seminario biologia molecular

Santiago Castro.Sara Berdugo Mesa.

Estudiante Medicina tercer SemestreUniversidad Pontificia Bolivariana

P16INK4A positively regulates p21WAF1 expression by suppressing AUF-1 dependent mRNA decay..

Autores: Huda H. AL Khalaf, Abdelilah Aboussekhra.

INTRODUCTION.

Cell cycle in most cells consist of four cordinate process.

Cell growth.

DNA replication.

Cell division.

Distribution of duplicated

chromosomes.

INTRODUCTION.

CELL CYCLE PHASES.

INTERPHASE.

G1 phase.

M phase.

G2 phase.

S phase.

G0 phase.

The cell is metabolically active and grows, but does not replicate DNA. (2n)

DNA Rreplication occurs. (4n)

Enzime and other proteins are synthesized. (4n)

It refers to mitosis.

( quiescence) the cell is metabolically active but is non dividing cell.

INTRODUCTION.

INTERPHASE.

It refers to mitosis.

Telophase.

M phase.

Anphase.

Metaphase

Prophase.

Chromosomes relax and nuclear membranes are formed.

Chromosomes separate to opposite poles.

Chromosomes align at the euatorial zone.

Chromosomes condense and migrate to the center of the cell.

INTRODUCTION.

CONTROL POINTS OF CELL CYCLE.CONTROL POINTS OF CELL CYCLE.

G1G1 MMG2G2

In response to damaged DNA or DNA that has not

been replicated.

In response to damaged DNA or DNA that has not

been replicated.

Can not move

from 2n to 4n.

Can not move

from 2n to 4n.

It stops mitosis if choromosomes

are not correctly aligned at the

mitotic spindle.

It stops mitosis if choromosomes

are not correctly aligned at the

mitotic spindle.

Regulated by P53.

Regulated by P53.

INTRODUCTION.

P16INK4AP16INK4A P21WAF1P21WAF1

Cyclin-dependent kinases (cdkS)Cyclin-dependent kinases (cdkS)

INHIBITED.INHIBITED.

Cyclin.Cyclin.Regulated.Regulated.Cell

proliferation.Cell

proliferation.

FunctionsFunctions

• Suppress tumors and apoptosis.• Involved in cell cycle control(in the passage from G1 to S).

Participates in the P53 trackParticipates in the P53 track

Participates in the pRB trackParticipates in the pRB track

. INTRODUCTION.

Cyclin.Cyclin. Regulate the activity of specific enzymes, cyclin

dependent kinases.

Regulate the activity of specific enzymes, cyclin

dependent kinases.

kinase is activated and adds

phosphate groups to the protein and regulates the cell

cycle.

kinase is activated and adds

phosphate groups to the protein and regulates the cell

cycle.The most

important in the cell cycle.

The most important in the

cell cycle.

Cyclin A and B.Cyclin A and B.

Cyclin D.Cyclin D.

Cyclin E.Cyclin E.

participates in the beginning of G1participates in the beginning of G1

participates in the S phaseparticipates in the S phase

necessary to move from G1 phase to S phase

necessary to move from G1 phase to S phase

. INTRODUCTION.

P53P53 The detention of cell cycle at G1 ckeckpoint is regulated by the action of a protein known as P53, that responds rapidly to damaged DNA. The gen coding for P53 usually appear in human cancers. If P53 loses its fuction, the cell cycle is not stopped at G1. and damaged DNA replicates and passes on to daughter cell without reparation.

. INTRODUCTION.

Apoptosis.Apoptosis.Apoptosis or programmed cell death is the orderly process by which the cell dies before extra-or intracellular stimulus. Apoptosis has an important role in organism, allowing the destruction of genetically damaged cells, preventing the onset of diseases such as cancer.

. INTRODUCTION.

P21WAF1P21WAF1 P16INK4AP16INK4A

Inhibits cyclin E-CDK2

complex.

Inhibits cyclin E-CDK2

complex.

The target is cyclin D-CDK.The target is cyclin D-CDK.

Inhibits.Inhibits.

To pass G1 phase to S

phase

To pass G1 phase to S

phase

Regulated the beginning of

G1

Regulated the beginning of

G1

OBJECTIVE.

In this study the objective was to check that p16 has a positive control in the expression of p21 in human and mouse cells.

In this study the objective was to check that p16 has a positive control in the expression of p21 in human and mouse cells.

MATERIALES Y METODOS.

LINEA CELULAR.

1. U2OS,EH1 Y EH2 (líneas celulares).2. MEFs p16.3. Knockout p16.4. HFSN1 (fibroblastos de piel humana normal)5. DMEM/F12(medio)6. MCF-10ª se adquirieron de ATCC y fueron cultivadas según

recomendaciones.

. MATERIALES Y METODOS.IMMUNOBLOT.

PREPARACION DE LA MUETRAS.PREPARACION DE LA MUETRAS.

Los extractos de célula se prepararon a partir de diferentes líneas celulares tanto de humanos como de ratón, posteriormente fueron separados por electroforesis en gel según su tamaño y se disolvieron en el detergente SDS y las proteínas fueron transferidas a filtro y se encubaron con los anticuerpos y la β- actina como control interno.

los anticuerpos iban dirigidos contra:• p21(F5)•P14(c18)•GADPH (fl335)•PCNA (OC-10)

. MATERIALES Y METODOS.

INMUNOTINCION.INMUNOTINCION.

celulas se fijaron en acetona, metanol y se hizo un proceso de inmunoperoxidasa usando anticuerpo Ki-67 y anticuerpo anticonejo conjugado con peroxidasa, y los sitios a los que se unieron los anticuerpos se visualizaron por deposito de cromogenos.

TODO ESTE PROCEDIMIENTO SE REALIZO CON EL FIN DE EVALUAR EL p21 Y LA CANTIDAD DE CELULAS QUE SE ENCONTRABAN EN LA

FASE S.

TODO ESTE PROCEDIMIENTO SE REALIZO CON EL FIN DE EVALUAR EL p21 Y LA CANTIDAD DE CELULAS QUE SE ENCONTRABAN EN LA

FASE S.

. MATERIALES Y METODOS.PROLIFERACION CELULAR.

Las células MFC-10A expresan CDKN2A-ORF o plásmido de control se sembraron en una placa E16 y la tasa de proliferación se midió usando un sistema xCELLigence.(monitorea eventos celulares en tiempo real sin la incorporación de marcadores)

. MATERIALES Y METODOS.CITOMETRIA DE FLUJO.

Esta técnica permite analizar una población celular en donde predominan otras poblaciones celulares mayoritarias y me permite obtener varios parámetros de una célula analizada.

Células. Células. PBS. PBS. Centrifugación. Centrifugación. Fijación (metanol).

Fijación (metanol). RNasa. RNasa.

Incubación y adhesión de

yoduro.

Incubación y adhesión de

yoduro. ESTE PROCEDIMIENTO SE USO PARA SABER EL CONTENIDO

EXACTO DE DNA Y ADEMÁS PARA ANALIZAR LAS CÉLULAS EN DIFERENTES CICLOS CELULARES.

ESTE PROCEDIMIENTO SE USO PARA SABER EL CONTENIDO EXACTO DE DNA Y ADEMÁS PARA ANALIZAR LAS CÉLULAS EN

DIFERENTES CICLOS CELULARES.

. MATERIALES Y METODOS.RT-PCR.

Esta prueba se utiliza para la amplificación directa de un gen o de un fragmento de DNA o indirecta de RNA.

El ARN total fue purificado utilizando reactivo , se determinaron concentraciones ADN complementario monocatenario (ADNc) se obtuvo porla transcripción inversa y se amplifico por cebadores y posteriormente se calentó y se observaron después de la electroforesis.

. MATERIALES Y METODOS.

ESTE MÉTODO SE UTILIZO PARA DEMOSTRAR QUE EL P16 CUMPLE UN PAPEL FUNDAMENTAL EN LA ESTABILIDAD DEL

RNAM DEL CDKN1A DE LOS FIBROBLASTOS DE LA PIEL NORMAL.

ESTE MÉTODO SE UTILIZO PARA DEMOSTRAR QUE EL P16 CUMPLE UN PAPEL FUNDAMENTAL EN LA ESTABILIDAD DEL

RNAM DEL CDKN1A DE LOS FIBROBLASTOS DE LA PIEL NORMAL.

. MATERIALES Y METODOS.ANLISIS DE LA ESTABILIDAD.

Se hicieron curvas de calibración para el gen CDKN1A para determinar la concentración relativa de los transcritos amplificados (p21-p16),a través de la AUF1 y luego se normalizó el nivel de ARNm del GAPDH.

LOS VALORES NORMALIZADOS SE UTILIZARON PARA CALCULAR LA VIDA MEDIA DEL ARNM CDKN1A.

LOS VALORES NORMALIZADOS SE UTILIZARON PARA CALCULAR LA VIDA MEDIA DEL ARNM CDKN1A.

. RT-PCRq.

La PCR a tiempo real la amplificación y la detección se dan simultáneamente sin tener que hacer procedimientos posteriores y me permite monitorizar por fluorescencia cuanto DNA se sintetiza en cada momento .

En este caso se extrajo ARN de ambos p16 competente y p16 deficiente, el ARN total fue purificado, tratado por DNasa, y después se sintetizó ADNc , todo este proceso se hiso mediante cebadores específicos.

ESTE MÉTODO SE REALIZO PARA INVESTIGAR EL MECANISMO POR EL QUE P16 REGULA EL NIVEL DE LA PROTEÍNA P21, SE EVALUÓ EL PAPEL DE P16 EN LA EXPRESIÓN DEL ARNM CDKN1A EN RATÓN Y FIBROBLASTOS HUMANOS.

ESTE MÉTODO SE REALIZO PARA INVESTIGAR EL MECANISMO POR EL QUE P16 REGULA EL NIVEL DE LA PROTEÍNA P21, SE EVALUÓ EL PAPEL DE P16 EN LA EXPRESIÓN DEL ARNM CDKN1A EN RATÓN Y FIBROBLASTOS HUMANOS.

MATERIALES Y METODOS.

. Transfección y evaluación de la actividad reportero

GFP

Permite la introducción de ácidos nucleicos en el interior de las células, lo que a llevado a ampliar los conocimientos acerca de la regulación génica y de la función de las proteínas en los sistemas celulares.

Las células fueron transfectadas con un reportero EGFP, en el que la región del reportero se fusiono con un fragmento que se extiende a

través del RNAm del CDK1A

Todo esto se hizo con el fin de aclarar el papel de la proteina de union ARE AUF1 en el control de p16 relacionado con el decaimiento de

CDKN1A RNAm

Las células fueron transfectadas con un reportero EGFP, en el que la región del reportero se fusiono con un fragmento que se extiende a

través del RNAm del CDK1A

Todo esto se hizo con el fin de aclarar el papel de la proteina de union ARE AUF1 en el control de p16 relacionado con el decaimiento de

CDKN1A RNAm

MATERIALES Y METODOS.

. La cuantificación del nivel de expresión de la proteína

Todo este procedimiento lo hicieron para demostrar que el supresor de tumores p16 controla positivamente la expresión de p21 en cáncer de mama células epiteliales

Todo este procedimiento lo hicieron para demostrar que el supresor de tumores p16 controla positivamente la expresión de p21 en cáncer de mama células epiteliales

Los niveles de expresión de las proteínas obtenidas por inmunotransferencia fueron medidas utilizando el densitómetro. Y se llego a la conclusión debido a que el p16 indujo una respuesta a la luz ultravioleta.

MATERIALES Y METODOS.

RESULTADOS.

. RESULTADOS.

. RESULTADOS.

RESULTADOS.

RESULTADOS.

. DISCUSSION.REFERENCE WHAT THEY SAID AGREE OR DISAGREE

Mitra J, Dai CY, Somasundaram K, El-Deiry WS, Satyamoorthy K

“p16 positivelyregulates the basal expression of p21 in various human celltypes and mouse embryonic fibroblasts. Likewise, usingdifferent p16 constructs and the U2OS cell line, it has beenpreviously found that p16 enhances p21 expression”.

Agree

Al-Mohanna MA, Al-Khalaf HH, Al-Yousef N, Aboussekhra A

“while p21 is thep53 effector during the cellular response to γ-rays, its activity isunder the control of p16 in response to UV light”.

Agree

Al-Ansari MM, Hendrayani SF, Shehata AI, Aboussekhra A

“p21 and p16 are both concomitantly down-regulated in variousbreast cancer-associated fibroblasts as compared to theiradjacent counterparts”.

Agree

Lal A, Mazan-Mamczarz K, Kawai T, Yang X, Martindale JL

“AUF1 targets also p53 and C-Myc, which are well known modulatorsof p21 transcription”.

Agree

CONCLUSION.

P16 is a protein with an important role in the regulation of cell proliferation, enhancing the activity of p21 on the critical G1 to S phase transition of the cell cycle.

AUF1, an important RNA binding protein, is negatively regulated by the p16, which increases the CDKN1A´s expression.

CONCLUSION.

Using ectopic p16 on p16-deficient cells, can increase considerably p21 levels, but it doesn´t have any effect on the cell proliferation .

There is an important correlation with p16 and p21 levels with certain cancer cell lines like medulloblastoma and meningioma cells, which also is negatively correlated with AUF1 levels on the same type of cells.

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Sara Berdugo Mesa.

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Santiago Castro.

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