Ana Sofia Pedrosa Pinto 

sofia@bioinfo.hr  

Bioinformatics Group Department of Molecular Biology 

Faculty of Science, University of Zagreb Horvatovac  102a, 10 000 Zagreb 

 

December 20, 2012 

Study Committee of the Biophysics Doctoral Programme Faculty of Science, University of Split   

REQUEST FOR APPROVAL OF THE DISSERTATION TOPIC 

 

Title of the proprosed topic: 

Computational analysis of human plasma N‐glycome and genotypes 

 

Mentor: 

Prof. Kristian Vlahoviček 

Full Professor of Bioinformatics and Group Leader of the Bioinformatics Group in the Faculty of 

Science, University of Zagreb. 

 

Proposed members for the committee: 

Prof. Kristian Vlahoviček 

Prof. Igor Weber 

Prof. Andreja Ambriović‐Ristov 

 

Requirements for the dissertation topic defense: 

1. Attended and succesfully passed all the courses enrolled in the Biophysics Doctoral Programme. 

2. Presented the qualification seminar and was approved by the evaluation committee. 

3. Published two papers in high impact journals (see Curriculum Vitae below). 

 

Enclosed documents: 

1. Overview and description of the research: AnaSofiaPedrosaPinto_ResearchOverview.pdf 

2. Mentor's candidate evaluation about the research: AnaSofiaPedrosaPinto_MentorEvaluation.pdf 

   

Curriculum Vitae of the Doctoral Candidate: 

Education  October 2008 – present  Interdisciplinary PhD Program in Biophysics, University of Split, Croatia 

October 2005 – July 2006 Socrates/ Erasmus Program, University of Bologna, Italy 

September 2002 – September 2007  Graduated in Biomedical Engineering, Faculty of Sciences and Technology, University of Coimbra, Portugal Thesis title: Home Monitoring for Obstructive Sleep Apnea Diagnosis in Children 

Work experience  October 2009 – December 2011 Teaching assistant of Algorithms and Programming  course  (Computational Biology module), University of Zagreb, Croatia 

October 2007 – September 2008 Research project entitled Computational Analysis of Exonic Splicing Regulators, Bioinformatics Group, University of Zagreb, Croatia 

Publications  Pinto, S., Vlahoviček, K. and Buratti, E. (2011), PRO‐MINE: A Bioinformatics Repository  and  Analytical  Tool  for  TARDBP Mutations.  Human Mutation, 32: E1948–E1958. doi: 10.1002/humu.21393 

Pučić, M., Pinto, S., Novokmet, M., Knežević, A., Gornik, O., Polašek, O., Vlahoviček, K., Wei, W., Rudd, P. M., Wright, A. F., Campbell, H., Rudan, I., and Lauc, G. (2010) Common aberrations from normal human N‐glycan plasma profile. Glycobiology 20, 970‐975. 

Participation in Conferences and Workshops 

Participate  in the EMBO YIP PhD Course, Heidelberg, Germany (2011) [oral 

and poster presentation]. 

Attended  the  10th  Congress  of  the  Croatian  Society  of  Biochemistry  and 

Molecular Biology, Opatija, Croatia (2010) [poster presentation]. 

Participated in the FEBS workshop: Education in biochemistry and molecular 

biology, Opatija, Croatia (2010). 

Participated in the workshop Glycomics meets Genomics: novel strategies in 

combining omics approaches, Dubrovnik, Croatia (2010). 

Attented  the  3rd  Adriatic Meeting  on  Computational  Solutions  in  the  Life 

Sciences, Primosten, Croatia (2009) [poster presentation]. 

Attended the EMBO Young Scientists Forum, Zagreb, Croatia (2009). 

Attended  the  Scientific  Symposium:  50  Years  of  Molecular  Biology  in 

Croatia, Zagreb, Croatia (2008) [oral presentation]. 

Participated  in  the  ENSAPI08  Course:  Ensembl  API  access,  Programming workshop, Oeiras, Portugal (2008). 

 

RESEARCH OVERVIEW 

 

CANDIDATE:  Ana Sofia Pedrosa Pinto 

STUDY PROGRAMME:  Biophysics Doctoral Programme 

Faculty of Science, University of Split 

RESEARCH INSTITUTION:  Bioinformatics Group, Department of Molecular Biology 

Faculty of Science, University of Zagreb 

 

 

CONTENTS 

TITLE ........................................................................................................................................... 2 

INTRODUCTION .......................................................................................................................... 2 

1. Glycomics ............................................................................................................................ 2 

2. Glycosylation ....................................................................................................................... 3 

3. Structural analyses and previous studies of N‐glycans ...................................................... 4 

4. Aim of the thesis ................................................................................................................. 5 

MATERIALS & METHODS ............................................................................................................ 6 

1. Human Samples .................................................................................................................. 6 

2. Glycan analysis and glycan profiles .................................................................................... 6 

3. Phenotype and Genotype Data .......................................................................................... 7 

DATA ANALYSIS AND RESEARCH RELEVANCE ............................................................................ 8 

1. Clustering ............................................................................................................................ 8 

2. Discriminant Analysis of Principal Components ................................................................. 9 

3. SNP selection .................................................................................................................... 10 

ETHICAL GUIDELINES ................................................................................................................ 11 

REFERENCES ............................................................................................................................. 11 

 

   

TITLE 

Computational analysis of human plasma N‐glycome and genotypes 

 

 

INTRODUCTION 

1. Glycomics 

Glycans are considered to be the most abundant and diverse nature's biopolymers  [1] and 

can  be  found  in  their  free  form  or  attached  to  proteins  and  lipids,  also  called 

glycoconjugates. 

Investigating  the  structure,  biosynthesis  and  biological  function  of  glycans  is  the  focus  of 

glycobiolgy  and  has  been  of  interest  since  the  early  nineteenth  century.  The  field  of 

glycobiology has expanded with the aid of technological developments and new discoveries 

and  the  concept  of  glycomics  emerged  as  an  analogous  to  those  of  genomics  and 

proteomics. 

Glycomics is the systematic study of the entire set of glycan structures expressed by specific 

cells,  tissues  or  organisms,  comprehending  the  analyses  of  their  genetic,  physiologic  and 

pathologic  aspects,  in  order  to  gain  more  knowledge  about  the  factors  regulating  the 

synthesis  of  glycans  and  to  understand  the  role  and  association  of  glycans  in  biological 

processes. 

The  spectrum of all glycans and glycoconjugates  is  called glycome and  is estimated  to be 

much larger than the proteome itself [2], an evidence of the importance of the glycome and 

of the fact that the glycome need to be considered when studying and analysing biological 

systems and processes. 

The  "omics"  approaches of  genomics,  transcriptomics  and proteomics have enabled  gene 

mapping, elucidated the possible relationships between gene and diseases, explored protein 

modifications under different physiological  states of  the  cell or organism. Although  these 

discoveries  have  been  unquestionably  important,  the  view  of  human  physiology  is  not 

complete  and many  explanations  are  still  lacking.  The  new  emerging  field  of  glycomics 

integrated with  the other "omics"  fields and combined with major advances  in  technology 

can help to reveal some of the missing links. 

 

 

 

2. Glycosylation 

Glycans are usually composed of 10 to 15 monosaccharides (or simple sugars) and consist of 

a  core and an  antennary  structure  (figure 1). While  the  synthesis of  the  core  structure  is 

mainly  conserved,  the antennary  structure assembly  is often  regulated  in a  tissue‐ or  cell 

lineage‐specific manner  [3]  and  can  vary  in  length,  structure  (number  of  branches)  and 

composition (types of sugars). The variability of the antennary structure gives rise to a vast 

glycome composed of thousands of glycan isomers which increase diversity in the proteome. 

Glycans  participate  in  many  biological  processes  including  protein  folding,  molecular 

trafficking and clearance, signaling and cell‐cell interactions, among others [4].  

 

 

Figure 1. Eukaryotic glycan structures showing the core (red) and antennary (green) structures. (Adapted from [5]) 

 

Glycosylation  is the enzymatic process through which glycans are synthesized and attached 

to proteins and lipids. Contrary to protein synthesis where a single gene codes for a protein, 

glycan  synthesis  is  not  template  driven  but  encoded  within  a  complex  network  of 

glycotransferases, glycosidases, transcripton factors, transporters and other proteins [4,6]. 

Glycosylation  is  the most  complex  and  abundant  post‐translational modification  affecting 

the stucture of proteins and  increasing their  functional diversity. Nearly all membrane and 

extracellular  proteins  are  glycosylated  [7],  hence  small  structural  and  conformational 

modifications of the glycans attached to them can be sufficient to cause loss or impairment 

of protein function. Disregulation of glycosylation has been associated with several diseases 

such as cancer, diabetes, cardiovascular, congenital and immunological disorders.  

N‐glycosylation  is  the most  common  type  of  glycosylation which  links  glycans  (named N‐

linked glycans or N‐glycans in short) to the asparagine residue of the protein through rather 

extensive and  intricate biosynthetic mechanisms. The complete absence of N‐glycosylation 

can  be  lethal  to  the  embryo  demonstrating  its  importance  for  the  normal  growth  and 

function of the organism [8]. Also, congenital disorders of glycosylation, a group of rare but 

severe  inherited  metabolic  disorders,  are  characterized  by  an  abnormal  N‐glycosylation 

resulting from genetically  inherited mutations which alter the function of the enzymes part 

of the N‐glycosylation synthetic pathway. 

Immunoglobulin G (IgG) is the most abundant antibody isotype found in human blood and is 

an  example  of  a  N‐glycosylated  protein.  Several  studies  investigating  the  structural  and 

functional  properties  of  the  glycans  attached  to  IgG,  associated  changes  in  these  glycans 

with various diseases, such as  rheumatoid arthritis and diabetes  [9‐11].  It was also shown 

that different glycosylation of IgG can lead to opposite pro‐ and anti‐inflammatory responses 

[12]. 

 

3. Structural analyses and previous studies of N‐glycans 

Structural  analyses  of  glycans  have  always  been  challenging,  not  only  because  of  the 

complexity of glycan  structures  that make  their  identification difficult but also because of 

restrictions  on  the  level  of  the  analytical  tools  used  that  limited  the  analysis  to  a  small 

number of samples. 

High‐performace  liquid  chromatography  is  one  of  the  techniques widely  used  for  glycan 

analysis and it has been recently adapted for high‐throughput glycan quantification [13]. 

The developed method allowed the first large scale study which evaluated the variability and 

heritability of the human plasma N‐glycome [14]. Two main findings should be noted: first, 

the variability of glycans at the population  level was shown to be  larger than expected and 

should  be  taken  into  account when  using  glycan  levels  for  diagnostic  purposes;  second, 

different N‐glycan groups are under distinct influence of genetic and environmental control 

with variable strength. 

Since changes reported to be associated with disease are usually smaller than the found high 

glycan variability, a follow up study was conducted to test the stability of the human plasma 

N‐glycan  profile  of  healthy  individuals  over  a  period  of  time  [15].  The  plasma N‐glycome 

exhibited temporal stability, indicating that the genetic background might have a significant 

influence  on  it.  Consequently,  glycan  profiles  present  themselves  as  potential  diagnostic 

markers  for diseases as  their changes will be determined by environmental  factors and/or 

altered physiological processes. 

Associations of N‐glycan  levels with gender, age and  lifestyle parameters, such as smoking 

and diet, were reported [16]. However, these factors explained only a small fraction of the 

glycans variability supporting the evidence that glycans are under greater genetic control. 

Several  individuals  exhibiting  different  deviations  from  the  normal  plasma  glycan  profile 

were  identified within a population [17]. Groups of  individuals with the most similar glycan 

profiles  to  these  outliers were  determined,  by  performing  consensus  scoring  of  pairwise 

distance between vectors containing measured glycan values, and analysed for the presence 

of  common  phenotypic  characteristics.  Some  groups  shared  clinical  conditions,  like  renal 

problems, while others were apparently healthy. The study showed the presence of specific 

glyco‐phenotypes  indicating  a  possible  association  between  them  and  certain 

(patho)physiological  conditions  which  could  originate  from  rare  mutations  and/or 

combinations  of  common mutations.  The  reported  glyco‐phenotypes  are  the  result  of  a 

preliminary analysis  that needs additional studies with a  larger data set and with genomic 

data to validate and corroborate these findings. 

These  initial  studies  characterize  in  detail  the  N‐glycome  and  give  an  overall  view  of  its 

behaviour at the population level. However, to demonstrate the practical applicability of the 

glycan  profiles  as  biomarkers  and  to  unravel  the  influence  of  genetic  component  on  the 

glycan  levels, both disease  traits and genetic data need  to be  integrated and combined  in 

further studies. 

The first attempt to join genomics and glycomics was recently performed in the first genomic 

wide association  study of human N‐glycome and  identified  some polymorphisms affecting 

glycan levels [18].  

 

4. Aim of the thesis 

Glycans are involved in human health and disease. The great potential of the human plasma 

N‐glycome as a disease biomarker  is reinforced by the simplicity of the non‐invasive blood 

test.  Additionally,  the  glycans  composition  of  plasma  is  expected  to  reflect  physiological 

status  of  the  organism  and  advances  in  technology  have  enabled  fast  and  simple 

quantitative analysis of glycans. 

The previously reported studies and their results concerning the human plasma N‐glycome 

constitute  the  basis  for  this  thesis  research  and motivate  the  analyses  proposed  to  be 

performed  which  are  described  below  in  more  detail  (see  Data  Analysis  and  Research 

Relevance section). 

The aims of  the present  research  include  locating disease  related N‐glycosylation  changes 

that could be used as a biomarker and to reveal polymorphisms associated with glycan levels 

that would enable more insights into the glycosylation network. 

   

MATERIALS & METHODS 

1. Human Samples 

This  research  is  based  on  samples  from  individuals  part  of  larger  genetic  epidemology 

studies which aim to investigate genetic variability and map genes associated with common 

complex disease traits in genetically isolated populations. 

The individuals belong to four different population cohorts: the islands of Vis and Korčula in 

Croatia  [19],  the Orkney  archipelago  in  Scotland  [20]  and  the  Karesuando  community  in 

Sweden [21]. 

The data consists of 975 individuals from Vis island, 957 individuals from Korčula island, 890 

individuals from Orkney islands and 686 individuals from Sweden community. 

 

2. Glycan analysis and glycan profiles 

Plasma samples from the  individuals were collected and subjected to a previously reported 

procedure for the release and labeling of the plasma N‐glycans [13]. 

Hydrophilic  interaction high performance  liquid chromatography  (HILIC) was performed on 

released glycans before and after desialylation (the process of removing the sialic acids from 

the  glycans  by  sialidase  digestion).  The  chromatograms  obtained  were  divided  into 

chromatographic peaks based on the similarity of the glycan structures present in each peak, 

resulting in 16 groups of glycans before desialylation (figure 2) and 13 groups of desialylated 

glycans. The amount of glycans present  in each peak  is expressed as a percentage of  the 

total  integrated  chromatogram  and  calculated  as:  the  amount of  glycan  structures  in  the 

peak/total N‐glycome. 

Glycans were also quantified by weak anion exchange high‐pressure liquid chromatography 

(WAX‐HPLC) according  to  the number of attached sialic acids: monosialylated, disialylated, 

trisialylated and tetrasialylated. 

Additionally, glycan  structural  features,  such as  fucosylation, galactosylation,  sialylation of 

biantennary  structures  and  branching  degree, were  approximated  by  adding  the  glycans 

sharing  the  same  structural  characteristic  from  either  HILIC,  after  sialidase  treatment‐

integrated glycan profiles or WAX‐HPLC. 

Regarding the Immunoglobulin G,  it was  isolated from plasma and the released IgG glycans 

were  subjected  to  ultra  performance  liquid  chromatography  [11].  The  chromatograms 

obtained for the IgG glycans were divided into 24 peaks and additional IgG glycan structural 

features were derived. 

Each  individual  will  be  represented  by  a  plasma  N‐glycan  profile  consisting  of  33 

chromatographic peaks and 13 derived glycan structural features (in a total of 46 traits) and 

an IgG glycan profile comprising 23 chromatographic peaks and 54 derived glycan structural 

features (in a total of 77 traits). 

 

 

Figure 2. N‐Glycan profile chromatogram from human plasma sample divided into 16 groups of 

glycans. Individual glycan structures present in each chromatographic peak are shown. (Adapted 

from [22]). 

 

3. Phenotype and Genotype Data 

Besides glycan profiles, phenotype data  is available for the samples of Vis and Korčula and 

genotype data is available for Vis, Korčula and Orkney cohorts. 

Phenotypes include age, gender, health‐related lifestyle variables (such as diet and smoking 

status)  and  physiological measurements  including  blood  preasure,  uric  acid,  cholesterol, 

insulin and blood glucose. 

Genotype data consists of approximately 258.000 SNPs, of which about 900 are related with 

glycosylation. 

   

DATA ANALYSIS AND RESEARCH RELEVANCE 

The exploratory analysis of the three data sets (glycan profiles, phenotypes and genotypes)  

is  performed  in  the  R  programming  environment  using  specialized  packages.  R  is  a  free 

software for statistical computing and graphics [23]. 

Several machine learning, data mining and statistical methods, as well as different graphical 

representation  approaches,  are  applied  to  analyse  and  model  the  data  and  to  derive 

relevant biological information. 

 

1. Clustering 

Cluster analysis aims to divide a set of data points  into groups (called clusters) by assigning 

similar data points to the same cluster. One of the most widely used clustering algorithms is 

the K‐means clustering which partitions the data points into k clusters such that the sum of 

squares from the data points to the assigned cluster centers is minimized. One drawback of 

this algorithm  is that the k number of clusters  is required  in advance and an  inappropriate 

choice might  induce  poor  or wrong  results. Also,  it  should  be  noted  that  K‐means might 

originate  slightly  different  final  clusters  for  one  data  set,  as  a  result  of  the  random 

assignment of the initial cluster centers and the data structure. When performing K‐means it 

is necessary to determine the number of optimal clusters for a certain data set and to assess 

the stability of the clusters obtained. 

Consensus  Clustering  is  one  approach  that  has  been  proposed  to  assess  the  stability  of 

clusters  and  find  reliable  clusters  [24].  The  consensus  clustering  method  consists  of 

repeating  the  K‐means  algorithm  with  different  subsets  of  the  data  and  construct  a 

consensus matrix which can be viewed as a summary of the individual results of all K‐means 

repetitions.  Each  element  of  the  consensus matrix  is  defined  as  the  ratio  between  the 

number of times two samples clustered together and the number of times the samples were 

selected  for  the  clustering.  In addition  to  the  consensus matrix, other measures  to assess 

and validate the robustness of the clusters can be computed. 

The consensus clustering was applied to the glycan profiles of the  four population cohorts 

and performed varying the number of clusters defined for the K‐means algorithm. The most 

reliable  and  stable  cluster  division  for  each  population  is  achieved  by  comparing  the 

consensus matrices and the stability measures obtained for all the different cluster divisions. 

The optimal number of clusters for the population division varies for each population.  

The  establishment  of  stable  clusters  shows  an  internal  structure  of  the  populations  and 

allows  further  analyses  of  the  glycan  and  phenotype  signatures  of  each  cluster.  The 

comparison of these signatures can be useful in the investigation of the association between 

glycans and phenotypes and can bring new insights into it. 

2. Discriminant Analysis of Principal Components 

Principal Component Analysis (PCA) and Discriminant Analysis (DA) are statistical techniques 

used to search patterns in data, as well as to characterize and/or separate the data. For high‐

dimensional  data  sets,  where  a  graphical  representation  of  the  data  is  not 

accessible/suitable,  these methods  are  also  a means  of  dimensionality  reduction  of  the 

variables describing  the data without much  loss of  information.  In both PCA  and DA,  the 

initial set of variables (possibly correlated) are converted into a combination of uncorrelated 

variables. In other words, the data is transformed into a new coordinate system where linear 

combinations of variables explain most of the data variability.   

When  investigating  the  genetic  structure of biological populations, PCA might not be  the 

most appropriate method and yield poor  results owing  to  the  fact  that  it searches  for  the 

direction  where  the  overall  variability  of  data  is  larger  ignoring  the  possible  divergence 

between groups. DA can be a better choice because it tries to maximizes the between‐group 

separation while minimizing the within‐group variation. However, the performance of DA in 

the analysis of genetic data is compromised by the correlation existing between SNPs and by 

the much larger number of SNPs compared to the number of samples. 

A new multivariate method called Discriminat Analysis of Principal Components (DAPC) has 

been developed  to overcome  the mentioned  limitations and  to allow DA  to be applied  to 

genetic data [25]. DAPC combines the two described methods: as a first step, PCA is used for 

dimensionality  reduction  and  removal  of  correlation  between  variables,  after  which 

transformations DA  is applied. Moreover, DAPC computes the contribution of the variables 

for the obtained population structures. 

DAPC and PCA were computed  for the  individual populations and  for  the  four populations 

merged based on  the glycan data.  In  the case of  the  individual populations, no underlying 

internal  structure  is  shown  when  using  PCA  as  opposed  to  the  results  obtained  with 

clustering and DAPC. In the case of the four populations merged, DAPC performs better than 

PCA  in discriminating  the  four populations with only Vis  and Korčula not being  so  clearly 

separated  from each other, what can somehow be expected as  these  two populations are 

geographically  closer.  From  this  analysis,  the  most  important  glycans  to  separate  the 

populations were obtained and identified as those showing the bigger differences across the 

populations. 

Employing  DAPC  to  the  genetic  data  in  parallel  with  the  glycans  data  may  reveal  the 

contribution of the genetic component to the structure of the populations and the influence 

of genotypes on certain glycan‐phenotypes. 

 

 

3. SNP selection 

Screening  for  relevant  biomarkers  is  important  for  the  development  of  better  strategies 

regarding detection, treatment and prevention of diseases.  

Genome‐wide  association  studies  (GWAS)  have  been  used  to  identify  genetic  variants 

underlying  human  diseases  and  traits.  In  brief,  these  association  studies  compare  the 

frequency of alleles or genotypes of a particular variant or SNP between disease cases and 

controls [26]. Establishing associations for polygenic traits is not a straightforward task as for 

the single gene disorders due to the complex  interplay between the several genes involved 

in producing a specific phenotype. 

GWAS  has  identified  hundreds  of  common  genetic  variants  associated  with  complex 

diseases,  such  as    cancer,  diabetes  and  cardiovascular  and  neurological  diseases. 

Nevertheless,  most  of  these  variants  explain  only  a  small  proportion  of  the  genetic 

contribution to the disease variation and cannot be taken with full reliability as risk factors 

for disease [27]. Another drawback of GWAS is that each SNP is analysed individually for the 

association with the phenotype ignoring any correlations existent among SNPs. 

Recently, multivariate methods that account for the dependencies between SNPs have been 

developed and applied  to  the challenging  task of SNP selection  [28‐29]. These approaches 

can  effectively  be  used  in  high‐dimensional  data  sets  with  comparable  or  better 

performance than GWAS. 

The  first  comprehensive  analysis  of  common  genetic  polymorphisms  that  affect  protein 

glycosylation was  recently  performed  by  combining  high‐throughput  glycan  analysis with 

GWAS and reported a set of polymorphisms affecting the plasma N‐glycan  levels [18]. This 

study puts  together genomics and glycomics  in an effort  to map and unravel  the complex 

network of proteins involved in the genetic regulation of the human glycome. 

By incorporating the SNP‐SNP correlation factor, the above mentioned multivariate methods 

could  have  the  potential  to  identify  novel  associations  between  SNPs  and  protein 

glycosylation  and,  in  this  manner,  complement  and/or  improve  the  results  of  this  first 

genome‐wide association study of human plasma N‐glycome. 

   

ETHICAL GUIDELINES 

The data analysed in this research was used in previous studies which were approved by the 

appropriate ethical committees. 

 

REFERENCES 

[1] Ohtsubo, K. and Marth, J. D.  (2006) Glycosylation  in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126: 855‐867 

[2] Lee, R. T., Lauc, G., et al.  (2005) Glycoproteomics: protein modifications  for versatile  functions. Meeting on glycoproteomics. EMBO Rep. 6: 1018‐1022 

[3]  Varki,  A.  Essentials  of  glycobiology  (2nd).  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press  (Cold  Spring Harbor, N.Y.): 2009. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1908/ 

[4] Freeze, H. H. (2006) Genetic defects in the human glycome. Nat Rev Genet. 7: 537‐551 

[5] Balzarini, J. (2007) Targeting the glycans of glycoproteins: a novel paradigm for antiviral therapy. Nat Rev Microbiol. 5: 583‐597 

[6] Lauc, G., Rudan, I., et al. (2010) Complex genetic regulation of protein glycosylation. Mol Biosyst. 6: 329‐335 

[7] Apweiler, R., Hermjakob, H., et al. (1999) On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS‐PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473: 4‐8 

[8] Marek, K. W., Vijay,  I. K., et al.  (1999) A recessive deletion  in  the GlcNAc‐1‐phosphotransferase gene results in peri‐implantation embryonic lethality. Glycobiology. 9: 1263‐1271 

[9] Hounsell, E. F. and Davies, M. J.  (1993) Role of protein glycosylation  in  immune regulation. Ann Rheum Dis. 52 Suppl 1: S22‐29 

[10]  Field, M.  C.,  Amatayakul‐Chantler,  S.,  et  al.  (1994)  Structural  analysis  of  the N‐glycans  from human  immunoglobulin  A1:  comparison  of  normal  human  serum  immunoglobulin  A1  with  that isolated from patients with rheumatoid arthritis. Biochem J. 299 ( Pt 1): 261‐275 

[11] Pucic, M., Knezevic, A., et al. (2011) High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG‐variability  and  heritability  of  the  IgG  glycome  in  three  isolated  human  populations.  Mol  Cell Proteomics. 10: M111 010090 

[12] Huhn, C., Selman, M. H., et al. (2009) IgG glycosylation analysis. Proteomics. 9: 882‐913 

[13] Royle,  L., Campbell, M. P., et al.  (2008) HPLC‐based analysis of  serum N‐glycans on a 96‐well plate platform with dedicated database software. Anal Biochem. 376: 1‐12 

[14] Knezevic, A., Polasek, O., et al. (2009) Variability, heritability and environmental determinants of human plasma N‐glycome. J Proteome Res. 8: 694‐701 

[15] Gornik, O., Wagner, J., et al. (2009) Stability of N‐glycan profiles in human plasma. Glycobiology. 19: 1547‐1553 

[16] Knezevic, A., Gornik, O., et al. (2010) Effects of aging, body mass index, plasma lipid profiles, and smoking on human plasma N‐glycans. Glycobiology. 20: 959‐969 

[17] Pucic, M., Pinto, S., et al. (2010) Common aberrations from the normal human plasma N‐glycan profile. Glycobiology. 20: 970‐975 

[18] Lauc, G., Essafi, A., et al.  (2010) Genomics meets glycomics‐the  first GWAS study of human N‐Glycome  identifies HNF1alpha as a master regulator of plasma protein  fucosylation. PLoS Genet. 6: e1001256 

[19]  Rudan,  I.,  Biloglav,  Z.,  et  al.  (2006)  Effects  of  inbreeding,  endogamy,  genetic  admixture,  and outbreeding on human health: a (1001 Dalmatians) study. Croat Med J. 47: 601‐610 

[20] McQuillan, R., Leutenegger, A. L., et al. (2008) Runs of homozygosity  in European populations. Am J Hum Genet. 83: 359‐372 

[21]  Igl, W.,  Johansson, A., et al.  (2010) The Northern Swedish Population Health Study  (NSPHS)‐‐a paradigmatic  study  in  a  rural  population  combining  community  health  and  basic  research.  Rural Remote Health. 10: 1363 

[22] Lauc, G. and Zoldos, V.  (2010) Protein glycosylation‐‐an evolutionary crossroad between genes and environment. Mol Biosyst. 6: 2373‐2379 

[23] Team, R. C. R: A  Language and Environment  for Statistical Computing  (2012). Available  from: http://www.R‐project.org 

[24] Monti, S., Tamayo, P., et al. (2003) Consensus clustering: A resampling‐based method for class discovery and visualization of gene expression microarray data. Mach Learn. 52: 91‐118 

[25]  Jombart,  T., Devillard,  S.,  et  al.  (2010) Discriminant  analysis  of  principal  components:  a  new method for the analysis of genetically structured populations. Bmc Genet. 11:  

[26] Hirschhorn, J. N. and Daly, M. J. (2005) Genome‐wide association studies for common diseases and complex traits. Nat Rev Genet. 6: 95‐108 

[27] Queitsch, C., Carlson, K. D., et al. (2012) Lessons from model organisms: phenotypic robustness and missing heritability in complex disease. PLoS Genet. 8: e1003041 

[28]  Zuber,  V.  and  Strimmer,  K.  (2009) Gene  ranking  and  biomarker  discovery  under  correlation. Bioinformatics. 25: 2700‐2707 

[29] Zuber, V. and Strimmer, K. (2011) High‐Dimensional Regression and Variable Selection Using CAR Scores. Stat Appl Genet Mol. 10:  

 

 

UNIVERSITY OF ZAGREB FACULTY OF SCIENCE

DIVISION OF BIOLOGY Rooseveltov trg 6 10000 Zagreb

tel +385 1 4877700 fax +385 1 4826260 uredbo@zg.biol.pmf.hr http://www.biol.pmf.hr

1

Professor Kristian Vlahoviček, PhD Head, Bioinformatics Group e-mail: kristian@bioinfo.hr

Zagreb, December 19th, 2012.

Subject: Ana Sofia Pedrosa Pinto, justification of the PhD thesis topic

Sofia Pinto is a PhD student in my lab since 2007 and has been enrolled in the PhD program since 2008. She is actively pursuing several research directions, of which we propose for her dissertation topic the computational analysis of glycosylation patterns in human plasma and plasma-associated proteins and association to population genotypes.

Sofia has so far published two research papers, where she demonstrated to have mastered the skills for analyzing and visualizing high-throughput biological data, as well as outlined her first results in the analysis of human plasma glycosylation profiles, where she further demonstrated the mastery of advanced statistics and machine learning methods. She demonstrated the ability to independently plan and execute complex computational analyses of large sets of biological data.

I am confidently stating that the proposed topic of Sofia’s doctoral dissertation “Computational analysis of human plasma N-glycome and genotypes” is fully compliant with all the requirements for her doctoral degree.

Professor Kristian Vlahoviček, PhD, EMBO YIP IG Head, Bioinformatics Group Faculty of Science, University of Zagreb, Croatia