i

   Role of Pathogenic Mediators in murine Arthritis and Levels of Serum Soluble CD21 and CD23 in autoimmune patients                                                                                            Dissertation 

                                     Zur Erlangung des Doktorgrades (Dr.rer.nat.) 

                                                                               der 

                                        Mathematisch‐Naturwissenschaftliche Fakultät 

                                                                              der 

                                        Rheinischen Friedrich‐Wilhelms‐Universität Bonn 

                                                                    Vorgelegt von    

                                                      ANJANA SINGH 

                                                                 aus 

                                                        (Delhi, INDIA) 

                                                         Bonn (2009) 

 

Rheinische Friedrich‐Wilhelms‐Universität Bonn 

Mathematisch‐Naturwissenschaftliche Fakultät                               Wegelerstr. 10                                 53115 Bonn 

ii

                                                                                                             GUTACHTER‐I  

                                                              Prof. Dr. Harald Illges 

                                             Professor of Immunology and Cell Biology 

                                                           University of Applied Sciences 

                                                                   Bonn‐Rhein‐Sieg 

                                                                   Von‐Liebig Str. 20 

                                                                   53359 Rheinbach 

                                                                        Germany 

                      

 

 

                                                                   GUTACHTER‐II 

                                                        Prof. Dr. Waldemar Kolanus 

                                                        Professor of Cellular Biochemistry 

                                                        Institute of Molecular Physiology 

                                                            and Developmental Biology 

                                                         Division of Cellular Biochemistry 

                                                                   University of Bonn 

                                                      Karlrobert‐Kreiten 13, D‐53115 Bonn 

                                                                                Germany 

 

                                          Date of Examination: 16th March 2009 

 

 

 

 

 

 

iii

 

                                                                                    

                                                                               

                                                                        Dedicated to My Parents 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

iv

                                                   ACKNOWLEDGEMENT 

This thesis work was carried out at Rheumatology unit, Department of Immunology and Cell Biology, 

Rheinbach.  I would  like to express my gratitude to all colleagues and  friends who have helped me 

during the PhD studies. 

My first, and most earnest, acknowledgement must go to my advisor Prof. Harald Illges. Nearly three 

years ago, a telephone conversation with Prof. Illges started me on the path I traveled at Germany. 

Prof.  Illges has been  instrumental  in ensuring my academic, professional,  financial, and moral well 

being  ever  since. His  support  and  guidance made my  thesis work  possible. He  has  been  actively 

interested  in my  work  and  has  always  been  available  to  advise me.  I  am  very  grateful  for  his 

patience,  motivation,  enthusiasm,  and  immense  knowledge  in  B  cell  biology  and  Rheumatoid 

Arthritis  that,  taken  together, make him a great mentor.  In every  sense, none of  this work would 

have been possible without him.  

Prof. Waldemar Kulanus for accepting to be my examiner. 

I want  to  thank present and past members of  the  lab: Dr. Narendrian Rajashekaran, Hui Zhi Low, 

Stephan  Gütgemann,  Danile  Ferrando,  sebastian  Howe  and  Mahwish  Iftikhar.  Dr.  Narendrian 

Rajashekara  gave me  an  introduction  into  the  lab  and  for  sharing  his  knowledge.  I  also  thank 

Sebastian Howe for helping me write the German version of thesis summary. 

Far  too many  people  to mention  individually  have  assisted  in  so many ways  during my work  at 

Germany. They all have my sincere gratitude.  In particular,  I would  like to thank Mrs. Robert Karin 

and Olaf Stock for timely help, Prof. Rolf Baüer for all the histology in this study, Prof. Miri Blank for 

APS  sera  samples, Prof. Richard Buccala  for MIF‐/‐ mice, Prof. Peter Angel  for MMP 13‐/‐ mice, Dr. 

Bettina Hartenstein‐Füssel  and Mrs.  Sibylle  Teurich  for  the  reagents  and  for  help with  the  Semi‐

quantitative PCR experiments and also his valuable discussion  for MMP13 paper, Prof. Zimmer  for 

SP‐/‐ and several anonymous reviewers for their help and comments that improved various published 

papers. 

I am also indebted to the Department of Immunology and Biological sciences at Rheinbach, for direct 

financial aid through fellowships, awards, and travel grants. 

For  the  non‐scientific  side  of my  thesis,  I  particularly want  to  thank Mr.  and Mrs.  Baüer  (House 

owner)  for  sharing  their  apartment with me  for  3  years  for  undertaking  neat  and  adventurous 

excursions  in Rheinbach, and for being my eternal sunshine. Their support and care means a  lot to 

me.  

A penultimate thank‐you goes to my wonderful parents, Anal Dharamshi, Jalpa Vasani and Thaniga 

Subramaniam. For always being there when I needed them most, and never once complaining about 

how infrequently I visit, they deserve far more credit than I can ever give them. 

v

                                                       PUBLICATIONS 

 (1) Anjana Singh, Miri Blank, Yehuda Shoenfeld, Harald Illges 

Antiphospholipid  Syndrome  patients  display  reduced  titers  of  soluble  CD21  in  their  plasma 

irrespective of the presence of immune complex generating autoantibodies. Rheumatol Int 2008 Jan 

3 

(2) Madhan Masilamani, Narendiran Rajasekaran , Anjana Singh, Hui Zhi Low, Kerstin Albu, Swentje 

Anders, Frank Behne, Peter Eiermann, Kathraina Konig, Clarissa Mindnich, Terdora Ribaraka, Harald 

Illges. 

Systemic  reduction  of  soluble  complement  receptor  II/CD21  during  pregnancy  reminiscent  of 

autoimmune disease. Rheumatol Int 2008 May 24 

 

Manuscripts in preparation 

(1) Anjana Singh, Bas Vestert, Harald Illges 

Decreased  levels  of  sCD21  and  sCD23  in  blood  of  patients  with  Systemic‐JA,  Polyarticular‐JA, 

Pauciarticular‐JA  

(2) Anjana Singh, Narendiran Rajasekaran, Sibylle Teurich, Bettina Hartenstein‐Füssel, Gaida, Peter 

Angel, Rolf Brauer and Harald Illges 

Increased expression of collagenase‐3 (MMP‐13) deficiency protects from antibody‐induced arthritis 

(3) Anjana Singh, Gaida , Rolf Brauer, Günter Fingerle‐Rowson, Richard Bucala, and Harald Illges 

Inhibition of  joint  inflammation and destruction  induced by K/BxN serum‐induced arthritis  in mice 

due to depletion of macrophage secreted macrophage inhibitory factor (MIF) 

(4) Anjana Singh, A.Pfutzner, Harald Illges. 

Decreased levels of sCD21 and sCD23 in patients with Insulin dependent Diabetes Mellitus 

                                

                                    ABSTRACTS AND CONFERENCES 

(1)  Poster presentation in 16th European Congress of Immunology, Paris, 6th Sep‐9th Sep 2006. 

(2) Oral and poster presentation in 13th International Congress of Immunology, Rio de Janeiro, Brazil, 

21st Aug‐25th Aug 2007 

(3) Poster Presentation 37th Annual meeting of German Society, Heidelberg, 5th Sep‐8th Sep 2007 

 

 

vi

                                                 ABBREVATIONS 

 6‐OHDA  6‐hydroxydopamine Ag  Antigen Ab  Antibody APC  Antigen presenting cell APS ALM 633 ALPS APS 

Ammoniumpersulfate Alexa Fluor 633 C5 maleimide Autoimmune lymphoproliferative syndrome Antiphospholipid Syndrome 

BCR  B cell Receptor BSA CIA 

Bovine Serum Albumin Collagen Induced Arthritis 

CR Carboxy‐H2DCFDA  CD CL‐3 

Complement Receptor 5‐(and‐6)‐carboxy‐2´,7´‐dichlorodihydrofluorescein acetate Cluster of Differentiation collagenase‐3  

DAF  Decay Acceletrating Factor DC DMSO 

Dendritic Cell Dimethyl Sulfoxide 

EDTA  Ethylene Diamine Tetraacetic Acid ELISA  Enzyme‐linked Immunosorbant Assay FACS FBS 

Fluorescence Activated Cell Sorter Fetal Bovine Serum 

FDC  Follicular Dendritic Cell FGF  Fibroblast Growth Factor FITC  Fluorescein Isothiocyanate FLS  Fibroblast like Synoviocytes FC FCA 

Fluorescence Channel Freund’s complete adjuvant  

FSC  Forward Scatter GC  Germinal Center GM‐CSF  Granulocyte‐Macrophage Colony Stimulating 

Factor GPI  Glucose‐6‐Phosphate‐Isomerase HCV  Hepatitis‐C Virus HRP   Horse Radish Peroxidase i.p.  Intraperitoneal IC  Immune Complex Ig  Immunoglobin IL  JA JRA 

Interleukin Juvenile Arthritis Juvenile Rheumatoid Arthritis 

K Da  Kilo Dalton L, ml, µl  Liter, millilitre, microlitter M, Mm  Molar, Millimolar MCA  Membrane Attack Complex MBL  Mannose Binding Lectin 

vii

MCP MIF MFI 

Monocyte Chemoattractant Protein Macrophage inhibitory factor Median Fluorescence Intensity 

MHC  Major Histocompatibility Complex MMP  Matrix Metalloproteinase NOD α7nAChR 

Nonobese Diabetic Nicotinic Acetylcholine Receptor‐α7 

O.D. PIA 

Optical Density Pristane Induced Arthritis 

PAGE  Polyacryamide Gel Electrophoresis PBL  Preipheral Blood Lymphocytes PBS  Phosphate‐Buffered Saline PE PerCP P‐JA 

Phycoerythrin Peridinin Chlorophyll Protein Pauciarticular Juvenile Arthritis 

PVDF  Polyvinylidene Fluoride RA  Rheumatoid Arthritis RF  Rheumatoid Factor ROS  Reactive Oxygen Species RPE  R‐Phycoerythrin SCR  Short Consensus Repeat SDS  Sodium Dodecyl Sulphate SLE SH S‐JA 

Systemic Lupus Erythematosus Sulfhydryl  Systemic Juvenile Arthritis 

SP  Substance p SS  Sjoegren’s Syndrome SSC  Side Scatter TEMED  N, N,N, N’‐tetramethylethylenediamine TGF  Transforming Growth Factor TMAO  Trimethylamine N‐Oxide TNF  Tumor Necrosis Factor v/v, w/w  Volume/volume, weight/weight VCAM  Vascular Cell Adhesion Molecule V  Volt                                   

viii

                                                   CONTENTS 

        

     1. CHAPTER I INTRODUCTION  

       1. Human Immune System……………………………………………………………………….1  1.1 Hematopoiesis……………………………………………………………………………………………………… 2  1.2 Innate immunity vs. adaptive immunity  1.1.1. Innate immunity……………………………………………………………………………………………. 4              1.1.2. Adaptive immunity………………………………………………………………………………………… 4          1.3. Complement pathway…………………………………………………………………………………………. 5  1.3.1. Activation of classical pathway………………………………………………………………………..6                 1.3.1.1. C1 activation…………………………………………………………………………………………….. 6                 1.3.1.2. C4 and C2 activation (generation of C3 convertase)…………………………………. 6                 1.3.1.3. C3 activation (generation of C5 convertase)…………………………………………….. 6               1.3.2. Activation of alternative pathway…………………………………………………………………. 6               1.3.3. Initiation of Lectin pathway…………………………………………………………………………… 7               1.3.4. Membrane attack complex (MAC) formation ……………………………………………….. 7               1.3.5. Regulation of complement activation ………………………………………………………..... 7                  1.3.5.1. Complement receptor (CR1 or CD35)………………………………………………………..8                  1.3.5.2. Complement receptor 2 (CR2)…………………………………………………………………. 8  1.4. Autoimmunity……………………………………………………………………………………………………..  9              1.4.1. Dimensions of autoimmune diseases…………………………………………………………… 13          1.5. Rheumatoid arthritis…………………………………………………………………………………………. 14          1.6. Autoimmune diseases                1.6.1. Animal models of rheumatoid arthritis                    1.6.1.1. Type II collagen‐induced arthritis…………………………………………………………. 16                    1.6.1.2. Adjuvant arthritis…………………………………………………………………………………. 17                    1.6.1.3. Pristane‐induced arthritis………………………………………………………………….…. 17                    1.6.1.4. Streptococcal cell wall‐induced arthritis………………………………………….…… 17                    1.6.1.5. K/BxN murine model of RA……………………………………………………………….…..18            1.7. Juvenile arthritis………………………………………………………………………………………………. 21            1.8. Diabetes…………………………………………………………………………………………………………… 21            1.9. Antiphospholipd syndrome (APS)……………………………………………………………………. 22            1.10. Autoimmune lymphoproliferative syndrome (ALPS)…………………………………….. 23            1.11. Cellular abnormalties                 1.11.1. Antigen presenting cells………………………………………………………………………….. 24                 1.11.2. Macrophages…………………………………………………………………………………………… 24                 1.11.3. Role of cytokines in RA………………………………………………………………………….... 25            1.12. Contributors to the inflammatory process                 1.12.1. Neuropeptide connection in arthritis…………………………………………………….… 27                     1.12.1.1. Role of Substance P in RA…………………………………………………………………. 28                 1.12.2. Role of MMP 13 in RA……………………………………………………………………………... 29                 1.12.3. Role of macrophage inhibitory factor (MIF) in RA………………………………….… 30                 1.12.4. Role of redox‐reactions in RA………………………………………………………………….. 31  

ix

           1.13. Role of serum soluble CD21 and CD23 in autoimmune diseases                  1.13.1. Soluble CD21…………………………………………………………………………………………. 32                  1.13.1. Soluble CD23…………………………………………………………………………………………. 33     2.  CHAPTER II AIMS OF THE STUDY…………………………………………………………………….. 34      3.  CHAPTER III MATERIALS AND METHODS          3.1.1 Mouse strains 

     3.1.1.1 KRN transgenic mouse strain…………………………………………………………………….. 35      3.1.1.2. NOD/Lt mouse strain………………………………………………………………………………….35      3.1.1.3. K/BxN mouse strain………………………………………………………………………………….. 35 3.2. Knockout mouse     3.2.1. MMP 13‐/‐ mouse strain……………………………………………………………………………….. 36     3.2.2. Macrophage inhibitory factor‐/‐ mouse strain……………………………………………….. 36     3.2.3. Substance‐P‐/‐ mouse strain………………………………………………………………………..... 36     3.2.4. DBA mt FvB mouse strain……………………………………………………………………………… 36     3.2.5. B6.129 S7‐chrna 7tm1Bay/J mouse strain……………………………………………………….... 36     3.2.6. Balb/c and C57BL/6 mouse strain…………………………………………………………………. 36 3.3. Breeding experiments…………………………………………………………………........................ 36 3.4. Induction arthritis using K/BxN sera transfer     3.4.1. Production of K/BxN sera……………………………………………………………………………… 37     3.4.2. Establishment of antibody‐induced arthritis in mice…………………………………….. 37     3.4.3. Assessment of antibody‐induced arthritis by ankle thickness (mm) and                    clinical index (U)…………………………………………………………………………………………… 37 

         3.5. Histology             3.5.1. Decalcification…………………………………………………………………………………………….... 38          3.6. Preparation of adherent peritoneal macrophages and reconstitution of                    macrophages in MIF‐/‐ mice………………………………………………………………………………. 38          3.7. Immunological methods              3.7.1. Fluorescence activated cell sorter (FACS)                        Ficoll density gradient preparation of lymphocytes………………………………………. 38              3.7.2. RBC lysis………………………………………………………………………………………………………. 39          3.8. Quantification of sCD21 from human serum/plasma samples by ELISA…………… 39          3.9. Quantification of sCD23 from human serum/plasma samples by ELISA…………… 40          3.10. Immunoloblot              3.10.1. Western blot……………………………………………………………………………………………… 40              3.10.2. Dot blot……………………………………………………………………………………………………... 41          3.11.1. Transient sympathectomy …………………………………………………………………………… 42          3.11.2. Permanent sympathectomy…………………………………………………………………………. 42          3.12. Statistics              3.12.1. P‐value………………………………………………………………………………………………………. 43              3.12.2. Mann‐whitney test & Kruskal‐wallis test……………………………………………………. 43     

x

  4.  CHAPTER IV RESULTS 

     4.1 Neurological experiments 

       4.1.1. Transient sympathectomy partially protects Balb/c mice from antibody‐induced                   arthritis……………………………………………………………………………………………………………  44       4.1.2. Permanent symathectomy protects Balb/c mice from antibody‐induced                       arthritis……………………………………………………………………………………………………..……  47         4.1.3. Nicotinic acetylcholine receptor‐α7 (α7nAChR) homozygous knockout mice were                   completely resistant to antibody‐induced arthritis…………………………………………….. 48         4.1.4. Capsaicin does not provide permanent sympathectomy in Balb/c mice…………… 50         4.1.5. Substance P knockout mice were partially protected from antibody‐induced                    arthritis……………………………………………………………………………………………………........... 52       4.2 Role of macrophage inhibitory factor in K/BxN serum‐induce arthritis        4.2.1. MIF‐/‐mice are protected from antibody induced arthritis…………………………………. 53        4.2.2. MIF deficiency reduced joint inflammation and cartilage destruction………………. 55        4.2.3. Reconstitution of MIF‐/‐ mice with naive macrophages restored susceptibility to                   arthritis………………………………………………………………………………………………………………. 57      4.3 Collagenase‐3 (MMP13) deficiency protects from antibody‐induced arthritis        4.3.1. An Essential role for MMP13 in K/BxN antibody‐induced arthritis…………………….. 59       4.3.2. Joint inflammation and cartilage destruction in MMP13‐/‐ mice………………………… 60       4.3.3. MMP13‐/‐ mice display reduced numbers of infiltrating neutrophil and increased                 number of monocytes in the joints………………………………………………………………………. 64         4.4. Role of redox reactions in RA antibody‐induced arthritis        4.4.1. In the K/BxN model phytol‐treated mice show an early onset of arthritis…………. 65        4.4.2. Increasing the number of R–SH groups on control neutrophils increased the                   arthritis………………………………………………………………………………………………………………. 66        4.4.3. No change of surface thiol levels on monocytes………………………………………………… 67        4.4.4. Measurement of intracellular ROS in neutrophils……………………………………………… 68        4.4.5. Measurement of intracellular ROS in monocytes………………………………………………. 69        4.4.6. Number of neutrohils increased after phytol treatment……………………………………. 70        4.4.7. No change in the levels of surface thiol in young and old KBN and BN mice……… 70    4.5. MCP‐1 antagonist treatment does not protect mice from antibody‐induced              arthritis…………………………………………………………………………………………………………………… 71    4.6. DBA mt FvB mice are not protected from antibody‐induced arthritis…………………… 72     4.7. Soluble CD21 and CD23 concentration in autoimmune diseases 4.7.1. Antiphospholipid syndrome patients display reduced titers of soluble                  CD21 in their sera irrespective of circulating anti‐beta‐2‐glycoprotein‐                      Autoantibodies…………………………………………………………………………………………………....75        4.7.2. Soluble CD21 levels in Autoimmune Lymphoproliferative Syndrome …………….. 77        4.7.3. Soluble CD21 levels in Vaccinated patients sera samples………………………………… 78  4.7.4. Decreased levels of sCD21 and sCD23 in patients with insulin dependent                Diabetes Mellitus

xi

4.7.4.1. Levels of serum soluble CD21 are decreased in sera of patients with diabetes                         type I but not with diabetes type II…………………………………………….…….….…… 79           4.7.4.2. Levels of Serum soluble CD23 levels in sera of patients with Diabetes type I                          are decreased but not with diabetes type II…………………………………….…….…. 80           4.7.4.3. Decreased levels of plasma sCD21 after proinsulin treatment in diabetic                         obese patients……………………………………………………………………………………….… 81           4.7.4.4. Increased levels of plasma sCD23 after proinsulin treatment in diabetic obese                          patients…………………………………………………………………………………………….………82               4.7.5. Decreased levels of sCD21 and sCD23 in blood of patients with Systemic                   Juvenile Arthritis, Polyarticular Juvenile Arthritis and Pauciarticular                   Juvenile Arthritis          4.7.5.1. Low levels of soluble CD21 in plasma of patients with JA………………………... 84          4.7.5.2. Low levels of soluble CD23 in plasma of patients with JA…………………………. 85           4.7.5.3. Plasma sCD23 but not sCD21 levels correlate with age in healthy donors… 86  4.7.5.4. Plasma sCD21and sCD23 levels decline with age in JA……………………………… 87          4.7.5.6. Blood granulocytes were significantly increased in S‐JA patients compared                         with control and O‐JA and P‐JA patients……………………………………………………. 89  4.7.5.7. JA patients in remission showed increased sCD23 levels…………………………. 90  5. CHAPTER V DISCUSSION 

         5.1 The sympathetic nervous system and antibody‐induced arthritis……………………… 93         5.2. Macrophage inhibitory factor in antibody‐induced arthritis…………………………….. 96         5.3. MMP 13 (collagenase‐3) deficiency protects from antibody‐induced arthritis…. 97         5.4. Role of redox‐regulations in antibody‐induced arthritis …………………………………… 99         5.5. An antagonist of monocyte chemoattractant protein 1 (MCP‐1) did not inhibit               arthritis in the K/BxN model……………………………………………………………………………… 100          5.6. DBA mt FvB mice are not protected from antibody‐induced arthritis………………. 101         5.7. Role of CD21 and CD23 in autoimmune disorders               5.7.1. Antiphospholipid syndrome……………………………………………………………………….103  5.7.2. Soluble CD21 levels in autoimmune lymphoproliferative syndrome………… 104               5.7.3. Diabetes……………………………………………………………………………………………………. 105                5.7.4. Juvenile arthritis………………………………………………………………………………………...106  

  6. CHAPTER VI SUMMARY………………………………………………………………………… 109 

  7.  Zusammenfassung……………………………………………………………………………….. 113 

  8.   References………………………………………………………………………………………………………….. 117 

  9.  Lebenslauf……………………………………………………………………………………………. 133 

- 1 -

CHAPTER‐I

                                                INTRODUCTION 

1. Human Immune system 

An  immune  system  can  be  divided  into  two  related  activities‐recognition  and  response.  Once  a 

foreign organism has been recognized,  the  immune system enlists the participation of a variety of 

cells (T cells, B cells, NK cells, helper cells, suppressor cells, macrophages, etc) and molecules to an 

appropriate response, to eliminate or neutralize the invading organism. 

The state of protection from infectious disease has both specific (adaptive immune system) and non 

specific (innate  immune system) components. The nonspecific components,  innate  immunity, are a 

set of disease  resistance mechanisms  that are not  specific  to  the particular pathogen. Phagocytic 

cells such as macrophages, play an  important role  in many aspects of  innate  immunity. In contrast, 

the  specific  components,  adaptive  immunity,  display  a  high  degree  of  specificity  as well  as  the 

remarkable property of ‘memory’. 

There  is  an  adaptive  immune  response  against  an  antigen within  five or  six days  after  the  initial 

exposure to that antigen. Exposure to the same antigen sometime in the future results in a memory 

response,  the  immune  response  to  the  second  challenge  occurs more  quickly  than  the  first,  is 

stronger, and often  is more effective  in neutralizing and clearing  the pathogen. The major cellular 

agents of adaptive immunity are lymphocytes and the antibodies. 

Adaptive and innate immunity do not operate independently of each other; they function as a highly 

interactive  and  cooperative  system,  producing  a  total  response more  effective  than  either  could 

alone.  There is evidence that both the arms of immunity are highly inter‐connected and an efficient 

immune response against a particular antigen requires both the arms of immunity. 

The organs of  the  immune  system are positioned  throughout  the body. They are  called  lymphoid 

organ because they are home to lymphocytes, small while blood cells that are the key players in the 

immune  system. The  lymphoid organs are boldly classified as primary  (bone marrow and  thymus) 

- 2 -

and  secondary  lymphoid  organs  (spleen,  lymph  nodes,  and  lymphatic  vessels).  Primary  lymphoid 

organs provide appropriate microenvironments for the development and maturation of lymphocytes 

while secondary lymphoid organs trap the antigen from the defined tissues or from vascular spaces 

and are site where mature lymphocytes can interact effectively with antigen. 

1.1 Hematopoiesis 

Hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow and have the unique ability to give rise 

to  all  of  the  different  mature  blood  cell  types.  The  stem  cells  produce  hemocytoblasts  and 

differentiate into the preccursors of all the other types of cells.  

The hematopoeitic system can also be divided into lymphoid and myeloid cells. Lymphoid progenitor 

cells gives rise to the lymphocytes (B and T cells). B lymphocytes, which when activated differentiate 

into plasma cells that secrete antibodies. There are two main classes of T cells Cytotoxic T cells killing 

cells infected with viruses and T cells that activate other cells such as B cells and macrophages. While 

the myeloid progenitor is the precursor of the granulocytes, macrophages and mast cells. 

Hemocytoblasts mature into three types of blood cells: erythrocytes (RBCs), leukocytes (WBCs) and 

thrombocytes  (platelets).  The  leukocytes  are  further  subdivided  into  granulocytes  with  large 

granules  in  the  cytoplasm  and  agranulocytes  without  granules.  The  granulocytes  consists  of 

neutrophils,  eosinophils  and basophils.  The  agarulocytes  are  the  lymphocytes  (B  and  T  cells)  and 

monocytes. 

- 3 -

 

        Hematopoietic stem cells produce cells in blood and  lymph

Adapted from Biology of the Immune System, JAMA 278 (22)

- 4 -

1.2. Innate Immunity vs Adaptive Immunity 

The  immune  system  is  typically  divided  into  two  categories‐innate  and  adaptive‐although  these 

distinctions are not mutually exclusive. 

1.2.1 Innate immunity 

Innate  immunity  refers  to  nonspecific  defense mechanisms  that  come  into  play  immediately  or 

within hours of an antigen's appearance  in  the body. These mechanisms  include physical barriers 

such as  the  skin, chemicals  in  the blood, and  immune  system cells  that attack  foreign cells  in  the 

body. The innate immune response is activated by chemical properties of the antigen. 

1.2.2 Adaptive immunity 

Adaptive  immunity  refers  to antigen‐specific  immune  response. The adaptive  immune  response  is 

more complex than the innate. The antigen first must be processed and recognized. Once an antigen 

has  been  recognized,  the  adaptive  immune  system  creates  an  army  of  immune  cells  specifically 

designed  to  attack  that  antigen. Adaptive  immunity  also  includes  a  "memory"  that makes  future 

responses against a specific antigen more efficient. 

Cells that make up the adaptive  (specific)  immune system  include the B and T  lymphocytes.  After 

exposure to antigen, B cells differentiate into plasma cells whose primary function is the production 

of antibodies.  Similarly, T cells can differentiate  into either T cytotoxic (Tc) or T helper (Th) cells of 

which there are two types Th1 and Th2 cells. Specificity on the adaptive immune response resides in 

the antigen receptors on T and B cells, the TCR and BCR, respectively.

There are two major types of adaptive immune responses: 

1. humoral  immunity:  humoral  immunity  involves  the  production  of  antibody molecules  in 

response to an antigen and is mediated by B‐lymphocytes. 

2. Cell‐mediated  immunity:  the  second  class of adaptive  immune  response, activated T  cells 

react directly against a  foreign antigen  that  is presented  to  them on  the surface of a host 

cell. The T cell, for example, might kill a virus‐infected host cell that has viral antigens on its 

- 5 -

surface, thereby eliminating the infected cell before the virus has had a chance to replicate. 

In other cases, the T cell produces signal molecules that activate macrophages to destroy the 

invading microbes that they have phagocytosed. 

Overview of the Immune System 

1.3. Complement System 

Complement  is involved in the eradication of microorganisms and immune complexes, as well as in 

inflammation  and  immunoregulation.  The  complement  system  comprises  a  series  of  20  serum 

glycoproteins that are activated  in a cascade sequence, with pro enzymes that undergo sequential 

proteolytic cleavage.  

Two  main  pathways  of  complement  activation  exists,  termed  the  classical  pathway,  and  the 

alternative pathway. These converge in the activation of C3, both forming individual C3 convertase. 

- 6 -

This  leads  to  the  final  common  pathway with  the  assembly  of  C5‐C9  into  the membrane  attack 

complex  (MAC)  which  forms  a  ‘doughnut  like’  transmembrane  channel  leading  to  cell  lysis  by 

osmotic shock. 

1.3.1. Activation of the Classical Pathway  

1.3.1.1. C1 activation 

C1, a multi‐subunit protein containing  three different proteins  (C1q, C1r and C1s), binds  to  the Fc 

region of IgG and IgM antibody molecules that have bound to antigen. C1 binding does not occur to 

antibodies that have not bound to antigen and binding requires calcium and magnesium  ions. The 

binding of C1 to antibodies is via C1q and C1q must cross link at least two antibody molecules before 

it is firmly fixed. The binding of C1q results in the activation of C1r which  in turns activate C1s. The 

result  is  the  formation of an activated  ‘C1qrs’, which  is an enzyme  that cleaves C4  into  fragments 

C4a and C4b. 

1.3.1.2 C4 and C2 activation (generation of C3 convertase) 

The C4b fragment binds to the membrane and the C4a fragment  is released  into the environment. 

Activated C1qrs also cleaves C2 into C2a and C2b. C2a binds to the membrane‐ associated C4b, and 

C2b is released into the microenvironment. The resulting C4bC2a complex is a C3 convertase, which 

cleaves C3 into C3a and C3b.  

1.3.1.3. C3 activation (generation of C5 convertase) 

C3b  binds  to  the  membrane  in  association  with  C4b  and  C2a,  and  C3a  is  released  into  the 

microenvironment.  The  resulting  C4bC2aC3b  complex  is  a  C5  convertase.  The  generation  of  C5 

convertase is the end product of the classical pathway.  

 1.3.2. Activation of alternative pathway 

- 7 -

The alternative pathway  is  initiated by  the  low‐grade activation of C3 by hydrolysed C3  (C3  (H2O)) 

and activated  factor B  (Bb). The activated C3b binds  factor B  (B), which  is then cleaved  into Bb by 

factor D (D) to form the alternative pathway C3 convertase, C3bBb. Once C3b is attached to the cell 

surface,  the amplification  loop consisting of  the alternative‐pathway components  is activated, and 

the C3‐convertase enzymes cleave many molecules of C3 to C3b, which bind covalently around the 

site of complement activation. 

1.3.3. Initiation of Lectin pathway 

This pathway is similar to the classical pathway but gets activated by mannose binding lectin (MBLs). 

The  lectin  pathway  is  a  subdivision  of  the  classical  pathways  and  it  actiavtes  classical  pathway 

without using the C1q complex. 

1.3.4 Membrane attack complex formation 

C5  convertase  from  the  classical  or  lectin  pathway  (C4b2a3b)  or  alternative  pathway  (C3bBb3b) 

cleaves C5 into C5a and C5b. C5a remains in the fluid phase and the C5b rapidly associates with C6 

and C7 and inserts into the membrane. Subsequently C8 binds, followed by several molecules of C9. 

The C9 molecules form a pore  in the membrane through which the cellular content  leaks and  lysis 

occurs. 

Lysis  is  not  an  enzymatic    process,  it  acts  via  physical  damage  to  the membrane.  The  complex 

consisting of C5bC6C7C8C9 is referred to as the membrane attack complex (MAC). C5a generated in 

the  lectin pathway has  several potent biological activities.  It  is  the most potent anaphylotoxin.  In 

addition, it is a chemotactic factor for neutrophils and stimulates the respiratory burst in them and it 

stimulates inflammatory cytokine production by macrophages. 

1.3.5. Regulation of complement activation 

1.3.5.1 Complement Receptor 1 (CR1 or CD35) 

- 8 -

Complement  receptor  type  1  (CR1,  CD35,  C3b/C4b  receptor)  is  a  190  kDa  transmembrane 

glycoprotein  expressed  on  several  circulating  cells,  including  erythrocytes,  neutrophils, 

monocytes/macrophages,  B  lymphocytes,  and  some  T  lymphocytes,  as well  as  specific  epithelial 

cells. The CR1 is encoded along with CR2 at the single locus Cr2 on chromosome 1 in mice. The CR1 

and CR2 consist of multiple repeating structures referred as short consensus repeats (SCR). The SCR 

consists of conserved units of 60‐70 amino acids. CR2 consists of 16 SCR, a transmembrane region 

and a 35 amino acid cytoplasmic tail, whereas CR1 includes all of CR2 and an additional 6 SCR on its 

N‐terminal region. Just like factor H, CR1 acts as a cofactor and promotes cleavage of C3b and iC3by 

factor  I    (Kinoshita  et  al.,  1985; Molina  et  al.,  1994).  CR1  has moderate  affinity  for  C3b  but  low 

affinity for iC3b. It does not bind to the further metabolites of iC3b. CR1 also bind to the C4b. It helps 

the  phagocytes  to  generate  opsonized  particles,  enhances  antigen  specific  B  cells  endocytic 

responses and clearance of antigen‐antibody complex by erythrocytes.   

1.3.5.2 Complement Receptor 2 

Human CD21 (complement receptor type 2, CR2)  is a 145‐kDa type 1 transmembrane glycoprotein 

that binds the surface‐fixed cleavage fragments of C3,  iC3b/ C3d/ C3dg and serves as the receptor 

for Epstein–Barr virus  (EBV) on B  lymphocytes  (Fingeroth et al., 1984; Weis et al., 1984). CD21  is 

comprised of a 954 aa extracellular domain, a 24 aa transmembrane domain and a 34 aa cytoplasmic 

domain.  The  extracellular  domain  is  composed  of  15  or  16  tandemly  repeated  short  consensus 

repeats (SCR) sequences which are homologous to those described in other C3/C4‐binding proteins 

(Ahearn and Fearon, 1989). 

CD21 has initially been described as the receptor for the C3dg fragment of C3. The binding site is less 

accessible  in the native C3 molecule and  in the C3b fragment so that the  latter molecules exhibit a 

lower affinity for CD21 than C3bi, C3dg and C3d (Kalli et al., 1991). CD21 also serves as the receptor 

for EBV which binds to CD21 through  its envelope glycoprotein gp350/220. Kaufman‐Paterson et al 

demonstrate  that  human  T  cell  lines  and  human  thymocytes may  be  infected with  EBV  in  vitro, 

which relates to the expression of CD21 by these cells  (Kelleher et al., 1995)(Kaufman‐Paterson et 

- 9 -

al., 1995). An additional  ligand  for CD21  is CD23, a type  II  transmembrane protein expressed on a 

variety of hemopoietic  cell  types  that  serves  as  the  low‐affinity  receptor  for  IgE. Cleavage of  the 

membrane receptor generates soluble forms of CD23 that are endowed with ‘cytokine‐ like’ activity 

(Delespesse et al., 1991). Fluorescent  liposomes carrying CD23 were shown  to  interact specifically 

with CD21 on B cells, some T cells, follicular dendritic cells (Aubry et al., 1992; Pochon et al., 1992). 

Human  CD21  is  expressed  by B  lymphocytes  and B  lymphoblastoid  cell  lines,  human  thymocytes 

(Tsoukas  and  Lambris,  1988)  a  fraction  of  human  T  lymphocytes  (Fischer  et  al.,  1991),  certain 

leukemia T  cell  lines,  the pharyngeal  and  cervical  epithelium  and by  follicular dendritic  cells. The 

level of expression of CD21 is developmentally regulated: it is highest on mature B lymphocytes and 

on a  subpopulation of  immature blastic  thymocytes. A major  function of CD21  is  to contribute  to 

human B cell activation and proliferation. On the surface of B lymphocytes, CD21 was found to form 

a complex with the membrane proteins CD19, TAPA‐1 and Leu‐13 (Bradbury et al., 1992). 

Bonnefoy et al observed  secondary cellular  responses mediated  through  interaction of CD21 with 

membrane and soluble CD23 had been demonstrated (Bonnefoy et al., 1995a). CD21/CD23 pairing 

occurred between membrane forms of the receptors and were shown to be  involved  in homotypic 

adhesion of B cells. Certain biological properties of soluble CD23 had been attributed to interaction 

with CD21 on B cells. Thus, a subset of anti‐CD21 monoclonal antibodies has been shown to behave 

in a similar fashion as soluble CD23  in decreasing the occurrence of apoptosis  in germinal centre B 

cells and in enhancing IL‐4‐induced IgE production by blood mononuclear cells. 

 

 

 

 

- 10 -

Overview of complement pathway 

- 11 -

1.4. Autoimmunity  

The concept of autoimmunity was first predicted by Nobel Laureate Paul Ehrlich at the start of the 

twentieth century, and he described it as 'horror autotoxicus'. His experiments led him to conclude 

that the  immune system  is normally focused on responding to foreign materials and has an  inbuilt 

tendency to avoid attacking self tissues. But when this process goes wrong, the immune system can 

attack self tissues resulting in autoimmune disease. The perplexing issue of what allows the immune 

system to attack self tissues is a continuing focus of research. 

In the past, autoimmune diseases have been studied on the basis of the organ affected, but in recent 

years the focus has switched to a more cross‐disciplinary approach with a view to providing a better 

understanding of the common mechanisms underlying the pathogenesis of these diseases. 

Autoimmunity  is  caused  by  an  adaptive  immune  response  against  "self"  antigen.  The  random 

generation of many diverse TCR and BCR makes autoimmunity possible. Clonal deletion and anergy 

of self‐specific lymphocytes greatly reduces but does not eliminate the possibility of low affinity self‐

specific  responses.  Transient  autoimmune  responses  are  common  but  usually  cause  no  lasting 

damage. Because self antigens are continually present in the body, when autoimmune responses are 

prolonged the resulting tissue damage can be life‐threatening. Risk factors for autoimmune disease 

include the presence of certain HLA alleles, sex hormone levels, infection, and other environmental 

factors. Autoimmune diseases can be caused by antibodies or T cells and may be organ‐specific or 

systemic.  

Autoimmune diseases are initiated by activation of antigen‐specific T cells. Th2 cells activate B cells 

to  make  autoantibodies,  which  (by  activating  complement)  damage  tissues  directly  or  initiate 

prolonged inflammation. CTL and macrophages activated by Th1 cells are directly cytotoxic and also 

promote  inflammation.  The  damage  done  by  some  autoimmune  responses  is  limited  to  a  single 

- 12 -

organ, while other diseases  cause  systemic damage. The events  that  initiate  specific autoimmune 

diseases are not known. 

Autoimmunity  can  be  classified  into  two  categories:  organ  specific  autoimmune  disease  and 

systemic autoimmune disease. Organ‐specific autoimmune diseases  involve  specific organs of  the 

body  in which  the  target  auto‐antigen  is  found.  Examples of organ‐specific  autoimmune diseases 

include  type  1  or  insulin‐dependent  diabetes  (insulin  secreting  cells  of  the  pancreas),  thyroiditis 

(thyroid), multiple sclerosis (myelin sheath of the nervous system; brain) and autoimmune gastritis; 

which is the underlying cause of pernicious anaemia (acid secreting cells of the stomach). In systemic 

autoimmune disease tissue injury and inflammation occur in multiple sites in organs without relation 

to  their  antigenic makeup  and  are usually  intitiated by  vascular  leakage  and  tissue  deposition of 

circulating autologous  immune complexes. Sytemic autoimmune diseases  include diseases such as 

systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis, scleroderma and polymyositis.(Table) 

Organ specific autoimmune disease 

               Disease           Self Antigen           Immune response 

Addision disease  Adrenal cells  Autoantibodies 

Autoimmune hemolytic disease  RBC membrane proteins  Autoantibodies 

Grave’s Disease  Thyroid  stimulating  hormone 

receptor 

Autoantibodies 

Hashimoto’s thyroiditis  Thyroid proteins and cells  TDTH cells, autoantibodies 

Insuline dependent diabetes  Pancreatic beta cells  Autoantibodies 

Myasthenia gravis  Acetylcholine receptor  Autoantibodies (blocking) 

Myocardial infarction  Heart  Autoantibodies 

  

Systemic autoimmune disease 

        Disease          Self Antigen        Immune response 

           SLE  DNA, nuclear protein, RBC  and 

platelet membrane 

Autoantibodies,  mmune 

complex 

Multiple sclerosis  Brain or while matter  TDTH and Tc cells, autoantibodies 

Rheumatoid arthritis  Connective tissue, IgG  Autoantibodies,  immune 

complexes 

- 13 -

Scleroderma  Heart,  lungs,  kidney, 

gastrointestinal tract 

Autoantibodies 

Sjogren’s syndrome  Salivery  gland,  liver,  kidney, 

thyroid 

Autoantibody 

 

1.4.1. The dimensions of the autoimmune diseases  

Autoimmune diseases are a major threat to the health of worldwide. Understating, preventing and 

managing chronic conditions are  important steps for maintaining satisfactory health. Many chronic 

autoimmune diseases affect women more than the men. 

Female‐Male ratios in autoimmune diseases.   

Hashimoto’s syndrome/hypothyroiditis                                   10:1 

System lupus erythematosus                                    9:1 

Sjoegren’s Syndrome                                   9:1 

Antiphospholipid syndrome                                   9:1 

Autoimmune hepaititis                                   8:1 

Primary biliary cirrhosis                                  9:1 

Grave’s disease                                  7:1 

Scleroderma                                  3:1 

Rheumatoid arthritis                                  2:5 

Antiphospholipd syndrome‐primary                                 2:1      

Autoimmune thromobocytopenia purpura                                2:1 

Multiple sclerosis                                2:1  

Myasthenia gravis                                2:1 

 

 

 

 

- 14 -

1.5. Rheumatoid Arthritis 

Rheumatoid  arthritis  (RA)  which  affect  approximately  1%  of  the  population  worldwide  and 

disproportionately affects woman, comprise a heterogenous group of poorly understood disorders 

(Davidson and Diamond, 2001; Marrack et al., 2001). It  is a chronic systemic  inflammatory disease, 

which predominately affects  the  joints. The  symptoms  include pain,  swelling,  stiffness and  loss of 

function of the joints. The disease often affects the writs and fingers joints closest to the hand and 

occurs  in a symmetrical pattern  involving both  the  limbs.  It can also affect other part of  the body 

besides the joints with symptoms of fatigue, occasional fever and malaise. 

   

 

Courtesy of J. Cush 2002 

The etiology of RA  is  still unknown. Even a basic question whether  it  is primarily an autoimmune 

disease, or an inflammatory response/ to infection, is yet to be resolved. Genetic predisposition has 

been implicated, while failure to demonstrate Mendelian inheritance means multiple genetic factors 

may  be  involved.  In  human  the  MHC  class  II  HLA‐DR4  allele  is  shown  to  be  associated  with 

development and severity of RA. As the only known function of DR  is to present peptide to CD4 T 

cells this genetic association clearly indicates a role for T cells in the disease. It could be in defining 

the  repertoire of antigen  receptors or  in presentation of autoantigens. However,  the autoantigen 

recognized by autoreactive T cells is not known. The role of T‐lymphocytes in the pathology of RA is 

always controversial.  Firestein and Zvaifler, (Firestein and Zvaifler, 1990) suggested that T cells may 

- 15 -

not be important in perpetuating the disease at late stages based on the lack of nay any evidence of 

T cells proliferation in the synovium and low levels of T cells derived cytokines in the inflamed joint. 

This is further supported by failed therapeutic trials targeting T cells functions. 

Then,  new  animal  models  have  shifted  the  focus  to  B  cell‐secreted  autoantibodies  and  innate 

immunity mediators (Benoist and Mathis, 2000). The current concept being that while T and B cells 

are  important  in  the  initiation of RA  the pathogenesity  is mostly mediated by autoantibodies and 

innate  immune mediators. The  role of proinflammatory cytokines such as  IL‐1 and TNF α are well 

known and are a current target in RA therapy. 

          Normal Joint 

    

                              

 

     

                               

 

 

 

 

 

- 16 -

1.6. Autoimmune diseases 

1.6.1. Animal models of rheumatoid arthritis 

Experimental  animal  models  of  arthritis,  including  type  II  collagen‐induced  arthritis,  adjuvant 

arthritis, pristane‐induced arthritis, streptococcal cell wall‐induced arthritis and the K/BxN model of 

arthritis  have  contributed  to  recent  advances  in  the  understanding  of  the  immunopathology  of 

arthritis. 

1.6.1.1. Type II collagen‐induced arthritis 

The  autoimmune  targets  in  RA  are  not  known  but  autoantibodies  against  various  joint‐related 

epitopes  are  detected  in  sera.  Antibodies  against  epitopes  modified  by  citrullination  show  the 

highest specificity for RA and can be detected very early  in the disease course (Masson‐Bessiere et 

al.,  2001;  Rantapaa‐Dahlqvist  et  al.,  2003;  Schellekens  et  al.,  1998).  Antibodies  against  type  II 

collagen  (CII)  occur  in  a  subset  of  RA,  and  CII‐specific  B  and  T‐cells  have  been  identified  in 

rheumatoid synovium and synovial fluid (Burkhardt et al., 2002; Cook et al., 1999; Kim et al., 1999; 

Londei et al., 1989; Rudolphi et al., 1997; Tarkowski et al., 1989). 

Immunization of mice with CII  leads to the development of arthritis, the collagen‐induced arthritis 

(CIA) model  for RA. CII‐specific  activation of both  T  and B  cells  is  critical  for  the development of 

arthritis, and the transfer of both rodent (Stuart and Dixon, 1983) and human (Wooley et al., 1984)  

serum with CII‐specific antibodies  induces arthritis  in mice. Monoclonal CII‐specific autoantibodies 

bind cartilage  in vivo and  induce arthritis (Holmdahl et al., 1986); the  injection of  large amounts of 

several of such mAbs  in cocktails  induces severe arthritis (Nandakumar et al., 2003b; Terato et al., 

1992).  Collagen‐antibody‐induced  arthritis  (CAIA)  is  an  inflammation  that  is  dependent  on  Fc 

receptor and complement, involving the infiltration of both neutrophils and macrophages (Hietala et 

al., 2004; Nandakumar et al., 2003a; Nandakumar et al., 2003b; Watson et al., 1987). 

 

- 17 -

1.6.1.2. Adjuvant arthritis 

It was  initially demonstrated  in suceptibale strains of  rats,  that  the  injection of Freund’s complete 

adjuvant  (FCA),  a  water‐in‐oil  emulsion  containing  mycobacteria,  causes  a  chronic  polyarthritis 

(Pearson, 1956). A single  intrademal  injection of adjuvant  into  the  footpad or  tail of  rat  induces a 

severe arthropathy  begining within 2 weeks involving the wrist, ankle, paws and caudal part of the 

spine and tail. The arthropathy ultimately consists of synovitis with villus formation, pannus eroding 

cartilage and bone, periostitis with new bone  formation, and an accompanying  inflammation and 

fibrosis of the periarticular tissues. 

1.6.1.3 Pristane‐induced arthritis 

Two weeks after a single intradermal injection of 150 microliters of pristane, rats develop severe and 

chronic arthritis. The  inflammation  is restricted to the  joints and  involves pannus formation, major 

histocompatibility  complex  (MHC)  class  II  expression,  and  T  lymphocyte  infiltration.  The  initial 

development as well as the chronic stage of pristane‐induced arthritis  is ameliorated by treatment 

with  antibodies  to  the  alpha  beta‐T‐cell  receptor  showing  that  the  disease  is  T  cell‐dependent. 

Increased levels of interleukins in serum was seen after pristane injection but not during the chronic 

stage of arthritis. Joint erosions were accompanied by elevated serum levels of cartilage oligomeric 

matrix protein. 

1.6.1.4. Streptococcal cell wall‐induced arthritis 

Several  groups  have  described  the  arthritogenic  properties  of  bacterial  preparations.  The  best 

studied  are  the  peptidogylcan‐carbohydrate  polymers  of  group  A  streptococcal  cell  wall.  This 

fragment  induces  a  peripheral  arthritis,  particularly  in  Lewis  female  rats.  Histologically,  it  is 

characterized by  a  synovial  thickening, with  surface  fibrin,  thickening of  the  synovial  lining  layer, 

polymorphonuclear  leucocytes  exudation  into  the  joint  fluid,  and  predominately  CD4+  T  cells 

mononuclear  cell  infiltrate. Ultimately,  there  is erosion of  cartilage  and bone,  so  that  the  clinical 

- 18 -

features  of  this model  do  give  resonable  approximation  to  the  histopathological  appearance  of 

human RA. 

1.6.1.5. K/BxN murine model of RA 

A  spontaneous  murine  disease  with  most  of  the  characteristics  of  human  RA  was  fortuitously 

discovered by breeding the KRN TCR transgenic, mouse specific for bovine RNase (42‐56)/ I‐Ak, to the 

nonbese diabetic (NOD) mouse strain (Kouskoff, V et al., 1996). The F1 generation between KRN and 

NOD  (K/BxN)  spontaneously develops  a progressive  joint‐specific  autoimmune disease between 3 

and 5 weeks of age, characterized by the rapid symmetrical onset of peripheral  joint  inflammation 

that  is  restricted primarily  to  the  joints of  the  front and  rear  limbs. Pathology of disease  in K/BxN 

mice is similar to human RA with: 

1) Pannus formation 

2) Synovial hyperplasia 

3) Increased synovial fluid volume 

4) Cellular infiltration  

5) Chronic remodeling of cartilage and bone  

6) Elevated expression of proinflammatory cytokines  

7) Autoreactive antibody production 

One  difference  between  the  the  K/BxN  model  and  human  RA  is  the  absence  of  detectable 

rheumatoid factor in the K/BxN mice (Kouskoff et al., 1996), although 20‐30% of human RA patients 

are  also  negative  for  serum  rheumatoid  factor  (Chen  et  al.,  1987).  Immune  complexes    of 

rheumatoid factor‐IgG and potentially other Ab‐Ag immune complexes can be found in the joints of 

human  RA  patients  (Winchester  et  al.,  1970),  but  their  role  in  joint  pathology  and  disease 

progression has yet to be ascertained. 

- 19 -

In  the K/BxN model, KRN  transgenic  cells  recognize a mouse  (self derived) peptide bound  to  I‐Ak, 

presented by B cells and other MHC class II‐positive APCs (Ji et al., 1999). The autoantigen for both 

K/BxN arthritogenic  Ig and KRN T‐cells was  identified as glucose‐6‐phosphate  isomerase  (GPI), an 

ubiquitous  cytoplasmic  enzyme  that  catalyzes  the  interconversion  of  fructose‐6‐phosphate  and 

glucose‐6‐phosphate during glycolysis. KRN TCR has dual ability to recognize RNase (42‐56)/ I‐Ak and 

GPI (282‐294)/ I‐Ag7  (Basu et al., 2000; Basu et al., 2001). A working model of K/BxN mice postulates 

that  GPI‐specific  B  cells  endocytose  GPI  via  surface  Ig  receptors  and  present  the  I‐Ag7  restricted 

epitope to incompletely tolerized CD4+ KRN T cells, which in turns provide specific help in maturation 

and  Ig  isotype  switching  leading  to  production  of  autoantibodies  (Ji  et  al.,  1999;  Kouskoff  et  al., 

1996; Matsumoto et al., 1999) and subsequently induction of joint inflammation. 

Transfer  of  serum  or  purified  Ig  from  arthritic  K/BxN mice  induces  a  synchronized  joint‐specific 

inflammatory reaction that mimic the K/BxN disease (Ji et al., 1999), indicating that arthritogenic Ig 

can  induce  synovitis  and  rheumatoid‐like  arthritic  disease.  The  disease  induced  by  single 

administration  of  serum  eventually  resolves,  unless  arthritogenic  Ig  is  reputedly  transferred  into 

recipients  (Ji  et  al.,  1999).  The  development  of  an  easily  inducible  model  of  RA  with  a  rapid, 

synchronized onset facilitates the study of the pathogenic mechanisms  involved  in the  initiation of 

joint specific autoimmunity.   

                                          

 

                                        

 

 

 

 

 

- 20 -

                                       K/BxN Mice Model 

BN mice K/BxN mice

 

 

 

 

- 21 -

1.7. Juvenile Arthritis 

Juvenile  arthritis  (JA)  is  also  known  as  juvenile  rheumatoid  arthritis  (JRA)  and  occurs  with  a 

prevalence of 100‐400/100,000 (Gare, 1998). The characteristic symptoms of JA are chronic pain and 

stiffness due to  inflammation of the joints, sometime resulting  in  irreversible joint damage, growth 

retardation  and  functional  disability.  The  disease  activity  is  generally  considered  to  be  T‐  cell 

mediated  (Panayi  et  al.,  2001)  although  the  contribution  of  B‐cells  is  debated    (Edwards  and 

Cambridge, 2001; Edwards et al., 1999). Complement activation in JA seems to be mediated by the 

alternative  pathway  (Aggarwal  et  al.,  2000)  although  activation  through  the  classical  pathway  is 

reported as well (Miller et al., 1986).  

Juvenile arthritis  (JA)  is a broad  term encompassing several disorders starting before  the age of 

16.  It  is  characterized by  arthritis  lasting more  than 6 weeks, of unknown etiology  and usually 

persisting for six months  initially. Of the various distinguishable clinical forms, oligoarticular JA  is 

the most frequent. It is characterised by an involvement of up to 4 joints during the first 6 months 

and is mostly observed in females. Polyarticular JA involves more than 4 joints from the beginning 

of  the  disease  and  can  be  subclassified  into  rheumatoid  factor  positive  or  negative  disease. 

Systemic onset JA (also called Still disease) usually  involves a polyarticular arthritis accompanied 

by  systemic  symptoms  like  a  spiking  fever  for  more  than  14  days,  a  skin  rash, 

hepatosplenomegaly, serositis (or pericarditis) and lymphadenopathy. The prognosis of JA may be 

complicated by the presence of uveitis, associated with an insidious progression. In systemic JA as 

well as in some polyarticular forms, inflammation may continue into adulthood.  

1.8 Diabetes 

Diabetes  is  an  epidemic health problem,  affecting more  than 150 million people worldwide.  This 

number  is  expected  to  double  in  the  first  decades  of  the  third  millennium.  Insulin‐dependent 

diabetes mellitus (type 1) diabetes is generally accepted to be an organ specific autoimmune disease 

characterized by a mononuclear  infiltrate within  the Langerhans  islet,  immunocytes activation and 

- 22 -

autoantibody  production  (Bach,  1994),  but  the mechanism  of  T  cell‐dependent  pancreatic  B‐cell 

destruction  is still not exactly understood. Antigen presenting cells  (APCs), which  include dendritic 

cells, macrophages, and B‐cells, play essential roles not only in the initiation of a protective immune 

response  against  pathogen  but  also  in  the  prevention  of  autoimmunity. While  Type  II  diabetes 

mellitus  is  strongly  associated with  various  changes  in  the  lymphocytes distribution  in peripheral 

blood; for example, T cell lymphocytosis (Chang and Shaio, 1995), T cell lymphopenia (Kimura et al., 

1998) and unchanged T cell subpopulation (Spooren et al., 1993). Some authors also suggest that, in 

diabetic patients, metabolic control influences lymphocytes distribution. 

Recent studies have demonstrated that immune markers on B‐cells like CD40, CD86 and T‐cells like 

CD4 and CD8, it is possible to predict the disease even years before the clinical onset (Honeyman et 

al., 1997).  In the  last few years,  intervention trials have also begun to prevent the development of 

type I diabetes at the stage of asymptomatic autoimmunity (Honeyman et al., 1997). However 5‐10 

years will be required before the effect of preventive procedures, using humoral and/or metabolic 

parameters as marker of progression to overt diabetes, are fully determined. This situation therefore 

creates  a  strong  need  for  identification  of  surrogate  immune markers  to  show‐term  effects  of 

manipulation of the autoimmune process, leading to the prevention of disease.  

1.9 Antiphospholipid syndrome 

The  antiphospholipid  syndrome  (APS)  is  characterized  by  the  presence  of  anti‐phospholipid 

autoantibodies which bind target molecules mainly via ß2‐GPI (beta‐2‐glycoprotein‐I), and/or  lupus 

anticoagulants,  associated  with  recurrent  fetal  loss,  thromboembolic  phenomena  and 

thrombocytopenia  (Galli  et  al.,  1990;  Sammaritano  and  Gharavi,  1992;  Shoenfeld,  2003).  The 

pathogenicity of anti ß2‐GPI antibodies was demonstrated by transfer into naive mice and rabbits as 

well as preventing the ß2‐GPI antibodies generation and disease by oral tolerance with ß2‐GPI (Blank 

et al., 1994; George et al., 1998).  It has been postulated that anti ß2‐GPI antibodies exert a direct 

pathogenic effect by interfering with homeostatic reactions occurring on the surface of platelets or 

vascular endothelial cells as well as placenta (Blank et al., 1991; Blank et al., 1998; Blank et al., 2002; 

- 23 -

Blank  et  al.,  1999; Meroni  et  al.,  2005).  The  factors  causing  production  of  anti  ß2‐GPI  remain 

unidentified, but one of the causes were shown to be infectious agents by molecular mimicry.  

 

1.10. Autoimmune lymphoproliferative syndrome (ALPS)  ALPS was first described by Canale and Smith in 1967. In most cases disease is ravelled early in the 

life,  usually  before  5  years  of  age.  ALPS  is  characterized  by  the  accumulation  of  a  polyclonal 

population of T cells called double‐negative T cells. These  lymphocytes display the marker common 

to  mature  T  cells,  CD3,  and  /β  T‐cell–antigen  receptors,  but  neither  the  CD4  nor  the  CD8 

coreceptors (CD3+ T‐cell receptor  /β+ CD4–CD8–). They normally account for less than 2 percent of 

peripheral  /β+ T  cells and are distinct  from  the double‐negative  thymocytes  in  the  cortex of  the 

thymus, which lack CD3 and T‐cell receptors for antigen. The double‐negative T cells in patients with 

ALPS are poorly responsive to mitogens and antigens and fail to produce growth and survival factors 

such as  interleukin‐2  (Fuss et al., 1997).  In Fas‐deficient MRL  lpr/lpr mice,  the  large population of 

double‐negative  T  cells  appears  to  originate  from  chronically  activated  CD8+  T  cells  that  down‐

regulate the expression of CD8 and fail to undergo apoptosis (Nagata and Suda, 1995).  In humans, 

double‐negative T cells also seem to be antigen‐exposed T cells that have escaped apoptosis.  

ALPS  is  classified  according  to  the underlying  genetic defect  (Rieux‐Laucat et  al., 2003).  In  type 0 

disease, homozygous  Fas mutations usually  cause a  complete deficiency of  the  Fas protein and a 

severe form of the disease (Kasahara et al., 1998). In ALPS type I, heterozygous Fas mutations (ALPS 

type Ia) (Jackson et al., 1999; Vaishnaw et al., 1999) or, more rarely, heterozygous mutations in the 

gene  for Fas  ligand  (ALPS  type  Ib)  (Wu et al., 1996) are usually associated with a partial defect  in 

apoptosis mediated by Fas and  its  ligand. ALPS type  II, which  is characterized by resistance to Fas‐

mediated  apoptosis  despite  the  presence  of  normal  Fas  ligand  and  Fas,  has  been  found  in  two 

patients with caspase 10 mutations  (Wang et al., 1999).  In ALPS type  III, Fas‐mediated apoptosis  is 

also normal in vitro, (Dianzani et al., 1997) and the genetic defect is unclear. Patients with ALPS type 

III may not have all four classic features of the syndrome‐lymphoproliferation, excessive numbers of 

- 24 -

double‐negative T  cells, hypergammaglobulinemia, and autoimmune manifestations.  (Fisher et al., 

1995; Rieux‐Laucat et al., 1995).  

 

1.11. Cellular abnormalities 

1.11.1. Antigen presenting cells 

The concept that exogenous antigen, possibly from an infectious agent(s), is responsible for initiating 

disease  in  RA,  is  an  area  of  controversy.  An  exogenous  arthritogenic  antigen(s)  has  not  been 

recognized  and  it may  be  possible  that  endogenous  antigen  is  capable  of  initiating  and  driving 

disease  processes.  Dendritic  cells  (DC)  are  termed  ‘professional  APCs’  and  have  been  shown  to 

accumulate  in rheumatoid synovial tissue (Zvaifler et al., 1985), where they differentiate under the 

influence of abundant monocytes and  fibroblast derived cytokines and express high  levels of MHC 

class  I  and  II    and  costimulatory  molecules.  Presentation  of  endogenous  DC‐derived  antigen, 

including MHC‐derived peptides, to low affinity, self reactive CD4+T cells under the influence of TNF‐

α and GM‐CSF has been demonstrated (Thomas et al., 1994). This event provides a model by which 

RA  could be  initiated  and  also  accounts  for  the  strong  association between RA  and MHC  class  II 

alleles  (Thomas and Lipsky, 1996). 

1.11.2. Macrophages   

Macrophages play a central role in the amplification of stimulatory signals nad tissue destruction in 

RA. Activated macrophages are  found  in  the  synovium, destructive pannus  tissue and  rheumatoid 

nodule (Highton et al., 1995). Both circulating and synovial macrophages produce large quantities of 

prostanoids and proinflammatory cytokines like IL1, IL‐6, IL‐10, 1L‐13, IL‐15, IL‐18 and TNFα and they 

are professional APCs. In the RA synovial environment, they are induced to upregulate Fc gamma RI 

and Fc gamma RII, important in the capture of immune complexes (Burmester et al., 1997). 

The  other  critical  role  of  synovial  macrophages  is  the  induction  and  perpetuation  of  local 

inflammatory changes  in the  joints. These occur  in the cartilage pannus  junction and are known to 

mediate cartilage and bone destruction through secretion of matrixmetalloproteases. 

- 25 -

1.11.3. Role of Cytokines in RA 

Cytokines  are    protein mediators,  now  known  to  be  involved  in  almost  all  important  biological 

processes, including cell growth and activation, inflammation, immunity, and differentiation. Thus, it 

is not surprising that they also have a role  in an autoimmune disease such as rheumatoid arthritis 

(RA),  in which there  is chronic  inflammation, with fibrosis and the eventual destruction of cartilage 

and bone.  

Analysis  of  cytokine‐mRNA  and‐protein  in  rheumatoid  arthritis  tissue  revealed  that  many 

proinflammatory  cytokines  such  as  TNFα,  IL‐1,  IL‐6,  GM‐CSF,  and  chemokines  such  as  IL‐8  are 

abundant in all patients regardless of therapy. This is compensated to some degree by the increased 

production of anti‐inflammatory cytokines such as IL‐10 and TGFα and cytokine inhibitors such as IL‐

1ra  and  soluble  TNF‐R. However,  this  upregulation  in  homeostatic  regulatory mechanisms  is  not 

sufficient as these are unable to neutralize all the TNFα and IL‐1 produced.  

 In  rheumatoid  arthritis,  joint  cell  cultures  that  spontaneously  produce  IL‐1,  TNFα was  the major 

dominant  regulator of  IL‐1.  Subsequently, other proinflammatory  cytokines were  also  inhibited  if 

TNFα was neutralized. This led to the hypothesis that TNFα was of major importance in rheumatoid 

arthritis and became therapeutic target. A balance of proinflammatory and  inflammatory cytokines 

exists  in  the  synovium  and  disturbance  in  this  balance  contributes  to  the  pathogenesis  in  the 

synovium. 

Finally two theories are suggested regarding the pathogenesis of rheumatoid arthritis: 

1) T cell centric theory of RA 

According  to  this  theory  activation  of  CD4+  cells  would  trigger  and  maintain  the 

inflammatory process  in  the  rheumatoid  joint.  Large numbers of CD4+  cells persist  in  the 

synovium throughout the disease course, they appear to be inactive in the chronic phase of 

the disease. 

2) macrophage‐fibroblast theory 

- 26 -

Cytokines known to be produced by effector cells (macrophages) and connective tissue cells 

(fibroblasts) are expressed in abundance in RA synovium and synovial fluid . These cytokines 

include  IL1,  IL6, TNF,  IL8 and GM‐CSF. According to this theory T cells may be  important  in 

inhitiating  the  disease,  chronic  inflammmation  is  self‐perpetuated  by  macrophages  and 

fibroblats in a T cell independent manner. This theory in based upon the relative absence of 

activated  T  cell  phenotypes  in  the  chronic  RA  and  the  preponderance  of  activated 

macrophages and fibroblats phenotype. 

There  is also a controversy as  to whether  the process of  joint destruction  is directly driven by  the 

inflammatory  processor,  the  basic  process  of  joint  destruction  with  fibroblast  proliferation  and 

activation of other cells is driven independently of the inflammatory process. 

The central role of cytokines  is confirmed by the success of cytokine‐directed  immunotherapy. The 

use of Anti –TNF‐α monoclonal antibodies gives therapeutic value to RA. 

 

 

 

- 27 -

                

PMN –polymorphonuclear leukocytes 

 

1.12. Contributors to the inflammatory process 

1.12.1 Neuropeptide connection in arthritis 

Many  studies  have  shown  that  modulation  of  cytokine  function  is  effective  in  ameliorating 

symptoms  of  rheumatoid  arthritis.  Neuropeptides  have  recently  been  shown  to  have  powerful 

effects  on  the  production  and  release  of  cytokines  and  have  also  been  shown  to  exert  potent 

proinflammatory and anti‐inflammatory effects in animal models of inflammatory diseases. A lack of 

a comprehensive understanding of the pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA) has hampered the 

development  of  novel  therapeutic  approaches  to  the  treatment  of  this  disease.  Grimsholm  and 

colleagues  (Grimsholm et al., 2005) demonstrated many different cell  types, such as macrophages 

and  synoviocytes,  have  long  been  known  to  be  involved  in  RA,  it  has  been  realized  that  the 

peripheral nervous system has a key  role  in modulating  the severity of RA  (Eskandari et al., 2003; 

Levine et al., 1985; Straub and Cutolo, 2001). Synovial tissue is richly innervated with neuropeptide‐

- 28 -

containing primary afferent and sympathetic neurons (Grigg, 2001; Mapp et al., 1990; Miller et al., 

2000)  and  there  is  evidence  that  the  release  of  these  neuropeptides  powerfully  influences  the 

severity of chronic  inflammatory diseases,  including RA  (Cerinic et al., 1998; Niissalo et al., 2002). 

Grimsholm  and  colleagues  (Grimsholm  et  al.,  2005)  evaluated  the  relationship  between  synovial 

fluid levels of neuropeptides, inflammatory cytokines and duration of disease in patients with RA. 

The  evidence  for  the  involvement  of  neuropeptides  in  inflammatory  diseases  has  focused 

predominantly  on  a  proinflammatory  role  for  SP  (O'Connor  et  al.,  2004),  as well  as  an  immuno‐

modulatory  role  for neuropeptide Y  (O'Connor et al., 2004) and an anti‐inflammatory  role  for VIP 

(Niissalo et al., 2002).  

1.12.1.1. Role of Substance‐P in RA 

SP  is  a  bio  active  undecapeptide  found  in  high  levels  in  primary  afferent  nociceptor,  the  central 

nervous system and gastrointestinal tract. Since its initial characterization by Leeman and Carraway 

the  involvement of this peptide  in a variety of physiological processes has been well documented. 

Some  of  the  functions  attributed  to  SP  include  its  potential  roles  as  a  sensory  neurotransmitter, 

regulator of cell proliferation, a modulator of vascular perfusion and permeability and a mediator of 

immunological  and  inflammatory  processes.  Evidence  supporting  the  interaction  of  SP  in 

immunological phenomena include its ability to bind to neutrophils and cause endogenous mediator 

release, to activate lymphocytes and macrophages, as well as to cause degranulation of mast cells. In 

addition, SP has been  shown  to enhance monocyte  secretion of  interleukin‐1 and  tumor necrosis 

factor, and can stimulate synovial  cells to sectete postglandin E2and collagenase.  

Levine at el, 1984 found that substance P concentration increased in RA patients. . They found that, 

in  the  rat,  joints  that developed more  severe  arthritis  (ankles) were more densely  innervated by 

substance  P  containing  primary  afferent  neurons  than  were  joints  that  developed  less  severe 

arthritis (knees). 

 

 

- 29 -

1.12.2. Role of MMP‐13 in arthritis 

There  is  a  growing  body  of  evidence  that  implicates matrix metalloproteinases  (MMPs)  as major 

players in numerous diseased conditions. The articular cartilage degradation that is characteristic of 

rheumatoid  arthritis  (RA)  is  believed  to  be  mediated  by  the  collagenase  subfamily  of  matrix 

metalloproteinases. About 20 members of this family have been identified. Most MMPs are secreted 

into  the  extracellular  space  in  a  latent  proform,  and  require  proteolytic  cleavage  for  enzymatic 

activity. A few MMPs, however, are activated intracellularly by a furin‐like mechanism and therefore, 

these enzymes are fully active when they reach the extracellular space. 

The articular cartilage degradation that is characteristic of rheumatoid arthritis (RA) is believed to be 

mediated by the collagenases subfamily of MMPs. Collagenase cleave fibrillar collagens at neural pH 

and play an  important role  in matrix remodeling. Collagens are the major structural proteins of all 

connective  tissues.  The  most  abundant  collagens  are  the  type  I,  II  and  III,  named  interstitial 

collagens. The expression of type  I and type  II collagen genes  is tightly regulated during embryonic 

development with each type of collagen being made  in specific tissue   at specific times (Miller and 

Gay, 1987). Type I collagen is widely distributed, being present in bone, skin, tendons, and ligament 

whereas type II collagen is located almost exclusively in hyline cartilage. One of the newest members 

of  the  collagenase  subfamily  is  collagenase‐3  (CL‐3),  which  was  originally  isolated  from  breast 

carcinoma (Freije et al., 1994).  In addition to being detected  in brest tumers. CL‐3 mRNA has been 

found in articular cartilage (Stahle‐Backdahl et al., 1997) and in the synovial tissue from patients with 

osteoarthritis  or  rheumatoid  arthritis  (Wernicke  et  al.,  1996).  CL‐3  has  been  shown  to  degrade 

collagen types I, II, III as well as being able to degrade the cartilage proteoglycan aggrecans (Fosang 

et  al.,  1996).  Biochemical  characterization  of  CL‐3  has  a  broad  spectrum  of  activity  against 

connective  tissue  components  (Knauper  et  al.,  1996a;  Knauper  et  al.,  1996b).  The  preference  of 

collagenase  3  (CL‐3)  for  collagen  type  II makes  it  a  likely  candidate  in  the  turnover  of  articular 

cartilage and a potential  target  for drug development.  Improper management of MMP expression 

- 30 -

and activation has been  suggested  to play major  role diseases  such as osteoarthritis,  rheumatoid 

arthritis, tumor invasion and metastasis and Alzheimer’s disease.  

Most  cells  in  the  body  express MMPs,  even  though  some  enzymes  are  often  associated with  a 

particular cell type. For example, the principle substrate of MMP‐2 (also known as gelatinase A) and 

MMP‐9 (also known as gelatinase B) is the type IV collagen in basement membrane and thus, these 

enzymes  are usually  expressed by  endothelial  cells,  although other  cells  (e.g.  stromal  fibroblasts, 

macrophages, tumor cells) also express them (Borden and Heller, 1997; Nagase and Woessner, 1999; 

Stetler‐Stevenson and Yu, 2001; Vincenti, 2001). 

MMP‐3  (also known as stromelysin) activates MMP‐1  (also known as collagenase‐1) and cleaves a 

broad range of matrix proteins; MMP‐1, which is an interstitial collagenase, and MMP‐3 are among 

the most ubiquitously expressed MMPs.  In contrast, MMP‐13  (also known as collagenase‐3) has a 

more  restricted  pattern  of  expression within  connective  tissue,  and  is  usually  produced  only  by 

cartilage and bone during development, and by  chondrocytes  in osteoarthritis  (OA)(Borden et al., 

1996; Mengshol  et  al.,  2000;  Vincenti  et  al.,  1998).  The  preference  of  collagenase‐3  (CL‐3)  for 

collagen type II makes it a likely candidate in the turnover of articular cartilage and a potential target 

for drug development.  

1.12.3. Role of macrophage inhibitory factor (MIF) in RA 

Macrophage  inhibitory  factor  is  a  cytokine  with  increasingly  well  recognized  importance  in  the 

regulation of  immune and  inflammatory responses.  Its original description focused on  its ability to 

prevent the random migration of macrophages  in the culture, but since  its cloning  in the mid‐1990 

evidence  of  a much  broad  range  of  proinflammatory  actions  has  emerged  (Bacher  et  al.,  1996; 

Calandra  et  al.,  1994;  Churchill  et  al.,  1975). MIF  is  released  by  activated  T‐  lymphocytes  and 

macrophages and up regulates the proinflammatory activity of these cells. MIF induces macrophage 

secretion  of  TNF‐alpha  and  promotes  interferone‐gamma  induced  production  of  nitric  oxide  by 

- 31 -

mouse  macrophages  (Attur  et  al.,  1997;  Bernhagen  et  al.,  1994;  Liew,  1994).  Macrophage 

intracellular  killing  and  phagocytic  function  is  upregulated  in  the  presence  of MIF  (Juttner  et  al., 

1998; Onodera  et  al.,  1997). MIF  has  also  been  demonstrated  to  be  a  crucial  cofactor  in  T  cell 

activation  (Bacher  et  al.,  1996).  The  key  proinflammatory  actions  exerted  by  MIF  in  vitro  are 

confirmed by the demonstration of its critical role in the development of both endotoxic shock and 

delayed‐type hypersensitivity in vivo in mice (Bernhagen et al., 1996; Calandra and Bucala, 1995). Its 

potential role in the development of autoimmune disease is highlighted by previous studies in which 

immunoneutralization of MIF resulted in profound inhibition of adjuvant arthritis in the rat (Leech et 

al., 1998). MIF antagonist has additionally been shown to delay the onset and  lower the frequency 

arthritis of collagen‐induced arthritis in the rat (Leech et al., 1998). 

RA  is  characterized  by  synovial  hyperplasia  and  a  cellular  infiltrate  comprised  predominately  of 

macrophage and T‐cells (Burmester et al., 1997). Macrophage‐derived cytokines, in particularly TNF‐

alpha, are thought to be crucial to the inflammatory process in RA (Elliott et al., 1993). 

1.12.4. Role of redox‐reactions in RA 

Reactive oxygen species (ROS) are generally thought to be harmful and to play a disease‐enhancing 

role in autoimmune disease such as RA (Babior, 2000; Hitchon and El‐Gabalawy, 2004). However, we 

have found that decrease capacity of intracellular ROS and surface thiol helps to increase arthritis is 

K/BxN  serum  transfer  model.    The  association  between  ROS  and  autoimmunity  is  interesting, 

because it opens up the possibilities for new insight into the pathogenesis of complex autoimmune 

disorders. NADPH  oxidase  complex  that  catalyzes  the  transfer  of  single  electron  from NADPH  to 

oxygen, generating ROS. The  release of ROS and  its downstream products  from phagocytic cells  is 

known  as  a  respiratory burst  and  is  regarded  as  a part  the protection  against  invading pathogen  

(Babior, 2000).  In healthy  individuals, ROS  and  associated oxidative  stresses  are  kept  in  check by 

combination  of  antioxidant  activates  (Droge,  2002;  Winyard  et  al.,  2005).  Human  cells  have 

developed a formidable antioxidant defence against oxidant reactions.  In particularly, they possess 

enzymatic  and  non  enzymatic  antioxidant  molecules,  including  thiols  mainly  glutathione,  for 

- 32 -

defence.  One  key  chemical  barrier  against  stress  induced  damage  is  the  redox  equilibrium  of 

sulfhydryl  (SH)/  disulphides,  by  which  low molecular  weight  thiol  can  be  oxidized  reversibly  to 

disulphide and/ or protein mixed disulphide  in response to an oxidative stress  (Cuozzo and Kaiser, 

1999; Deneke, 2000; Dickinson and Forman, 2002). There  is  increasing evidence  that ROS and  the 

resulting  pro‐oxidant/antioxidant  imbalance  play  a major  role  in  the  pathogenesis  of RA  (Brown‐

Galatola and Hall, 1992; Lawrence et al., 1996; Remans et al., 2005).  

1.13. Role of Serum soluble CD21 in autoimmune diseases 

1.13.1. Soluble CD21 

Several lymphocyte surface proteins of are released into the extracellular environment by enzymatic 

cleavage.  The  cleavage  may  occur  close  to  the  extracellular  face  of  the  membrane  releasing 

physiologically active proteins. We have characterized a soluble form of CD21  in human serum and 

in culture supernatants of human  lymphoblastoid B and T cell  lines (Fremeaux‐Bacchi et al., 1996). 

Soluble CD21  is a 135‐kDa protein corresponding  to  the extracytoplasmic portion of  the molecule. 

The CD21 protein has also been found in culture supernatants of tonsillar B cells and normal human 

thymocytes.  The  release  of  soluble  CD21(sCD21),  from  lymphocytes  correlated  with  a  parallel 

decrease  in  the  expression  of  the  membrane‐associated  molecule,  indicating  that  sCD21  is 

generated  by  cleavage  and  shedding  of  the membrane  receptor.  Furthermore,  analysis  of  CD21 

transcription excluded that alternative splicing is another mechanism leading to production of sCD21 

(Illges  et  al.,  1997).  Soluble  CD21  retains  the  ability  to  bind  the  ligands  of  the membrane  form 

(Fremeaux‐Bacchi et al., 1996). Analysis of sCD21 purified from normal human plasma indicated that 

a part of sCD21 circulates in association with cleavage fragments of C3 and a trimeric form of sCD23 

(Fremeaux‐Bacchi et al., 1998b).  sCD21  levels are often altered  in pathologic  conditions  including 

lymphoproliferative  leukemias, such as B‐CLL (chronic B‐lymphocytic  leukemia) (Lowe et al., 1989), 

acute EBV‐infection and other virus‐associated diseases   (Delibrias et al., 1992; Moore et al., 1989) 

and autoimmune diseases  like RA, SLE,   Sjoegren’s syndrome, Antiphospholipd syndrome,  Juvenile 

arthritis  and  diabetes.  Therefore  sCD21  can  be  regarded  as  a  marker  of  chronic  inflammatory 

- 33 -

autoimmune disease. The levels of sCD21 in the serum may modulate the immunity as sCD21 levels 

are  correlated  with  several  disorders  like  SLE,  RA  and  Sjoegren’s  syndrome,  antiphospholipid 

syndrom and diabetes. 

                                                         

1.13.2. Soluble CD23 

 sCD21 activates monocytes  through binding  to membrane CD23 and  leads  to degranulation of 

basophils upon crosslinking  (Fremeaux‐Bacchi et al., 1998b). CD23,  the  low affinity  receptor  for 

the Fc portion of  IgE  (FcγRII),  is expressed   on a variety of haematopoietic cells  including B cells 

and monocytes  (Delespesse  et  al.,  1991).  It  is  a  45  kDa membrane  type  II  glycoprotein whose 

proteolytic  cleavage  gives  rise  to  unstable  soluble  fragments  subsequently  transformed  into  a 

stable 25  kDa   product  referred  to  as  soluble CD23  (sCD23). Cell  surface CD23  expression  and 

sCD23  release  are  up  regulated  by  IL‐4  in  all  CD23  expressing  cell  types,  and  inhibited  by 

interferon–gamma (IFN‐γ), transforming growth factor beta (TGF‐β) and glucocorticoids on B‐cells 

(Delespesse et al., 1992). While sCD23 retains the capacity to bind IgE, it has many activities that 

are IgE‐independent (Delespesse et al., 1992; Sarfati et al., 1992), including inhibition of apoptosis 

(Liu et al., 1991). The amount of sCD21 and sCD23 in serum may modulate immunity as sCD21 and 

sCD23 levels are correlated with several clinical conditions. In particularly reduced levels of sCD21 

seems to be a marker of chronic inflammation 

                                   

 

 

 

- 34 -

                                                      CHAPTER‐II 

                                              AIMS OF THE STUDY 

The  study  presented  here  is  an  investigation  of  cellular  and molecular  factors  involved  in  the 

rheumatoid arthritis using the antibody induced arthritis model. 

The  first part of  the  study  investigates  the  role of neuronal pathways  in  the  antibody  induced 

arthritis. We determined the role of sympathetic, parasympathetic and peripheral nervous system 

contribution to antibody induced‐arthritis. 

The articular cartilage degradation that is characteristic of rheumatoid arthritis (RA) is believed to 

be mediated by the collagenase subfamily of matrix metalloproteinases. MMP13 has been shown 

to  degrade  collagen  types  I,  II,  III  as well  as  being  able  to  degrade  the  cartilage  proteoglycan 

aggrecans. The K/BxN model was used to determined the role of MMP13 in arthritis. 

 MIF  is  released  by  activated  T‐  lymphocytes  and  macrophages  and  up  regulates  the 

proinflammatory activity of  these cells.  It has been  shown  that macrophages play an  important 

role in K/BxN model (Solomon et al., 2005). Therefore we determined MIF role in K/BxN model. 

Chnages  in  the  redox  state determine biochemical  activities of  variety of molecules  and  affect 

immunity (Gelderman et al., 2006). Phytol, an oxidizing substance, has  influence on the capacity 

of T cells to mediate immunity (Hultqvist et al., 2006). Moreover, we analyzed the possible role of 

ROS in K/BxN model. 

 

2) The second aspect of the study was to determine the amounts of sCD21 and sCD23 in various 

autoimmune disorders and healthy donor’s serum /plasma samples.                                                  

- 35 -

                                                     CHAPTER‐III MATERIALS AND METHODS  3. Mouse strains  

   3.1.1. KRN transgenic mouse strain 

The transgenic mouse strain was propagated  in the animal facility, Rheinbach. The strain harbours 

the  transgenes  encoding  the  αβ  T  cell  receptor  capable  of  recognizing  Glucose‐6‐phosphate 

isomerase in the context of IAg7 molecule (Kouskoff et al., 1996). The strain was maintained by serial 

crossing  the  heterozygotes  positive  for  the  KRN  T  cell  receptor  against  the  C57BL/6  background. 

Inbred strain of C57BL/6 mice were also maintained in the same animal facility, Rheinbach, Germany 

and were maintained under pathogen  free conditions. This mouse  line was used  for breeding KRN 

mouse strain and also for various experiments.   

3.1.2. NOD/Lt mouse strain 

The nonobese diabetic  (NOD) mouse  strain was also propagated  in animal  facility of University of 

Applied Sciences, Bonn‐Rhein‐Sieg, Rheinbach. The mice were originally derived from out bred JCL‐

ICR mice. This strain serves as an excellent model  for  the autoimmune disease,  insulin dependent 

diabetes mellitus. 

3.1.3. K/BxN mouse stain (KRNxNOD) 

The K/BxN mouse strain  is obtained through a genetic crossing between K/B (KRN) transgenic mice 

with C57BL/6 background) and the NOD strain. The KRN transgeneic mice being heterozygous, the 

F1 offspring were either carrier or non carrier of the KRN transgene. The carrier were designated as 

K/BxN and these develop arthritis within one monthafter birth. The non carrier were designated as 

BxN.  

 

 

- 36 -

3.2 Knockout mice 

3.2.1 MMP13 knockout mouse strain 

MMP 13‐/‐ mice were obtained from Prof. Peter Angel, Heidelberg, Germany (Angel P et al. 2006) 

3.2.2. Macrophage inhibitory factor (MIF) knockout mice 

MIF ‐/‐ were obtained from Prof. Bucala, Tke Picower Institute for Medical Research, Manhasset, New 

York. USA. 

3.2.3. Substance P knockout mouse strain 

SP  ‐/‐ mice were obtained from Prof. Dr. Zimmer, University of Bonn, Germany (Bilkei‐ Gorzo et al., 

2002)  and  propagated  in  the  animal  facility,  University  of  Applied  Sciences,  Bonn‐Rhein‐Sieg, 

Rheinbach. 

3.2.4. DBA mt FvB mouse strain 

DBA mt FvB (ATP deficient) mouse strain and wild type DBA/1J were a kind gift from Dr. Ibrahim, 

University of Rostock, Germany. 

3.2.5. B6.129 S7‐Chrna7 tm1Bay/J mouse strain 

B6.129 S7‐Chrna7 tm1Bay/J mice were obtained from Jackson laboratory. 

All knockout mice were C57BL/6 background, maintained and breed under pathogen free condition, 

University of Applied Sciences, Bonn‐Rhein‐Sieg, Rheinbach. 

3.2.6. BALB/c mice and CD57BL/6 mice 

BALB/c and C57BL/6 mice were obtained from the Charles Liver Laboratory. 

 

3.3. Breeding Experiments 

All mouse strains were kept  in a pathogen  free environment  in  the University of applied Sciences, 

University  of  Applied  Sciences,  Bonn‐Rhein‐Sieg,  Rheinbach.  The  KRN  strain  was  bred  with  the 

C57BL/6 strain to maintain the KRN mouse line in a heterozygous condition on C57BL/6 background. 

- 37 -

The mice were  screened by FACS analysis of  the peripheral blood  lymphocytes using CD4 PE and 

TCR‐Vβ6‐ FITC antibodies. The double positive phenotype were selected for breeding. 

 

3.4 Induction of arthritis using K/BxN sera transfer 

3.4.1. Production of K/BxN sera  

The K/BxN mice were the F1 generation of KRN transgenic mice crossed with the NOD strain and, 

develop arthritis around day 30 after birth. 

K/BxN mice produce anti‐GPI antibodies and when sera from theses arthritic mice are transferred to 

susceptible stains like BALB/c and C57BL/6 mice they develop arthritis. For all experiments involving 

sera  transfer K/BxN mice around 2‐5 months old were bled by  their  tail and  collected blood was 

allowed to clot at 4°C overnight. The samples were then centrifuged at 2000 rpm at 4°C and clot was 

removed. The samples were again centrifuged at 2,000 rpm to remove the residual blood cells. The 

sera were pooled and stored  at ‐200C and used for arthritis induction.    

3.4.2. Establishment of antibody‐induced arthritis in mice 

Arthritis was  induced  into  the  recipient mice  by  an  intraperitoneal  injection  of  200µl  of  pooled 

K/BxN sera on day 0. 

3.4.3 Assessment of antibody‐induced arthritis by ankle thickness (mm) and clinical score 

(U) 

Increase in ankle thickness was measured in all experiments using a calliper from Hann &Kolb (model 

no 33185). Ankle thickness was measured till day 14 and it was expressed in millimetres as summed 

average of ankle  thickness of  the  four  limbs of each mouse. Clinical  index  (I) were also measured 

along with the ankle thickness and I a scale varying from 0‐4. The lowest score of 0 was given for a 

leg when ankle  is not affected; 1  if redening and highly swollen ankle was observed. The error was 

expressed as standard error of mean (SEM). 

 

- 38 -

3.5 Histology 

Ankle and knee  joints of the mice were carefully dissected out without damage to the  joints. Skin, 

hair  and  soft  tissue were  removed  surgically  and  the  complete  joints were  fixed overnight  in 4% 

formaldehyde solution.  

3.5.1 Decalcification 

Fixed  joints  were  decalcified  by  treatment  with  ethylenediaminetetraacetic  acid  (EDTA)  pH  7.2 

solution for two weeks with gentle stirring with the help of scalpel and daily replacement of solution. 

Soon after decalcification the  joints were washed with PBS and stored  in 50% ethanol. The treated 

joints were  then,  embedded  in paraffin  for  sectioning. About  5‐10µm  thick  sagittal  serial  section 

were  cut.  The  sections  were  placed  on  glass  slides  and  quality  of  sections  were  tested 

microscopically. 

5.6. Preparation of adherent peritoneal macrophages and reconstitution of macrophages 

in MIF knockout Mice 

Adherent peritoneal macrophages were  isolated from 6–8 weeks old C57BL/6 mice. 5‐8 ml  ice‐cold 

PBS,  was  intraperitoneally  injected  into mice,  killed  by  cervical  dislocation  and  the  cells  in  the 

peritoneal  fluid  were  collected.  After  centrifugation  from  the  peritoneal  extract,  the  cells  were 

resuspended  in  PBS.  The  macrophages  were  purified  by  adherence  on  90‐mm  culture  dishes 

(Greiner, Frickenhausen, Germany) for 1 h in 5% CO2 at 37°C. Non‐adherent cells, which are mainly 

lymphocytes, were  removed  by washing  two  times with  PBS. Adherent  cells, which were mainly 

macrophages by morphology, were collected and resuspended in PBS. To reconstitute macrophages, 

1.5×107 cells in a total volume of 0.2 ml PBS were injected intraperitoneally into MIF knockout mice. 

3.7 Immunological Methods 

3.7.1 Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)  

Ficoll density gradient preparation of lymphocytes 

- 39 -

Mice were bled from the tail vein and blood was directly collected  into the 1.5ml centrifuge tubes 

containing  400  µl  of  Alsever’s  solution  (0.42g  NaCl,  0.8g  tri‐Na‐Citrate‐2H2O,  2.05g  D‐Glucose  in 

100ml of water, pH6.1 adjusted with 10% citric acid). Samples were mixed properly in order to avoid 

blood coagulation and kept at 4oC.   Ficoll gradient purification of samples were performed at 2500 

rpm for 10 min at 4oC in 1.5 ml centrifuge tubes. The lymphocytes were carefully removed from the 

interface of the two  layers and transferred  into 96 well plates. Then, the cells washed with 1x PBS. 

The supernatant was discarded and the pellet resuspended in 50µl of antibody mixture. 

All the antibodies were diluted  in 1x PBS. The anti‐CD4 and anti‐Vß6 antibody mixture was used to 

check for the KRN TCR transgene. 

Cells in the antibody solution were incubated in the dark for 30 min on ice. Then, cells were washed 

with 100‐200µl of 1x PBS  and  centrifuged  at 1200  rpm  for 10 min  at 4oC.  Finally,  the pellet was 

resuspended  in  100µl  of  1xPBS  and  transfered  into  the  FACS  tubes  (BD  Pharmingen, Heidelberg, 

Germany). Data were collected  in a FACS Calibur using the  ‘Cell Quest’ software  (BD‐ Pharmingen, 

Heidelberg, Germany). 

3.7.2. RBC Lysis  

 Mice were bled from the tail and blood was collected  into 1.5ml centrifuge tube containing 400µl 

Alsever’s solution. The whole blood sample was transferred  into 15ml falcon tube and 10‐12 ml RBC 

lysis  buffer  was  added  [8.29  grams  NH4Cl  (0.15M),  1  gram  KHCO3  (10mM),  37.2  mg  Na2EDTA 

(0.1mM), added 800ml H2O and adjusted pH 7.2‐7.4 with HCl  ].The  cells were  incubated at  room 

temperature for 10 min and then, cells were centrifuged at 1200 rpm   for 10 min. The supernatant 

was discarded  and  the  cells washed with  1xPBS  at  1200rpm  for  10 min. After  centrifugation  the 

pellet was resuspended in 100µl of 1x PBS and stained the cells with different antibody mixtures. 

3.8. Quantification of sCD21 from human serum/plasma by ELISA 

The  monoclonal  antibodies  THB5  and  biotinylated  BU32  were  used  as  capture  and  detection 

antibody  respectively.  Titration  was  performed  with  purified  sCD21  and  a  standard  curve  was 

plotted.THB5 was  coated  onto  an  ELISA  plate  (NUNC, Germany)  at  a  concentration  of  5µg/ml  in 

- 40 -

coating buffer (phosphate buffer, pH 7.2) for overnight at 4°C. Then the plate was empted to get rid 

of  residual  buffer  and  tapped  on  an  adsorbent  paper.  Subsequently  the  plate was  blocked with 

5%BSA in PBS for 2 h. The serum samples at a dilution of 1:50, were added into the plate along with 

the standard in triplicates. The plates were incubated overnight at 4°C. Then, the plate were washed 

two times with PBS‐T and incubated with biotinylated BU32 for 1h at RT. Then, after three washes, 

streptavidin  coupled  to horse‐radish peroxidase was added and TMB as  substrate/coloring agent. 

The  enzyme  reaction was  stopped by  adding  1M H2SO4  and was quantified  by  taking  the optical 

density at 450nm and  reference wavelength at 690nm  in an ELISA  reader  (Anthos Micro  System, 

Germany). The sCD21 concentration was calculated by extrapolating from the standard graph. 

3.9. Quantification of sCD23 from human serum/plasma by ELISA 

sCD23 levels in serum were determined  using a commercial sCD23 ELISA in accordance with the 

manufacturer's instructions (Bender Medsystems, Vienna, Austria). 

Briefly,  plates  were  coated  with  5µg/ml  coating  antibody  over  night  at  4°C.  Then,  plates  were 

washed with wash buffer (0.05% Tween 20 in PBS), blocked with assay buffer (5%BSA, 0.05% Tween 

20 in PBS) for two hours. After washing, sera samples were added at a dilution of 1:10 into the plates 

along with the standard and biotin‐conjugate in duplicates and the plates were incubated for 2 hour 

at room temperature. Then, after incubation plates were washed with wash buffer and streptavidin‐

HRP added in all the wells. Finally, TMB (Sigma) was added as a substrats. The enzyme reaction was 

stopped by addition of 1M H2SO4 and the optical density measured at 450nm, reference wavelength 

at  690nm,  in  an  ELISA  reader  Anthos Microsystem,  Germany).  The  sCD23  concentrations  were 

calculated by extrapolating from the standard graph. 

3.10. Immunoblot 

3.10.1. Western blot 

Immunoblotting  is  a  technique  used  for  the  detection  of  the macromolecular  antigens  (usually 

proteis) using specific antibody  (Towbin et al., 1979). Proteins bind  to  the nitrocellulose chiefly by 

hydrophobic bonds (van Oss et al., 1987) and PVDF membranes ensure much stronger hydrophobic 

- 41 -

interactions . Polyacrylamide   gels were, carefully removed from the electrophoresis chambers and 

placed  on  the  top  of    an  equal  size  nitrocellulose  or  PVDF membrane  soaked  in  transfer  buffer 

(50mM Tris; pH 8.8, 250mM Glycine; pH 8.3, 20% Methanol). Six pieces of Whatmann 3mm paper of 

equal size were also socked in the transfer buffer to saturation. Three piece Whatmann 3MM paper 

saturated with transfer buffer were placed on the bottom of the gel‐membrane sandwich and three 

on the top. The complete sandwich was placed on the bed of the transfer apparatus  in such a way 

that the membrane faces the anode. Transfer was carried out for 1 h at 20 V and 200mA. Soon after 

the transfer the membrane was carefully taken out from the sandwich and stained with Ponceau S 

solution  for  the  detection  of  the  transferred  polypeptide  bands.  The  band  pattern was  scanned 

electronically. 

The membrane containing the polypeptide bands were placed in the blocking buffer (5% BSA in PBS) 

for  overnight  at  4oC.  After  blocking,  the membrane was  incubated  in  primary  antibody  solution 

(dilution in blocking buffer according to the manufacture’s instructions) for 1 h at room temperature 

on a shaker. The unbound antibodies were removed by washing the membrane three times for 10 

minute with PBS‐T. After the  last wash the membrane was  incubated with Horse radish peroxidase 

(HRP)‐conjugated secondary antibody  for 1 hour at room temperature on a shaker. After that, the 

membrane was washed three times with wash buffer. 

Super  Signal  chemiluminescent  substrate  (Pierce,  Rockford,  USA) was  prepared  by mixing  equal 

volumes of Solution A and solution B. The cocktail was added to the membrane and  incubated for 

five minute at room temperature. Pictures were taken by Chemidoc (Biorad, Germany). 

3.10.2. Dot Blot 

Instead  of  running  a  SDS  PAGE,  protein  samples  were  spotted  directly  onto  a  nitrocellulose 

membrane. The membrane was blocked with 5% BSA  in PBS at 4°C overnight. After blocking,  the 

membrane was  incubated  in primary antibody solution (dilution  in blocking buffer according to the 

manufacture’s instructions) for 1 h at room temperature on a shaker. The unbound antibodies were 

removed by washing the membrane three times for 10 minute with PBS‐T. After the  last wash the 

- 42 -

membrane was incubated with Horse radish peroxidase (HRP)‐conjugated secondary antibody for 1 

hour  at  room  temperature on  a  shaker. After  that,  the membrane was washed  three  times with 

wash buffer. 

Super  Signal  chemiluminescent  substrate  (Pierce,  Rockford,USA)  was  prepared  by  mixing  equal 

volumes of Solution A and solution B. The cocktail was added to the membrane and  incubated for 

five minute at room temperature. Pictures were taken by Chemidoc (Biorad, Germany). 

3.11 Chemical Sympathectomy 

BALB/c mice  8 weeks old were obtained  from  the  Charles  Liver  laboratories, Germany. Chemical 

Sympathectomy  was  performed  by  injecting  6‐OHDA  (6‐Hydroxydopamine  hydrochloride,  Sigma 

Aldrich  Chemie  GmbH,  Germany).  6‐  OHDA  was  dissolved  in  0.8%  NaCl  containing  1x10‐3  M 

Ascorbate as antioxidant. The solution was stored in the dark at ‐20°C.   

3.11.1. Transient sympathectomy 

In this method eight weeks old BALB/c mice were injected weekly once with 6‐OHDA (150mg/kg of 

body weight)  for  seven weeks  consecutively.    The  control mice were  injected with  vehicle  alone 

(0.8% NaCl containing 1x10‐3 M Ascorbate as antioxidant). Mice were maintained  in pathogen free 

environment. At the end of the  last  injection mice were taken for the arthritis  induction by serum 

transfer. 

3.11.2. Permanent sympathectomy 

For  permanent  sympathectomy,  pubs  were  injected  with  6‐OHDA  (50mg/kg  of  body  weight)  at 

postnatal day 1. The control pubs were treated with vehicle alone  (0.8% NaCl containing 1x10‐3 M 

Ascorbate as antioxidant). At 8 weeks of  the age  the mice  in  this group were  taken  for  the serum 

transfer experiments for arthritis induction. 

- 43 -

3.12. Statistics 

Statistical  calculations  and  graphical  illustrations  were  performed  using  Instat/Prism  software. 

Kruskal Wallis test for nonparametric analysis of variance (ANOVA) and Mann‐Whitney test to obtain 

nonparametric two‐tail P value were performed. 

3.12.1. P value 

Having collected data from several samples and means,  it  is possible that the populations have the 

same mean and the difference observed  is a coincidence of random sampling.   There  is no way we 

can  ever  be  sure whether  the  difference  observed  reflects  a  true  difference  or  a  coincidence  of 

random sampling.   All we can do  is to calculate the probabilities.   P‐value answers this question:  If 

the populations  really did have  the  same mean, what  is  the probability of observing  such a  large 

difference  (or  larger)  between  sample  means  in  an  experiment  of  this  size?  The  P‐value  is  a 

probability with a value ranging from zero to one. If the P value  is small, we can conclude that the 

difference  is  quite  unlikely  to  be  caused  by  random  sampling.    Instead,  the  populations  have 

different means.  The lower the P‐value is, the higher is the significance of the observed differences. 

3.12.2. Mann‐Whitney test & Kruskal‐Wallis test 

The Mann‐Whitney test is a nonparametric test to compare two unpaired groups. The Kruskal‐Wallis 

test  is  a  nonparametric  test  to  compare  three  or  more  unpaired  groups  answering  the  same 

question as above. The key result  is a P‐value  that answers  this question:  If  the populations really 

have  the  same median, what  is  the  chance  that  random  sampling would  result  in medians as  far 

apart  (or more so) as observed  in  this experiment?    If  the P‐value  is small,  the difference  is not a 

coincidence; instead the populations have different medians.  If the P‐value is large, the data do not 

give any reason to conclude that the overall medians differ. 

 

   

- 44 -

                                                          CHAPTER‐IV   RESULTS  4.1 Neurological Experiments: 

4.1.1 Transient sympathectomy partially protects Balb/c mice from antibody induced 

arthritis 

Rheumatoid  arthritis  is  a  chronic,  painful,  inflammatory  disease  that  causes  debilitation  of  distal 

joints. The disease  is also characterised by spontaneous  ‘flare ups’, causing an exacerbation of the 

pain  and  inflammation.  Inflammatory  events  that  take  place  within  the  joints  include  oedema 

formation, vascular remodelling and a significant amount of cellular infiltration, amongst other. For 

many years it has been considered that sensory nerves, which mediate neurogenic inflammation in a 

variety  of  disease  states, may  play  a  role  in  the  onset  and  progression  of  disease.  Neurogenic 

inflammation  is  defined  as  the  oedema  formation,  increased  blood  flow  and  inflammatory  cells 

recruitment observed after  stimulation of  sensory nerves  (usually C and Aδ  fibers) and  release of 

neuropeptides.  The  symmetrical  inflammation  of  joints  observed  in  patients  with  rheumatoid 

arthritis  suggests  that  the  progression  of  the  disease  has  a  neural  influence.  Sensory  nerves  are 

involved in the development of joint disease, however no immunological explanation is given so far 

for this fact.  In order to evaluate the role of the sympathectic nervous system  in RA pathogenesis, 

we performed chemical sympathectomy followed by induction of arthritis by K/BxN sera induction.  

Sympathectomy was  done  by  administration  of  6‐OH Dopamine  and  depletion  of  the  peripheral 

sympathetic  nervous  system was  checked  by western  blot.  Since  lymphoid  organs  are  rich with 

sympathetic nerve  fibres, we  selected  the  spleen  for western blot analysis of  tyrosine hyroxylase 

(TH), a marker  for sympathetic nerve  fibers  innervating  lymphoid organs. TH  is expressed  in basal 

and  stress  conditions  in  spleen. After 6‐OH Dopamine  injection, we observed 60% denervation of 

- 45 -

sympathetic nerve  fibers  in  the  spleen of adult mice and 99% denervation  in neonatal  compared 

with vehicle treated mice Fig. 1.1.  

Figure 1.1: Effect of 6‐OH Dopamine induced denervation in murine spleens. 

Western blot analysis of Tyrosine Hydroxylase (TH) in spleens of adult and neonatal 6‐OH Dopamine 

treated mice and brain used as control. The 60 KDa TH bands were stronger in the mice which were 

treated  four  times  with  6‐OHDA  at  8  weeks  of  age  compared  to  the  neonatal  treated  mice. 

Quantification of TH content was done by chemiluminescence scanning.  

     

Figure 1.2: Densitometric analysis of the Western blot. 

Balb/c mice  were  taken  for  neurological  experiments  because  of  their  highest  susceptibility  for 

K/BxN  sera‐induced  arthritis  (Maccioni  et  al.,  2002;  Solomon  et  al.,  2002).  For  transient 

sympathectomy Balb/c mice were treated with 6‐OH Dopamine weekly once for four weeks. Then, 

arthritis was  induced by  intraperitoneal  injection of 200 µl of K/BxN sera. The control group were 

60 KDa

Brain Control 6‐OHDA  Untreated6‐OHDA  Untreated 

Neonatal  Adult 

- 46 -

treated with vehicle only  followed by 200 µl of K/BxN sera. Clinical  index and ankle measurement 

were observed  at days 3, 6, 9, 12, 15, 18  and 21 post  injection of K/BxN  sera. Administration of 

K/BxN  serum  into  transient  sympathectomized  mice  resulted  in  significantly  decreased  ankle 

thickness and clinical  index  from day 6  to 15.  In  transient sympathectomized mice ankle  thickness 

reached a maximum value of 2 mm on day 6 and swelling decreased slowly from day 9 on and finally 

reached an average ankle  thickness of about 0.5 mm by day 15. Similarly,  in vehicle  treated mice  

ankle thickness reached a maximum value of 3.4 mm on day 6 and disease decreased slowly from 

day 9 and finally reached an average ankle thickness of about 1.0 mm by day 15 (Fig.1.3 a).  

Clinical Index 

A decrease in the clinical index of the disease was also observed, with the maximum clinical index 4 

in vehicle treated mice at day 9 while  in transient sympathectomized mice maximum clinical  index 

reached up to 3 at day 9. Decreased clinical index was significant at days 3, 6 and 9 (Fig 1.3 b). 

(a)                                                                       (b) 

 

 

 

Figure 1.3: Transient Sympathectomy results in significantly reduced arthritis.  

- 47 -

Transient  sypathectomized  Balb/c mice  (n=10)  and  control mice  (n=10) were  treated with  200µl 

K/BxN sera and arthritis evaluated by measuring (a) ankle thickness and (b) clinical index. There was 

significant  difference  in  ankle  thickness  and  clinical  index  between  the  two  groups.  The  values 

represent the mean ± SEM of ankles/ time points, which were compared with student t‐test to  the 

wild type mice. 

4.1.2. Permanent sympathectomy protects Balb/c mice from antibody induced arthritis. 

Permanent  sympathectomy was  done  by  injection  of  6‐OH  dopamine  on  postnatal  day  one.  The 

control  mice  were  treated  with  vehicle  only.  Arthritis  was  induced  in  the  permanent 

sympathectomized mice at 8 week of age. In vehicle treated mice maximum ankle thickness reached 

3 mm on day 9 while in permanent sympathectomised mice maximum ankle thickness reached up to 

2.5mm at day 9 and the swelling decreased slowly from day 9 on and finally reached 2 mm and 1.5 

mm  for  vehicle  treated mice  and permanent  sympathectomized mice  respectively. A  significantly 

reduced  arthritis  was  observed  at  day  3  and  9  in  the  permanent  sympathectomized  mice  as 

compared to vehicle treated mice.  

There has been considerable debate  regarding  the  role of  the  sympathetic nervous  system  in  the 

inflammatory  diseases  (Fitzgerald,  1989;  Kidd  et  al.,  1992;  Levine  et  al.,  1988).  Usually  pain  is 

associated with  stress, which  increases  the  sympathetic activity.  Sympathetic  terminals  terminate 

near  blood  vessels  and  mast  cells  in  the  synovium  and  therefore  it  is  conceivable  that 

neurotransmitters  released  from  sympathetic  nerves  would  influence  vascular  permeability  and 

mast  cells  activity  in  joints.  ATP  released  from  the  adrenergic  terminals  influence mast  cells  to 

degranulate (Wilhelm et al., 2005). 

Clinical index 

The  clinical  index  for  vehicle  treated mice  reached  a maximum  of  3.7 mm  and  for  permanent 

sympathectomized mice of 3 mm. The difference was significant at days 3, 6 and 9 (Fig. 1.4 b).  

 

 

- 48 -

(a)                                                                            (b) 

 

Figure 1.4 : Permanent Sympathectomy  

(a) Average Ankle thickness and (b) clinical index of permanently sympathectomized Balb/c mice 

(n=6)  and  vehicle  treated  mice  (n=7).  Control  mice  and  permanently  sympathectomized 

Balb/c mice were treated with 200µl K/BxN sera. 

4.1.3.  Nicotinic  acetylcholine  receptor‐α7  (α7nAChR)  homozygous  knockout mice were 

completely resistant to K/BxN antibody‐induced arthritis 

The nicotinic acetylcholine receptor‐α7 (α7nAChR) subunit is an essential regulator of inflammation. 

Activation of parasympathetic nervous system results in the activation of cholinergic nerve fibers of 

the efferent nerve and release of acetylcholine at the synapses. Acetylcholine attenuate the release 

of proinflammatory cytokines (TNF, IL‐1β, IL‐6 and IL‐18) but not the anti‐inflammatory cytokine IL‐

10 in LPS stimulated human macrophage culture. 

 Acetrylcholine  acts  through  2  types  of  receptors: muscarinic  and  nicotine,  the  α7subunit  of  the 

nicotine acetylcholine  receptor  is expressed on macrophages. Because of  the  immunosuppressive 

effects  of  acetylcholine  in  vitro,  we  studied  the  possible  immunomodulatory  role  of  the 

parasympathetic nervous system in K/BxN antibody‐induced arthritis model.  

- 49 -

The α7nAChR homozygous‐/‐, heterozygous‐/+ α7nAChR mice and genotype matched C57BL/6 control 

mice were  injected with  200  µl  K/BxN  serum.  The mouse  cohorts were  followed  up  for  signs  of 

arthritis development by caliper measurement of ankle thickness and by visual  examination of ankle 

swelling  to obtain  the clinical  score on days 0, 3, 5, 7, 9, 11 and 13. Ankle  swelling  in  the control 

cohorts was evident beginning at day 2 after K/BxN sera transfer and progressing up to day 12/ 13 

and peak ankle thickness occurred between days 5 to 7.  On the contrary the α7nAChR‐/‐ mice were 

found  to be completely resistant  to arthritis, not showing any symptom of  joint  inflammation and 

clinical  index  while  α7nAChR‐/+  mice  were  showing  almost  the  same  clinical  index,  and  ankle 

measurements just like control mice. The average ankle thickness of diseased control C57BL/6 mice 

reached its maximum increase of 2.2 mm on day 7, in α7nAChR‐/‐ mice was 0.2 mm on day 3 and in 

α7nAChR‐/+ mice  the  value was  1.5  on  day  7.  In  control  and  α7nAChR  heterozygous‐/+ mice  the 

disease decreased from day 9 and reached normal values on day 11. The reduction in ankle thickness 

was significant when we compared control groups with the α7nAChR‐/‐ experimental groups (Fig 1.5 

a). 

Clinical index 

A significant decrease in clinical index was observed between control C57BL/6 mice and α7nAChR‐/‐ 

mice after K/BxN sera  injection. The difference was not significant when we compared α7nAChR‐/+ 

and control mice (Fig 1.5 b). 

 

 

 

Wild type (440bp) 

α7nAChR Homozygous‐/‐ (770bp) α7nAChR Heterozygous+/‐ (440 and 750bp)

DNA Ladder

- 50 -

Figure 1.4: The genotype of α7nAChR  ‐/‐ and  ‐/+ mice were checked by PCR analysis. DNA was taken 

from the mice tail, was described in materials and methods. C57BL/6 mice DNA was used as control 

with 440bp α7nAChR‐specific band, α7nAChR  ‐/‐ 750bp band and α7nAChR  ‐/+ mice shared with 440 

and 750bp bands. 

(a)                                                                               (b) 

 

Figure 1.5 : α7nAChR  ‐/‐ deficient mice are resistant to arthritis. On day 0, 200 µl K/BxN serum was 

injected intraperitoneally in α7nAChR homozygous deficient mice, α7nAChR  ‐/+ and wild type control 

C57BL/6 mice.  The mice  were  assessed  for  arthritis  development  by  (a)  ankle  thickness  and  (b) 

clinical index on days 0, 3, 5, 7, 9 and 11. α7nAChR ‐/‐ mice were completely resistant to arthritis while 

α7nAChR ‐/+ mice showed disease just like the wild type control mice. Data are expressed as mean ± 

SEM; n=3.

 4.1.4. Capsaicin does not provide permanent sympathectomy in Balb/c mice 

Pups were  treated with  capsaicin  (50mg/kg  of  body weight)  at  postnatal  day  1.  After  8 weeks, 

arthritis was induced by injection of 200 µl K/BxN sera. Average ankle thickness was not significantly 

- 51 -

decreased between  the control mice  (n=5) and capsaicin  treated mice  (n=5). The values represent 

the mean ± SEM of ankles/ time points, which were compared with student t‐test to the wild type 

mice (Fig 1.6 a). The experiment was repeated 3 times with same result. 

Clinical Index 

The mice were assessed for arthritis development by clinical index score on days 0, 2, 4, 6, 8, 10 and 

12. There was no significant difference between control and capsacine treated mice (Fig 1.6 b) 

 

(a)                                                             (b) 

Figure 1.6: Permanent Sympathectomy showed no significant difference between the control and 

capsaicin treated pups.  

The effect of capsaicin, an ingredient of hot pepper, on rheumatoid arthritis. Pups were treated with 

capsaicin  (50mg/kg  of  body weight)  at  postnatal  day  1.  After  8 weeks,  arthritis was  induced  by 

injection of 200 µl K/BxN sera. Average ankle thickness (a) and clinical index (b) was not significantly 

decreased comparing the control mice (n=5) and capsaicin treated mice (n=5). The values represent 

- 52 -

the mean ± SEM of ankles/  time points, which were compared with student  t‐test  to  the wild  type 

mice. 

4.1.5. Substance P knockout mice were partially protected from antibody induced arthritis 

SP is known to be widely distributed throughout the central and peripheral nervous system and the 

intestinal  tract of many species  including humans  (Hokfelt et al., 1975;  Jiang et al., 1982; Pernow, 

1983).  In order to specifically observe the influence of the SP in arthritis, we used mice deficient in 

the peptide neurotransmitter SP. SP  is  released  from unmyelinated C  fibers  innervating ankle and 

knee joints. The role of SP has been studied in adjuvant‐induced arthritis (Levine et al., 1984). Levine 

et al found in the rat, joints that developed more severe arthritis were more densely innervated by 

SP  containing primary afferent neurons  than were  joints  that developed  less  severe arthritis. The 

concentration of SP increased in the joints affected by arthritis (Lotz et al., 1987). Joints having dense 

innervations  display more  severe  inflammation  and  tissue  destruction  in  adjuvant  and  collagen 

induced arthritis (Mitchell and Fries, 1982). 

The  Substance  P‐/‐ mice  and  genotype matched  C57BL/6  control mice were  injected with  200  µl 

K/BxN  serum.  Ankle  thickness  and  clinical  index  were  recorded  as  given  in  the  materials  and 

methods section. A reduced arthritis was observed in SP‐/‐ mice. Clinical manifestation of the disease 

was  evident  on  day  3  as  in  control  C57/BL/6 mice  and  SP‐/‐mice.  The  average  ankle  thickness  of 

diseased C57BL/6 mice reached its maximum value with 2.5 mm on day 9 and in SP‐/‐ mice was 2 mm 

on day 9. In both the groups the disease was decreased from day 10 and reached normal values on 

day  21.  The  reduction  in  ankle  thickness was  significant  at day  3,  9,  12  and 15 when  comparing 

control groups with SP knockout  groups (Fig 1.7 a). 

Clinical index 

A significant decrease  in the clinical  index was observed comparing control C57BL/6 mice and SP‐/‐ 

mice after K/BxN sera injection. The difference was significant at days 3, 6, 9 and 15 (Fig 1.7 b). 

- 53 -

These  results  suggest  a  significant  physiological  difference  between  joints  that  develop mild  and 

severe arthritis and  indicate  that  release of  intraneuronal  substance P  in  joints contributes  to  the 

severity of the arthritis. 

 

(a)                                                                              (b) 

 

Figure 1.7: Mice deficient  in the neurotransmitter Substance P (n=5) showed reduced  inflammation 

after  the  injection  of  200µl  K/BxN  sera.  There  was  a  significant  decrease  in  (a)  average  ankle 

thickness (mm) (b) Clinical index between SP knockout mice and C57BL/6 mice.  The values represent 

the mean ± SEM of ankles/ time points. 

 

4.2. Role of macrophage inhibitory factor in K/BxN serum‐induced arthritis  

4.2.1. MIF knockout mice are protected from antibody‐induced arthritis 

Macrophage migration  inhibitory factor (MIF)  is  increasingly recognized as an  important regulatory 

cytokine in immune and inflammatory responses. MIF is a product of activated macrophages, T‐cells 

and endothelial  cells, and up‐regulates  the proinflammatory activity of  these  cells. Here we have 

- 54 -

shown  that  murine  K/BxN  serum‐transfer  model  is  MIF‐dependent  because  MIF  ‐/‐  mice  are 

protected from antibody‐induced arthritis.  

Figure  1.8:  The  genotype  of MIF‐/‐ mice was  checked  analysing  genomic  DNA  by  PCR.  DNA was 

isolated from the mice tail. PCR of C57BL/6 mice DNA was used as control with a 544bp MIF wildtype 

band and MIF‐/‐ mice DNA with a 383bp band.  

MIF ‐/‐ mice with C57BL/6 genetic background were treated with 200 µl K/BxN sera to induce arthritis 

at day 0. Control mice were treated in parallel with 200 µl K/BxN sera. These cohorts were assessed 

for arthritis development, measuring ankle thickness and clinical index scores on days 0, 2, 4, 6, 8, 10 

and  12.  Ankle  thickness  from  MIF‐/‐  mice  showed  significant  decrease  throughout  the  entire 

experiment as compared with wild type controls.  

Clinical manifestation of the disease was evident on day 2 both in control C57BL/6 mice and MIF  ‐/‐ 

mice. The average ankle  thickness of diseased C57BL/6 mice  reached  its maximum value of 2 mm 

and in MIF ‐/‐ mice with 0.8 mm on day 6 and 8. In both the groups the disease decreased from day 8 

on and reached normal values on day 14 (Fig 1.9 a). 

Clinical Index 

A significant decrease in clinical index was observed between control C57BL/6 mice and MIF‐/‐ mice 

after K/BxN sera injection. The difference was significant at days 2, 4, 6, 8 and 10 (Fig 1.9 b). 

DNA Ladder

Wild type (544bp)

MIF‐/‐ (388bp)

- 55 -

(a)                                                                                (b) 

Figure  1.9: MIF‐/‐ mice  (n=8)  and  control  C57BL/6 mice  (n=8)  were  treated  with  intraperitoneal 

injection of 200µl of K/BxN sera and arthritis evaluated by measuring ankle thickness (a) and clinical 

index (b). There was a significant difference in ankle thickness and clinical index scores between the 

two  groups.  The  values  represent  the mean  ±  SEM  of  ankles/  time  points, which were  compared 

student t‐test. 

4.2.2. MIF deficiency reduced joint inflammation and cartilage destruction 

To  accurately  assess  the  degree  of  inflammation  and  destruction  of  bone  and  cartilage,  ankle 

sections were examined using a histopathologic scoring system and found joint swelling and clinical 

severity  of  arthritis  were  higher  in  wild  type  mice  compared  with  MIF  ‐/‐  (day  8  mean  ±SD 

inflammation score 4±0.5 in wild type mice, 1±0.5 in MIF‐/‐ mice; P < 0.0004 and cartilage destruction 

score 0.9±0.5 in wild type mice, 0.2±0.5 in MIF‐/‐ mice; P < 0.0043) (Fig 1.10). Histologic evaluation of 

synovial  inflammation  revealed  high  degrees  of  infiltration  by  polymorphonuclear  leukocytes, 

exudation  of  granulocytes  and  hyperplasia  of  joints  in  wild  type  compared  to  MIF‐/‐  mice. 

Examination of the histologic features of arthritis revealed significant differences  in the severity of 

arthritis, including less inflammation, pannus formation, and bone and cartilage destruction in MIF‐/‐ 

mice joints as compared with wild type mice joints at day 8 post serum transfer (Fig 1.10).  

- 56 -

(a)                    

 

(b) 

P < 0.0004 

P < 0.0043

- 57 -

Figure 1.10: Arthritis scores of 8 weeks old wild type C57BL/6 and MIF‐/‐ mice after administration of 

K/BxN  serum  (n=3  per  genotype  per  time  point)  (a)  Inflammation  (Infiltration  of  the  synovial 

membrane  by  polymorphonuclear  leukocytes  and  exudation  of  granulocytes)  and  (b)  cartilage 

damage  in  mice  was  induced  with  K/BxN  sera  in  wild  type  and  MIF‐/‐  mice  to  evaluate  the 

contribution of MIF. The histology scores for synovial  inflammation, bone and cartilage erosion are 

significantly  less MIF‐/‐ mice  compared  to  the wild  type C57BL/6  (P < 0.0004, 0.0043  respectively). 

Bars show the mean and SEM. P values were determined by student t‐test. 

4.2.3.  Reconstitution  of MIF‐/‐ mice with  naive macrophages  restored  susceptibility  to 

arthritis 

The activities of MIF in vivo and in vitro are strongly suggestive of a role for MIF in the pathogenesis 

of many inflammatory diseases, including RA. However, it has not been known which cells contribute 

to  the  MIF  dependent  pathology  in  RA.  We  hypothesized  that  macrophage  were  key  to  the 

pathology of arthritis. Therefore, macrophages from C57BL/6 mice were adoptively transferred into 

MIF‐/‐  mice.  For  this,  1.5  x  107  peritoneal  macrophages  suspended  in  200  µl  of  PBS  injected 

intraperitoneally  into MIF‐/‐ mice,  and  this was  followed  immediately  by  200  µl  K/BxN  serum  to 

induce  arthritis. Wild  type  cohorts were  treated  in  parallel, with  PBS  only  injections  followed  by 

arthritis induction by K/BxN serum. These mice were assessed for arthritis development, measuring 

ankle thickness (mm) and clinical index scores on days 0, 3, 5, 7, 9 and 12 (Fig 1.11).  

The macrophage reconstituted MIF‐/‐ mice were found to be susceptible to arthritis  induction upon 

K/BxN serum transfer, as evident  from the ankle thickness and clinical  index scores. Typical K/BxN 

serum‐induced  arthritis  manifested  with  a  peak  swelling  around  day  5‐6  and  inflammation 

progressed  up  to  day  8‐12.  Also,  there was  no  difference  in  the  inflammation  (P  <  0.6445)  and 

cartilage  score  (P  <  0.4710)  when  we  compared  wild  type  with  MIF‐/‐  mice  reconstituted  with 

peritoneal macrophages (Fig 1.11c). Thus, reconstitution of MIF‐/‐ mice with peritoneal macrophages 

showed that these are indeed one of the key cellular players in arthritis pathogenesis. 

 

- 58 -

(a)                                                                      (b) 

 

(c) 

Figure  1.11:  Macrophage‐reconstituted  MIF‐/‐  mice  are  susceptible  to  arthritis.  Peritoneal 

macrophages were injected intraperitoneally into the MIF‐/‐ mice, followed by 200 µl K/BxN sera. The 

mice  were  assessed  for  arthritis  development  by  ankle  thickness  and  clinical  index.  MIF‐/‐  mice 

reconstituted with wildtype peritoneal macrophages showed arthritis just like control C57BL/6 mice. 

Data are expressed as mean ± SEM; n=5.  

(c)There was no difference in inflammation and cartilage scores between wild type C57BL/6 and MIF‐

/‐ mice reconstituted with peritoneal macrophages. 

 

- 59 -

4.3  Collagenase‐3  (MMP13)  deficiency  protects  from  antibody‐induced 

arthritis 

4.3.1. An Essential role for MMP13 in K/BxN antibody‐induced arthritis 

Transfer of K/BxN serum into normal mice induced rapid and synchronous development of arthritis, 

the  first  signs  of  joint  inflammation  appearing  with  in  24  hrs  in  fully  susceptible  strains.  The 

degradation  of  articular  cartilage  is  a  characteristic  of  rheumatoid  arthritis. MMP  13  has  been 

suggested to play a role in this degradation. Expression of MMP 13 is low in normal cells, and these 

low  levels  allow  for  healthy  connective  tissue  remodeling  (Uitto  et  al.,  1998).  In  the  pathogenic 

conditions, however the level of MMP 13 expression increases considerably, resulting in connective 

tissue  destruction.  Excess  MMP‐production  is  associated  with  the  pathology  of  many  diseases, 

including atherosclerosis tumour invasion/metastasis and arthritic diseases. 

To elucidate  the  role of MMP 13  in  the antibody  induced arthritis, MMP 13‐/‐ and wild  type mice 

were  injected with 200µl of K/BxN sera  intra‐peritonealy at day 0. After  induction of arthritis,  the 

control mice  showed  typical  signs  and  symptoms  of  arthritis with  increasing  ankle  thickness  and 

clinical index while MMP 13‐/‐ mice showed 50% reduction of disease. Arthritis was monitored every 

2 days by measuring ankle  thickness and clinical  index. The onset of arthritis and ankle  thickening 

started  during  24  h  to  48  h  after  injection  of  sera  in  both MMP13‐/‐  and  control  C57BL/6 mice 

(Figure1.11 a). The ankle  thickness  increased  to a maximum value around day 10 after which  the 

diseases resolved until day 18 (Figure 1.11 a). The average ankle thickness of the MMP13‐/‐ mice was 

decreased  by  1.5  fold  (P<0.0001) when  compared  to  the wild  type.  The MMP13‐/‐ mice  showed 

significant difference  in the ankle thickness values when compared to the wild type C57BL/6 mice. 

Inflammation and joint destruction was assessed histologically from ankle sections of mice sacrificed 

on  days  0,  2,  6,  8  and  14. As  expected  severe  cellular  infiltration  and  synovial  proliferation was 

observed  in the arthritic wild type mice on day 8. Cartilage and bone destruction was observed on 

histological  sections  of mice  sacrificed  on  day  6  and  day  8  (Fig  1.12).  There was  a  difference  in 

- 60 -

synovial  cells  infiltration and pannus  tissue  formation between MMP13‐/‐ and  control mice. These 

clear cut  results  indicate  that  in  this  serum‐transfer model mediated by arthritogenic  Igs, MMP13 

plays an essential role, critically required for disease progression.   

Clinical Index 

A significant decrease  in clinical  index was observed between control C57BL/6 mice and MMP 13‐/‐ 

mice after K/BxN sera injection. The difference was significant at days 10, 12 and 14 (Fig 11.1 b). 

(a)                                                                                 (b) 

 

Figure 1.11: MMP13 ‐/‐ mice were protected from antibody‐induced arthritis. 

MMP13‐/‐ mice (n=21) and control C57BL/6 (n=20) mice were treated with 200µl of K/BxN sera and 

arthritis evaluated by measuring ankle  thickness  (a) and  clinical  index  (b). There was a  significant 

difference in ankle thickness and clinical index scores between the two groups. The values represent 

the mean ± SEM of ankles/ time points, which were compared using the student t‐test. 

Mice Incidence Day of Onset Max AT Max CI Histo. Score

C57BL/6 20 1, 2, 3, 4 2.9 4.0 6, 1.5

MMP13 -/- 21 1, 2, -, - 1.5 2.0 2, 0.8

- 61 -

Tabulation of  results  for 21 MMP 13  ‐/‐ mice and age/gender matched 20  control mice  (C57/BL6); 

Max AT=maximum increase in ankle thickness in millimeter. Max CI=maximum clinical index (for each 

limb: 0, no disease; 0.5, mild swelling of paw; 1, clear joint inflammation in ankle). Histological score, 

inflammatory score and cartilage destruction. 

 

4.3.2. Joint inflammation and cartilage destruction in MMP13‐/‐ mice 

Inflammation and joint destruction was assessed histologically from ankle sections of mice sacrificed 

on  days  0,  2,  6,  8  and  14.  K/BxN  sera was  injected  in wild  type  and MMP13‐/‐  to  evaluate  the 

contribution of MMP13 in arthritis development and progression. Joint swelling and clinical severity 

of arthritis were higher  in wild type mice compared with MMP 13‐/‐ (day 8 mean ±SD  inflammation 

score 6±0.5  in wild  type mice, 1.8±0.5  in MMP13‐/‐ mice; P < 0.05 and cartilage destruction  score 

1.5±0.5 in wild type mice, 0.6±0.5 in MMP13‐/‐ mice; P < 0.0043) (Fig 1.12). Histologic evaluation of 

synovial  inflammation  revealed  high  degrees  of  infiltration  by  polymorphonuclear  leukocytes, 

exudation  of  granulocytes  and  hyperplasia  of  joints  in  wild  type  compared  to  MMP13‐/‐  mice.  

Examination of histologic features of arthritis revealed that there was a significant difference in the 

severity of arthritis, including the extent of inflammation, bone and cartilage destruction in MMP13 ‐

/‐ mice  joints as compared to the wild type  joints at days   4 and 8 post serum transfer (Fig 1.12 b). 

Histological analysis of  joints on day 8  from wild  type arthritic mice demonstrated a characteristic 

inflammation,  synovial  hypertrophy  and  joint  erosion,  findings  that  were  completely  absent  or 

minimally present in MMP13‐/‐ mice (Fig1.13). On day 8 post serum transfer wild type mice (Fig 1.13 

b)  showed,  the  proliferating  inflamed  synovial  tissue  (pannus)  expanded  over  the  surface  of  the 

articular  cartilage, and at places of  contact of  the pannus  tissue with  the  cartilage matrix and/or 

bone degradation of the cartilage and erosion of the bone surface, whereas in MMP13‐/‐ mice there 

was no cartilage destruction and pannus formation.

- 62 -

(a) 

( b)

Figure  1.12:  Arthritis  scores  of  8  weeks  old  wild  type  C57BL/6  and  MMP13‐/‐  mice  after 

administration of K/BxN serum (n=3 per genotype per time point) (a) Inflammation (infiltration of the 

synovial  membrane  by  polymorphonuclear  leukocytes  and  exudation  of  granulocytes)  and  (b) 

cartilage damage  in mice was  induced with K/BxN sera  in wild type and MMP13‐/‐ mice to evaluate 

the  contribution  of MMP13  in  arthritis.  The  histology  scores  for  synovial  inflammation,  bone  and 

cartilage erosion were significantly  less  in MMP13‐/‐ mice compared  to  the wild  type C57BL/6 mice 

(P<0.05). Bars show the mean and ± SEM. P values were determined using student t‐test. 

 

 

- 63 -

(a)

(b)

(c)

Figure  (1.13): Representative  histology  of  ankle  joints  from wildtype  C57BL/6  and MMP13‐/‐ mice 

during  (a) day 0  (before sera transfer) and  (b,c)day 8  (post sera  transfer.(b) wildtype  joints display 

synovial  inflammation,  cartilage  destruction,  pannus  tissue  formation,  bone  erosion  and  synovial 

- 64 -

hypertrophy whereas  (c) MMP13‐/‐  joints were  free of  inflammation and  the  synovium  retained  its 

relatively acellular composition. 

4.3.3. MMP13‐/‐ mice  display  reduced  numbers  of  infiltrating  neutrophil  and  increased 

number of monocytes in the joints.  

The K/BxN antibody‐induced arthritis is characterized by high neutrophil infiltration during onset of 

disease.  The  infiltrating  cells  in  wild  type  and  MMP13‐/‐  ankle  mainly  consist  of  lymphocytes, 

granulocytes and macrophages. However, MMP13‐/‐ mice had less number of neutrophils compared 

to wild  type C57BL/6 mice. There was  an  increase  in  the numbers of neutrophils  (Fig 1.14  a)and 

surprisingly a decrease in the numbers of monocytes (Fig 1.14 b) found in wild type C57BL/6 mice at 

day 7 after serum transfer as compared to MMP13‐/‐ mice. FACS analysis showed that the Ly6G and 

CD11b populations were decreased  and  increased  in MMP13‐/‐ mice  respectively.  The number of 

neutrophils in wild type joints correlated with the levels of inflammation and ankle thickness. These 

data suggested that less inflammation and joint destruction as seen in the MMP13‐/‐ following K/BxN 

serum transfer may be due to lower number of blood neutophils.   

 

              (a)                                                                         (b) 

 

- 65 -

Figure 1.14: (a) Less neutrophils and (b) more monocytes were found in MMP13‐/‐ peripheral blood 

following injection of K/BxN serum 

Immunophenotying of peripheral blood  cells  showed an  increase of neutrophils and a decrease of 

monocytes in the blood of MMP13 ‐/‐ mice compared to wild type C57BL/6 mice at day 7. Peripheral 

blood was isolated from the tail vein of mice. Red blood cells were lysed with lysis buffer followed by 

staining with Ly6G and CD11b antibodies for 30 minutes. 

4.4. Role of redox reactions in RA antibody‐induced arthritis 

4.4.1. In the K/BxN model phytol‐treated mice show an early onset of arthritis  

To elucidate the role of changes  in the redox state, phytol (3, 7, 11, 15‐tetramethyl‐2‐hexadecene‐

1ol) was applied in the antibody‐induced arthritis model. For this Balb/c mice were injected with 200 

µl of phytol. After  five days, arthritis was  induced  in  the phytol‐  treated and control Balb/c mice. 

Onset  and  progression  of  arthritis  was  observed  through  the  next  two  weeks.  Arthritis  was 

monitored  every  two  days  by measuring  ankle  thickness  and  clinical  index.  The  onset  of  ankle 

thickness and clinical index occurred within a 24 hrs in phytol‐treated mice.  The phytol‐treated mice 

showed enhanced arthritis during the first autoimmune phase of the K/BxN model. After day 4, the 

disease  started  resolving  and  on  day  8  the  disease was  resolved  completely.  The  average  ankle 

thickness of the phytol‐treated mice reached 2.5 mm on day 4 and the disease decreased from day 6 

and reached normal values on day 10 as opposed to control Balb/c mice (Fig 1.15).  

Immunohistological examination of normal mouse  joint  tissue  showed  the presence of GPI  in  the 

articular  cavity,  along  the  cartilage  surface;  these  GPI  deposits  were  amplified  in  arthritic mice 

(Matsumoto et al., 2002). During autoimmune phase arthritogenic K/BxN  sera  containing anti‐GPI 

antibodies bind directly to pre‐existing extracellular GPI in normal healthy mouse joints, followed by 

the formation of immune complexs on the articular surface.  And in the chronic phase mice showed 

histological  features  like  leukocyte  invasion,  synovitis,  pannus  formation,  cartilage,  and  bone 

destruction. In control mice the arthritis appeared on day 2 and the average ankle thickness reached 

its maximum value with 3.0 mm on day 8 and disease was resolved by day 14. Comparing phytol‐

- 66 -

treated and control mice, difference in the reduction of ankle thickness was significant at days 6, 8, 

10 and 12 (Fig 1.15 a). 

Clinical Index 

A significant decrease  in  the clinical  index was observed between control Balb/c mice and phytol‐

treated mice after K/BxN sera  injection. The difference was significant at days 6, 8, 10 and 12  (Fig 

1.15 b). 

(a)                                                               (b) 

 

Figure 1.15: Effect of phytol  in K/BxN sera‐induced arthritis. Control Balb/c mice (n=21) and 

Phytol‐treated mice (n=21) were injected with 200µl of K/BxN sera i.p. on day 0 and arthritis 

evaluated  by measuring  ankle  thickness  (a)  and  clinical  index  (b).There was  a  significant 

difference  in ankle  thickness and clinical  index scores between  the  two groups. The values 

represent  the mean  ±  SEM  of  ankles/time  points,  using  student  t‐test  to  the  wild  type 

mice.***‐P<0.0001, **‐P<0.001, *‐P<0.05. 

4.4.2. Increasing the number of R–SH groups on control neutrophils increased the arthritis 

To  measure  the  overall  level  of  cell  surface  R‐SH,  we  took  advantage  of  the  readily  available 

AlexaFluor‐maleimide reagents. The nucleophilic maleimide covalently couples to an available R‐SH 

moiety. Maleimide is effective in its ability to react with thiols and is considered to be highly specific 

- 67 -

for thiol groups. The Alexa dyes that are coupled to maleimide do not interfere with the maleimide‐

thiol  interaction  and  as  they  are  charged molecules, do not enter  the  cell,  thus enabling  a  FACS‐

detectable, overall cell surface‐thiol determination. For assessment of surface thiol  levels  in phytol‐

treated mice cells were stained as described in the material and method section (Chapter III). After 

K/BxN  sera  transfer  surface  thiol  levels  on  neutrophils  were  significantly  decreased  on  day  6 

compared with control mice. The decreased surface thiol levels parallel the resolving disease on day 

6. During  the autoimmune phase  the  surface  thiol  levels were  increased and  in pathogenic phase 

surface thiol levels decreased.  

Figure 1.16: Surface  thiol  levels on neutrophils. Phytol  treated mice  (n=15) have significantly  lower 

levels of surface thiol on neutrophils than the control mice (n=15) at day 6. Cells were stained with 

Alexa maleimide (10µM) followed by staining with Ly6G antibodies. The levels of thiol on the surface 

of  neutrophils  are  presented  as  a  units  of mean  fluorescence  intensity  (MFI).  The  data  are mean 

±SEM,*, Significant difference (P<0.05). 

 

4.4.3. No change of surface thiol levels on monocytes 

Surface  thiol  levels on monocytes were determined  in  the peripheral blood collected  from phytol‐

treated  and  control mice  Balb/c.  After  lysisof  red  blood  cells  the  leukocytes  were  stained  with 

*

- 68 -

antibodies of R‐SH group (Alexa maleimide dye) and CD11b (monocyte marker). After FACS analysis, 

we  found  there was no significant change  in  the monocytes population as compared with control 

mice. 

Figure 1.17: Surface thiol levels on monocytes. Surface thiol levels on monocytes were determined by 

FACS. Peripheral blood was  isolated from mice tail vein. Blood cells were  lysed with  lysis buffer and 

then  leukocytes were  stained with Alexa maleimide  dye  (10µM)  followed  by  staining with  CD11b 

antibodies.  The  difference was  not  significant  comparing  phytol‐treated  (n=15)  and  control mice 

(n=15), P< 0.9619. 

 

4.4.4. Measurement of intracellular ROS in neutrophils 

Polymorphonuclear neutrophils (PMNs) are crucial in host defence against invading microorganisms 

through reactive oxygen species (ROS) production. However, generated ROS released  in excess can 

damage  the  host  tissue.  Intracellular  PMN  ROS‐production  was  measured  using  2′‐7′‐

dichlorofluorescen  diacetate  (DCFH‐DA)  and  flow  cytometry.  The  dyes  is    nonfluorescent  until 

oxidized  by  ROS  and  an  increase  in  fluorescence  of  DCFDA  indicates  oxidation  by  peroxides, 

peroxynitrite, and/or hydroxyl radicals. PMN were incubated with DCFDA before Ly6G staining, and 

the  median  fluorescence  intensity  was  determined.  Fig  1.19  demonstrates  that  there  were  no 

- 69 -

differences in intracellular ROS in PMN comparing control and phytol‐treated mice after K/BxN sera 

transfer.  

Figure  1.19:  Intracellular  ROS  levels  in  neutophils.  There  was  no  significant  difference  when  we 

compared control mice with phytol‐treated mice, P < 0.9432. 

4.5.5. Measurement of intracellular ROS in monocytes 

Comparisons between  the  control  and phytol  treated monocytes  revealed  that  the  generation of 

ROS by phytol‐treated cells was insignificantly higher than in the controls. There was no difference in 

intracellular ROS generation  in monocytes after phytol‐treatment when compared with the MFI of 

control mice.  

- 70 -

Figure 1.20: Intracellular ROS levels in monocytes. The levels were insignificantly increased in phytol 

treated mice (n=15) on day 6 as compared to control mice (n=15), P < 0.8607. 

4.4.6. Number of neutrohils increased after phytol treatment 

The absolute number of neutrophils after phytol‐treatment were measured using true count beads. 

The number of neutrophils were calculated per microliter. We found that before sera induction the 

numbers of neutrophils were significantly higher in phytol treated mice as compared to control mice 

but after sera transfer there was no significant difference between the groups. 

Figure 1.21: Neutrophils were counted by BD true count beads. At day 0, phytol‐treated mice (n=8) 

neutrophil counts were significantly higher than in control mice (n=8), P < 0.008. 

4.4.6. No change in the levels of surface thiol in young and old KBN and BN mice 

Surface redox  levels on monocytes   and neutrophils from young and old KBN mice and young   and 

old BN mice   were   determined by FACS after staining the cells  for reduced  thiol  (‐SH) groups and 

leukocytes  specific  markers.  No  difference  in  the  levels  of  surface  thiols  on  monocytes  and 

neutrophils was observed when we compared young KBN with young BN and old KBN with an old BN 

mice. There were increased surface thiol levels on monocytes and neutrophils in old KBN and old BN 

than the young KBN and BN mice, although the difference was not significant. 

 

**

- 71 -

 

(a)                                                                               (b)

Figure 1.22:   Surface  thiol  levels on monocytes  (a) and neutrophils  (b)  in old KBN and young KBN 

mice. The  thiol  levels on  the surface of monocytes and neutophils were presented as units of MFI. 

There was no significant change of surface  thiol  level  in young KBN  (n=4) as compared  to old KBN 

mice (n=4). There were no differences of surface thiol levels in the young and old KBN compared with 

young and old BN mice. 

 

4.5.  MCP‐1  antagonist  treatment  does  not  protect  mice  from  antibody‐

induced arthritis 

Balb/c mice were treated with MCP‐1 antagonist once weekly for 5 weeks. Arthritis was induced by 

intraperitoneal  injection of 200 µl K/BxN sera  in MCP‐1 antagonist treated mice and control Balb/c 

mice.  Ankle  thickness was measured  every  third  day.  The  average maximum  ankle  thickness  in 

control mice was 2.9 mm while  in MCP‐1 antagonist treated mice  it was 2.4 mm at day 6 and the 

swelling decreased slowly from day 9  in both the groups. The decrease  in ankle thickness between 

control  and  MCP‐1  treated  Balb/c  mice  was  not  significant.  MCP‐1  antagonist‐treated  mice 

developed disease was similar to control mice (Fig 1.23a).  

- 72 -

Clinical Index 

The clinical  index was measured every third day  in both the groups. There was no decrease  in the 

clinical index comparing control mice and MCP‐1 antagonist‐treated mice (Fig 1.23b). 

(a)                                                            (b) 

Figure 1.23: MCP‐1 antagonist‐treated mice were not protected from serum‐induced arthritis. 

Balb/c mice were treated with MCP antagonist (2mg/kg body weight) and control mice were treated 

with vehicle only. Arthritis was induced injecting 200 µl K/BxN sera. The difference was not significant 

in  ankle  thickness  (a)  and  clinical  index  (b)  between MCP‐1  antagonist  treated mice  (n=10)  and 

control mice (n=10).The values represent the mean ± SEM of ankles/ time points, using student t‐test. 

4.6. DBA mt FvB mice are not protected from antibody induced arthritis 

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex, multifactorial polygenic disease that is influenced by age and 

sex as well as hormonal and environmental factors (Silman, 1994). Susceptibility to RA is controlled 

by genetic factors. Quantitative traits such as complex diseases are controlled by many genes with 

small‐effect that are difficult to identify. The genetic contribution to RA susceptibility is estimated to 

be as much as 60%, of which the HLA– DRB1 locus is thought to account for 30–50% (MacGregor et 

al., 2000; Wordsworth et al., 1989). For arthritis  severity,  recently a new QTL, Cia2 and Cia4 was 

- 73 -

identified  (Bauer  et  al.,  2004).  Cia2  control  the  severity  and  Cia4  control  the  onset  of  disease. 

However, Cia2 contributed only to 16% to the phenotypic variations, indicating that there should be 

some small‐effect QTL.  

 Here, we used (DBA/1J × FVB/N) F2 progeny for the sera‐induced arthritis and DBA/1 used as wild 

type control. We found that DBA mt FvB mice were as highly sensitive to arthritis as were wildtype 

DBA/1 mice. 

Arthritis was evaluated by measuring ankle thickness every two days. The average maximum ankle 

thickness in control DBA/1 mice it was 3.8 mm while in DBA mt FvB mice was 3.4 mm at day 6 and 

the  swelling  decreased  slowly  from  day  9  in  both  the  groups.  The  decrease  in  ankle  thickness 

between DBA/1 and DBA mt FvB mice was not significant. DBA mt FvB sera treated mice developed 

arthritis and progress of the disease was similar as DBA/1 mice (Fig 1.24 a).  

Clinical  Index: The  clinical  index was measured every  third day  in both  the groups. There was no 

decrease in clinical index comparing DBA/1 mice and DBA mt FvB sera‐treated mice (Fig 1.24 b). 

(a)                                                                 (b) 

- 74 -

Figure 1.25: DBA mt FvB mice were not protected  from serum  induced arthritis. DBA mt FvB  (n=5) 

and wild  type DBA/1  (n=5) were  injected with 200µl of pooled serum  from arthritic K/BxN mice on 

day 0. Arthritis was evaluated by measuring ankle thickness (a) and clinical  index (b) every 2 days.  

The values represent the mean ± SEM of ankles/ time points, using student t‐test. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

- 75 -

4.7. Soluble CD21 and CD23 concentration in autoimmune diseases 

 4.7.1. Antiphospholipid syndrome patients display reduced titers of soluble CD21 in their 

sera irrespective of circulating anti‐beta‐2‐glycoprotein‐I autoantibodies.  

Sera from 49 APS patients and 24 controls (table 1) were analyzed for the presence of sCD21 using a 

sandwich ELISA. The sera were diluted 1:50 and applied to the ELISA assay. For control standard sera 

with known sCD21 titer was used in serial dilution. Comparing standard, patients and healthy control 

sera we  determined  the  concentration  of  sCD21  in  ng/ml. We  used  the Mann‐Whitney  test  for 

statistical analysis. The  level of sCD21  in healthy control  ranged  from 100‐500 ng/ml  (median 330 

ng/ml) while in APS it was 10‐250 ng/ml (Median 121.95 ng/ml) (Fig 2.1). Thus sCD21 is significantly 

reduced in APS patients sera compared to healthy controls. 

p<0.0001

Healthy Doner APS0

250

500

750Healthy DonerAPS

 

Figure2.1.  Serum  soluble  CD21  (sCD21)  levels  in  Antiphospholipid  Syndrome  (APS).  Serum  sCD21 

concentrations of APS patients (n=49) were compared to healthy donors (n=24). Serum sCD21 levels 

are significantly decreased in APS patient samples (P<0.0001). Horizontal lines in the graph represent 

the median value. Statistical significance was calculated using nonparametric Mann‐Whitney test. 

 

- 76 -

        Samples          n        p<0.05      Rank 

Control/APS       24/49         ***          S 

APS‐SLE‐ve/+ve       14/34      0.7832         Ns 

APS‐DVT‐ve/+ve       16/32      0.0716         Ns 

APS‐B2GPI‐ve/+ve       24/24      0.1539         Ns 

APS‐P‐APS‐ve/+ve       21/27      0.8835         Ns 

APS‐Art‐Th‐ve/+ve       20/28      0.3953         Ns 

APS‐TH‐ve/+ve       31/16      0.7448         Ns 

APS‐FETAL‐ve/+ve       35/13      0.1635         Ns 

APS‐Joints‐ve/+ve       34/12      0.3656         Ns 

Table 1.  Serum soluble CD21 levels in other disorders of Antiphospholipid Syndrome. There were no 

significant changes in serum sCD21 levels. Statistical significance was calculated using nonparametric 

Mann‐Whitney test. 

Table 2   

APS Patients Characteristic (n=49)                        %* 

Deep Vein Thrombosis(DVT)                        16.5 

Beta 2GPI (IgM)                        12.5 

Beta 2GPI (IgG)                          25 

Primary antiphosholipid Syndrome (P‐APS)                          14 

Systemic Lupus Erythematosus (SLE)                         7.5 

Thrombosis                          22 

Fetal Loss                         6.5 

Venous Thrombosis                         17 

Arterial Thrombosis (Leg or hands)                         2.5 

Transient Ischmemic Attcak (TIA)                         2.5 

Stroke                         3.5 

Multiinfarct dementia                         7.5 

Pulmonary embolism and infarction                         6.5 

Digital gangrene                         0.5 

Retinal artey Thrombosis                           0 

- 77 -

Arterial Thrombosis                        10.5 

Epilepsy                         1.5 

Migraine                           2 

Vegetations                         0.5 

Avascular necrosis of bone                         0.5 

Joints                         6.5 

Livedo reticularis                          2 

Autoimmune hemolytic anemia                          1 

Thrombocytopenia                          8.5 

 

*The values given represent percentage of patients which were positive for the symptom. 

4.7.2. Soluble CD21 levels in Autoimmune Lymphoproliferative Syndrome (ALPS). 

Autoimmune Lymphoproliferative Syndrome  (ALPS)  is an  inherited disorder of the  immune system 

that  affects  both  children  and  adults. Autoimmune  lymphoproliferative  syndrome  is  caused  by 

genetic mutations  that  interfere with  apoptosis  or  programmed  cell  death.  Normally,  all  of  the 

body’s  cells  have  a  programmed  cell  death  or  survival  time  known  as  apoptosis.  And  normally, 

apoptosis  prevents  the  accumulation  of  mature  lymphocytes.  symptoms  in  autoimmune 

lymphoproliferative  syndrome  include moderate  to massive  splenomegaly  (enlarged  spleen),  skin 

rashes,  frequent nosebleeds, enlarged  lymph nodes especially  in the neck, enlarged  liver, petechia 

(small  bruises),  edema,  evidence  of  autoimmunity  expressed  usually  as  autoimmune  hemolytic 

anemia,  increased  levels  of  gamma  immunoglobulins  (hypergammaglobulinemia),  B‐cell 

lymphocytosis  (increased  number  of  B‐lymphocytes),  thrombocytopenia  (decreased  platelets), 

autoimmune neutropenia (decreased number of segmented granulocytes), and the expansion of an 

unusual  population  of  CD4‐CD8‐  T  cells  (lymphocytes with markers  for  T‐helper  and  T‐suppressor 

functions) that express the alpha/beta T‐cell receptor (TCR). 

The  soluble CD21 concentration were estimated  in  the  sera  from 17 ALPS patients and compared 

with healthy volunteers.  The range of sCD21 in healthy individuals was 50‐300 ng/ml with a median 

of 200±5 ng/ml while the levels of sCD21 in ALPS patients were 50‐1300 ng/ml with a median 650±5 

- 78 -

ng/ml  (Fig  2.2). We  found  the  levels  of  sCD21 were  significantly  increased  in ALPS  patients  sera 

samples as compared to healthy individuals, P < 0.006. 

Control ALPS 0

500

1000

1500

Figure  2.2:  The  serum  Soluble  CD21  concentration  is  significantly  increased  in  ALPS  patients 

compared  to  healthy  controls  (P  <  0.006).  Horizontal  lines  represent  the median  and  statistical 

significance was calculated using nonparametric Mann Whitney test.  

 

4.7.3. Soluble CD21 levels in Vaccinated patients sera samples 

Serum  samples of  vaccinated  volunteers were  tested  for  their  sCD21  concentration by ELISA  and 

compared to non‐vaccinated controls. The serum sCD21 concentration in vaccinated patients ranged 

from 10‐850ng/ml with a median of 300±5 ng/ml while control samples ranged from 10‐275 ng/ml 

with a median 185±5 ng/ml. The serum sCD21 concentration were  found significantly  increased  in 

vaccinated patients (P < 0.0001). 

**

- 79 -

Heathy Donor Vaccinated Donor0

250

500

750

Figure  2.3:  Serum  sCD21  concentration  of  vaccinated  volunteers  (n=40)  were  estimated  and 

compared  with  non‐vaccinated  controls  (n=25).  Serum  sCD21  was  significantly  increased  in 

vaccinated patients  (P < 0.0001). Statistical significance was calculated using nonparametric Mann 

Whitney test. 

4.7.4 Decreased  levels of sCD21 and sCD23  in patients with autoimmune diabetes type  I 

not with type II 

4.7.4.1. Levels of serum soluble CD21 are decreased in sera of patients with Diabetes type I 

but not with Diabetes type II 

Sera from 30 age matched healthy donors and 30 each diabetes type I and II patients were analyzed 

for  the presence of  sCD21 using a  sandwich ELISA. The  sera were diluted 1:50 and applied  to  the 

ELISA assay. For control standard sera with known sCD21 titer was used in serial dilution.  

Comparing standard, patients and healthy control sera we determined the concentration of sCD21 in 

ng/ml.   We compared sCD21 concentration  in age matched healthy controls with those  in diabetic 

type I and II patients sera samples and found a statistically significant reduction with diabetes type I 

(P < 0.0067) and no statistically significant reduction with diabetes type II patients sera samples (P < 

***

- 80 -

0.8603). The  levels of sCD21  in healthy control ranged  from 30  to 400 ng/ml  (Median 204 ng/ml), 

diabetes type I and II were 50‐400ng/ml (Median 166 ng/ml) and 100‐400ng/ml (Median 216 ng/ml) 

respectively (Fig 2.4.1). Mann‐ Whitney test was used for statistical comparison. 

Control Diabetes I Diabetes II 0

100

200

300

400

 

 Figure 2.4.1: The serum sCD21 concentration was significantly decreased  in diabetes  I  (n=30)  (P < 

0.0067)  but  not  in  diabetes  II  (n=30)  patients  as  compared  to  healthy  controls  (n=30).  Statistical 

significance was calculated using the nonparametric Mann Whitney test.  

4.7.4.2. Levels of Serum  soluble CD23  levels  in  sera of patients with Diabetes  type  I are 

decreased but not with diabetes type II 

Serum sCD23 concentration of diabetic I and II patients (n=30 each) were estimated and compared 

to age‐matched healthy donors (n=30). The sera samples were diluted 1:5 and applied to the sCD23 

ELISA assay. The median values of sCD23 in healthy donor were 72 U/ml while in diabetes type I and 

II were  42 U/ml  and  63 U/ml  respectively  (Fig  2.4.2). A  significant  decrease  of  sCD23  in  sera  of 

diabetic  type  I  patients  (P  <0.0001)  and  non  significant  increase  in  diabetes  type  II  (P  <  0.5692) 

compared to age matched healthy controls. The Mann‐Whitney test was used for statistical analysis. 

 

 

**

- 81 -

Control Diabetes I DiabetesII0

20

40

60

80

100

Figure  2.4.2:  The  serum  sCD23  concentration  of  diabetes  I  (n=30)  patients  were  estimated  and 

compared with healthy controls (n=30). Serum sCD23 levels were significantly decreased in diabetes I 

(P  <  0.0001)  samples  but  not  in  diabetes  II. Horizontal  lines  represent  the median  and  statistical 

significance was calculated using nonparametric Mann Whitney test. 

4.8.4.3. Decreased  levels of plasma  sCD21 after pro  insulin  treatment  in diabetic obese 

patients

Next we measured sCD21 concentration in plasma of obese diabetic patients after (n=87) and before 

(n=87)  proinsulin  treatment.  The median  values  of  sCD21  in  the  pre  treatment  group were  200 

ng/ml and in after treatment were 174 ng/ml. We found sCD21 levels were significantly reduced  in 

patients  after  treatment  (n=87) with  pro  insulin  as  compared with  before  treatment  (n=87)  (P  < 

0.001).We used the Mann‐Whitney test for statistical analysis (Fig 2.4.3). 

***

- 82 -

Before Treatment After Treatment0

250

500

750

Figure  2.4.3:  The  serum  soluble  CD21  concentration  was  significantly  decreased  in  the  diabetic 

patients with BMI < 90 treated with proinsulin (n=87) compared to untreated group (n=87) (P<0.001). 

Horizontal lines in the graph represent the median value. Statistical significance was calculated using 

the nonparametric Mann Whitney test.  

 

4.8.4.4.  Increased  levels  of  plasma  sCD23  after  pro  insulin  treatment  in  diabetic  obese 

patients

40 Plasma samples  from obese diabetic patients before and after  treatment with pro  insulin were 

analyzed  for  the  presence  of  sCD23  using  a  sandwich  ELISA.  The  patient  plasma  samples  were 

diluted 1:5 and applied to the sCD23 ELISA assay. The  levels of sCD23  in pre treatment group with 

median 101 U/ml and in after treatment group were 132 U/ml. Soluble. We found sCD23 levels were 

significantly  increased  in  patient’s  after  treatment  (n=40) with proinsulin  treatment  as  compared 

with before (n=40) treatment (P < 0.0001).We used the Mann‐Whitney test for statistical analysis.  

**

- 83 -

Before Treatment After Treatment0

100

200

300

Figure  2.4.4:  The  serum  soluble  CD23  concentration  was  significantly  increased  in  the  diabetic 

patients with BMI < 90  (n=40) of  treated group compared  to untreated persons  (n=40)  (P<0.0001). 

Horizontal lines in the graph represent the median value. Statistical significance was calculated using 

the nonparametric Mann Whitney test. 

              Samples               P‐Value            Significance 

               sCD21     

            Diabetes I (n=30)                 0.0067                      ** 

            Diabetes II (n=30)                 0.8603                      ns 

               sCD23     

            Diabetes I (n=30)                 0.0001                      *** 

            Diabetes II(n=30)                 0.5692                       ns 

 

Table  1:  P‐values  of  sCD21  and  sCD23  of  diabetic  I  and  II  samples.  Statistical  significance was 

calculated by nonparametric student t‐test of graph pad prism software. 

 

 

***

- 84 -

4.7.5.  Decreased  levels  of  sCD21  and  sCD23  in  blood  of  patients  with 

Systemic Juvenile Arthritis, Polyarticular Juvenile Arthritis and Pauciarticular 

Juvenile Arthritis 

4.7.5.1. Low levels of soluble CD21 in plasma of patients with JA  

Plasma from 20 age‐matched healthy donors and 20 of each subtype of JA patients were analyzed 

for the presence of sCD21 using a sandwich ELISA. The plasma were diluted 1:50 and applied to 

the ELISA assay. For control standard sera with known sCD21 titer were used in serial dilution.  

Comparing  standard, patients and healthy control plasma, we determined  the concentration of 

sCD21 in ng/ml. The median levels of sCD21 in healthy controls were 700ng/ml, in O‐JA 200 ng/ml, 

in  P‐JA  400  ng/ml  and  in  S‐JA  225ng/ml  (Fig  2.5.1). When we  applied  the Mann‐Whitney  test 

comparing data from all subtypes of JA with controls we found that sCD21 levels were significantly 

reduced in all subtypes of JA as compared with healthy donors (P < 0.0001 for O‐JA and S‐JA and P 

< 0.0068 for P‐JA).  

We also compared the sCD21  levels among the JA subtypes. Comparing P‐JA with O‐JA and S‐JA 

showed significant decrease in sCD21 (P < 0.0001 and 0.0036 respectively). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

- 85 -

Control O-JA P-JA S-JA0

200

400

600

800

1000

1200

Figure 2.5.1: Plasma sCD21  levels  in patients suffering  from different  forms of  Juvenile Arthritis. 

Plasma  sCD21 concentration of O‐JA  (n=20), P‐JA  (n=20) and S‐  JA  (n=20) were determined and 

compared to healthy controls. Plasma sCD21 levels were significantly decreased in all subtypes of 

JA  samples  (P  <  0.0001).  Horizontal  lines  represent  the  median.  Statistical  significance  was 

calculated using nonparametric student t‐test.

4.7.5.2. Low levels of soluble CD23 in plasma of patients with JA  

Next we measured sCD23  levels  in  the plasma of patients  representing  the 3  subtypes of  JA by 

ELISA. Median sCD23 levels in healthy controls were 45 U/ml, in O‐JA 20 U/ml, 30 U/ml in P‐JA and 

35 U/ml in S‐JA (Fig 2.5.2). The levels of sCD23 were significantly reduced in P‐JA (P < 0.0001) and 

S‐JA  (P  <  0.0184) while  the  reduction  of  sCD23  in O‐JA was  not  significant  as  compared with 

healthy controls. 

Unlike sCD21 levels comparing the subtypes of JA, sCD23 levels were significantly increased when 

we compared P‐JA with S‐JA (P < 0.009) but we found non‐significant decreased  levels when we 

compared P‐JA with O‐JA (P < 0.4181). 

***

*** **

*** **

- 86 -

 

Control O-JA P-JA S-JA0

50

100

150

200

Figure 2.5.2: Plasma sCD23  levels  in patients suffering  from different  forms of  Juvenile arthritis. 

The sCD23 concentrations were measured  in plasma from healthy controls (n=20) and compared 

with  JA patient samples. Plasma sCD23 were significantly decrease  in P‐JA  (P < 0.0001) and S‐JA 

samples (P < 0.0184). Horizontal lines represent the median. Statistical significance was calculated 

using the nonparametric student t‐test. 

4.7.5.3. Plasma sCD23 but not sCD21 levels correlate with age in healthy donors 

In  the previous  study  (Masilamani et al., 2003) we  found  that  sCD21  levels decline  significantly 

with age, comparing groups spanning 0‐20, 21‐40 years of life and so on. The decline was stronger 

in the younger age, therefore we here analyzed children grouped  in cohorts spanning 5 years of 

age  (0‐5,  6‐10  and  11‐15  years).  Analyzing  healthy  donors,  we  found  that  levels  of  sCD21 

significantly decrease with age comparing the 0‐5 years group with the 11‐15 group (P < 0.0077) 

(Fig 2.5.3a). The levels of sCD23 decreased with age comparing the 0‐5 years group with the 6‐10 

and the 11‐15 years group (P < 0.0068, 0.0021 respectively, Fig 2.5.3b).

**

*

***

- 87 -

(a)                                                                      (b) 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figure 2.5.3: Plasma sCD23 not sCD21 concentration decreases with age. The data were grouped 

0‐5, 6‐10, 11‐15 years age group. The Mann‐Whitney test was done to obtain non‐parametric two‐

tail  P  values  (a)  The  sCD21  levels  was  significant  decreased  in  11‐15  years  age  group  when 

compared  with  0‐5  years  age  group  (P  <  0.0077)  whereas  (b)  sCD23  values  were  significant 

decreased  in  6‐10  and  11‐15  years  age  group when  compared with  0‐5  years  age  group(  P  < 

0.0068 and 0.0021 respectively ). 

4.7.5.4. Plasma sCD21and sCD23 levels decline with age in JA 

sCD21 and sCD23  levels were determined  in all age groups as above comparing the JA subtypes 

with  healthy  controls.  sCD21  levels  in  S‐JA  in  the  0‐5  year  group  were  300  ng/ml  average 

compared to 800 ng/ml in the control group (difference statistically not significant). However, the 

difference was significant in the 6‐10 (median 257 ng/ml) and 11‐15 years age group (median 230 

ng/ml) of S‐JA when compared with the control groups (6‐10 years median 609 ng/ml; 11‐15 years 

median 500 ng/ml (P < 0.0039, 0.0057 respectively) (Fig 2.5.4a). 

Like  in  S‐JA,  sCD21  levels were  also  significantly  decreased with  age  in  the  6‐10  years  group 

(median 255 ng/ml) and the 11‐15 years group (median 195 ng/ml)  in O‐JA   when we compared 

**

**

0-5 6-10 11-150

500

1000

1500

2000

Age (Years)0-5 6-10 11-15

0

100

200

300

400

500

Age (Years)

**

***

- 88 -

with their respective controls (group 6‐10 years median 609 ng/ml; group 11‐15 years median 500 

ng/ml (P < 0.0038, 0.0004 respectively) (Fig 2.5.4b). In contrast there was no significant difference 

in the P‐JA age groups (data not shown). 

Analysis of sCD23 levels in S‐JA showed a statistically significant difference when compared to the 

levels of healthy controls only in the 6‐10 years group (P < 0.01) (Fig 2.5.5a). 

Similarly, in P‐JA, the sCD23 levels in the 6‐10 year age group (median 25 U/ml) were significantly 

lower compared with the controls (median 35 U/ml) (P < 0.0001) (Fig 2.5.5b). 

In O‐JA, sCD23  levels were significantly  lower  in the 6‐10 years age group (median 25 U/ml) and 

11‐15  years  age  group  (median  20  U/ml)  compared  with  the  respective  control  6‐10  years 

(median  35 U/ml)  and  11‐15  years  age  group  (median  35 U/ml)  (P  <  0.005)  (Fig  5c).  Thus  the 

reduction of sCD23 and sCD21 in JA is independent of age. 

(a)                                                                    (b)     

S-JA

6-10 6-10 11-15 11-150

250

500

750

1000

Age (Years)

Figure 2.5.4: Levels of sCD21 in JA subtypes patients are low irrespective of age. The control and JA 

subtypes sCD21 data were grouped according to age. sCD21  levels from healthy volunteers were 

compared with the corresponding age group of  (a) S‐JA and (b) O‐JA. 

 

 

*****

** ***

O-JA

6-10 6-10 11-15 11-150

250

500

750

1000

Age (Years)

- 89 -

(a)                                                                                 (b)                                                                    

S-JA

6-10 6-10 11-15 11-150

50

100

150

200

Age (Years)

(c)

O-JA

6-10 6-10 11-15 11-150

50

100

150

200

Age (Years)

Figure 2.5.5: Levels of sCD23 in control and JA subtypes grouped according to age. Control sCD23 

levels compared with their respective age group of (a) S‐JA, (b) P‐JA and (c) O‐JA.

4.7.5.6. Blood granulocytes were significantly increased in S‐JA patients compared with 

control and O‐JA and P‐JA patients

****

**

**

P-JA

6-10 6-10 11-15 11-150

50

100

150

200

Age (Years)

- 90 -

Lymphocytes, granulocytes and monocytes were counted during diagnostical examination of the 

JA blood samples. Granulocytes were significantly increased in S‐JA (P < 0.0001) as compared with 

control and also with P‐JA and O‐JA samples (Figure2.5.6). 

 

 

Figure 2.5.6: Blood granulocyte counts were significantly  increased  in S‐JA patients compared  to 

those from control, O‐JA and P‐JA (P < 0.0001).

4.7.5.7. JA patients in remission showed increased sCD23 levels

All  subtypes of  JA plasma  samples were  further divided  into active and  remission disease  state 

and  the sCD21 and sCD23  levels were determined. We  found no significant difference  in sCD21 

levels (P < 0.9718) (Fig 2.5.7a) but sCD23  levels differed significantly when comparing active and 

remission JA disease state, with higher values in patients in remission (P < 0.002) (Fig2.5.7b). 

 

 

 

******

***

- 91 -

 

(a)                                                                    (b) 

Active Remission0

250

500

750

1000

Figure 2.5.7: (a) sCD21 and (b) sCD23  levels  in active and remission disease state. Plasma sCD21 

levels were  insignificant comparing active and  remission disease state while difference  in  sCD23 

levels were significant (P<0.0022), using the nonparametric student t‐test.

Table 2.5.1: P‐ values of sCD21 and sCD23 of JA samples. Statistical significance was calculated by 

nonparametric student t‐test of graphpad prism software. 

           Samples             P Value             Significance sCD21                                         O‐JA             0.0001                  ***         P‐JA             0.0068                   **         S‐JA             0.0001                  ***sCD23              O‐JA             0.3843                   ns          P‐JA             0.0001                  ***         S‐JA             0.0184                    * Table 5.2.2:  P‐values of sCD21 and sCD23 in active and remission disease state. 

Active and Remission             P Value          Significance 

         sCD21           0.9718                 ns 

         sCD23           0.0022                 **

 

**

Active Remission0

20

40

60

80

100

- 92 -

Table  5.2.3: Median  and  interqartile  range  of  (a)  sCD21  and  (b)  sCD23  in  healthy  Controls  and 

subtypes of JA. 

(a) Patient Group (sCD21)       Median Range   Interquartile Range      Control (n=20)      600 ng/ml±10         180‐1100 ng/ml          JA‐O (n=20)      200 ng/ml±10              10‐400 ng/ml           JA‐P (n=20)      400 ng/ml±10             150‐800 ng/ml           JA‐S (n=20)      220 ng/ml±10               20‐500 ng/ml        JA‐All (n=20)      250 ng/ml±10               0‐800 ng/ml    (b) Patient Group (sCD23)            Median Range         Interquartile Range      Control  (n=20)            45 U/ml ±10                  0‐170 U/ml         O‐JA  (n=20)            25 U/ml ±10                   0‐150 U/ml          P‐JA  (n=20)            30 U/ml ±10                   0‐90  U/ml          S‐JA  (n=20)            35 U/ml ±10               0‐100 U/ml        All‐JA  (n=20)            25 U/ml ±10               0‐150 U/ml                                                    

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

- 93 -

CHAPTER‐V                                                                                                                        DISCUSSION   5.1. The sympathetic nervous system and antibody‐induced arthritis 

Importance  of  the  nervous  system  in  immune  regulation  is  clearly  suggested  by  innervations  of 

lymphoid  tissues  by  sympathetic  nerve  fibers.  In  a  disease  like  arthritis,  there  is  a  persistent 

inflammation characterized by micro vascular permeability and neutrophil  influx  into  the  joints.  In 

the antibody‐induced arthritis model, the onset of the disease is marked by joint swelling within 24 

hours of pathogenic antibody  injection  in Balb/c mice. This strain  is highly susceptible  to antibody 

induced‐arthritis  (Maccioni  et  al.,  2002;  Solomon  et  al.,  2002).  In  this  model  of  arthritis,  the 

alternative pathway of  the  complement  system  is  involved  (Ji et al., 1999; Solomon et al., 2002). 

Development of disease  requires FcγRIII and C5aR as well as neutrophils  (Wipke and Allen, 2001), 

mast  cells  (Kneilling  et  al.,  2007;  Lee  et  al.,  2002),  macrophages    (Solomon  et  al.,  2002)  and 

inflammatory cytokines like TNF‐α and IL‐1β. 

Here, we have provided evidence  that neural pathways contribute  to  the clinical manifestation of 

antibody‐induced arthritis. There has been  considerable debate  regarding  the  role of  sympathetic 

nerves in chronic inflammatory diseases. Joints are supplied with nerves contacting myelinated and 

unmyelinated primary afferent fibers. Neurogenic inflammation is defined as the oedema formation, 

increased blood  flow and  involvement of  inflammatory cells observed after stimulation of sensory 

nerve fibers and release of neuropeptides, such as substance P (SP), calcitonin gene related peptide, 

and neuropeptide Y.  

The  role  of  substance  P  has  been  studied  in  adjuvant‐induced  arthritis  (Levine  et  al.,  1984).  The 

concentration  of  substance  P  is  increased  in  the  joints  affected  by  arthritis.  Joints  having  dense 

innervations  display  more  severe  inflammation  and  tissue  destruction  in  adjuvant  or  collagen‐ 

induced arthritis (Levine et al., 1984).  

- 94 -

Substance  P  has  a potent  effect on  the  cellular  components of  inflammation,  such  as neutrophil 

accumulation  (Cao  et  al.,  2000).  Moreover,  Substance  P  is  a  powerful  mediator  of  vascular 

permeability. It is released from the unmyelinated C‐fibers in the joints. Besides joints and mucosal 

epithelium  immunoreactive  Substance  P,  Substance  P  mRNA  and  NK‐1R  are  found  in  the 

macrophages and mast cells where they   stimulate the release of TNF‐α (Ansel et al., 1993; Luber‐

Narod et al., 1994; Pascual and Bost, 1990). The Substance P receptor NK‐1R  is also present on the 

post  capillary  venular  endothelium  (Baluk  et  al.,  1996)  and  NK‐1R  is  expressed  on  lymphocytes, 

macrophages, endothelial cells, neurons and other cell types. The release of Substance P is an early 

event in immune complex mediated injury and acts as an amplifier of the subsequent inflammatory 

changes.  Substance P  acts on  the  vascular  endothelium  to  cause  leakage of plasma proteins  and 

thereby  increasing  the  concentration  of more  and more  complement  components  at  the  site  of 

inflammation. Complement components are fixed by the immune complexes and ultimately release 

C5a  (Sylvestre and Ravetch, 1996). 

Macrophages/monocytes  and  the  proinflammatory  mediators,  such  as  TNF‐α,  prostaglandin  E2 

(PGE2),  macrophage  inflammatory  protein  (MIP)‐1α  and  MIP‐1α,  play  a  critical  role  in  the 

progression of  immunological disorders  including rheumatoid arthritis, Behçets disease and Crohns 

disease. 

It has been known that if adult and neonatal pups are treated with 6‐OH Dopamine they denervate 

the  sympathetic nerve  fibers    (Taxt et al., 1983). Considering  the  role of  the  sympathetic nervous 

system  in  the K/BxN sera‐induced arthritis model, we sympathectomised adult mice and neonatal 

pups  with  6‐OH  Dopamine  to  denervate  the  sympathetic  nervous  system  and  we  observed  

protection in transiently and permanently sympathectomised mice.  

Next we determined the role of capsaicin in the neonatal pups. Capsaicin, the parent compound of a 

group of vanillyl fatty acid amides isolated from capsicum, is a distinct, single chemical entity (Buck 

and  Burks,  1986;  Cordell  and  Araujo,  1993),  which  has  been  used  as  an  experimental  tool  to 

investigate the functional and neurochemical characteristics of peptide containing primary sensory 

- 95 -

neurones  (Gamse  et  al.,  1982).  Biologically, when  a  sensory  neuron  is  exposed  to  capsaicin  the 

neuron will  release  its supply of Substance P  (Martine et al., 1991). Capsaicin evoked Substance P 

release  is  due  to  its  ability  to  induce  calcium  influx  into  nerve  terminals  (Buck  and  Burks,  1986; 

Cordell  and  Araujo,  1993).  In  adjuvant  arthritis,  capsaicin  pre‐treated  rats  were  not  protected 

(Ahmed et al., 1995). We demonstrated that neonatal pups treated with capsaicin are not protected 

from the serum induced arthritis. Because capsaicin stimulates Substance release, we found disease 

after K/BxN serum transfer while SP‐/‐ mice were partially protected.  

To  understand  the  role  of  the  cholinergic  anti‐inflammatory  pathway  in  K/BxN  antibody‐induced 

arthritis  model  we  used  α7nAChR‐/‐  mice.  This  pathway  plays  a  critical  role  in  controlling  the 

inflammatory  response  through  interaction  with  peripheral  α7  subunit‐containing  nicotine 

acetylcholine receptors which are expressed on macrophages. Nicotine acetylcholine receptor‐α7 is 

an essential candidate  in  the  inflammatory cascades. We  found  that α7nAChR‐/‐ homozygous mice 

were completely resistant to inflammation induced by transfer of K/BxN serum. The main function of 

this  receptor  family  is  to  transmit signals  for  the neurotransmitter acetylcholine at neuromuscular 

junctions  and  in  the  central  and  peripheral  nervous  systems    (Le  Novere  and  Changeux,  1995; 

Leonard and Bertrand, 2001; Marubio and Changeux, 2000; Steinlein, 1998). It has been shown that 

acetylcholine  inhibits  the  release  of  TNF‐α  and  other  cytokines  through  a  post‐transcriptional 

mechanism that is dependent on α‐ nicotinic receptors on primary human macrophages (Borovikova 

et al., 2000). Macrophages are an important source of TNF‐α and play a crucial role for macrophages 

in the pathology of K/BxN serum induced arthritis (Solomon et al., 2005). 

 Particular focus was placed on TNF‐α due to the  importance of this cytokine  in human disease, as 

suggested by the successful treatment of RA patients with antibodies or fusion proteins capable of 

blocking  the TNF‐α/TNF‐α  receptor  interaction.  (Brennan, 2001;  Feldmann et al., 1996;  Feldmann 

and Maini, 2001). Both macrophages and TNF‐α are  the  important  target  to prevent  the disease. 

α7nAChR deficiency in mice might prevent the release of TNF‐α from macrophages, which could be 

the reason why α7nAChR‐/‐ mice were completely resistant to disease after K/BxN sera transfer. 

- 96 -

Taken  together,  this  study  adds  further  support  to  link  between  the  neural  pathways  and 

inflammatory  diseases  which  may  exemplify  the  emerging  intimate  connection  between 

neuropeptides and the immune system. 

5.2. Macrophage inhibitory factor in antibody‐induced arthritis 

The  cytokine  profile  of  RA  synovium  is  an  area  of  intense  research  interest.  Pro‐inflammatory 

cytokines  such  as  TNF  α  and  IL‐1β  are  known  to  induce,  in  vitro,  many  of  the  mediators  of 

inflammation and  joint  injury operative  in RA. Moreover,  the discovery of  the expression of  these 

cytokines  in RA synovium has  led to the development of specific therapeutic strategies targeted at 

these molecules. To date, however no such strategies have proved curative, and the search for other 

therapeutic targets in RA continues.  

Many aspects of the function of MIF suggest it as an important cytokine in RA. Recombinant MIF is 

an  inducer  of monocyte/macrophage  TNF  α  and MIF  also  induces  or  enhances  other  aspects  of 

monocytes/macrophage activity, including interferon‐γ‐induced nitric oxide production, intracellular 

killing  and  phagocytic  function  (Bernhagen  et  al.,  1994).  MIF  also  up‐regulates  MMPs  and 

cyclooxygenase 2 mRNA in rheumatoid synovial fibroblast (Leech et al., 1998). In addition, the recent 

report of the expression of MIF by endothelial cells suggest it has a uniquely broad range of activates 

within the immune/inflammatory response involved in RA pathology.  

Macrophages play a crucial role in the K/BxN serum‐induced arthritis model (Solomon et al., 2005), 

and are present in high numbers in inflamed tissue and at the cartilage‐pannus interface in RA. The 

data  presented  here  demonstrate  the  role  of  MIF  in  antibody‐induced  arthritis.  Age‐matched 

C57BL/6 wild  type mice developed  arthritis within  a day  after  the  arthritic K/BxN  serum  transfer 

while MIF ‐/‐ mice were disease‐free by measureable clinical parameters at that time. On day 6 and 8 

MIF  ‐/‐ mice showed a significant reduction  in the ankle thickness and clinical  index compared with 

wild type mice. 

Eleveated MIF  levels have been reported  in RA serum, synovial  fluid and synovial tissues, with the 

later correlating with disease activity (Leech et al., 1999; Morand et al., 2002).  Cellular sourch of MIF 

- 97 -

in RA include monocytes/macrophages, fibroblasts like synoviocytes  (Leech et al., 1999), endothelial 

cells and to a lesser extent T cells (Bacher et al., 1996). 

MIF  is  known  to  promote  TNF  α  secretion  from  macrophage  cell  lines  and  peritoneal  mouse 

macrophages  (Bernhagen et al., 1994; Calandra et al., 1995). To determine whether macrophages 

are responsible for the MIF‐production relevant to the RA pathogenesis we reconstituted the MIF‐/‐ 

mice  with  naive  macrophages  and  found  that  adoptive  transfer  completely  restores  the 

susceptibility  to arthritis  in MIF  ‐/‐ with measurable ankle  thickness and clinical  index  just  like wild 

type mice. 

In  conclusion, we  have  shown  that  a  deficiency  in  the MIF  gene  inhibits  joint  inflammation  and 

destruction  induced  by  antibody‐induced  arthritis. We  show  for  the  first  time  that macrophage 

derived MIF  is  the key  to arthritis. These  results  support  the hypothesis  that MIF  is an  important 

factor in the inflammation and cartilage degradation of RA. These data further support the view that 

MIF is a potential target in RA.  

5.3. MMP 13 (collagenase‐3) deficiency protects from antibody‐induced arthritis 

The degradation of  articular  cartilage  is  a  characteristic of  rheumatoid  arthritis.  The  collagenases 

(MMP‐1, MMP‐8 and MMP‐13) have the unique ability to cleave the triple helix of collagen, thereby 

allowing  the  chains  to unwind, and are believed  to play a major  role  in  the  collagen degradation 

associated with arthritic conditions. MMP‐13 was originally isolated from breast tumor cells  (Freije 

et al., 1994).  

Expression of MMPs  is  low  in normal cells, and  this  low  levels allow  for healthy connective  tissue 

remodeling. In pathologic conditions however, the level of MMP expression increases considerably, 

resulting  in  tissue destruction.  Excess MMP production  is  associated with  the pathology of many 

diseases,  including artherosclerosis,  tumor  invasion/metastasis and RA.  (Borden and Heller, 1997; 

Brinckerhoff et al., 2000; Vincenti, 2001).  

Among all MMPs, MMP‐13 has been suggested to play a major role  in the pathogenesis and tissue 

destruction  in rheumatoid arthritis because MMP‐13 mRNA   has been  found  in the synovial tissue 

- 98 -

from patients with rheumatoid arthritis (Wernicke et al., 1996). MMP‐13 has been shown to degrade 

collagen type I, II, III as well as being able to degrade cartilage proteoglycan aggrecan (Fosang et al., 

1996).  Unlike  MMP‐1,  which  has  a  substrate  preference  for  collagen  type  III,  MMP‐13  prefers 

collagen  type  II which  is  the primary  collagen  found  in articular  cartilage  (Knauper et al., 1996b). 

Also,  MMP  13  mRNA  and  protein  have  been  found  in  synoviocytes  of  the  pannus‐hard  tissue 

junction of RA patients  (Konttinen et al., 1999). TNF‐α expression by monocyte/macrophages has 

been demonstrated both in synovial tissue and at the cartilage‐pannus junction. IL‐1ß and TNF‐α can 

induce expression of MMP‐13  in  the  synovium. Therefore we have  chosen  to analyze  the  role of 

MMP‐13 in antibody induced arthritis.   

The data presented in this study show an important role of MMP13 in the progression of arthritis in 

the K/BxN antibody induced arthritis. We tested whether mice lacking MMP13 would be capable of 

developing arthritis. Although age‐matched C57Bl/6 wt controls developed arthritis within 2 days of 

K/BxN serum  injection, MMP13‐/‐ mice remained disease free by measurable clinical parameter (Fig 

1.11).  In MMP13‐/‐ mice, arthritis was significantly reduced in the progressive stage of the disease on 

days 4, 6 and 8 as shown by the ankle measurement and clinical index when compared to wild type 

mice.  In  wild  type  mice  the  arthritis  was  significantly  evident  on  day  6.  On  day  8,  significant 

difference between wild  type and MMP13  ‐/‐ was also  confirmed by histological examination. The 

wild  type  showed  chronic  inflammation  with  infiltration  of  mononuclear  cells  of  the  synovial 

membrane, hyperplasia of synovial lining cells and fibrosis of synovial membrane and inflammation 

was accompanied by pannus tissue formation and cartilage and bone destruction while ankle  joint 

sections  of MMP13  ‐/‐  showed  complete  absence  of  pannus  tissue,  bone  erosion  and  cartilage 

destruction (Fig. 1.13). 

Our  data  indicate  that  MMP‐13  is  involved  in  triggering  the  inflammation  in  antibody‐induced 

arthritis and MMP13  is  required  to prevent a  sustained  inflammatory  response  that occurs  in  the 

effecter phase of arthritis. Therefore a drug aiming to  inhibit MMP‐13 function might be candidate 

for RA therapy. 

- 99 -

5.4. Role of redox‐regulations in antibody‐induced arthritis  

Our results showed that increased arthritis in Phytol‐treated mice is mediated by increased oxidative 

burst in vivo the disease was resolved soon as compared to wild type mice.  

Generally,  ROS  is  thought  to  play  a  major  role  in  defence  against  invading  pathogens.  ROS 

production  is maintained  by  the  nicotinamide  adenine  dinucleotide  phosphate  (NADPH)  oxidase 

complex which functions as an electron donor in the oxidative burst process via reduction of oxygen 

[22]  to  superoxide  that  in  turn  could  yield  various  reactive  oxygen  species.  The most  important 

component  of  the NADPH  complex  is  the Ncf1  (Neutrophil  cytosolic  factor)  protein.  It  has  been 

shown that complete lack of ROS due to Ncf 1 deficiency results in chronic granulomatous disease in 

both mice (Jackson et al., 1995) and human. Ncf1 is heavily phosphorylated and it is responsible for 

transporting the cytosolic complex to the membrane during the activation. 

Before  sera  injection  into  the  phytol‐treated mice, we  found  significantly  increased  numbers  of 

neutrophils as compared to control mice. Neurophils play a key role in host defence against invading 

pathogens and have a major role  in  inflammation  in general  (Babior, 2000; Klebanoff, 2005; Segal, 

2005).  In  response  to a variety of agents,  they  release  large quantities of  superoxide anions  (O2.‐) 

(Chanock et al., 1994; Groemping and Rittinger, 2005; Quinn and Gauss, 2004). O2.‐   production by 

neutrophils  is  dependent  on  activation  of  the  NADPH  oxidase  complex.  Increased  numbers  of 

neutrophils in phytol‐treated mice could be responsible for an increase the O2.‐ concentration which 

quenches  the  ROS,  and  decreased  ROS might  be  responsible  to    increase  the  disease  in  phytol‐

treated mice at days 2 and 4 as compared to control mice (Fig 1.15). It has been shown that  lower 

oxidative burst led to a reduction in the cell membrane proteins and activation of autorecative and 

arthritogenic T cells (Gelderman et al., 2006). 

To determine  relative amounts of surface R‐SH on neutrophils and monocytes we used ALM. This 

assay  takes  advantage of  the  fluorescent Alexa dye  (FL‐4)  covalently bound  to maleimide,  a well 

known neutrophilic molecule widely used to react with‐SH groups  on proteins and other molecules. 

ALM reagents are commonly used to make Alexa‐  labeled mAb for use  in FACS. However, here we 

- 100 -

used  ALM  for  labeling  cell  surface  thiols.  We  observed  on  day  6,  the  surface  R‐SH  levels  on 

neutrophils were significantly decreased in the phytol‐treated mice compared with control mice. The 

reason  for  this could be  that  in  the phytol‐treated mice on day 4  the diseases  starts  resolving.  In 

K/BxN mice model,  it has been shown that neutrophils play an  important role  in the early stage of 

the disease (Wipke and Allen, 2001). We also measured the absolute numbers of neutrophils after 

phytol‐treatment and found that on day 0 neutrophil numbers were significantly higher as compared 

with controls. This increased numbers of neutrophils in the phytol‐treated mice could be responsible 

for  onset  of  disease within  a  24  hrs.  Along with  the  surface  thiol  levels  on  neutrophils we  also 

determined the surface thiol levels on monocytes. Unlike thiol levels on neutrophils, we did not find 

any change on surface R‐SH levels on monocytes. 

Along with  the surface R‐SH we also determined  the  intracellular ROS  levels  in neutrophils and  in 

monocytes and found there was no significant correlation between phytol‐ treated and control mice. 

5.5.  An  antagonist  of  monocyte  chemoattractant  protein  1  (MCP‐1)  did  not  inhibits 

arthritis in the K/BxN model  

Monocyte chemoattractant protein  (MCP)‐1  is a chemoattractant cytokine  (chemokine)  (Baggiolini 

et al., 1994)  that promotes  the migration and activation of monocytes  (Van Damme et  al., 1992; 

Zachariae  et  al.,  1990).  It  has  been  associated  with  several  inflammatory  diseases  (Furie  and 

Randolph,  1995),  but  a  causal  relationship  has  been  difficult  to  prove. Monocyte  infiltrates  are 

prominent  in  rheumatoid  arthritis  (RA)  and  their  products,  such  as  cytokines  that  amplify  the 

inflammatory response and enzymes that destroy connective tissue (Furie and Randolph, 1995), are 

readily  detected  in  diseased  joints.  MCP‐1  is  produced  by  both  synovial  cells  and  infiltrated 

monocytes in RA (Harigai et al., 1993; Koch et al., 1992; Kunkel et al., 1996). 

To  test  the  hypothesis  that,  by  inhibiting  endogenous  MCP‐1,  the  inflammatory  reaction  was 

reduced, we  examined  its  effect  in  the  K/BxN mouse model  of  arthritis.  Daily  injections  of  the 

antagonist did not prevent  the onset of arthritis as monitored by measuring  joint swelling and by 

clinical score of the  joints. The MCP‐1 antagonist‐treated mice spontaneously developed a chronic 

- 101 -

inflammatory  arthritis  that was  similar  to  control  Balb/c mice. MCP‐1  accelerated  the  onset  and 

enhanced the symptoms of joint inflammation (Fig 1.23). In vitro, MCP‐1 results in migration only if a 

gradient  is  formed,  high  concentrations,  MCP‐1  inhibits  migration  by  collapsing  the  gradient 

(Randolph and Furie, 1995). It is unlikely that the enhancement we have observed in vivo with MCP‐

1 antagonist is simply nonspecific. Rather, it is more likely that the systemic levels of MCP‐1 in these 

mice  are  insufficient  to  cause  non‐responsiveness  of  the  target  cells  to MCP‐1  antagonist.  Our 

interpretation  for  the  enhancement  of  the  onset  and  swelling  is  that  the  injected  MCP‐1 

accumulates  in the tissues and causes activation of monocytes and other target cells, whereas the 

MCP‐1 that remains in the vascular compartment is eliminated rapidly. 

 

5.6. DBA mt FvB mice are not protected from antibody‐induced arthritis 

Antibody‐induced arthritis in mice is one of the most widely used autoimmune experimental models, 

with many features similar to humsn rheumatoid arthritis. Five of the eight small‐effect QTL  in the 

DBA/1  strain  are  arthritis‐enhancing  alleles, while  in  the  FVB/N  strain  are  the  arthritis‐enhancing 

alleles  are  the  other  three  QTL,  indicating  that  some  susceptibility  genes  could  come  from  the 

resistant strain. Several studies have been carried out to detect gene expression profile responsible 

for disease  in CIA model, all of which used  joints as  the  investigated  tissue. The susceptibility and 

resistance  of  DBA/1J  and  FVB/N  mouse  strains  respectively,  to  the  induction  of  CIA  is  well 

documented. Previously  it has been shown that the  (DBA1JxFVB/N) F1 progeny was susceptible  to 

CIA.  A  comparison  and  arthritis  indexes  between  the  F2  progeny  and  parental  DBA/1J  showed 

significant  difference  suggesting  the  existence  of  protective  FvB/N  loci  (Ibrahim  et  al.,  2002; 

Thornton et al., 2002). 

In  this  study, we used  (DBA/1J×FVB/N)  F2 mice and  found after arthritic  sera  transfer mice were 

susceptible to disease and showed severity to antibody‐induced arthritis similar to DBA/1 wild type 

mice. The reason for this could be differential expression of a gene could result not only from allele 

difference between two strains. 

- 102 -

 5.7. Role of CD21 and CD23 in autoimmune disorders 

Autoimmune diseases are often characterized by high levels of circulating autoantibodies and/or the 

presence, of T cells, in affected organs with reactivity against self‐antigens. It is well established that 

complement plays a crucial role  in the acute  inflammatory response following attack on self tissue 

by  autoantibodies  and  deposition  of  complement  activating  immune  complexes  in  glomeruli  and 

small vessels (Sheerin et al., 1997; Wang et al., 2000). 

Complement  facilitates  the  clearance of  immune  complexes  (IC)  from  circulation  (Schifferli  et  al., 

1986).  In  human,  erythrocytes  bear  clusters  of  CD35    (Chevalier  and  Kazatchkine,  1989;  Fearon, 

1980) that mediate multivalent binding of C3 and/or C4 fragments deposited on IC in the periphery 

and  transport  the  complexes  to  the  liver  and  spleen where  transfer  to  phagocytic macrophages 

takes place (Bogers et al., 1991; Davies et al., 1993). But, in autoimmune diseases, disposal of IC to 

the  liver  and  spleen  could  fail,  resulting  in  the  deposition  of  IC  in  glomeruli  and  small  vessels 

followed by inflammatory reactions. 

The role of B cells in various autoimmune diseases, like diabetes (Falcone et al., 1998; Serreze et al., 

1996) in mice, rheumatoid arthritis in human (Edwards and Cambridge, 2001; Takemura et al., 2001) 

and systemic lupus erythematosus (SLE)is shown. SLE is a systemic, autoimmune disease with clinical 

features, including glomerulonephritis, haemolytic anaemia, thrombocytopenia and central nervous 

system involvement (Robson and Walport, 2001). SLE is characterized by polyclonal B cell activation 

and (Gross et al., 2000; Levinson et al., 1981)  excessive production of autoantibodies. 

 CD21  is expressed by B  lymphocytes and B  lymphoblastoid cell  lines, human  thymocytes  (Tsoukas 

and Lambris, 1988) a fraction of human T  lymphocytes (Fischer et al., 1991) certain  leukemia T cell 

lines,  the  pharyngeal  and  cervical  epithelium  and  by  follicular  dendritic  cells.  The  level  of  CD21 

expression  is  developmentally  regulated:  it  is  highest  on  mature  B  lymphocytes  and  on  a 

subpopulation of immature blastic thymocytes. The soluble form of CD21 (sCD21) is found in human 

plasma and  in  cell  culture  supernatants of  lymphoid  cells  (Huemer et al., 1993;  Ling et  al., 1991; 

Myones and Ross, 1987).  

- 103 -

The cellular response of CD21 is mediated through interaction of CD21 with membrane and soluble 

CD23  (Bonnefoy  et  al.,  1995.)  CD21/CD23  pairing  occurred  between  membrane  forms  of  the 

receptors and  is  involved  in homotypic adhesion of B cells. Certain biological properties of soluble 

CD23 had been attributed to interaction with CD21 on B cells. 

CD23  is a  ligand for CD21, a type  II transmembrane protein expressed on a variety of hemopoietic 

cell  types  that  serves  as  the  low‐affinity  receptor  for  IgE.  Cleavage  of  the membrane  receptor 

generates  soluble  forms of CD23  that are endowed with  ‘cytokine‐like’ activity  (Delespesse et al., 

1991). 

CD23, is expressed  on a variety of hematopoietic cells including B cells and monocytes (Delespesse 

et al., 1991).  It  is a 45 kDa membrane type  II glycoprotein whose proteolytic cleavage gives rise to 

unstable soluble  fragments subsequently transformed  into a stable 25 kDa   product referred to as 

soluble CD23 (sCD23). Cell surface CD23 expression and sCD23 release are up regulated by IL‐4 in all 

CD23 expressing cell types, and  inhibited by  interferon‐gamma (IFN‐�), transforming growth factor 

beta  (TGF‐�)  and  glucocorticoids  on  B‐cells  (Delespesse  et  al.,  1992).  While  sCD23  retains  the 

capacity to bind IgE, it has many activities that are IgE‐independent (Delespesse et al., 1992; Sarfati 

et al., 1992),  including  inhibition of apoptosis (Liu et al., 1991). The amount of sCD21 and sCD23  in 

serum  may  modulate  immunity  as  sCD21  and  sCD23  levels  are  correlated  with  several  clinical 

conditions. 

sCD21  and  sCD23  levels  differ  in  various    autoimmune  diseases  from  normal  values  and  can  be 

regarded  as    diagnostical markers  for  autoimmne  diseases.  That  is  why  we  were  interested  to 

determine their levels in autoimmune sera/plasma samples. 

5.7.1. Antiphospholipid syndrome  

sCD21  is  significantly  reduced  in APS patients  sera  compared  to healthy  controls. Because  sCD21 

binds  to C3d on  immune  complexes  (Carel  et  al.,  1990;  Lyubchenko  et  al.,  2005;  Szakonyi  et  al., 

2001)  we  reasoned  that  the  presence  of  autoantibodies  forming  immune  complexes  might 

influences the amounts of sCD21 due to phagocytic clearance of theses complexes  in the  liver. The 

- 104 -

presence of anti‐ ß2GPI autoantibodies and the occurrence of the respective antigen (ß2‐GPI) in sera 

in quantities of 150‐300µg/ml exceeds  the amounts of  sCD21  in healthy donors and autoimmune 

patients  by  about  1000  fold.  Because  the  complement  activation  is  an  enzymatic  amplification 

cascade, one would expect a further molar  increase  in complement activation products  like C3d  in 

these  immune  complexes.  Therefore  one would  expect  to  observe  a  reduction  of  sCD21  due  to 

binding to immune complexes formed by autoantibodies, complement and autoantigens. However, 

when we compared sCD21 titers from patients having anti‐ß2GPI autoantibodies with those lacking 

these  antibodies, we  could  not  find  significant  differences.  This  finding  is  astonishing  because  it 

sheds some doubts on  the presence of classical/textbook style  immune complexes  in the blood of 

these  patients.  We  analyzed  previously  a  large  cohort  of  rheumatoid  arthritis  patients  for  the 

presence of sCD21 and found no difference between patients with and without rheumatoid factors 

(Masilamani  et  al.,  2004b).  Because  IgM  is  the  strongest  complement  activator  among  the 

immunoglobulin  isotypes, we  expected  in  particular  the  IgM  anti  IgG  rheumatoid  factors  to  bind 

sCD21 via activated complement C3d and finally be cleared via the  liver.  In rheumatoid arthritis as 

well  as  in  APS  the  autoantibodies  and  their  ligands  outnumber  by  far  sCD21  and  thus  should 

significantly reduce amounts of circulating sCD21 in the blood. This is obviously not the case. 

 

5.7.2. Soluble CD21 levels in autoimmune lymphoproliferative syndrome (ALPS)  Autoimmune  lymphoproliferative syndrome (ALPS)  is a rare disorder  in which there  is chronic non‐

malignant  lymphoproliferation and autoimmunity, most often  involving cells of the haematopoietic 

system.    It can present  in children or adults but usually presents  in early childhood (Deutsch et al., 

2004). It is caused by a genetic defect in the mechanism of programmed cell death (apoptosis) and is 

characterized by the presence of double‐negative (TCR alpha/beta CD4‐ CD8‐) T lymphocytes (DNT). 

Our study indicates sCD21 levels significantly increased in ALPS patient’s sera as compared with age 

matched healthy controls. During the first decade of life, T cells are generated from the thymus and 

double negative thymocytes express high levels of CD21 (Fischer et al., 1999). The increased sCD21 

- 105 -

concentration in ALPS patients could be a result of thehigh expression of CD21 on double negative T 

cells in the periphery. 

5.7.3. Diabetes 

Diabetes  is  occurring  in  two  forms  type  I  and  type  II, where  diabetes  type  I  is  an  result  of  an 

autoimmune  reaction while  type  II has occur  for non  immunological  reasons. Thus diabetes  is an 

interesting model to address the question whether changes in sCD21 and sCD23 levels are realted to 

autoimmunity. Clinically altered levels of sCD21 and sCD23 have been shown in various autoimmune 

diseases. Therefore we were  interested  to determine sCD21 and sCD23  levels  in diabetes patients 

samples. 

In the present study we demonstrated that the decreased sCD21 and sCD23  levels  in autoimmune 

diabetes type I (P < 0.0067 and 0.0001 respectively) while there was no change in the levels of sCD21 

and  sCD23  in  diabetes  type  II  (P  <  0.8603,  0.5692  respectively)  as  compared  to  age‐matched 

controls. The  lower  levels of sCD21 and sCD23  in autoimmune diabetes type  I could be because of 

decreased activation and insufficient autoproteolysis of surface CD21 and CD23 antigen on immune‐

competent cells while no change in diabetes type II because it is not an autoimmune disease. 

The  lower  levels of sCD23 were found  in subjects with the  lowest  insulin secretion, who represent 

the group with the highest risk of progression to autoimmune type I diabetes. These findings could 

be explained by Gladstone & Nepom’s hypothesis that insulin can substitute IL‐4 function and locally 

enhance the Th2 subset in pancreatic β‐cells at an early stage of pancreatic β‐cell destruction. 

Honeyman  et  al.  suggested  that  the  imbalance between  Th1  cells  secreting  interleukin  (IL‐1)  and 

Interferon‐γ and Th2 lymphocytes producing mainly IL‐4 and IL‐5, plays a key role in the autoimmune 

process  leading  to pancreatic  β‐ cells destruction  (Honeyman et al., 1997; Hussain et al., 1998).  It 

was also shown that surface expression of CD23 lymphocytes and sCD23 release are up regulated by 

IL‐4, but down regulated by  IFN‐γ  (Corominas et al., 1998). The high expression of CD23 on T cells 

would favour the  interaction between T and B cells by means of CD23 expressed on T cells and  its 

receptor CD21 on B cells. This would lead to IgE production. 

- 106 -

Secondly,  we  have  found  that  after  proinsulin  treatment  the  sCD21  levels  were  significantly 

decreased  in diabetic patients with BMI < 90 when compared with without treatment  (P < 0.001). 

But  in contrast surprisingly, sCD23  levels significantly  increased after treatment (P < 0.0001). It has 

been  found  that  anti‐CD3  and  nasal  proinsulin  combination  therapy  enhances  remission  from 

autoimmune  type  I diabetes by  inducing Tregs  (Bresson et al., 2006). The anti‐CD3 would create a 

systemic  immune modulatory milieu  to  facilitate  the  islet‐antigen‐specific  induction  of  Tregs  and 

also  induce  a  shift  in  the  cytokine  profile  (mainly  Th1  to  Th2).  The  levels  of  CD4+  lymphocytes 

significantly  increased after proinsulin treatment. CD23  like CD21  is considered to be an activation 

marker of B cells. The expression of CD4+ cells after proinsulin treatment could be one of the reasons 

for  the  increased  sCD23  levels,  whereas  numbers  of  B  cells  remain  constant  after  proinsulin 

treatment. It has been known that B cells are involved in diabetes (Charlton et al., 2001) but it is not 

clear at which  stage  they play a  role: early,  late or both while destruction of pancreatic  β cells  is 

dependent on T cells. 

In conclusion our study suggests  that sCD21 and sCD23  titers have  the potential  to be used as an 

additional markers for type I diabetes and could play a role in determining the efficacy of prevention 

trials.  

5.7.4. Juvenile arthritis 

JA  involves  joint  pain  and  inflammation  and  is  the most  common  chronic  arthritis  in  children. 

Shedding  of  CD21  seems  to  be  correlated with  that  of  CD23.  Both  are  ligands  of  each  other 

(Bonnefoy  et  al.,  1995b)  and  both  are  expressed  and/or  released  by  B‐cells,  possibly  allowing 

homotypic  interactions to take place (Cherukuri et al., 2001). Such  interaction may contribute to 

B‐cell hyperactivity and autoantibody production. Analysis of sCD21 purified from normal human 

plasma indicated that a part of sCD21 circulates in association with a cleavage fragment of C3 and 

a  trimeric  form  of  sCD23    (Fremeaux‐Bacchi  et  al.,  1998a).  Therefore  we  were  interested  to 

analyze both sCD21 and sCD23 in JA. 

- 107 -

Reduction of sCD21 levels have been reported in SLE, RA, anti‐phospholipid syndrome and Sjogren’s 

syndrome  (Illges et al., 2000; Masilamani et al., 2003; Masilamani et al., 2004a; Masilamani et al., 

2004b; Singh et al., 2008) and here in JA subtypes. Unlike sCD21, sCD23 levels were found elevated 

in various autoimmune disorder  like  localized scleroderma  (Sato et al., 1996), rheumatoid arthritis 

and systemic  lupus erythematosus  (Bansal et al., 1992). Therefore, sCD21 and sCD23 appear to be 

markers  for  autoimmunity  and/or  chronic  inflammation  in  human.  Supporting  this,  in  a mouse 

model, genetic ablation of CD21 results in enhanced autoimmunity (Del Nagro et al., 2005). A further 

support of our hypothesis that sCD21  is modulated  in  immunity comes from our analysis of sCD21 

levels during pregnancy. In pregnancy  immunity  is changed to prevent  immune attack to the fetus. 

During pregnancy sCD21 declines to levels reminiscent of autoimmune diseases and it takes month 

after delivery to reach normal  levels again (Masilamani et al., 2008). Levels of sCD23 also changed 

during pregnancy (Wegmann et al., 1993).   

In a previous study we analyzed a cohort of JA sera, which was undifferentiated for the subtypes, 

and concluded that JA displayed a  just not significant decline  in sCD21  levels  (Masilamani et al., 

2004a).  The  difference  to  our  present  study may  relate  to  the  following:  the  controls  of  our 

previous study were age related less stringently and as we have shown here there are differences 

in the JA subtypes with respect to sCD21 levels, which may have biased our previous results.  

Our study shows sCD23 levels decreased in plasma of patients with JA while in RA, the percentage 

of  B  cells  expressing  CD23  and  serum  sCD23  levels were  elevated  (Chomarat  et  al.,  1993).  In 

contrast  to our  findings,  Kutukculer  et  al.  (Kutukculer  and Caglayan,  1998)  found  an  increased 

sCD23  levels  in patients with chronic  juvenile arthritis. Their observation could, however, reflect 

the  later  stage  of  the  autoimmune  process  than  observed  in  present  study.  On  the  basis  of 

present  results  we  could  suggest  that  the  changes  in  the  levels  of  sCD23  on  peripheral 

lymphocytes could serve as a marker of different stages of autoimmune process.  

The study presented here demonstrates that the significant decline of sCD21 and sCD23 in healthy 

donors was  independent on gender  (Fig 2.5.4 and Fig 2.5.5). Sällfors et. al., 2003 (Sallfors et al., 

- 108 -

2003)  found  age  differences  in  pain,  coping  and  health  status  among  children  and  chronic 

arthritis. As found in RA, the reduction of sCD21 in JA is independent of age and this indicates that 

pathological mechanisms are responsible for lowering systemic sCD21 (and sCD23). 

JA  is  also  associated  with  effusion  and  swelling  of  soft  tissue.  This  inflammatory  process  is 

generated by a series of events, including the migration of leucocytes (Pitzalis, 1993), lymphocytes 

(Silverman  et  al.,  1993),  granulocytes  and monocytes  (Kashiwagi  et  al.,  1998)  from  the  blood 

stream  into the tissue, their activation to become effector cells and, finally, their  local retention 

which  faciliates  the  continuing  immune  reaction. We  found  that  in  circulating  blood  of  S‐JA 

patients  granulocytes  significantly  increased  as  compared  with  those  of  healthy  subjects  and 

other  subtypes of  JA  (Fig 2.5.6).  It has been  shown  that granulocytes and monocytes apheresis 

suppress the symptoms of rheumatoid arthritis (Nagashima et al., 1998). Therefore, the  increase 

in  granulocytes  in  S‐JA  can  be  of  diagnostical  value  and  our  data  suggest  that  apheresis  of 

granulocytes could be useful particularly in S‐JA but not in O‐JA and P‐JA.   

Active  JA  stage  is  associated with  higher  levels  of  soluble  E‐selectin  (sE‐selectin)    and  soluble 

intracellular  adhesion molecules‐1  (sICAM) while during  remission  state  their  levels  goes down 

(Chen  et  al.,  2002).  C‐Y  Chen  et.  al  found  that  sE‐selectin  and  sICAM  levels were  significantly 

higher  in S‐JA. Difference  in  the  levels of sCD21 were not significant when we compared active 

state with remission state while the difference was significant in sCD23 (P < 0.0022) (Fig 2.5.7b). In 

pregnancy we observed that the sCD21 levels need months to be in the normal range again. This 

may be the same for sCD21 here with respect to the remission stage. In contrast to sCD21, sCD23 

levels  increased again  in remission state, which suggest that the mechanism of shedding though 

related has different aspects at least in regulation.   

 

 

 

 

- 109 -

                                                CHAPTER VI 

                                                          SUMMARY 

The K/BxN sera  induced arthritis  is a unique model used to study the  inflammatory process taking 

place  in the  joints  independent of the autoimmune mechanisms that are required for autoimmune 

production. The K/BxN mouse model shows many features common to human RA and other forms 

of inflammatory arthritis, including leukocyte invasion, synoviocyte proliferation, pannus formation, 

synovitis and cartilage and bone erosion.  Intraperitoneal injection of sera from arthritic K/BxN mice 

containing antibodies against Glucose‐6‐phosphate isomerase (GPI) is capable of inducing arthritis in 

the  susceptible mice  like  Balb/c  and  C57Bl/6.  This  disease  is  independent  of  T  and  B  cells.  The 

inflammatory mediators (cellular and molecular) involved in the K/BxN sera‐induced arthritis model 

are examined in this research work. 

Many  studies  have  shown  that  modulation  of  cytokine  function  is  effective  in  ameliorating 

symptoms  of  rheumatoid  arthritis.  Neuropeptides  have  recently  been  shown  to  have  powerful 

effects  on  the  production  and  release  of  cytokines  and  have  also  been  shown  to  exert  potent 

proinflammatory  and  anti‐inflammatory  effects  in  animal  models  of  inflammatory  diseases. 

Importance  of  the  nervous  system  in  immune  regulation  is  clearly  suggested  by  innervations  of 

lymphoid  tissues  by  sympathetic  nerve  fibers.  Substance‐P,  Nicotine  Acetylcholine  receptor 

(α7nAChR)  is  a  powerful mediator  of  vascular  permeability  and  is  released  from  unmyelinated  C 

fibers  and macrophages  respectively.  The  release  of  substance  P  is  an  early  event  in  immune‐

complex‐mediated  injury  and  could  act  as  an  amplifier of  the  subsequent  inflammatory  changes. 

Vagus nerve releases acetylcholine (ACh) in the vicinity of macrophages. ACh can interact specifically 

with  macrophage  α7  subunits  of  nicotinic  ACh  receptors,  leading  to  cellular  deactivation  and 

inhibition of  cytokine  release mainly  TNF‐α.  TNF‐α was  identified  in  the  synovial membrane,  and 

particularly  at  the  cartilage‐pannus  junction  (Chu  et  al.,  1991),  promoted  cartilage  and  bone 

- 110 -

resorption (Bertolini et al., 1986; Saklatvala, 1986) and induced the release of prostaglandin E2 and 

collagenase (Dayer et al., 1985) by synovial cells of patients with RA. 

 In antibody‐induced arthritis,  it was observed that transiently and permanently sympathectomised 

mice  showed partial protection  from disease. Similarly  substance‐P knockout mice  showed partial 

protection whereas α7nAChR ‐/‐ mice showed completely resistant from antibody induced arthritis. 

The matrix metalloproteinase  (MMP)  family members  are  the major  enzymes  that  degrade  the 

components of  the extracellular matrix  (Nagase and Woessner, 1999; Vincenti, 2001). We  focused 

mainly  on MMP13  because  it may  have  a  particular  role  in  cartilage  degradation  because  it  is 

expressed  by  chondrocytes,  and  because  it  hydrolyzes  type‐II  collagen more  efficiently  than  the 

other collagenases (Mitchell et al., 1996). We found that MMP13 deficient mice showed protection 

from arthritis. 

Cytokines  play  important  roles  in  the  pathology  of  rheumatoid  arthritis. Macropahge migration 

inhibitory  factor  (MIF)  is  a  cytokine  with  a  broad  spectrum  of  actions  including  induction  of 

monocyte TNF‐α in monocytes. MIF is a cytokine with well recognised importance in the regulation 

of  immune and  inflammatory responses. Our results demonstrate that MIF plays an  important role 

in the antibody  induced arthritis. MIF knockout mice showed significant protection compared with 

wild  type mice.  In addition we  reconstituted  the MIF deficient mice with peritoneal macrophages 

and found the MIF knockout mice were susceptible to arthritis  induction after K/BxN sera transfer 

just like control mice. Our data indicate for the first time that macrophage devoid MIF is responsible 

for the MIF related pathology of arthritis. 

Inflammation  is  not  always  abnormal,  but  in  fact  plays  an  important  part  in  the  body's  defense 

against  infection.  As  part  of  their  activity  against  disease‐causing  bacteria,  the white  blood  cells 

known as granulocytes generate reactive oxygen species (ROS), sometimes known as “free radicals.” 

To  elucidate  the  role  of  redox  reactions  we  determined  the  importance  of  phytol  in  antibody 

induced arthritis. Phytol (3,7,11,15‐tetramethyl‐2‐hexadecene‐1‐ol) increased oxidative burst in vivo. 

We found that onset of disease within 24 hours in phytol treated mice while in control mice disease 

- 111 -

took 48 or 72 hours.  Surprisingly  the disease  resolved  faster  in phytol‐treated mice  as  compared 

with  control mice. We also  found  in phytol  treated mice  increased numbers of neutrophil before 

induction  of  arthritis  as  compared  to  control mice.  Increased  neutrophils  in  phytol  treated mice 

could  be  responsible    increasing  the O2.‐ which  quenches  the  ROS,  and  decreased  ROS might  be 

responsible to increase the disease in phytol treated mice at days 2 and 4 as compared with control 

mice (Fig 1,15), because  it has been shown that  lower oxidative burst  led to a reduction  in the cell 

membrane proteins and activation of autorecative and arthritogenic T cells (Gelderman et al., 2006).  

Monocyte chemoattractant protein  (MCP)‐1  is a chemoattractant cytokine  (chemokine)  (Baggiolini 

et al., 1994)  that promotes  the migration and activation of monocytes  (Van Damme et  al., 1992; 

Zachariae  et  al.,  1990).  It  has  been  associated  with  several  inflammatory  diseases.  To  test  the 

hypothesis  that, by  inhibiting  endogenous MCP‐1,  the  antagonist has  antiinflammatory  activity  in 

vivo, we examined  its effect  in  the K/BxN mouse model of arthritis. Daily  injection of  the MCP‐1 

antagonist did not prevent  the onset of arthritis as monitored by measuring  joint swelling and by 

clinical score of the joints. 

sCD21 and sCD23 levels in autoimmune disorders 

CD21 and CD23 are released as a soluble form from the cell surface by proteolytic activity known as 

‘Shedding’.  sCD21  retains  the  capacity  to  bind  iC3b  and  CD23,  the  known  ligands  of membrane 

CD21.  In  a  similar  fashion  to  IgE  complexes,  another  ligand  of  CD23,  the  sCD21  was  shown  to 

efficiently trigger CD23‐signalling pathways  in human monocytes. The clinical significance of sCD21 

and sCD23 has been shown by changes in their concentrations in various autoimmune disorders. 

We  estimated  the  sCD21  and  sCD23  concentration  in  antiphospholipid  syndrome  (APS),  juvenile 

arthritis (JA), diabetes and autoimmune  lymphoproliferative syndrome (ALPS) patients sera/plasma 

samples. 

sCD21  levels were  significantly  reduced  in APS  patients,  in  comparison with  healthy  donors  (P  < 

0.0001).  The  presence  of  specific  ß2‐GPI  autoantibodies  did  not  correlate  with  sCD21  titers. 

- 112 -

However, the levels of sCD21 in these patients are not further influenced by additional autoimmune 

SLE, vasculitis, DVT (Deep vein thrombosis) fetal loss or thrombosis. 

In case of  JA, we  investigated  the  levels of plasma sCD21 and sCD23  in subtypes of  JA patients. 

Our data demonstrate  that  levels of  sCD21 were decreased  in all  subtypes of  JA patients while 

plasma sCD23  levels were significantly reduced  in P‐JA and S‐JA samples (P < 0.0001, 0.018), but 

not in O‐JA (P < 0.3843). 

As  the  CD21  and  CD23  antigens  were  shown  to  be  involved  in  the  pathogenesis  of  various 

autoimmune diseases, we evaluated the  levels of sCD21 and sCD23  in sera of healthy and diabetes 

type  I  and  II  patients. Our  data  demonstrate  that  levels  of  sCD21  and  sCD23  in  diabetes  type  I 

individuals significantly decrease (P < 0.0067 and P < 0.0001 respectively) while there is no change in 

diabetes type II (P < 0.8603 and 0.5692 respectively) as compared to age matched healthy controls.  

In case of ALPS patient’s sera, the soluble CD21 concentration were estimated  in the sera from 17 

ALPS  patients  and  compared  with  healthy  volunteers.  We  found  the  levels  of  sCD21  were 

significantly increased in ALPS patient’s sera samples as compared to healthy individuals, P < 0.006.  

This disease  is found  in children or adults but usually presents  in early childhood. The  increased 

sCD21 in ALPS patients sera, could be related to the presence of double‐negative (TCR alpha/beta 

CD4‐ CD8‐) T  lymphocytes  (DNT). During  the  first decade of  life, T  cells are generated  from  the 

thymus and double negative thymocytes express higher levels of CD21. 

Our study indicates that sCD21 and sCD23 are additional markers for autoimmune diseases. 

 

 

 

 

 

 

- 113 -

                                                 Zusammenfassung 

Die  K/BxN  Serum  induzierende  Arthritis  ist  ein  einzigartiges  Modell  zur  Untersuchung  von 

Entzündungsprozessen,  die  in  den  Gelenken  stattfinden.  Das  K/BxN  Mausmodell  zeigt  viele 

Merkmale  der menschlichen  rheumatischen  Arthritis  und  anderen  Arthritisformen,  einschließlich 

Leukozyteneinfall,  Synoviozytenproliferation,  Pannusformation,  Synovitis  sowie  Knorpel‐  und 

Knochenerosion.  Peritonale  Injektion  des  Serums  von  arthritischen  K/BxN  Mäusen  Glukose‐6‐

Phosphat  Isomerase  (GPI) enthält  in anfälligen Mäusen  stämme wie Balb/c und C57BI/6, welches 

Antikörper  gegen,  verursacht  Arthritis.  Diese  Krankheit  ist  unabhängig  von  T‐  und  B‐Zellen.  Die 

Entzündungsmediatoren (zelluläre und molekulare), die im K/BxN Serum induzierten Arthritismodell 

eine Rolle spielen, werden in dieser Forschungsarbeit untersucht. 

Viele  Studien  haben  gezeigt,  dass  die Modulierung  der  Zytokinfunktion  sehr  effektiv  ist  um  die 

Symptome  von  rheumatischer Arthritis  zu  verbessern. Neuropeptide haben  starke Effekte auf die 

Produktion  und  Abgabe  von  Zytokinen  .  Außerdem  üben  sie  starke  entzündungshemmende  und 

entzündungsverursachende Effekte in Tiermodellen mit Entzündungskrankheiten aus. Die Bedeutung 

des  Nervensystems  für  das  Immunesystem  liegt  nahe,  da  Lymphgewebe  von  sympathischen 

Nervensträngen  angeregt  werder.  Die  Substanz  P,  ist  ein  starker  Mediator  der  vaskulären 

Permeabilität  und  wird  von  unmyelinierten  C  Nervenfasern  und  Makrophagen  abgegeben.  Die 

Abgabe von Substanz P  ist ein  frühes Ereignis bei  immun‐komplex verursachten Verletzungen und 

könnte als Verstärker von nachfolgenden entzündlichen Veränderungen agieren. Der Vagusnerv gibt 

Acetylcholine  (Ach)  in  die  Umgebung  von  Makrophagen  ab.  ACh  kann  spezifisch  mit  der 

Makrophagen  α7  Untereinheit  des  nikotinischen  Acetylcholinrezeptors  interagieren,  welches  zu 

zellulärer Deaktivierung und Unterdrückung der Zytokinabgabe, hauptsächlich TNF‐α,  führt. TNF‐α 

wurde in der Synovialmembran identifiziert, insbesondere an der Knorpel‐Pannus‐Grenze (Chu et al., 

1991) bei begünstigter Knorpel‐ und Knochenresorption (Bertolini et al., 1986; Saklatvala, 1986) und 

induzierter Abgabe  von  Prostaglandin  E2  und  Collagenase  (Dayer  et  al.,  1985)  von  Synovialzellen 

rheumatischer Arthritis Patienten. 

- 114 -

In  Antikörper  induzierter  Arthritis  wurde  beobachtet,  das  vorübergehende  und  dauerhafte 

sympathektomierte Mäuse teilweise vor der Krankheit geschützt sind. Substanz P Knockout Mäuse 

zeigten  einen  ähnlichen  Schutz.  α7nAChR‐/‐  Mäuse  zeigten  eine  komplette  Resistenz  gegen 

Antikörper  induzierte  Arthritis. Mitglieder  der Matrix Metalloproteinase  (MMP)  Familie  sind  die 

Hauptenzyme, die Komponenten der extrazellulären Matrix abbauen (Nagase and Woessner, 1999; 

Vincenti, 2001).Wir konzentrierten uns hauptsächlich auf MMP13 weil es eine entscheidende Rolle 

im  Knorpelabbau  haben  könnte.  Es  wird  von  Chondrozyten  exprimiert  und  hydrolysiert  Typ‐II 

Collagen effizienter als andere Collagenasen (Mitchell et al., 1996). Wir fanden heraus, dass MMP13 

defiziente Mäuse Schutz vor Arthritis besitzen.  

Zytokine  spielen  eine wichtige Rolle  in  der  Pathologie  von  rheumatischer Arthritis. Makrophagen 

migration  inhibitory  factor  (MIF)  ist ein Zytokin mit einem breiten Wirkspektrum einschließlich der 

Induktion  von  TNF‐α  in  Monozyten.  Unsere  Ergebnisse  zeigen  das  MIF  eine  wichtige  Rolle  in 

Antikörper  induzierter Arthritis spielt. MIF defiziente Mäuse zeigten einen erheblichen Schutz   vor 

Arthritis  im  Vergleich  mit  Wildtyp  Mäusen.  Außerdem  haben  wir  die  MIF  Knockoutmäuse  mit 

peritonalen  Makrophagen  rekonstituiert    und  herausgefunden,  dass  die  MIF  Knockout‐Mäuse 

anfällig  für Arthritis  Induktion nach K/BxN Serum Transfer wurden, ebenso wie die Kontrollmäuse. 

Unsere Daten zeigen zum ersten Mal, das MIF von Makrophagen verantwortlich für die Pathologie 

von Arthritis im Zusammenhang mit MIF ist. Entzündungen sind im eigentlichen Sinne ein wichtiger 

Teil der körpereigenen Abwehr gegen  Infektionen. Als Teil der Aktivität gegen krankheitserregende 

Bakterien, generieren weiße Blutkörperchen bekannt als Granulozyten, reaktive Sauerstoff Formen 

(ROS), auch bekannt als „freie Radikale“. Um die Rolle von Redox Reaktionen zu untersuchen haben 

wir  die  Bedeutung  von  Phytol  in  Antikörper  induzierter  Arthritis  bestimmt.  Phytol  (3,7,11,15‐

tetramethyl‐2‐hexadecene‐1‐ol) erhöht die Radikalfreisetzung (oxidative burst)  in vivo. Wir fanden, 

das  der  Beginn  der  Arthritis  innerhalb  von  24  Stunden  in  Phytol  behandelten Mäuse  stattfand 

während  es  in  Kontrollmäusen  48  bis  72  Stunden  dauerte.  Überraschenderweise  wurde  die 

Krankheit in Phytol behandelten Mäusen schneller beendet im Vergleich zu den Kontrollmäusen. Wir 

- 115 -

fanden  außerdem  eine  erhöhte  Zahl Neutrophile  in  Phytol behandelten Mäusen  vor der Arthritis 

Induktion  im  Vergleich  zu  Kontrollmäusen.  Eine  erhöhte  Zahl  von  Neutrophilen  in  Phytol 

behandelten Mäusen  könnte  verantwortlich  für  erhöhtes  O2  sein, welches  die  ROS  unterdrückt. 

Verringerte ROS könnten verantwortlich dafür sein die Krankheit  in Phytol behandelten Mäusen an 

Tag 2 und 4  im Vergleich zu den Kontrollmäusen, zu verschlimmern  (Fig 1,15), weil gezeigt wurde, 

dass  eine  verringerte  Radikalfreisetzung  (oxidative  burst)  zu  einer  Reduktion  von  Zellmembran 

proteinen und der Aktivierung von selbstreaktiven und arthritischen T‐Zellen führt (Gelderman et al., 

2006). 

Monocyte chemoattractant protein (MCP)‐1  ist ein chemotaktisches Zytokin (Chemokin) (Baggiolini 

et al., 1994) welches die Migration und Aktivierung von Monozyten fördert (Van Damme et al., 1992; 

Zachariae  et  al., 1990).  Es wurde mit mehreren  Entzündungskrankheiten  in Verbindung  gebracht. 

Um  die  Hypothese,  mit  der  Hemmung  von  endogenem  MCP‐1  habe  der  Antagonist 

entzündungshemmende  Wirkung  in  vivo,  zu  testen,  haben  wir  den  Effekt  im  K/BxN  Arthritis 

Mausmodell untersucht. Tägliche  Injektionen des MCP‐1 Antagonisten hat den Beginn der Arthritis 

nicht verhindert,. 

sCD21 und sCD23 Titer in Autoimmunstörungen  

CD21 und CD23 werden als  lösliche Form von der Zelloberfläche mit Hilfe proteolytischer Aktivität, 

bekannt  als  „Shedding“,  abgegeben.  sCD21  behält  die  Fähigkeit  iC3b  und  CD23  zu  binden,  die 

bekannten Liganden von membranem CD21. In ähnlicher Weise zu IgE, einem anderen Liganden von 

CD23, wurde gezeigt, dass sCD21 wirkungsvoll CD23 Signalwege in menschlichen Monozyten auslöst. 

Die klinische Bedeutung von sCD21 und sCD23 wurde mit Veränderungen  ihrer Konzentrationen  in 

verschiedenen Autoimmunerkrankungen gezeigt.  

Wir haben die Konzentrationen von sCD21 und sCD23  im Serum und Plasma von antiphospholipid 

syndrome  (APS),  juvenile  arthritis  (JA),  Diabetes  und  autoimmune  lymphoproliferative  syndrom 

(ALPS)  Patienten  untersucht.  sCD21  Titer  waren  in  APS  Patienten  im  Vergleich  mit  gesunden 

Spendern (P < 0.0001) deutlich verringert. Die Anwesenheit von spezifischen �2‐GPI Autoantikörpern 

- 116 -

stand nicht  in Beziehung  zu dem  sCD21 Titer. Allerdings  sind die  sCD21  Level  in diesen Patienten 

nicht  von  zusätzlichen  Autoimmunerkrankungen wie  SLE,  vasculitis,  DVT  (deep  vein  thrombosis), 

Fehlgeburten oder Thrombosis beeinflusst.  

Im Falle von JA haben wir die Titer des Plasma sCD21 und sCD23 in Untergruppen von JA untersucht. 

Unsere Daten demonstrieren, dass die sCD21 Titer in allen Untergruppen der JA Patienten gesunken 

sind, während die Plasma sCD23 Level nur bedeutend  in P‐JA und S‐JA Proben  (P < 0.0001, 0.018) 

gesunken sind, aber nicht in O‐JA (P < 0.3843).  

Da gezeigt wurde das CD21 und CD23 an mehreren Autoimmun krankheiten beteiligt sind, haben wir 

die  Level  von  sCD21 und  sCD23  in den  Seren  von  gesunden und Diabetes  Typ  I und  II  Patienten 

untersucht. Unsere Daten zeigen dass die Titer von  sCD21 und  sCD23  in Diabetes Typ  I verringert 

sind (P < 0.0067 und P < 0.0001) während es keine Veränderungen in Diabetes Typ II im Vergleich zu 

gesunden Kontrollen gleichen Alters gibt.  

Im  Falle  von  ALPS  Patienten wurde  die  Konzentration  des  löslichen  CD21  in  Seren  von  17  ALPS 

Patienten untersucht und mit gesunden  Freiwilligen  verglichen. Wir  fanden heraus, dass die Titer 

von  sCD21  in  den  ALPS  Patientenproben  stark  erhöht  waren  im  Vergleich  zu  den  gesunden 

Personen, P < 0.006. Diese Krankheit wird  in Kindern oder Erwachsenen gefunden  ist aber meist  in 

der frühen Kindheit präsent. Das erhöhte sCD21 in ALPS Patientenseren könnte mit der Anwesenheit 

von  doppel‐negativen  (TCR  alpha/beta  CD4‐  CD8‐)  T‐Lymphozyten  (DNT)  in  der  Peripherie 

zusammenhängen. Während dem ersten Jahrzehnt werden die T‐Zellen vom Thymus erzeugt, wobei 

doppel‐negative Thymozyten höhere Level von CD21 exprimieren.  

Unsere Arbeten zeigen auf, dass sCD21 und sCD23 zusätzliche Marker für Autoimmunerkrankungen 

sind.      

- 117 -

                                                          REFERENCES     Aggarwal, A., Bhardwaj, A., Alam, S. and Misra, R. (2000). Evidence for activation of the alternate complement pathway in patients with juvenile rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford) 39, 189‐92.   Ahearn, J. M. and Fearon, D. T. (1989). Structure and function of the complement receptors, CR1 (CD35) and CR2 (CD21). Adv Immunol 46, 183‐219.   Ahmed, M., Bjurholm, A., Srinivasan, G. R., Lundeberg, T., Theodorsson, E., Schultzberg, M. and Kreicbergs, A. (1995). Capsaicin effects on substance P and CGRP in rat adjuvant arthritis. Regul Pept 55, 85‐102.   Ansel, J. C., Brown, J. R., Payan, D. G. and Brown, M. A. (1993). Substance P selectively activates TNF‐alpha gene expression in murine mast cells. J Immunol 150, 4478‐85.   Attur, M. G., Patel, R. N., Abramson, S. B. and Amin, A. R. (1997). Interleukin‐17 up‐regulation of nitric oxide production in human osteoarthritis cartilage. Arthritis Rheum 40, 1050‐3.   Aubry, J. P., Pochon, S., Graber, P., Jansen, K. U. and Bonnefoy, J. Y. (1992). CD21 is a ligand for CD23 and regulates IgE production. Nature 358, 505‐7.   Babior, B. M. (2000). Phagocytes and oxidative stress. Am J Med 109, 33‐44.   Bach, J. F. (1994). Insulin‐dependent diabetes mellitus as an autoimmune disease. Endocr Rev 15, 516‐42.   Bacher, M., Metz, C. N., Calandra, T., Mayer, K., Chesney, J., Lohoff, M., Gemsa, D., Donnelly, T. and Bucala, R. (1996). An essential regulatory role for macrophage migration inhibitory factor in T‐cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 7849‐54.   Baggiolini, M., Dewald, B. and Moser, B. (1994). Interleukin‐8 and related chemotactic cytokines‐‐CXC and CC chemokines. Adv Immunol 55, 97‐179.   Baluk, P., Bertrand, C., Geppetti, P., McDonald, D. M. and Nadel, J. A. (1996). NK1 receptor antagonist CP‐99,994 inhibits cigarette smoke‐induced neutrophil and eosinophil adhesion in rat tracheal venules. Exp Lung Res 22, 409‐18.   Bansal, A., Roberts, T., Hay, E. M., Kay, R., Pumphrey, R. S. and Wilson, P. B. (1992). Soluble CD23 levels are elevated in the serum of patients with primary Sjogren's syndrome and systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol 89, 452‐5.   Basu, D., Horvath, S., Matsumoto, I., Fremont, D. H. and Allen, P. M. (2000). Molecular basis for recognition of an arthritic peptide and a foreign epitope on distinct MHC molecules by a single TCR. J Immunol 164, 5788‐96.   Basu, D., Horvath, S., O'Mara, L., Donermeyer, D. and Allen, P. M. (2001). Two MHC surface amino acid differences distinguish foreign peptide recognition from autoantigen specificity. J Immunol 166, 4005‐11.   Bauer, K., Yu, X., Wernhoff, P., Koczan, D., Thiesen, H. J. and Ibrahim, S. M. (2004). Identification of new quantitative trait loci in mice with collagen‐induced arthritis. Arthritis Rheum 50, 3721‐8.   Benoist, C. and Mathis, D. (2000). A revival of the B cell paradigm for rheumatoid arthritis pathogenesis? Arthritis Res 2, 90‐4.   Bernhagen, J., Bacher, M., Calandra, T., Metz, C. N., Doty, S. B., Donnelly, T. and Bucala, R. (1996). An essential role for macrophage migration inhibitory factor in the tuberculin delayed‐type hypersensitivity reaction. J Exp Med 183, 277‐82. 

- 118 -

  Bernhagen, J., Mitchell, R. A., Calandra, T., Voelter, W., Cerami, A. and Bucala, R. (1994). Purification, bioactivity, and secondary structure analysis of mouse and human macrophage migration inhibitory factor (MIF). Biochemistry 33, 14144‐55.   Bertolini, D. R., Nedwin, G. E., Bringman, T. S., Smith, D. D. and Mundy, G. R. (1986). Stimulation of bone resorption and inhibition of bone formation in vitro by human tumour necrosis factors. Nature 319, 516‐8.   Blank, M., Cohen, J., Toder, V. and Shoenfeld, Y. (1991). Induction of anti‐phospholipid syndrome in naive mice with mouse lupus monoclonal and human polyclonal anti‐cardiolipin antibodies. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 3069‐73.   Blank, M., George, J., Barak, V., Tincani, A., Koike, T. and Shoenfeld, Y. (1998). Oral tolerance to low dose beta 2‐glycoprotein I: immunomodulation of experimental antiphospholipid syndrome. J Immunol 161, 5303‐12.   Blank, M., Krause, I., Fridkin, M., Keller, N., Kopolovic, J., Goldberg, I., Tobar, A. and Shoenfeld, Y. (2002). Bacterial induction of autoantibodies to beta2‐glycoprotein‐I accounts for the infectious etiology of antiphospholipid syndrome. J Clin Invest 109, 797‐804.   Blank, M., Shoenfeld, Y., Cabilly, S., Heldman, Y., Fridkin, M. and Katchalski‐Katzir, E. (1999). Prevention of experimental antiphospholipid syndrome and endothelial cell activation by synthetic peptides. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 5164‐8.   Blank, M., Tincani, A. and Shoenfeld, Y. (1994). Induction of experimental antiphospholipid syndrome in naive mice with purified IgG antiphosphatidylserine antibodies. J Rheumatol 21, 100‐4.   Bogers, W. M., Stad, R. K., Janssen, D. J., van Rooijen, N., van Es, L. A. and Daha, M. R. (1991). Kupffer cell depletion in vivo results in preferential elimination of IgG aggregates and immune complexes via specific Fc receptors on rat liver endothelial cells. Clin Exp Immunol 86, 328‐33.   Bonnefoy, J. Y., Gauchat, J. F., Life, P., Graber, P., Aubry, J. P. and Lecoanet‐Henchoz, S. (1995a). Regulation of IgE synthesis by CD23/CD21 interaction. Int Arch Allergy Immunol 107, 40‐2.   Bonnefoy, J. Y., Lecoanet‐Henchoz, S., Aubry, J. P., Gauchat, J. F. and Graber, P. (1995b). CD23 and B‐cell activation. Curr Opin Immunol 7, 355‐9.   Borden, P. and Heller, R. A. (1997). Transcriptional control of matrix metalloproteinases and the tissue inhibitors of matrix metalloproteinases. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 7, 159‐78.   Borden, P., Solymar, D., Sucharczuk, A., Lindman, B., Cannon, P. and Heller, R. A. (1996). Cytokine control of interstitial collagenase and collagenase‐3 gene expression in human chondrocytes. J Biol Chem 271, 23577‐81.   Borovikova, L. V., Ivanova, S., Zhang, M., Yang, H., Botchkina, G. I., Watkins, L. R., Wang, H., Abumrad, N., Eaton, J. W. and Tracey, K. J. (2000). Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin. Nature 405, 458‐62.   Bradbury, L. E., Kansas, G. S., Levy, S., Evans, R. L. and Tedder, T. F. (1992). The CD19/CD21 signal transducing complex of human B lymphocytes includes the target of antiproliferative antibody‐1 and Leu‐13 molecules. J Immunol 149, 2841‐50.   Brennan, F. M. (2001). A follow‐up to "Anti‐cytokine therapy in chronic destructive arthritis" by Wim B van den Berg. Arthritis Res 3, 211‐3; discussion 214‐5. 

- 119 -

  Bresson, M., Cirimele, V., Villain, M. and Kintz, P. (2006). Doping control for metandienone using hair analyzed by gas chromatography‐tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 836, 124‐8.   Brinckerhoff, C. E., Rutter, J. L. and Benbow, U. (2000). Interstitial collagenases as markers of tumor progression. Clin Cancer Res 6, 4823‐30.   Brown‐Galatola, C. H. and Hall, N. D. (1992). Impaired suppressor cell activity due to surface sulphydryl oxidation in rheumatoid arthritis. Br J Rheumatol 31, 599‐603.   Buck, S. H. and Burks, T. F. (1986). The neuropharmacology of capsaicin: review of some recent observations. Pharmacol Rev 38, 179‐226.   Burkhardt, H., Koller, T., Engstrom, A., Nandakumar, K. S., Turnay, J., Kraetsch, H. G., Kalden, J. R. and Holmdahl, R. (2002). Epitope‐specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen‐induced arthritis in the mouse. Arthritis Rheum 46, 2339‐48.   Burmester, G. R., Stuhlmuller, B., Keyszer, G. and Kinne, R. W. (1997). Mononuclear phagocytes and rheumatoid synovitis. Mastermind or workhorse in arthritis? Arthritis Rheum 40, 5‐18.   Calandra, T., Bernhagen, J., Metz, C. N., Spiegel, L. A., Bacher, M., Donnelly, T., Cerami, A. and Bucala, R. (1995). MIF as a glucocorticoid‐induced modulator of cytokine production. Nature 377, 68‐71.   Calandra, T., Bernhagen, J., Mitchell, R. A. and Bucala, R. (1994). The macrophage is an important and previously unrecognized source of macrophage migration inhibitory factor. J Exp Med 179, 1895‐902.   Calandra, T. and Bucala, R. (1995). Macrophage migration inhibitory factor: a counter‐regulator of glucocorticoid action and critical mediator of septic shock. J Inflamm 47, 39‐51.   Cao, T., Pinter, E., Al‐Rashed, S., Gerard, N., Hoult, J. R. and Brain, S. D. (2000). Neurokinin‐1 receptor agonists are involved in mediating neutrophil accumulation in the inflamed, but not normal, cutaneous microvasculature: an in vivo study using neurokinin‐1 receptor knockout mice. J Immunol 164, 5424‐9.   Carel, J. C., Myones, B. L., Frazier, B. and Holers, V. M. (1990). Structural requirements for C3d,g/Epstein‐Barr virus receptor (CR2/CD21) ligand binding, internalization, and viral infection. In J Biol Chem, vol. 265, pp. 12293‐9.   Cerinic, M. M., Konttinen, Y., Generini, S. and Cutolo, M. (1998). Neuropeptides and steroid hormones in arthritis. Curr Opin Rheumatol 10, 220‐35.   Chang, F. Y. and Shaio, M. F. (1995). Decreased cell‐mediated immunity in patients with non‐insulin‐dependent diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract 28, 137‐46.   Chanock, S. J., el Benna, J., Smith, R. M. and Babior, B. M. (1994). The respiratory burst oxidase. J Biol Chem 269, 24519‐22.   Charlton, B., Zhang, M. D. and Slattery, R. M. (2001). B lymphocytes not required for progression from insulitis to diabetes in non‐obese diabetic mice. Immunol Cell Biol 79, 597‐601.   Chen, C. Y., Tsao, C. H., Ou, L. S., Yang, M. H., Kuo, M. L. and Huang, J. L. (2002). Comparison of soluble adhesion molecules in juvenile idiopathic arthritis between the active and remission stages. Ann Rheum Dis 61, 167‐70.   Chen, P. P., Fong, S. and Carson, D. A. (1987). Rheumatoid factor. Rheum Dis Clin North Am 13, 545‐68. 

- 120 -

  Cherukuri, A., Cheng, P. C. and Pierce, S. K. (2001). The role of the CD19/CD21 complex in B cell processing and presentation of complement‐tagged antigens. J Immunol 167, 163‐72.   Chevalier, J. and Kazatchkine, M. D. (1989). Distribution in clusters of complement receptor type one (CR1) on human erythrocytes. J Immunol 142, 2031‐6.   Chomarat, P., Briolay, J., Banchereau, J. and Miossec, P. (1993). Increased production of soluble CD23 in rheumatoid arthritis, and its regulation by interleukin‐4. Arthritis Rheum 36, 234‐42.   Chu, C. Q., Field, M., Feldmann, M. and Maini, R. N. (1991). Localization of tumor necrosis factor alpha in synovial tissues and at the cartilage‐pannus junction in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 34, 1125‐32.   Churchill, W. H., Jr., Piessens, W. F., Sulis, C. A. and David, J. R. (1975). Macrophages activated as suspension cultures with lymphocyte mediators devoid of antigen become cytotoxic for tumor cells. J Immunol 115, 781‐6.   Cook, A. D., Stockman, A., Brand, C. A., Tait, B. D., Mackay, I. R., Muirden, K. D., Bernard, C. C. and Rowley, M. J. (1999). Antibodies to type II collagen and HLA disease susceptibility markers in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 42, 2569‐76.   Cordell, G. A. and Araujo, O. E. (1993). Capsaicin: identification, nomenclature, and pharmacotherapy. Ann Pharmacother 27, 330‐6.   Corominas, M., Mestre, M., Bas, J. and Buendia, E. (1998). Distinct modulation by interferon‐gamma (IFN‐gamma) of CD23 expression on B and T lymphocytes of atopic subjects. Clin Exp Immunol 112, 276‐80.   Cuozzo, J. W. and Kaiser, C. A. (1999). Competition between glutathione and protein thiols for disulphide‐bond formation. Nat Cell Biol 1, 130‐5.   Davidson, A. and Diamond, B. (2001). Autoimmune diseases. N Engl J Med 345, 340‐50.   Davies, K. A., Erlendsson, K., Beynon, H. L., Peters, A. M., Steinsson, K., Valdimarsson, H. and Walport, M. J. (1993). Splenic uptake of immune complexes in man is complement‐dependent. J Immunol 151, 3866‐73.   Dayer, J. M., Beutler, B. and Cerami, A. (1985). Cachectin/tumor necrosis factor stimulates collagenase and prostaglandin E2 production by human synovial cells and dermal fibroblasts. J Exp Med 162, 2163‐8.   Del Nagro, C. J., Kolla, R. V. and Rickert, R. C. (2005). A critical role for complement C3d and the B cell coreceptor (CD19/CD21) complex in the initiation of inflammatory arthritis. J Immunol 175, 5379‐89.   Delespesse, G., Sarfati, M., Wu, C. Y., Fournier, S. and Letellier, M. (1992). The low‐affinity receptor for IgE. Immunol Rev 125, 77‐97.   Delespesse, G., Suter, U., Mossalayi, D., Bettler, B., Sarfati, M., Hofstetter, H., Kilcherr, E., Debre, P. and Dalloul, A. (1991). Expression, structure, and function of the CD23 antigen. Adv Immunol 49, 149‐91.   Delibrias, C. C., Fischer, E., Bismuth, G. and Kazatchkine, M. D. (1992). Expression, molecular association, and functions of C3 complement receptors CR1 (CD35) and CR2 (CD21) on the human T cell line HPB‐ALL. J Immunol 149, 768‐74.   Deneke, S. M. (2000). Thiol‐based antioxidants. Curr Top Cell Regul 36, 151‐80.   Deutsch, M., Tsopanou, E. and Dourakis, S. P. (2004). The autoimmune lymphoproliferative syndrome (Canale‐Smith) in adulthood. Clin Rheumatol 23, 43‐4. 

- 121 -

  Dianzani, U., Bragardo, M., DiFranco, D., Alliaudi, C., Scagni, P., Buonfiglio, D., Redoglia, V., Bonissoni, S., Correra, A., Dianzani, I. et al. (1997). Deficiency of the Fas apoptosis pathway without Fas gene mutations in pediatric patients with autoimmunity/lymphoproliferation. Blood 89, 2871‐9.   Dickinson, D. A. and Forman, H. J. (2002). Cellular glutathione and thiols metabolism. Biochem Pharmacol 64, 1019‐26.   Droge, W. (2002). Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev 82, 47‐95.   Edwards, J. C. and Cambridge, G. (2001). Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes. Rheumatology (Oxford) 40, 205‐11.   Edwards, J. C., Cambridge, G. and Abrahams, V. M. (1999). Do self‐perpetuating B lymphocytes drive human autoimmune disease? Immunology 97, 188‐96.   Elliott, M. J., Maini, R. N., Feldmann, M., Long‐Fox, A., Charles, P., Katsikis, P., Brennan, F. M., Walker, J., Bijl, H., Ghrayeb, J. et al. (1993). Treatment of rheumatoid arthritis with chimeric monoclonal antibodies to tumor necrosis factor alpha. Arthritis Rheum 36, 1681‐90.   Eskandari, F., Webster, J. I. and Sternberg, E. M. (2003). Neural immune pathways and their connection to inflammatory diseases. Arthritis Res Ther 5, 251‐65.   Falcone, M., Lee, J., Patstone, G., Yeung, B. and Sarvetnick, N. (1998). B lymphocytes are crucial antigen‐presenting cells in the pathogenic autoimmune response to GAD65 antigen in nonobese diabetic mice. J Immunol 161, 1163‐8.   Fearon, D. T. (1980). Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. J Exp Med 152, 20‐30.   Feldmann, M., Brennan, F. M. and Maini, R. N. (1996). Role of cytokines in rheumatoid arthritis. Annu Rev Immunol 14, 397‐440.   Feldmann, M. and Maini, R. N. (2001). Anti‐TNF alpha therapy of rheumatoid arthritis: what have we learned? Annu Rev Immunol 19, 163‐96.   Fingeroth, J. D., Weis, J. J., Tedder, T. F., Strominger, J. L., Biro, P. A. and Fearon, D. T. (1984). Epstein‐Barr virus receptor of human B lymphocytes is the C3d receptor CR2. Proc Natl Acad Sci U S A 81, 4510‐4.   Firestein, G. S. and Zvaifler, N. J. (1990). How important are T cells in chronic rheumatoid synovitis? Arthritis Rheum 33, 768‐73.   Fischer, E., Delibrias, C. and Kazatchkine, M. D. (1991). Expression of CR2 (the C3dg/EBV receptor, CD21) on normal human peripheral blood T lymphocytes. J Immunol 146, 865‐9.   Fischer, E. M., Mouhoub, A., Maillet, F., Fremeaux‐Bacchi, V., Krief, C., Gould, H., Berrih‐Aknin, S. and Kazatchkine, M. D. (1999). Expression of CD21 is developmentally regulated during thymic maturation of human T lymphocytes. Int Immunol 11, 1841‐9.   Fisher, G. H., Rosenberg, F. J., Straus, S. E., Dale, J. K., Middleton, L. A., Lin, A. Y., Strober, W., Lenardo, M. J. and Puck, J. M. (1995). Dominant interfering Fas gene mutations impair apoptosis in a human autoimmune lymphoproliferative syndrome. Cell 81, 935‐46.   Fitzgerald, M. (1989). Arthritis and the nervous system. Trends Neurosci 12, 86‐7.   Fosang, A. J., Last, K., Knauper, V., Murphy, G. and Neame, P. J. (1996). Degradation of cartilage aggrecan by collagenase‐3 (MMP‐13). FEBS Lett 380, 17‐20. 

- 122 -

  Freije, J. M., Diez‐Itza, I., Balbin, M., Sanchez, L. M., Blasco, R., Tolivia, J. and Lopez‐Otin, C. (1994). Molecular cloning and expression of collagenase‐3, a novel human matrix metalloproteinase produced by breast carcinomas. J Biol Chem 269, 16766‐73.   Fremeaux‐Bacchi, V., Aubry, J. P., Bonnefoy, J. Y., Kazatchkine, M. D., Kolb, J. P. and Fischer, E. M. (1998a). Soluble CD21 induces activation and differentiation of human monocytes through binding to membrane CD23. Eur J Immunol 28, 4268‐74.   Fremeaux‐Bacchi, V., Bernard, I., Maillet, F., Mani, J. C., Fontaine, M., Bonnefoy, J. Y., Kazatchkine, M. D. and Fischer, E. (1996). Human lymphocytes shed a soluble form of CD21 (the C3dg/Epstein‐Barr virus receptor, CR2) that binds iC3b and CD23. Eur J Immunol 26, 1497‐503.   Fremeaux‐Bacchi, V., Fischer, E., Lecoanet‐Henchoz, S., Mani, J. C., Bonnefoy, J. Y. and Kazatchkine, M. D. (1998b). Soluble CD21 (sCD21) forms biologically active complexes with CD23: sCD21 is present in normal plasma as a complex with trimeric CD23 and inhibits soluble CD23‐induced IgE synthesis by B cells. Int Immunol 10, 1459‐66.   Furie, M. B. and Randolph, G. J. (1995). Chemokines and tissue injury. Am J Pathol 146, 1287‐301.   Fuss, I. J., Strober, W., Dale, J. K., Fritz, S., Pearlstein, G. R., Puck, J. M., Lenardo, M. J. and Straus, S. E. (1997). Characteristic T helper 2 T cell cytokine abnormalities in autoimmune lymphoproliferative syndrome, a syndrome marked by defective apoptosis and humoral autoimmunity. J Immunol 158, 1912‐8.   Galli, M., Comfurius, P., Maassen, C., Hemker, H. C., de Baets, M. H., van Breda‐Vriesman, P. J., Barbui, T., Zwaal, R. F. and Bevers, E. M. (1990). Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma protein cofactor. Lancet 335, 1544‐7.   Gamse, R., Petsche, U., Lembeck, F. and Jancso, G. (1982). Capsaicin applied to peripheral nerve inhibits axoplasmic transport of substance P and somatostatin. Brain Res 239, 447‐62.   Gare, B. A. (1998). Epidemiology. Baillieres Clin Rheumatol 12, 191‐208.   Gelderman, K. A., Hultqvist, M., Holmberg, J., Olofsson, P. and Holmdahl, R. (2006). T cell surface redox levels determine T cell reactivity and arthritis susceptibility. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 12831‐6.   George, J., Blank, M., Levy, Y., Meroni, P., Damianovich, M., Tincani, A. and Shoenfeld, Y. (1998). Differential effects of anti‐beta2‐glycoprotein I antibodies on endothelial cells and on the manifestations of experimental antiphospholipid syndrome. Circulation 97, 900‐6.   Grigg, P. (2001). Properties of sensory neurons innervating synovial joints. Cells Tissues Organs 169, 218‐25.   Grimsholm, O., Rantapaa‐Dahlqvist, S. and Forsgren, S. (2005). Levels of gastrin‐releasing peptide and substance P in synovial fluid and serum correlate with levels of cytokines in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 7, R416‐26.   Groemping, Y. and Rittinger, K. (2005). Activation and assembly of the NADPH oxidase: a structural perspective. Biochem J 386, 401‐16.   Gross, J. A., Johnston, J., Mudri, S., Enselman, R., Dillon, S. R., Madden, K., Xu, W., Parrish‐Novak, J., Foster, D., Lofton‐Day, C. et al. (2000). TACI and BCMA are receptors for a TNF homologue implicated in B‐cell autoimmune disease. Nature 404, 995‐9.   Harigai, M., Hara, M., Yoshimura, T., Leonard, E. J., Inoue, K. and Kashiwazaki, S. (1993). Monocyte chemoattractant protein‐1 (MCP‐1) in inflammatory joint diseases and 

- 123 -

its involvement in the cytokine network of rheumatoid synovium. Clin Immunol Immunopathol 69, 83‐91.   Hietala, M. A., Nandakumar, K. S., Persson, L., Fahlen, S., Holmdahl, R. and Pekna, M. (2004). Complement activation by both classical and alternative pathways is critical for the effector phase of arthritis. Eur J Immunol 34, 1208‐16.   Highton, J., Carlisle, B. and Palmer, D. G. (1995). Changes in the phenotype of monocytes/macrophages and expression of cytokine mRNA in peripheral blood and synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol 102, 541‐6.   Hitchon, C. A. and El‐Gabalawy, H. S. (2004). Oxidation in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 6, 265‐78.   Hokfelt, T., Kellerth, J. O., Nilsson, G. and Pernow, B. (1975). Substance p: localization in the central nervous system and in some primary sensory neurons. Science 190, 889‐90.   Holmdahl, R., Rubin, K., Klareskog, L., Larsson, E. and Wigzell, H. (1986). Characterization of the antibody response in mice with type II collagen‐induced arthritis, using monoclonal anti‐type II collagen antibodies. Arthritis Rheum 29, 400‐10.   Honeyman, M., Wasserfall, C., Nerup, J. and Rossini, A. (1997). Prediction and prevention of IDDM. Diabetologia 40 Suppl 3, B58‐61.   Huemer, H. P., Larcher, C., Prodinger, W. M., Petzer, A. L., Mitterer, M. and Falser, N. (1993). Determination of soluble CD21 as a parameter of B cell activation. Clin Exp Immunol 93, 195‐9.   Hultqvist, M., Olofsson, P., Gelderman, K. A., Holmberg, J. and Holmdahl, R. (2006). A new arthritis therapy with oxidative burst inducers. PLoS Med 3, e348.   Hussain, M. J., Maher, J., Warnock, T., Vats, A., Peakman, M. and Vergani, D. (1998). Cytokine overproduction in healthy first degree relatives of patients with IDDM. Diabetologia 41, 343‐9.   Ibrahim, S. M., Koczan, D. and Thiesen, H. J. (2002). Gene‐expression profile of collagen‐induced arthritis. J Autoimmun 18, 159‐67.   Illges, H., Braun, M., Peter, H. H. and Melchers, I. (1997). Analysis of the human CD21 transcription unit reveals differential splicing of exon 11 in mature transcripts and excludes alternative splicing as the mechanism causing solubilization of CD21. Mol Immunol 34, 683‐93.   Illges, H., Braun, M., Peter, H. H. and Melchers, I. (2000). Reduced expression of the complement receptor type 2 (CR2, CD21) by synovial fluid B and T lymphocytes. Clin Exp Immunol 122, 270‐6.   Jackson, C. E., Fischer, R. E., Hsu, A. P., Anderson, S. M., Choi, Y., Wang, J., Dale, J. K., Fleisher, T. A., Middelton, L. A., Sneller, M. C. et al. (1999). Autoimmune lymphoproliferative syndrome with defective Fas: genotype influences penetrance. Am J Hum Genet 64, 1002‐14.   Jackson, S. H., Gallin, J. I. and Holland, S. M. (1995). The p47phox mouse knock‐out model of chronic granulomatous disease. J Exp Med 182, 751‐8.   Ji, H., Korganow, A. S., Mangialaio, S., Hoglund, P., Andre, I., Luhder, F., Gonzalez, A., Poirot, L., Benoist, C. and Mathis, D. (1999). Different modes of pathogenesis in T‐cell‐dependent autoimmunity: clues from two TCR transgenic systems. Immunol Rev 169, 139‐46.   Jiang, Z., Dun, N. J. and Karczmar, A. G. (1982). Substance P: a putative sensory transmitter in mammalian autonomic ganglia. Science 217, 739‐41. 

- 124 -

  Juttner, S., Bernhagen, J., Metz, C. N., Rollinghoff, M., Bucala, R. and Gessner, A. (1998). Migration inhibitory factor induces killing of Leishmania major by macrophages: dependence on reactive nitrogen intermediates and endogenous TNF‐alpha. J Immunol 161, 2383‐90.   Kalli, K. R., Ahearn, J. M. and Fearon, D. T. (1991). Interaction of iC3b with recombinant isotypic and chimeric forms of CR2. J Immunol 147, 590‐4.   Kasahara, Y., Wada, T., Niida, Y., Yachie, A., Seki, H., Ishida, Y., Sakai, T., Koizumi, F., Koizumi, S., Miyawaki, T. et al. (1998). Novel Fas (CD95/APO‐1) mutations in infants with a lymphoproliferative disorder. Int Immunol 10, 195‐202.   Kashiwagi, N., Hirata, I. and Kasukawa, R. (1998). A role for granulocyte and monocyte apheresis in the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Apher 2, 134‐41.   Kelleher, C. A., Paterson, R. K., Dreyfus, D. H., Streib, J. E., Xu, J. W., Takase, K., Jones, J. F. and Gelfand, E. W. (1995). Epstein‐Barr virus replicative gene transcription during de novo infection of human thymocytes: simultaneous early expression of BZLF‐1 and its repressor RAZ. Virology 208, 685‐95.   Kidd, B. L., Cruwys, S., Mapp, P. I. and Blake, D. R. (1992). Role of the sympathetic nervous system in chronic joint pain and inflammation. Ann Rheum Dis 51, 1188‐91.   Kim, H. Y., Kim, W. U., Cho, M. L., Lee, S. K., Youn, J., Kim, S. I., Yoo, W. H., Park, J. H., Min, J. K., Lee, S. H. et al. (1999). Enhanced T cell proliferative response to type II collagen and synthetic peptide CII (255‐274) in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 42, 2085‐93.   Kimura, M., Tanaka, S., Isoda, F., Sekigawa, K., Yamakawa, T. and Sekihara, H. (1998). T lymphopenia in obese diabetic (db/db) mice is non‐selective and thymus independent. Life Sci 62, 1243‐50.   Kinoshita, T., Lavoie, S. and Nussenzweig, V. (1985). Regulatory proteins for the activated third and fourth components of complement (C3b and C4b) in mice. II. Identification and properties of complement receptor type 1 (CR1). J Immunol 134, 2564‐70.   Klebanoff, S. J. (2005). Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol 77, 598‐625.   Knauper, V., Lopez‐Otin, C., Smith, B., Knight, G. and Murphy, G. (1996a). Biochemical characterization of human collagenase‐3. J Biol Chem 271, 1544‐50.   Knauper, V., Will, H., Lopez‐Otin, C., Smith, B., Atkinson, S. J., Stanton, H., Hembry, R. M. and Murphy, G. (1996b). Cellular mechanisms for human procollagenase‐3 (MMP‐13) activation. Evidence that MT1‐MMP (MMP‐14) and gelatinase a (MMP‐2) are able to generate active enzyme. J Biol Chem 271, 17124‐31.   Kneilling, M., Hultner, L., Pichler, B. J., Mailhammer, R., Morawietz, L., Solomon, S., Eichner, M., Sabatino, J., Biedermann, T., Krenn, V. et al. (2007). Targeted mast cell silencing protects against joint destruction and angiogenesis in experimental arthritis in mice. Arthritis Rheum 56, 1806‐16.   Koch, A. E., Kunkel, S. L., Harlow, L. A., Johnson, B., Evanoff, H. L., Haines, G. K., Burdick, M. D., Pope, R. M. and Strieter, R. M. (1992). Enhanced production of monocyte chemoattractant protein‐1 in rheumatoid arthritis. J Clin Invest 90, 772‐9.   Konttinen, Y. T., Salo, T., Hanemaaijer, R., Valleala, H., Sorsa, T., Sutinen, M., Ceponis, A., Xu, J. W., Santavirta, S., Teronen, O. et al. (1999). Collagenase‐3 (MMP‐13) and its activators in rheumatoid arthritis: localization in the pannus‐hard tissue junction and inhibition by alendronate. Matrix Biol 18, 401‐12. 

- 125 -

  Kouskoff, V., Korganow, A. S., Duchatelle, V., Degott, C., Benoist, C. and Mathis, D. (1996). Organ‐specific disease provoked by systemic autoimmunity. Cell 87, 811‐22.   Kunkel, S. L., Lukacs, N., Kasama, T. and Strieter, R. M. (1996). The role of chemokines in inflammatory joint disease. J Leukoc Biol 59, 6‐12.   Kutukculer, N. and Caglayan, S. (1998). Plasma and synovial fluid soluble CD23 concentrations in children with juvenile chronic arthritis. Autoimmunity 27, 155‐8.   Lander, E. S. and Botstein, D. (1989). Mapping mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics 121, 185‐99.   Lawrence, D. A., Song, R. and Weber, P. (1996). Surface thiols of human lymphocytes and their changes after in vitro and in vivo activation. J Leukoc Biol 60, 611‐8.   Le Novere, N. and Changeux, J. P. (1995). Molecular evolution of the nicotinic acetylcholine receptor: an example of multigene family in excitable cells. J Mol Evol 40, 155‐72.   Lee, D. M., Friend, D. S., Gurish, M. F., Benoist, C., Mathis, D. and Brenner, M. B. (2002). Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Science 297, 1689‐92.   Leech, M., Metz, C., Hall, P., Hutchinson, P., Gianis, K., Smith, M., Weedon, H., Holdsworth, S. R., Bucala, R. and Morand, E. F. (1999). Macrophage migration inhibitory factor in rheumatoid arthritis: evidence of proinflammatory function and regulation by glucocorticoids. Arthritis Rheum 42, 1601‐8.   Leech, M., Metz, C., Santos, L., Peng, T., Holdsworth, S. R., Bucala, R. and Morand, E. F. (1998). Involvement of macrophage migration inhibitory factor in the evolution of rat adjuvant arthritis. Arthritis Rheum 41, 910‐7.   Leonard, S. and Bertrand, D. (2001). Neuronal nicotinic receptors: from structure to function. Nicotine Tob Res 3, 203‐23.   Levine, J. D., Clark, R., Devor, M., Helms, C., Moskowitz, M. A. and Basbaum, A. I. (1984). Intraneuronal substance P contributes to the severity of experimental arthritis. Science 226, 547‐9.   Levine, J. D., Coderre, T. J., Helms, C. and Basbaum, A. I. (1988). Beta 2‐adrenergic mechanisms in experimental arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 4553‐6.   Levine, J. D., Collier, D. H., Basbaum, A. I., Moskowitz, M. A. and Helms, C. A. (1985). Hypothesis: the nervous system may contribute to the pathophysiology of rheumatoid arthritis. J Rheumatol 12, 406‐11.   Levinson, A. I., Dziarski, A., Pincus, T., deHoratius, R. J. and Zweiman, B. (1981). Heterogeneity of polyclonal B‐cell activity in systemic lupus erythematosus. J Clin Lab Immunol 5, 17‐22.   Liew, F. Y. (1994). Regulation of nitric oxide synthesis in infectious and autoimmune diseases. Immunol Lett 43, 95‐8.   Ling, N., Hansel, T., Richardson, P. and Brown, B. (1991). Cellular origins of serum complement receptor type 2 in normal individuals and in hypogammaglobulinaemia. Clin Exp Immunol 84, 16‐22.   Liu, Y. J., Cairns, J. A., Holder, M. J., Abbot, S. D., Jansen, K. U., Bonnefoy, J. Y., Gordon, J. and MacLennan, I. C. (1991). Recombinant 25‐kDa CD23 and interleukin 1 alpha promote the survival of germinal center B cells: evidence for bifurcation in the development of centrocytes rescued from apoptosis. Eur J Immunol 21, 1107‐14.   Londei, M., Savill, C. M., Verhoef, A., Brennan, F., Leech, Z. A., Duance, V., Maini, R. N. and Feldmann, M. (1989). Persistence of collagen type II‐specific T‐cell clones in the 

- 126 -

synovial membrane of a patient with rheumatoid arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 636‐40.   Lotz, M., Carson, D. A. and Vaughan, J. H. (1987). Substance P activation of rheumatoid synoviocytes: neural pathway in pathogenesis of arthritis. Science 235, 893‐5.   Lowe, J., Brown, B., Hardie, D., Richardson, P. and Ling, N. (1989). Soluble forms of CD21 and CD23 antigens in the serum in B cell chronic lymphocytic leukaemia. Immunol Lett 20, 103‐9.   Luber‐Narod, J., Kage, R. and Leeman, S. E. (1994). Substance P enhances the secretion of tumor necrosis factor‐alpha from neuroglial cells stimulated with lipopolysaccharide. J Immunol 152, 819‐24.   Lyubchenko, T., dal Porto, J., Cambier, J. C. and Holers, V. M. (2005). Coligation of the B cell receptor with complement receptor type 2 (CR2/CD21) using its natural ligand C3dg: activation without engagement of an inhibitory signaling pathway. J Immunol 174, 3264‐72.   Maccioni, M., Zeder‐Lutz, G., Huang, H., Ebel, C., Gerber, P., Hergueux, J., Marchal, P., Duchatelle, V., Degott, C., van Regenmortel, M. et al. (2002). Arthritogenic monoclonal antibodies from K/BxN mice. J Exp Med 195, 1071‐7.   MacGregor, A. J., Snieder, H., Rigby, A. S., Koskenvuo, M., Kaprio, J., Aho, K. and Silman, A. J. (2000). Characterizing the quantitative genetic contribution to rheumatoid arthritis using data from twins. Arthritis Rheum 43, 30‐7.   Mapp, P. I., Kidd, B. L., Gibson, S. J., Terry, J. M., Revell, P. A., Ibrahim, N. B., Blake, D. R. and Polak, J. M. (1990). Substance P‐, calcitonin gene‐related peptide‐ and C‐flanking peptide of neuropeptide Y‐immunoreactive fibres are present in normal synovium but depleted in patients with rheumatoid arthritis. Neuroscience 37, 143‐53.   Marrack, P., Kappler, J. and Kotzin, B. L. (2001). Autoimmune disease: why and where it occurs. Nat Med 7, 899‐905.   Marubio, L. M. and Changeux, J. (2000). Nicotinic acetylcholine receptor knockout mice as animal models for studying receptor function. Eur J Pharmacol 393, 113‐21.   Masilamani, M., Kassahn, D., Mikkat, S., Glocker, M. O. and Illges, H. (2003). B cell activation leads to shedding of complement receptor type II (CR2/CD21). Eur J Immunol 33, 2391‐7.   Masilamani, M., Nowack, R., Witte, T., Schlesier, M., Warnatz, K., Glocker, M. O., Peter, H. H. and Illges, H. (2004a). Reduction of soluble complement receptor 2/CD21 in systemic lupus erythomatosus and Sjogren's syndrome but not juvenile arthritis. Scand J Immunol 60, 625‐30.   Masilamani, M., Rajasekaran, N., Singh, A., Low, H. Z., Albus, K., Anders, S., Behne, F., Eiermann, P., Konig, K., Mindnich, C. et al. (2008). Systemic reduction of soluble complement receptor II/CD21 during pregnancy to levels reminiscent of autoimmune disease. Rheumatol Int 28, 1137‐41.   Masilamani, M., von Kempis, J. and Illges, H. (2004b). Decreased levels of serum soluble complement receptor‐II (CR2/CD21) in patients with rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford) 43, 186‐90.   Masson‐Bessiere, C., Sebbag, M., Girbal‐Neuhauser, E., Nogueira, L., Vincent, C., Senshu, T. and Serre, G. (2001). The major synovial targets of the rheumatoid arthritis‐specific antifilaggrin autoantibodies are deiminated forms of the alpha‐ and beta‐chains of fibrin. J Immunol 166, 4177‐84. 

- 127 -

  Matsumoto, I., Maccioni, M., Lee, D. M., Maurice, M., Simmons, B., Brenner, M., Mathis, D. and Benoist, C. (2002). How antibodies to a ubiquitous cytoplasmic enzyme may provoke joint‐specific autoimmune disease. Nat Immunol 3, 360‐5.   Matsumoto, I., Okada, S., Kuroda, K., Iwamoto, I., Saito, Y., Tokuhisa, T., Nishioka, K. and Sumida, T. (1999). Single cell analysis of T cells infiltrating labial salivary glands from patients with Sjogren's syndrome. Int J Mol Med 4, 519‐27.   Mengshol, J. A., Vincenti, M. P., Coon, C. I., Barchowsky, A. and Brinckerhoff, C. E. (2000). Interleukin‐1 induction of collagenase 3 (matrix metalloproteinase 13) gene expression in chondrocytes requires p38, c‐Jun N‐terminal kinase, and nuclear factor kappaB: differential regulation of collagenase 1 and collagenase 3. Arthritis Rheum 43, 801‐11.   Meroni, P., Ronda, N., Raschi, E. and Borghi, M. O. (2005). Humoral autoimmunity against endothelium: theory or reality? Trends Immunol 26, 275‐81.   Miller, E. J. and Gay, S. (1987). The collagens: an overview and update. Methods Enzymol 144, 3‐41.   Miller, J. J., 3rd, Olds, L. C. and Huene, D. B. (1986). Complement activation products and factors influencing phagocyte migration in synovial fluids from children with chronic arthritis. Clin Exp Rheumatol 4, 53‐6.   Miller, L. E., Justen, H. P., Scholmerich, J. and Straub, R. H. (2000). The loss of sympathetic nerve fibers in the synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis is accompanied by increased norepinephrine release from synovial macrophages. Faseb J 14, 2097‐107.   Mitchell, P. G., Magna, H. A., Reeves, L. M., Lopresti‐Morrow, L. L., Yocum, S. A., Rosner, P. J., Geoghegan, K. F. and Hambor, J. E. (1996). Cloning, expression, and type II collagenolytic activity of matrix metalloproteinase‐13 from human osteoarthritic cartilage. J Clin Invest 97, 761‐8.   Molina, H., Kinoshita, T., Webster, C. B. and Holers, V. M. (1994). Analysis of C3b/C3d binding sites and factor I cofactor regions within mouse complement receptors 1 and 2. J Immunol 153, 789‐95.   Moore, M. D., DiScipio, R. G., Cooper, N. R. and Nemerow, G. R. (1989). Hydrodynamic, electron microscopic, and ligand‐binding analysis of the Epstein‐Barr virus/C3dg receptor (CR2). J Biol Chem 264, 20576‐82.   Morand, E. F., Leech, M., Weedon, H., Metz, C., Bucala, R. and Smith, M. D. (2002). Macrophage migration inhibitory factor in rheumatoid arthritis: clinical correlations. Rheumatology (Oxford) 41, 558‐62.   Myones, B. L. and Ross, G. D. (1987). Identification of a spontaneously shed fragment of B cell complement receptor type two (CR2) containing the C3d‐binding site. Complement 4, 87‐98.   Nagase, H. and Woessner, J. F., Jr. (1999). Matrix metalloproteinases. J Biol Chem 274, 21491‐4.   Nagashima, M., Yoshino, S., Tanaka, H., Yoshida, N., Kashiwagi, N. and Saniabadi, A. R. (1998). Granulocyte and monocyte apheresis suppresses symptoms of rheumatoid arthritis: a pilot study. Rheumatol Int 18, 113‐8.   Nagata, S. and Suda, T. (1995). Fas and Fas ligand: lpr and gld mutations. Immunol Today 16, 39‐43.   Nandakumar, K. S., Andren, M., Martinsson, P., Bajtner, E., Hellstrom, S., Holmdahl, R. and Kleinau, S. (2003a). Induction of arthritis by single monoclonal IgG anti‐

- 128 -

collagen type II antibodies and enhancement of arthritis in mice lacking inhibitory FcgammaRIIB. Eur J Immunol 33, 2269‐77.   Nandakumar, K. S., Svensson, L. and Holmdahl, R. (2003b). Collagen type II‐specific monoclonal antibody‐induced arthritis in mice: description of the disease and the influence of age, sex, and genes. Am J Pathol 163, 1827‐37.   Niissalo, S., Hukkanen, M., Imai, S., Tornwall, J. and Konttinen, Y. T. (2002). Neuropeptides in experimental and degenerative arthritis. Ann N Y Acad Sci 966, 384‐99.   O'Connor, T. M., O'Connell, J., O'Brien, D. I., Goode, T., Bredin, C. P. and Shanahan, F. (2004). The role of substance P in inflammatory disease. J Cell Physiol 201, 167‐80.   Onodera, S., Suzuki, K., Matsuno, T., Kaneda, K., Takagi, M. and Nishihira, J. (1997). Macrophage migration inhibitory factor induces phagocytosis of foreign particles by macrophages in autocrine and paracrine fashion. Immunology 92, 131‐7.   Panayi, G. S., Corrigall, V. M. and Pitzalis, C. (2001). Pathogenesis of rheumatoid arthritis. The role of T cells and other beasts. Rheum Dis Clin North Am 27, 317‐34.   Pascual, D. W. and Bost, K. L. (1990). Substance P production by P388D1 macrophages: a possible autocrine function for this neuropeptide. Immunology 71, 52‐6.   Pearson, C. M. (1956). Development of arthritis, periarthritis and periostitis in rats given adjuvants. Proc Soc Exp Biol Med 91, 95‐101.   Pernow, B. (1983). Substance P‐‐a putative mediator of antidromic vasodilation. Gen Pharmacol 14, 13‐6.   Pitzalis, C. (1993). Adhesion and migration of inflammatory cells. Clin Exp Rheumatol 11 Suppl 8, S71‐6.   Pochon, S., Graber, P., Yeager, M., Jansen, K., Bernard, A. R., Aubry, J. P. and Bonnefoy, J. Y. (1992). Demonstration of a second ligand for the low affinity receptor for immunoglobulin E (CD23) using recombinant CD23 reconstituted into fluorescent liposomes. J Exp Med 176, 389‐97.   Quinn, M. T. and Gauss, K. A. (2004). Structure and regulation of the neutrophil respiratory burst oxidase: comparison with nonphagocyte oxidases. J Leukoc Biol 76, 760‐81.   Randolph, G. J. and Furie, M. B. (1995). A soluble gradient of endogenous monocyte chemoattractant protein‐1 promotes the transendothelial migration of monocytes in vitro. J Immunol 155, 3610‐8.   Rantapaa‐Dahlqvist, S., de Jong, B. A., Berglin, E., Hallmans, G., Wadell, G., Stenlund, H., Sundin, U. and van Venrooij, W. J. (2003). Antibodies against cyclic citrullinated peptide and IgA rheumatoid factor predict the development of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 48, 2741‐9.   Remans, P. H., van Oosterhout, M., Smeets, T. J., Sanders, M., Frederiks, W. M., Reedquist, K. A., Tak, P. P., Breedveld, F. C. and van Laar, J. M. (2005). Intracellular free radical production in synovial T lymphocytes from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 52, 2003‐9.   Rieux‐Laucat, F., Fischer, A. and Deist, F. L. (2003). Cell‐death signaling and human disease. Curr Opin Immunol 15, 325‐31.   Rieux‐Laucat, F., Le Deist, F., Hivroz, C., Roberts, I. A., Debatin, K. M., Fischer, A. and de Villartay, J. P. (1995). Mutations in Fas associated with human lymphoproliferative syndrome and autoimmunity. Science 268, 1347‐9.   Robson, M. G. and Walport, M. J. (2001). Pathogenesis of systemic lupus erythematosus (SLE). Clin Exp Allergy 31, 678‐85. 

- 129 -

  Rudolphi, U., Rzepka, R., Batsford, S., Kaufmann, S. H., von der Mark, K., Peter, H. H. and Melchers, I. (1997). The B cell repertoire of patients with rheumatoid arthritis. II. Increased frequencies of IgG+ and IgA+ B cells specific for mycobacterial heat‐shock protein 60 or human type II collagen in synovial fluid and tissue. Arthritis Rheum 40, 1409‐19.   Saklatvala, J. (1986). Tumour necrosis factor alpha stimulates resorption and inhibits synthesis of proteoglycan in cartilage. Nature 322, 547‐9.   Sallfors, C., Hallberg, L. R. and Fasth, A. (2003). Gender and age differences in pain, coping and health status among children with chronic arthritis. Clin Exp Rheumatol 21, 785‐93.   Sammaritano, L. R. and Gharavi, A. E. (1992). Antiphospholipid antibody syndrome. Clin Lab Med 12, 41‐59.   Sarfati, M., Fournier, S., Wu, C. Y. and Delespesse, G. (1992). Expression, regulation and function of human Fc epsilon RII (CD23) antigen. Immunol Res 11, 260‐72.   Sato, S., Fujimoto, M., Kikuchi, K., Ihn, H., Tamaki, K. and Takehara, K. (1996). Elevated soluble CD23 levels in the sera from patients with localized scleroderma. Arch Dermatol Res 288, 74‐8.   Schellekens, G. A., de Jong, B. A., van den Hoogen, F. H., van de Putte, L. B. and van Venrooij, W. J. (1998). Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis‐specific autoantibodies. J Clin Invest 101, 273‐81.   Schifferli, J. A., Ng, Y. C. and Peters, D. K. (1986). The role of complement and its receptor in the elimination of immune complexes. N Engl J Med 315, 488‐95.   Segal, A. W. (2005). How neutrophils kill microbes. Annu Rev Immunol 23, 197‐223.   Serreze, D. V., Chapman, H. D., Varnum, D. S., Hanson, M. S., Reifsnyder, P. C., Richard, S. D., Fleming, S. A., Leiter, E. H. and Shultz, L. D. (1996). B lymphocytes are essential for the initiation of T cell‐mediated autoimmune diabetes: analysis of a new "speed congenic" stock of NOD.Ig mu null mice. J Exp Med 184, 2049‐53.   Sheerin, N. S., Springall, T., Carroll, M. C., Hartley, B. and Sacks, S. H. (1997). Protection against anti‐glomerular basement membrane (GBM)‐mediated nephritis in C3‐ and C4‐deficient mice. Clin Exp Immunol 110, 403‐9.   Shoenfeld, Y. (2003). Systemic antiphospholipid syndrome. Lupus 12, 497‐8.   Silman, A. J. (1994). Epidemiology of rheumatoid arthritis. Apmis 102, 721‐8.   Silverman, E. D., Isacovics, B., Petsche, D. and Laxer, R. M. (1993). Synovial fluid cells in juvenile arthritis: evidence of selective T cell migration to inflamed tissue. Clin Exp Immunol 91, 90‐5.   Singh, A., Blank, M., Shoenfeld, Y. and Illges, H. (2008). Antiphospholipid syndrome patients display reduced titers of soluble CD21 in their sera irrespective of circulating anti‐beta2‐glycoprotein‐I autoantibodies. Rheumatol Int.   Solomon, S., Kolb, C., Mohanty, S., Jeisy‐Walder, E., Preyer, R., Schollhorn, V. and Illges, H. (2002). Transmission of antibody‐induced arthritis is independent of complement component 4 (C4) and the complement receptors 1 and 2 (CD21/35). Eur J Immunol 32, 644‐51.   Solomon, S., Rajasekaran, N., Jeisy‐Walder, E., Snapper, S. B. and Illges, H. (2005). A crucial role for macrophages in the pathology of K/B x N serum‐induced arthritis. Eur J Immunol 35, 3064‐73.   Spooren, P. F., Vermes, I. and Soons, J. W. (1993). Similar alterations of lymphocyte subpopulations in type I and type II diabetes. Neth J Med 42, 163‐7. 

- 130 -

  Stahle‐Backdahl, M., Sandstedt, B., Bruce, K., Lindahl, A., Jimenez, M. G., Vega, J. A. and Lopez‐Otin, C. (1997). Collagenase‐3 (MMP‐13) is expressed during human fetal ossification and re‐expressed in postnatal bone remodeling and in rheumatoid arthritis. Lab Invest 76, 717‐28.   Steinlein, O. (1998). New functions for nicotinic acetylcholine receptors? Behav Brain Res 95, 31‐5.   Stetler‐Stevenson, W. G. and Yu, A. E. (2001). Proteases in invasion: matrix metalloproteinases. Semin Cancer Biol 11, 143‐52.   Straub, R. H. and Cutolo, M. (2001). Involvement of the hypothalamic‐‐pituitary‐‐adrenal/gonadal axis and the peripheral nervous system in rheumatoid arthritis: viewpoint based on a systemic pathogenetic role. Arthritis Rheum 44, 493‐507.   Stuart, J. M. and Dixon, F. J. (1983). Serum transfer of collagen‐induced arthritis in mice. J Exp Med 158, 378‐92.   Sylvestre, D. L. and Ravetch, J. V. (1996). A dominant role for mast cell Fc receptors in the Arthus reaction. Immunity 5, 387‐90.   Szakonyi, G., Guthridge, J. M., Li, D., Young, K., Holers, V. M. and Chen, X. S. (2001). Structure of complement receptor 2 in complex with its C3d ligand. In Science, vol. 292, pp. 1725‐8.   Takemura, S., Klimiuk, P. A., Braun, A., Goronzy, J. J. and Weyand, C. M. (2001). T cell activation in rheumatoid synovium is B cell dependent. J Immunol 167, 4710‐8.   Tarkowski, A., Klareskog, L., Carlsten, H., Herberts, P. and Koopman, W. J. (1989). Secretion of antibodies to types I and II collagen by synovial tissue cells in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 32, 1087‐92.   Taxt, T., Tonnesen, H. and Jansen, J. K. (1983). Neonatal treatment with 6‐OH dopamine and the elimination of polyneuronal innervation of skeletal muscle in the rat. Acta Physiol Scand 119, 293‐7.   Terato, K., Hasty, K. A., Reife, R. A., Cremer, M. A., Kang, A. H. and Stuart, J. M. (1992). Induction of arthritis with monoclonal antibodies to collagen. J Immunol 148, 2103‐8.   Thomas, R., Davis, L. S. and Lipsky, P. E. (1994). Rheumatoid synovium is enriched in mature antigen‐presenting dendritic cells. J Immunol 152, 2613‐23.   Thomas, R. and Lipsky, P. E. (1996). Could endogenous self‐peptides presented by dendritic cells initiate rheumatoid arthritis? Immunol Today 17, 559‐64.   Thornton, S., Sowders, D., Aronow, B., Witte, D. P., Brunner, H. I., Giannini, E. H. and Hirsch, R. (2002). DNA microarray analysis reveals novel gene expression profiles in collagen‐induced arthritis. Clin Immunol 105, 155‐68.   Towbin, H., Staehelin, T. and Gordon, J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A 76, 4350‐4.   Tsoukas, C. D. and Lambris, J. D. (1988). Expression of CR2/EBV receptors on human thymocytes detected by monoclonal antibodies. Eur J Immunol 18, 1299‐302.   Uitto, V. J., Airola, K., Vaalamo, M., Johansson, N., Putnins, E. E., Firth, J. D., Salonen, J., Lopez‐Otin, C., Saarialho‐Kere, U. and Kahari, V. M. (1998). Collagenase‐3 (matrix metalloproteinase‐13) expression is induced in oral mucosal epithelium during chronic inflammation. Am J Pathol 152, 1489‐99. 

- 131 -

  Vaishnaw, A. K., Orlinick, J. R., Chu, J. L., Krammer, P. H., Chao, M. V. and Elkon, K. B. (1999). The molecular basis for apoptotic defects in patients with CD95 (Fas/Apo‐1) mutations. J Clin Invest 103, 355‐63.   Van Damme, J., Proost, P., Lenaerts, J. P. and Opdenakker, G. (1992). Structural and functional identification of two human, tumor‐derived monocyte chemotactic proteins (MCP‐2 and MCP‐3) belonging to the chemokine family. J Exp Med 176, 59‐65.   van Oss, C. J., Chaudhury, M. K. and Good, R. J. (1987). Monopolar surfaces. Adv Colloid Interface Sci 28, 35‐64.   Vincenti, M. P. (2001). The matrix metalloproteinase (MMP) and tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP) genes. Transcriptional and posttranscriptional regulation, signal transduction and cell‐type‐specific expression. Methods Mol Biol 151, 121‐48.   Vincenti, M. P., Coon, C. I., Mengshol, J. A., Yocum, S., Mitchell, P. and Brinckerhoff, C. E. (1998). Cloning of the gene for interstitial collagenase‐3 (matrix metalloproteinase‐13) from rabbit synovial fibroblasts: differential expression with collagenase‐1 (matrix metalloproteinase‐1). Biochem J 331 ( Pt 1), 341‐6.   Wang, J., Zheng, L., Lobito, A., Chan, F. K., Dale, J., Sneller, M., Yao, X., Puck, J. M., Straus, S. E. and Lenardo, M. J. (1999). Inherited human Caspase 10 mutations underlie defective lymphocyte and dendritic cell apoptosis in autoimmune lymphoproliferative syndrome type II. Cell 98, 47‐58.   Wang, Y., Kristan, J., Hao, L., Lenkoski, C. S., Shen, Y. and Matis, L. A. (2000). A role for complement in antibody‐mediated inflammation: C5‐deficient DBA/1 mice are resistant to collagen‐induced arthritis. J Immunol 164, 4340‐7.   Watson, W. C., Brown, P. S., Pitcock, J. A. and Townes, A. S. (1987). Passive transfer studies with type II collagen antibody in B10.D2/old and new line and C57Bl/6 normal and beige (Chediak‐Higashi) strains: evidence of important roles for C5 and multiple inflammatory cell types in the development of erosive arthritis. Arthritis Rheum 30, 460‐5.   Wegmann, T. G., Lin, H., Guilbert, L. and Mosmann, T. R. (1993). Bidirectional cytokine interactions in the maternal‐fetal relationship: is successful pregnancy a TH2 phenomenon? Immunol Today 14, 353‐6.   Weis, J. J., Tedder, T. F. and Fearon, D. T. (1984). Identification of a 145,000 Mr membrane protein as the C3d receptor (CR2) of human B lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 81, 881‐5.   Wernicke, D., Seyfert, C., Hinzmann, B. and Gromnica‐Ihle, E. (1996). Cloning of collagenase 3 from the synovial membrane and its expression in rheumatoid arthritis and osteoarthritis. J Rheumatol 23, 590‐5.   Wilhelm, M., Silver, R. and Silverman, A. J. (2005). Central nervous system neurons acquire mast cell products via transgranulation. Eur J Neurosci 22, 2238‐48.   Winchester, R. J., Agnello, V. and Kunkel, H. G. (1970). Gamma globulin complexes in synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Partial characterization and relationship to lowered complement levels. Clin Exp Immunol 6, 689‐706.   Winyard, P. G., Moody, C. J. and Jacob, C. (2005). Oxidative activation of antioxidant defence. Trends Biochem Sci 30, 453‐61.   Wipke, B. T. and Allen, P. M. (2001). Essential role of neutrophils in the initiation and progression of a murine model of rheumatoid arthritis. J Immunol 167, 1601‐8.   Wooley, P. H., Luthra, H. S., Singh, S. K., Huse, A. R., Stuart, J. M. and David, C. S. (1984). Passive transfer of arthritis to mice by injection of human anti‐type II collagen antibody. Mayo Clin Proc 59, 737‐43. 

- 132 -

  Wordsworth, B. P., Lanchbury, J. S., Sakkas, L. I., Welsh, K. I., Panayi, G. S. and Bell, J. I. (1989). HLA‐DR4 subtype frequencies in rheumatoid arthritis indicate that DRB1 is the major susceptibility locus within the HLA class II region. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 10049‐53.   Wu, J., Wilson, J., He, J., Xiang, L., Schur, P. H. and Mountz, J. D. (1996). Fas ligand mutation in a patient with systemic lupus erythematosus and lymphoproliferative disease. J Clin Invest 98, 1107‐13.   Zachariae, C. O., Anderson, A. O., Thompson, H. L., Appella, E., Mantovani, A., Oppenheim, J. J. and Matsushima, K. (1990). Properties of monocyte chemotactic and activating factor (MCAF) purified from a human fibrosarcoma cell line. J Exp Med 171, 2177‐82.   Zvaifler, N. J., Steinman, R. M., Kaplan, G., Lau, L. L. and Rivelis, M. (1985). Identification of immunostimulatory dendritic cells in the synovial effusions of patients with rheumatoid arthritis. J Clin Invest 76, 789‐800.