review 1. ngs, rnaseq, chipseq

Київський національний університет імені ТарасаШевченка

ННЦ “Інститут біології”

Відеододатки до презентації Ви можетезавантажити на:

www.ex.ua/213724430783

Де я?

Навіщо?

Що нового?

Де я?

● Цикл розповідей з ілюстраціями про те, яклюдям було цікаво побачити і зрозуміти те, чого ніколи не побачити неозброєним окомі до чого це призвело:)

Навіщо?● Допомогти людям, що тільки йдуть до

лабораторії зрозуміти, а що взагалі можливозробити в лабораторії і наскільки це цікаво

● Показати і описати сучасні техніки, що вжевикористовують чи будуть використовуватисяу тих лабораторіях, куди ви прийшли чиприйдете.

● Використовуючи симульовані чи реальнідатасети показати функціонування певнихлабораторних технік на прикладі

● Розділити з іншими здивування і задоволеннявинахідливістю людини, якщо ну дуже-дужецікаво, що всередині шкарлупки:)

Що нового?

● Відкритий проект без кафедральноїналежності (особлива подяка за допомогукафедрі вірусології!)

● Біоінформатичне спрямування

● Регулярність (сподіваємось):)

● Відкритість до співпраці, зворотньогозв'язку

Секвенування- як прочитати текст, який формує

нас

1927, Nikolai Koltsov

● inherited traits would be inherited via a "giant hereditary molecule" made up of "two mirror strands that would replicate in a semi-conservative fashion using each strand as a template"

1953 рік – ось коли все почалося!

1977

Лютий – Maxam AM, Gilbert W. "A new method for sequencing DNA". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (2): 560–4.

● Грудень - Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (12): 5463–7

Пурини↑ Піримідини↓

Пройшло десять місяців...

1mg вашої геномної ДНК

5000$

Бажання дослідити специфічніоднонуклеотидні мутації (SNP), що відповідають за…ЗДАТНІСТЬ ВИМОВИТИ “НІКОТИНАМІДАДЕНІНДИНУКЛЕОТИДФОСФАТ” без жодноїзапинки

NGS-cеквенування

Обробка NGS-даних тавиявлення SNP, з якимипов’язані певніознаки

Експериментальнаперевіркаотриманих даних

Quick start guide :)

Центральна догмасеквенування:)

Підготовкагеномної

бібліотекиАмпліфікація

Власнесеквенування

ВиділенняДНК

ФрагментаціяДНК

Лігування з адаптером

Ампліфікація

Лігування з лінкером

Циклізаціяфрагменту

Лінеаризаціяфрагменту

Ампліфікація

Бібліотеканепарних рідів

Бібліотекаспарених (Mate-

pair) рідів

Фрагментація ДНК

● Рестриктазний метод

● Небулізація

● Сонікація

Рестриктазний метод

Небулізація

Зразок ДНК

Газ під високимтиском

Сонікація

Бібліотеки рідів

Парні

Власнепарні

Cпарені(mate-pair)

Непарні

Власне парні ріди

Спарені (mate-pair) ріди

Центральна догмасеквенування:)

Підготовкагеномної

бібліотекиАмпліфікація

Власнесеквенування

ДНК вжепідготовлене для

ампліфікації

Ампліфікація – емульсійна ПЛР

Ампліфікація - bridgePCR

Центральна догмасеквенування:)

Підготовкагеномної

бібліотекиАмпліфікація

Власнесеквенування

ДНК вжепідготовлене для

ампліфікації

Збільшеннякількості копій ДНК

проведено

SOLiD – піонер NGS

FinishedVideo/SOLID.mp4

Roche 454(Pyrosequencing)

FinishedVideo/Pyrosequencing.mp4

Завантаження на субстрат

Flowgramm(454)

Характеристики

• Час рану – 8 год

• Вихід за ран – 120Mb

• Довжина ріду – 300-400п.н.

• Якість секвенування - 99,7%

Illumina – галузевий стандарт

Все просте - геніальне

FinishedVideo/Illumina.mp4

Характеристики

• Якість секвенування – 99,9%

• Час рану 8 діб

• Вихід за ран – 250Gb

• Довжина рідів – 100-250п.о.

IonTorrent-NGS із запасом намайбутнє

IonTorrent Chip

FinishedVideo/IonTOrrentNew.mp4

Характеристики чіпів

PacBio2- Гості з майбутнього

FinishedVideo/Intruduction to SMRT Sequencing.mp4

Епігенетичне секвенування

Статистика

• Точність – 83% (13% помилок!!!!!!!!)

Статистика

• Точність – 83% (13% помилок!!!!!!!!)

• Для ампліфікації використовуєтьсяEmulsionPCR (як і в 454) НЕ ВИКОРИСТОВУЄТЬСЯ АМПЛІФІКАЦІЯ

• Вихід за ран - 217Mb

• Довжина рідів – 17000 п.н.

• Час рану – 30хв-2год. (залежить відпослідовності та довжини рідів)

Найсолодше… :)

Чим довелось пожертвувати?

● Довжина рідів (у перших модифікаціяхSOLiD – від 5 пар основ)

● Якість секвенування (відсоток помилок)

● Дороговизна обладнання

● Патентовані реактиви чи субстрат(неможливість випуску сумісних реактивів)

● Проблеми з розв'язуванням повторів

NGS - р(ЕВОЛЮЦІЯ)

● Паралелізація

● Ущільнення

● ВІДСУТНІСТЬ ЕТАПУ ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ

● Скорочення використання реактивів

● Швидка підготовка бібліотек

● Мала кількість необхідної ДНК

MDA Sequencing

`

• Вступ: Біологічна проблематика>

Наявні методи>

RNA-seq, визначення>

• Метод: Протокол>

Платформи для RNA-seq>

Обробка данних>

?..Дослідження та виявлення новихтипів РНК

Альтернативний сплайсинг, місця стику екзонів

РНК – модифікації

Мутації (SNP)

Профіль генної експресії

Біологічна проблематика

Яким чином вирішуються ці питання?

Огляд методів

• кДНК, EST секвенування

• Мікроаррей

• RNA- seq

• Direct RNA-seq

Принцип секвенуванняза Сенгером

зразок: кДНК

стик екзонів,

сплайс варіанти,

SNP(single nucleotide polymorphysm)

Огляд методів

• кДНК, EST секвенування

• Мікроаррей

• RNA- seq

• Direct RNA-seq

Огляд методів

зразок : кДНК

аналіз експресії генів

комплементарна гібридизація з олігопослідовностями на чіпі

потребує знання послідовності транкрипту

• кДНК, EST секвенування

• Мікроаррей

• RNA- seq

• Direct RNA-seq

RNA- seqПряме визначення послідовності РНК повного

траскриптому>

сплайс-варіанти

SNP

профіль експресії генів

ідентифікація нових типів РНК

1 день:)

• Вступ:

Біологічна проблематика>

Огляд методів>

RNA-seq, визначення>

• Метод:

Платформи для RNA-seq>

Протокол>

Обробка данних>

IlluminaRNA-seq платформи

SOLIDRNA-seq платформи

Roche 454RNA-seq платформи

Порівняння платформ

Як же працюєRNA-seq?

Приготування бібліотеки:

Фрагментація РНК>

лігування з адаптерами>

cинтез кДНК>

ампліфікація>

- платформи використовуютьрізні принципи

Illumina SOLID Roche 454

Illumina – bridge amplification>

Roche 454, SOLID – emulsion PCR>

Секвенування

Секвенування

>мільйони коротких рідів – залежно від платформи

Накладання рідів на геном(транскриптом)

Збирання транскрипту de novo

Збірка послідовності

Накладання транкрипту на геном

>дозволяє виявлення нових та альтернативних транскриптів

Виявлення двох ізоформтранскрипту

• Вступ:

Біологічна проблематика>

Огляд методів>

RNA-seq, визначення>

• Метод:

Платформи для RNA-seq>

Протокол>

Обробка данних>

Обробка данних

Накладання рідів (сірим к.) на геном(транскриптом)/збірка de novo

Конструкція варіантів транкрипту

Аналіз графу

Готові ізоформи

Збірка послідовності

програми-збиральники:

> Bowtie – накладання на геном

Проблема: а нові транскрипти??

√ TopHat, splicemap,

mapsplice,

rum, star –

De novo – Trinity,

EBARDenovo..

Обробка данних

Накладання рідів (сірим к.) на геном(транскриптом)/збірка de novo

Конструкція варіантів транкрипту

Аналіз графу

>Готові ізоформи

Визначення профілю експресії(кількості транскрипту)

Кількість послідовностей, що збігаються з геномом залежить від:

Кількості транкрипту>

Його довжини

Наявності в ньому послідовностей, що часто зустрічаються в геномі

Данні нормалізують>

Обробка данних

RPKM (Reads Per Kilobase of exon model per

Million mapped reads)

FPKM (Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (paired-end sequencing)

І тд…

Обробка данних

І на цьому все ще не закінчується..

>Chip-seqІмунопреципітація хроматину + секвенування

Chip-seq

ДНК – білок : транскрипційний фактор, тощо

В якій ділянці зв’ язуєтьсябілок?

Секвенування – NGS

білок

антитіло

Ампліфікація зв’язаних фрагментів

Фіксація в метанолі + формальдегід

База даних функціональних елементів в геномі людини

>Сайти зв’язування ТФ

>Модифікації гістонів

>Позиції нуклеосом

>ДНК-метилювання

>ДНКаза-чутливі елементи

Caenorhabditis elegans,Drosophila melanogaster