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AMPLIFIED MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS DIRECT TEST(bioMérieux ref. 39006/Gen-Probe Cat. No. 301001/1001F)

AMPLIFIED MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS DIREKTTEST(bioMérieux Best. Nr. 39006/Gen-Probe Kat. Nr. 301001/1001F)

TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

(bioMérieux réf. 39006/Gen-Probe Cat. No. 301001/1001F)

TEST AMPLIFIED PARA LA DETECCION DIRECTA DEL COMPLEJO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

(bioMérieux ref. 39006/Gen-Probe Cat. No. 301001/1001F)

TEST AMPLIFIED PER L’IDENTIFICAZIONE DIRETTA DEI MICOBATTERI DEL MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEX

(bioMérieux cod. 39006/Gen-Probe Cat. N. 301001/1001F)

TESTE AMPLIFIED PARA A DETECÇÃO DIRECTA DAS MICOBACTÉRIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

(bioMérieux ref. 39006/Gen-Probe Cat. No. 301001/1001F)

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AMPLIFIED MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS DIRECT TESTFor In Vitro Diagnostic Use

50 Test Kit(bioMérieux ref. 39006 / Gen-Probe Cat. No. 301001/1001F)

INTENDED USEThe GEN-PROBE AMPLIFIED Mycobacterium Tuberculosis Direct (MTD) Test is a target-amplified nucleicacid probe test for the in vitro diagnostic detection of Mycobacterium tuberculosis complex rRNA in sedimentsprepared from sputum (induced or expectorated), bronchial specimens (e.g., bronchoalveolar lavages orbronchial aspirates) or tracheal aspirates.WARNINGSThe efficacy of this test has not been demonstrated for the direct detection of M. tuberculosis rRNA usingother clinical specimens (e.g., blood, urine, or stool). Performance of the MTD test has not been establishedfor sediments processed in a different fashion than described, or stored for different time periods ortemperatures than specified in this Package Insert.Positive sediments must be cultured to determine if Mycobacterium other than tuberculosis complex (MOTT)are present in addition to M. tuberculosis complex and to perform antimycobacterial susceptibility testing.Culture for AFB should also be performed to determine which subspecies of the M. tuberculosis complex(e.g., M. bovis) is present.Although specimens from pediatric patients, HIV positive patients, and patients with MOTT infections weretested during the clinical evaluations, total numbers were insufficient to definitely conclude that there were nostatistical performance differences in these specific patient populations.The MTD test has not been studied for use with specimens from patients being treated with antituberculousagents to determine bacteriologic cure or to monitor response to such therapy.Specimens that are grossly bloody should not be tested with the MTD test.PRECAUTIONSA. For In Vitro Diagnostic Use.B. The MTD test is specific for, but does not differentiate among, members of the M. tuberculosis complex,

i.e., M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti and M. canetti (13). M. celatumand M.terrae-like organisms will cross-react if present at concentrations higher than 30 colony formingunits (CFU) per test. However, M. celatum and M. terrae-like organisms are rare clinical isolates.

C. A negative test does not exclude the possibility of isolating an M. tuberculosis complex organism from thespecimen. Test results may be affected by specimen collection and transport, specimen samplingvariability, laboratory procedural errors, sample misidentification, and transcriptional errors.

D. Use only for the detection of members of the M. tuberculosis complex using sediments prepared followingthe NALC-NaOH or NaOH procedures recommended by the Centers for Disease Control (CDC)7. Thistest may only be used with concentrated sediments prepared from sputum (induced or expectorated),tracheal aspirates, or bronchial specimens (e.g., bronchoalveolar lavages or bronchial aspirates). Caremust be taken when resuspending the sediment in phosphate buffer to ensure that the phosphate concen-

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tration is 67 mM7.E. Avoid contact of Detection Reagents I and II with skin, eyes, and mucous membranes. Wash with water if

contact with these reagents occurs. If spills of these reagents occur, dilute with water before wiping dry.F. Use universal precautions when performing this test4. Preparation of digested and decontaminated sed-

iments, and MTD procedures should be done using Biosafety Level 2 practices5.G. Use only supplied or specified disposable laboratory ware.H. Work surfaces, pipettors, and equipment must be decontaminated of RNA amplicon with a 1:1 dilution of

household bleach. Work surface may be wiped with water after 15 minutes to remove the bleach.I. Positive displacement pipettors or air displacement pipettors with hydrophobically plugged tips must be

used when performing this test. When transferring lysate from Lysing Tube to Amplification Tube,extended length hydrophobically plugged tips must be used. A separate disposable tip must be used foreach reaction tube. Waving of a pipette tip containing specimen over the rack of tubes should be avoided.Spent pipette tips must be immediately discarded in an appropriate biosafety waste container.

J. When using repeat pipettors for reagent addition, after the lysate has been added to the tube, avoidtouching the tube with the pipette tip in order to minimize the chance of carryover from one tube toanother. The reagent stream should be aimed against the interior wall of the test tube to preventsplashing. Careful pipetting is important to avoid carryover contamination.

K. Separate pipettors must be used for steps that precede amplification and those that follow amplification.L. After reading reaction tubes in the luminometer, decontaminate and carefully dispose of them as described

in the TEST PROCEDURE and PROCEDURAL NOTES in order to avoid contamination of the laboratoryenvironment with amplicon.

M. Sealing cards or snap caps should be disposed of in an appropriate biosafety waste container immediatelyafter removing them from reaction tubes. Fresh sealing cards or snap caps should always be used toavoid cross-contamination. These materials should NEVER be reused from a previous step. Sealingcards should be firmly fixed to the top of all reaction tubes.

N. Do not cover water bath during incubations, especially when using snap caps. (Condensation from thecover may be a possible source of contamination.)

O. Adequate vortexing after addition of Selection Reagent is necessary to achieve accurate assay results.P. A segregated area for the Hybridization Protection Assay (HPA) step is recommended to minimize

amplicon contamination in the assay. This dedicated area should be separated from the specimen andreagent preparation and amplification areas.

Q. To help prevent lab areas from becoming contaminated with amplicon, the laboratory area should bearranged with a uni-directional workflow. For example, proceed from specimen and reagent preparation toamplification and then to HPA areas. Specimens, equipment, and reagents should not be returned to thearea where a previous step was performed. Also, personnel should not move back into previous workareas without proper anti-contamination safeguards. It is strongly recommended that the biosafety cabinetused for specimen processing not be used for performing the MTD test.

SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TESTThe MTD test utilizes Transcription-Mediated Amplification (TMA) and the Hybridization Protection Assay(HPA2) to qualitatively detect M. tuberculosis complex ribosomal ribonucleic acid (rRNA). The MTD test willdetect rRNA from both cultivable and non-cultivable organisms. Organisms of the M. tuberculosis complexinclude M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti and M. canetti (12,13). The MTDtest will detect all organisms within the M. tuberculosis complex. However, M. microti infects only animals,M. bovis is uncommonly transmitted from infected animals to humans, and M. africanum causes pulmonarydisease in humans in tropical Africa12. M. tuberculosis is by far the most common member of the complexthat is responsible for human disease worldwide. The CDC has recently reported a rise in the incidence of

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tuberculosis associated with AIDS, foreign-born cases, and increased transmission in higher riskpopulations6,9. There has also been a rise in the number of M. tuberculosis strains that are resistant to one ormore than one antituberculous drugs11. The public health implications of these facts are considerable.Conventional culture methodologies can detect tuberculosis growth as early as 1 week, but may take up to 8weeks7,10. Comparatively, the MTD test provides detection of M. tuberculosis complex rRNA within 2.5 to 3.5hours after beginning the test procedure. Thus, while the MTD test cannot ascertain drug susceptibility, it canresult in rapid and reliable detection of M. tuberculosis. This could lead to more appropriate use of isolationfacilities, more appropriate initiation of therapy, and earlier detection and containment of infected contacts3.PRINCIPLES OF THE PROCEDUREThe MTD test is a two-part test in which amplification and detection take place in a single tube. Initially,nucleic acids are released from mycobacterial cells by sonication. Heat is used to denature the nucleic acidsand disrupt the secondary structure of the rRNA. The Gen-Probe Transcription-Mediated Amplification (TMA)method, using a constant 42°C temperature, then amplifies a specific mycobacterial rRNA target bytranscription of DNA intermediates, resulting in multiple copies of mycobacterial RNA amplicon.M. tuberculosis complex-specific sequences are then detected in the RNA amplicon using the Gen-ProbeHybridization Protection Assay (HPA) method2. The Mycobacterium Tuberculosis Hybridization Reagent con-tains a single-stranded DNA probe with a chemiluminescent label. This probe is complementary to M. tuber-culosis complex-specific sequences. When stable RNA:DNA hybrids are formed between the probe and thespecific sequences, hybridized probe is selected and measured in a GEN-PROBE LEADER luminometer.REAGENTS (50 TEST KIT)Reagents for the MTD test are provided as follows:

Reagent Name VolumeMYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS AMPLIFICATION TRAYMycobacterium Specimen Dilution Buffer (SDB) 1 x 2.5 mL

Tris buffered solution containing < 3% detergentMycobacterium Tuberculosis Amplification Reagent (A) 1 x 3 mL

Nucleic acids lyophilized in tris buffered solution containing 5% bulking agent (when reconstituted)Mycobacterium Amplification Buffer (AB) 1 x 3 mL

Aqueous solution containing preservativesMycobacterium Oil Reagent (O) 1 x 10 mL

Silicone OilMycobacterium Enzyme Reagent (E) 1 x 1.5 mL

Reverse transcriptase and RNA polymerase lyophilized in HEPES (when reconstituted)buffered solution containing < 10% bulking agent and > 15 mM N-acetyl-L-cysteine

Mycobacterium Enzyme Dilution Buffer (EDB) 1 x 1.5 mLTris buffered solution containing a surfactant and glycerol

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS HYBRIDIZATION TRAYMycobacterium Tuberculosis Hybridization Reagent (H) 1 x 6 mL

< 100 ng/vial non-infectious DNA probe with a chemiluminescent label (when reconstituted)lyophilized in succinate buffered solution containing bulking agent and detergent

Mycobacterium Hybridization Buffer (HB) 1 x 6 mL

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Succinate buffered solution containing < 4% detergentMycobacterium Selection Reagent (S) 1 x 15 mL

Borate buffered solution containing surfactantMycobacterium Lysing Tubes (LT) 2 x 25 Tubes

Glass Beads, Bulking AgentSTORAGE AND HANDLING REQUIREMENTSA. The following liquid or unreconstituted components must be stored at 2° to 8°C and are stable until the

expiration date indicated:Mycobacterium Specimen Dilution Buffer (SDB)Mycobacterium Tuberculosis Amplification Reagent (A)Mycobacterium Amplification Buffer (AB)Mycobacterium Enzyme Reagent (E)Mycobacterium Enzyme Dilution Buffer (EDB)Mycobacterium Tuberculosis Hybridization Reagent (H)

The reconstituted Mycobacterium Tuberculosis Amplification Reagent (A) is stable for 2 months at 2° to 8°C.The Mycobacterium Tuberculosis Hybridization Reagent (H) and the Mycobacterium Enzyme Reagent (E) arestable for 1 month at 2° to 8°C after reconstitution, or for 2 months at -20°C or colder if stored as frozenaliquots on the day of initial reconstitution. Frozen aliquots must be used on the day thawed. Frost-freefreezers must not be used.B. The following kit components are stable when stored at 2° to 25°C until the expiration date indicated.

Mycobacterium Oil Reagent (O)Mycobacterium Hybridization Buffer (HB)Mycobacterium Selection Reagent (S)Mycobacterium Lysing Tubes (LT)

SPECIMEN COLLECTION, STORAGE, TRANSPORT, AND PROCESSINGSpecimen Collection and Storage:Specimens must be collected in sterile plastic containers, and stored at 2° to 8°C until transported orprocessed. Specimens included in the clinical trial were stored for no more than 4 days (generally less than24 hours) prior to processing.Transport:Transport specimens to the laboratory as soon as possible according to appropriate regulations.Processing (Decontamination and Concentration):Specimens that are grossly bloody should not be tested with the MTD test. The MTD test is designed todetect rRNA from members of the M. tuberculosis complex using sediments prepared from generally acceptedcurrent adaptations of the NALC-NaOH or NaOH decontamination protocols described by the CDC using 1%to 1.5% NaOH for 15 to 20 minutes and centrifugation at > 3,000 x g 7.Processed Sediment Storage:Sediments may be stored at 2° to 8°C for up to 3 days prior to testing. Sediments may also be stored frozenat -20° or -70°C for up to 6 months. Frost-free freezers must not be used.

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MATERIALSA. Materials Provided

(bioMérieux Ref. No. 39006 / Gen-Probe Cat. No. 301001/1001F) 50 TestsMYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS AMPLIFICATION TRAYMycobacterium Specimen Dilution Buffer (SDB) 1 x 2.5 mLMycobacterium Tuberculosis Amplification Reagent (A) 1 x 3 mL (when reconstituted)Mycobacterium Amplification Buffer (AB) 1 x 3 mLMycobacterium Oil Reagent (O) 1 x 10 mLMycobacterium Enzyme Reagent (E) 1 x 1.5 mL (when reconstituted)Mycobacterium Enzyme Dilution Buffer (EDB) 1 x 1.5 mLMYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS HYBRIDIZATION TRAYMycobacterium Tuberculosis Hybridization Reagent (H) 1 x 6 mL (when reconstituted)Mycobacterium Hybridization Buffer (HB) 1 x 6 mLMycobacterium Selection Reagent (S) 1 x 15 mLMycobacterium Lysing Tubes (LT) 2 x 25 TubesSealing Cards 1 package

B. Materials Required But Not ProvidedMicropipettes capable of dispensing 25 μL, 50 μL, 100 μL, 200 μL, 300 μL, and 450 μLVortex mixerSterile water (filtered or autoclaved)Culture tubesSterile 3 mm glass beadsScrew cap microcentrifuge tubesAmplification Positive Cell Controls (e.g., M. tuberculosis, ATCC 25177 or ATCC 27294)Amplification Negative Cell Controls (e.g., M. gordonae, ATCC 14470, or M. terrae, ATCC 15755)Household bleach (5.25% hypochlorite solution)Plastic-backed laboratory bench covers1000 μL pipette tips with hydrophobic plugs

C. Additional Materials Available From Your Gen-Probe Distributor:GEN-PROBE LEADER 50i Luminometer (bioMérieux ref. 39400 / Gen-Probe Cat. No. 103100i/3100i)GEN-PROBE Ultrasonic Water Bath (bioMérieux ref. 39409 / Gen-Probe Cat. No. 901104/T460)GEN-PROBE Detection Reagent Kit (bioMérieux ref. 39300 / Gen-Probe Cat. No. 201791/1791)GEN-PROBE MTD Amplification Controls (bioMérieux ref. 39223/Gen-Probe Cat. No. 301043F/1043F) GEN-PROBE Dry Heat Bath A (42° ± 1°C, 60° ± 1°C, and 95° ± 5°C) (bioMérieux ref. 39405, 39406,39407 / Gen-Probe Cat. No. 3396, 3397, 3398)

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GEN-PROBE Ultrasonic Water Bath Rack (bioMérieux ref. 39313 / Gen-Probe Cat. No. 104027/4027)Test tube racks (bioMérieux ref. 39311 / Gen-Probe Cat. No. 3994)Extended length pipette tips with hydrophobic plugs (1250 μL) (bioMérieux ref. 39315 / Gen-Probe Cat. No. 104316/4316)Tubes, polypropylene, 12 x 75 mm (bioMérieux ref. 39308 / Gen-Probe Cat. No. 102440/2440)Snap top polypropylene caps for 12 x 75 mm tubes (bioMérieux ref. 39320 / Gen-Probe Cat. No. 400713)

TEST PROCEDUREControlsCells used for the Amplification Positive Cell Control should be a member of the M. tuberculosis complex,such as avirulent H37Ra (ATCC 25177) or virulent H37Rv (ATCC 27294). Cells used for the Negative CellControl should be MOTT, such as M. gordonae (ATCC 14470) or M. terrae (ATCC 15755). Controls must beprepared prior to sample testing.

Cell controls must contain 25 - 150 CFU per 50 μL so that a final concentration of 1 - 10 CFU per assay isachieved. This concentration should be verified by culture. These cell controls will be utilized in the prepara-tion of Specimen Processing Controls. (See Sample Preparation.)1. Suggested Preparation of Cell Controls

a. Place 3 to 5 sterile 3 mm glass beads in a clean culture tube.b. Add 1-2 mL sterile water. Add several 1 μL loopfuls of growth from the appropriate culture. Cap the

tube and vortex repeatedly at high speed.c. Allow the suspension to settle for 15 minutes.d. Transfer the supernatant to a clean culture tube. Adjust turbidity to the equivalent of a #1 McFarland

nephelometer standard using a McFarland reference.e. Make a 1:100 dilution of the suspension by placing 100 μL of the #1 McFarland suspension into 10

mL sterile water. Cap and vortex. This is Dilution 1.f. Make a second 1:100 dilution by placing 100 μL of Dilution 1 into 10 mL sterile water. Cap and vortex.

This is Dilution 2. This dilution should contain approximately 25 - 150 CFU per 50 μL.Aliquotting and Storage of Cell Controlsa. The dilutions must be aliquotted into clean 1.5 mL screw cap microcentrifuge tubes as single use

aliquots (500 μL) and stored frozen at -20°C for 6 months or -70°C for 1 year. Frost-free freezersmust not be used.

Testing of the recommended M. tuberculosis cell positive control will monitor for substantial reagent failureonly. The positive control is designed to monitor effect of reagents used during processing for interferencefrom excess NaOH and phosphate buffer. Procedural variations in timing or temperatures that may affect effi-ciency of amplification or adequacy of selection time may not be detected using the recommended cell con-trols. Additional controls may be tested according to guidelines or special requirements. 2. Specimen Inhibition Controls

If the MTD test is negative and the physician strongly suspects that the patient has tuberculosis, it is possi-ble to check for specimen inhibition using the following procedure:a. Place 50 μL Specimen Dilution Buffer into 2 Mycobacterium Lysing Tubes (LT) (seeded and unseeded).b. Add 50 μL Amplification Positive Cell Control and 450 μL sediment to 1 tube (seeded). Add 450 μL sed-

iment to the second tube (unseeded). Proceed with the testing as usual.

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InterpretationIf the RLU value of the seeded tube is > 30,000, then the sample does not inhibit amplification and thereapparently was no target available for amplification. If the RLU value of the seeded tube is below 30,000,then the sample inhibits amplification and another sample should be evaluated. If the repeat testing of theunseeded specimen is positive, the MTD test result may be reported as positive. The most likely explana-tion for this type of result is random sampling variability; i.e., that the first aliquot did not contain target foramplification, while the second aliquot did. The RLU value of the unseeded tube may be either positive ornegative because the aliquot of sediment may or may not contain M. tuberculosis rRNA.

3. Laboratory Contamination Monitoring ControlTo monitor for laboratory contamination with amplicon or M. tuberculosis cells, the following procedure canbe performed:a. Place 1 mL of sterile water in a clean tube. Wet a sterile polyester or dacron swab with sterile water.b. Wipe area of bench or equipment to be tested.c. Place the swab in the water and swirl gently. Remove the swab while expressing it along the side of

the tube. Discard the swab into a container containing a 1:1 dilution of household bleach.d. Add 25 μL of the water containing the expressed swab material into an Amplification Tube containing

50 μL Amplification Reagent and 200 μL Oil Reagent.e. Follow the TEST PROCEDURE for amplification and detection.InterpretationIf the results are > 30,000 RLU, the surface is contaminated and should be decontaminated by treatingwith a bleach as recommended in TEST PROCEDURE, Equipment Preparation. If contamination of thewater bath is suspected, 25 μL of water bath water can be amplified as described for the expressed swabmaterial providing no antimicrobials are used in the water bath.

Equipment Preparation1. For optimal transfer of sonic energy in an ultrasonic water bath, water must be thoroughly degassed

according to the following procedure prior to each run:a. Add enough ambient temperature tap water to fill the ultrasonic water bath to within 1/2 inch of the top

of the tank.b. Run the ultrasonic water bath for 15 minutes to thoroughly degas the water.

2. Adjust 1 dry heat bath to 95°C, 1 dry heat bath or water bath to 60°C and another dry heat bath or waterbath to 42° ± 1°C.

3. Wipe down work surfaces, equipment, and pipettors with a 1:1 dilution of household bleach prior to start-ing. Bleach must be in contact with the surface for at least 15 minutes. Work surfaces may be wiped withwater to remove the bleach. Cover the surface on which the test will be performed with plastic-backedlaboratory bench covers.

4. Prepare the GEN-PROBE LEADER Luminometer for operation. Make sure there are sufficient volumes ofDetection Reagents I and II to complete the tests and ensure that the reagent lines are primed. Refer tothe Instrument Operator’s Manual for further instructions on loading of Detection Reagents. (DetectionReagents are sold separately).

Reagent PreparationReconstitute the vial (50 tests) of lyophilized Mycobacterium Tuberculosis Amplification Reagent (A) with3.0 mL Mycobacterium Amplification Buffer (AB). Vortex until the solution is mixed. Let reconstituted reagentsit at room temperature until clear. The reconstituted Mycobacterium Tuberculosis Amplification Reagent maybe stored at 2° to 8°C for 2 months. The reconstituted Mycobacterium Tuberculosis Amplification Reagentshould be allowed to come to room temperature before use.

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Sample Preparation1. Label a sufficient number of Mycobacterium Lysing Tubes (LT) to test the samples and 1 each of either the

Amplification Cell Positive and Negative or the Specimen Processing Positive and Negative Controls.Remove and retain the caps.

2. Pipette 50 μL Mycobacterium Specimen Dilution Buffer (SDB) into all Mycobacterium Lysing Tubes (LT).Follow the directions in A or B below for controls and in C for specimens.A. Specimen Processing Controls:

For each control, add 1 mL of the NALC/NaOH solution and 3 mL of phosphate buffer used to processsputum with 1 mL of sterile water to a sample processing tube. i. Vortex to mix.ii. Transfer 450 μL of the NALC/NaOH/phosphate buffer solution and 50 μL Cell Control dilution to

the correspondingly labeled Mycobacterium Lysing Tube (LT).B. If Amplification Cell Controls are being used, transfer 450 μL Amplification Cell Control from its con-

tainer to the correspondingly labeled Mycobacterium Lysing Tube (LT).C. Specimen: Transfer 450 μL decontaminated well-vortexed specimen from its container to the corre-

spondingly labeled Mycobacterium Lysing Tube (LT).3. Recap the Mycobacterium Lysing Tubes (LT) after addition of each sample.4. Vortex 3 seconds.Sample Lysis1. Push the Mycobacterium Lysing Tubes (LT) through the ultrasonic water bath rack so that the reaction mix-

ture in the bottom of the tube is submerged but the caps are above water. Place ultrasonic water bathrack on ultrasonic water bath. DO NOT ALLOW THE TUBES TO TOUCH THE BOTTOM OR SIDES OFTHE ULTRASONIC WATER BATH.

2. Place rack on ultrasonic water bath for 15 minutes but no more than 20 minutes. Samples and controlsthat have been sonicated are now referred to as “lysates”. DO NOT VORTEX LYSATES.

Amplification1. Label amplification tubes (12 x 75 mm polypropylene tubes) near the top of the tube with numbers that cor-

respond to those used on the Mycobacterium Lysing Tubes (LT). Also label amplification tubes for each ofthe Amplification Cell Positive and Negative Controls. If RNA controls are being used, label amplificationtubes to correspond to Negative and Positive Controls.

2. Add 50 μL reconstituted Mycobacterium Tuberculosis Amplification Reagent to the bottom of eachamplification tube using a repeat pipettor. Add 200 μL Mycobacterium Oil Reagent (O) to each amplifica-tion tube using a repeat pipettor.

3. DO NOT VORTEX LYSATE. Transfer 25 μL lysate to the bottom of the appropriately labeled amplificationtube using a separate extended length hydrophobically plugged pipette tip for each transfer. Remaininglysate may be stored at 2° to 8°C for up to 7 days or stored frozen at -20°C or below for up to 1 month.Frost-free freezers must not be used. If additional testing is to be performed on patient specimen lysates,bring stored lysate to room temperature. DO NOT VORTEX LYSATE.

4. Incubate the tubes at 95°C for 15 minutes, but no more than 20 minutes, in the dry heat bath.5. Prepare the enzyme mix by adding 1.5 mL Mycobacterium Enzyme Dilution Buffer (EDB) to the lyophilized

Mycobacterium Enzyme Reagent (E). Swirl to mix. Do not vortex. The reconstituted Enzyme Reagent isstable for 1 month at 2° to 8°C or for 2 months at -20°C or colder if stored as frozen aliquotsB on the day ofinitial reconstitution. If testing with frozen enzyme aliquots, first bring frozen aliquot to room temperature;do not thaw aliquots at elevated temperatures. To mix aliquot after thawing, gently aspirate and expel mix-ture with repeat pipettor before adding to amplification tubes.

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6. Transfer the tubes to the 42° ± 1°C dry heat bath or water bath and allow them to cool for 5 minutes. DONOT ALLOW THE TUBES TO COOL AT ROOM TEMPERATURE. DO NOT COVER THE WATER BATH.

7. Add 25 μL enzyme mix to each amplification tube using a repeat pipettor while tubes are at 42° ± 1°C.Shake to mix. Incubate at 42°C for 30 minutes, but no more than 60 minutes. Sealing cards or snap capsshould be used during this incubation step. DO NOT COVER THE WATER BATH.

8. Tubes may be covered and placed at 2° to 8°C for up to 2 hours or at -20°C overnight after the 30 minuteincubation. If stored at -20°C overnight, tubes must be completely thawed at room temperature or nogreater than 60°C prior to the Hybridization step. If held overnight, snap caps rather than sealing cardsshould be used.

Hybridization1. Reconstitute lyophilized Mycobacterium Tuberculosis Hybridization Reagent (H) with 6 mL Mycobacterium

Hybridization Buffer (HB). Mycobacterium Tuberculosis Hybridization Reagent (H) and MycobacteriumHybridization Buffer (HB) must be at room temperature prior to reconstitution. If MycobacteriumHybridization Buffer (HB) has been refrigerated, warm at 60°C while swirling gently to ensure that all thecomponents are in solution. Vortex until the solution is clear (this could take up to 1 minute) to ensure thatall components are in solution. The reconstituted Hybridization Reagent is stable for 1 month at 2° to 8°Cor for two months at -20°C or colder if stored as frozen aliquotsC on the day of initial reconstitution. If thereconstituted Hybridization Reagent has been refrigerated or frozen, warm at 60°C while swirling gently toensure that all components are in solution.

2. Add 100 μL reconstituted Hybridization Reagent to each tube using a repeat pipettor. Cover tubes withsealing cards or snap caps. Vortex 3 times for at least 1 full second each timeD at medium speed. Toachieve proper mixing in reaction tube(s), maintain tubes in an upright position and allow reaction mixtureto reach upper half of tube wall throughout vortexing procedure. (To avoid possible contamination do notallow reaction mixture to come in contact with sealing cards or caps.) After adequate vortexing, the reac-tion mixture should be uniformly yellow.

3. Incubate at 60°C for 15 minutes, but no more than 20 minutes, in a dry heat bath or water bath.Selection1. Mycobacterium Selection Reagent (S) must be at room temperature prior to starting the test. Remove

tubes from the 60°C water bath or dry heat bath and add 300 μL Mycobacterium Selection Reagent (S)using a repeat pipettor. Cover tubes with sealing cards or snap caps. Vortex 3 times for at least 1 fullsecond each timeD at medium speed. To achieve proper mixing in reaction tube(s), maintain tubes in anupright position and allow reaction mixture to reach upper half of tube wall throughout vortexing procedure.(To avoid possible contamination do not allow reaction mixture to come in contact with sealing cards orcaps.) After adequate vortexing the reaction mixture should be uniformly pink.

2. Incubate tubes at 60°C for 15 minutes, but no more than 16 minutes, in a dry heat bath or water bath.3. Remove tubes from the water bath or dry heat bath. Cool tubes at room temperature for at least 5 minutes

but not more than 1 hour. Remove sealing cards or caps just prior to detection.Detection1. Select the appropriate protocol from the menu of the luminometer software. Use a 2 second read time.2. Using a damp tissue or lint-free paper towel, wipe each tube to ensure that no residue is present on the

outside of the tube, and insert the tube into the luminometer according to the instrument directions. Tubesmust be read within 1 hour of Selection Step 3.

3. When the analysis is complete, remove the tube(s) from the luminometer.4. After reading the reaction tubes, carefully fill them to the top with a 1:9 dilution of household bleach using a

squirt bottle. Allow tubes to sit with solution for a minimum of 1 hour before discarding. This will help toprevent contamination of the laboratory environment with amplicon.

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5. Test tube racks, including racks used for the specimens and tests, should be decontaminated by completeimmersion in a 1:1 dilution of household bleach for a minimum of 15 minutes. The bleach should then berinsed off with water and the racks should be wiped dry or allowed to air dry.

6. Decontaminate the laboratory surfaces and equipment using a 1:1 dilution of household bleach.Repeat Testing1. If additional testing is to be performed on patient specimen lysates, bring prepared lysate to room

temperature. DO NOT VORTEX LYSATE.2. Follow TEST PROCEDURE protocol as outlined, beginning with the Amplification step.PROCEDURAL NOTESA. Reagents

1. Enzyme Reagent should not be held at room temperature for more than 15 minutes after it is reconstituted.

2. Mycobacterium Hybridization Buffer (HB) may precipitate. Warming and mixing the MycobacteriumHybridization Buffer (HB) or reconstituted Hybridization Reagent at 60°C will dissolve the precipitate.

B. Temperature1. The amplification, hybridization and selection reactions are temperature dependent; ensure that the

water bath or dry heat bath is maintained within the specified temperature range.2. The tubes must be cooled at 42°C for 5 minutes before addition of enzyme mix for optimal amplification

performance.3. The temperature is critical for the amplification (42° ± 1°C).

C. TimeIt is critical that the time limits specified in the TEST PROCEDURE be followed.

D. Water Bath1. The level of water in the water bath should be maintained to ensure that the entire liquid reagent

volume in the reaction tubes is submerged, but the level must not be so high that water gets into thetubes.

2. During the Amplification step, water bath covers should not be used to ensure that condensate cannotdrip into or onto the tubes.

E. VortexingIt is important to have a homogeneous mixture during the Hybridization and Selection steps, specificallyafter the addition of the reconstituted Mycobacterium Tuberculosis Hybridization Reagent (H) (the reactionmixture will be uniformly yellow) and Mycobacterium Selection Reagent (S) (the reaction mixture will beuniformly pink).Vortexing is the manipulation of a solution to produce a uniform suspension. When the reagents areplaced into a test tube and supplied with an external energy source, a rapid rotation of the solution aboutthe tube axis is produced. The output of this rapid rotation is the production of a uniform test suspension.During vortexing the tubes should be held in an upright, vertical position and supported by the top portionof the tube to ensure that adequate vortexing is achieved. If an adequate vortexing motion is achieved,the suspension rotates in a circular motion at a rate capable of lifting the solution to a height within theupper half of the tube. During the Hybridization and Selection steps, this manipulation is appliedsequentially 3 times and the vortex maintained for at least 1 full second each time.

TEST INTERPRETATIONThe specimen result when tested using the GEN-PROBE AMPLIFIED Mycobacterium Tuberculosis Direct(MTD) Test is interpreted based on an initial negative result (< 30,000 RLU), an initial positive result

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(> 500,000 RLU), or an initial equivocal result (30,000 to 499,999 RLU). The MTD test should be repeatedfrom the reserved lysate when an initial test result is equivocal. A repeat result from the lysate > 30,000 isconsidered positive.A. Quality Control Results and Acceptability

Controls should produce the following values:Amplification Cell Negative Control < 20,000 RLUAmplification Cell Positive Control > 500,000 RLUSpecimen Processing Negative Control < 20,000 RLUSpecimen Processing Positive Control > 1,000,000 RLU

Patient test results must not be reported if the MTD test control values do not meet the criteria above. SeeTROUBLESHOOTING section for further information.Target values for controls should be determined in each laboratory using test results for each batch of pre-pared controls.

B. Patient Test ResultsIf the controls do not yield the expected results, test results on patient specimens in the same run must notbe reported.Results:

> 500,000 RLU positive for M. tuberculosis complex rRNA< 30,000 RLU negative for M. tuberculosis complex rRNA30,000 to 499,999 RLU probable M. tuberculosis complex rRNA positive; repeat to verify results:

Repeat > 30,000 RLU positive for M. tuberculosis complex rRNARepeat < 30,000 RLU negative for M. tuberculosis complex rRNA

REPORTING OF RESULTSResults from the MTD test should be interpreted in conjunction with other laboratory and clinical data availableto the clinician. Based upon the degree of clinical suspicion, testing of an additional specimen should beconsidered.If the initial MTD test result is positive at > 500,000 RLU, or the repeat MTD test result is positive at > 30,000RLU, then report the following:

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Report: Mycobacterium tuberculosis complex rRNA detected. AFBsmear (positive or negative).

Additional Information: AFB culture pending. Specimen may contain both MOTTand M. tuberculosis or M. tuberculosis alone. This testshould not be the sole basis for diagnosing tuberculosis.The positive predictive value for a smear negative patientis lower than for a smear positive patient. This is particu-larly important in test populations where the prevalence oftuberculosis is low and the positive predictive values ofdiagnostic methods are correspondingly reduced.

English


If the initial or the repeat MTD test result is negative at <30,000 RLU, then report the following:

LIMITATIONSUse only for the detection of members of the M. tuberculosis complex using sediments prepared following theNALC-NaOH or NaOH procedures recommended by the CDC7. This test may only be used with sedimentsprepared from sputum (induced or expectorated), tracheal aspirates, or bronchial specimens (e.g., bron-choalveolar lavages and bronchial aspirates).The MTD test is specific for, but does not differentiate among, members of the M. tuberculosis complex, i.e.,M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti and M. canetti and M. terrae-like organismswill cross-react if present at concentrations higher than 30 CFU per test. However, M. celatum and M. terrae-like organisms are rare clinical isolates.Test results may be affected by specimen collection and transport, specimen sampling variability, laboratoryprocedural errors, sample misidentification, and transcriptional errors. A negative test does not exclude thepossibility of isolating an M. tuberculosis complex organism from the specimen.EXPECTED VALUESA. Range of Control Values Observed in the Clinical Studies

The RLU range for the controls observed in a 7 site clinical study was:

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Report: No Mycobacterium tuberculosis complex rRNA detected.AFB Smear (positive or negative).

Additional Information: No Mycobacterium tuberculosis complex rRNA detected.AFB culture pending. Specimen may not contain M. tuber-culosis, the result may be falsely negative due to low num-bers of M. tuberculosis in the presence or absence ofMOTT, or the result may be falsely negative due to assayinterference by specimen inhibitors. Testing of anotherpatient specimen is recommended if active tuberculosis isclinically suspected or specimen inhibition is suspected.


B. Range of RLU Values for Clinical SpecimensThe range of RLU values for the 127 specimens that were MTD test positive was 35,777 to > 2,000,000 RLU.For the 577 MTD test negative specimens, the range of values was 573 to 19,176 RLU.The frequency distribution of the RLU values for all these specimens after discrepant resolution is shownbelow: Discrepant resolution is based on the presence of other culture positive specimens from the samepatient and/or attending physician’s final diagnosis.

PERFORMANCE CHARACTERISTICSA. Clinical Evaluation

The original MTD test was evaluated in studies at 6 sites comparing AFB smear results to mycobacterialculture results in 6,079 specimens from 2,609 patients. Of these, 4,000 specimens were collected from1,898 patients not on antituberculous therapy. The 6 study sites were geographically diverse: 5 werelarge metropolitan hospital centers with tuberculosis treatment centers and one was a state public healthlaboratory.The current MTD test format was evaluated in a separate study at 7 sites comparing the MTD test results tomycobacterial culture results. The 7 study sites were geographically diverse; 6 sites were large metropolitanhospital centers with tuberculosis treatment centers and one was also a national mycobacteriology laboratory.

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English


The seventh site was a public health laboratory. Specimens from patients not on therapy were tested. Of these,132 were culture positive for M. tuberculosis complex. MTD detected 119 of these culture positive specimens; 7specimens grew MOTT in addition to M. tuberculosis.

Patients with suspected active pulmonary tuberculosis and not on therapy were enrolled in this study. Theoverall prevalence of patients that were culture positive for M. tuberculosis was 20.5%.The overall MTD test sensitivity by patient was 93.3% and specificity by patient was 99.1% compared toculture results. The overall MTD test sensitivity by specimen was 90.6% and specificity by specimen was99.6% compared to culture results. Results from the 7 sites for sensitivity, specificity, Positive PredictiveValue (PPV), and Negative Predictive Value (NPV) are shown in the following table, along with the 95%confidence intervals for the performance estimates. All data are shown subsequent to discrepantresolution based on the presence of other culture positive specimens from the same patient and/or attend-ing physician’s final diagnosis.

Of the 564 specimens that were culture and MTD negative for M. tuberculosis complex, 114 specimensgrew MOTT on culture, 64 were from patients with other cultures positive for MOTT, and 169 were frompatients with negative mycobacterial cultures.

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B. Precision StudiesPrecision panels, consisting of 2 negative samples, 2 low positive samples (ª 100 CFU/test) and 2moderately high positive samples (ª 1000 CFU/test) were tested at 3 sites. The positive samples wereprepared by spiking a contrived moderately inhibitory sediment pool with known amounts ofM. tuberculosis. The samples were tested in triplicate twice a day for 3 days at the 3 sites. Positive andnegative amplification controls were included in each run.Because there was no significant site-to-site or day-to-day variability observed, the data from all 3 siteswere combined and are presented below. The RLU values measured are limited by the luminometerphotomultiplier tube. Therefore, values greater than 2,000,000 RLU are truncated. No standard deviationor % CV values are given.

C. ReproducibilityThe reproducibility panel consisted of 25 samples with Amplification Negative Controls interspersedbetween each sample for a total of 50 samples. The Reproducibility Panel was tested at 4 sites.Overall, 100% (120/120) of the negative samples yielded the expected results and 98.8 % (79/80) of thepositive samples yielded the expected results.

D. Analytical SpecificitySpecificity of the MTD test was assessed using bacteria, fungi, and viruses. For bacteria and fungi,specificity testing included 160 strains (151 species from 62 genera) of closely related mycobacteria, otherorganisms causing respiratory disease, and normal respiratory flora or organisms representing across-section of phylogeny. Type strains were obtained from the American Type Culture Collection(ATCC), and 5 isolates were obtained from clinical laboratories. Lysates prepared from actively growingcultures (or rRNA in 3 cases) were evaluated in the MTD test according to the TEST PROCEDURE.Approximately 5 x 107 CFU per reaction were tested. Only strains of the M. tuberculosis complex yieldedpositive results, with the exception of M. celatum and M. terrae-like strains.At concentrations higher than 30 CFU per test, M. celatum and some M. terrae-like strains will yieldpositive MTD test results. At a level of 30 CFU per test, M. celatum yielded 26,772 RLU and M. terrae-likeranged from 19,470 to 49,976 RLU.

E. Limits of DetectionThirty (30) strains of M. tuberculosis from a wide geographic distribution, including representativedrug-resistant and drug-sensitive strains, were detected with the MTD test. The MTD test detected 1 CFUper test of all 30 strains.

F. RecoveryTwenty-five (25) fg Mycobacterium tuberculosis rRNA (equivalent to 5 CFU per test) were tested in thepresence of approximately 540,000 CFU per test (450 μL) of the following relevant non-target organisms:Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa,

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English


Mycobacterium gordonae, M. avium, M. kansasii, M. terrae, Nocardia asteroides, N. otitidis-caviarum,Corynebacterium pseudotuberculosis, C. diphtheriae, Gordona sputi, and Rhodococcus bronchialis. All testresults were positive for M. tuberculosis rRNA in the presence of these non-target organisms.

TROUBLE SHOOTING

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OBSERVATIONElevated Amplification CellNegative Control or SpecimenProcessing Negative Control (> 20.000 RLU)

Low Amplification Cell PositiveControl or Specimen ProcessingPositive Control(< 500.000 RLU)

POSSIBLE CAUSES• Insufficient mixing or volume

added after addition of theMycobacterium SelectionReagent (S).

• Insufficient care taken duringset up of the reactions andthe resultant amplification ofcontaminating materialsintroduced at that time.

• Skipped 5 minute cool downstep.

• Contamination of lab surfaceor reagents.

• Failure to wipe tubes prior toreading in the luminometer.

• Performed the amplificationstep outside the recommend-ed temperature range.

• Added Amplification Reagentto the side instead of to thebottom of the tube.

• Insufficient mixing after addi-tion of the reconstitutedMycobacterium TuberculosisHybridization Reagent.

• Added too much SelectionReagent.

• Allowed the Selection step togo over the recommendedtime limit.

• Allowed the tubes to cooldown below 42°C after the95°C incubation.

• Detection Reagent linesclogged.

RECOMMENDED ACTIONSAchieve complete mixing.Ensure correct volume isadded. Visually verify a uni-formly pink solution after vor-texing.Exercise extreme care whenpipetting. The spent reactiontubes must be decontaminatedwith a 1:9 dilution of householdbleach as described in theTEST PROCEDURE section.Laboratory bench surfaces, dryheat bath, water baths andpipettors must be decontami-nated with a 1:1 dilution ofhousehold bleach as describedin the TEST PROCEDURE.

Tubes must be wiped with adamp tissue or lint-free papertowel prior to reading in theluminometer.Check water bath and/or dryheat bath temperature andadjust as necessary to achievethe temperature ranges speci-fied in procedure.

Carefully vortex as specified.(See Hybridization, Step 2.)Visually verify solution is yellowafter vortexing.Check pipettor volume setting.

Carefully time the 60°C incuba-tion in the Selection step to be15 minutes.Transfer tubes directly from the95°C dry heat bath to the 42°Cwater bath/dry heat bath.Perform warm water flushes asdescribed in the InstrumentOperator’s Manual.


NOTESA Heating blocks must have wells properly sized for 12 x 75 mm tubes. Use of GEN-PROBE dry heat bath

is recommended.B Screw-capped microcentrifuge tubes are recommended for storage of frozen aliquots. Individual frozen

aliquots may be frozen and thawed for use no more than once. Frost-free freezers must not be used.C 5 mL cryovials are recommended for storage of frozen aliquots. Individual frozen aliquots may be frozen

and thawed for use no more than once. Frost-free freezers must not be used.D Due to vortexing equipment differences and set speed variations, a longer vortex time may be required

depending on individual vortexing equipment. Adjust vortexer speed and follow vortex handling proceduresas described under PROCEDURAL NOTES, Section E, to allow reaction mixture to reach and maintain aheight within the upper half of the tube. Adequate vortexing as described is necessary to achieve accurateassay results. Times may be increased up to a total of 15 seconds without affecting assay results.

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English


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AMPLIFIED MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS DIREKTTESTPackung mit 50 Tests

(bioMérieux Best.Nr. 39006 / Gen-Probe Kat. Nr. 301001/1001F)VERWENDUNGSZWECKDer GEN-PROBE AMPLIFIED Mycobacterium Tuberculosis Direkttest (MTD) ist ein Nukleinsäure-Amplifizierungstest für den in vitro Nachweis von rRNA aus dem Mycobacterium tuberculosis Komplex inSedimenten, die aus Sputum (induziert oder expektoriert), Bronchialmaterial (Bronchiallavage oderBronchialaspirate) oder Trachealsekret gewonnen wurden.WARNHINWEISEDieser Test wurde nicht für den direkten Nachweis von M. tuberculosis rRNA aus anderen klinischen Proben(z.B. Blut, Urin oder Stuhl) evaluiert. Die Performance des MTD-Tests wurde nur für solche Proben ermittelt,die gemäß den in dieser Packungsbeilage beschriebenen Verfahren gewonnen und gemäß den angegebenenLagerungsbedingungen aufbewahrt wurden.Positive Sedimente müssen kultiviert werden, um festzustellen, ob die Probe neben M. tuberculosis Komplexauch atypische Mykobakterien (MOTT) enthält und um eine Resistenztestung durchzuführen. Desweiterensollten Kulturen angelegt werden, um zu bestimmen, welche M. tuberculosis Subspezies (z.B. M. bovis) vor-liegt.Obwohl im Verlauf klinischer Evaluierungen auch Probenmaterialien von Kindern, HIV-positiven Patienten undPersonen mit MOTT-Infektionen getestet wurden, sind die Gesamtzahlen nicht ausreichend, um darausschließen zu können, daß es keine statistischen Performanceunterschiede in diesen besonderenPatientengruppen gibt. Hinsichtlich einer Verlaufskontrolle oder eines Therapieerfolgs bei antituberkulotisch therapierten Patientenwurde der MTD-Test nicht evaluiert. Für den MTD-Test sollten keine blutigen Untersuchungsmaterialien verwendet werden.VORSICHTSMASSNAHMENA. Nur für die in vitro Diagnostik verwenden.B. Der MTD weist spezifisch Mykobakterien des M. tuberculosis Komplexes nach, d.h. M. tuberculosis, M.

bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti und M. canetti (13). Er ermöglicht jedoch keineDifferenzierung innerhalb dieser Spezies. M. celatum und M. terrae-ähnliche Mykobakterien können zuKreuzreaktionen führen, wenn sie in Konzentrationen über 30 KBE (Kolonie-bildenden Einheiten) pro Testvorhanden sind. M. celatum und M. terrae-ähnliche Mykobakterien werden jedoch selten aus klinischenProben isoliert.

C. Ein negatives Ergebnis schließt nicht aus, daß die Probe Keime des M. tuberculosis Komplex enthält. DieTestergebnisse werden durch Probenentnahme und Transport, Variabilitäten bei der Probenabnahme,technische Fehler des Labors, Fehler bei der Probenidentifikation und durch Fehler bei der Übermittlungder Ergebnisse beeinflußt.

D. Der Test ist nur für den Nachweis von Spezies des M. tuberculosis Komplex aus Proben bestimmt, die

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Deutsch


gemäß der vom Centers for Disease Control (CDC)7 empfohlenen NALC-NaOH oder NaOH Methodebehandelt wurden. Dieser Test darf nur mit konzentrierten Sedimenten aus Sputum (induziert oder expek-toriert), Trachealsekreten oder Bronchialmaterial (z.B. Bronchiallavagen, Bronchialaspirationen) verwendetwerden. Es muß darauf geachtet werden, daß die Phosphatkonzentration nach der Resuspension derProbe mit Phosphatpuffer 67 mM7 beträgt.

E. Vermeiden Sie jeden Kontakt der Detektionsreagenzien I und II (bioMérieux Best.Nr. 39300 / Gen-ProbeKat. Nr. 201791/1791) mit der Haut, den Augen oder den Schleimhäuten. Bei eventuellem Kontakt sofortmit Wasser spülen. Beim Verschütten einer dieser Reagenzien, die Flüssigkeit vor dem Aufwischen mitWasser verdünnen.

F. Beachten Sie bei der Durchführung dieses Tests die allgemein gültigen Vorsichtsmaßnahmen4. Bei derVorbereitung der Sedimente, sowie bei den einzelnen Arbeitsschritten des MTD-Tests sollten die mikrobiol-ogischen Vorschriften für den Sicherheitsbereich 2 beachtet werden 5.

G. Verwenden Sie nur die mitgelieferten oder empfohlenen Einweg-Labormaterialien.H. Die Arbeitsflächen, Pipetten und das Material müssen, wie im Abschnitt „TESTDURCHFÜHRUNG“

beschrieben, mit einer 1:1 verdünnten Chlorbleichlösung (ein Teil Bleiche, ein Teil Wasser) dekontaminiertwerden. Die Bleichlösung 15 min einwirken lassen und anschließend mit Wasser spülen und abwischen.

I. Verwenden Sie für die Durchführung dieses Tests Pipetten mit Spitzen, die einen hydrophoben Filterenthalten. Für den Transfer des Lysats aus den Lyseröhrchen in die Amplifizierungsröhrchen müssen extralange Spitzen mit hydrophobem Filter verwendet werden. Für jedes Reaktionsröhrchen muß eine neuePipettenspitze verwendet werden. Pipettenspitzen mit Probenmaterial sollten nicht über den Ständer mitden Reaktionsröhrchen geführt werden. Die Pipettenpitzen müssen nach Gebrauch sofort in einen dafürvorgesehenen Abfallbehälter entsorgt werden.

J. Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, achten Sie beim Pipettieren der Reagenzien mit derRepetierpipette bitte darauf, daß nach der Lysatzugabe in die Röhrchen, die Pipettenspitze nicht mit denRöhrchen in Kontakt kommt. Zur Vermeidung von Spritzern sollten die Reagenzien gegen die innereRöhrchenwand pipettiert werden. Vorsichtiges Pipettieren ist wichtig, um Kreuzkontaminationen zu vermei-den.

K. Für die Arbeitsschritte vor und nach der Amplifizierung müssen separate Pipetten verwendet werden.L. Nach Messung der Proben im Luminometer, dekontaminieren Sie die Röhrchen und entsorgen Sie diese

wie im Abschnitt „TESTDURCHFÜHRUNG“ und „ANMERKUNGEN“ beschrieben, umLaborkontaminationen mit Amplifikaten zu vermeiden.

M. Selbstklebefolien und Stopfen sollten nach dem Abnehmen von den Reaktionsröhrchen sofort in einendafür vorgesehenen Abfallbehälter entsorgt werden. Sie dürfen AUF KEINEN FALL wiederverwendet wer-den. Bei der Verwendung von Selbstklebefolie ist darauf zu achten, daß alle Röhrchen gut abgedichtetsind.

N. Die Wasserbäder während der Inkubationen nicht abdecken, insbesondere wenn Stopfen verwendet wer-den (Kondenswasser am Deckel ist eine mögliche Quelle für Kontaminationen).

O. Für die Erzielung akkurater Ergebnisse ist es wichtig, nach der Zugabe des Selektionsreagenzes ausrei-chend zu vortexen.

P. Zur Minimierung des Kontaminationsrisikos durch Amplikons wird empfohlen, den HPA (HybridizationProtection Assay)-Testschritt in einem separaten Arbeitsbereich durchzuführen. Dieser Arbeitsbereich solltevon den Arbeitsplätzen für Proben- und Reagenzvorbereitung sowie der Amplifizierung deutlich getrenntsein.

Q. Um Laborkontaminationen mit Amplikons zu vermeiden, sollten die Arbeitsabläufe in einer Richtung organ-isiert sein, z.B. von der Proben- und Reagenzvorbereitung zur Amplifizierung und anschließend zum HPA.Proben, Geräte und Reagenzien sollten nicht wieder in einen Bereich zurückgebracht werden, in denenein vorheriger Arbeitsschritt durchgeführt wurde. Desweiteren sollte das Laborpersonal nicht in vorherigeArbeitsbereiche zurückgehen, ohne entsprechende Sicherheitsmaßnahmen zur Vermeidung von

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Kontaminationen getroffen zu haben. Es wird dringend empfohlen, die Laminar Flow Box, die für dieProbenbehandlung verwendet wurde, nicht zur Durchführung des MTD Tests zu verwenden.

EINFÜHRUNGDer MTD-Test verwendet die Techniken TMA (Transcription-Mediated Amplification) und HPA (HybridizationProtection Assay)2 zum qualitativen Nachweis von ribosomaler Ribonukleinsäure (rRNA) von Mykobakteriendes M. tuberculosis Komplexes. Der MTD-Test weist sowohl die rRNA von kultivierbaren als auch von nichtkultivierbaren Organismen nach. Der M. tuberculosis Komplex umfaßt die Subspezies M. tuberculosis, M.bovis, M. bovis BCG, M. africanum M. microti und M. canetti (12, 13). Der MTD-Test weist alleMikroorganismen des M. tuberculosis Komplex nach. M. microti ist nur für Tiere infektiös, M. bovis wird seltenvom Tier auf den Menschen übertragen und M. africanum ist für die Lungentuberkulose im tropischen Afrikaverantwortlich12. M. tuberculosis ist der häufigste Erreger, der Tuberkulose. Das CDC hat kürzlich über einenAnstieg der Tuberkulose-Inzidenz bei AIDS-Patienten und Einwanderern und über eine Zunahme derKrankheitsübertragungen innerhalb von Hochrisikogruppen berichtet6,9. Außerdem wird ein Anstieg derAusbildung von resistenten bzw. multiresistenten Stämme gegenüber Antituberkulotika beobachtet11. DieKonsequenzen im Bereich der öffentlichen Gesundheit sind beträchtlich.Konventionelle Kulturmethoden können das Wachstum von Tuberkulose-Bakterien innerhalb von 1 bis 8Wochen nachweisen7,10. Der MTD-Test dagegen ermöglicht den rRNA Nachweis von Mykobakterien des M.tuberculosis Komplexes innerhalb von 2,5 bis 3,5 Stunden. Auch wenn der MTD-Test keine Aussage hin-sichtlich der Empfindlichkeit gegen Antibiotika macht, so weist er doch M. tuberculosis zuverlässig und schnellnach. Dadurch könnten die Isolierstationen der Krankenhäuser besser eingesetzt und schneller mit eineradäquaten Therapie begonnen werden. Die Isolierung von möglicherweise infizierten Kontaktpersonen könnterechtzeitig vorgenommen werden3.PRINZIPDer MTD-Test ist ein Test, bei dem Amplifizierung und Detektion in ein und demselben Röhrchen durchgeführtwerden. Zunächst werden die Nukleinsäuren der Mykobakterien durch Ultraschall freigesetzt. UnterHitzeeinwirkung werden die Nukleinsäuren denaturiert und die Sekundärstruktur der rRNA aufgebrochen.Mittels der Gen-Probe TMA Methode wird dann bei einer konstanten Temperatur von 42°C ein spezifischerAbschnitt der Mykobakterien rRNA amplifiziert. Dabei kommt es in einem Zwischenschritt durch Transkriptionzur Bildung von DNA, aus der wiederum sehr viele RNA Amplikons gebildet werden.Die M. tuberculosis Komplex spezifischen Sequenzen der rRNA Amplikons werden anschließend mit der Gen-Probe HPA Methode nachgewiesen2. Das Mycobacterium Tuberculosis-Hybridisierungsreagenz enthält eineeinzelsträngige DNA-Sonde, an die ein Chemiluminiszenzmarker gekoppelt ist. Diese Sonde ist zu den M.tuberculosis spezifischen Sequenzen komplementär. Die Sonde bildet mit diesen spezifischen Sequenzenstabile RNA-DNA Hybride. Nach einem Selektionsschritt wird das von den hybridisierten Sonden abgegebeneLichtsignal mit dem GEN-PROBE LEADER Luminometer detektiert. REAGENZIEN (Packung mit 50 Tests)Die Reagenzien des MTD-Tests werden folgendermaßen angeboten:Reagenz-Bezeichnung VolumenREAGENZIEN FÜR DIE AMPLIFIZIERUNGProbenverdünnungspuffer (SDB) ....................................................................................................1 x 2,5 ml

Tris-Pufferlösung mit < 3 % DetergenzAmplifizierungsreagenz (A) ................................................................................................................1 x 3 ml

Lyophilisierte Nukleinsäuren in Tris Pufferlösung mit 5 % Bindemittel (nach Auflösung)Amplifizierungspuffer (AB) ..................................................................................................................1 x 3 ml

Wässrige Lösung mit KonservierungsstoffenÖlreagenz (O)....................................................................................................................................1 x 10 ml

Silikonöl21

Deutsch


Enzymreagenz (E)............................................................................................................................1 x 1,5 mlReverse Transkriptase und RNA-Polymerase, lyophilisiert, in HEPES-Pufferlösung (nach Auflösung)mit < 10 % Bindemittel und > 15 mM N-Acetyl-L-Cystein

Enzymverdünnungspuffer (EDB)......................................................................................................1 x 1,5 mlTris Pufferlösung mit oberflächenaktiver Substanz und Glyzerin

HYBRIDISIERUNGS-REAGENZIENHybridisierungsreagenz (H) ................................................................................................................1 x 6 ml

Nicht-infektiöse Chemiluminiszenz-markierte DNA-Sonde, < 100 ng/Ampulle, (nach Auflösung)lyophilisiert, in Succinat-Pufferlösung mit Bindemittel und Detergenz

Hybridisierungspuffer (HB) ..................................................................................................................1 x 6 mlSuccinat-Pufferlösung mit < 4 % Detergenz

Selektionsreagenz (S) ......................................................................................................................1 x 15 mlBorat-Pufferlösung mit oberflächenaktiver Substanz

Lyseröhrchen (LT)..................................................................................................................2 x 25 RöhrchenGlaskügelchen, Bindemittel

LAGERUNGA. Die folgenden Lösungen bzw. nicht gelösten Bestandteile müssen bei 2° - 8°C gelagert werden und sind bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar:

Probenverdünnungspuffer (SDB)Amplifizierungsreagenz (A)Amplifizierungspuffer (AB)Enzymreagenz (E)Enzymverdünnungspuffer (EDB)Hybridisierungsreagenz (H)

Das aufgelöste Amplifizierungsreagenz (A) ist 2 Monate bei 2° - 8°C haltbar. Das Hybridisierungsreagenz (H)und das Enzymreagenz (E) sind nach der Auflösung 1 Monat bei 2° - 8°C haltbar oder 2 Monate bei einerTemperatur < -20°C, wenn sie am Tag der Auflösung portioniert und eingefroren werden. Die eingefrorenenAliquots müssen an dem Tag, an dem sie aufgetaut werden, verbraucht werden. Tiefkühlgeräte mit automatis-cher Abtauvorrichtung dürfen nicht verwendet werden.B. Folgende Bestandteile müssen bei 2° - 25°C gelagert werden und sind bis zum angegebenen

Verfallsdatum haltbar:Ölreagenz (O)Hybridisierungspuffer (HB)Selektionsreagenz (S)Lyseröhrchen (LT)

ENTNAHME, LAGERUNG, TRANSPORT UND VERARBEITUNG DER PROBENProbenentnahme und Lagerung:Die Proben müssen in sterilen Plastikbehältern gesammelt und bis zum Transport bzw. bis zur Verarbeitungbei 2° - 8°C gelagert werden. Die für klinische Studien verwendeten Proben wurden bis zur Verarbeitung nichtlänger als 4 Tage gelagert (im allgemeinen weniger als 24 Stunden).

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Transport:Die Proben sollten so schnell wie möglich ins Labor gebracht werden.Verarbeitung (Dekontamination und Konzentration):Stark bluthaltige Materialien sollten nicht mit dem MTD-Test getestet werden. Dieser Test ist für den Nachweisder rRNA von Mykobakterien des M. tuberculosis Komplex in solchen Proben bestimmt, die gemäß den allge-mein anerkannten Verfahren mit NALC-NaOH oder NaOH (mit 1 % bis 1,5 % NaOH) 15 bis 20 min dekonta-miniert und bei > 3000 x g zentrifugiert wurden 7.Lagerung der behandelten Proben:Das Sediment kann vor der Testung bis zu 3 Tage bei 2° - 8°C gelagert werden. Bei -20°C oder -70°C kann esbis zu 6 Monate gelagert werden. Tiefkühlgeräte mit automatischer Abtauvorrichtung dürfen nicht verwendetwerden.MATERIALA. LieferumfangPackungsinhalt (bioMérieux Best.Nr. 39006 / Gen-Probe Kat. Nr. 301001/1001F) 50 Tests

AMPLIFIZIERUNGSREAGENZIENProbenverdünnungspuffer (SDB) 1 x 2,5 mlAmplifizierungsreagenz (A) 1 x 3 ml (nach Auflösung)Amplifizierungspuffer (AB) 1 x 3 mlÖlreagenz (O) 1 x 10 mlEnzymreagenz (E) 1 x 1,5 ml (nach Auflösung)Enzymverdünnungspuffer (EDB) 1 x 1,5 mlHYBRIDISIERUNGSREAGENZIENHybridisierungsreagenz (H) 1 x 6 ml (nach Auflösung)Hybridisierungspuffer (HB) 1 x 6 mlSelektionsreagenz (S) 1 x 15 mlLyseröhrchen (LT) 2 x 25 RöhrchenSelbstklebefolien 1 Packung

B. Zusätzlich erforderliches Material:Mikropipetten für 25 μl, 50 μl, 100 μl, 200 μl, 300 μl und 450 μlRepetierpipetteVortexSteriles Wasser (filtriert oder autoklaviert)KulturröhrchenSterile Glaskügelchen 3 mmMikrozentrifugenröhrchen mit SchraubverschlußStänder für ReaktionsröhrchenPipettenspitzen mit Filter (1 000 μl)Positive Amplifizierungskontrolle (z.B. M. tuberculosis, ATCC 25177 oder ATCC 27294)Negative Amplifizierungskontrollen z.B. M. gordonae, ATCC 14470 oder M. terrae, ATCC 15755)Bleichlösung (Hypochloritlösung 5,25 %)

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Deutsch


Plastik-Abdeckfolien für die ArbeitsflächenC. Zusätzlich lieferbare Materialien:

GEN-PROBE Ultraschallbad (bioMérieux Best.Nr. 39409 / Gen-Probe Kat.Nr. No. 901104/T460)GEN-PROBE Heizblöcke (42°C ± 1°C, 60°C ± 1°C, 95°C ± 5°C)A (bioMérieux Best.Nr. 39405, 39406,39407 / Gen-Probe Kat.Nr. 3396, 3397, 3398)GEN-PROBE LEADER 50i Luminometer (bioMérieux Best.Nr. 39400 / Gen-Probe Kat.Nr. 103100i/3100i)GEN-PROBE Detektionsreagenzien-Kit (bioMérieux Best.Nr. 39300 / Gen-Probe Kat.Nr. 201791/1791)GEN-PROBE MTD Amplifizierungskontrollen (bioMérieux Best.-Nr. 39223 / Gen-Probe Kat.Nr. 301043F/ 1043F)GEN-PROBE Röhrchenständer für das Ultraschallbad (bioMérieux Best.Nr. 39313 / Gen-Probe Kat.Nr. 104027/ 4027)Ständer für Reaktionsröhrchen (bioMérieux Best.Nr. 39311 / Gen-Probe Kat.Nr. 3994)Lange Pipettenspitzen mit Filter (1250 μl) (bioMérieux Best.Nr. 39315 / Gen-Probe Kat.Nr. 104316/4316)Polypropylenröhrchen, 12 x 75 mm (bioMérieux Best.Nr. 39308 / Gen-Probe Kat.Nr. 102440/2440)Polypropylenstopfen für Röhrchen mit 12 x 75 mm (bioMérieux Best.Nr. 39320 / Gen-Probe Kat.Nr. 400713)

TESTDURCHFÜHRUNGKontrollenDie Stämme für die Amplifizierungs-Positivkontrolle müssen zum M. tuberculosis Komplex gehören, wie z.B.der avirulente H37Ra (ATCC 25177) Stamm oder der virulente H37Rv (ATCC 27294) Stamm. Die Stämme fürdie Negativkontrolle sollten zu den atypischen Mykobakterien (MOTT) gehören, z.B. M. gordonae (ATCC14470) oder M. terrae (ATCC 15755). Die Kontrollen müssen vor der Testung der Probe vorbereitet sein.

Die Kontrollen müssen 25 – 150 KBE pro 50 μl enthalten, so dass eine Endkonzentration von 1 – 10 KBE proTest erreicht wird. Diese Konzentration sollte kulturell überprüft werden. Diese Kontrollen werden für dieVorbereitung der Probenbehandlungskontrollen verwendet (siehe Probenvorbereitung).

1. Empfohlenes Verfahren zur Vorbereitung der Kontrollen a. Geben Sie 3 bis 5 sterile Glaskügelchen (Durchmesser 3 mm) in ein sauberes Kulturröhrchen. b. 1 bis 2 ml steriles Wasser zugeben. Nehmen Sie mehrere Impfösen (1 μl) von der entsprechenden

Kultur ab und geben Sie diese in das vorbereitete Röhrchen. Das Röhrchen verschließen undmehrmals bei hoher Geschwindigkeit vortexen.

c. Suspension für 15 min stehen lassen. d. Überführen Sie den Überstand in ein sauberes Kulturröhrchen. Stellen Sie die Trübung mit einem

Nephelometer auf McFarland Standard 1 ein. e. Verdünnen Sie die Suspension 1:100, indem Sie 100 μl der auf McFarland 1 eingestellten Suspension

in 10 ml steriles Wasser geben. Das Röhrchen verschließen und vortexen. Dies ist die Verdünnung 1. f. Anschließend eine zweite 1:100 Verdünnung herstellen. Geben Sie hierfür 100 μl der Verdünnung 1 in

10 ml steriles Wasser. Das Röhrchen verschließen und vortexen. Dies ist die Verdünnung 2. DieseVerdünnung sollte ca. 25 – 150 KBE pro 50 μl enthalten.

Portionierung und Lagerung der Kontrollen a. Die Verdünnungen müssen à 500 μl in saubere 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluß

pipettiert werden. Diese Aliquots sind für den einmaligen Gebrauch bestimmt und können 6 Monate bei

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–20°C oder 1 Jahr bei –70°C aufbewahrt werden. Verwenden Sie kein Tiefkühlgerät mit automatischerAbtauvorrichtung. Die Testung der empfohlenen M. tuberculosis Positivkontrolle dient nur zumNachweis eines wesentlichen Qualitätsverlustes der Reagenzien. Mit der Positivkontrolle wird dieEinwirkung durch überschüssiges NaOH und Phosphatpuffer auf die Reagenzien kontrolliert. Zeit- undTemperaturschwankungen im Test, welche die Amplifizierung oder Selektionszeit beeinflussen, könnenmit der empfohlenen Kontrolle nicht nachgewiesen werden. Weitere Kontrollen können den Richtlinienoder besonderen Anforderungen entsprechend getestet werden.

2. InhibitionskontrollenBei negativem MTD-Testergebnis und gleichzeitigem starken klinischen Verdacht auf das Vorliegen einerTuberkulose besteht die Möglichkeit, die Probe auf Inhibitoren zu untersuchen. Gehen Sie hierfür folgen-dermaßen vor:a 50 μl des Probenverdünnungspuffers in 2 Mykobakterien Lyseröhrchen (LT) pipettieren (angereichert

und nicht angereichert).b. In ein Röhrchen 50 μl der Positivkontrolle und 450 μl der Probe geben (angereicherte Probe). In das

zweite Röhrchen nur 450 μl Probe pipettieren (nicht angereichert). Führen Sie den MTD-Test wiegewohnt durch.

InterpretationBeträgt der RLU Wert (Relative Light Units) in der angereicherten Probe > 30.000 RLU, enthält die Probekeinen Amplifizierungsinhibitor und offensichtlich keine Zielsequenz für die Amplifikation. Liegt der RLUWert der angereicherten Probe unter 30.000 RLU, enthält die Probe einen Amplifizierungsinhibitor. FordernSie in diesem Fall neues Untersuchungsmaterial an. Ergibt sich bei der erneuten Testung der nichtangereicherten Probe ein positives Ergebnis, kann das MTD-Ergebnis als positiv bewertet werden. Diewahrscheinlichste Erklärung für diesen Reaktionstyp sind Schwankungen bei der Probengewinnung; d.h.im Gegensatz zur zweiten Probe enthielt die erste Probe keine Zielsequenz für die Amplifikation. Der RLU-Wert der nicht angereicherten Probe kann entweder positiv oder negativ sein, abhängig davon, ob das ver-wendete Aliquot aus dem Sediment M. tuberculosis Komplex rRNA enthielt oder nicht.

3. Kontaminationskontrolle des LaborsZur Überprüfung des Labors auf Kontamination mit M. tuberculosis Amplikons sollte folgendes Verfahrenangewendet werden:a. Geben Sie 1 ml steriles Wasser in ein sauberes Röhrchen. Befeuchten Sie einen sterilen Wattetupfer

aus Polyester oder Dacron mit sterilem Wasser.b. Wischen Sie mit diesem Tupfer über den Labortisch oder die verwendeten Geräte.c. Den Tupfer in das Röhrchen geben und sorgfältig mischen. Den Tupfer herausnehmen und an der

Röhrchenwand ausdrücken. Verwerfen Sie den Tupfer in einem Behälter, der 1:2 verdünnteBleichlösung (1 Teil Bleiche, 1 Teil Wasser) enthält.

d. 25 μl der so erhaltenen Lösung in ein Amplifizierungsröhrchen geben, das 50 μl Amplifizierungsreagenzund 200 μl Ölreagenz enthält.

e. Folgen Sie den Anleitungen im Abschnitt „TESTDURCHFÜHRUNG“.Interpretation

Bei Ergebnissen > 30.000 RLU ist die Oberfläche kontaminiert und muß mit Bleichlösung dekontaminiertwerden, wie im Abschnitt „TESTDURCHFÜHRUNG: Vorbereitung des Materials“ angegeben. Bei Verdachtauf eine Kontamination des Wasserbads, testen Sie 25 μl Wasser aus dem Wasserbad wie obenbeschrieben, vorausgesetzt das Wasserbad enthält keine Antiseptika.

Gerätevorbereitung1. Für eine optimale Energieübertragung im Ultraschallbad muß das Wasser vor jedem Betrieb des Gerätes

entgast werden:25

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a. Füllen Sie das Ultraschallbad bis ca. 1 cm unter den Rand mit Leitungswasser bei Raumtemperatur.b. Schalten Sie das Ultraschallbad für 15 min. ein, um das Wasser zu entgasen.

2. Einen Heizblock auf 95°C, einen Heizblock oder ein Wasserbad auf 60° ± 1°C und einen Heizblock oderein Wasserbad auf 42° ± 1°C einstellen.

3. Vor der Testdurchführung müssen die Arbeitsflächen, das Material und die Pipetten mit einer 1:2 verdün-nten Bleichlösung (1 Teil Bleiche, 1 Teil Wasser) gereinigt werden. Die Bleichlösung sollte min-destens 15 min. einwirken. Die Arbeitsfläche zur Entfernung der Bleichlösung mit Wasser abspülen. DieOberfläche, auf der der Test durchgeführt wird, mit einer Plastikunterlage abdecken.

4. Das GEN-PROBE LEADER Luminometer vorbereiten. Vergewissern Sie sich, daß für die Durchführungdes Tests ausreichend Detektionsreagenz I und II vorhanden ist und die Schläuche angeschlossen sind.Zum Nachfüllen der Detektionsreagenzien beachten Sie bitte die Hinweise im Handbuch desLuminometers (diese Reagenzien sind separat zu beziehen).

ReagenzvorbereitungDas Amplifizierungsreagenz (A) (50 Tests) mit 3 ml Amplifizierungspuffer (AB) aufnehmen. Vortexen bis dasReagenz gelöst ist. Das aufgelöste Reagenz solange bei Raumtemperatur stehen lassen, bis die Lösung klarwird. Das aufgelöste Amplifizierungsreagenz ist bei 2° - 8°C 2 Monate haltbar. Vor Gebrauch sollte die Lösungauf Raumtemperatur gebracht werden.Probenvorbereitung 1. Beschriften Sie eine ausreichende Zahl an Mycobacterium Lyseröhrchen (LT) für die Testung der Proben

und entweder jeweils ein Röhrchen für die Amplifizierungs-Positivkontrolle bzw. -Negativkontrolle oder diePositiv- bzw. Negativkontrolle für die Probenbehandlung. Entfernen Sie die Stopfen und bewahren Siediese auf.

2. Pipettieren Sie 50 μl Mycobacterium Probenverdünnungspuffer (SDB) in alle Mycobacterium Lyseröhrchen(LT). Gehen Sie gemäß den folgenden Anweisungen (A oder B für die Kontrollen und C für die Proben)vor. A. Kontrollen für die Probenbehandlung

Pipettieren Sie für jede Kontrolle 1 ml der NALC/NaOH Lösung und 3 ml des Phosphatpuffers, die fürdie Behandlung des Sputums verwendet wurden, mit 1 ml sterilem Wasser in einProbenbehandlungsröhrchen. I. Vortexen. II. Überführen Sie 450 μl der NALC/NaOH/Phosphatpuffer Lösung und

50 μl Kontrollverdünnung in die entsprechend beschrifteten Mycobacterium Lyseröhrchen (LT).

B. Testung der Amplifizierungskontrollen: Überführen Sie 450 μl Amplifizierungskontrolle in die entsprechend beschrifteten Mycobacterium Lyseröhrchen (LT).

C. Proben: Überführen Sie 450 μl dekontaminierte gut gevortexte Probe in die entsprechend beschrifteten Mycobacterium Lyseröhrchen (LT).

3. Verschließen Sie die Mycobacterium Lyseröhrchen (LT) nach Zugabe jeder Probe. 4. Vortexen Sie 3 Sekunden. Lysieren der Proben1. Die Lyseröhrchen in den Röhrchenständer des Ultraschallbads stellen, so daß das Probenmaterial am

Boden der Röhrchen ins Wasser eintaucht, die Deckel jedoch über dem Wasser sind. DIE RÖHRCHENDÜRFEN DEN BODEN ODER DIE WÄNDE DES ULTRASCHALLBADS NICHT BERÜHREN.

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2. Die Proben für 15 min beschallen, jedoch nicht länger als 20 min. Die so behandelten Proben undKontrollen werden nun als Lysate bezeichnet. LYSATE NICHT VORTEXEN.

Amplifizierung1. Beschriften Sie die Amplifizierungsröhrchen (Propylenröhrchen, 12 x 75 mm) am oberen Rand

entsprechend der Numerierung der Lyseröhrchen (LT). Markieren Sie auch die Amplifizierungsröhrchen fürdie Positiv- und Negativkontrolle Wenn RNA-Kontrollen eingesetzt werden, beschriften Sie dieentsprechenden Amplifizierungsröhrchen als Positiv- bzw. Negativkontrollen. .

2. Pipettieren Sie 50 μl des aufgelösten Amplifizierungsreagenzes mit einer Repetierpipette auf den Bodender Amplifizierungsröhrchen. Anschließend mit einer Repetierpipette in jedes Amplifizierungsröhrchen200 μl Ölreagenz (O) pipettieren.

3. LYSATE NICHT VORTEXEN. 25 μl Lysat auf den Boden der entsprechenden beschriftetenAmplifizierungsröhrchen pipettieren. Verwenden Sie für jedes Lysat eine neue lange Pipettenspitze mithydrophobem Filter. Übrig gebliebenes Lysat kann für 7 Tage bei 2° - 8°C aufbewahrt oder 1 Monat beieiner Temperatur < -20°C eingefroren werden. Tiefkühlgeräte mit automatischer Abtauvorrichtung dürfennicht verwendet werden. Wenn das Lysat für weitere Tests benötigt wird, sollte es vor Gebrauch aufRaumtemperatur gebracht werden. LYSATE NICHT VORTEXEN .

4. Die Röhrchen im Heizblock bei 95°C für 15 min inkubieren, jedoch nicht länger als 20 min.5. Herstellung der Enzymlösung: Lösen Sie das lyophilisierte Enzymreagenz (E) mit 1,5 ml

Enzymverdünnungspuffer (EDB). Leicht mischen. NICHT VORTEXEN. Das aufgelöste Enzymreagenz ist 1Monat bei 2° - 8°C haltbar oder 2 Monate bei < -20°C, wenn es am Tag der Rekonstitution portioniert undeingefroren wird. Wenn Sie den Test mit eingefrorenen Enzymaliquots durchführen, sollten diese vorGebrauch auf Raumtemperatur gebracht werden; die AliquotsB nicht durch Inkubieren bei hohenTemperaturen auftauen. Die aufgetauten Aliquots sollten vor der Zugabe in die Amplifizierungsröhrchen miteiner Repetierpipette durch vorsichtiges Aspirieren und wieder Abgeben homogenisiert werden.

6. Die Röhrchen bei 42° ± 1°C in den Heizblock oder das Wasserbad stellen und 5 min abkühlen lassen. DIERÖHRCHEN NICHT AUF RAUMTEMPERATUR ABKÜHLEN LASSEN UND DAS WASSERBAD NICHTABDECKEN.

7. Nach Abkühlung der Röhrchen auf 42° ± 1°C geben Sie in jedes Röhrchen mit einer Repetierpipette 25 μlEnzymreagenz. Die Röhrchen durch leichtes Schütteln mischen. Inkubieren Sie bei 42°C für 30 min,jedoch nicht länger als 60 min. Für diesen Inkubationsschritt sollten Selbstklebefolien oder Stopfen verwen-det werden. DAS WASSERBAD NICHT ABDECKEN.

8. Nach 30-minütiger Inkubation können die abgedeckten Röhrchen bei 2° - 8°C 2 Stunden oder bei -20°Cbis zum nächsten Tag aufbewahrt werden. Nach einer Lagerung bei -20°C müssen dieAmplifizierungsröhrchen vor der Hybridisierung vollständig aufgetaut werden (bei Raumtemperatur oder beieiner Temperatur von maximal 60°C ). Die Röhrchen sollten in diesem Fall besser nicht mitSelbstklebefolie sondern mit den Stopfen abgedeckt werden.

Hybridisierung1. Das lyophilisierte Hybridisierungsreagenz (H) mit 6 ml Hybridisierungspuffer (HB) aufnehmen. Das

Hybridisierungsreagenz (H) und der Hybridisierungspuffer (HB) müssen vor der Rekonstitution aufRaumtemperatur gebracht werden. Gekühltes Hybridisierungsreagenz (HB) sollte vor Gebrauch unter vor-sichtigem Schütteln auf eine Temperatur von 60°C gebracht werden, um zu gewährleisten, daß alleBestandteile gelöst sind. Die Lösung solange vortexen, bis sie klar wird (dies kann bis zu 1 Min. dauern).Die Haltbarkeit des aufgelösten Hybridisierungsreagenzes beträgt 1 Monat bei 2° - 8°C oder 2 Monate bei< -20°C, wenn es am Tag der Auflösung portioniertC und eingefroren wird. Wenn das aufgelösteHybridisierungsreagenz gekühlt oder eingefroren wurde, erwärmen Sie es vor Gebrauch unter vor-sichtigem Schütteln auf 60°C, um zu gewährleisten, daß alle Bestandteile gelöst sind.

2. 100 μl aufgelöstes Hybridisierungsreagenz mit einer Repetierpipette in jedes Röhrchen pipettieren. DieRöhrchen mit Selbstklebefolien oder Stopfen abdecken. Vortexen Sie die Röhrchen anschließend bei mit-

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tlerer Geschwindigkeit 3 Mal für mindestens 1 SekundeD. Um eine gute Homogenisierung desReaktionsmediums zu erreichen, sollten die Röhrchen aufrecht stehen und die Reaktionsmischungwährend des Schüttelvorgangs sollte die obere Hälfte der Röhrchen erreichen (um Kontaminationen zu ver-meiden, sollte die Reaktionsmischung nicht mit den Selbstklebefolien bzw. Stopfen in Kontakt kommen).Nach der Homogenisierung sollte die Reaktionsmischung eine einheitlich gelbe Farbe aufweisen.

3. Inkubieren Sie im Heizblock oder Wasserbad bei 60°C für 15 min, jedoch nicht länger als 20 min.Selektion1. Das Selektionsreagenz (S) muß vor der Testung auf Raumtemperatur gebracht werden. Die Röhrchen aus

dem 60°C Wasserbad oder dem Heizblock nehmen und mit einer Repetierpipette 300 μl Selektionsreagenz(S) zugeben. Die Röhrchen mit Selbstklebefolie oder Stopfen abdecken. Vortexen Sie die Röhrchenanschließend bei mittlerer Geschwindigkeit 3 Mal für mindestens 1 SekundeD. Um eine guteHomogenisierung des Reaktionsmediums zu erreichen, sollten die Röhrchen aufrecht stehen und dieReaktionsmischung sollte während des Schüttelvorgangs die obere Hälfte des Röhrchens erreichen (umKontaminationen zu vermeiden, sollte die Reaktionsmischung nicht mit den Selbstklebefolien bzw. Stopfenin Kontakt kommen). Nach der Homogenisierung sollte die Reaktionsmischung eine einheitlich rosa Farbeaufweisen.

2. Inkubieren Sie im Heizblock oder Wasserbad bei 60°C für 15 min, jedoch nicht länger als 16 min.3. Die Röhrchen aus dem Wasserbad oder dem Heizblock nehmen. Mindestens 5 min, jedoch nicht länger als

1 Stunde auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Die Selbstklebefolien bzw. Stopfen kurz vor der Detektionabnehmen.

Detektion1. Wählen Sie auf dem Luminometer das geeignete Programm mit einer Ablesezeit von 2 Sekunden.2. Zur Säuberung der Röhrchenaußenwand, sowie zur Vermeidung von elektrostatischen Einflüssen während

der Messung durch das Röhrchenmaterial selbst, sollten diese vor der Messung mit einem feuchten Tuchbzw. Papier abgewischt werden. Stellen Sie die Röhrchen gemäß den Angaben im Handbuch in dasLuminometer. Die Röhrchen müssen innerhalb einer Stunde nach der Selektion gemessen werden.

3. Nehmen Sie die Röhrchen nach der Messung aus dem Luminometer.4. Nach dem Ablesen füllen Sie die Röhrchen vorsichtig mit einer 1:10 verdünnten Bleichlösung (1 Teil

Bleiche, 9 Teil Wasser) aus einer Waschflasche Die Bleichlösung mindestens 1 Stunde einwirken lassen,bevor Sie die Röhrchen verwerfen, um Kontaminationen des Labors mit Amplikons zu vermeiden.

5. Die Röhrchenständer müssen zur Dekontamination mindestens 15 min vollständig in 1:2 verdünnteBleichlösung getaucht (1 Teil Bleiche, 1 Teil Wasser) werden. Die Ständer danach mit Wasser abspülen undabtrocken oder an der Luft trocken lassen.

6. Labor und Material mit einer 1:2 (1 Teil Bleiche, 9 Teil Wasser) verdünnten Bleichlösung dekontaminieren.Testwiederholung1. Wenn der Test wiederholt werden muß, sollten die Lysate auf Raumtemperatur gebracht werden. LYSATE

NICHT VORTEXEN!2. Gehen Sie gemäß den im Abschnitt TESTDURCHFÜHRUNG beschriebenen Schritten vor und beginnen

Sie mit der Amplifizierung.HINWEISEA. Reagenzien

1. Das Enzymreagenz darf nach der Auflösung nicht länger als 15 min bei Raumtemperatur stehenbleiben.

2. Im Hybridisierungspuffer (HB) können sich Präzipitate bilden. Zur Auflösung des Niederschlags, denHybridisierungspuffer (HB) oder das aufgelöste Hybridisierungsreagenz auf 60°C erhitzen und schütteln.

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B. Temperatur1. Die Amplifizierung, Hybridisierung und Selektion sind temperaturabhängige Reaktionen; die Temperatur

der verwendeten Heizsysteme (Heizblock oder Wasserbad) muß deshalb präzise im angegebenenTemperaturbereich gehalten werden.

2. Vor Zugabe des Enzymreagenzes die Röhrchen 5 min abkühlen lassen, so daß sie eine Temperaturvon 42°C erreichen. Die Amplifizierungsreaktion verläuft bei dieser Temperatur optimal.

3. Das Einhalten der Temperatur ist für die Amplifizierungsphase von entscheidender Bedeutung (42° ± 1°C).

C. ZeitDie im Abschnitt „TESTDURCHFÜHRUNG“ angegebenen Zeiten müssen unbedingt eingehalten werden.

D. Wasserbad1. Ein gleichbleibend hoher Wasserstand ist wichtig, so daß die gesamte Reaktionslösung im Wasser

steht, es muß jedoch darauf geachtet werden, daß kein Wasser von oben in die Röhrchen eindringenkann.

2. Während der Amplifizierung darf das Wasserbad nicht abgedeckt werden, um Kondensationen auf oderin den Röhrchen zu vermeiden.

E. VortexenBitte achten Sie unbedingt darauf, daß das Reaktionsgemisch für die Hybridisierung und die Selektionabsolut homogen ist, insbesondere nach Zugabe des aufgelösten Hybridisierungsreagenzes (H) (dieMischung wird einheitlich gelb) und des Selektionsreagenzes (S) (die Mischung wird einheitlich rosa).Durch Vortexen erhält man homogene Suspensionen. Wenn Reagenzien in ein Reaktionsröhrchengegeben werden und einer externen Kraft ausgesetzt werden, findet eine schnelle Rotation der Lösung umdie Achse des Röhrchens statt. Dadurch entsteht eine homogene Suspension. Um eine korrekteHomogenisierung auf dem Vortex zu erreichen, müssen die Röhrchen in aufrechter, senkrechter Positiongehalten werden. Das Reaktionsgemisch muß während des Schüttelvorgangs die obere Hälfte derRöhrchen erreichen. Während des Hybridisierungs- und des Selektionsschrittes wird dieser Mischvorgang3 Mal in Folge für jeweils mindestens 1 Sekunde durchgeführt.

TESTINTERPRETATIONDie Ergebnisse des GEN-PROBE AMPLIFIED Mycobacterium Tuberculosis Direct Tests (MTD) werden aufder Basis eines negativen (< 30.000 RLU), eines positiven (> 500.000 RLU) oder eines zweifelhaftenErstbefundes (30.000 bis 499.999 RLU) interpretiert. Bei zweifelhaften Ergebnissen sollte der MTD Test mitdem verbliebenen Lysat wiederholt werden. Ist das Ergebnis des wiederholten Tests > 30.000 RLU gilt dieProbe als positiv. A. Qualitätskontrolle und Validierung der Ergebnisse Die Kontrollen sollten folgende Werte ergeben:

Amplifizierungs-Negativkontrolle < 20.000 RLUAmplifizierungs- Positivkontrolle > 500.000 RLUNegativkontrolle Probenbehandlung < 20.000 RLUPositivkontrolle Probenbehandlung > 1.000.000 RLUWenn die Werte der MTD Kontrollen nicht in den oben genannten Sollbereichen liegen, dürfen dieErgebnisse der Patientenproben nicht verwendet werden. Weitere Informationen entnehmen Sie bitte demAbschnitt FEHLERSUCHE.

Jedes Labor sollte aus den Ergebnissen der einzelnen Kontrollserien seine eigenen Sollwerte für dieKontrollen festlegen.

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B. Ergebnisse der Patientenproben Bei einer Abweichung der Kontrollen von den Sollwerten, können die Ergebnisse der Patientenproben ausdieser Testserie nicht verwendet werden. Ergebnisse:> 500.000 RLU positiv für M. tuberculosis Komplex rRNA< 30.000 RLU negativ für M. tuberculosis Komplex rRNA30.000 bis 499.999 RLU wahrscheinlich positiv für M. tuberculosis Komplex rRNA, wiederholen Sie denTest, um die Ergebnisse zu überprüfen.

Testwiederholung: > 30.000 RLU: positiv für M. tuberculosis Komplex rRNATestwiederholung < 30.000 RLU: negativ für M. tuberculosis Komplex rRNA

BEFUNDÜBERMITTLUNGDie Ergebnisse des MTD Tests sollten in Zusammenhang mit anderen verfügbaren Laborergebnissen undunter Berücksichtigung der Klinik des Patienten interpretiert werden. In Abhängigkeit des Grades des klinis-chen Verdachtes sollte die Testung einer weiteren Probe in Erwägung gezogen werden. Wenn das Ergebnis des ersten MTD Tests mit > 500.000 RLU oder der wiederholte MTD Test mit > 30.000RLU positiv ist, protokollieren Sie das Ergebnis wie folgt:

Wenn das Ergebnis des ersten oder des wiederholten MTD Tests mit < 30.000 RLU negativ ist, protokollierenSie das Ergebnis wie folgt:

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Befund: Mycobacterium tuberculosis Komplex rRNA nachgewiesen.Direktpräparat auf säurefeste Stäbchen (positiv odernegativ).

Zusatz- information Das Kulturergebnis liegt noch nicht vor. Die Probe kannsowohl MOTT und M. tuberculosis oder nur M. tuberculosisenthalten. Dieser Test sollte nicht die einzige Grundlage fürdie Diagnose einer Tuberkulose sein. Der positiveVorhersagewert (PPV) für einen Kultur-negativen Patientenist geringer als der für einen Kultur-positiven Patienten.Dies ist besonders wichtig für Testpopulationen, in denendie Tuberkulose-Prävalenz gering und der positiveVorhersagewert für diagnostische Verfahren entsprechendreduziert ist.

Befund: Mycobacterium tuberculosis Komplex rRNA nichtnachgewiesen. Direktpräparat auf säurefeste Stäbchen(positiv oder negativ).

Zusatz- information: Keine Mycobacterium tuberculosis Komplex rRNAnachgewiesen.Das Kulturergebnis liegt noch nicht vor. Die Probe enthältwahrscheinlich keine M. tuberculosis Bakterien. DasErgebnis kann aber aufgrund zu geringer M. tuberculosisKeimzahlen in An- oder Abwesenheit von atypischenMykobakterien falsch negativ sein. Ebenso könnenInhibitoren in der Probe zu einem falsch negativenErgebnis führen. Bei klinischem Verdacht auf eine aktiveTuberkulose oder auf Vorliegen von Inhibitoren in derProbe ist die Testung einer weiteren Patientenprobeempfehlenswert.


LIMITIERUNGENDer Test ist nur für den Nachweis von Spezies des M. tuberculosis Komplex aus Proben bestimmt, die gemäßder vom Centers for Disease Control (CDC)7 empfohlenen NALC-NaOH oder NaOH Methode behandelt wur-den. Dieser Test darf nur mit konzentrierten Sedimenten aus Sputum (induziert oder expektoriert),Trachealsekreten oder Bronchialmaterial (z.B. Bronchiallavagen, Bronchialaspirationen) verwendet werden.Der MTD-Test erfaßt spezifisch Mykobakterien des M. tuberculosis Komplex, d.h. M. tuberculosis, M. bovis, M.bovis BCG, M. africanum, M.microti und M.canetti., er ermöglicht jedoch keine Differenzierung innerhalb dieserSpezies. M. celatum und M. terrae-ähnliche Mykobakterien können in Konzentrationen von mehr als 30 KBEpro Test zu Kreuzreaktionen führen. M. celatum und M. terrae- ähnliche Mykobakterien werden jedoch seltenaus klinischen Proben isoliert.Die Testergebnisse werden durch Probenentnahme und Transport, Variabilitäten bei der Probenabnahme,technische Fehler des Labors, Fehler bei der Probenidentifikation und durch Fehler bei der Übermittlung derErgebnisse beeinflußt. Ein negatives Ergebnis schließt nicht aus, daß die Probe Keime des M. tuberculosisKomplex enthält.NORMALWERTEA. Kontrollwertebereich in klinischen Studien

Folgender Wertebereich für die Kontrollen (RLU) wurde in klinischen Studien von 7 Laboratorien ermittelt:

B. Wertebereich der klinischen ProbenDie RLU-Werte von 127 MTD-positiven Proben lagen zwischen 35.777 und > 2.000.000 RLU.Die RLU-Werte von 577 MTD-negativen Proben lagen zwischen 573 und 19.176 RLU.Folgende Tabelle gibt Aufschluß über die Häufigkeitsverteilung der RLU-Werte für alle untersuchten Probennach der Diskrepanzanalyse: Die Diskrepanzanalyse orientiert sich am Vorhandensein anderer kulturposi-tiver Proben desselben Patienten bzw. an der abschließenden Diagnose des Klinikers.

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PERFORMANCEA. Klinische Evaluierung

Die ursprüngliche MTD-Test Version wurde in 6 Studien evaluiert und mit mikroskopischen und kulturellenErgebnissen von 6.079 Proben von 2.609 Patienten verglichen. Von diesen stammten 4.000 Proben von1.898 Patienten, die keiner Tuberkulosetherapie unterworfen waren. Die 6 Studien wurden an geo-graphisch verschiedenen Orten durchgeführt: Bei 5 dieser Orte handelte es sich um großeKrankenhauszentren in amerikanischen Städten mit angeschlossenen Tuberkulosebehandlungszentren, beieinem handelte es sich um ein staatliches Labor des öffentlichen Gesundheitswesens.Die Performance des aktuellen MTD-Tests wurde in einer ergänzenden Studie in 7 Laboratorien mitmykobakteriellen Kulturresultaten verglichen. Die 7 Studienorte lagen in geographisch unterschiedlichenRegionen. 6 Labors waren in großen städtischen Krankenhauszentren mitTuberkulosebehandlungszentren, eines dieser 6 Zentren war zusätzlich nationales Referenzzentrum fürTuberkulosediagnostik. Der 7. Studienort war ein Labor des öffentlichen Gesundheitswesens. Es wurdenausschließlich Proben von Patienten ohne Therapie untersucht. Von diesen waren 132 kulturpositiv für denM. tuberculosis Komplex. Der MTD konnte 119 dieser kulturpositiven Proben nachweisen. Aus 7 Probenkonnten neben M. tuberculosis nicht tuberkulöse Mykobakterien nachgewiesen werden.

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Diese Studie enthält Proben von Patienten, bei denen der Verdacht auf eine aktive Lungentuberkulose vor-lag und die nicht therapeutisch behandelt wurden. Die gesamte Prävalenz der Patienten mit positiverKultur für M. tuberculosis betrug 20,5%.Die mittlere Sensitivität des MTD-Tests betrug bei jedem Patienten im Vergleich zur Kultur 93,3%, die mittlereSpezifität 99,1%. Für die Proben wurde eine mittlere Sensitivität von 90,6% und eine mittlere Spezifität von99,6% im Vergleich zur Kultur ermittelt. In der folgenden Tabelle sind die Sensitivität, die Spezifität, der posi-tive Vorhersagewert (PVW) sowie der negative Vorhersagewert (NVW) mit den Vertrauensbereichen von 95%für die Performance-Beurteilung aufgeführt. Es handelt sich dabei jeweils um Daten nach Diskrepanzanalyse.Die Diskrepanzanalyse orientiert sich am Vorhandensein anderer kulturpositiver Proben desselben Patientenbzw. an der abschließenden Diagnose des Klinikers.

Von den 564 Proben, die in der Kultur und im MTD negativ für M. tuberculosis Komplex waren, enthielten114 Proben atypische Mykobakterien, die in der Kultur nachgewiesen wurden. 64 stammten von Patienten,bei denen in anderen Proben atypische Mykobakterien in der Kultur isoliert werden konnten. 169 stammtenvon Patienten, bei denen keine Mykobakterien in der Kultur isoliert wurden.

B. PräzisionPräzisionspanels, bestehend aus 2 negativen Proben, 2 schwach positiven Proben (ca. 100 KBE/Test) und2 mittelmäßig positiven Proben (ca. 1000 KBE/Test) wurden in 3 Laboratorien getestet. Die positivenProben wurden mittels eines artifiziellen, schwach hemmenden Sedimentpools durch Zugabe einerdefinierten Menge an M. tuberculosis hergestellt. Die Proben sowie die positiven und negativenAmplifizierungskontrollen wurden in allen 3 Laboratorien über 3 Tage zweimal täglich im Dreifachansatzbestimmt.

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Da keine signifikante, ortsabhängige bzw. tagesabhängige Variation in den Ergebnissen festzustellen war,wurden die Resultate aller 3 beteiligten Laboratorien in untenstehender Tabelle zusammengefaßt. Diegemessenen RLU-Werte sind durch die Photomultipliermeßeinheit des Luminometers begrenzt. Deshalbwurden Werte über 2.000.000 RLU auf den Grenzwert 2.000.000 RLU herabgesetzt.Standardabweichungen und Variationskoeffizienten sind nicht angegeben.

C. ReproduzierbarkeitDas Panel für die Bestimmung der Reproduzierbarkeit bestand aus 25 Proben, wobei zwischen jede Probeeine negative Amplifizierungskontrolle gesetzt wurde, so daß ingesamt 50 Tests durchgeführt wurden.Dieses Panel wurde in 4 verschiedenen Laboratorien getestet.Insgesamt entsprachen 100 % (120/120) der negativen Proben und 98,8 % (79/80) der positiven Probenden erwarteten Ergebnissen.

D. Analytische SpezifitätDie Spezifität des MTD-Tests wurde mit Bakterien, Pilzen und Viren überprüft. Für die Spezifitätstestungmittels Bakterien und Pilzen wurden 160 Stämme (151 Arten aus 62 Gattungen) von nah verwandtenMykobakterien, anderen Erregern von Erkrankungen des Respirationstraktes und der normalenRespirationsflora, sowie von phylogenetisch repräsentativen Organismen verwendet. Typstämme wurdenvon der ATCC bezogen. 5 Isolate stammten von klinischen Laboratorien. Lysate aus aktiv wachsendenKulturen (bzw. in 3 Fällen: rRNA) wurden gemäß der Arbeitsanleitung mit dem MTD-Test evaluiert.Annähernd 5 x 107 KBE pro Reaktion wurden eingesetzt. Nur Stämme des M. tuberculosis Komplex liefer-ten positive Resultate, mit Ausnahme der M. celatum und M. terrae-ähnliche Stämme. Bei Konzentrationen über 30 KBE pro Test kommt es bei M. celatum und einigen M. terrae-ähnlichenStämmen zu positiven Ergebnissen (26.772 RLU für M. celatum und 19.470 bis 49.976 RLU für M. terrae-ähnliche Mykobakterien).

E. Nachweisgrenze30 M. tuberculosis Stämme aus geographisch sehr unterschiedlichen Gebieten, darunter sowohl resistenteals auch sensitive Stämme, wurden mit dem MTD-Test nachgewiesen. Die Nachweisgrenze lag für alle 30untersuchten Stämme bei 1 KBE/Test.

F. Wiederfindung25 fg rRNA von Mycobacterium tuberculosis (entspricht 5 KBE pro Test) wurden in Gegenwart von annäh-ernd 540.000 KBE pro Test (450 μl) relevanter, Organismen, die nicht zu den Zielspezies gehörten,getestet: Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonasaeruginosa, Mycobacterium gordonae, M. avium, M. kansasii, M. terrae, Nocardia asteroides, N. otitidis-caviarum, Corynebacterium pseudotuberculosis, C. diphtheriae, Gordona sputi und Rhodococcusbronchialis. Alle Testergebnisse waren in Gegenwart dieser nicht spezifischen Organismen, die nicht zuden Zielspezies gehörten positiv für M. tuberculosis rRNA und zeigten somit keine Interferenzen.


FEHLERSUCHE- UND BESEITIGUNGFEHLER MÖGLICHE URSACHE EMPFEHLUNGEN

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Erhöhte Amplifizierungs-Negativkontrolle oder NegativkontrolleProbenbehandlung (> 20.000 RLU)

Erniedrigte Amplifizierungs-Positivkontrolle oder Positivkontrolle Probenbehandlung (< 500.000 RLU)

Ungenügendes Mischennach Zugabe desSelektionsreagenzes (S) oderzu geringes Volumen desSelektionsreagenzes.

Mangelnde Sorgfalt bei derAbarbeitung der Reaktionenund bei der Vermeidung vonKontaminationen.

5-minütige Abkühlungszeitnicht eingehalten.

Kontamination vonLaboroberflächen oderReagenzien.

Die Röhrchen wurden vorder Messung nicht abgewischt.

Die Amplifizierungsreaktionwurde nicht im gefordertenTemperaturbereich durchge-führt.

Das Amplifizierungsreagenzwurde an die Röhrchenwandund nicht auf den Boden pipet-tiert

Ungenügendes Mischennach Zugabe des aufgelöstenHybridisierungsreagenzes.

Es wurde zuvielSelektionsreagenz zugegeben.

Die Inkubationszeit desSelektionsschrittes war zu lang.

Abkühlung derAmplifizierungsröhrchen auf42°C nach der Inkubation bei95°C.

Die Pumpenschläuche derDetektionsreagenzien am Gerätsind verstopft.

Mischvorgang korrekt wieder-holen. Die angegebenenVolumina beachten. Nach demVortexen muß eine einheitlicherosa Färbung sichtbar werden.

Das Pipettieren muß mitgrößter Sorgfalt ausgeübt wer-den. Die verwendetenRöhrchen müssen mit einer1:10 verdünnten Bleichlösungdekontaminiert werden, sieheAbschnitt„TESTDURCHFÜHRUNG“. DieArbeitsflächen, Heizblöcke,Wasserbäder und Pipettenmüssen wie im Abschnitt„TESTDURCHFÜHRUNG“beschrieben mit einer 1:2verdünnten Bleichlösungdekontaminiert werden.Die Röhrchen müssen vor derMessung im Luminometer miteinem feuchten Tuch oderholzfreiem Papier abgewischtwerden.Wasserbad und/oder Heizblock-Temperatur überprüfen und ein-stellen.

Das Reagenz auf dem Vortexsorgfältig mischen (sieheAbschnitt Hybridisierung, Punkt2). Das Reagenz sollte nachdem Mischen eine homogeneGelbfärbung zeigen.

Einstellung derPipettenvolumina überprüfen.Die 15-minütige Inkubationszeitbei 60°C bei der Selektion ein-halten.

Die Reaktionsröhrchen müssendirekt und ohne Verzögerungvom 95°C Heizblock in den42°C Heizblock bzw. dasWasserbad überführt werden.

Das Pumpsystem mit heißemWasser durchspülen (sieheHandbuch).

Deutsch


HINWEISEA Die Heizblöcke müssen für 12 x 75 mm Röhrchen geeignet sein. Es wird daher empfohlen, die

GEN-PROBE Heizblocksysteme zu verwenden.B Zur Lagerung der tiefgefrorenen Aliquots empfiehlt es sich, Mikrozentrifugenröhrchen mit

Schraubverschluß zu verwenden. Tiefgefrorene Aliquots dürfen nur einmal aufgetaut werden. VerwendenSie kein Tiefkühlgerät mit automatischer Abtauvorrichtung.

C Zur Lagerung der tiefgefrorenen Aliquots empfiehlt es sich, Kryoröhrchen für 5 ml zu verwenden.Tiefgefrorene Aliquots dürfen nur einmal aufgetaut werden. Verwenden Sie kein Tiefkühlgerät mit automa-tischer Abtauvorrichtung.

D Wegen der unterschiedlichen Ausführung der einzelnen Vortex-Geräte müssen die Mischzeiten gegebe-nenfalls angepaßt werden. Stellen Sie die Geschwindigkeit des Gerätes gemäß den Hinweisen im §„TESTDURCHFÜHRUNG“ Abschnitt E“ so ein, daß das Reaktionsgemisch die obere Hälfte der Röhrchenerreicht. Um präzise Ergebnisse zu erhalten, ist eine einwandfreie Homogenisierung unbedingt erforder-lich. Die Mischzeiten können bis zu 15 sec verlängert werden, ohne daß die Ergebnisse dadurch beein-flußt werden.

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TEST AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES MYCOBACTERIES DUCOMPLEXE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Coffret de 50 tests(bioMérieux réf. 39006/Gen-Probe Cat. No. 301001/1001F)

UTILISATIONLe test AMPLIFIED POUR LA DETECTION DIRECTE DES MYCOBACTERIES DU COMPLEXE MYCOBAC-TERIUM TUBERCULOSIS (MTD) est un test utilisant une sonde d’acide nucléique dirigée contre une cibleamplifiée permettant la détection in vitro des acides nucléiques des mycobactéries du complexeMycobacterium tuberculosis. Ce test est réalisé à partir d’échantillons provenant de crachats (induits ouexpectorés), de prélèvements bronchiques (lavages broncho-alvéolaires ou aspirations bronchiques) oud’aspirations trachéales.AVERTISSEMENTL’efficacité de ce test n’a pas encore été démontrée pour la détection directe d’ARNr de M. tuberculosis à par-tir d’autres échantillons cliniques (sanguins, urinaires ou coprologiques par exemple). Les performances dutest MTD n’ont été étudiées que pour des échantillons traités selon la technique décrite et conservés pour desdurées et aux températures spécifiées dans la présente notice.Les échantillons donnant des résultats positifs doivent être mis en culture pour déterminer la présenceéventuelle de mycobactéries autres que celles du complexe M. tuberculosis ou mycobactéries atypiques. Destests de sensibilité aux agents anti-mycobactériens doivent également être effectués. Des cultures pour larecherche de bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR) doivent être réalisées afin de préciser quelle sous-espèce du complexe M. tuberculosis (M. bovis, par exemple) est présente.Au cours des essais cliniques, des prélèvements réalisés sur des enfants, des patients VIH-positifs et despatients infectés par des mycobactéries atypiques ont été soumis au test. Toutefois, le nombre de ces essaisn’a pas permis de comparer statistiquement les performances du test pour ces différents groupes.Les performances du test sur des prélèvements provenant de patients sous traitement anti-tuberculeux, dansle but de réaliser un suivi thérapeutique ou de confirmer une guérison, n’ont pas été évaluées.Les échantillons à forte concentration sanguine ne doivent pas être testés avec le coffret MTD.PRÉCAUTIONS D’UTILISATIONA. A usage diagnostic in vitro seulement.B. Le test MTD est spécifique des mycobactéries du complexe M. tuberculosis, à savoir M. tuberculosis, M.

bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, et M.canetti, mais ne différencie pas ces espèces entreelles. M. celatum et M. terrae-like peuvent provoquer des réactions croisées s’ils sont présents à des con-centrations supérieures à 30 UFC (Unités Formant Colonie) par test. Toutefois M. celatum et M. terrae-likesont rarement isolées en clinique.

C. Un résultat négatif n’exclut pas la présence d’une mycobactérie du complexe M. tuberculosis dans l’échan-tillon. La qualité des résultats est liée à la qualité du prélèvement et de son transport, à la variabilité de laprise d’échantillons, aux erreurs techniques du laboratoire, aux erreurs d’identification des échantillons et

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aux erreurs de transcription des résultats.D. Le test est réservé à la détection des mycobactéries du complexe M. tuberculosis, à partir d’échantillons

préparés selon les méthodes NALC-NaOH ou NaOH qui sont recommandées par les Centers for DiseaseControl (CDC)7. Ce test doit être utilisé uniquement pour des échantillons concentrés préparés à partir decrachats (induits ou expectorés), d’aspirations trachéales ou de prélèvements bronchiques (lavages bron-cho-alvéolaires ou aspirations bronchiques). Lors de la remise en suspension de l’échantillon dans la solu-tion de tampon phosphate, vérifier que la concentration de phosphate soit de 67 mM7.

E. Eviter tout contact des Réactifs de Détection I et II (bioMérieux réf. 39300 / Gen-Probe Cat. No. 201791/1791) avec la peau, les yeux et les muqueuses. En cas de contact, rincer à l’eau. Si ces réactifs sont ren-versés, les diluer avec de l’eau avant d’essuyer.

F. Prendre les précautions habituelles lors de la réalisation de ce test4. La préparation des échantillonsdigérés et décontaminés ainsi que les étapes du test MTD doivent être réalisées en respectant les règlesde sécurité microbiologique de niveau 2 5.

G. N’utiliser que le matériel fourni ou du matériel de laboratoire à usage unique.H. Les paillasses, les pipettes et le matériel doivent être décontaminés avec une solution d’eau de Javel

diluée au 1 / 2 (moitié eau de Javel, moitié eau), comme décrit dans le paragraphe « MODE OPERA-TOIRE ». Laisser l’eau de Javel en contact pendant 15 minutes, puis rincer à l’eau et essuyer pour élimin-er les traces d’eau de Javel.

I. Des pipettes à déplacement positif ou des pipettes à déplacement d’air équipées de pointes munies d’unfiltre doivent être utilisées pour réaliser ce test. Lors du transfert du lysat des tubes de lyse aux tubesd’amplification, des pointes extra-longues doivent être utilisées. Changer de pointe entre chaque étape.Eviter de passer au-dessus des autres tubes du portoir. Les pointes usagées doivent être immédiatementjetées dans un récipient destiné aux déchets biologiques.

J. Lors de l’utilisation d’une pipette répétitive pour la distribution des réactifs, après l’introduction du lysatdans les tubes, éviter de toucher le tube avec la pointe de la pipette afin de réduire les risques de contami-nation entre tubes. Les réactifs doivent être distribués contre la paroi du tube afin d’éviter les projections.Le soin apporté à la distribution des réactifs permettra de réduire les risques de contamination croisée.

K. Ne pas utiliser les mêmes pipettes pour les étapes précédant l’amplification et les étapes suivant l’amplifi-cation.

L. Après la lecture des résultats à l’aide du luminomètre, décontaminer les tubes et les jeter comme décritdans les paragraphes « MODE OPERATOIRE » et « REMARQUES » afin d’éviter la contamination dulaboratoire par les amplicons.

M. Ne JAMAIS réutiliser les feuilles autocollantes et les bouchons utilisés au cours d’une précédente étape.Les bouchons doivent être jetés dans un récipient approprié immédiatement après leur retrait pour évitertoute contamination croisée. Les feuilles autocollantes doivent être fermement appliquées sur le haut destubes réactionnels.

N. Ne pas couvrir le bain-marie pendant les incubations, particulièrement si des bouchons sont utilisés (lacondensation sur le couvercle peut être une source de contamination).

O. Une bonne homogénéisation à l’aide d’un Vortex est nécessaire après l’addition du Réactif de Sélectionpour obtenir des résultats précis.

P. Il est recommandé de sélectionner un endroit pour l’étape HPA (Hybridization Protection Assay) pour min-imiser la contamination par les amplicons. Cet endroit doit être différent de celui des préparations deséchantillons et des réactifs et de l’étape d’amplification.

Q. Pour prévenir les contaminations par amplicons au laboratoire, les emplacements doivent être organiséspour un travail à sens uni-directionnel. Par example, procéder à la préparation des échantillons et desréactifs puis à l’étape d’amplification et ensuite passer à l’étape HPA. Les échantillons, le matériel et lesréactifs ne doivent pas retourner dans les endroits ou a eu lieu l’étape précédente. De même le personnel

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ne doit pas retourner dans les aires de travail sans des précautions d’anticontamination. Il est fortementrecommandé que la hotte utilisée pour la préparation des échantillons ne soit pas utiliser pour réaliser letest MTD.

INTRODUCTIONLe test MTD utilise les méthodes TMA (Transcription-Mediated Amplification) et HPA (Hybridization ProtectionAssay)2 pour détecter qualitativement l’ARN ribosomal (ARNr) des mycobactéries du complexe M. tuberculo-sis. Le test MTD détecte l’ARN des organismes cultivables et non cultivables. Le complexe M. tuberculosiscomprend les sous-espèces M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, et M. canet-ti(12, 13). Le test MTD détecte tous les microorganismes du complexe M. tuberculosis. Toutefois, M. microti n’in-fecte que les animaux, M. bovis est rarement transmis des animaux infectés aux humains. M. africanum,quant à lui, est responsable de tuberculose pulmonaire en Afrique tropicale12. M. tuberculosis est de loin lemembre le plus commun, responsable d’une morbidité importante dans le monde entier. Le CDC a récem-ment fait état d’une augmentation des cas de tuberculose chez les patients atteints de SIDA et les immigrés,et d’une augmentation de la transmission de la maladie au sein des populations à haut risque6,9. On observeégalement l’augmentation du nombre de souches résistantes, voire multi-résistantes aux anti-tuberculeux11.Les conséquences sont considérables dans le domaine de la santé publique.Les méthodes de culture conventionnelles permettent d’observer la croissance de M. tuberculosis dans undélai de 1 à 8 semaines7,10. Le test MTD, quant à lui, permet la détection de l’ARNr des mycobactéries ducomplexe M. tuberculosis en 2,5 à 3,5 heures. Bien qu’il ne permette pas de réaliser d’antibiogramme, le testMTD détecte M. tuberculosis de manière fiable et rapide. Ceci permet d’utiliser au mieux les services d’isole-ment des hôpitaux, de débuter rapidement un traitement approprié et de prévenir la propagation de la maladiegrâce à l’identification précoce et l’isolement des individus contaminés3.PRINCIPELe test MTD est un test en deux phases (l’amplification et la détection) qui sont réalisées dans un même tube.Tout d’abord, la sonication provoque la libération des acides nucléiques des mycobactéries. La chaleur estutilisée pour dénaturer ces acides nucléiques et rompre la structure secondaire de l’ARNr. La méthode d’am-plification Gen-Probe TMA amplifie ensuite une cible spécifique d’ARNr mycobactérien via un intermédiaired’ADN, à une température constante de 42°C. De multiples copies de l’ARNr mycobactérien (amplicons) sontainsi produites.Les séquences de l’amplicon d’ARNr, spécifiques des mycobactéries du complexe M. tuberculosis, sontensuite détectées grâce à la méthode d’hybridation d’acides nucléiques Gen-Probe HPA2. Le Réactifd’Hybridation du test MTD contient une sonde ADN monocaténaire conjuguée à un marqueur chimilumines-cent. Cette sonde est complémentaire des séquences d’ARN spécifiques des mycobactéries du complexe M.tuberculosis. La sonde forme avec ces séquences spécifiques des hybrides stables ARN:ADN. Après l’étapede sélection, le signal lumineux émis par les sondes hybridées est mesuré à l’aide du luminomètre GEN-PROBE LEADER.RÉACTIFS (Coffret de 50 tests)Les réactifs pour le test MTD sont fournis comme suit :Nom du réactif VolumePRESENTOIR DES REACTIFS POUR AMPLIFICATIONTampon de Dilution des Echantillons (SDB) .................................................................................. 1 x 2,5 ml

Solution tampon Tris contenant < 3 % de détergentRéactif d’Amplification (A).................................................................................................................. 1 x 3 ml

Acides nucléiques lyophilisés dans une solution tampon Tris contenant 5 % d’agent liant ..............................................................................(après reconstitution)

Tampon d’amplification (AB) .............................................................................................................. 1 x 3 mlSolution aqueuse contenant des conservateurs

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Réactif d’amplification huileux (huile pour réaction d’amplification) (O) .......................................... 1 x 10 mlHuile silicone

Réactif Enzymatique (E) ................................................................................................................ 1 x 1,5 mlTranscriptase inverse et ARN polymérase lyophilisées dans une solution (après reconstitution)tampon HEPES contenant < 10 % d’agent liant et > 15 mM de N-Acétyl-L-Cystéine

Tampon de Dilution Enzymatique (tampon de dilution des enzymes) (EDB) ..................................1 x 1,5 mlSolution tampon Tris contenant un surfactant et du glycérol

PRESENTOIR DES REACTIFS POUR HYBRIDATIONRéactif d’Hybridation (H) ....................................................................................................................1 x 6 ml

< 100 ng/flacon de sonde ADN non infectieuse conjuguée à un marqueur (après reconstitution)chimiluminescent, lyophilisée, dans une solution tampon succinate contenant un agent liant et un détergentTampon d’Hybridation (HB) ................................................................................................................1 x 6 ml

Solution tampon succinate contenant < 4 % de détergentRéactif de Sélection (S) ....................................................................................................................1 x 15 ml

Solution tampon borate contenant un surfactantTubes de Lyse (LT) ......................................................................................................................2 x 25 tubes

Billes de verre, agent liantCONSERVATIONLes solutions ou les composants non reconstitués suivants doivent être conservés à 2° - 8°C C et sont utilis-ables jusqu’à la date de péremption indiquée :

Tampon de Dilution des Echantillons (SDB)Réactif d’Amplification (A)Tampon d’Amplification (AB)Réactif Enzymatique (E)Tampon de Dilution Enzymatique (EDB)Réactif d’Hybridation (H)

Le Réactif d’Amplification reconstitué (A) est utilisable pendant 2 mois s’il est conservé à 2° - 8°C. Le Réactifd’Hybridation (H) et le Réactif Enzymatique (E) sont utilisables un mois à 2° - 8°C après reconstitution, oudeux mois à une température égale ou inférieure à -20°C s’ils sont aliquotés et congelés le jour de leur recon-stitution. Les fractions aliquotes congelées doivent être utilisées le jour où elles sont décongelées. Ne pasutiliser de congélateur à dégivrage automatique.Les composants suivants doivent être conservés entre 2° et 25°C et sont utilisables jusqu’à la date depéremption indiquée :

Réactif d’amplification huileux (O)Tampon d’Hybridation (HB)Réactif de Sélection (S)Tubes de Lyse (LT)

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PRELEVEMENT, CONSERVATION, TRANSPORT ET TRAITEMENT DES ECHANTILLONSPrélèvement et conservation de l’échantillon:Les échantillons doivent être placés dans des récipients en plastique stériles et conservés à 2° - 8°C avantleur transport et leur traitement. Au cours des essais cliniques, les échantillons ont été stockés moins de 4jours (généralement moins de 24 heures) avant leur traitement.Transport :Transporter les échantillons au laboratoire le plus rapidement possible conformément aux réglementations envigueur.Traitement (décontamination et concentration) :Les échantillons à forte concentration sanguine ne doivent pas être soumis au test MTD. Ce test est conçupour détecter l’ARNr des mycobactéries du complexe M. tuberculosis en utilisant des échantillons préparésselon les méthodes de décontamination NALC-NaOH ou NaOH utilisant 1 % à 1,5 % de NaOH pendant 15 à20 minutes et une centrifugation à une vitesse supérieure ou égale à 3 000 g 7.Stockage des échantillons traités :Les échantillons peuvent être stockés au maximum 3 jours à 2° - 8°C avant le test. Ils peuvent également êtrestockés entre -20° et -70° C pendant 6 mois au plus. Ne pas utiliser de congélateur à dégivrage automatique.MATERIELA. Matériel fourni

Composition du coffret (bioMérieux réf. 39006 / Gen-Probe Cat. No. 301001/1001F) 50 testsPRESENTOIR DES REACTIFS POUR AMPLIFICATIONTampon de Dilution des Echantillons (SDB) 1 x 2,5 mlRéactif d’Amplification (A) 1 x 3 ml (après reconstitution)Tampon de Reconstitution (AB) 1 x 3 mlRéactif huileux (huile pour réaction d’amplification) (O) 1 x 10 mlRéactif Enzymatique (E) 1 x 1,5 ml (après reconstitution)Tampon de Dilution Enzymatique (EDB) 1 x 1,5 mlPRESENTOIR DES REACTIFS POUR HYBRIDATIONRéactif d’Hybridation (H) 1 x 6 ml (après reconstitution)Tampon d’Hybridation (HB) 1 x 6 mlRéactif de Sélection (S) 1 x 15 mlTubes de Lyse (LT) 2 x 25 tubesCartes de protection (feuilles autocollantes) 1 paquet

B. Matériel nécessaire non fourni :Micropipettes capables de distribuer 25 μl, 50μl, 100μl, 200μl, 300μl et 450μlVortexEau stérile (filtrée ou autoclavée)Tubes de cultureBilles de verre stériles de 3 mmTubes pour microcentrifugeuse avec bouchons à visPortoir pour tubes réactionnels

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Pointes de pipette munies d’un filtre (1 000 μl)Témoins Positifs d’Amplification (par ex. M. tuberculosis, ATCC 25177 ou ATCC 27294)Témoins Négatifs d’Amplification (par ex. M. gordonae, ATCC 14470 ou M. terrae, ATCC 15755)Eau de Javel (solution d’hypochlorite à 5,25 %)Feuilles de protection de paillasse plastifiéesPipettes répétitives

C. Matériel supplémentaire disponible chez votre distributeur Gen-Probe:Sonicateur GEN-PROBE (bioMérieux réf. 39409 / Gen-Probe Cat. No. 901104/T460)Blocs chauffants GEN-PROBE (42°C ± 1°C, 60°C ± 1°C, 95°C ± 5°C)A (bioMérieux réf. 39405, 39406, 39407 / Gen-Probe Cat. No. 3396, 3397, 3398)Luminomètre GEN-PROBE LEADER 50i (bioMérieux réf. 39400 / Gen-Probe Cat. No. 103100i/3100i)Contrôles d'Amplification GEN-PROBE MTD (bioMérieux réf.39223 / Gen-Probe Cat.No. 301043F/1043F)Coffret de Réactifs de Détection GEN-PROBE (bioMérieux réf. 39300 / Gen-Probe Cat. No. 201791/1791)Portoir de tubes pour le sonicateur GEN-PROBE (bioMérieux réf. 39313 / Gen-Probe Cat. No. 104027/ 4027)Portoir de tubes réactionnels (bioMérieux réf. 39311 / Gen-Probe Cat. No. 3994)Pointes de pipette longues munies d’un filtre (1250 μl) (bioMérieux réf. 39315 / Gen-Probe Cat. No. 104316/4316)Tubes en polypropylène, 12 x 75 mm (bioMérieux réf. 39308 / Gen-Probe Cat. No. 102440/2440)Bouchons en polypropylène pour tubes de 12 x 75 mm (bioMérieux réf. 39320 / Gen-Probe Cat. No. 400713)

MODE OPERATOIREContrôlesLes souches utilisées comme Contrôle Positif d' Amplification doivent faire parties du complexe M. tuberculo-sis, par exemple comme souche non virulente H37Ra (ATCC 25177) ou comme souche virulente H37Rv(ATCC 27294). Les souches utilisées comme Contrôle Négatif doivent être des souches de mycobactériesnon tuberculeuses (MOTT) par exemple M. gordonae (ATCC14470) ou M. terrae (ATCC 15755). Les témoinsdoivent être préparés avant de tester les échantillons.Les contrôles cellulaires doivent contenir de 25 à 150 CFU par 50 μl pour atteindre une concentration finalede 1 à 10 CFU par test. Cette concentration peut être vérifiée par culture cellulaire. Ces contrôles cellulairesseront utilisés dans la préparation des Contrôles d‘Amplification (voir Préparation des Echantillons).1. Préparation recommandée des Contrôles Cellulaires :

a. Mettre 3 à 5 billes de verre stériles de 3 mm dans un tube de culture propre.b. Ajouter 1-2 ml d’eau stérile. Ajouter le contenu de plusieurs öses de1 μl de la culture appropriée.

Fermer le tube et l’agiter au vortex plusieurs fois à grande vitesse.c. Laisser reposer la suspension pendant 15 minutes.d. Transférer le surnageant dans un tube de culture propre. Ajuster la turbidité à 1 McFarland à l’aide d’un

néphélémètre.e. Faire une dilution au 1/100 en mettant 100 μl de la suspension à 1 McFarland dans 10 ml d’eau stérile.

Fermer et agiter à l’aide d’un Vortex. Ceci est la Dilution 1.f. Faire une seconde dilution au 1/100 de la suspension en mettant 100 μl de la Dilution 1 dans 10 ml

d’eau stérile. Fermer et agiter à l’aide d’un Vortex. Ceci est la Dilution 2. Cette dilution doit contenir

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approximativement 25 à 150 CFU pour 50 μl.Aliquotage et conservation des Contrôles Cellulaires :

a. Les dilutions doivent être reparties en fractions aliquotées (500 μl) à usage unique dans des tubesmicrofuges propres de 1.5 ml avec bouchons à vis conservés à – 20°C pendant 6 mois ou à –70°Cpendant un an. Ne pas utiliser de congélateur à dégivrage automatique.Le test avec le contrôle cellulaire positif recommandé de M. tuberculosis ne mettra en évidence seule-ment que les défaillances importantes des réactifs. Le contrôle positif est destiné à suivre les réactionsdes réactifs durant la préparation pour des interférences provenant d’un excès de NaOH ou de tamponphosphate. Le contrôle cellulaire recommandé ne détecte pas les variations de procédures concernantles temps ou les températures qui pourraient affecter l’efficacité de l’amplification ou l’adéquation dutemps de la sélection. Des contrôles additionnels peuvent être testés conformément aux réglementa-tions en vigueur ou guides de bonnes exécutions des analyses.

2. Contrôle d’inhibition des échantillonsLorsque le test MTD est négatif mais que le diagnostic du médecin est en faveur d’une tuberculose, il estpossible de vérifier si l’échantillon contient un inhibiteur en utilisant la procédure suivante :a. Placer 50 μl de Tampon de Dilution des échantillons dans 2 tubes de lyse (LT) des mycobactéries (sur-

chargé et non surchargé).b. Introduire 50 μl de Témoin Positif d’Amplification et 450 μl d’échantillon dans un tube (surchargé).

Ajouter 450 μl d’échantillon dans le second tube (non surchargé). Réaliser le test selon le protocolehabituel.

InterprétationSi le nombre de RLU (Relative Light Units) obtenu sur le luminomètre avec le tube surchargé est > 30.000 RLU, l’échantillon ne contient pas d’inhibiteur de l’amplification et l’échantillon ne contientapparemment pas de cible à amplifier. Si le nombre de RLU obtenu avec le tube surchargé est < 30.000 RLU, l’échantillon contient un inhibiteur de l’amplification et un autre échantillon doit être testé.Si le test répété du tube non surchargé est positif, le résultat du test MTD peut être rendu positif.L’explication la plus plausible pour ce type de résultat est la variabilité liée à l’échantillonnage : la premièreprise d’essai ne contenait pas de cible à amplifier, alors que la seconde en contenait. Le nombre de RLUdu tube non surchargé peut être positif ou négatif selon que la prise d’essai contient ou ne contient pasd’ARNr de mycobactérie appartenant au complexe M. tuberculosis.

3. Contrôle de la contamination du laboratoirePour tester la contamination du laboratoire par les amplicons de M. tuberculosis, procéder comme suit :a. Mettre 1 ml d’eau stérile dans un tube propre. Humidifier un écouvillon stérile en polyester ou en

dacron avec de l’eau stérile.b. Frotter l’écouvillon sur la paillasse ou le matériel à tester.c. Placer l’écouvillon dans le tube et mélanger doucement. Retirer l’écouvillon en l’essorant contre la paroi

du tube. Jeter l’écouvillon dans un récipient contenant une solution d’eau de Javel diluée au 1 / 2(moitié eau de Javel, moitié eau).

d. Distribuer 25 μl de la solution ainsi obtenue dans un tube d’amplification contenant 50 μl de Réactifd’Amplification et 200 μl d’huile pour réaction d’amplification.

e. Suivre les instructions du paragraphe « MODE OPERATOIRE » pour l’amplification et la détection.InterprétationSi les résultats sont > 30.000 RLU, la surface testée est contaminée et doit être décontaminée par untraitement à l’eau de Javel suivant les instructions du paragraphe « MODE OPERATOIRE : Préparationdu matériel». Si l’on suspecte une contamination du bain-marie, procéder de la même façon que ci-dessus

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avec 25 μl de l’eau du bain-marie à condition que celle-ci ne contienne aucun produit antiseptique.Préparation du matériel1. a. Remplir le réservoir du sonicateur d’eau du robinet à température ambiante jusqu’à environ 1cm du

bord.b. L’eau du bain à ultrasons doit être dégazée avant chaque essai, afin d’optimiser le transfert d’énergie

des ultrasons. Pour dégazer l’eau complètement, faire fonctionner le sonicateur pendant 15 minutes.2. Régler un bloc chauffant à 95° ± 5°C, un bloc chauffant ou un bain-marie à 60° ± 1°C et un bloc chauffant

ou un bain-marie à 42° ± 1°C.3. Nettoyer surfaces de travail, matériel et pipettes avec une dilution 1:2 d’eau de Javel avant de commencer

l’analyse. L’eau de Javel doit rester en contact pendant au moins 15 minutes. Rincer à l’eau la surface detravail pour éliminer les traces d’eau de Javel. Couvrir la surface sur laquelle le test sera réalisé avec unefeuille de protection de paillasse plastifiée.

4. Préparer le luminomètre GEN-PROBE LEADER. S’assurer qu’il y ait une quantité suffisante de Réactifs deDétection I et II pour réaliser les tests et s’assurer que les tubulures soient amorcées. Consulter le manueld’utilisation du luminomètre pour les instructions de chargement des Réactifs de Détection (ces réactifssont vendus séparément).

Préparation du réactifReconstituer le Réactif d’Amplification lyophilisé (A) dans son flacon (50 tests) avec 3 ml de Tampond’Amplification (AB). Homogénéiser à l’aide d’un Vortex. Laisser le réactif reconstitué reposer à températureambiante jusqu’à ce qu’il devienne clair. Le Réactif d’Amplification reconstitué peut être conservé 2 mois à 2° -8°C. La solution doit être remise à température ambiante avant utilisation.Préparation des échantillons1. Identifier un nombre suffisant de Tubes de Lyse de Mycobactéries (LT) pour tester les échantillons et cha-

cun des Contrôles Cellulaires d’Amplification positif et négatif ou des Témoins d’Amplification positifs etnégatifs. Retirer et conserver les bouchons.

2. Distribuer 50 μl du Tampon de Dilution des Echantillons (SDB) dans tous les tubes de lyse (LT). Suivre lesparagraphes ci-dessous A et B pour les contrôles et C pour les échantillons.A. Témoins d’Amplification des Echantillons :Pour chaque contrôle, ajouter 1 ml de solution CLNA/NaOH et 3 ml de tampon phosphate utilisé pour pré-parer les crachats avec 1 ml d’eau stérile dans le tube échantillon.

i. Agiter pour mélangerii. Transférer 450 μl de solution tampon phosphate CLNA/NaOH et 50 μl de la dilution du Contrôle

Cellulaire dans le Tube de Lyse identifié (LT).B. Si on utilise les Contrôles Cellulaires d' Amplification, transférer 450 μl du flacon de Contrôle Cellulaire

d' Amplification au Tube de Lyse (LT) correspondant.C. Echantillons : Transférer 450 μl d’échantillon, bien agité au vortex et décontaminé, de son flacon dans

le Tube de Lyse (LT) identifié correspondant.3. Reboucher les Tubes de Lyse aprés addition de chaque échantillon.4. Agiter sous Vortex pendant 3 secondes.

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Lyse des échantillons1. Insérer les Tubes de Lyse dans le portoir du sonicateur de façon à ce que le mélange réactionnel au fond

des tubes soit immergé, tout en maintenant les bouchons hors de l’eau. Mettre le portoir en place. LESTUBES NE DOIVENT EN AUCUN CAS ETRE EN CONTACT AVEC LE FOND OU LES PAROIS DU SON-ICATEUR.

2. Faire fonctionner le sonicateur pendant 15 minutes, mais pas plus de 20 minutes. Les échantillons ettémoins ainsi traités aux ultrasons sont des « lysats ». NE PAS UTILISER LE VORTEX POUR AGITERLES LYSATS.

Amplification1. En écrivant sur le haut des tubes, identifier les tubes polypropylène pour amplification (12 x 75 mm) avec

les numéros correspondant aux numéros d’identification des Tubes de Lyse (LT). Identifier également destubes d’amplification pour les témoins d’amplification positif et négatif. Si on utilise des contrôles ARN,identifier des tubes d’amplification pour les contrôles Négatifs et Positifs.

2. Introduire 50 μl de Réactif d’Amplification reconstitué au fond de chaque tube en utilisant une pipetterépétitive. Ajouter 200 μl d’huile pour réaction d’amplification (O) dans chaque tube en utilisant une pipetterépétitive.

3. NE PAS UTILISER LE VORTEX POUR LES LYSATS. Transférer 25 μl de chaque lysat dans le fond dutube d’amplification correspondant en utilisant une nouvelle pointe munie d’un filtre pour chaque transfert .Les lysats restants peuvent être conservés à 2° - 8°C pendant 7 jours, ou congelés à une températureégale ou inférieure à -20°C pendant 1 mois. Ne pas utiliser de congélateur à dégivrage automatique. Sid’autres tests doivent être effectués sur les lysats, les laisser préalablement revenir à températureambiante. NE PAS UTILISER LE VORTEX POUR LES LYSATS.

4. Incuber les tubes dans un bloc chauffant à 95°C pendant 15 minutes, mais pas plus de 20 minutes.5. Préparer la Solution Enzymatique en ajoutant 1,5 ml de Tampon de Dilution Enzymatique (EDB) au Réactif

Enzymatique lyophilisé (E). Faire tournoyer pour mélanger. Ne pas agiter à l’aide d’un Vortex. Le RéactifEnzymatique reconstitué est utilisable pendant un mois à 2° - 8°C ou pendant deux mois à une tempéra-ture égale ou inférieure à -20°C s’il est aliquoté et congeléB le jour de sa reconstitution. Si le test est effec-tué avec des fractions aliquotes d’enzymes congelées, les ramener préalablement à températureambiante; ne pas décongeler les fractions aliquotes en les incubant à haute température. Pourhomogénéiser les fractions aliquotes décongelées, aspirer et rejeter doucement la solution en utilisant unepipette répétitive avant de l’ajouter aux tubes d’amplification.

6. Transférer les tubes dans le bloc chauffant ou le bain-marie à 42° ± 1°C et les laisser refroidir pendant 5minutes. NE PAS LAISSER LES TUBES ATTEINDRE LA TEMPERATURE AMBIANTE. NE PAS COU-VRIR LE BAIN-MARIE.

7. Lorsque les tubes sont à 42°C, ajouter 25 μl de Réactif Enzymatique dans chaque tube en utilisant unepipette répétitive. Secouer pour mélanger. Incuber à 42°C pendant 30 minutes, mais pas plus de 60 min-utes. Il faut utiliser des feuilles autocollantes ou des bouchons pendant cette étape d’incubation. NE PASCOUVRIR LE BAIN-MARIE.

8. Après la période d’incubation de 30 minutes, les tubes couverts peuvent être conservés à 2 - 8°C pendant2 heures ou à -20°C jusqu’au lendemain. S’ils sont stockés à -20°C jusqu’au lendemain, les tubes doiventêtre totalement décongelés à température ambiante ou au maximum à 60°C avant l’étape d’hybridation, etdoivent être fermés avec des bouchons plutôt qu’avec des feuilles autocollantes.

Hybridation1. Reconstituer le Réactif d’Hybridation lyophilisé (H) avec 6 ml de Tampon d’Hybridation (HB). Le Réactif

d’Hybridation (H) et le Tampon d’Hybridation (HB) doivent être à température ambiante avant la reconstitu-tion. Si le Tampon d’Hybridation (HB) a été réfrigéré, le réchauffer à 60°C en le faisant tournoyer douce-ment pour s’assurer que tous les composants sont solubilisés. Agiter à l’aide d’un Vortex jusqu’à ce que lasolution devienne claire (cela peut prendre jusqu’à une minute) pour s’assurer que tous les composants

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Français


sont solubilisés. Le Réactif d’Hybridation reconstitué est utilisable pendant un mois à 2° - 8°C ou pendantdeux mois à une température égale ou inférieure à -20°C s’il est aliquoté et congeléC le jour de sa recon-stitution. Si le Réactif d’Hybridation reconstitué a été réfrigéré ou congelé, le réchauffer à 60°C en lefaisant tournoyer doucement pour s’assurer que tous les composants sont solubilisés.

2. Ajouter 100 μl de Réactif d’Hybridation reconstitué dans chaque tube à l’aide d’une pipette répétitive.Couvrir les tubes avec des feuilles autocollantes ou des bouchons. Agiter les tubes à l’aide d’un Vortex àvitesse moyenne 3 fois pendant au moins 1 secondeD. Pour une bonne homogénéisation des tubes réac-tionnels, les maintenir en position verticale et laisser le mélange atteindre la moitié supérieure de la paroidu tube pendant l’agitation (pour éviter toute contamination ne pas laisser le mélange réactionnel entrer encontact avec les feuilles autocollantes ou les bouchons). Lorsque l’homogénéisation a été correctementeffectuée, le mélange doit alors avoir une couleur jaune uniforme.

3. Incuber à 60°C pendant 15 minutes, mais pas plus de 20 minutes, dans un bloc chauffant ou un bain-marie.

Sélection1. Le Réactif de Sélection (S) doit être à température ambiante avant de commencer le test. Retirer les tubes

du bain-marie ou du bloc chauffant à 60°C et ajouter 300 μl de Réactif de Sélection (S) à l’aide d’unepipette répétitive. Couvrir les tubes avec des feuilles autocollantes ou des bouchons. Agiter à l’aide d’unVortex, à vitesse moyenne, 3 fois pendant au moins 1 secondeD. Pour une bonne homogénéisation destubes réactionnels, les maintenir en position verticale et laisser le mélange atteindre la moitié supérieurede la paroi du tube pendant l’agitation (pour éviter toute contamination ne pas laisser le mélange réaction-nel entrer en contact avec les feuilles autocollantes ou les bouchons). Lorsque l’homogénéisation a étécorrectement effectuée, le mélange doit alors avoir une couleur rose uniforme.

2. Incuber à 60°C pendant 15 minutes, mais pas plus de 16 minutes, dans un bloc chauffant ou un bain-marie.

3. Retirer les tubes du bain-marie ou du bloc chauffant. Laisser les tubes revenir à température ambiantependant au moins 5 minutes, mais pas plus d’une heure. Retirer les feuilles autocollantes ou les bouchonsjuste avant la phase de détection.

Détection1. Programmer le protocole approprié sur le luminomètre. Choisir une lecture à 2 secondes.2. Pour éliminer tout résidu de la surface des tubes, les essuyer à l’aide de papier absorbant ne peluchant

pas humide, puis les introduire dans le luminomètre en suivant les instructions du manuel d’utilisation. Lestubes doivent être lus moins d’une heure après l’étape de sélection.

3. Une fois l’analyse terminée, retirer les tubes du luminomètre.4. Après la lecture des tubes, les remplir avec précaution d’une solution d’eau de Javel diluée au 1 / 10 (un

volume d’eau de Javel, 9 volumes d’eau), à l’aide d’une pissette. Laisser l’eau de Javel en contact pendantau moins une heure avant de jeter les tubes pour éviter la contamination du laboratoire par les amplicons.

5. Les portoirs de tubes doivent être décontaminés par immersion complète dans une solution d’eau de Javeldiluée au 1 / 2 pendant au moins 15 minutes. Ils doivent ensuite être rincés à l’eau et essuyés, ou séchésà l’air.

6. Décontaminer le laboratoire et le matériel à l’aide d’une solution d’eau de Javel diluée au 1 / 2.Répétition du test1. Si le test doit être répété, laisser revenir les lysats préparés à température ambiante. NE PAS UTILISER

LE VORTEX POUR LES LYSATS.2. Suivre ensuite le mode opératoire, en commençant par l’étape d’amplification.

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REMARQUESA. Réactifs

1. Le Réactif Enzymatique ne doit pas rester à température ambiante plus de 15 minutes après avoir étéreconstitué.

2. Le Tampon d’hybridation (HB) peut précipiter. Chauffer et agiter le Tampon d’Hybridation (HB) ou leRéactif d’Hybridation reconstitué à 60°C pour dissoudre le précipité.

B. Température1. L’amplification, l’hybridation et la sélection sont des réactions thermo-dépendantes ; par conséquent il

est impératif de maintenir le bain-marie ou le bloc chauffant aux températures préconisées.2. Avant l’addition du Réactif Enzymatique, laisser refroidir les tubes pendant 5 minutes afin qu’ils

atteignent 42°C. Cette température permet d’obtenir des performances d’amplification optimales.3. Le respect de la température est fondamental pour la phase d’amplification (42° ± 1°C).

C. TempsIl est impératif de respecter les temps indiqués dans le paragraphe « MODE OPERATOIRE ».

D. Bain-marie1. Le niveau de l’eau dans le bain-marie doit être maintenu de manière à ce que le mélange réactionnel

au fond des tubes soit immergé, mais à ce que l’eau ne pénètre pas dans les tubes.2. Durant la phase d’amplification, le bain-marie ne doit pas être couvert afin d’éviter que la condensation

ne tombe sur, ou dans les tubes.E. Agitation à l’aide d’un Vortex

Il est important de disposer d’un mélange homogène lors des étapes d’hybridation et de sélection, partic-ulièrement après l’addition du Réactif d’Hybridation (H) reconstitué (le mélange prend une couleur jauneuniforme) et du Réactif de Sélection (S) (le mélange prend une couleur rose uniforme).L’agitation à l’aide d’un Vortex permet d’obtenir une suspension uniforme. Quand les réactifs sont placésdans un tube réactionnel et qu’ils sont exposés à une source d’énergie extérieure, il se produit une rotationrapide de la solution autour de l’axe du tube. Il en résulte une suspension uniforme. Pour que l’homogénéi-sation soit correctement effectuée à l’aide d’un Vortex, les tubes doivent être tenus verticalement par lehaut du tube. Le liquide doit alors atteindre la moitié supérieure du tube au cours de l’agitation. Au coursdes étapes d’hybridation et de sélection, cette agitation est réalisée 3 fois de suite et doit durer au moins 1seconde chaque fois.

INTERPRETATION DU TESTLes résultats des échantillons testés par le coffret GEN-PROBE AMPLIFIED Mycobacterium TuberculosisDirect (MTD) sont interprétés sur la base d’un résultat initial négatif (< 30.000 RLU), d’un résultat initial positif(> 500.000 RLU) ou d’un résultat initial équivoque (de 30.000 à 499.999 RLU). Le test MTD doit être répété àpartir du lysat conservé lorsque le résultat initial est équivoque. Un résultat répété du lysat > 30.000 est con-sidéré comme positif.A. Contrôle de qualité et acceptation des résultats

Les contrôles doivent satisfaire aux valeurs suivantes :Contrôle Cellulaire Négatif d’Amplification : < 20.000 RLUContrôle Cellulaire Positif d’Amplification : > 500.000 RLUTémoin Négatif d’Amplification : < 20.000 RLUTémoin Positif d’Amplification : > 1.000.000 RLU

Les résultats des tests patient ne doivent pas être reportés si les contrôles ne répondent pas aux critères47

Français


ci-dessus. Se reporter au chapitre « RESOLUTION D’INCIDENTS » pour plus d’informations.Les valeurs cibles pour les contrôles doivent être déterminées pour chaque laboratoire en fonction desrésultats de chaque série de contrôles préparés.

B. Résultats des tests pour les échantillons cliniques :Si les contrôles ne correspondent pas aux valeurs escomptées, les résultats des échantillons cliniques nesont pas valides et ne peuvent être rendus.Résultats :

> 500.000 RLU : positif pour l’ARNr des mycobactéries du complexe M. tuberculosis< 30.000 RLU : négatif pour l’ARNr des mycobactéries du complexe M. tuberculosisde 30.000 à 499.999 RLU : positif probable pour l’ARNr des mycobactéries du complexe M.tuberculosis ; test à répéter pour vérification :

test répété > 30.000 RLU : positif pour l’ARNr des mycobactérie du complexe M.tuberculosis.test répété < 30.000 RLU : : négatif pour l’ARNr des mycobactérie du complexe M.tuberculosis.

PRESENTATION DES RESULTATSLes résultats des tests MTD doivent être interprétés avec l’ensemble des données cliniques et autres tests dulaboratoire disponibles pour le clinicien .On peut considérer de tester d’autres échantillons en fonction dudegré d’appréciation de l’état clinique.Si le résultat initial est positif avec une RLU > 500.000 ou que le test MTD répété est > 30.000 RLU, alorsprésenter les résultats de la manière suivante :

Si le résultat initial ou le test répété MTD est négatif (< 30.000 RLU), alors présenter les résultats de lamanière suivante :

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Interprétation : ARNr de mycobactéries du complexe Mycobacterium tuber-culosis détecté. Résultat microscopique (positif ou négatif).

Informations complémentaires: Culture pour la recherche de BAAR en cours. L’échantillonpeut contenir à la fois des mycobactéries non tuberculeuseset M. tuberculosis, ou M. tuberculosis seul. Ce test ne doitpas être la seule base du diagnostic de tuberculose. Lavaleur prédictive pour un patient avec un examen micro-scopique négatif est inférieure à celle d’un patient avec unexamen microscopique positif. Ceci est particulièrementimportant dans les populations testés où la prévalence de latuberculose est faible et que les valeurs prédictives positivesdes méthodes de diagnostic sont réduites de façon corre-spondante

Interprétation : ARNr de mycobactérie du complexe M.tuberculosis nondétectéRésultat microscopique (positif ou négatif).

Information complémentaires : ARNr de mycobactérie du complexe M.tuberculosis nondétecté. Culture pour la recherche des BAAR en attente.L’échantillon ne contient apparemment pas de mycobactériesdu complexe M.tuberculosis, mais le résultat peut êtrefaussement négatif du à la présence d’inhibiteurs dansl’échantillon. La recherche sur un autre échantillon estrecommandée si une tuberculose active est cliniquementsuspectée ou si la présence d’inhibiteurs est envisagée.


LIMITESCe test n’est destiné qu’à la détection des mycobactéries du complexe M. tuberculosis à partir d’échantillonspréparés selon les procédures NALC-NaOH ou NaOH recommandées par le CDC7. Ce test ne peut être util-isé qu’avec des échantillons préparés à partir de crachats (induits ou expectorés), de prélèvementsbronchiques (lavages broncho-alvéolaires ou aspirations bronchiques) ou d’aspirations trachéales.Le test MTD est spécifique des mycobactéries du complexe M. tuberculosis, à savoir M. tuberculosis, M.bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti et M. cannetti, mais ne différencie pas ces espèces entre elles.M. celatum et M. terrae-like peuvent provoquer des réactions croisées s’ils sont présents à des concentrationssupérieures à 30 UFC par test. Toutefois, M. celatum et M. terrae-like sont rarement isolées en clinique.La qualité des résultats du test est liée à la qualité du prélèvement et de son transport, à la variabilité de laprise d’échantillons, aux erreurs techniques du laboratoire, aux erreurs d’identification des échantillons et auxerreurs de transcription des résultats. Un test négatif n’exclut pas la présence d’une mycobactérie du com-plexe M. tuberculosis dans l’échantillon.VALEURS ATTENDUESA. Eventail des valeurs de contrôle relevées au cours des essais cliniques

L’évantail des valeurs obtenues pour les contrôles (RLU) lors d’essais cliniques réalisés sur 7 sites a été :

B. Eventail des valeurs obtenues pour les échantillons cliniquesPour les 127 échantillons MTD-positifs, les valeurs étaient comprises entre 35.777 et > 2.000.000 RLU.Pour les 577 échantillons MTD-négatifs, les valeurs étaient comprises entre 573 et 19.176 RLU.L’occurrence des résultats en RLU pour tous ces échantillons, après résolution des discordances, figure ci-dessous : la résolution des discordances est basée sur l’analyse d’autres échantillons, positifs en culture,provenant d’un même patient et/ou sur le diagnostic final du médecin traitant.

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PERFORMANCES

A. Evaluation cliniqueLes performances du test MTD dans sa forme originale ont été évaluées au cours d’essais cliniques réal-isés dans six laboratoires en comparant les résultats obtenus par examen de frottis aux résultats de la cul-ture, sur 6.079 échantillons provenant de 2.609 patients. Parmi ceux-ci, 4.000 échantillons provenaient de1.898 patients ne recevant pas de traitement anti-tuberculeux. Les six sites représentaient des zones géo-graphiques différentes : cinq centres hospitaliers de grandes villes américaines, possédant un service spé-cialisé pour la tuberculose, et un laboratoire public.Les performances du test MTD dans sa forme actuelle ont été évaluées sur sept sites, en comparant lesrésultats du test MTD aux résultats de la culture. Les sept centres participant au test représentaient deszones géographiques différentes : six centres hospitaliers de grandes villes américaines, possédant unservice spécialisé pour la tuberculose, et un laboratoire public national de mycobactériologie. Les échantil-lons testés provenaient de patients ne recevant pas de traitement anti-tuberculeux. 132 ont donné desrésultats positifs en culture pour les mycobactéries du complexe M. tuberculosis. MTD a détecté 119 deces échantillons culture-positifs ; 7 échantillons contenaient des mycobactéries non tuberculeuses en plusde M. tuberculosis.

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Les patients suspectés d’être atteints d’une tuberculose pulmonaire active et n’étant pas sous traitement ontété inclus dans cette étude. La prévalence totale des patients ayant eu une culture positive pour M. tubercu-losis était de 20,5%.Par patient, une sensibilité moyenne de 93,3 % et une spécificité moyenne de 99,1 % ont été déterminées,par rapport à la culture. Par échantillon, une sensibilité moyenne de 90,6 % et une spécificité moyenne de99,6 % ont été déterminées, par rapport à la culture. Le tableau ci-dessous donne la sensibilité, la spécificité,la valeur prédictive positive (VPP) et la valeur prédictive négative (VPN), avec des intervalles de confiance de95 %, pour les estimations de performances. Toutes les données affichées sont présentées après résolutiondes discordances basée sur l’analyse d’autres échantillons, positifs en culture, provenant du même patientet/ou sur le diagnostic final du médecin traitant.

Sur les 564 échantillons négatifs en culture et MTD-négatifs pour les mycobactéries du complexe M. tuber-culosis, 114 échantillons contenaient des mycobactéries atypiques, mises en évidence par culture, 64provenaient de patients dont d’autres échantillons ont permis d’isoler des mycobactéries atypiques par cul-ture et 169 provenaient de patients dont aucune mycobactérie n’a été isolée en culture.

B. PrécisionDes panels d’échantillons, consistant en 2 échantillons négatifs, 2 échantillons faiblement positifs (ª 100 UFC/ test) et 2 échantillons modérément positifs (ª 1000 UFC/ test) ont été testés sur trois sites. Leséchantillons positifs on été préparés en ajoutant des quantités connues de M. tuberculosis à un poold’échantillons modérément inhibiteurs. Les échantillons ainsi que des témoins d’amplification positif etnégatif ont été testés en triple deux fois par jour, pendant 3 jours sur les trois sites.

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La variabilité des résultats n’étant pas significative d’un site à l’autre ou d’un jour à l’autre, les résultats destrois sites ont pu être consolidés et sont présentés ci-dessous. Les valeurs de lecture mesurées en RLUsont limitées par la résolution du tube photomultiplicateur du luminomètre. Pour cette raison, les valeurssupérieures à 2.000.000 RLU sont ramenées à 2.000.000 RLU. Ni les écarts-types, ni les coefficients devariation ne sont indiqués.

C. ReproductibilitéL’étude de reproductibilité a été effectuée en testant 25 échantillons, des témoins d’amplification négatifsétant intercalés entre chaque échantillon, pour former un total de 50 échantillons. Le panel de repro-ductibilité a été testé sur quatre sites.Au total, 100 % (120/120) des échantillons négatifs et 98,8 % (79/80) des échantillons positifs ont donnéles résultats attendus.

D. Spécificité analytiqueLa spécificité du test MTD a été évaluée à l’aide de bactéries, de champignons et de virus. Dans le casdes bactéries et des champignons, les tests de spécificité ont porté sur 160 souches (151 espècesprovenant de 62 genres) de mycobactéries très proches de M. tuberculosis, d’autres microorganismesresponsables de maladies respiratoires, et d’un panel phylogénétique de microorganismes de la flore com-mensale de l’appareil respiratoire. Les souches types étaient des cultures ATCC (American Type CultureCollection), et 5 souches avaient été fournies par des laboratoires d’analyses. Les lysats, préparés à partirde cultures en phase active de croissance (ou d’ARNr, dans trois cas) ont été analysés selon le protocoledu test MTD, à environ 5 x 107 UFC par test. Seules les souches du complexe M. tuberculosis ont donnédes résultats positifs, à l’exception de souches de M. celatum et M. terrae-like.A des concentrations supérieures à 30 UFC par test, les souches de M. celatum et certaines souches M.terrae-like ont donné des résultats positifs (26.772 RLU pour M. celatum et de 19.470 à 49.976 RLU pourM. terrae-like).

E. Limite de détectionTrente souches de M. tuberculosis provenant de régions géographiques très variées, y compris desreprésentants de souches résistantes et de souches sensibles aux antibiotiques, ont été détectées par letest MTD. Le test MTD a pu détecter jusqu’à 1 UFC par test de chacune des 30 souches.

F. Test de surchargeDe l’ARNr de Mycobacterium tuberculosis à une concentration de 25 fg (équivalant à 5 UFC par test) ontété testés en présence d’environ 540.000 UFC par test (450 μl) des organismes non cibles suivants :Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa,Mycobacterium gordonae, M. avium, M. kansasii, M. terrae, Nocardia asteroides, N. otitidis-caviarum,Corynebacterium pseudotuberculosis, C. diphtheriae, Gordona sputi et Rhodococcus bronchialis. Tous lesrésultats ont été positifs pour l’ARNr de M. tuberculosis en présence de ces organismes non-cibles, quin’ont donc pas créé d’interférence.

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RESOLUTION D’INCIDENTS

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OBSERVATIONValeurs élevées pour les ContrôlesCellulaires Négatifs d'Amplification ou les ContrôlesNégatifs d’Amplification.(> 20.000 RLU)

Valeurs faibles pour les ContrôlesCellulaires Positifs d' Amplificationou les Contrôles Positifsd’Amplification (< 500.000 RLU)

CAUSES POSSIBLESHomogénéisation insuff-

isante après ajout du Réactif deSélection (S) ou trop faible vol-ume de Réactif de Sélection.

Amplification de contami-nants introduits par manque deprécaution au cours de la pré-paration des réactions.

Omission de l’étape derefroidissement de 5 minutes.

Contamination du laboratoireou des réactifs.

Omission de l’essuyage destubes avant lecture à l’aide duluminomètre.

Non respect des tempéra-tures préconisées lors de l’é-tape d’amplification.

Ajout du Réactifd’Amplification en versant le liq-uide sur les parois du tube etnon directement au fond dutube.

Homogénéisation insuff-isante après ajout du Réactifd’Hybridation reconstitué.

Volume de Réactif deSélection trop important.

Non respect du temps pré-conisé pour l’étape de sélec-tion.

La température des tubesest descendue en dessous de42°C après l’incubation à 95°C.

Les tubulures amenant leRéactif de Détection sontbouchés.

RECOMMANDATIONSRé-homogénéiser correctement.Veiller à respecter les volumesindiqués. Vérifier l’apparition d’unesolution de couleur rose uniformeaprès l’agitation.

Un grand soin doit être apporté à ladistribution des réactifs à l’aide despipettes. Les tubes usagés doiventêtre décontaminés avec une solutiond’eau de Javel diluée au 1 / 10,comme indiqué dans le paragraphe« MODE OPERATOIRE ». Les pail-lasses, blocs chauffants, bains-marieet pipettes doivent être décontam-inés avec une solution d’eau deJavel diluée au 1 / 2 comme indiquédans le paragraphe « MODE OPER-ATOIRE ».

Les tubes doivent être essuyés avecdu papier absorbant ne peluchantpas humide avant lecture à l’aide duluminomètre.Vérifier la température du bain-marieet/ou du bloc chauffant et l’ajuster sinécessaire pour respecter les tem-pératures préconisées.

Agiter soigneusement à l’aide duVortex, comme spécifié (voir le para-graphe « Hybridation / 2 »). Vérifierla formation d’une solution decouleur jaune uniforme après agita-tion.

Vérifier le réglage de volume sur lapipette.Respecter les 15 minutes d’incuba-tion à 60°C, au cours de l’étape deSélection.

Transférer directement les tubes dubloc chauffant à 95°C au bain-marie/ bloc chauffant à 42°C.

Rincer les tubulures à l’eau chaudecomme indiqué dans le manuel d’u-tilisation de l’instrument.

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NOTESA Les blocs chauffants doivent avoir des puits prévus pour les tubes 12 x 75 mm. L’utilisation des blocs

chauffants GEN-PROBE est recommandée.B Il est recommandé d’utiliser des tubes microfuges munis d’un bouchon à vis pour conserver les fractions

aliquotes congelées. Les fractions aliquotées ne peuvent être congelées et décongelées qu’une seule fois.NE PAS utiliser de congélateurs à dégivrage automatique.

C Pour le stockage des fractions aliquotes congelées, il est recommandé d’utiliser des flacons pour réfrigéra-tion de 5 ml. Les fractions aliquotes congelées ne peuvent être décongelées qu’une seule fois. Ne pasutiliser de congélateur à dégivrage automatique.

D Les performances des VORTEX pouvant différer selon le matériel utilisé , il peut être nécessaire d’adapterle temps d’agitation. Régler la vitesse de l’appareil et suivre les instructions du « MODE OPÉRATOIRE,paragraphe E », pour permettre au mélange réactionnel d’atteindre la moitié supérieure de la paroi dutube. Une bonne homogénéisation est indispensable à l’obtention de résultats précis. Les temps d’agitationpeuvent être portés à 15 secondes sans affecter les résultats.

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TEST AMPLIFIED PARA LA DETECCION DIRECTA DEL COMPLEJO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Equipo de 50 tests(bioMérieux ref. 39006/Gen-Probe Cat. No. 301001/1001F)

UTILIZACIONEl test AMPLIFIED PARA LA DETECCION DIRECTA DEL COMPLEJO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS(MTD) es un test que utiliza una sonda de ácido nucleico dirigida contra una diana amplificada, que permite ladetección in vitro de los ácidos nucleicos de las micobacterias del complejo Mycobacterium tuberculosis. Estetest es realizado a partir de muestras procedentes de esputos (inducidos o expectorados), de muestras bron-quiales (lavados bronco-alveolares o aspirados bronquiales) o de aspiraciones traqueales.ADVERTENCIASLa eficacia de este test no ha sido aún demostrada para la detección directa del RNAr de M. tuberculosis apartir de otras muestras clínicas (sanguíneas, urinarias o coprológicas, por ejemplo). Los rendimientos del testMTD han sido estudiados exclusivamente en muestras tratadas según la técnica descrita, y conservadasdurante el tiempo y a las temperaturas especificadas en la presente ficha técnica.Las muestras que den resultados positivos deben ser cultivadas para determinar la eventual presencia deotras micobacterias, además de las del complejo M. tuberculosis o de micobacterias atípicas. También debenrealizarse tests de sensibilidad frente a los agentes anti-micobacterianos. Deben realizarse cultivos paradetectar bacilos ácido-alcohol-resistentes (BAAR) con el fin de precisar qué subespecie del complejo M.tuberculosis (M. bovis, por ejemplo) se encuentra presente.Durante los ensayos clínicos, se han analizado muestras realizadas en niños, en pacientes HIV-positivos y enpacientes contagiados con micobacterias atípicas. Sin embargo, el número de ensayos no ha permitido com-parar estadísticamente los rendimientos del test en estos diferentes grupos.No han sido evaluados los resultados del test en muestras procedentes de pacientes bajo tratamiento antitu-berculoso, con el fin de realizar un seguimiento terapéutico o de confirmar una mejoría.Las muestras con elevada concentración sanguínea no deben ser analizadas con el equipo MTD.PRECAUCIONES DE UTILIZACIONA. Utilización reservada para el diagnóstico in vitro.B. El test MTD está destinado específicamente a las micobacterias del complejo M. tuberculosis, es decir, M.

tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, y M. canetti, pero no diferencia estasespecies entre sí. M. celatum y M. pseudo-terrae pueden provocar reacciones cruzadas si se encuentranpresentes en concentraciones superiores a 30 UFC (Unidades Formadoras de Colonias) por test. Sinembargo, M. celatum y M. pseudo-terrae son rara vez aislados en clínica.

C. Un resultado negativo no excluye la presencia de una micobacteria del complejo M. tuberculosis en lamuestra. La calidad de los resultados depende de la calidad de la muestra y de su transporte, de lavariabilidad de la toma de muestras, de los errores técnicos del laboratorio, de los errores de identificaciónde las muestras y de los errores en la transcripción de los resultados.

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D. El test se encuentra destinado sólo a la detección de las micobacterias del complejo M. tuberculosis a par-tir de muestras preparadas según los métodos NALC-NaOH o NaOH, recomendados por los Centros parael Control de Enfermedades (CDC)7. Este test debe ser utilizado sólo en muestras concentradaspreparadas a partir de esputos (inducidos o expectorados), de aspirados traqueales o de muestras bron-quiales (lavados bronco-alveolares o aspiraciones bronquiales). Durante la puesta en suspensión de lamuestra en la solución de tampón fosfato, verificar que la concentración de fosfato sea de 67 mM7.

E. Evitar cualquier contacto de los Reactivos de Detección I y II (bioMérieux ref. 39300 / Gen-Probe Cat. No.201791/1791) con la piel, los ojos y las mucosas. En caso de contacto, enjuagar con agua. Si estos reac-tivos se derraman, diluirlos con agua antes de secarlos.

F. Adoptar las precauciones habituales durante la realizatión de este test4. La preparación de las muestrasdigeridas y descontaminadas, así como las etapas del test MTD, deben ser realizadas respetando lasreglas de seguridad microbiológica de nivel 2 5.

G. Utilizar sólo el material suministrado o material de laboratorio de un solo uso.H. Las superficiies de trabajo, las pipetas y el material deben ser descontaminados con una solución de lejía

diluida al 1/2 (mitad de lejía, mitad de agua), como se describe en el párrafo « TECNICA ». Dejar la lejía en contacto durante 15 minutos y después enjuagar con agua y secar paraeliminar los restos de lejía.

I. Para realizar este test deben utilizarse pipetas con desplazamiento positivo o pipetas con desplazamientode aire equipadas de puntas provistas de filtro. Durante la transferencia del lisado desde los tubos de lisisa los tubos de amplificación, deben utilizarse puntas extra largas. Cambiar de punta entre una etapa yotra. Evitar pasar por encima de otros tubos de la gradilla. Las puntas ya utilizadas deben ser desechadasde inmediato en un recipiente destinado a los desechos biológicos.

J. Al utilizar una pipeta de repetición para la distribución de los reactivos, después de introducir el lisado enlos tubos, evitar tocar el tubo con la punta de la pipeta con el fin de reducir los riesgos de contaminaciónentre los tubos. Los reactivos deben ser distribuidos contra la pared del tubo con el fin de evitar salpica-duras. Ser cuidadoso en la distribución de los reactivos reduce los riesgos de contaminación cruzada.

K. No volver a utilizar las mismas pipetas en las etapas anteriores a la amplificación y en las etapas quesiguen a la amplificación.

L. Después de la lectura de los resultados utilizando un luminómetro, descontaminar los tubos y desecharloscomo se ha descrito en los párrafos « TECNICA » y « OBSERVACIONES » con el fin de evitar la conta-minación del laboratorio por los amplicones.

M. JAMAS volver a utilizar las hojas autoadhesivas y los tapones utilizados durante la etapa precedente. Lostapones deben ser desechados en un recipiente apropiado, inmediatamente después de haberlos retirado,para evitar cualquier contaminación cruzada. Las hojas autoadhesivas deben ser firmemente aplicadas enla parte alta de los tubos de reactivos.

N. No cubrir el baño maría durante la incubación, en particular si se utilizan tapones (la condensación en latapa puede ser una fuente de contaminación).

O. Una buena homogeneización con un Vortex es necesaria después de añadir el Reactivo de Selección conel fin de obtener resultados precisos.

P. Se recomienda elegir un lugar para la fase HPA (Hybridization Protection Assay ) con vistas a mini-mizarla contaminación por amplicons. Este lugar debe ser diferente de aquél donde se realicen las prepara-ciones de las muestras, los reactivos y la etapa de amplificación.

Q. Para prevenir las contaminaciones por amplicons en el laboratorio, el proceso deberá organizarse medi-ante un flujo de trabajo unidireccional. Por ejemplo, proceder a la preparación de las muestras y los reac-tivos, después la fase de amplificación para, finalmente, realizar la etapa HPA. Las muestras, el equipo ylos reactivos nunca de-berían retornar al área donde se han llevado a cabo los procesos anteriores. Elpersonal no deberá volver a dichas áreas de trabajo sin haber tomado precauciones anticontaminación.Se recomienda firmemente que la cabina de bioseguridad empleada para el procesamiento de muestrasno se reutilice para los ensayos MTD.

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INTRODUCCIONEl test MTD utiliza los métodos TMA (Transcription-Mediated Amplification) y HPA (Hybridization ProtectionEnsayo)2 para detectar cualitativamente el RNA ribosómico (RNAr) de las micobacterias del complejo M.tuberculosis. El test MTD detecta el RNA de los organismos cultivables y no cultivables. El complejo M. tuber-culosis incluye las subespecies M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, y M. canetti(12, 13). El test MTD detecta todos los microorganismos del complejo M. tuberculosis. Sin embargo, M.microti infecta solamente a los animales, M. bovis se transmite rara vez desde los animales infectados alhombre, mientras que M. africanum, es responsable de la tuberculosis pulmonar en Africa Tropical12. M.tuberculosis es con mucho el miembro más común, responsable de importante morbilidad en el mundoentero. El CDC ha dado a conocer recientemente un aumento de los casos de tuberculosis en los pacientesafectados de SIDA y en los inmigrantes, y un aumento de la transmisión de la enfermedad en la población dealto riesgo6,9. Se observa además el aumento del número de cepas resistentes e incluso multirresistentes alos agentes antituberculosos11. Las consecuencias son considerables en el ámbito de la salud pública.Los métodos de cultivo convencionales permiten observar el crecimiento de M. tuberculosis en un plazo de 1a 8 semanas7,10. El test MTD, por su parte, permite la detección del RNAr de las micobacterias del comple-jo M. tuberculosis en 2,5 a 3,5 horas. A pesar de que no permite realizar antibiogramas, el test MTD detectaM. tuberculosis de manera fiable y rápida. Esto permite utilizar mejor los servicios de aislamiento en los hos-pitales, iniciar rápidamente un tratamiento apropiado y prevenir la propagación de la enfermedad gracias a laidentificación precoz y al aislamiento de los individuos contaminados3.PRINCIPIOEl test MTD es un test en dos fases (amplificación y detección) , que son realizadas en un mismo tubo. Enprimer lugar, la sonicación provoca la liberación de los ácidos nucleicos de las micobacterias. El calor es uti-lizado para desnaturalizar estos ácidos nucleicos y romper la estructura secundaria del RNAr. El método deamplificación Gen-Probe TMA amplifica a continuación una diana específica del RNAr micobacteriano através de un intermediario del DNA a una temperatura constante de 42°C. Se producen así múltiples copiasdel RNAr micobacteriano (amplicones).Las secuencias del amplicon del RNAr, específicas a las micobacterias del complejo M. tuberculosis, son acontinuación detectadas gracias al método de hibridación de ácidos nucleicos Gen-Probe HPA2. El Reactivode Hibridación del test MTD contiene una sonda DNA monocatenaria conjugada con un marcador quimiolu-miniscente. Esta sonda es complementaria de las secuencias de RNA específicas de las micobacterias delcomplejo M. tuberculosis. La sonda forma, con estas secuencias específicas, híbridos estables RNA-DNA.Después de la etapa de selección, la señal luminosa emitida por las sondas hibridadas es medida con elluminómetro de GEN-PROBE LEADER.REACTIVOS (Equipo de 50 tests)Los reactivos para el test MTD son suministrados como sigue:Nombre del reactivo VolumenBANDEJA DE REACTIVOS PARA LA AMPLIFICACIONTampón de Dilución de las Muestras (SDB)....................................................................................1 x 2,5 ml

Solución tampón Tris que contiene < 3 % de detergenteReactivo de Amplificación (A) ............................................................................................................1 x 3 ml

Acidos nucleicos liofilizados en una solución tampón Tris que (después de la reconstitución)contiene 5 % de agente ligante

Tampón de amplificación (AB)............................................................................................................1 x 3 mlSolución acuosa que contiene conservantes

Reactivo de amplificación oleoso (aceite para reacción de amplificación) (O) ................................1 x 10 mlAceite de silicona

Reactivo Enzimático (E) ..................................................................................................................1 x 1,5 ml

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Transcriptasa inversa y RNA polimerasa liofilizadas en una solución (después de la reconstitución)tampón HEPES que contiene < 10 % de agente ligante y > 15 mM de N-Acetil-L-cisteína

Tampón de Dilución Enzimático (tampón de dilución de las enzimas) (EDB) ................................1 x 1,5 mlSolución tampón Tris que contiene un sulfactante y glicerol

BANDEJA DE LOS REACTIVOS PARA HIBRIDACIONReactivo de Hibridación (H)................................................................................................................1 x 6 ml

< 100 ng/frasco de sonda DNA no infecciosa conjugada con un (después de la reconstitución)marcador quimioluminiscente, liofilizada, en una solución de tampón succinato que contiene un agente ligante y un detergente

Tampón de Hibridación (HB) ..............................................................................................................1 x 6 mlSolución de tampón succinato que contiene < 4 % de detergente

Reactivo de Selección (S) ................................................................................................................1 x 15 mlSolución de tampón borato que contiene un sulfactante

Tubos de Lisis (LT) ......................................................................................................................2 x 25 tubosBolas de vidrio, agente ligante

CONSERVACIONLas soluciones o los componentes no reconstituidos siguientes deben ser conservados a 2° - 8°C y son uti-lizables hasta la fecha de caducidad indicada:

Tampón de Dilución de las Muestras (SDB)Reactivo de Amplificación (A)Tampón de Amplificación (AB)Reactivo Enzimático (E)Tampón de Dilución Enzimático (EDB)Reactivo de Hibridación (H)

El Reactivo de Amplificación reconstituido (A) es utilizable durante 2 meses si se le conserva a 2° - 8°C. ElReactivo de Hibridación (H) y el Reactivo Enzimático (E) son utilizables un mes a 2° - 8°C después de lareconstitución, o dos meses a una temperatura igual o inferior a -20°C si son distribuidos en alícuotas y con-gelados el día de su reconstitución. Las fracciones alícuotas congeladas deben ser utilizadas el día en queson descongeladas. No utilizar congeladores con descongelación automática.Los siguientes componentes deben ser conservados entre 2° y 25°C y son utilizables hasta la fecha decaducidad indicada:

Reactivo de Amplificación Oleosa (O)Tampón de Hibridación (HB)Reactivo de Selección (S)Tubos de Lisis (LT)

TOMA DE MUESTRAS, CONSERVACION, TRANSPORTE Y TRATAMIENTO DE LAS MUESTRASToma y conservación de las muestras:Las muestras deben ser colocadas en recipientes estériles de plástico y conservadas a 2° - 8°C antes de sutransporte y tratamiento. Durante los ensayos clínicos, las muestras han estado almacenadas menos de 4días (en general, menos de 24 horas) antes de su tratamiento.

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Transporte:Transportar las muestras al laboratorio lo más rápidamente posible, conforme a la reglamentación vigente.Tratamiento (descontaminación y concentración) :Las muestras con una fuerte concentración sanguínea no deben ser sometidas al test MTD. Este test ha sidodiseñado para detectar el RNAr de las micobacterias del complejo M. tuberculosis utilizando muestraspreparadas según los métodos de descontaminación NALC-NaOH o NaOH, utilizando 1% a 1,5% de NaOHdurante 15 a 20 minutos y una centrifugación a una velocidad superior o igual a 3 000 g 7.Conservación de las muestras tratadas:Las muestras pueden ser conservadas como máximo durante 3 días a 2° - 8°C antes del test. Pueden tam-bién ser conservadas entre -20° y -70°C durante 6 meses como máximo. No utilizar congeladores condescongelación automática.MATERIALA. Material suministrado

Composición del equipo (bioMérieux ref. 39006 / Gen-Probe 50 testsCat. No. 1001F)BANDEJA DE REACTIVOS PARA AMPLIFICACIONTampón de Dilución de las Muestras (SDB) 1 x 2,5 mlReactivo de Amplificación (A) 1 x 3 ml (después de su reconstitución)Tampón de Reconstitución (AB) 1 x 3 mlReactivo oleoso (aceite para reacción de amplificación) (O) 1 x 10 mlReactivo Enzimático (E) 1 x 1,5 ml (después de su reconstitución)Tampón de Dilución Enzimática (EDB) 1 x 1,5 mlBANDEJA DE REACTIVOS PARA HIBRIDACIONReactivo de Hibridación (H) 1 x 6 ml (después de su reconstitución)Tampón de Hibridación (HB) 1 x 6 mlReactivo de Selección (S) 1 x 15 mlTubos de Lisis (LT) 2 x 25 tubosTarjetas de protección (hojas autoadhesivas) 1 paquete

B. Material necesario no suministrado:Micropipetas capaces de distribuir 25 μl, 50μl, 100μl, 200μl, 300μl y 450μlVortexAgua estéril (filtrada o sometida a autoclave)Tubos de cultivoBolas de vidrio estériles de 3 mmTubos para microcentrifugadora con tapones de roscaPortatubos para tubos de reactivosPuntas de pipeta provistas de filtro (1 000 μl)Controles Positivos de Amplificación (p. ej., M. tuberculosis, ATCC 25177 o ATCC 27294)Controles Negativos de Amplificación (p. ej., M. gordonae, ATCC 14470 o M. terrae, ATCC 15755)Lejía (solución de hipoclorito al 5,25%)Hojas de protección de superficies de trabajo, plastificadas

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Pipetas repetitivasC. Material suplementario disponible en su distribuidor Gen-Probe:

Sonicador GEN-PROBE (bioMérieux ref. 39409 / Gen-Probe Cat. No. 901104/T460)Bloques calefactores GEN-PROBE (42°C ± 1°C, 60°C ± 1°C, 95°C ± 5°C)A (bioMérieux ref. 39405, 39406,39407 / Gen-Probe Cat. No. 3396, 3397, 3398)Luminómetro GEN-PROBE LEADER 50i (bioMérieux ref. 39400 / Gen-Probe Cat. No. 103100i/3100i)Equipo de Reactivos de Detección GEN-PROBE (bioMérieux ref. 39300 / Gen-Probe Cat. No. 201791/ 1791)GEN-PROBE MTD Testigos de Amplificación (bioMérieux ref.39223/Gen-Probe Cat. No. 301043F/1043F)Portatubos para el sonicador GEN-PROBE (bioMérieux ref. 39313 / Gen-Probe Cat. No. 104027/4027)Portatubos para tubos de reactivos (bioMérieux ref. 39311 / Gen-Probe Cat. No. 3994)Puntas de pipeta largas provistas de filtro (1250 μl) (bioMérieux ref. 39315 / Gen-Probe Cat. No. 104316/ 4316)Tubos de polipropileno, 12 x 75 mm (bioMérieux ref. 39308 / Gen-Probe Cat. No. 102440/2440)Tapones de polipropileno para tubos de 12 x 75 mm (bioMérieux ref. 39320 / Gen-Probe Cat. No. 400713)

PROCEDIMIENTO DE ENSAYOControleLas cepas usadas como Testigos Positivos de Amplificación deberían pertenecer al complejo M. tuberculosistales como el H37Ra (ATCC 25177)no virulento o el H37Rv (ATCC 27294) virulento Las cepas usadas comoTestigos Negativos deberían ser tipo MOTT,tales como M. gordona (ATCC 14470)o M. terra (ATCC 15755).Los testigos deberían prepararse antes de analizar las muestras. Los testigos han de contener 25 -150 CFUpor 50 μl de forma que se consiga una concentración final de 1-10 CFU por ensayo Se verificará dicha con-centración en cada cultivo Se utilizarán estos testigos en la preparación de los Testigos de Procesamiento deMuestras (Ver Preparación de Muestras )1. Recomendaciones para la Preparación de los Testigos.

a. Introducir de 3 a 5 bolas de vidrio estériles de 3 mm en un tubo de cultivo limpiob. Añadir 1-2 ml de agua estéril A gregar el contenido de varias asas de 1 μl del cultivo apropiado. Cerrar el tubo y homogeneizarlo repetida e intensamente mediante Vórtexc. Dejar decantar la suspensión durante 15 minutod. Transferir la fase flotante a un tubo de cultivo limpio.Ajustar la turbidez al equivalente de 1 McFarland

mediante un nefelómetro estándard, utilizando una referencia McFarland .e. Realizar una dilución al 1:100 de la suspensión, añadiendo 100 μl de la suspensión 1 McFarland en

10 ml de agua estéril. Tapar y agitar mediante Vórtex. Esta es la Dilución 1.f. Realizar una 2ª dilución al 1:100 añadiendo 100 μl de Dilución 1 en 10 ml de agua estéril. Tapar y

agitar mediante Vórtex. Esta es la Dilución 2. Esta dilución debería contener 25-150 CFU por 50 μl aprox Partes alícuotas y almacenamiento de los Testigos

a. Las diluciones deberán ser repartidas en fracciones alícuotas en microtubos limpios para centrifugación, de 1,5 ml con tapón de rosca de un sólo uso, 500 μl y se conservarán congeladas a -20°C durante 6 meses o a -70ºC durante un año. No usar congeladores con descongelación automática.

Los ensayos de los testigos positivos recomendados para M. tuberculosis sólo controlarán fallos substan-ciales de los reactivos. El testigo positivo se ha diseñado para controlar el efecto de los reactivos durante elprocesamiento para la interferencia del exceso de los tampones de NaOH y fosfato Los cambios en tiempos o

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temperaturas de los procedimientos que pueden afectar la eficacia de la amplificación o la aceptabilidad deltiempo de selección pueden no ser detectados usando los testigos recomendados Se ensayarán testigos adicionales según normas o necesidades.2. Control de inhibición de las muestras

Cuando el test MTD es negativo pero el diagnóstico del médico se inclina por una tuberculosis, es posibleverificar si la muestra contiene un inhibidor utilizando el procedimiento siguiente:a. Poner 50 μl de Tampón de Dilución de las muestras en 2 tubos de lisis de las micobacterias (sobrecar-

gada y no sobrecargada).b. Introducir 50 μl de Control Positivo de Amplificación y 450 μl de muestra en un tubo (sobrecargado).

Añadir 450 μl de muestra en el segundo tubo (no sobrecargado). Realizar el test conforme al protocolohabitual.

InterpretaciónSi el número de RLU (Relative Light Units - Unidades Relativas de Luz) obtenido en el luminómetro con eltubo sobrecargado es > 30.000 RLU, la muestra no contiene inhibidor de amplificación y la muestraaparentemente no contiene diana por amplificar. Si el número de RLU obtenido con el tubo sobrecargadoes < 30.000 RLU, la muestra contiene un inhibidor de la amplificación y debe analizarse otra muestra. Siel análisis repetido del tubo no sobrecargado es positivo, el resultado del test MTD puede ser consideradopositivo. La explicación más plausible para este tipo de resultado es la variabilidad ligada al muestreo: laprimera toma de prueba no contenía diana por amplificar, mientras que la segunda si contenía. El númerode RLU del tubo no sobrecargado puede ser positivo o negativo, según si la toma de muestra contiene ono RNAr de micobacterias que pertenezcan al complejo M. tuberculosis.

3. Control de la contaminación del laboratorioPara analizar la contaminación del laboratorio con amplicones de M. tuberculosis, proceder como sigue:a. Introducir 1 ml de agua estéril en un tubo limpio. Humedecer un escobillón estéril de poliéster o

dacrón con agua estéril.b. Frotar el escobillón en la cubierta de la mesa de trabajo o del material por analizar.c. Colocar el escobillón en el tubo y mezclar suavemente. Retirar el escobillón estrujándolo contra la

pared del tubo. Desechar el escobillón en un recipiente que contenga una solución de lejía diluida al1/2 (mitad de lejía, mitad de agua).

d. Distribuir 25 μl de la solución así obtenida en un tubo de amplificación que contenga 50μl de Reactivode Amplificación y 200μl de aceite para reacción de amplificación.

e. Seguir las instrucciones del párrafo « TECNICA » para la amplificación y la detección.InterpretaciónSi los resultados son > 30.000 RLU, la superficie estudiada está contaminada y debe ser descontaminadamediante un tratamiento con lejía, siguiendo las instrucciones del párrafo « TECNICA : Preparación del material ». Si se sospecha la presencia de contaminación del baño maría,proceder en la misma forma ya indicada, con 25 μl de agua del baño maría, a condición que ésta no con-tenga productos antisépticos.

Preparación del material1. a. Llenar el depósito del sonicador con agua de grifo a temperatura ambiente, hasta aproximadamente 1

cm del borde.b. El agua del baño de ultrasonidos debe ser desgasificada antes de cada ensayo con el fin de optimizar

la transferencia de energía de los ultrasonidos. Para desgasificar el agua en forma completa, hacerfuncionar el sonicador durante 15 minutos.

2. Regular un bloque calefactor a 95° ± 5°C, un bloque calefactor o un baño maría a 60° ± 1°C y un bloque

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calefactor o un baño maría a 42° ± 1°C.3. Limpiar las superficies de trabajo, material y pipetas con una dilución 1/2 de lejía antes de comenzar el

análisis. La lejía debe permanecer en contacto con esos objetos durante al menos 15 minutos. Enjuagarcon agua la superficie de trabajo para eliminar los restos de lejía. Cubrir la superficie sobre la cual serárealizado el test con una hoja de protección plastificada.

4. Preparar el luminómetro GEN-PROBE LEADER. Verificar que se cuenta con una cantidad suficiente deReactivos de Detección I y II para realizar los tests y verificar que los tubos se encuentran cebados.Consultar el manual de empleo del luminómetro para las instrucciones de carga de los Reactivos deDetección (estos reactivos son vendidos por separado).

Preparación del reactivoReconstituir el Reactivo de Amplificación liofilizado (A) en su frasco (50 tests) con 3 ml de Tampón deAmplificación (AB). Homogeneizar mediante un Vortex. Dejar reposar el reactivo reconstituido a temperaturaambiente hasta que se vuelva transparente. El Reactivo de Amplificación reconstituido puede conservarse 2meses a 2° - 8°C. La solución debe llevarse a la temperatura ambiente antes de su utilizatión.Preparación de las muestras1. Etiquetar e identificar un número suficiente de tubos de Lisis Mycobacterium (LT) para analizar tanto las

muestras, como un Testigo Positivo y otro Negativo bien sea de Amplificación o de Procesamiento de Muestras. Retirar y conservar los tapones

2. Pipetear 50 μl del Tampón de Dilución de las Muestras (SDB) Mycobacterium en todos los tubos de Lisis Mycobacterium (LT). Seguir las indicaciones facilitadas a continuación. Párrafos A o B para los testigos y C para las muestrasA. Testigos de Procesamiento de Muestras:

Para cada testigo agregar 1 ml de la solución ClNa/NaOH y 3 ml del tampón fosfato utilizado para analizar los esputos con 1 ml de agua estéril a un tubo de análisis de muestra.i. Mezclar mediante Vórtex.ii. Transferir 450 μl de la solución tampón fosfato/ClNa/NaOH y 50 μl de la dilución del Testigo al

tubo correspondientemente etiquetado de Lisis Mycobacterium (LT).B. Caso de emplear los Testigos de Amplificación, transferir 450 μl de dichos Testigos desde su envase

al tubo de Lisis Mycobacterium (LT) correspondientemente etiquetado.C. Muestra Transferir 450 μl de una muestra descontaminada bien mezclada en Vórtex, desde su envase al tubo de Lisis Mycobacterium (LT) correspondientemente etiquetado.

3. Volver a tapar los tubos de Lisis Mycobacterium (LT) después de la adición de cada muestra.4 Homogeneizar mediante Vórtex durante 3 segundosLisis de las muestras1. Insertar los Tubos de Lisis (LT) en el portatubos del sonicador de manera que la mezcla de reactivos en el

fondo de los tubos se encuentre sumergida, manteniendo al mismo tiempo los tapones fuera del agua.Poner el portatubos en su lugar. LOS TUBOS NO DEBEN EN NINGUN CASO ESTAR EN CONTACTOCON EL FONDO NI CON LAS PAREDES DEL SONICADOR.

2. Hacer funcionar el sonicador durante 15 minutos, pero no más de 20 minutos. Las muestras y controlesasí tratados con ultrasonidos son « lisados ». NO UTILIZAR EL VORTEX PARA AGITAR LOS LISADOS.

Amplificación1. Escribiendo en la parte alta de los tubos, identificar los tubos de polipropileno para amplificación

(12 x 75 mm) con los números correspondientes a los números de identificación de los Tubos de Lisis (LT).Identificar también los tubos de amplificación para los controles de amplificación positivo y negativo.

2. Introducir 50 μl de Reactivo de Amplificación reconstituido en el fondo de cada tubo utilizando una pipeta

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de repetición. Añadir 200 μl de aceite para reacción de amplificación (O) en cada tubo, utilizando unapipeta de repetición.

3. NO UTILIZAR EL VORTEX PARA LOS LISADOS. Transferir 25 μl de cada lisado en el fondo del tubo deamplificación correspondiente, utilizando una nueva punta provista de filtro para cada transferencia. Loslisados restantes pueden ser conservados a 2° - 8°C durante 7 días, o congelados a una temperaturaigual o inferior a -20°C durante 1 mes. No utilizar congelador con descongelación automática. Si debenefectuarse otros tests con los lisados, llevar antes a temperatura ambiente. NO UTILIZAR EL VORTEXPARA LOS LISADOS.

4. Incubar los tubos en un bloque calefactor a 95° C durante 15 minutos, pero no más de 20 minutos.5. Preparar la Solución Enzimática añadiendo 1,5 ml de Tampón de Dilución Enzimático (EDB) al Reactivo

Enzimático liofilizado (E). Hacer girar para mezclar. No utilizar el agitador Vortex. El Reactivo Enzimáticoreconstituido es utilizable durante un mes a 2° - 8°C o durante dos meses a una temperatura igual o inferiora -20°C si es dividido en alícuotas y congeladoB el día de su reconstitución. Si el test se realiza con frac-ciones alícuotas de enzimas congeladas, llevar a temperatura ambiente; no descongelar las fraccionesalícuotas incubándolas a alta temperatura. Para homogeneizar las fracciones alícuotas descongeladas, aspi-rar y expulsar suavemente la solución utilizando una pipeta de repetición antes de añadirla a los tubos deamplificación.

6. Transferir los tubos al bloque calefactor o al baño maría a 42° ± 1°C y dejarlos enfriar durante 5 minutos.NO DEJAR QUE LOS TUBOS ALCANCEN LA TEMPERATURA AMBIENTE. NO CUBRIR EL BAÑOMARIA.

7. Cuando los tubos se encuentran a 42°C, añadir 25 μl de Reactivo Enzimático en cada tubo, utilizandouna pipeta de repetición. Agitar para mezclar. Incubar a 42°C durante 30 minutos, pero no más de 60minutos. Hay que utilizar hojas autoadhesivas o tapones durante esta etapa de incubación. NO CUBRIREL BAÑO MARIA.

8. Después del período de incubación de 30 minutos, los tubos cubiertos pueden ser conservados a 2° - 8° C durante 2 horas o a -20°C hasta el día siguiente. Si son conservadas a -20°C hasta el díasiguiente, los tubos deben ser totalmente descongelados a temperatura ambiente o, como máximo, a60°C antes de cada etapa de hibridación, y deben ser cerrados con tapones mejor que con hojasautoadhesivas.

Hibridación1. Reconstituir el Reactivo de Hibridación liofilizado (H) con 6 ml de Tampón de Hibridación (HB). El Reactivo

de Hibridación (H) y el Tampón de Hibridación (HB) deben estar a temperatura ambiente antes de lareconstitución. Si el Tampón de Hibridación (HB) ha sido refrigerado, calentarlo hasta 60°C haciéndolo girarsuavemente para verificar que todos los componentes están disueltos. Agitar con ayuda de un Vortex hastaque la solución se vuelva transparente (lo que puede demorar hasta un minuto) para verificar que todos loscomponentes hayan quedado disueltos. El Reactivo de Hibridación reconstituido es utilizable durante unmes a 2° - 8°C o durante dos meses a una temperatura igual o inferior a -20°C si es dividido en alícuotas ycongeladoC el día de su reconstitución. Si el Reactivo de Hibridación reconstituido ha sido refrigerado ocongelado, calentarlo hasta 60°C haciéndolo girar suavemente para que todos sus componentes quedendisueltos

2. Añadir 100 μl de Reactivo de Hibridación reconstituido a cada tubo utilizando una pipeta de repetición.Cubrir los tubos con hojas autoadhesivas o con tapones. Agitar los tubos mediante un Vortex a velocidadmedia 3 veces durante por lo menos 1 segundoD. Para alcanzar una correcta homogeneidad de los tubosde reactivos, mantenerlos en posición vertical y dejar que la mezcla alcance la mitad superior de la pareddel tubo durante la agitación (para evitar cualquier contaminación, no dejar que la mezcla de reactivostome contacte con las hojas autoadhesivas o con los tapones). Cuando la homogeneización ha sido cor-rectamente realizada, la mezcla debe presentar un color amarillo uniforme.

3. Incubar a 60°C durante 15 minutos, pero no más de 20 minutos, en un bloque calefactor o al baño maría.

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Selección1. El Reactivo de Selección (S) debe estar a temperatura ambiente antes de comenzar el test. Retirar los

tubos del baño maría o del bloque calefactor a 60°C y añadir 300 μl de Reactivo de Selección (S) utilizan-do una pipeta de repetición. Cubrir los tubos con hojas autoadhesivas o tapones. Agitar mediante unVortex a velocidad media, 3 veces durante al menos 1 segundoD. Para alcanzar una buena homo-geneización de los tubos de reactivos, mantenerlos en posición vertical y dejar que la mezcla alcance lamitad superior de la pared del tubo durante la agitación (para evitar cualquier contaminación, no dejar quela mezcla de reactivos entre en contacto con las hojas autoadhesivas o los tapones). Cuando se harealizado correctamente la homogeneización, la mezcla debe presentar en este momento un color rosauniforme.

2. Incubar a 60°C durante 15 minutos, pero no más de 16 minutos, en un bloque calefactor o al baño maría.3. Retirar los tubos del baño maría o del bloque calefactor. Dejar los tubos a temperatura ambiente durante

al menos 5 minutos, pero no más de una hora. Retirar las hojas autoadhesivas o los tapones justo antesde la fase de detección.

Detección1. Programar el protocolo apropiado en el luminómetro. Elegir una lectura en 2 segundos.2. Para eliminar cualquier residuo de la superficie de los tubos, secarlos con papel absorbente sin pelusas y

húmedo; introducir a continuación en el luminómetro siguiendo las instrucciones del manual de empleo.Los tubos deben ser leídos dentro de la hora siguiente a la etapa de selección.

3. Una vez terminado el análisis, retirar los tubos del luminómetro.4. Después de la lectura de los tubos, llenarlos con precauciones con una solución de lejía diluida a

1/10 (un volumen de lejía por 9 volúmenes de agua), utilizando un matraz. Dejar la lejía en contactodurante por lo menos una hora antes de desechar los tubos, para evitar la contaminación del laboratoriocon amplicones.

5. Los portatubos deben ser descontaminados sumergiéndolos por completo en una solución de lejía diluidaal 1/2 durante al menos 15 minutos. Deben ser enjuagados a continuación con agua y secados, o dejadossecar al aire.

6. Descontaminar el laboratorio y el material utilizando una solución de lejía diluida a 1/2.Repetición del test1. Si se repite el test, llevar los lisados a temperatura ambiente. NO UTILIZAR VORTEX PARA LOS LISA-

DOS.2. Seguir a continuación la Técnica, comenzando por la etapa de amplificación.OBSERVACIONESA. Reactivos

1. El Reactivo Enzimático no debe quedar a temperatura ambiente más de 15 minutos después de habersido reconstituido.

2. El Tampón de Hibridación (HB) puede precipitar. Calentar y agitar el Tampón de Hibridación (HB) o elReactivo de Hibridación reconstituido a 60°C para disolver el precipitado.

B. Temperatura1. La amplificación, la hibridación y la selección son reacciones termodependientes; en consecuencia, es

necesario mantener el baño maría o el bloque calefactor a las temperaturas recomendadas.2. Antes de añadir el Reactivo Enzimático, dejar enfriar los tubos durante 5 minutos con el fin de que

alcancen 42°C. Esta temperatura permite alcanzar rendimientos de amplificación óptimos.3. El respeto de la temperatura es fundamental para la fase de amplificación (42° ± 1°C).

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C. TiemposEs imperativo respetar los tiempos indicados en el párrafo « TECNICA ».

D. Baño maría1. El nivel de agua en el baño maría debe mantenerse de manera que la mezcla de reactivos en el fondo

de los tubos se encuentre sumergido, pero que el agua no penetre en los tubos.2. Durante la fase de amplificación, el baño maría no debe quedar cubierto con el fin de evitar que la con-

densación caiga sobre o dentro de los tubos.E. Agitación utilizando ‘un Vortex

Es importante disponer de una mezcla homogénea durante las etapas de hibridación y de selección, par-ticularmente después de añadir el Reactivo de Hibridación (H) reconstituido (la mezcla adopta un coloramarillo uniforme) y del Reactivo de Selección (S) (la mezcla adopta un color rosa uniforme).La agitación utilizando un Vortex permite obtener una suspensión uniforme. Cuando los reactivos soncolocados en un tubo de reactivos y son expuestos a una fuente de energía exterior, se produce unarotación rápida de la solución en torno al eje del tubo. Esto se traduce en una suspensión uniforme. Paraque la homogeneización se realice correctamente, utilizando un Vortex, los tubos deben mantenerse verti-calmente, sosteniéndolos por la parte superior. El líquido debe entonces alcanzar la mitad superior deltubo durante la agitación. Durante etapas de hibridación y selección, esta agitación es realizada 3 vecesseguidas y debe durar por lo menos 1 segundo cada vez.

INTERPRETACION DEL ENSAYOEl resultado de la muestra analizada mediante el GEN-PROBE TEST AMPLIFI ED para la detección directadel complejo Mycobacterium Tuberculosis (MTD) se interpreta basándose en un resultado negativo inicial (<30.000 RLU),un resultado positivo inicial (> 500.000 RLU), o un resultado equívoco inicial (de 30.000 a499.999 RLU). Debe repetirse el ensayo MTD del lisado reservado cuando el resultado del ensayo inicialresulte equívoco. Un resultado repetido del lisado > 30.000 se considera positivoA. Resultados de Control de Calidad y Aceptabilidad

Los testigos deberán producir los siguientes valores:Testigo Negativo de Amplificación < 20.000 RLUTestigo Positivo de Amplificación > 500.000 RLUTestigo Negativo del Procesamiento de Muestra < 20.000 RLUTestigo Positivo del Procesamiento de Muestra > 1.000.000 RLU

No deberán entregarse los resultados de ensayos MTD de pacientes que no cumplan los criterios arribareseñados.Consultar el párrafo "RESOLUCIÓN DE INCIDENTES" para información adicional.Cada laboratorio debe determinar los valores objetivo para los testigos utilizando los resultados de ensayopara cada lote de testigos preparados.

B. Resultados de Ensayos en PacientesCaso de que los testigos no arrojen las cifras esperadas, los resultados de ensayo en muestras de pacientes del mismo lote no deberán ser entregados Result ado:

> 500.000 RLU positivo para ARNr del complejo M. tuberculosis< 30.000 RLU negativo para ARNr del complejo M. tuberculosis

30.000 a 499.999 RLU probable positivo para ARNr del complejo M. tuberculos; repetir para verificación:Repetir > 30.000 RLU positivo para ARNr del complejo M. tuberculosisRepetir < 30.000 RLU negativo para ARNr del complejo M. tuberculosis

PRESENTACIÓN DE LOS RESULTADOS

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Los resultados del ensayo MTD se interpretarán con juntamente con otros datos clínicos y de laboratoriodisponibles para el analista. Basándose en el grado de sospecha clínica, se debería considerar el ensayo deuna muestra adicional. Si el ensayo inicial MTD fuese positivo a > 500.000 RLU, o el ensayo MTD repetido fuese positivo a > 30.000RLU, se emitirá el siguiente informe:

Caso de que el resultado del ensayo MTD inicial o repetido resultase negativo a < 30.000 RLU,se informaríacomo sigue:

LIMITESEste test está destinado exclusivamente a la detección de micobacterias del complejo M. tuberculosis a partirde muestras preparadas según los procedimientos NALC-NaOH o NaOH recomendados por el CDC7. Estaprueba sólo puede ser utilizada con muestras preparadas a partir de esputos (inducidos o expectorados), demuestras bronquiales (lavados bronco-alveolares o aspirados bronquiales) o de aspirados traqueales.El test MTD es específico para las micobacterias del complejo M. tuberculosis, a saber, M. tuberculosis, M.bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, y M. canetti (12, 13), pero no diferencia estas especies entresí. M. celatum y M. pseudo-terrae pueden provocar reacciones cruzadas si se presentan en concentracionessuperiores a 30 UFC por test. En todo caso, M. celatum y M. pseudo-terrae son rara vez aisladas en clínica.La calidad de los resultados del test se encuentra relacionada con la calidad de la toma de muestra y con sutransporte; con la variabilidad de la toma de muestras; con los errores técnicos del laboratorio; con los erroresde identificación de las muestras y con los errores de transcripción de los resultados. Un test negativo noexcluye la presencia de una micobacteria del complejo M. tuberculosis en la muestra.

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Informe: Se ha detectado ARNr del complejo Mycobacterium tuberculosis. Frotis BAAR (positivo o negativo).

Información adicional: Cultivo para detección BAAR en curso.La muestra puedecontener tanto MOTT como M. tuberculosis o sólo M. tuberculosis Este ensayo no debes er la única base paradiagnosticar la tuberculosis. El valor positivo predictivo paraun frotis negativo del paciente es inferior a un frotis positivodel paciente Resulta particularmente importante en ensayosde poblaciones donde la prevalencia de tuberculosis resultebaja y los valores positivos predictivos de los métodos dediagnosis se reducen de forma correspondiente.

Informe: No se ha detectado ARNr para el complejo Mycobacteriumtuberculos is Frotis BAAR (positivo o negativo).

Información Adicional: N o hay detección de ARNr del complejo tuberculosisCultivo para detección BAAR en curso La muestra puede nocontener M. tuberculosis, el resultado puede ser falso nega-tivo debido al bajo número de M. tuberculosis e presencia oausencia de MOTT, o el resultado puede ser falso debibo ala interferencia en el ensayo de muestras inhibidoras. Serecomienda analizar muestras de otro paciente si clínica-mente se sospechase la presencia de tuberculosis activa ode la inhibición de la muestra.


VALORES ESPERADOSA. Gama de valores de control obtenidos durante los ensayos clínicos

La gama de valores obtenidos por los controles (RLU) durante los ensayos clínicos realizados en 7 sitiosha sido la siguiente:

B. Gama de los valores obtenidos para las muestras clínicasPara las 127 muestras MTD-positivas, los valores se encontraban entre 35.777 y > 2.000.000 RLU.Para las 577 muestras MTD-negativas, los valores se encontraban entre 573 y 19.176 RLU.La frecuencia de los resultados en RLU para todas estas muestras, después de resolver las discordan-

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cias, figura a continuación. La resolución de las discordancias se basa en el análisis de otras muestras,positivas en cultivo, procedentes de un mismo paciente y/o en el diagnóstico final del médico tratante.

RESULTADOSA. Evaluación clínica

Los resultados del test MTD en su forma original han sido evaluados durante ensayos clínicos realizadosen seis laboratorios, comparando los resultados obtenidos por examen de frotis con resultados del cultivo,en 6.079 muestras procedentes de 2.609 pacientes. Entre éstas, 4.000 muestras provenían de 1.898pacientes que no habían recibido tratamiento antituberculoso. Los seis sitios representaban zonas geográ-ficas diferentes: cinco centros hospitalarios de grandes ciudades de EE.UU. que poseen un servicio espe-cializado para la tuberculosis, y un laboratorio público.Los resultados del test MTD en su forma actual han sido evaluados en siete sitios, comparando los resul-tados del test MTD con los resultados del cultivo. Los siete centros que participaron en el test representa-ban zonas geográficas diferentes: seis centros hospitalarios de grandes ciudades de EE.UU. que poseíanun servicio especializado para la tuberculosis y un laboratorio nacional público de micobacteriología. Lasmuestras analizadas provenían de pacientes que no habían recibido tratamiento antituberculoso. 132

dieron resultados positivos en cultivo con respecto a las micobacterias del complejo M. tuberculosis. MTDdetectó 119 de estas muestras como cultivos positivos; y 7 muestras contenían micobacterias no tuber-culosas además de M. tuberculosis.Pacientes sospechosos de estar afectados por una tuberculosis pulmonar activa que no se encontrabanbajo tratamiento han sido incluidos en este estudio. La prevalencia total de los pacientes que presentaronun cultivo positivo de M. tuberculosis fue de 20,5%.Por paciente, fueron determinadas una sensibilidad media de 93,3 % y una especificidad media de 99,1 %en relación al cultivo. Por muestra, fueron determinadas una sensibilidad media de 90,6 % y una especifici-dad media de 99,6 % en relación al cultivo. En el cuadro que sigue se proporciona la sensibilidad, laespecificidad, el valor predictivo positivo (VPP) y el valor predictivo negativo (VPN), con intervalos deconfianza del 95%, para las estimaciones de resultados. Todos los datos visualizados son presentadosdespués de resolver las discordancias en base al análisis de otras muestras positivas en cultivoprocedentes del mismo paciente y/o en base al diagnóstico final del médico tratante.

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De las 564 muestras negativas en cultivo y MTD-negativas para las micobacterias del complejo M. tuber-culosis, 114 muestras contenían micobacterias atípicas, puestas en evidencia por cultivo, 64 procedían depacientes cuyas otras muestras permitieron aislar micobacterias atípicas por cultivo y 169 provenían depacientes en los cuales no se aisló en cultivo ninguna micobacteria.

B. PrecisiónPaneles de muestras, consistentes en 2 muestras negativas, 2 muestras débilmente positivas (= 100 UFC/ test) y 2 muestras moderadamente positivas (= 1000 UFC/ test) fueron analizadas en trescentros. Las muestras positivas fueron preparadas agregando cantidades conocidas de M. tuberculosis auna mezcla de muestras moderadamente inhibidoras.. Las muestras y los controles de amplificación posi-tivo y negativo fueron analizados por triplicado dos veces al día, durante 3 días, en los tres centrosDada que la variabilidad de los resultados no era significativa entre un sitio y otro o entre un día y otro,los resultados de los tres centros pudieron ser consolidados y son presentados a continuación. Los val-ores de lectura medidos en RLU son limitados por la resolución del tubo fotomultiplicador del luminómetro.Por esta razón, los valores superiores a 2.000.000 RLU son llevados a 2.000.000 RLU. No se indican lasdesviaciones tipo ni los coeficientes de variación.

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C. ReproductibilidadEl estudio de reproductibilidad fue realizado analizando 25 muestras; se intercalaron controles de amplifi-cación negativos entre cada muestra para formar un total de 50 muestras. El panel de reproductibilidadfue analizado en cuatro centrosEn total, 100 % (120/120) de las muestras negativas y 98,8 % (79/80) de las muestras positivas dieronlos resultados esperados.

D. Especificidad analíticaLa especificidad del test MTD fue evaluada con la ayuda de bacterias, hongos y virus. En el caso de lasbacterias y de los hongos, los tests de especificidad incluyeron 160 cepas (151 especies procedentes de62 géneros) de micobacterias muy cercanas a M. tuberculosis, otros microorganismos responsables deenfermedades respiratorias y un panel filogenético de microorganismos de la flora comensal del aparatorespiratorio. Las cepas tipo fueron cultivos ATCC (American Type Culture Collection), y 5 cepas fueronsuministradas por laboratorios de análisis. Los lisados, preparados a partir de cultivos en fase activa decrecimiento (o de RNAr, en tres casos) fueron analizados conforme al protocolo del test MTD a razón deaproximadamente 5 x 107 UFC por test. Unicamente las cepas del complejo M. tuberculosis dieron resul-tados positivos, con excepción de cepas de M. celatum y M. pseudo-terrae.Con concentraciones superiores a 30 UCF por test, las cepas de M. celatum y algunas cepas de M.pseudo-terrae dieron resultados positivos (26.772 RLU para M. celatum y 19.470 a 49.976 RLU para M.pseudo-terrae).

E. Límite de detecciónTreinta cepas de M. tuberculosis provenientes de regiones geográficas muy variadas, incluidos represen-tantes de cepas resistentes y de cepas sensibles a los antibióticos, fueron detectadas mediante el testMTD. El test MTD pudo detectar hasta 1 UFC por test de cada una de las 30 cepas.

F. Test de sobrecargaFueron analizados RNAr de Mycobacterium tuberculosis con una concentración de 25 fg (equivalente a5 UFC por test) en presencia de aproximadamente 540.000 UFC por test (450 μl) de los siguientesorganismos no dianas: Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila,Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium gordonae, M. avium, M. kansasii, M. terrae, Nocardia aster-oides, N. otitidis-caviarum, Corynebacterium pseudotuberculosis, C. diphtheriae, Gordona sputi yRhodococcus bronchialis. Todos los resultados fueron positivos para el RNAr de M. tuberculosis en pres-encia de estos organismos no dianas, que por lo tanto no crearon interferencia.

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RESOLUTION DE INCIDENTES

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OBSERVACIONValores Elevados de los TestigosNegativos de Amplificación o deTestigos Negativos deProcesamiento de Muestras(> 20.000 RLU)

Valores Bajos de los TestigosPositivos de Amplificación o deTestigos Positivos deProcesamiento de Muestras(< 500.000 RLU)

CAUSAS POSIBLESHomogeneización insufi-

ciente o adición de volumeninsuficiente tras añadir elMycobacterium Selection

Amplificación de los contami-nantes introducidos por falta deprecaución durante lapreparación de las reacciones.

Omisión de la etapa deenfriamiento de 5 minutos.

Contaminación del laborato-rio o de los reactivos.

Omisión del secado de lostubos antes de la lectura con elluminómetro.

fase fuera del rango detemperatura recomendado

Adición del Reactivo deAmplificación, vertiendo ellíquido en las paredes del tuboy no directamente al fondo delmismo.

Homogeneizacióninsuficiente después de añadirel Reactivo de Hibridaciónreconstituido.

Volumen de Reactivo deSelección demasiado impor-tante.

No respeto del tiemporecomendado para la etapa deselección.

La temperatura de los tubosha descendido por debajo de42°C después de la incubacióna 95°C.

Los conductos que llevan elReactivo de Detección seencuentran obstruidos.

RECOMENDACIONESConseguir una homogeneizacióncompleta. Garantizar que el volumendel reactivo añadido sea Correcto

Debe prestarse gran cuidado a ladistribución de los reactivosmediante pipetas. Los tubos yautilizados deben serdescontaminados con una soluciónde lejía diluida al 1/10, tal como seindica en el párrafo « TECNICA ».Las superficies de trabajo, losbloques calefactores, los bañosmarías y las pipetas deben serdescontaminadas con una soluciónde lejía diluida al 1/2, como se indi-ca en el párrafo « TECNICA ».

Ajustar según convenga para con-seguir los rangos especificados detemperaturaVerificar la temperatura del bañomaría y/o del bloque calefactor yajustarlo si fuera necesario pararespetar las temperaturas recomen-dadas.

Agitar cuidadosamente con el Vortexcomo se ha especificado (ver el pár-rafo « Hibridación / 2 »). Verificar laformación de una solución de coloramarillo uniforme después de laagitación.

Respetar los 15 minutos deincubación a 60°C, durante la etapade Selección.

Transferir directamente los tubos delbloque calefactor a 95°C al bañomaría / bloque calefactor a 42°C.

Enjuagar los conductos con aguacaliente, como se indica en elmanual de empleo del instrumento.

Español


NOTASA Los bloques calefactores deben tener pocillos previstos para los tubos 12 x 75 mm. Se recomienda uti-

lizar bloques calefactores GEN-PROBE.B Se recomienda para el almacenamiento de la alícuotas congeladas tubos de microcentrífuga con tapa.

Las alícuotas individuales congeladas pueden congelarse y descongelarse solo de una vez. No debenusarse congeladores con sistema “frost-free”.

C Se recomienda para almacenar las alícuotas congeladas crioviales de 5 ml. Las alícuotas individualescongeladas pueden congelarse y descongelarse solo de una vez. No deben usarse congeladores consistema “frost-free”.

D Los rendimientos de los Vortex pueden diferir, según el material utilizado: puede ser necesario adaptar eltiempo de agitación. Regular la velocidad del aparato y seguir las instrucciones descritas en « TECNICA,párrafo E », con el fin de permitir que la mezcla de reactivos pueda alcanzar la mitad superior de lapared del tubo. Una homogenización correcta es indispensable para obtener resultados precisos. Eltiempo de agitación puede ser llevado a 15 segundos sin afectar los resultados.

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TEST AMPLIFIED PER L’IDENTIFICAZIONE DIRETTA DEI MICOBATTERI DELMYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEX

Kit da 50 test(bioMérieux cod. 39006/Gen-Probe Cat. N. 301001/1001F)

MODALITÀ D’IMPIEGOIl test AMPLIFIED PER L’IDENTIFICAZIONE DIRETTA DEI MICOBATTERI DEL MYCOBACTERIUM TUBER-CULOSIS COMPLEX (MTD) è un test che impiega una sonda a DNA diretta contro un bersaglio amplificato.Questa sonda permette di identificare in vitro gli acidi nucleici dei micobatteri del Mycobacterium tuberculosiscomplex. Questo test viene effettuato su campioni provenienti da escreati (indotti o espettorati), prelievibronchiali (lavaggi bronco-alveolari o broncoaspirati) ed aspirati tracheali.AVVERTENZANon è ancora stata dimostrata l’efficacia di questo test per l’identificazione diretta di rRNA di M. tuberculosis apartire da altri campioni clinici (ad esempio ematici, urinari o coprologici). Le performance del test MTD sonostate unicamente stabilite per campioni trattati in base alla metodica descritta e conservati per i periodi e alletemperature di cui al presente foglietto illustrativo.I campioni che evidenziano risultati positivi devono essere messi in coltura allo scopo di determinare l’even-tuale presenza di micobatteri diversi da quelli appartenenti al M. tuberculosis complex o micobatteri atipici.Devono essere altresì effettuati sia test di sensibilità agli anti-tubercolari che, successivamente, colture per laricerca di bacilli alcol-acido resistenti (BAAR) al fine di precisare la sottospecie del TB complex presente (adesempio M. bovis).Nel quadro delle prove cliniche, sono stati sottoposti al test anche prelievi eseguiti su bambini, su pazientiHIV positivi e pazienti infettati da micobatteri atipici. In ogni caso il numero di questi test non ha consentito diconfrontare statisticamente le performance del test nei vari gruppi sopra citati.Non sono state valutate le performance del test su prelievi da pazienti sotto trattamento anti-tubercolare al finedi effettuare un monitoraggio terapeutico o confermare una guarigione.Il kit MTD non deve essere impiegato per testare i campioni ad alta concentrazione ematica.PRECAUZIONI D’USOA. Il test è riservato esclusivamente all'uso diagnostico in vitro.B. Il test MTD è specifico per i micobatteri del M. tuberculosis complex, vale a dire M. tuberculosis, M. bovis,

M. bovis BCG, M. africanum, M. microti e M. canetti (13), ma non consente di diversificare fra questespecie. M. celatum e M. terrae-like possono indurre reazioni incrociate se presenti a concentrazioni supe-riori a 30 CFU (Unità Formanti Colonie) per test. Tuttavia, M. celatum e M. terrae-like vengono raramenteisolati in clinica.

C. Un risultato negativo non esclude la presenza nel campione di un micobatterio del M. tuberculosis com-plex. La qualità dei risultati dipende dal prelievo e dalla manipolazione, dalla variabilità del prelievo deicampioni, dagli errori tecnici del laboratorio, dagli errori di identificazione dei campioni e dagli errori ditrascrizione dei risultati.

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Italiano


D. Il test è riservato all’identificazione dei micobatteri del M. tuberculosis complex a partire da campionipreparati in base ai metodi NALC-NaOH o NaOH raccomandate dai Centers for Disease Control (CDC)7.Questo test deve essere esclusivamente impiegato per campioni concentrati preparati a partire da escreati(indotti o espettorati), aspirati tracheali o prelievi bronchiali (lavaggi bronco-alveolari o broncoaspirati).Quando il campione viene rimesso in sospensione nella soluzione di tampone fosfato, assicurarsi che laconcentrazione di fosfato sia di 67 mM7.

E. Evitare qualsiasi contatto della cute, degli occhi e delle mucose con i Reagenti di Rivelazione I e II(bioMérieux cod. 39300 / Gen-Probe Cat. N. 201791/1791). In caso di contatto, lavare abbondantementecon acqua le parti interessate. Se si verificassero versamenti di reagenti, diluirli abbondantemente conacqua prima di asciugare la superficie.

F. Adottare le normali precauzioni durante l’esecuzione di questo test4. La preparazione dei campioni digeritie decontaminati così come le fasi del test MTD devono essere effettuate osservando le norme di sicurezzamicrobiologica di classe 25.

G. Usare esclusivamente il materiale compreso nel kit o materiale da laboratorio monouso.H. Occorre decontaminare i banchi, le pipette e il materiale con una soluzione di candeggina diluita al 50%

(metà candeggina, metà acqua), seguendo le istruzioni fornite nel paragrafo “ PROCEDIMENTO ”. Lasciarela candeggina in situ per 15 minuti, risciacquare con acqua e asciugare per eliminare i residui di candeggi-na.

I. Per condurre questo test è necessario impiegare pipette munite di puntali provvisti di filtro. Durante iltrasporto del lisato dalle provette di lisi alle provette di amplificazione, ricorrere a puntali extra-lunghi. Adogni fase cambiare il puntale. Non passare sopra alle altre provette nel portaprovette. I puntali usatidevono essere immediatamente gettati in un apposito contenitore per rifiuti biologici.

J. Durante l’impiego di una micropipetta a volume fisso per l’erogazione dei reagenti, una volta introdotto illisato nelle provette non toccare la provetta con il puntale della pipetta al fine di minimizzare i rischi di cont-aminazione fra provette. I reagenti devono essere dispensati contro la parete della provetta per evitarespruzzi. Un’erogazione estremamente accurata permetterà di ridurre i rischi di contaminazione crociata.

K. Non usare le stesse pipette per le tappe a monte e a valle dell’amplificazione.L. Dopo la lettura dei risultati per mezzo del luminometro, decontaminare le provette e gettarle seguendo le

istruzioni fornite nei paragrafi “ PROCEDIMENTO ” e “ OSSERVAZIONI ” al fine di evitare la contami-nazione del laboratorio attraverso gli amplicon.

M. Non riusare MAI i fogli autoadesivi e i tappi impiegati durante una fase precedente. I tappi devono esseregettati in un apposito contenitore subito dopo la loro rimozione per evitare qualsiasi contaminazionecrociata. Le etichette devono essere perfettamente applicate sulla parte superiore delle provette di reazione.

N. Non coprire il bagno-maria durante le incubazioni, soprattutto nel caso in cui vengano impiegati tappi (lacondensa sul coperchio può costituire una fonte di contaminazione).

O. Per ottenere la massima precisione nei risultati, dopo aver aggiunto il Reagente di Selezione è necessariooperare una perfetta omogeneizzazione mediante Vortex.

P. Si raccomanda di utilizzare, per la fase HPA (Hybridization Protection Assay), un'area separata per ridurreal minimo la contaminazione da amplicon del test. Questa area dedicata deve essere separata dall'area perla preparazione dei campioni e dei reagenti e dall'area per l'amplificazione.

Q. Per aiutare a prevenire la contaminazione da amplicon delle aree di lavoro, il laboratorio deve disporre learee di lavoro secondo un flusso uni-direzionale. Per esempio, procedere dall'area di preparazione deicampioni e dei reattivi all'area di amplificazione e quindi a quella dell'HPA. I campioni, i materiali ed i reat-tivi non possono essere riportati nell'area dove è stata eseguita la fase precedente. Inoltre il personale nonpuò tornare nelle precedenti aree di lavoro senza adeguate protezioni anti-contaminazioni. E' fortementeraccomandato di non utilizzare, per l'esecuzione del test MTD, il locale di bio-sicurezza utilizzato per il trat-tamento dei campioni.

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INTRODUZIONEIl test MTD impiega il metodo TMA (Transcription-Mediated Amplification) ed il metodo HPA (HybridizationProtection Assay)2 al fine di identificare in maniera qualitativa l’RNA ribosomiale (rRNA) dei micobatteri del M.tuberculosis complex. Il test MTD identifica l’RNA degli organismi coltivabili e non coltivabili. ll M. tuberculosiscomplex comprende le sotto-specie M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti e M.canetti (12, 13). Il test MTD identifica tutti i microrganismi del TB complex. Tuttavia, M. microti infetta unica-mente gli animali; M. bovis viene trasmesso soltanto molto raramente dagli animali infetti all’essere umano; M.africanum, dal canto suo, è responsabile della tubercolosi polmonare nell’Africa tropicale12; M. tuberculosis èdi gran lunga la sotto-specie più comune, responsabile di un tasso di morbilità significativamente alto in tutto ilmondo. Recentemente i CDC hanno diffuso dati relativi ad un aumento dei casi di tubercolosi nei soggetti col-piti da AIDS, fra gli immigrati e ad un incremento della trasmissione della patologia nelle popolazioni ad altorischio6,9. Si registra inoltre un aumento del numero di ceppi resistenti, ma anche multi-resistenti agli anti-tubercolari11. Nel campo della salute pubblica le conseguenze devono essere attentamente valutate.I metodi di coltura tradizionali consentono l’osservazione della crescita di M. tuberculosis in un arco tempo-rale variabile da 1 a 8 settimane7,10. Il test MTD, invece, permette di identificare l’rRNA dei micobatteri del M.tuberculosis complex in 2,5 - 3,5 ore. Anche se non consente la realizzazione dell’antibiogramma, il test MTDidentifica il M. tuberculosis in modo rapido e affidabile. Ciò permette di gestire in modo ottimale i reparti di iso-lamento dei presidi ospedalieri al fine di iniziare immediatamente un trattamento adeguato e prevenire così lapropagazione della malattia grazie all’individuazione diretta e all’isolamento dei soggetti infetti3.PRINCIPIO OPERATIVOIl test MTD è un test suddiviso in due fasi (amplificazione e rivelazione) effettuate in una stessa provetta. Inprimo luogo, mediante sonicazioneviene liberato l’RNA ribosomale dei micobatteri. Mediante il calore sidenatura e si rompe la struttura secondaria dell’rRNA. Il metodo di amplificazione Gen-Probe TMA amplificaquindi un bersaglio specifico di rRNA micobatterico attraverso un intermedio di DNA ad una temperaturacostante di 42°C. In questo modo vengono prodotte molteplici copie di rRNA micobatterico (amplicon). Le sequenze dell’amplicon di rRNA, specifiche dei micobatteri del M. tuberculosis complex, vengono poi iden-tificate servendosi della metodica di ibridazione degli acidi nucleici Gen-Probe HPA2. Il Reagente diIbridazione del test MTD contiene una sonda a DNA a catena singola collegata ad un marker chemiolumine-scente. Questa sonda è complementare alle sequenze di RNA specifiche dei micobatteri del M. tuberculosiscomplex. La sonda contenente queste sequenze specifiche forma degli ibridi stabili RNA-DNA. Dopo la fase diselezione, il segnale luminoso emesso dagli ibridi viene misurato mediante un luminometro GEN-PROBELEADER.REAGENTI (Kit da 50 test)I reagenti per il test MTD vengono forniti come di seguito indicato :Nome del reagente VolumeTRAY DEI REAGENTI PER AMPLIFICAZIONETampone di Diluizione dei Campioni (SDB) ....................................................................................1 x 2,5 ml

Soluzione tampone Tris contenente < 3 % di detergenteReagente di Amplificazione (A) ..........................................................................................................1 x 3 ml

Acidi nucleici liofilizzati in una soluzione tampone Tris contenente (dopo ricostituzione)il 5 % di agente legante

Tampone di amplificazione (AB) ........................................................................................................1 x 3 mlSoluzione acquosa contenente conservanti

Reagente di amplificazione oleoso (olio per la reazione di amplificazione) (O) ..............................1 x 10 mlOlio al silicone

Reagente Enzimatico (E) ................................................................................................................1 x 1,5 mlTranscriptasi inversa e RNA polimerasi liofilizzate in una soluzione tampone (dopo ricostituzione)

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HEPES contenente < 10 % di agente legante e > 15 mM di N-Acetil-L-CisteinaTampone di Diluizione Enzimatica (tampone di diluizione degli enzimi) (EDB) ..............................1 x 1,5 ml

Soluzione tampone Tris contenente un surfactante e gliceroloTRAY DEI REAGENTI PER IBRIDAZIONEReagente di Ibridazione (H)................................................................................................................1 x 6 ml

< 100 ng/flacone di sonda a DNA non infettiva associata ad un marker (dopo ricostituzione)chemioluminescente, liofilizzata, in una soluzione tampone succinato contenente un agente legante e un detergente

Tampone di Ibridazione (HB) ..............................................................................................................1 x 6 mlSoluzione tampone succinato contenente < 4 % di detergente

Reagente di Selezione (S)................................................................................................................1 x 15 mlSoluzione tampone borato contenente un surfactante

Provette di Lisi (LT) ................................................................................................................2 x 25 provetteSfere di vetro, agente legante

CONSERVAZIONEA. Le soluzioni o i componenti non ricostituiti sottoindicati devono essere conservati ad una temperatura com-

presa tra 2° e 25°C e possono essere impiegati fino alla data di scadenza indicata:Tampone di Diluizione dei Campioni (SDB)Reagente di Amplificazione (A)Tampone di Amplificazione (AB)Reagente Enzimatico (E)Tampone di Diluizione Enzimatico (EDB)Reagente di Ibridazione (H)

Il Reagente di Amplificazione ricostituito (A) è stabile per 2 mesi se conservato a temperature comprese tra 2°e 25°C. Il Reagente di Ibridazione (H) e il Reagente Enzimatico (E) sono stabili per un mese ad una tempera-tura compresa tra 2° e 25°C dopo ricostituzione o per due mesi a una temperatura uguale o inferiore a -20°Cnel caso in cui siano aliquotati e congelati il giorno della loro ricostituzione. Le aliquote congelate devonoessere impiegate il giorno in cui vengono scongelate. Non utilizzare congelatori a sbrinamento automatico.B. I seguenti componenti devono essere conservati ad una temperatura compresa tra 2° e 25°C e possono

essere impiegati fino alla data di scadenza indicata :Reagente di amplificazione oleoso (O)Tampone di Ibridazione (HB)Reagente di Selezione (S)Provette di lisi (LT)

PRELIEVO, CONSERVAZIONE, TRASPORTO E TRATTAMENTO DEI CAMPIONIPrelievo e conservazione del campione:Prima del trasporto e del trattamento i campioni devono essere trasferiti in contenitori di plastica sterili e con-servati ad una temperatura compresa tra 2° e 25°C. I campioni utilizzati nelle valutazioni cliniche erano stati-conservati per meno di 4 giorni (in genere meno di 24 ore) prima del relativo trattamento.

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Trasporto :Trasportare i campioni in laboratorio il più rapidamente possibile ottemperando alle normative in vigore.Trattamento (decontaminazione e concentrazione) :I campioni con elevata concentrazione ematica non devono essere sottoposti al test MTD. Questo test è statoprogettato e sviluppato per identificare l’RNA dei micobatteri del M. tuberculosis complex ricorrendo a cam-pioni preparati in base ai metodi di decontaminazione NALC-NaOH o NaOH, impiegando dall’1% all’1,5% diNaOH per un tempo variabile da 15 a 20 minuti e una centrifugazione ad una velocità superiore o uguale a3000 g7.Conservazione dei campioni trattati :I campioni possono essere conservati, prima del test, per un massimo di 3 giorni a 2° - 8°C. Possono essereanche conservati ad una temperatura compresa fra -20° e -70°C per un massimo di 6 mesi. Non utilizzare con-gelatori a sbrinamento automatico.MATERIALEA. Materiale fornito

Composizione del kit (bioMérieux cod. 39006 / Gen-Probe 50 testCat. N. 1001F)TRAY DEI REAGENTI PER AMPLIFICAZIONETampone di Diluizione del Campione (SDB) 1 x 2,5 mlReagente di Amplificazione (A) 1 x 3 ml (dopo ricostituzione)Tampone di Ricostituzione (AB) 1 x 3 mlReagente oleoso (olio per reazione di amplificazione) (O) 1 x 10 mlReagente Enzimatico (E) 1 x 1,5 ml (dopo ricostituzione)Tampone di Diluizione Enzimatico (EDB) 1 x 1,5 mlTRAY DEI REAGENTI PER IBRIDAZIONEReagente di Ibridazione (H) 1 x 6 ml (dopo ricostituzione)Tampone di Ibridazione (HB) 1 x 6 mlReagente di Selezione (S) 1 x 15 mlProvette di lisi (LT) 2 x 25 provetteFogli autoadesivi 1 pacchetto

B. Materiale necessario ma non fornito :Micropipette con capacità di erogazione 25 μl, 50 μl, 100 μl, 200 μl, 300 μl e 450 μlVortexAcqua sterile (filtrata o autoclavata)Provette di colturaBiglie di vetro sterili da 3 mmProvette per microcentrifuga con tappi a vitePorta-provette per provette di reazionePuntali per pipetta provvisti di filtro (1000 μl)Controlli Positivi di Amplificazione (ad es. M. tuberculosis, ATCC 25177 o ATCC 27294)Controlli Negativi di Amplificazione (ad es. M. gordonae, ATCC 14470 o M. terrae, ATCC 15755)Candeggina (soluzione di ipoclorito di sodio al 5,25 %)

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Fogli plastificati per la protezione dei banconiMicropipette a volume fisso Eppendorf

C. Materiale supplementare disponibile presso il vostro distributore Gen-Probe:Sonicatore GEN-PROBE (bioMérieux cod. 39409 / Gen-Probe Cat. N. 901104/T460)Incubatori GEN-PROBE (42°C ± 1°C, 60°C ± 1°C, 95°C ± 5°C)A (bioMérieux cod. 39405, 39406, 39407 /Gen-Probe Cat. N. 3396, 3397, 3398)Luminometro GEN-PROBE LEADER 50i (bioMérieux cod. 39400 / Gen-Probe Cat. N. 103100i/3100i)Kit di Reagenti di Rivelazione GEN-PROBE (bioMérieux cod. 39300 / Gen-Probe Cat. N. 201791/1791)Controlli dell'Amplificazione MTD GEN-PROBE (bioMérieux cod. 39223 / Gen-Probe Cat. N. 301043F/ 1043FPorta-provette per sonicatore GEN-PROBE (bioMérieux cod. 39313 / Gen-Probe Cat. N. 104027/4027)Porta-provette per provette di reazione (bioMérieux cod. 39311 / Gen-Probe Cat. N. 3994)Puntali lunghi provvisti di filtro per pipetta (1250 μl) (bioMérieux cod. 39315 / Gen-Probe Cat. N. 104316/ 4316)Provette in polipropilene da 12 x 75 mm (bioMérieux cod. 39308 / Gen-Probe Cat. N. 102440/2440)Tappi in polipropilene per provette da 12 x 75 mm (bioMérieux cod. 39320 / Gen-Probe Cat. N. 400713)

PROCEDIMENTOControlliI ceppi impiegati per il Controllo Positivo di Amplificazione devono appartenere al M. tuberculosis complex,come il ceppo non virulento H37Ra (ATCC 25177) od il ceppo virulento H37Rv (ATCC 27294). I ceppi impie-gati per il Controllo Negativo di Amplificazione devono appartenere ai MOTT, come il M. gordonae (ATCC14470) od il M. terrae (ATCC 15755). I controlli devono essere preparati prima di iniziare l'analisi dei campioni.I controlli devono contenere 25 - 150 CFU in 50 μl in modo da arrivare ad una concentrazione finale nel test di1 - 10 CFU. Questa concentrazione può essere verificata tramite coltura. Questi controlli saranno utilizzati perla preparazione dei Campioni di Controllo (Vedere Preparazione dei campioni).1. Preparazione dei controlli consigliata

a. Inserire da 3 - 5 biglie di vetro da 3 mm all’interno di una provetta per coltura pulita.b. Aggiungere 1 - 2 ml di acqua sterile. Prelevare diverse volte mediante un’ansa (1 μl) la coltura

appropriata. Richiudere la provetta e vortexarla più volte a velocità elevata.c. Lasciare riposare la sospensione per 15 minuti.d. Trasferire il supernatante in una provetta di coltura pulita. Regolare la torbidità ad 1 McFarland serven-

dosi di un nefelometro.e. Eseguire una diluizione 1:100 della sospensione mettendo 100 μl della sospensione 1 McFarland in 10

ml di acqua sterile. Chiudere e vortexare. Questa è la diluzione 1.f. Eseguire una seconda diluizione 1 : mettendo 100 μl della diluizione 1 in 10 ml di acqua sterile.

Chiudere e vortexare.Questa è la diluizione 2; dovrebbe contenere approssimativamente 25 - 150 CFUin 50 ml.

Suddivisione in aliquote e conservazione dei Controllia. Le diluizioni, suddivise in aliquote monouso (500 μl), vanno distribuite in provette da microcentrifuga contappo a vite e si conservano per 6 mesi se congelate a -20°C o per 1 anno se congelate a -70°C. Non utiliz-zare congelatori a sbrinamento automatico.Testare il controllo positivo per il M. tuberculosis raccomandato consente di evidenziare unicamente gli errori

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grossolani dei reagenti. Il controllo positivo è concepito per monitorare l'effetto interferente dell'eccesso diNaOH e di tampone fosfato sui reagenti utilizzati durante il procedimento. Variazioni del procedimento in ter-mine di tempo o di temperatura che possono alterare l'efficienza dell'amplificazione non possono essere rile-vate tramite il controllo raccomandato. Dei controlli addizionali possono essere testati in accordo con le linee-guida o con specifici requisiti.2. Controllo di inibizione dei campioni

Quando il test MTD risulta negativo, ma il medico propende per una diagnosi di tubercolosi, è possibile ver-ificare la presenza di eventuali inibitori agendo come segue:a. Dispensare 50 μl di Tampone di Diluizione del Campione in 2 provette di lisi.b. Dispensare 50 μl di Controllo Positivo di Amplificazione e 450 μl di campione nella I° provetta.

Dispensare 450 μl dello stesso campione nella II°provetta. Condurre il test seguendo il solito protocollo.

InterpretazioneSe la quantità di RLU (Relative Light Units) misurata dal luminometro nella I° provetta è > 30.000 RLU, ilcampione non contiene inibitori dell’amplificazione e non contiene apparentemente il bersaglio da amplifi-care. Se la quantità di RLU ottenuta nella I° provetta è < 30.000 RLU, il campione contiene un inibitore del-l’amplificazione e deve essere testato un altro campione. Se il test ripetuto nella II° provetta è positivo, ilrisultato del test MTD può essere dichiarato positivo. La spiegazione più plausibile per questo tipo di risulta-to è la variabilità legata al campione: il primo prelievo non conteneva alcun bersaglio da amplificare, con-trariamente al secondo. La quantità di RLU nella II° provetta può essere positiva o negativa a seconda cheil prelievo contenga o meno rRNA di micobatteri appartenenti al M. tuberculosis complex.

3. Controllo della contaminazione del laboratorioPer rivelare una eventuale contaminazione da amplicon di M. tuberculosis nel laboratorio, procedere nelmodo seguente:a. Dispensare 1 ml di acqua sterile in una provetta pulita. Inumidire un tampone sterile in poliestere o in

dacron con acqua sterile.b. Sfregare il tampone sul banco o sul materiale da testare.c. Inserire il tampone nella provetta e mescolare lentamente. Estrarre il tampone premendolo contro la

parete della provetta per strizzarlo accuratamente. Gettare il tampone in un recipiente contenente unasoluzione di candeggina diluita al 50% (metà candeggina, metà acqua).

d. Dispensare 25 μl della soluzione così ottenuta in una provetta di amplificazione contenente 50 μl diReagente di Amplificazione e 200 μl di olio per la reazione di amplificazione.

e. Per l’amplificazione e l’identificazione attenersi alle istruzioni del paragrafo “ PROCEDIMENTO ”.InterpretazioneSe i risultati sono > 30.000 RLU, la superficie testata è contaminata e deve essere decontaminata mediantetrattamento con candeggina; a questo scopo seguire le istruzioni del paragrafo “ PROCEDIMENTO :Preparazione del materiale ”. Nel caso in cui si sospetti una contaminazione del bagno-maria, procederecome sopra indicato utilizzando 25 μl di acqua del bagno-maria che non contenga alcun prodottoantisettico.

Preparazione del materiale1. Per il trasferimento ottimale dell'energia sonica, prima di ogni sonicazione l'acqua contenuta nel sonicatore

deve essere accuratamente sgassata eseguendo il procedimento seguente:a. Riempire il serbatoio del sonicatore con acqua corrente a temperatura ambiente fino ad 1 cm circa dal

bordo.b. Per sgassare completamente l’acqua, far funzionare il sonicatore per 15 minuti.

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2. Impostare un incubatore ad una temperatura di 95° ± 5°C, un incubatore o un bagno-maria a 60° ± 1°C e un incubatore o un bagno-maria a 42° ± 1°C.

3. Prima di iniziare l’analisi pulire le superfici di lavoro, il materiale e le pipette con una diluizione 1/2 di can-deggina. La candeggina deve agire almeno per 15 minuti. Risciacquare la superficie di lavoro con acquaper eliminare le tracce di candeggina. Coprire la superficie su cui verrà realizzato il test servendosi di unfoglio protettivo plastificato per banconi.

4. Preparare il luminometro GEN-PROBE LEADER. Assicurarsi che vi sia una quantità sufficiente di Reagentidi Rivelazione I e II per completare i test e che le provette siano correttamente inseriti. Consultare il man-uale d’uso del luminometro per le istruzioni relative alla sostituzione dei Reagenti di Rivelazione (venduti aparte).

Preparazione del reagenteRicostituire il Reagente di Amplificazione liofilizzato (A) nel suo flacone (50 test) utilizzando 3 ml di Tamponedi Amplificazione (AB). Omogeneizzare servendosi di un Vortex. Far riposare il reagente ricostituito a temper-atura ambiente fino a quando non assuma una colorazione chiara. Il Reagente di Amplificazione ricostituitopuò essere conservato per 2 mesi ad una temperatura compresa tra 2° e 25°C. La soluzione deve essereriportata a temperatura ambiente prima dell’uso.Preparazione dei campioni1. Contrassegnare un numero di provette di lisi (LT) sufficiente per testare i campioni ed 1 di ciascuno dei

Controlli Positivo e Negativo di Amplificazione o dei Controlli del Trattamento del Campione Positivo eNegativo. Togliere e conservare i tappi.

2. Pipettare 50 μl del Tampone di Diluizione dei Campioni (SDB) in tutte le provette di lisi (LT).Eseguire quanto indicato nei paragrafi A e B per i controlli e C per i campioni.A. Controlli del Trattamento dei Campioni:

Per ogni controllo aggiungere, in una provetta per l'analisi dei campioni, 1 ml della soluzioneNALC/NaOH e 3 ml del tampone fosfato utilizzati per il trattamento degli espettorati ad 1 ml di acquasterile.i. Mescolare con il vortex.ii. Trasferire 450 μl della soluzione NALC/NaOH/tampone fosfato e 50 μl della diluizione dei ceppi di

Controllo nella corrispondente provetta di lisi (LT) contrassegnata.B. Se vengono utilizzati i Controlli dell'Amplificazione, trasferire 450 μl del Controllo dell'Amplificazione dal

suo contenitore nella corrispondente provetta di lisi (LT) contrassegnata. C. Campione: Trasferire 450 μl del campione decontaminato ed accuratamente vortexato dal suo conteni-

tore alla corrispondente provetta di lisi (LT) contrassegnata.3. Dopo aver aggiunto tutti i campiono, tappare nuovamente le provette di lisi (LT).4. Vortexare per 3 secondi.Lisi dei campioni1. Inserire le provette di lisi nel porta-provette del sonicatore in modo che la miscela di reazione sul fondo

delle provette venga completamente sommersa, mantenendo i tappi fuori dall’acqua. Posizionare il porta-provette nel sonicatore. IN NESSUN CASO LE PROVETTE DEVONO TOCCARE IL FONDO O LEPARETI DEL SONICATORE.

2. Fare funzionare il sonicatore per 15 minuti, avendo cura di non superare i 20 minuti. I campioni ed i con-trolli trattati con ultrasuoni sono ora indicati " lisati ”. NON USARE ILVORTEX PER AGITARE I LISATI.

Amplificazione1. Contrassegnare le provette di polipropilene per l’amplificazione (12 x 75 mm) scrivendo sulla parte

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superiore delle stesse i numeri di identificazione (corrispondenti a quelli scritti sulle provette di lisi).Analogamente, contrassegnare le provette di amplificazione per i Controlli di Amplificazione Positivo eNegativo.

2. Erogare 50 μl di Reagente di Amplificazione ricostituito sul fondo di ogni provetta servendosi di unamicropipetta a volume fisso Eppendorf. Aggiungere 200 μl di olio per reazione di amplificazione (O) in ogniprovetta utilizzando una micropipetta ripetitiva.

3. NON USARE IL VORTEX PER I LISATI. Trasferire 25 μl di ogni lisato sul fondo della rispettiva provetta diamplificazione servendosi, per ogni lisato, di un nuovo puntale dotato di filtro. I lisati rimanenti possonoessere conservati ad una temperatura compresa tra 2° e 25°C per 7 giorni o, congelati ad una temperaturauguale o inferiore a -20°C, per 1 mese. Non utilizzare congelatori a sbrinamento automatico. Nel caso incui debbano essere effettuati altri test sui lisati, fare in modo che prima siano portati a temperaturaambiente. NON USARE IL VORTEX PER I LISATI.

4. Incubare le provette in un incubatore a 95° C per 15 minuti, senza superare però i 20 minuti.5. Preparare la Soluzione Enzimatica aggiungendo 1,5 ml di Tampone di Diluizione Enzimatica (EDB) al

Reagente Enzimatico liofilizzato (E). Non vortexare. Il Reagente Enzimatico ricostituito è stabile per unmese ad una temperatura di 2° - 8°C o per due mesi ad una temperatura uguale od inferiore a -20°C nelcaso in cui sia stato aliquotato e congelatoB il giorno della sua ricostituzione. Se il test verrà effettuato conaliquote di enzimi congelati, riportarle in primo luogo a temperatura ambiente; non scongelare le aliquoteincubandole a temperatura elevata. Per omogeneizzare le aliquote scongelate, aspirare e rilasciare lenta-mente la soluzione servendosi di una micropipetta a volume fisso prima di aggiungerla alle provette diamplificazione.

6. Trasferire le provette nell’incubatore o nel bagno-maria a 42° ± 1°C e lasciare che si raffreddino per 5minuti. EVITARE CHE LE PROVETTE RAGGIUNGANO LA TEMPERATURA AMBIENTE. NON COPRIREIL BAGNO-MARIA.

7. Quando le provette raggiungono i 42°C aggiungere in ognuna, con una micropipetta ripetitiva a siringa, 25μl di Reagente Enzimatico. Mescolare delicatamente. Incubare a 42°C per 30 minuti, senza oltrepassare i60 minuti. In questa fase di incubazione è necessario usare fogli autoadesivi o tappi. NON COPRIRE ILBAGNO-MARIA.

8. Dopo il periodo di incubazione della durata di 30 minuti, le provette possono essere conservate 2 ore aduna temperatura compresa tra 2° e 8° C o, congelate a -20°C, fino al giorno seguente. Nel caso in cuivengano conservate a -20°C fino all’indomani, le provette devono essere completamente scongelate a tem-peratura ambiente o al massimo a 60°C prima della fase di ibridazione e devono essere chiuse con i tappipiuttosto che con i fogli autoadesivi.

Ibridazione1. Ricostituire il Reagente di Ibridazione liofilizzato (H) con 6 ml di Tampone di Ibridazione (HB). Il Reagente

di Ibridazione (H) e il Tampone di Ibridazione (HB) devono essere portati a temperatura ambiente primadella ricostituzione. Se il Tampone di Ibridazione (HB) è stato refrigerato, riscaldarlo a 60°C e mescolarlolentamente per assicurare una perfetta solubilizzazione di tutti i componenti. Vortexare fino a che lasoluzione non diventa chiara (questa operazione può richiedere sino ad un minuto) per ottenere la comple-ta solubilizzazione di tutti gli elementi. Il Reagente di Ibridazione ricostituito può essere usato per un mesead una temperatura compresa tra 2° e 8°C o per due mesi ad una temperatura uguale od inferiore a -20°Cnel caso in cui sia stato aliquotato e congelatoC il giorno della sua ricostituzione. Se il Reagente diIbridazione ricostituito è stato refrigerato o congelato, riscaldarlo a 60°C e agitarlo lentamente al fine diottenere una perfetta solubilizzazione di tutti i componenti.

2. Dispensare 100 μl di Reagente di Ibridazione ricostituito in ogni provetta servendosi di una micropipettaripetitiva a siringa. Coprire le provette con fogli autoadesivi o con tappi. Vortexare 3 volte le provette avelocità media per almeno 1 secondoD. Per ottenere una buona omogeneizzazione delle provette direazione, tenerle in posizione verticale e lasciare che durante l'agitazione la miscela raggiunga la metàsuperiore della parete della provetta (evitare qualsiasi contatto della miscela di reazione con i fogli autoad-

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esivi o con i tappi per prevenire eventuali contaminazioni). Dopo la corretta esecuzione dell’omogeneiz-zazione, la miscela dovrà assumereuna colorazione gialla uniforme.

3. Incubare a 60°C per 15 minuti, senza superare però i 20 minuti, in un incubatore o in un bagno-maria.Selezione1. Prima di iniziare il test, il Reagente di Selezione (S) deve essere portato a temperatura ambiente. Estrarre

le provette dal bagno-maria o dall’incubatore a 60°C e aggiungere 300 μl di Reagente di Selezione (S) conuna micropipetta ripetitiva a siringa. Coprire le provette con fogli autoadesivi o con tappi. Vortexare 3 voltea velocita media e per almeno 1 secondoD. Per ottenere una buona omogeneizzazione delle provette direazione, tenerle in posizione verticale e lasciare che durante l'agitazione la miscela raggiunga la metàsuperiore della parete della provetta (evitare qualsiasi contatto della miscela di reazione con i fogli autoad-esivi o con i tappi per prevenire un’eventuale contaminazione). Dopo la corretta esecuzione dell’omo-geneizzazione, la miscela dovrà assumere una colorazione rosa uniforme.

2. Incubare a 60°C per 15 minuti, senza superare però i 16 minuti, in un incubatore o in un bagno-maria.3. Estrarre le provette dal bagno-maria o dall’incubatore. Lasciare le provette a temperatura ambiente almeno

per 5 minuti, senza oltrepassare il limite di un’ora. Rimuovere i fogli autoadesivi od i tappi proprio primadella lettura.

Lettura1. Programmare il protocollo giusto sul luminometro. Impostare una lettura a 2 secondi.2. Per eliminare tutti i residui dalla superficie delle provette, asciugarle con carta assorbente inumidita, priva

di lanugine, e inserirle successivamente nel luminometro, attenendosi alle istruzioni fornite nel manualed’uso. Le provette devono essere lette entro un’ora dalla fase di selezione.

3. Una volta conclusa l’analisi, estrarre le provette dal luminometro.4. Dopo la lettura delle provette, riempirle accuratamente con una soluzione di candeggina diluita al 1:10 (un

volume di candeggina + 9 volumi di acqua ), servendosi di una spruzzetta. Il contatto con la candegginadeve durare almeno un’ora; successivamente, eliminare le provette per prevenire ogni possibile contami-nazione da amplicon del laboratorio.

5. I porta-provette devono essere decontaminati immergendoli completamente in una soluzione di candeggi-na diluita 1:2 per almeno 15 minuti. Successivamente dovranno essere risciacquati con acqua e asciugatio esposti all’aria.

6. Decontaminare il laboratorio e il materiale con una soluzione di candeggina diluita al 1:2.Ripetizione del test1. Nel caso in cui occorra ripetere il test , riportare i lisati preparati a temperatura ambiente. NON USARE IL

VORTEX PER I LISATI.2. ATTENERSI AL PROCEDIMENTO iniziando dalla fase di amplificazione.OSSERVAZIONIA. Reagenti

1. Il Reagente Enzimatico non deve rimanere a temperatura ambiente per più di 15 minuti dopo laricostituzione.

2. Il Tampone di Ibridazione (HB) può precipitare. Riscaldare e agitare il tampone di Ibridazione (HB) o ilReagente di Ibridazione ricostituito a 60°C per sciogliere il precipitato.

B. Temperatura1. L’amplificazione, l’ibridazione e la selezione sono reazioni temperatura-dipendenti, di conseguenza è

assolutamente necessario mantenere il bagno-maria o l’incubatore alle temperature prestabilite.

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2. Prima di aggiungere il Reagente Enzimatico, lasciare raffreddare le provette per 5 minuti affinché rag-giungano i 42°C. Questa temperatura permette di ottenere performance ottimali di amplificazione.

3. Il rispetto della temperatura è fondamentale per la fase di amplificazione (42° ± 1°C).C. Tempi

È assolutamente necessario rispettare i tempi indicati nel paragrafo “ PROCEDIMENTO ”.D. Bagno-maria

1. Il livello dell’acqua nel bagno-maria deve essere tale da garantire che il fondo delle provette sia sempreimmerso, evitando comunque che l’acqua penetri nelle provette.

2. Durante la fase di amplificazione, il bagnomaria non deve essere coperto per evitare il rischio che lacondensa possa cadere sopra o all’interno delle provette.

E. Agitazione mediante VortexDurante le fasi di ibridazione e di selezione è assolutamente necessario avere a disposizione una miscelaomogenea, in particolare dopo l’aggiunta del Reagente di Ibridazione (H) ricostituito (la miscela si colorauniformemente di giallo) e del Reagente di Selezione (S) (la miscela si colora uniformemente di rosa).L’agitazione con il Vortex permette di ottenere una sospensione uniforme. Quando i reagenti vengonointrodotti in una provetta di reazione ed esposti ad una fonte di energia esterna, si crea una rapidarotazione della soluzione attorno all’asse della provetta. Il risultato è una sospensione uniforme. Per realiz-zare una corretta omogeneizzazione con il Vortex, le provette devono essere impugnate nella parte superi-ore e tenute in posizione verticale Durante l'agitazione i liquido deve raggiungere la metà superiore dellaprovetta Durante le fasi di ibridazione e di selezione questa agitazione deve esser e ripetuta per 3 voltevortexando per almeno 1 ogni volta.

INTERPRETAZIONE DEL TESTI risultati del test AMPLIFIED PER LA RICERCA DIRETTA DEI MICOBATTERI DEL MYCOBACTERIUMTUBERCULOSIS COMPLEX vengono interpretati nel modo seguente: un risultato è negativo per un segnale< 30.000 RLU, è positivo quando il segnale è > 500.000 RLU ed è dubbio per valori di RLUcompresi tra30.000 e 499.999 RLU. Quando il risultato iniziale dell'esame èdubbio, il test MTD deve essere ripetuto par-tendo dal lisato conservato. Il campione va considerato positivo se il risultato della ripetizione partendo dallisato è > 30.000 RLU.A. Controllo di Qualità e accettabilità dei risultati

I controlli devono dare i seguenti risultati :Controllo Negativo di Amplificazione < 20.000 RLUControllo Positivo di Amplificazione > 500.000 RLUControllo Negativo del Trattamento del Campione < 20.000 RLUControllo Positivo del Trattamento del Campione > 500.000 RLU

Nel caso in cui i valori dei controlli non corrispondano ai valori sopra indicati,i risultati deicampioni clinici non sono validi e non possono essere refertati Vedere il paragrafo“ SOLUZIONE DI EVENTUALI PROBLEMI ” per maggiori informazioni.

Ogni laboratorio deve stabilire valori soglia per i controlli in base ai risultati ottenuti per ogni serie di control-li.

B. Risultati del test per i campioni cliniciSe i valori dei controlli non corrispondono ai valori previsti,i risultati dei campioni clinici non sono validi enon possono essere refertati.

> 500.000 RLU positivo per l’rRNA dei micobatteri del M. tuberculosis complex

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< 30.000 RLU negativo per l’rRNA dei micobatteri del M. tuberculosis complexREFERTAZIONE DEI RISULTATINel caso in cui il risultato del test MTD sia > 500.000 RLU,refertare i risultati nel modo seguente :

Se il risultato del test MTD è < 30.000 RLU, refertare i risultati nel modo seguente:

LIMITI DEL TESTQuesto test è destinato esclusivamente la ricerca dei micobatteri del M. tuberculosis complex a partire dacampioni preparati secondo le procedure NALC-NaOH o NaOH raccomandate dal CDC7. Questo test puòessere impiegato soltanto con campioni preparati a partire da escreati (indotti od espettorati), prelievibronchiali (lavaggi bronco-alveolari o broncoaspirati) ovvero aspirati tracheali.Il test MTD è specifico per i micobatteri del M. tuberculosis complex, vale a dire M. tuberculosis, M. bovis, M.bovis BCG, M. africanum, M. microti e M. canetti ma non consente di differenziare queste specie fra loro.M.celatum e M. terrae-like possono provocare reazioni crociate se presenti in concentrazioni superiori a 30CFU per test. Tuttavia, M. celatum e M. terrae-like vengono raramente isolati a livello clinico.

La qualità dei risultati del test è correlata alla qualità del prelievo e del suo trasporto, alla variabilità del prelie-vo dei campioni, agli errori tecnici del laboratorio, agli errori di identificazione dei campioni e agli errori ditrascrizione dei risultati. Un test negativo non esclude la presenza nel campione di un micobatterio del M.tuberculosis complex.

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Refertazione : Non rilevato rRNAdel Mycobacterium tuberculosis complex.Esame microscopico (positivo o negativo).

Informazioni aggiuntive : Non è stato rilevato rRNA di micobatteri del Mycobacteriumtuberculosis complex.Coltura per la ricerca di BAAR incorso. Il campione non contiene apparente mente micobat-teri del M. tuberculosis complex, ma il risultato puo essereun falso negativo se la quantità di M. tuberculosis è basache il campione contenga o meno micobatteri non tuberco-lari - o se il campione contiene inibitori che interferisconosull'esame. Se c'è il sospetto di una tubercolosi in fase atti-va o si sospetta la presenza di inibitori, si raccomanda diripetere il test su un nuovo prelievo del paziente.

Refertazione : Rilevato rRNA del Mycobacterium tuberculosis complex.Esame microscopico (positivo o negativo).

Informazioni aggiuntive : Coltura per la ricerca di BAAR in corso. Il campione può contenere sia micobatteri non tubercolari (MOTT) che il M. tuberculosis oppure soltanto il M. tuberculosis.Questo test non può costituire l'unica base per diagnosticare la tubercolosi. Il valore predittivo positivo per un paziente, se l'esame microscopico è negativo, è più basso rispetto a quello di pazienti in cui sia risultato positivo. Questo è particolarmente importante nei test sulla popolazione quando la prevalenza della tubercolosi è bassa ed i valori predittivi positivi dei metodi diagnostici è di conseguenza ridotto.


VALORI ATTESIA. Gamma dei valori di controllo rilevati durante le prove cliniche

La gamma dei valori ottenuti per i controlli (RLU) durante le prove cliniche effettuate su 7 siti è stata laseguente:

B. Gamma dei valori ottenuti in campioni cliniciPer i 127 campioni MTD-positivi, i valori erano compresi fra 35.777 e > 2.000.000 RLU.Per i 577 campioni MTD-negativi, i valori erano compresi fra 573 e 19.176 RLU.La distribuzione frequenziale dei risultati in RLU per tutti questi campioni, dopo risoluzione delle discor-danze, è di seguito indicata : la risoluzione delle discordanze si basa sull’analisi di altri campioni, positivi allacoltura, provenienti da uno stesso paziente e/o sulla diagnosi finale del medico curante.

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Italiano


PERFORMANCEA. Valutazione clinica

Le performance del test MTD nella sua forma originale sono state valutate durante delle prove clinichecondotte in sei laboratori confrontando i risultati ottenuti mediante vetrino con i risultati della coltura su6.079 campioni provenienti da 2.609 pazienti. Di questi campioni, 4.000 provenivano da 1.898 pazienti chenon erano sottoposti ad un trattamento anti-tubercolare. I sei laboratori rappresentavano zone geografichediverse: cinque nosocomi di grandi città statunitensi che disponevano di un reparto specializzato per latubercolosi e un laboratorio pubblico.Le performance del test MTD nella sua forma attuale sono state valutate su sette laboratori, mettendo aconfronto i risultati del test MTD con i risultati della coltura. I sette laboratori che partecipavano al test rap-presentavano zone geografiche diverse: sei presidi ospedalieri di grandi città statunitensi che disponevanodi un reparto specializzato per la tubercolosi e un laboratorio pubblico nazionale di micobatteriologia. Icampioni saggiati provenivano da pazienti che non erano sottoposti a trattamento anti-tubercolare. 132hanno evidenziato risultati positivi in coltura per i micobatteri dell’M. tuberculosis complex. Il test MTD haidentificato 119 di questi campioni di coltura positivi ; 7 campioni contenevano micobatteri non tubercolarioltre a M. tuberculosis.

I pazienti con sospetta tubercolosi polmonare attiva e non sottoposti a trattamento sono stati inclusi inquesto studio. La prevalenza totale dei pazienti che hanno evidenziato una coltura positiva al M. tuberculo-sis era del 20,5%.Sono state determinate, per ogni paziente, una sensibilità media del 93,3% e una specificità media del99,1% rispetto alla coltura. Per ogni campione sono state rilevate una sensibilità media del 90,6% e unaspecificità media del 99,6% rispetto alla coltura. La tabella sottoindicata mostra la sensibilità, la specificità,il valore predittivo positivo (VPP) e il valore predittivo negativo (VPN) con intervalli di confidenza del 95%per le stime di performance. Tutti i dati riportati sono quelli ottenuti dopo risoluzione delle discordanzebasata sull’analisi di altri campioni, positivi e negativi in coltura, provenienti dallo stesso paziente e/o sulladiagnosi finale del medico curante.

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Sui 564 campioni negativi sia alla cultura che con l’MTD per i micobatteri del M. tuberculosis complex, 114campioni erano risultati positivi per i MOTT alla coltura, 64 provenivano da pazienti per i quali in altricampioni erano stati isolati con la coltura dei MOTT e 169 provenivano da pazienti in cui con l'esamecolturale non era stato isolato alcun micobatterio.

B. PrecisioneSono stati testati, in tre laboratori, pannelli di campioni composti da 2 campioni negativi, 2 campioniscarsamente positivi (ª 100 CFU/ test) e 2 campioni moderatamente positivi (= 1000 CFU/ test). I campionipositivi sono stati preparati aggiungendo quantità note di M. tuberculosis a un pool di campioni moderata-mente inibitori. I campioni, così come i controlli di amplificazione positivo e negativo, sono stati testati suitre laboratori, in triplo cieco, due volte al giorno per 3 giorni.La variabilità dei risultati non è risultata significativa tra un laboratorio e l’altro o da un giorno all’altro equindi i risultati dei tre laboratori hanno potuto essere consolidati e presentati come di seguito indicato. Ivalori misurati in RLU sono limitati dalla risoluzione del fotomoltiplicatore del luminometro. Per questaragione i valori superiori a 2.000.000 RLU vengono riportati a 2.000.000 RLU. Non vengono indicati né ledeviazioni standard, né i coefficienti di variazione.

C. RiproducibilitàLo studio di riproducibilità è stato effettuato saggiando 25 campioni, con controlli di amplificazione negativiintercalati fra ogni campione, per formare un totale di 50 campioni. Il panello di riproducibilità è stato testa-to in quattro laboratori.In totale, il 100% (120/120) dei campioni negativi e il 98,8% (79/80) dei campioni positivi hanno dato i risul-tati attesi.

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D. Specificità analiticaLa specificità del test MTD è stata valutata utilizzando batteri, funghi e virus. Nel caso dei batteri e deifunghi, i test di specificità hanno riguardato 160 ceppi (151 specie provenienti da 62 generi) di micobatterimolto vicini al M. tuberculosis, altri microrganismi responsabili di patologie respiratorie e un pannello filoge-netico di microrganismi della flora commensale dell’apparato respiratorio. I ceppi tipo erano colture ATCC(American Type Culture Collection) e 5 ceppi erano stati forniti da laboratori di analisi. I lisati, preparati apartire da colture in fase attiva di crescita (o, in tre casi, da rRNA) sono stati analizzati seguendo il proto-collo del test MTD, a circa 5 x 107 CFU per test. Soltanto i ceppi del M. tuberculosis complex hanno fornitorisultati positivi, con l'eccezione dei ceppi di M. celatum e M. terrae-like.A concentrazioni superiori a 30 CFU per test, i ceppi di M. celatum e alcuni ceppi di M. terrae-like hannodato risultati positivi (26.772 RLU per M. celatum e tra 19.470 e 49.976 RLU per M. terrae-like).

E. Limite di identificazioneTrenta ceppi di M. tuberculosis provenienti da regioni geografiche molto diverse, compresi quelli rappre-sentanti di ceppi resistenti e di ceppi sensibili agli antibiotici, sono stati identificati dal test MTD. Il test MTDha potuto identificare fino a 1 CFU per test di ognuno dei 30 ceppi.

F. Test di sovraccaricoÈ stato testato l’rRNA di Mycobacterium tuberculosis ad una concentrazione di 25 fg (equivalente a 5 CFUper test) in presenza di circa 540.000 CFU per test (450 μl) dei seguenti organismi non bersaglio:Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa,Mycobacterium gordonae, M. avium, M. kansasii, M. terrae, Nocardia asteroides, N. otitidis-caviarum,Corynebacterium pseudotuberculosis, C. diphtheriae, Gordona sputi e Rhodococcus bronchialis. Tutti irisultati sono stati positivi per l’rRNA del M. tuberculosis in presenza di questi organismi non bersaglio chenon hanno quindi originato alcun tipo di interferenza.

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RISOLUZIONE DI EVENTUALI PROBLEMI

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OSSERVAZIONEValori elevati per il ControlloNegativo di Amplificazione o per ilControllo del Trattamento delCampione Negativo(> 20.000 RLU)

Valori bassi per il ControlloNegativo di Amplificazione o per ilControllo del Trattamento delCampione Negativo(< 500.000 RLU)

POSSIBILI CAUSEOmogeneizzazione insuffi-

ciente dopo aggiunta delReagente di Selezione (S) oinsufficiente volume delReagente di Selezione.

Amplificazione di contami-nanti introdotti per mancanza diprecauzioni durante lapreparazione delle reazioni.

Omissione della fase di raf-fredda-mento di 5 minuti.

Contaminazione del laborato-rio o dei reagenti.

Omissione dell’asciugaturadelle provette prima della let-tura con il luminometro.

Mancato rispetto delle tem-perature raccomandate durantela fase di amplificazione.

Aggiunta del Reagente diAmplifi-cazione dispensando ilreattivo sulle pareti dellaprovetta e non diretta-mente sulfondo della stessa.

Omogeneizzazione insuffi-ciente dopo aggiunta delReagente di Ibridazione ricosti-tuito.

Volume eccessivo delReagente di Selezione.

Inosservanza del tempoprestabilito per la fase diSelezione.

La temperatura delle provetteè scesa sotto i 42°C dopo l’in-cubazione a 95°C.

I tubi che portano il Reagentedi Rivelazione sono otturati.

AZIONI CONSIGLIATERipetere l’omogeneizzazione inmaniera corretta. Rispettare scrupo-lo-samente i volumi indicati.Verificare che dopo aver agitato conil vortex la soluzione assuma un col-ore rosa uniforme.

La distribuzione dei reagenti con lepipette deve essere eseguita con lamassima accuratezza. Le provettedevono essere decontaminate conuna soluzione di candeggina diluita1:10, come indicato nel paragrafo «PROCEDIMENTO ». I banchi, gli incubatori, i bagno-mariae le pipette devono essere deconta-minati con una soluzione di candeg-gina diluita 1:2, come indicato nelparagrafo « PROCEDIMENTO »..

Le provette devono essere asciu-gate con carta assorbente inumidita,priva di lanugine, prima della letturacon il luminometro.Verificare la temperatura del bagno-maria e/o dell’incubatore e regolarla,se necessario, per rispettare letempe-rature raccomandate.

Vortexare con cura, come specifica-to (vedere il punto 2 del paragrafoIbridazione). Verificare che dopoaver agitato con il vortex lasoluzione assuma un colore giallouniforme.Verificare la regolazione del volumedella pipetta.Aver cura che, durante la fase diSelezione, l’incubazione a 60°C duri15 minuti.Trasportare direttamente le provettedall’incubatore a 95°C al bagno-maria / incubatore a 42°C.Lavare i tubi con acqua calda comeindicato nel Manuale d’Uso dellostrumento.

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NOTEA Gli incubatori devono avere alloggiamenti adeguati per le provette da 12 x 75 mm. Si raccomanda

l’impiego degli incubatori GEN-PROBE.B Per la conservazione ed il congelamento in aliquote sono raccomandate le provette per microcentrifuga con

tappo a vite. Le aliquote congelate possono subire un unico ciclo di congelamento/scongelamento.Non utilizzare congelatori con sbrinamento automatico.

c Per lo stoccaggio delle aliquote congelate, si raccomanda di impiegare flaconi per la refrigerazione da 5 ml.Le aliquote congelate possono essere scongelate soltanto una volta. Non utilizzare congelatori a sbrina-mento automatico.

D Dato che vi sono differenze tra i diversi Vortex e che possono essere impostate velocità diverse, può esserenecessario allungare il tempo di agitazione. Impostare la velocità dell’apparecchio seguendo le istruzioni del“ PROCEDIMENTO, paragrafo E ” per far sì che la miscela di reazione raggiunga la parte superiore dellaparete della provetta. La precisione dei risultati dipende in gran parte da un’omogeneizzazione ottimale. Itempi di agitazione possono arrivare a 15 secondi senza compromettere i risultati.

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TESTE AMPLIFIED PARA A DETECÇÃO DIRECTA DAS MICOBACTÉRIAS DO COMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Embalagem de 50 testes(bioMérieux ref. 39006/Gen-Probe Cat. No. 301001/1001F)

UTILIZAÇÃOO teste AMPLIFIED PARA A DETECÇÃO DIRECTA DAS MICOBACTÉRIAS DO COMPLEXO MYCOBAC-TERIUM TUBERCULOSIS (MTD) é um teste que utiliza uma sonda de ácido nucleico dirigida contra um alvoamplificado, permitindo a detecção in vitro dos ácidos nucleicos das micobactérias do complexoMycobacterium tuberculosis. Este teste efectua-se a partir de amostras provenientes de expectorações(induzidas ou expectoradas), de colheitas/coletas brônquicas (lavagens bronco-alveolares ou aspiraçõesbrônquicas) ou de aspirações traqueais.ADVERTÊNCIAA eficácia deste teste não foi demonstrada para a detecção directa de ARNr de M. tuberculosis a partir deoutras amostras clínicas (sangue, urina ou fezes, por exemplo). O comportamento funcional do teste MTD foiestudada apenas para as amostras tratadas com a técnica descrita e conservadas respeitando o tempo etemperaturas especificadas nesta ficha técnica.As amostras que derem resultados positivos devem ser colocadas em cultura para determinar a presençaeventual de micobactérias atípicas juntamente com as do complexo M. tuberculosis permitindo efectuar testesde sensibilidade aos agentes anti-micobacterianos. Devem ser efectuadas culturas para a detecção de baci-los ácido-álcool-resistentes (BAAR) para precisar que tipo de sub-espécie do complexo M. tuberculosis estápresente (M. bovis, por exemplo).No decurso de ensaios clínicos, foram submetidas ao teste amostras provenientes de crianças, de pacientesVIH-positivos e de pacientes infectados com micobactérias atípicas. No entanto, o número destes ensaiosnão permitiu comparar estatisticamente o comportamento funcional do teste para estes diferentes grupos.O comportamento funcional do teste em amostras provenientes de pacientes sob tratamento anti-tuberculose,no intuito de efectuar um seguimento terapêutico ou de confirmar uma cura, não foi avaliada.As amostras com muito sangue não devem ser analisadas com o dispositivo MTD.PRECAUÇÕES DE UTILIZAÇÃOA. Somente para uso em diagnóstico in vitro.B. O teste MTD é específico para as micobactérias do complexo M. tuberculosis, ou seja, M. tuberculosis, M.

bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, e M.canetti (13), mas não as diferencia. M. celatum e M.tipo-terrae podem provocar reacções cruzadas se estiverem presentes concentrações superiores a 30UFC (Unidades Formadoras de Colónias) por teste. No entanto, M. celatum e M. tipo-terrae são raramenteisoladas em clínica.

C. Um resultado negativo não exclui a presença de uma micobactéria do complexo M. tuberculosis naamostra. A qualidade dos resultados está ligada à qualidade da colheita e do seu transporte, à variabili-

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Português


dade das colheitas/coleta , aos erros técnicos do laboratório, aos erros de identificação das amostras eaos erros de transcrição dos resultados.

D. O teste destina-se apenas à detecção das micobactérias do complexo M. tuberculosis, a partir deamostras preparadas segundo os métodos NALC-NaOH ou NaOH que são recomendados pelos Centersfor Disease Control (CDC)7. Este teste deve ser utilizado unicamente para amostras concentradas,preparadas a partir de expectorações (induzidas ou expectoradas), de aspirações traqueais ou de col-heitas/coleta brônquicas (lavagens bronco-alveolares ou aspirações brônquicas). Quando proceder à sus-pensão da amostra na solução de tampão fosfato, verificar se a concentração de fosfato é de 67 mM7.

E. Evitar qualquer contacto dos Reagentes de Detecção I e II (bioMérieux ref. 39300 / Gen-Probe Cat. No.201791/1791) com a pele, olhos ou mucosas. Caso haja contacto, lavar com água. Se estes reagentesforem entornados, diluí-los com água antes de limpar.

F. Ter as precauções habituais na realização deste teste4. A preparação das amostras fluidificadas e descon-taminadas, bem como as etapas do teste MTD, devem ser efectuadas respeitando as regras de segu-rança microbiológica do nível 2 5.

G. Utilizar unicamente o material fornecido ou material de laboratório de utilização única.H. As bancadas, pipetas e material devem ser descontaminados com uma solução de lixívia diluída a 1/2

(metade de lixívia, metade de água), como descrito no parágrafo « PROCEDIMENTO». Deixar a lixíviaactuar durante 15 minutos, depois lavar com água e enxugar para eliminar traços de lixívia.

I. Devem ser utilizadas “as pipetas da bancada de trabalho ou as pipetas da câmara de fluxo laminar”equipadas de pontas com filtro para efectuar este teste. Devem utilizar-se pontas extra-longas para trans-ferir o lisado dos tubos de lise para os tubos de amplificação. Mudar de ponta em cada etapa. Evitar pas-sar por cima dos outros tubos do suporte. As pontas usadas devem ser imediatamente deitadas numrecipiente destinado aos detritos biológicos.

J. Quando utilizar uma pipeta de repetição para a distribuição dos reagentes, depois da introdução do lisadonos tubos, evitar tocar no tubo com a ponta da pipeta para reduzir os riscos de contaminação entre tubos.Os reagentes devem ser distribuídos contra a parede do tubo para evitar projecções. O cuidado na dis-tribuição dos reagentes permitirá reduzir os riscos de contaminação cruzada.

K. Não utilizar as mesmas pipetas para as etapas anteriores e posteriores à amplificação.L. Depois da leitura dos resultados no luminómetro, descontaminar os tubos e eliminá-los como descrito nos

parágrafos «PROCEDIMENTO» e «NOTAS» para evitar a contaminação do laboratório com amplicons.M. NUNCA usar novamente as folhas autocolantes e as tampas utilizadas durante uma etapa anterior. As

tampas devem ser eliminadas num recipiente apropriado, imediatamente após tê-las retirado, para evitarqualquer contaminação cruzada. As folhas autocolantes devem ser aplicadas firmemente no cimo dostubos reaccionais.

N. Não cobrir o banho-maria durante as incubações, especialmente se as tampas forem utilizadas (a conden-sação na tampa pode ser uma fonte de contaminação).

O. É necessário efectuar uma boa homogeneização em Vortex depois da adição do Reagentes de Selecçãopara obter resultados precisos.

P. É recomendado utilizar uma área separada para a etapa de Ensaio de Protecção de Hibridização (HPA /Hybridization Protection Assay) para minimizar a contaminação por amplicons no ensaio. Esta área deveestar separada da área onde é efectuada a preparação da amostra, a preparação do reagente e a amplifi-cação.

Q. Para evitar que as áreas do laboratório fiquem contaminadas por amplicons, o laboratório deve estar orga-nizado de uma forma uni-direccional de trabalho. Por exemplo, efectuar em primeiro lugar a preparação daamostra e do reagente numa área, em seguida a amplificação noutra, e por último o HPA noutra área. Asamostras, equipamento e reagentes não devem voltar para a área onde foi efectuada uma etapa anterior.Além disso, o pessoal de laboratório não deve voltar para uma área de trabalho anterior sem ter as devi-

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das precauções de anti-contaminação. É vivamente recomendado que a área de segurança biológicausada para o processamento da amostra não seja usada para efectuar o teste MTD.

INTRODUÇÃOO teste MTD utiliza os métodos TMA (Transcription-Mediated Amplification) e HPA (Hybridization ProtectionAssay)2 para detectar qualitativamente o ARN ribossómico (ARNr) das micobactérias do complexo M. tuber-culosis. O teste MTD detecta o ARN dos organismos cultiváveis e não cultiváveis. O complexo M. tuberculosisé constituído pelas sub-espécies M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti e M.canetti12,13. O teste MTD detecta todos os microrganismos do complexo M. tuberculosis. No entanto, M.microti infecta apenas os animais e M. bovis raramente se transmite dos animais para o homem. M.africanum é responsável pela tuberculose pulmonar na África Tropical12. M. tuberculosis é ,de longe, o maiscomum, sendo responsável por uma morbidez significativa no mundo inteiro. O CDC relatou, recentemente,um aumento dos casos de tuberculose nos pacientes atingidos com SIDA e nos imigrantes, e um aumento datransmissão da doença nas populações de alto risco6,9. Observa-se igualmente o aumento de número deestirpes/cepas resistentes, ou seja, multi-resistentes aos anti-tuberculostáticos11. As consequências são con-sideráveis no domínio da saúde pública.Os métodos de cultura convencionais permitem observar o crescimento de M. tuberculosis num prazo de 1 a8 semanas7,10. O teste MTD permite a detecção do ARNr das micobactérias do complexo M. tuberculosisem 2,5 a 3,5 horas. Mesmo não permitindo efectuar o antibiograma, o teste MTD detecta o M. tuberculosisfiável e rapidamente. Isto permite uma melhor utilização dos serviços de isolamento dos hospitais, começarrapidamente um tratamento apropriado e prevenir a propagação da doença graças à identificação precoce eao isolamento das pessoas contaminadas3.PRINCÍPIOO teste MTD é um teste em duas fases (amplificação e detecção) que se efectuam no mesmo tubo. Primeiro,a sonicação provoca a libertação dos ácidos nucleicos das micobactérias. O calor é utilizado para desnaturarestes ácidos nucleicos e romper a estrutura secundária do ARNr. O método de amplificação Gen-ProbeTranscription-Mediated Amplification (TMA) amplifica em seguida um alvo específico do ARNr micobacterianoatravés de um intermediário de ADN, a uma temperatura constante de 42°C. Produzem-se assim múltiplascópias de ARNr micobacteriano (amplicons).As sequências de amplicons de ARNr, específicas das micobactérias do complexo M. tuberculosis, são detec-tadas em seguida pelo método de hibridização entre ácidos nucleicos Hibridization Protection Assay (HPA),da Gen-Probe2. O Reagente de Hibridização do teste MTD contém uma sonda ADN monocatenária conjuga-da com um marcador quimioluminescente. Esta sonda é complementar das sequências de ARN específicasdas micobactérias do complexo M. tuberculosis. A sonda forma, com estas sequências específicas, híbridosestáveis ARN:ADN. Após a etapa de selecção, o sinal luminoso emitido pelas sondas hibridizadas é medidono luminómetro GEN-PROBE LEADER.REAGENTES (Embalagem de 50 testes)Os reagentes para o teste MTD são fornecidos como segue:Nome do reagente VolumeEMBALAGEM DE REAGENTES PARA AMPLIFICAÇÃOTampão de Diluição das Amostras (SDB)........................................................................................1 x 2,5 ml

Solução Tampão Tris contendo < 3 % de detergenteReagente de Amplificação (A) ............................................................................................................1 x 3 ml

Ácidos nucleicos liofilizados numa solução tampão Tris contendo 5 % (após reconstituição)de agente espessante

Tampão de amplificação (AB) ............................................................................................................1 x 3 mlSolução aquosa contendo conservantes

Reagente óleo de amplificação (óleo para reacção de amplificação) (O)........................................1 x 10 ml93

Português


Óleo de siliconeReagente Enzimático (E) ................................................................................................................ 1 x 1,5 ml

Transcriptase inversa e ARN polimerase liofilizadas numa solução (após reconstituição)tampão HEPEScontendo < 10 % de agente espessante e > 15 mM de N-Acetil-L-Cisteína

Tampão de Diluição Enzimática (tampão de diluição das enzimas) (EDB) ....................................1 x 1,5 mlSolução tampão Tris contendo um surfactante e glicerol

EMBALAGEM DE REAGENTES PARA A HIBRIDIZAÇÃOReagente de Hibridização (H) ............................................................................................................1 x 6 ml

< 100 ng/frasco de sonda ADN não infecciosa conjugada com um (após reconstituição)marcador quimioluminescente, liofilizado numa solução tampão succinato contendo um agente espessante e um detergenteTampão de Hibridização (HB) ............................................................................................................1 x 6 ml

Solução tampão succinato contendo < 4 % de detergenteReagente de Selecção (S)................................................................................................................1 x 15 ml

Solução tampão borato contendo um surfactanteTubos de Lise (LT) ......................................................................................................................2 x 25 tubos

Esferas de vidro, agente espessanteCONSERVAÇÃOA. As soluções ou os componentes não reconstituídos seguintes devem ser conservados a 2º - 8°C e são uti-

lizáveis até à data de validade indicada:Tampão de Diluição das Amostras (SDB)Reagente de Amplificação (A)Tampão de Amplificação (AB)Reagente Enzimático (E)Tampão de Diluição Enzimática (EDB)Reagente de Hibridização (H)

B. O Reagente de Amplificação reconstituído (A) é utilizável durante 2 meses e conserva-se a 2º - 8°C. OReagente de Hibridização (H) e o Reagente Enzimático (E) são utilizáveis um mês a 2º - 8°C após recon-stituição, ou dois meses a uma temperatura igual ou inferior a -20°C, se forem distribuídos em alíquotas econgelados no dia da reconstituição. As alíquotas congeladas devem ser utilizadas no próprio dia dadescongelação. Não utilizar congelador com descongelação automática.

C. Os componentes que se seguem devem ser conservados entre 2° e 25°C e são utilizáveis até à data devalidade indicada:Reagente óleo de amplificação (O)Tampão de Hibridização (HB)Reagente de Selecção (S)Tubos de Lise (LT)

COLHEITA/COLETA, CONSERVAÇÃO, TRANSPORTE E TRATAMENTO DAS AMOSTRASColheita/coleta e conservação da amostra:

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As amostras devem ser colocadas em recipientes de plástico estéreis e conservadas a 2º - 8°C antes do seutransporte e tratamento. No decurso dos ensaios clínicos, as amostras foram conservadas menos de 4 dias(geralmente, menos de 24 horas) antes do seu tratamento.Transporte:Transportar as amostras para o laboratório o mais rapidamente possível, em conformidade com as regula-mentações em vigor.Tratamento (descontaminação e concentração):As amostras com muito sangue não devem ser testadas com MTD. Este teste foi concebido para detectar oARNr das micobactérias do complexo M. tuberculosis utilizando amostras preparadas segundo os métodosde descontaminação NALC-NaOH ou NaOH utilizando 1% a 1,5% de NaOH durante 15 a 20 minutos e umacentrifugação com uma velocidade superior ou igual a 3 000 g 7.Conservação das amostras tratadas:As amostras podem ser conservadas, no máximo, durante 3 dias a 2º - 8°C antes do teste. Podem tambémconservar-se entre -20° e -70°C durante 6 meses ou mais. Não utilizar congeladores com descongelaçãoautomática.MATERIALA. Material fornecido

Composição da embalagem (bioMérieux ref. 39006 / Gen-Probe Cat. No. 301001/1001F) 50 testesEMBALAGEM DE REAGENTES PARA AMPLIFICAÇÃOTampão de Diluição das Amostras (SDB) 1 x 2,5 mlReagente de Amplificação (A) 1 x 3 ml (após reconstituição)Tampão de Reconstituição (AB) 1 x 3 mlReagente de óleo (óleo para reacção de amplificação) (O) 1 x 10 mlReagente Enzimático (E) 1 x 1,5 ml (após reconstituição)Tampão de Diluição Enzimática (EDB) 1 x 1,5 mlEMBALAGEM DE REAGENTES PARA HIBRIDIZAÇÃOReagente de Hibridização (H) 1 x 6 ml (após reconstituição)Tampão de Hibridização (HB) 1 x 6 mlReagente de Selecção (S) 1 x 15 mlTubos de Lise (LT) 2 x 25 tubosCartas de protecção (folhas autocolantes) 1 pacote

B. Material necessário não fornecido:Micropipetas capazes de distribuir 25 μl, 50μl, 100μl, 200μl, 300μl e 450μlVortexÁgua estéril (filtrada ou autoclavada)Tubos de culturaEsferas de vidro estéreis de 3 mmTubos para microcentrífuga com tampas de enroscarSuporte para tubos reaccionaisPontas de pipeta com filtro (1 000 μl)

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Português


Testemunhos Positivos de Amplificação (por ex. M. tuberculosis, ATCC 25177 ou ATCC 27294)Testemunhos Negativos de Amplificação (por ex. M. gordonae, ATCC 14470 ou M. terrae, ATCC 15755)Lixívia (solução de hipoclorito a 5,25%)Folhas de protecção plastificadas para bancadaPipetas de repetição

C. Material suplementar disponível no distribuidor Gen-Probe:Sonicador GEN-PROBE (bioMérieux ref. 39409 / Gen-Probe Cat. No. 901104/T460)Blocos de aquecimento GEN-PROBE (42°C ± 1°C, 60°C ± 1°C, 95°C ± 5°C)A (bioMérieux ref. 39405,39406, 39407 / Gen-Probe Cat. No. 3396, 3397, 3398)Luminómetro GEN-PROBE LEADER 50i (bioMérieux ref. 39400 / Gen-Probe Cat. No. 103100i/3100i)Embalagem de Reagente de Detecção GEN-PROBE (bioMérieux ref. 39300 / Gen-Probe Cat. No. 201791/1791)Controlos de Amplificação MTD GEN-PROBE (bioMérieux ref. 39223/Gen-Probe Cat. No. 301043F/1043F)Suporte de tubos para o sonicador GEN-PROBE (bioMérieux ref. 39313 / Gen-Probe Cat. No. 104027/4027)Suporte de tubos reaccionais (bioMérieux ref. 39311 / Gen-Probe Cat. No. 3994)Pontas de pipeta longas com filtro (1250 μl) (bioMérieux ref. 39315 / Gen-Probe Cat. No. 104316/4316)Tubos em polipropileno, 12 x 75 mm (bioMérieux ref. 39308 / Gen-Probe Cat. No. 102440/2440)Tampas em polipropileno para tubos de 12 x 75 mm (bioMérieux ref. 39320 / Gen-Probe Cat. No. 400713)

PROCEDIMENTOControlosAs células usadas para o Controlo de Amplificação Positivo devem fazer parte do complexo M. tuberculosis,tal como a H37Ra não-virulenta (ATCC 25177) ou a H37Rv virulenta (ATCC 27294). As células usadas para oControlo Negativo devem ser MOTT, tal como M. gordonae (ATCC 14470) ou M. terrae (ATCC 15755). Oscontrolos devem ser preparados antes de efectuar o teste da amostra.Os controlos devem conter 25 – 150 CFU por 50 μl para obter uma concentração final de 1 – 10 CFU poramostra. Esta concentração deve ser verificada em cultura. Estes controlos devem ser utilizados napreparação dos Controlos de Processamento da Amostra (consultar a Preparação da Amostra).1. Preparação recomendada para os Controlos

a. Colocar 3 a 5 esferas de vidro de 3 mm num tubo de cultura limpo.b. Adicionar 1 a 2 ml de água estéril. Adicionar o conteúdo de várias ansas (1 μl) de cultura apropriada.

Fechar o tubo e agitar várias vezes a uma grande velocidade, utilizando um Vortex.c. Deixar repousar durante 15 minutos.d. Transferir o sobrenadante para um tubo de cultura limpo. Ajustar a turbidez a 1 McFarland utilizando

um nefelómetro.e. Diluir a 1/100 a suspensão, colocando 100 μl da suspensão a 1 McFarland em 10 ml de água estéril.

Fechar e agitar em vortex. Esta é a primeira diluição.f. Diluir uma segunda vez a 1/100, colocando 100 μl da diluição 1 em 10 ml de água estéril. Fechar e

agitar em vortex. Esta é a segunda diluição. Esta diluição deve conter aproximadamente 25 – 150 CFUpor 50 μl.

Aliquotar e Conservar os Controlos

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a. As diluições devem ser distribuídas em alíquotas (500 μl), em micro-tubos de centrífuga de 1,5 mllimpos, com tampas de rosca. As alíquotas destinam-se a uma única utilização e podem ser conser-vadas a –20 º C durante 6 meses ou a – 70º C durante 1 ano. Não utilizar congelador com desconge-lação automática.

A utilização do controlo positivo para M. tuberculosis servirá para monitorizar apenas a falha substancial doreagente. O controlo positivo foi concebido para verificar se houve excesso de NaOH e de tampão fosfato nosreagentes utilizados durante o procedimento. As variações dos procedimentos no tempo ou nas temperaturasque podem afectar a eficiência da amplificação ou a exactidão do tempo seleccionado podem não ser detec-tadas utilizando os controlos recomendados. Os controlos adicionais podem ser testados em conformidadecom as directivas ou recomendações especiais.2. Controlo de inibição das amostras

Quando o teste MTD for negativo mas o diagnóstico do médico for favorável a uma tuberculose, é possív-el verificar se a amostra contém um inibidor, procedendo da forma seguinte:a. Colocar 50 μl de Tampão de Diluição das amostras em 2 tubos de lise das micobactérias (identificado

com testemunho e sem testemunho).b. Introduzir 50 μl de Testemunho Positivo de Amplificação e 450 μl de amostra num tubo (com teste-

munho). Adicionar 450 μl de amostra num segundo tubo (sem testemunho). Efectuar o teste seguindoo protocolo habitual.

InterpretaçãoSe o número RLU (Relative Light Units) obtido no luminómetro com o tubo com testemunho for > 30.000 RLU, a amostra não contém inibidor de amplificação e, aparentemente, não contém alvo a ampli-ficar. Se o número de RLU obtido com o tubo com testemunho for < 30.000 RLU, a amostra contém uminibidor de amplificação e uma outra amostra deve ser analisada. Se o teste repetido do tubo sem teste-munho for positivo, o resultado do teste MTD pode considerar-se positivo. A explicação mais plausívelpara este tipo de resultado, é a variabilidade ligada à amostragem: a primeira amostra não continha alvo aamplificar, enquanto a segunda o continha. O número de RLU do tubo em testemunho pode ser positivoou negativo dependendo da amostra conter ou não ARNr de micobactéria pertencente ao complexo M.tuberculosis.

2. Controlo da contaminação do laboratórioPara controlar se o laboratório foi contaminado pelos amplicons de M. tuberculosis, proceder como segue:a. Colocar 1 ml de água estéril num tubo limpo. Humidificar uma zaragatoa/swab estéril de poliester ou

dacron com água estéril.b. Esfregar a zaragatoa/swab na bancada ou no material a controlar.c. Colocar a zaragatoa/swab no tubo e misturar suavemente. Retirar a zaragatoa/swab , espremendo-a

na parede do tubo. Eliminar a zaragatoa/swab num recipiente contendo uma solução de lixívia diluídaa 1/2 (metade de lixívia, metade de água).

d. Distribuir 25 μl da solução obtida num tubo de amplificação contendo 50 μl de Reagente deAmplificação e 200 μl de óleo para reacção de amplificação.

e. Seguir as instruções do parágrafo «PROCEDIMENTO» para a amplificação e a detecção.InterpretaçãoSe os resultados forem > 30.000 RLU, a superfície analisada está contaminada e deve ser descontamina-da com lixívia seguindo as instruções do parágrafo «PROCEDIMENTO: Preparação do material». Se sesuspeitar de uma contaminação do banho-maria, proceder do mesmo modo que o acima descrito com25 μl de água do banho-maria, na condição de esta não conter nenhum produto anti-séptico.

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Português


Preparação do material1. a. Encher o reservatório do sonicador com água da torneira à temperatura ambiente até cerca de

1 cm do bordo.b. A água deverá ser desgaseificada para optimizar a transferência de energia dos ultra-sons. Para desga-seificar inteiramente a água, colocar o sonicador em funcionamento durante 15 minutos antes do iníciodos testes.

2. Regular um bloco de aquecimento a 95° ± 5°C, um outro bloco de aquecimento ou um banho-maria a 60°± 1°C e ainda outro bloco de aquecimento ou um banho-maria a 42° ± 1°C.

3. Limpar as superfícies de trabalho, material e pipetas com uma diluição 1:2 de lixívia antes de começar aanálise. Deixar a lixívia actuar durante, pelo menos, 15 minutos. Lavar com água a superfície de trabalhopara eliminar os traços de lixívia. Cobrir a superfície na qual o teste será efectuado com uma folha de pro-tecção plastificada para bancada.

4. Preparar o luminómetro GEN-PROBE LEADER. Certificar-se de que há uma quantidade suficiente deReagentes de Detecção I e II para efectuar os testes e que os tubos são correctamente injectados com osreagentes de detecção. Consultar o Manual de Utilização do luminómetro para as instruções de intro-dução dos Reagentes de Detecção (estes reagentes são vendidos separadamente).

Preparação do reagenteReconstituir o Reagente de Amplificação liofilizado (A) no seu frasco (50 testes) com 3 ml de Tampão deAmplificação (AB). Homogeneizar num Vortex. Deixar o reagente reconstituído repousar à temperatura ambi-ente até ficar claro. O Reagente de Amplificação reconstituído pode conservar-se durante 2 meses a 2º - 8°C.A solução deve ser colocada à temperatura ambiente antes da utilização.Preparação das amostras1. Identificar um número suficiente de Tubos de Lise de Micobactérias (LT) para analisar as amostras, os

controlos de amplificação positiva e negativa e os testemunhos de amplificação positivo e negativo.Retirar e conservar as tampas.

2. Distribuir 50 μl do Tampão de Diluição das Amostras de Micobactérias (SDB) em todos os tubos de lise deMicobactérias (LT):Proceder como infra descrito em A e B para os controlos e em C para as amostras.A. Procedimento para Testemunhos de amplificação

Para cada controlo, adicionar 1 ml de solução de NALC/NaOH e 3 ml do tampão fosfato utilizado paraefectuar o processamento da expectoração com 1 ml de água estéril no tubo de processamento daamostra.i. Homogeneizar em vortex.ii. Transferir 450 μl de solução de tampão fosfato/NALC/NaOH e 50 μl de diluição de Controlo de

Amplificação para o tubo correspondente de lise de micobactérias (LT) identificado.B. Se estiverem a ser usados Controlos de Amplificação, transferir 450 μl do recipiente do Controlo de

Amplificação para o correspondente tubo de lise de micobactérias (LT) identificado.C. Amostras: Transferir 450 μl de cada amostra descontaminada e homogeneizada do recipiente para o

correspondente tubo de lise de micobactérias identificado (LT).2. Fechar os tubos de lise de Micobactérias (LT) após a adição de cada amostra.3. Agitar durante 3 segundos em vortex.Lise das amostras1. Inserir os Tubos de Lise no suporte do sonicador de forma a que a mistura de reacção no fundo dos tubos

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fique imersa, mantendo as tampas fora de água. Colocar o suporte no local. OS TUBOS NÃO DEVEM,EM CASO ALGUM, TOCAR NO FUNDO OU NAS PAREDES DO SONICADOR.

2. Colocar o sonicador em funcionamento durante 15 minutos, mas nunca mais de 20 minutos. As amostrase testemunhos assim tratados com ultra-sons designam-se por «lisados». NÃO UTILIZAR O Vortex PARAAGITAR OS LISADOS.

Amplificação1. Identificar os tubos de polipropileno para amplificação (12 x 75 mm) escrevendo no topo os números cor-

respondentes aos números de identificação dos Tubos de Lise. Identificar igualmente os tubos de amplifi-cação para os testemunhos de amplificação positivo e negativo.

2. Introduzir 50 μl de Reagente de Amplificação reconstituído no fundo de cada tubo utilizando uma pipetarepetitiva. Adicionar 200 μl de óleo para reacção de amplificação (O) em cada tubo utilizando uma pipetade repetição.

3. NÃO UTILIZAR O VORTEX PARA OS LISADOS. Transferir 25 μl de cada lisado para o fundo do tubo deamplificação correspondente, utilizando uma nova ponta com filtro para cada transferência. Os lisados quesobrarem podem ser conservados a 2º - 8°C durante 7 dias, ou congelados a uma temperatura igual ouinferior a -20°C durante 1 mês. Não utilizar congelador com descongelação automática. Se for necessárioefectuar outros testes com os lisados, deixá-los atingir previamente a temperatura ambiente. NÃO UTI-LIZAR O VORTEX PARA OS LISADOS.

4. Incubar os tubos num bloco de aquecimento a 95°C durante 15 minutos, mas não mais de 20 minutos.5. Preparar a Solução Enzimática adicionando 1,5 ml de Tampão de Diluição Enzimática (EDB) ao Reagente

Enzimático liofilizado (E). Rodar para misturar. Não agitar num Vortex. O Reagente Enzimático reconstituí-do é utilizável durante um mês a 2º - 8°C ou durante dois meses a uma temperatura igual ou inferior a -20°C, se for distribuído em alíquotas e congeladoB no dia da reconstituição. Se o teste for efectuado comalíquotas de enzimas congeladas, colocá-las previamente à temperatura ambiente; não descongelar asalíquotas colocando-as a uma alta temperatura. Para homogeneizar as alíquotas descongeladas, aspirar erejeitar a solução utilizando uma pipeta de repetição antes de adicioná-la aos tubos de amplificação.

6. Transferir os tubos para um bloco de aquecimento ou banho-maria a 42° ± 1°C e deixá-los arrefecerdurante 5 minutos. NÃO DEIXAR OS TUBOS ATINGIREM A TEMPERATURA AMBIENTE. NÃO COBRIRO BANHO-MARIA.

7. Quando os tubos estiverem a 42°C, adicionar 25 μl de Reagente Enzimático em cada tubo utilizando umapipeta de repetição. Sacudir para misturar. Incubar a 42°C durante 30 minutos, mas não mais de 60 minu-tos. É necessário utilizar folhas autocolantes ou tampas durante esta etapa de incubação. NÃO COBRIRO BANHO-MARIA.

8. Após o período de incubação de 30 minutos, os tubos cobertos podem ser conservados a 2° - 8°Cdurante 2 horas ou a -20°C até ao dia seguinte. Se forem conservados a -20°C até ao dia seguinte, ostubos devem ser totalmente descongelados à temperatura ambiente ou, no máximo, a 60°C antes daetapa de hibridização, e devem ser, de preferência, fechados com tampas e não com folhas autocolantes.

Hibridização1. Reconstituir o Reagente de Hibridização liofilizado (H) com 6 ml de Tampão de Hibridização (HB). O

Reagente de Hibridização (H) e o Tampão de Hibridização (HB) devem estar à temperatura ambienteantes da reconstituição. Se o Tampão de Hibridização (HB) foi guardado no frigorífico, aquecê-lo a 60°C,rodando-o lentamente para assegurar que todos os componentes se dissolvem. Agitar num Vortex atéque a solução fique clara (o que pode demorar cerca de um minuto) para assegurar que todos os compo-nentes estão dissolvidos. O Reagente de Hibridização reconstituído é utilizável durante um mês a 2° - 8°Cou durante dois meses a uma temperatura igual ou inferior a -20°C, se tiver sido distribuído em alíquotase congeladoC no dia da reconstituição. Se o Reagente de Hibridização reconstituído foi guardado no frig-orífico ou congelado, aquecê-lo a 60°C, rodando-o ligeiramente para assegurar que todos os compo-nentes se dissolvem.

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Português


2. Adicionar 100 μl de Reagente de Hibridização reconstituído em cada tubo com uma pipeta de repetição.Cobrir os tubos com folhas autocolantes ou com tampas. Agitar os tubos com um Vortex, a uma veloci-dade média, 3 vezes durante, pelos menos, 1 segundoD. Para uma boa homogeneização dos tubos dereacção, mantê-los na posição vertical e deixar a mistura atingir a metade superior da parede do tubodurante a agitação (para evitar qualquer contaminação não deixar a mistura entrar em contacto com asfolhas autocolantes ou com as tampas). Quando a homogeneização estiver correctamente efectuada, amistura deve ter uma cor amarela uniforme.

3. Incubar a 60°C durante 15 minutos, mas não mais de 20 minutos, num bloco de aquecimento ou embanho-maria.

Selecção1. O Reagente de Selecção (S) deve estar à temperatura ambiente antes de começar o teste. Retirar os

tubos do banho-maria ou do bloco de aquecimento a 60°C e adicionar 300 μl de Reagente de Selecção(S) com uma pipeta de repetição. Cobrir os tubos com folhas autocolantes ou com tampas. Agitar numVortex, a uma velocidade média, 3 vezes durante, pelo menos, 1 segundoD. Para uma boa homo-geneização dos tubos de reacção, mantê-los na posição vertical e deixar a mistura atingir a metade supe-rior da parede do tubo durante a agitação (para evitar qualquer contaminação não deixar a mistura entrarem contacto com as folhas autocolantes ou com as tampas). Quando a homogeneização estiver correcta-mente efectuada, a mistura deve ter uma cor rosa uniforme.

2. Incubar a 60°C durante 15 minutos, mas não mais de 16 minutos, num bloco de aquecimento ou numbanho-maria.

3. Retirar os tubos do banho-maria ou do bloco de aquecimento. Deixar os tubos atingirem a temperaturaambiente durante, pelo menos, 5 minutos, mas não mais de uma hora. Retirar as folhas autocolantes ouas tampas imediatamente antes da fase de detecção.

Detecção1. Programar o procedimento apropriado no luminómetro. Escolher uma leitura de 2 segundos.2. Para eliminar qualquer resíduo da superfície dos tubos, limpá-los com um papel absorvente húmido que

não se desfaça com a humidade, e depois introduzi-los no luminómetro seguindo as instruções do manualde utilização. Os tubos devem ser lidos na hora a seguir à etapa de selecção.

3. Quando a análise tiver terminado, retirar os tubos do luminómetro.4. Após a leitura dos tubos, enchê-los cuidadosamente com uma solução de lixívia diluída a 1/10 (um volume de

lixívia, 9 volumes de água, utilizando um esguicho. Deixar a lixívia actuar durante, pelo menos, uma horaantes de eliminar os tubos, para evitar a contaminação do laboratório com amplicons.

5. Os suportes de tubos devem ser descontaminados por imersão completa numa solução de lixívia diluída a1/2 durante, pelo menos, 15 minutos. Em seguida, devem-se lavar com água e enxugar, ou secar ao ar.

6. Descontaminar o laboratório e o material utilizando uma solução de lixívia diluída a 1/2.Repetição do teste1. Se tiver de repetir o teste, deixar os lisados atingir a temperatura ambiente. NÃO UTILIZAR O VORTEX

PARA OS LISADOS.2. Seguir o protocolo de «PROCEDIMENTO» começando pela etapa de amplificação.NOTASA. Reagentes

1. O Reagente Enzimático não deve permanecer à temperatura ambiente mais de 15 minutos após areconstituição.

2. O Tampão de Hibridização (HB) pode precipitar. Aquecer e agitar o Tampão de Hibridização (HB) ou oReagente de Hibridização reconstituído a 60°C para dissolver o precipitado.

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B. Temperatura1. A amplificação, a hibridização e a selecção são reacções termo-dependentes; consequentemente, é

imperativo manter o banho-maria ou o bloco de aquecimento às temperaturas preconizadas.2. Antes de adicionar o Reagente Enzimático, deixar arrefecer os tubos a 42°C durante 5 minutos. Esta

temperatura permite obter um comportamento funcional óptimo de amplificação.3. É fundamental respeitar a temperatura para a fase de amplificação (42° ± 1°C).

C. TempoÉ imperativo respeitar os tempos indicados no parágrafo «PROCEDIMENTO».

D. Banho-maria1. O nível de água no banho-maria deve manter-se de forma a que a mistura de reagentes no fundo dos

tubos esteja imersa, mas que a água não penetre nos tubos.2. Durante a fase de amplificação, o banho-maria não deve ser coberto para evitar que haja conden-

sação sobre ou dentro dos tubos.E. Agitação utilizando um Vortex

É importante dispor de uma mistura homogénea durante as etapas de hibridização e de selecção, espe-cialmente após a adição do Reagente de Hibridização (H) reconstituído (a mistura fica com uma coramarela uniforme) e do Reagente de Selecção (S) (a mistura fica com uma cor rosa uniforme).A agitação com Vortex permite obter uma suspensão uniforme. Quando os reagentes são colocados notubo de reacção e expostos a uma fonte de energia exterior, produz-se uma rotação rápida da solução àvolta do eixo do tubo. Daí resulta uma suspensão uniforme. Para que a homogeneização seja correcta-mente efectuada num Vortex, os tubos devem segurar-se na parte superior e manter-se na vertical. Olíquido deve então atingir a metade superior do tubo durante a agitação. Durante as etapas de hibridiza-ção e de selecção, esta agitação deve efectuar-se 3 vezes seguidas e durar, pelo menos, 1 segundo decada vez.

INTERPRETAÇÃO DO TESTEOs resultados do teste GEN-PROBE AMPLIFIED PARA A DETECÇÃO DIRECTA DAS MICOBACTÉRIAS DOCOMPLEXO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS (MTD) são interpretados considerando que um resultadonegativo inicial (< 30.000 RLU), um resultado positivo inicial (> 500.000 RLU), ou um resultado equívoco ini-cial (30,000 a 499,999 RLU). O teste MTD deve ser repetido a partir do lisado reservado quando um teste ini-cial é equívoco. Um resultado repetido do lisado > 30.000 é considerado positivo.A. Controlo de qualidade e validação de resultados

Os controlos devem dar os seguintes valores:Controlo negativo de amplificação < 20.000 RLUControlo positivo de amplificação > 500.000 RLUTestemunho negativo < 20.000 RLUTestemunho positivo > 1.000.000 RLUOs resultados dos testes dos pacientes não devem ser fornecidos se os valores do controlo de teste MTDnão estiverem dentro destes critérios. Consultar a tabela de RESOLUÇÃO DE INCIDENTES para infor-mações complementares.Cada laboratório deve determinar os valores alvo para cada controlo em função dos resultados obtidospara cada série de controlos.

B. Resultados de Testes de Pacientes

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Português


Se os valores dos controlos não estiverem dentro dos valores esperados, os resultados das amostras detestes de pacientes não devem ser validados.Resultados:

> 500.000 RLU positivo para o ARNr do complexo M. tuberculosis< 30.000 RLU negativo para o ARNr do complexo M. tuberculosis30.000 a 499.999 RLU provável rRNA positivo do complexo de M. tuberculosis; repetir para

verificar os resultados:Repetir > 30.000 RLU positivo para o complexo rRNA para M. tuberculosisRepetir < 30.000 RLU negativo para o complexo rRNA para M. tuberculosis

APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOSOs resultados do teste MTD devem ser interpretados em conjunto com outros dados clínicos e laboratoriais.Deve ser considerada a possibilidade de ser testada uma outra amostra consoante a suspeita clínica exis-tente.Se o resultado de teste MTD inicial for positivo > 500.000 RLU, ou se o resultado do teste MTD repetido forpositivo > 30.000 RLU, apresentar os resultados da forma seguinte:

Se o resultado de teste MTD ou a repetição deste for negativa < 30.000 RLU, apresentar os resultados daforma seguinte:

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Apresentar: Foi detectado o rRNA do complexo Mycobacterium tuber-culosis. Coloração AFB (positiva ou negativa)

Informação adicional: Cultura de AFB em crescimento. As amostras podem con-ter MOTT e M. tuberculosis ou apenas M. tuberculosis.Este teste não deve ser efectuado isoladamente para odiagnóstico M. tuberculosis. O valor positivo preditivo parauma amostra com coloração AFB negativa é mais baixoque para uma amostra com coloração AFB positiva. Tal éparticularmente importante ao testar amostras de popu-lações em que a prevalência de M. tuberculosis é baixa eos valores esperados com métodos de diagnóstico corre-spondentes são reduzidos.

Apresentar: Não foi detectado o rRNA do complexo de Mycobacteriumtuberculosis. Coloração AFB (positiva ou negativa)

Informação adicional: Não foi detectado o rRNA do complexo de Mycobacteriumtuberculosis Cultura de AFB em crescimento. As amostraspodem não conter M. tuberculosis, o resultado pode serfalso negativo devido a baixos números de M. tuberculosisna presença ou ausência de MOTT, ou o resultado podeser falso negativo devido a interferência de inibidores daamostra. É recomendado testar uma nova amostra dopaciente se, clinicamente, houver forte suspeita de tuber-culose ou se houver suspeita de inibição.es.


LIMITESEste teste destina-se apenas à detecção das micobactérias do complexo M. tuberculosis a partir de amostraspreparadas segundo os procedimentos NALC-NaOH ou NaOH recomendados pelo CDC7. Este teste só podeser efectuado com amostras preparadas a partir de expectorações (induzidas ou expectoradas), de col-heitas/coletas brônquicas (lavagens bronco-alveolares ou aspirações brônquicas) ou de aspirações traqueais.O teste MTD é específico das micobactérias do complexo M. tuberculosis, ou seja, M. tuberculosis, M. bovis,M. bovis BCG, M. africanum, M. microti e M. canetti, mas não as diferencia entre si. M. celatum e M. tipo-terrae podem provocar reacções cruzadas se estiverem presentes em concentrações superiores a 30 UFCpor teste. No entanto, M. celatum e M. tipo-terrae são raramente isoladas em clínica.A qualidade dos resultados do teste está ligada à qualidade da colheita/coleta e ao seu transporte, à variabili-dade das colheitas/coletas, aos erros técnicos do laboratório, aos erros de identificação das amostras e aoserros de transcrição dos resultados. Um teste negativo não exclui a presença de uma micobactéria do com-plexo M. tuberculosis na amostra.VALORES ESPERADOSA. Intervalo dos valores de controlo obtidos no decurso de ensaios clínicos

O intervalo dos valores obtidos para os controlos (RLU) no decurso dos ensaios clínicos efectuados em 7locais, foi:

B. Intervalo dos valores obtidos para amostras clínicas Para 127 amostras MTD-positivas, os valores estavam compreendidos entre 35.777 e > 2.000.000 RLU.Para 577 amostras MTD-negativas, os valores estavam compreendidos entre 573 e 19.176 RLU.A distribuição dos resultados em RLU para todas estas amostras, após resolução das discordâncias,encontra-se aqui abaixo: a resolução das discordâncias baseia-se na análise de outras amostras, positi-vas em cultura, provenientes do mesmo paciente e/ou com diagnóstico final do médico.

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Português


COMPORTAMENTO FUNCIONALA. Avaliação clínica

O comportamento funcional do teste MTD na sua forma original foram avaliadas no decurso de ensaiosclínicos efectuados em seis laboratórios, comparando os resultados obtidos por exame de esfregaços comos resultados da cultura, em 6.079 amostras provenientes de 2.609 pacientes. Entre estas, 4.000amostras provinham de 1.898 pacientes que não receberam tratamento anti-tuberculose. Os seis locaisrepresentavam zonas geográficas diferentes: cinco hospitais de grandes cidades americanas, com umserviço especializado para a tuberculose, e um laboratório público.O comportamento funcional do teste MTD na sua forma actual foram avaliadas em sete locais, comparan-do os resultados do teste MTD com os resultados da cultura. Os sete hospitais que participaram no testerepresentavam zonas geográficas diferentes: seis hospitais de grandes cidades americanas, com umserviço especializado para a tuberculose, e um laboratório público nacional de micobacteriologia. Asamostras analisadas eram provenientes de pacientes que não receberam tratamento anti-tuberculose. 132deram resultados positivos na cultura para as micobactérias do complexo M. tuberculosis. MTD detectou119 destas amostras cultura-positivas; 7 amostras continham micobactérias não tuberculosas para alémdas M. tuberculosis.

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Foram incluídos neste estudo pacientes suspeitos de terem uma tuberculose pulmonar activa, e nãoestando sob tratamento. A prevalência total dos pacientes que tiveram uma cultura positiva para M. tuber-culosis foi de 20,5%.Foram determinadas, por paciente, uma sensibilidade média de 93,3% e uma especificidade média de99,1% em relação à cultura. Foram determinadas, por amostra, uma sensibilidade média de 90,6% e umaespecificidade média de 99,6% em relação à cultura. O quadro abaixo dá a sensibilidade, especificidade,valor predictivo positivo (VPP) e o valor predictivo negativo (VPN), com intervalos de confiança de 95%,para as estimativas do comportamento funcional. Todos os dados são apresentados após resolução dasdiscordâncias, baseada na existência de outras amostras, com cultura positiva, provenientes do mesmopaciente e/ou com diagnóstico final do médico.

Das 564 amostras com cultura e MTD negativas para o complexo M. tuberculosis, 114 amostras contin-ham micobactérias atípicas, detectadas em cultura, 64 provinham de pacientes em que outras amostraspermitiram isolar micobactérias atípicas em cultura e 169 provinham de pacientes em que não foi isoladanenhuma micobactéria em cultura.

B. PrecisãoForam analisados, em três locais, dois painéis de amostras, consistindo em 2 amostras negativas, 2amostras fracamente positivas (ª 100 UFC/ teste) e 2 amostras moderadamente positivas (ª 1000 UFC/ teste). As amostras positivas foram preparadas adicionando quantidades conhecidas de M.tuberculosis a um pool de amostras moderadamente inibidor. Tanto as amostras como os testemunhos deamplificação positivo e negativo foram testados em triplicado, duas vezes por dia, durante 3 dias em trêslocais.

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Não houve variabilidade significativa de resultados de um local para outro ou de um dia para outro eassim, os resultados dos três locais puderam ser consolidados e apresentam-se aqui abaixo. Os valoresde leitura medidos em RLU estão limitados pela resolução do tubo fotomultiplicador do luminómetro. Poresta razão, os valores superiores a 2.000.000 RLU foram truncados. Nem os desvios-padrão, nem os coe-ficientes de variação são indicados.

C. ReprodutibilidadeO estudo da reprodutibilidade foi efectuado com 25 amostras, intercaladas com testemunhos de amplifi-cação negativos para um total de 50 amostras. O painel de reprodutibilidade foi testado em quatro locais.No total, 100% (120/120) das amostras negativas e 98,8 % (79/80) das amostras positivas deram osresultados esperados.

D. Especificidade analíticaA especificidade do teste MTD foi avaliada com bactérias, fungos e vírus. No caso das bactérias e dosfungos, os testes de especificidade incluírem 160 estirpes/cepas (151 espécies provenientes de 62géneros) de micobactérias muito próximas de M. tuberculosis, outros microrganismos responsáveis pordoenças respiratórias, e um painel filogenético de microrganismos da flora comensal do aparelho respi-ratório. As estirpes/cepas-tipo eram culturas ATCC (American Type Culture Collection), e 5 estirpes/cepasforam fornecidas por laboratórios de análises. Os lisados, preparados a partir de culturas em crescimentoactivo (ou de ARNr, em três casos) foram analisados seguindo o procedimento do teste MTD com cercade 5 x 107 UFC por teste. Só as estirpes/cepas do complexo M. tuberculosis deram resultados positivos,exceptuando as estirpes/cepas M. celatum e M. tipo-terrae.Com concentrações superiores a 30 UFC por teste, as estirpes/cepas de M. celatum e algumasestirpes/cepas de M. tipo-terrae deram resultados positivos (26.772 RLU para M. celatum e de 19.470 a49.976 RLU para M. tipo-terrae).

E. Limite de detecçãoForam detectadas, com o teste MTD, trinta estirpes/cepas de M. tuberculosis provenientes de regiõesgeográficas muito variadas, incluindo representantes de estirpes/cepas resistentes e de estirpes/cepassensíveis aos antibióticos. O teste MTD detectou até 1 UFC por teste, de cada uma destasestirpes/cepas.

F. Teste de sobrecargaForam analisados os ARNr de Mycobacterium tuberculosis , com uma concentração de 25 fg (equivalentea 5 UFC por teste), na presença de cerca de 540.000 UFC por teste (450 μl) dos organismos não alvoseguintes: Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonasaeruginosa, Mycobacterium gordonae, M. avium, M. kansasii, M. terrae, Nocardia asteroides, N. otitidis-

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caviarum, Corynebacterium pseudotuberculosis, C. diphtheriae, Gordona sputi e Rhodococcus bronchialis.Todos os resultados foram positivos para o ARNr de M. tuberculosis na presença destes organismos não-alvo, os quais, portanto, não criaram interferência.

RESOLUÇÃO DE INCIDENTES

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OBSERVAÇÃOControlo negativo de amplificação elevado ouControlo negativo deProcessamento da amostra(> 20.000 RLU)

Controlo Positivo deAmplificação Baixo ou ControloPositivo de Processamento daAmostra(< 500.000 RLU)

CAUSAS POSSÍVEISHomogeneização insuficienteapós adição do Reagente deSelecção (S) ou volume insufi-ciente de Reagente de Selecção.

Amplificação de contaminantesintroduzidos por falta de pre-caução no decurso da preparaçãodas reacções.

Omissão da etapa de arrefeci-mento de 5 minutos.Contaminação do laboratório oudos reagentes.Omissão da limpeza dos tubosantes da leitura no luminómetro.

Desrespeito das temperaturaspreconizadas na etapa de amplifi-cação.

Adição do Reagente deAmplificação deitando o líquidosobre as paredes do tubo e nãodirectamente no fundo.Homogeneização insuficienteapós adição do Reagente deHibridização reconstituído.

Volume excessivo de Reagentede Selecção.Desrespeito do tempo preconiza-do para a etapa de selecção.A temperatura dos tubos desceua menos de 42°C após aincubação a 95° C.Os tubos de passagem doReagente de Detecção estãoentupidos.

RECOMENDAÇÕESVoltar a homogeneizar correctamente.Respeitar os volumes indicados.Verificar o aparecimento de umasolução de cor rosa uniforme após aagitação.Deve ter-se muito cuidado com a uti-lização das pipetas na distribuição dosreagentes. Os tubos usados devemser descontaminados com umasolução de lixívia a 1/10, como indica-do no parágrafo «PROCEDIMENTO».As bancadas, blocos de aquecimento,banhos-maria e pipetas devem serdescontaminados com uma solução delixívia diluída a 1/2 como indicado noparágrafo «PROCEDIMENTO».

Os tubos devem limpar-se com papelabsorvente húmido que não se des-faça, antes da leitura no luminómetro.Verificar a temperatura do banho-mariae/ou do bloco de aquecimento eajustá-la, se necessário, para respeitaras temperaturas preconizadas.

Agitar cuidadosamente num Vortex,como especificado (consultar o pará-grafo «Hibridização/ 2»). Verificar a for-mação de uma solução de cor amarelauniforme após a agitação.Verificar a regulação do volume napipeta.Respeitar os 15 minutos de incubaçãoa 60° C, no decurso da etapa deSelecção.

Transferir directamente os tubos dobloco de aquecimento a 95° C parabanho-maria / bloco de aquecimento a42° C.Lavar os tubos com água quente comoindicado no manual de utilização doaparelho.

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NOTASA Os blocos de aquecimento devem conter poços previstos para tubos de 12 x 75 mm. Aconselha-se a uti-

lização dos blocos de aquecimento GEN-PROBE.B Para a conservação das alíquotas congeladas recomenda-se a utilização de tubos de microcentrífuga com

tampa. As alíquotas congeladas individualmente podem ser descongeladas apenas uma vez. Não devemser usados congeladores com descongelação automática.

C Recomenda-se a utilização de frascos de congelação de 5 ml para a conservação das alíquotas congeladas.As alíquotas congeladas individualmente podem ser descongeladas apenas uma vez. Não devem ser usa-dos congeladores com descongelação automática.

D As performances dos Vortex podem variar consoante o material utilizado podendo, por isso, sernecessário adaptar o tempo de agitação. Regular a velocidade do aparelho e seguir as instruções do«PROCEDIMENTO, parágrafo E», para deixar a mistura de reacção atingir a metade superior da parededo tubo. É indispensável uma boa homogeneização para obter resultados precisos. O tempo de agitaçãopode ir até 15 segundos, sem afectar os resultados.

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