’

’ ’

Lambda Exonuclease

’’

’ ’

’’

’ ’

Endonuclease Rsa I

’’

’ ’

’ ’

’ ’

Denature and hybridization

’ ’

’ ’

’ ’

Duplex-specific nuclease

� ���� �

’ ’

’ ’

’ ’

DNA amplification

’’

’ ’

’’

’ ’

’’

’ ’

Exonuclease I

’’

’ ’

’’

’ ’

’’

’ ’

Purification

’’

’ ’

’’

’ ’

’’

’ ’

Subtracted ds cDNA

Cloning

� ���� �

�� ��� ������� � ��� ���

�� ��������

� � ������ ��������� ��� � ����

��� �������� ��������� ������ ���� � ����

��� ������������� ������ ���� � ����

��� �� ���!� ������ ������� ��� � ����

��� ���� ���!� ������ ������� ������ ���� � ����

�"� ���������� ��� � ����

�#� ������������������ ���� � ����

�$� ��%��%����� ���� � ����

�&� '� '���� ���� � ����

� �� � ��(� '���� )������* � �+� ����� � ����

�� ������

,%�� -�� �� ����� �� ���� �� ����.���� ���!���+ )���� ��/*

����� -�� �%� �� ��� � �%� -�� ���� �%� ���0�/ ���������+

����

� � ������ ���������

��� �������� ��������� ������

��� ������������� ������

��� �� ���!� ������ �������

��� ���� ���!� ������ ������� ������

�"� ����������

�#� ������������������

� � ��

�$� ��%��%�����

�&� '� '����

� �� � ��(� '���� )������

�� ���������� �������� ��������������� �

� ��1) ��������� �� ������ �� ���.�� ��1)

�� 2������ �� ������ �� ���.�� ��1)

�� 2������ �� ���� /��� ��+/+ 3)2��*�!�����

�� ����� �� �1) �� ��������

�� �1,2 4������ � � ���(� �),2* �,,2* �5,2* �3,2 ���%�

"� ' � 5����� �� �0 4������� 6��/%� � &�! ��� �* 3��!��������

� � ����

#� 7�������� ��������� ���� �� �� $!���& �

$� 2%��(5%�����(8����� )��%� ���9��9 .�(.��

&� #�:* &&+�: ��%��

�� �1) ���� ������� ���-��

� )/����

�� ��%����� ������

�� �,)� ������

�� ����/ ������

�� '������ ��������� 0����

� ���� �

�������� �

��� ��� ��

��� � ������� ��� ��

��� � ���� ��

��� � �� � �

��� ����� � ��

��� ������ � ���

��� ! �� "�# � ������� ��� $��� � �%&'�� ���& ��&��� � ��

�(� )�* "�# ���� ���$��� �+� ��� � �& "* �� �����

�%� ,������������� $-.��� ���

�'� !�� ���/ $(�0����

��� � � �� ���������" " ��������"

�� � �� ��������� �� ����������� ������� ����������

� 1� �� �.23 � ��� ��� �"��& �"��# �.23" "����# ��+ ��

"�� �� ���� �� ��� �"� �� +����4

� ��� �� ��" ��� �� ������� �� �� �"�� ��# #� +� �.23" ��

#" ��# ���� ��, �� �� +���� �� �� ������� �� �#����� " �

�� �.23"4 1� "����# ��� �# ���� �� �� �� �� ��" ��� �"��

�.23 " ���"���� ���# �� �� '50��� ��� ��� ����� �� " ���0

"����## �.23 ���� #���0"����## ��� ���#���"4 6�� ��

�" �� #� +� �.23 ��# �"�� �.23 � ��� *� �� *� ����#

��� "�� +����& � "����# ��� �# ���� ��� �� ��" ��� ��0

�� � ��� �� �� #� +� �.23 *� #" ��# � �" # �� ��" ��

��� �� ��" ��� ���� � ��� �� �� �"�� �.234

� ��� � # �� ��" ������������� �� ������ ��� �+� ���

�" �" �� #����� �� ��� ��� ��� # �� ���������" " * ��

� + "�� "������ �"���"4

Primer 3

P-5TesterPrimer 15' 3' 3'

Primer 4

Primer 2

Driver 5' 3' 3' 5'

'

� ������� �� �� �� �� �� "� ��� ������� ��" " �"��� �� +���0

�� �� "������# �.23"4

� 1� �� �" � �����0"��� ��� ���"& * ������# �-�-0

�37 .23 ��� ���"& *� �� " � �� � #� � ��# �����0"���

�8 � * �� �� � ��0 � 99��� "����55 �����"4 �� �����* ��

����#��" �� ��� � 8# * �� �-�-�37 .23 ��� ���"4

� �� ������ �� �� ���� � # .23 ���#��� #��#" �� � ��� 0

���" ��# � ������ � ��� �"#4 3+� # �+� ���� � ��� �� ���0

� �� ��� � "������ ��4

� �"�� �� �� �#������"" �� ��� ����� �# � �� " / �4

� ��� ��" �� ,� � ����� �� :�0� ����� �� "� � ������ �� �0

;� �# ��� ���+�� �� �� ��" ��# "���� .23 �������" ��*

��� � � �� "������ �� ����""4

1� �� " ��������& * ����� �� ��� ���" ��� � ���� �� �" ��

"���� �� .23 ���� � ��� �� ����#"4

� ���� �

�� ��������� � ����� �� ����

� �� � ������ ���� �� �� ��� ������� ������

���� ������� ��� ������ ��� ��� ����

�� !��������� "���� ���� # �$� %�& '���

�� �$� ��()� '��

)�� �� � ����* ������������� ���% '��

)�� �� �'+*!���!����������� ���% '��

(,),(�- ��� )�� ����� ������ ��. �� �������� "����� /��

������� ����� �� �����

)�� �� � ��� )�� �� ��0���� ��!��� �� 1����� ��0����2 ��

��� 1����� ��� ����������� ��� ���� ������� ���� ��� !3& 1��*

���� �� ��� !3&$%�. 4������ ��� 5�1���� )�� ��2

� ���!���� ��� �� ��� �������� ������ ���� ���� �� ' )&5*���� 2

� � !��� ��� ����� ���� ��� ������������ ��������� ��� !��*

���6����� �� �� ��� �� !������� ����� ����2 (���� �� �� ���

������ ��� ��� ��������� ���� ��� �� ����*���� �2 �

����2

7'� ��2

7'� � ���2

'��#�� .� ���2 ��# �����

8 � ��2

8 � ' ��2

� &���� ���� �������� ����� �� � ������������� ���2 ��� ���

�� �� !���� � �������� ����� � ����� � '� /�� 1�$1�� ���

�� �� 1�����2

� &�������� �� �/���� �! ��9�9����� ��� . ����� �� ��� �� *

!������2

� (������� ��� �!�������� �� � ��� ��� ��� ��� ��� �� :�������*

���� ���� �� . �$� ;��� ������� ��� '��� �� 772'<

������2 %�� �� 1�����2

� &�������� �� �/���� �! ��9�9����� ��� ' ����� �� ��� �� *

!������2

5���� ��� !��� ���� �'��� �� 8�< ������ �� ��� �� !���*

���2 5� �1� ��� �!�������� ��� ��� ��� !��� �� ��� �� ���

���2 �����1� ��� !��� �� //�� �� ������� �����2

��� '�� �� ����� ��� :�������� "���� ��� ��� �� �� �*

�� :�������� ��� �� �����2 (������� �� ��� ��� )&5 ���

��� ������� ��� .� ����� �� .8�2

� ������� ��� �' ����� �� 9�� �� ������1��� ��� �� ��� :�*

�������2

� (������� �� ��� ��� ������������� ��� ��� ��=�� ��� ����

1� � �� ����� ���� '��� �� ������� �����2

���� �� ��� �� !� �� ;!�� &����� �� ��� ��*��������� �!��

�� � ��� �� �1� �� ��* �����*������ ���2

� &�������� �� 8���� ��� ' ����� �� ��� �� !������2

� %����� ��� ,� #� �� � ������ �� ��� ��� ���� ;!�����!���� *

���� �� ������ ��� ������������� �� ��� (����� �� ����2

��� ������������� ���$��� � ,� #� 1�� �.8��$ ��������

�,� #� � .8�� ����� ������ ���$ �

� ���� �

� ������� � ��� �� ����� �� ���� ���� ��������� ������

������ � �� ���

�� ��� ������������� �� ����� �� ���� �� ��� �� ������ ��

��������� ��� ������������� !" ������� ��������������

�� ��������� � ���� �� � ��

� �� � ������� ��!� ��# �� ��� ��������� �����$

���� �!���" ��� ��% ��� ���

&�������������� '����� ���� ( ���� )�*�& +%�

�% ���� �� �� +�

������ , �%�) +�

������ - �%�) +�

.�. �/ ��� ���"������ �������� �$, �� ���������� '������ -�

��������� ����� �� �%%�

������ , ��� ������ - ��0����� ������ �� 1����� ��0������ ��

"��� 1����� ��� ����������� ��� ���� �!���" ����� ��� �2*

1����� ��� ��� �2*)�, 3������ ��� 4�1���� ������� 5���

"�� ��� ��� ���1�� ���� ��� ������ ���� ��!���" ����� ����

������ ���� ���� 1����� �� ������ !� ������� ���� �*4 ������� ���

������������� �� ���1�� ���� ���� �������� �� ������ ������� ��

�*4 ������� ��� ������������� �� ������ �����

� �������� &%� �� ��� �������� �������� ���� ���� �� + �*4 ��!�� �

� ������" ��� ����� ����� ��� ������������ ��������� ��� ���"6

����7����� ����� ��� ������������ ������ !����� ���� ����� ���

�����!�� ��� &%� ��������� �����!��� �� ����6������ %�& �

��!���

8+� & ����

8+� &% ����

+%�(%� ,% ���� ��( �"����

9&� & ����

9&� + ����

� ��� �%%� �� ������$����������$�����"� ������� �&+$&-$�

1��1��� ��� ��# !" 1����#�

� *��������� �� �- %%% ��� ��: :%%��� ��� , ������� �� ���� ���6

���������

� ������� ��� ����������� �� � ��� ��!� ��� ��� �� �� ;���6

�������� �%� �� ,��� ������ ������� ��� &+%� �� 88�+<

�������� )�# !" 1����#�

*��������� �� �- %%% ��� ��: :%%��� ��� + ������� �� ���� ���6

���������

4���� ��� ������ ���� �+%� �� 9%< ������� �� ���� �������6

����� 4���1� ��� ����������� ��� ����� ��� ������ �� ��" �� ���

���� ������1� ��� ������ �� --� �� ��������� ������

� ��� �� ��� ������ �� ���� *������ �� ��� ���6���������� ����

������ ��� ����1�� �� ���6���������6������ ����

� *��������� �� 9%%�� ��� + ������� �� ���� ������������

��� +� �� �%�) '����� ��� �� �� ����� )�# �����" ��� ��6

��!��� ��� & ����� �� ,9��

� ������1��� ��� ��� ����������� ������������ ��� &% ������� �� :%��

� ���� �

� ������ ��� ��� ��� � � ����� ���� ��������� �����

� ��� ����� � ������������ ��� �� ���� ��������

����� �! "� ����!�

� #�������$� � ��%��� �� ��&%&���$ �� ' ������ � � �� (

��������

� )������ ��� ��������� � ��� ��"� �� �� ��� � *������(

��% ���� � ' ��� +��� ������ �� ����� � ,,��-

������ .�! "� ����!�

� #�������$� � ��%��� �� ��&%&���$ �� ' ������ � � �� (

��������

� /���� ��� ������ ���� ����� � 0�- ����� � � �� ���(

����� /� �� ��� ��������� �� ��� ��� ������ � ��� �� ���

��� 1������ ��� ������ �� ���� � ��������� �����

� .����� ��� 21�3� � ������� � ��� 14� ���� +�������� (

���� � ������� ��� ���������� � ��� 1����� �� �14��

14� ���������� ��$��� � 21�3� ��������$� �� �������

�21�3� � ���$ ��"�� ����� 14�� ��

� 5����� ��� �$��� � 1����� �� �14� ���� ��������� �����

+ ��� � �� �$

6� 14� ���������� � 1����� �� �14� �� �� �� ���% ��

��� ��� 14� ���������� "� ����� ������������

�� ����������

��� ��� � )����� �� �14� �� �$ % ��� � 1����� �� �14� ����

�$ �� ��� � ��7�"����8��� 9����� � 5#/ ��"� � .�!

$������

������ �� ��� ������ � ��� � � ���

6���"�� �� � ������ � ,&� �� ��"����8� �� �3(�� ���� �

3&��

�� ������ �� ������ �� ���� �� ��������������� ������

��� ��� � �������� ��1����!(�������� ������� 9����� � 3&

� � 7�"����8��� ������ �3&� �� +��� �� .�! $����� �� ��(

��"�� �� �� ������ � 3&��

��� ��� � 1����!(�������� ������� �� ����"�� �� '�

������ � 3&��

� ��� ���� � +�� +����� �� ����"�� �� � ������ � 3&��

������ ��� ��� ��� � � ����� ���� &��� � ��������� �����

� ��� ����� � ����� � ������ � �� �� ���� ��������

����� �� �! ���� ����!�

� #�������$� � ��%��� �� ��&%&���$ �� ' ������ � � �� (

��������

� )������ � ��� ��������� � ����� ��"� �� �� ��� �

*������ ��% ���� � ' ��� +��� ������ �� ����� �

,,��- ������ .�! "� ����!�

� #�������$� � ��%��� �� ��&%&���$ �� � ������ � � �� (

��������

� /���� ��� ������ ���� ����� � 0�- ����� � � �� ���(

����� /� �� ��� ��������� �� ��� ��� ������ � ��� �� ���

��� 1������ ��� ������ �� '��� � ��������� �����

� ������

�� ���������� �� �������� ���

� �� � ������ ���� �� �� ��� ������� ������

��������� ����� ����� ���� !�"

#�� ���������� $���� ���� % �&" '�(# �)�"

!) �&" ��*+� ��"

+�� �� !� !)�' ��"

+�� �� #� !)�' ��"

*,+,*�- ��� +�. ����� ������ !� �� !������� ������ /�"

*��� 0� � !))�"

+�� �� ! ��� +�� �� # ��� ��� �� � ��� ��� ��������� ��� ���

*����� ���� �� ���� !1

� �������� #)�" �� ��� �������� ������ ���� ���� �� � +(2 ���� 1

� � ���. ��� ����� ���� ��� ������������ ��������� ��� ��.�

���3����� �� �� ��� �� �������� ����� ����1 *���� �� �� ���

������ ��� #)�" ��������� ���� ��� �� ��������� )1# "

����1

4�� # ��14�� #) ���1�)�%)� ) ���1 � � �.���5#� # ��15#� � ��1

� (���� ���� �������� ����� �� � ������������� ���1 ��� !))

�" �� �������������� ����� . ����� �#��#/�! 0�&0�� ���

�� ���� 0�����1

� (�������� �� !/�))) �� �!6�6))��� ��� ����� �� ��� �� �

�������1

� *������� �� ��� ���������� �� � ����� ��� ��� ��� !�" ��

7������� ���� !)�" �� �&" ���� ������� ��� #�)�" ��

441�8 ������1 '�� ���� 0�����1

(�������� �� !/�))) �� �!6�6))��� ��� � ����� �� ��� �� �

�������1

2���� ��� ���� ���� !�)�" �� 5)8 ������ �� ��� �� �����

���1 2� �0� ��� ���������� ��� ��� ��� ���� �� ��. �� ���

���1 �����0� ��� ���� �� //�" �� ������� �����1

�� ������ �� ���� � � �� ��� �� ��� ������

� ��� �� //�" �� ���� ������ �� ��" �� !) � 7���������

$���� ��� !�" �� 7���������1 '�� ����.1 *������� �� ���

��� +(2 ��� ��� ������� ��� ) ����� �� 5�1

� ������� ��� !� ����� �� 5)� �� ������0��� 7���������1

� "��� �� ��� �� �� �� ���� (����� �� ��� ������������ ����

�� � ��� �� �0� �� ��� ������������ ���1

� (�������� �� 5))�� ��� � ����� �� ��� �� �������1

� '����� ��� ,�#%) �� � ������ �� ��� ��� ���� ������������ �

���� �� ������ ��� �������������1

�� �� �! ���

��� ������������� ���&�"� � ,�#%) 0����)��& "�������

!,�#%) � �)�� ���� ������ ���& "1

� ������

�� ����� � �� ��� �� ����� ����� ����� ������

��� ������ �� �� �� ��� ����� � �� ���� ������� ���� ���

��� �������� ���� ���� ����� �� ����� ������ ����� ������ �������

������ �� �� ��������

����� ������ �����! !��� �� "�� ��!��� �������� !��� ��

����� ���� ���!��� �� ������� !�����

#��� � ������������� �������� ��� ��� ����$������ ��� %&���

��� '� &����� �( �� ��� ��$������ �� %&����� )( ��� ��� ����

�� ��� ��������! �� ���

���� ��� �� ��� !� � ��� �� ����

�� %' �!( &����� '�� �� ) �'�*

�������������� +����� ���� , ����-* .!/�� '0�*

'0 ����-* ��� '�*

&���� ������� '0�. '�*

�������� ������� '0�. '�*

�1�1�2 � ���������� % ����� '3) �� '��������� +�����( '�*

������� ����� �� �0�*

�/4 ��� �������� ���� ��� ��������! ����������� ��� �/4 ��� ����

���� �����5� $� '�06 �!����� !�� ����������������

� ������� ��� ��������! ����� ��� �� ������� ��

78� � ����

78� �0 ����

80�,0� )0 ���� ��� ������

9�� ' ����

9�� � ����

��"� #��� �

"�!��� ' ����� ���� �$����� $�� � ���� ���� ����� �� ������ ��

����$������ �� �� �� ��$������ ��� ��� ������ ��

���� ��� ��!���������� ������� ����� ��$�������� �������

���� �� "� ��� ��������� � ��� ������� ��!!��� ���� ��� ��$�

�������� ����� ��� �� ���� �� &�$�������� :�� ;� � ��

���� ����������

HepG2 cDNA

GAPDH GAPDH 100bp SL

1,500bp1,000bp

1%

GAPDH glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase

Subtracted cDNA

Agarose S

AFP : alpha-fetoproteinGAPDH : glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

931bp859bp

AFP AFP GAPDH AFP

Normal liver tissue cDNA

�� #��������<���� ��� �� �� +�! ������ #� �� &����!���� � &�� =�!���� *� *��

:����� ��� �� *�� :�5����� �� =� +�� .��5� .� =�� .����� ������� #��

.���5� *� *�� *� ������ &� � �� &��!��� �� ��� ����� ���� ���

��>)� %)( 3 �)9� %�00?(

�� $����������� �� �� ������$�� �� ���������� ��� �������������� ��������������

�������� ���� "�� ���������� ��� �� ���� ��� ������ ������� ;� � ����

/������� @� ������������� �� &�$�������� :�� ;� � �� ������ ��� ��!�

� ������

�� ������� �����

���� ������� � �� �������� ������� ����

��������� ������ �� ���!"��� � ��� #���

��������� ���� $������ %�� &�' (����#��� ����)� *� �#+�

,�����*�� ��� � ��� #���

��,�*�*�� -�� (�.�#��/ (����#��� 0�����! 1��-� �* "&

,�������� �)����2$)����%��"23 ��"!� ����)�� 4*�5*�5�6 *�� "&

������**� 7�)���� 4���6/ (����#��� 0�����! 1��-� ��� "&

��������� 1�!�����/ (����#��� 0�����! 1��-� ��� "&

,�*������ 7�)��)��"��� �* "&

*�8�8���� ���+� �� ���� &�--�� 4������+�6 ,���

,�*�����, ����� � � �����

,�,����,� ��� ��7 ��� "&

,�����*8� 8� &��-��� 0#%%�� ������ �!� � "&�,

,�������� 7�)�-�#" 0��"�-� ���#���� �� "&

,�8������ �� �����- �����/ ��������-/ ������� ��� "&

� ������

�������� ��� ���� �� ��� ������������

←←

(1) Preparation of Tester ss cDNA

Amplified cDNA Library (16 cycles : 10 ng) : 100 LPhenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) 100 L

14,000 rpm (18,800 g), 3 min. R.T.

Sup.

Sample 1 (1 ng)

Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% Ethanol 250 L

←←←

14,000 rpm (18,800 g), 5 min. R.T.

ppt.

70% Ethanol 150 L←

14,000 rpm (18,800 g), 2 min. R.T.

ppt.Air-dryDistilled water 44 L10 Lambda Exonuclease Buffer 5 LLambda Exonuclease 1 LVortexIncubate at 37 30 min.Incubate at 80 15 min.Distilled water 50 L

←←←

Removal of low-molecular-weight DNA

700 g, 5 min. R.T.

filtrateMeasure at OD260 nm

Tester ss cDNA (1 ng/ L)

(2) Preparation of Driver ds cDNA

Amplified cDNA Library (16 cycles : 10 ng) : 100 L

Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% Ethanol 250 LVortex

←←←

14,000 rpm (18,800 g), 3 min. R.T.

Sup.

14,000 rpm (18,800 g), 5 min. R.T.

ppt.

70% Ethanol 150 L←

14,000 rpm (18,800 g), 2 min. R.T.

ppt.Air-dryDistilled water 44 L

Vortex

Vortex

← Phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) 100 LVortex

� ������

(4) Digestion of the hybrid ds cDNA by Duplex-specific nuclease

Sample 2 (1 ng)Measure at OD260 nm

Driver ds cDNA (100 ng/ L)

(3) Hybridization

Tester ss cDNA (1 ng) 1 LDriver ds cDNA (200 ng) 2 L

Mix

4 Hybridization Buffer 1 L

Heat at 98 for 2 min.

Hybridization at 68 for 16-20 hr.

Hybridization solution at 68 4 L

2 Duplex-specific nuclease Buffer 5 L68 , 10 min.Duplex-specific nuclease 1 L68 , 30 min.Stop Solution 10 L68 , 5 min.Distilled water 80 LPhenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) 100 L

14,000 rpm (18,800 g), 3 min. R.T.

Sup.Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% Ethanol 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 5 min. R.T.

ppt.

70% Ethanol 150 L

14,000 rpm (18,800 g), 2 min. R.T.

ppt.Air-dry

Distilled water 31 L

DNA amplification step

Vortex

Removal of low-molecular-weight DNA.

700 g, 5 min. R.T.10 M Buffer 5 LRsa 1 LIncubate at 37 2 hours.Incubate at 80 20 min.Distilled water 50 L.Phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) 100 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 3 min. R.T.

Sup.Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% Ethanol 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 5 min. R.T.

ppt.

70% Ethanol 150 L

14,000 rpm (18,800 g), 2 min. R.T.

ppt.Air-dryDistilled water 10 L

� ������

(5) Amplification of Subtracted cDNA

Amplified Subtracted cDNAPhenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) 100 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 3 min. R.T.

Sup.

Sample 3 (1 ng)

Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% Ethanol 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 5 min. R.T.

ppt.

70% Ethanol 150 L

14,000 rpm (18,800 g), 2 min. R.T.

ppt.

Air-dry

Distilled water 44 L

700 g, 5 min. R.T.

filtrateMeasure at OD260 nm

(6) Removal of the residual ss cDNA by Exonuclease I

Amplified subtracted cDNA : 44 L10 Exonuclease I Buffer 5 LExonuclease 1 LVortexIncubate at 37 30 min.Incubate at 70 15 min.Distilled water 50 L

Removal of low-molecular-weight DNA

(7) Check of Subtracted cDNA (human cDNA)

Amplification of Sample 1, Sample2, Sample3

Agarose gel electrophoresis (1% agarose in TAE)

Subtracted ds cDNA

���� ���� ��� �� ����������� �������� �������� ������ �������� ��� ��������� ���

��������� � ��������� � ���

������ � ������������!��

�""��##$$$%$������%��%&�

���� ��� ��� ���� �� ����� '���$��( )�(

)�����(� *+ � � �

,%-%+%

��������� � ���������������

������ � �������������!�

�""��##$$$%$����%��

���� ��� ��� ���� �..�/�"/��� ��

������� 0����

1�/�2

��������� � ��!��� �� ����

������ � ��!��� �� �����

�""��##$$$%$����������%(�

�������� �����

� ������

���� �� �� ����

������

���� ���� ������ � �� ���

�� � ���

���� ����������������������������

�� ������������������������������

���� �� � �������� ��� ��������� �����������

����� ���������������������������

� � �����������������������������

����������� ���������������������

���� ����������������������������

�� ������� ���������������������

�� ������ �� ����� ������������������

�� ������ �� ����� ������������������

�� !�����"����� ���������������������#

#� � �$�%&����'� � $�����������������

�������������������������#

(� � ������� ������� ��������������#

�� )%�� $������������������ �������(

�� � ������� ������������� ��������(

�&�� ���� ������ ��������������(

�&�� ���� �����������������������

���� ����������������������������

�������� �����������������������

���� ����������������������������

������� �������������������������

������

��������������������������������

���������� ����������������������

�������� ����������������������

��������������������� ���������

� ������������������������������

�������������������������������

*�����!�������� ���������������+,��

������!�"������ ������#�$���%&�

���� -� �$�%&����'� ����� ��.������/ �� � �������� ��� ������

�� *�����!� ��������!�"������ ����� �����

����������'���������!�"������ ����� ���

������ ����������������%�������

���� !������ �$�%&����'� � $������( �������

����������(������ ���)%�� $�������( �

���������� ���������� �����������

���������'$��������������������

����������� ��������������� ����������

�� ������������ ��������������

��������������� �� � �������� ��� ��������

*�����!�������� ������������������)�

��������������

� ������

�� ��

� ������ ����������������������������

������ ���������� ������������������

��

� ��� ��� �����������

������ ��� ��������� ��� ��������������

���������������������� ���� �����������

������������������ �������������������

��� ��������������

� ��������������������������

������� �������������� � �� ������������������

��������������������������

� ����� ������!�� ����� ����������"�� ����������

������

��� �����"�� �������������������

���������������������������� ���� ����

��������

� ���� �����������

��������������!������������"#��

�����

� ������ $���������"����������� ���� ���

��������

����� ���� ������ � �� ��� ������

Tester ss cDNA(1 Driver ds cDNA(2 )cDNA

DNA

cDNAP23

cDNAPCR

(Rsa )

P24

Tester ss cDNA Driver ds cDNA

P25

cDNADNA

cDNAP25

P25

xonuclease I

P26

Tester ss cDNA Driver ds cDNA

Tester ss cDNATester cDNA

PCR

ss cDNA ss cDNA

Subtracted ds cDNA

Tester ss cDNA DNA

Lambda Exonuclease

� ������

’’

’ ’

Lambda Exonuclease

’’

’ ’

’’

’ ’

Rsa I

’’

’ ’

’ ’

’ ’

’ ’

’ ’

’ ’

Duplex-specific nuclease

� ������

’ ’

’ ’

’ ’

DNA

’’

’ ’

’’

’ ’

’’

’ ’

Exonuclease I

’’

’ ’

’’

’ ’

’’

’ ’

’’

’ ’

’’

’ ’

’’

’ ’

Subtracted ds cDNA

Cloning

� ������

�������

�����

��� ����� �� ������� ��� � ��

��� �������� �� ������� ������ ���� � ��

��� ������������� ������ ���� � ��

��� �� ���!� ������ ������� ��� � ��

��� ���� ���!� ������ ������� ������ ���� � ��

�"� �� �������� ��� � ��

�#� ����� �������������� ���� � ��

�$� �%��%� ���� ���� � ��

�&� '�� '������ ���� � ��

���� � ���(� '���� )������* � �+� ����� � ��

�� ��

�������������������������������

���� , ��� ����� �� ������� ��� �������� �� ������� ������

��� ������������� ������ ��� �� ���!� ������ �������

��� ���� ���!� ������ ������� ������ �"� �� ��������

�#� ����� ��������������

����� , �$� �%��%� ���� �&� '�� '������ ���� ����(� '���� )������

�������������

� ��

�� -����������.�� ��/)�����/) �������

�� -����������.�� ��/)���0�����

�� ������������0������1)0��*�!���� ��

�� �/)�����

�����������/)���������������

��2�����������������2������ '��������

-303-)4 �/) ����������������-303-)4 �/)

�����������15�������������������

�������������������������

�� /-0 6���������� ����(� )-0* --0* 5-0* 1-0�

"� ��� ���������&�!�������������/)�

�0�����������

���� � �����������������������

��

#� �������� ����$!���&�

$� ������ �������������������������

&� #�7�&&+�7����

��� �/) �������

��� �����

��� ����� �

��� ��-) ������

��� ���� 8 ������

��� �����

� ��

�"� 059 �!�"

�#� �� ����!�"

�$� �� ��#��

�&� �#����$

� ������

��� ���������

��� ������

��� ���������������� �� �����������

��� �������� ��������� ������

��� ����������� ����

��������������������������

��� �������� ���������

��� ��������

������

�� �����������������

� ������������� �������������������� ��

����� ����� ����������� ����

� ��� ��������� ���������!��"# $�����������

����� ���������������

� $������������������ ������������������

�� �������������� ��������$�����������%

���������$�������� ��������$������

���������"� &'#�(�)���������������� ��

����������� ���������������� �����

������ ��������$������������������� ��

��������$�������� ����������������

����*���*������ ���

Primer 3

P-5TesterPrimer 15' 3' 3'

Primer 4

Primer 2

Driver 5' 3' 3' 5'

'

� $�����+$�,���$�-&��������������

� ����.(�������" ������������ ����$������

�� ����-�$�+��/������!���������� ���

���������

� ������ ���������� �� ��������������������

������ $#)����������������" �#�

��" #��������������������" ����

�����������������������������

� ������ ���������� �� ������������������$

�����������

� ������������� ��%��

� �� ��������������� ���$���� ��������

���.(�������" �������� ����� ����������

�����������������

� ������������������ ��%��0�"�)��� .��/

�������$���1 ��� #)�������������������

����������$���1 ��� $#)����������� ����

����������������������&�'$,!��

��������� ��� �����

� ������

�� ������ �� �����

� ���� ��������������������������

���� ������� ��� ����

�������������� ������ ���� � ������ �� �� ! ��

� ������ "�#$% !��

$����� �������& � �� !��

$����� ��!'����& � �� !��

#($(#�) ��� $�����%���� �*+ �� ���������� ������� ,��

������� � ��

$����� ��� $����� ��������������������

����- ���������� ����������- ���+ .��/

��"�� 0�1��%� $��������������

� !�� $ 0���� �� �����������

� �����������������

2!� ���

2!� � ��

! �� � + �� ��� ����%

3�� ���

3�� !��

� ����������������������� ��������

� ������ ��� ������ � �� ��!*�,*��

�����������

� �,& �����4&4 ����+�������������

� ����������������5��������� ����+�����

6�"��� ������ � ���� �227!8���� �! �������

������

� �,& �����4&4 ����!�����������

�! ���3 8���� �����������,,�����

����������

!���� ����" 59������%� ��������������" 59�/

�����%���������� $ 0���� ������� ��

���+3��+ �������������

� 4 ���! ��������������" 59������%������

���

� ������������������! ����������

������ �������

�������������������� $�����������

���������

� �����3 ���!�������������

� ���������(��� ��������������

6���� � �� ���

�����������������������(��� ��+3������

����������

�� ��������������������

������������������ �����������

������

� ������

�� ������ � ������

� ���� ��������������������������������� ����� �� ��� ����

�������������� ������ ���� � ������ �� �� ! ��

� ������ "�#$% !��

$����� &' � �� !��

$����� (' � �� !��

#)$)#�* ��� $�����%���� �+& �� ���������� ������� (��

�������� � ��

$����� &�$����� (���������� ��������

���, ���������� �����������, ���& -����"

�.�/��%� $��������������������/�� �����

#�%��� ������������ ����������#�%���

��������$��������������� ���/�� �����

���$��������������

� !�� $ .���� � ���� ������

� ������������������

0!� ���

0!� � ��

! �� � & �� ��� ����%

1�� ���

1�� !��

� ��������� ����$ .���� ���������

������ ��� ������ � �� ��!+�(+��

�����������

� �(' ��� ��2'2 ����&��������������

� ������������ ���3��������� ����& �����

4�"��� ������ � ����005!6���� �! �������

������

� �(' ��� ��2'2 ����!��������������

�! ���1 6���� ����������((��������

������

�������������������$�����������

��������

� ������1 ���!��������������

� � �� �������!������ ���������������&1���

�������������

2 ��� �����������������������

� �����! ��������� �� ����

� � ������ ��� ������ � ��

�!+�(+������������

� �(' ��� ��2'2 ����&��������������

� ������������ ���3��������� ����& �����

4�"��� ������ � ���005!6���� �! ��������

�����

� �(' ��� ��2'2 ����!��������������

� 1 6���� ����������� �������� ���

���

� ���������)��� ���������������

4���� � �� ���

�������������������������)��� ��! ������

����������

� ������

� ��� ���������������������

����������������������������

�� �

�� ����������

� ������ ����� ����� �� ��� �� �������������� ����� ���� ������������������������� !""���������

����

����� �� ��� # ������ �� ��� � � # ���

� $%����������&%���&�������������

����������� ��� ���������������

�� ��������������� ����������������������������

���

� ��������������������������&%���������&%�����������!'(�)*�'���"�� �!�(���� !""���+�����

������ ���&%�����������������

����� ��� ������������������

���������������� �

� �����!'(�)*�'���"�� �!�(���������&%��,�������

�������

� �����-��' -�(!��������&%��+�������������

� %��������������������������

� ��������������������� ���!����+#��#�������������

� ��.��� �'/ ��%.%������,��������������

����������������0�1��1��/��� ����, /�(��-���!/ ������ ��������$$2+3������+��������

������

��.��� �'/ ��%.%������+��������������

� �+����4�3������������ ��,���������

�������

���������������������������

���� �

�� ��������� ����������

� -!�������� ������������

-!�������� ��������+*�� ,�����/'(�"������� !""�� 5��1 & //�(�� 6��(� +�����//�(�� �� � +����/�� �. ���6 +����/�� �. ���6 +�� 77 8 �� �(�/���������#, �� ����(!���� �!""��� ���

�� �����

��/�� ������/�� �������� ����� ���������

�� ��/�������� �����/�� ����'��/�� �� �

����/������!����"#����/����������

���������+9 $��������$�

� ������

� ��� ������� ��������������

� ��������������

��� ������ ��������� ��� �� ��� ����� ������ ���

� ���������������������������������

���������� ���������������������

��������

� ������ ��� �������������������������

� ����������������� !"�!#$�" � �����% &�'%(#)� ��� " � ����������*�+���������� ��

������

� ������ ��� ��������������������������

� ��������+ ������������������������

�������

�� ������������������ �����

���� ������� ���� ��� � �,%$)� �"��� -)..������ ��,%$)� �"���� �������� ������� �����

�����������������

� ������������������,%$)� �"����������

� ��������������� ��������#��������

�������

� ���������������������������

� ��������/��� $�������������

'"�� � �� $��

������������������$�&����/���������&���

���������

�� ��������� � ��������������

����')0 �"� �( ����������������������

����� �����!������1���2� �3"� #$������

�������

����������������

�"�#��4�� �� ������������4�� �� �� �����'"�� �

����"�#���#5�� ��������������#5�� (� ����

�'"�� � �������"�#��')0 �"� �( ���� �'"�� � ���

���� $������1���2��3"� #$����������

��4�� ���������������������������

��������� ��������

���� �� $�� '"�� � ���� ���

����� #.#�" #%$ -)..�� 6# ! ��% &� 7�� � ����

����% &� (�4�� ���

'�$�� ��#���� ���7 ���

�$ #��$�� ��#���� ���7 ���

4/�/4�8 ��� �% ����"������� #$ ���# ) #%$ -)..��� ���

�������� ����

�������������� �����!������

1���2��3"� #$!�"��'�$�� ��#�������$ #��$��

��#�����������

� ������

��� ���

��� ����

������ ���� ��� ����

��� ��

��� ���

� ����� ���� ���������� �����������

������������������������

��������

� ����������������� ��������

������������������������� ���� �!"�#�"$%& '$"

(#)%�� ��� ������� �������������

������*�������������������� ��+*��

��� �� �!"�#�", ��������� ����

���� �������"� �� �������������������$-� ,�

��������� �!"�#�", ���������� &���������

������������������������

HepG2 cDNA cDNA

GAPDH GAPDH 100bp SL

1,500bp

1,000bp

1%

GAPDH glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase

Subtracted cDNA

Agarose S

AFP : alpha-fetoprotein

GAPDH : glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

931bp859bp

AFP AFP GAPDH AFP

������������������*�������� ������

�������������������������� �!"�#�",

��������������������������������

�+*�������� ������������������ �!"�#�",

������ ������ ���������������������

����������������� ����� �!"�#�", ����

������������������!����� �������

���

������

./�$,%-0 *� ��0 �%�,#&%-#0 �� ��0 /�/�%-0 �� �0 1#�&�0 �� ��0

'/#��)%-0 �� ��0 '%2/��#)%0 1� ��0 3#"20 3� 1�0 3�/)-$"�/0 ��0 3%4

�%20 �� ��0 ��)�#&%-0 � �� #&, /#�$&0 �� ��0 ������� ���� ��0 �� 5 �� 6�7 8

��� 6���97

�����������

���������"�����#������������

����������� ���� �!"�#�"$%& '$"(#)%���������

� ������

����

���� ��� � � � �

���� � ������� ��� ���������� � �����

������ � �� ������� !�� "�# $���%���� &��'(� ) ��*��

+�� )�� ��� � � �����

+)�)�� ���� $�,���� -�� ����."/0 $���%���� 1����'� 2���� �) �"

+��� ��� �(����.�(����!���.3������ ��%�(�� -)�4)4�/ )� �"

� �))� 5�(���� -����/0 $���%���� 1����'� 2���� � �"

� �� 2��%����0 $���%���� 1����'� 2���� � �"

+�) ���� 5�(�%(������ �) �"

)�66�� � � * ��� ��� "����� - �����7* / + �'

+�) ���+ �'����� � � �'

+�+� +� � � ��5 � �"

+�� )6� 6� "�����' 1�!!�� ��� �� ��� � �"�+

+��� �� 5�(����� 1������ �������� � �"

+�6� � � ��������� &����0 ������8��0 ������� � �"

� ������

������������

cDNA Library (10 ng) DNA (16 cycles) : 100 L

(25:24:1) 100

44 L

50 L

OD260 nm

(1) Tester ss cDNA

14,000 rpm (18,800 g), 3Vortex

Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 570% 150 L14,000 rpm (18,800 g), 2

10 Lambda Exonuclease Buffer 5 L

Lambda Exonuclease 1 L

37 3080 15

Vortex

DNA/Primer

700 g, 5

(1 ng/ L) Sample 1 (1ng)

(2) Driver ds cDNAcDNA Library (10 ng) DNA (16 cycles) : 100 L

(25:24:1) 100

14,000 rpm (18,800 g), 3Vortex

44 L

Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 5

70% 150 L14,000 rpm (18,800 g), 2

� ������

OD260 nm

(100 ng/ L)

98 , 2

80 L

(25:24:1) 100 L

cDNAcDNA

Sample 2 (1ng)

(3) Hybridization

Tester ss cDNA (1 ng) 1 LDriver ds cDNA (200 ng) 2 L

4 Hybridization Buffer 1 L

68 16 20

(4) Duplex-specific nuclease

Hybridization (68 ) : 4 L

2 Duplex-specific nuclease Buffer 5 L

68 , 10

Duplex-specific nuclease 1 L

68 , 30

Stop Solution 10 L

68 , 5

14,000 rpm (18,800 g), 3Vortex

31 L

Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 5

70% 150 L14,000 rpm (18,800 g), 2

DNA

DNA/Primer

700 g, 510 M Buffer 5 LRsa 1 L37 , 280 , 20

50 L

(25:24:1) 100 LVortex

14,000 rpm (18,800 g), 3

Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 5

70% 150 L14,000 rpm (18,800 g), 2

10 L

� ������

(5) Subtracted cDNA DNASubtracted cDNA DNA (35 cycles)

(25:24:1) 100 L

14,000 rpm (18,800 g), 3Vortex

44 L

Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 5

70% 150 L14,000 rpm (18,800 g), 2

(6) Exonuclease I cDNA

DNA Subtracted cDNA 44 L

50 L

10 Exonuclease I Buffer 5 L

Exonuclease I 1 L

37 3070 15

Vortex

DNA/Primer

OD260 nm

700 g, 5

(7) Subtracted ds cDNA ( )

Tester ss cDNA (Sample 1), Driver ds cDNA (Sample 2),Subtracted ds cDNA (Sample 3) 1 ng DNA (GAPDH, -actin )

Sample 3 (1ng)Subtracted ds cDNA

S T U V W X Y Z [ \

�������

top related