ANEXO

Baos R et al. 2012. Developmental Exposure to a Toxic Spill Compromises Long-Term

Reproductive Performance in a Wild, Long-Lived Bird: The White Stork (Ciconia

ciconia). Supporting Information: Table S1. Data on reproductive parameters

from white storks (Ciconia ciconia) breeding in the study area after the

Aznalcóllar mine spill (1999-2005).

Baos R et al. 2003. Niveles de Metales Pesados y Arsénico en las Aves de Doñana y

su Entorno tras el Vertido de las Minas de Aznalcóllar. Efecto a Nivel de

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Guadiamar: Resultados del Programa de Investigación del Corredor Verde del

Guadiamar: 1998-2002. Consejería de Medio Ambiente-Junta de Andalucía

(Ed). Disponible en:

http://www.juntadeandalucia.es/medioambiente/consolidado/publicacionesdigita

les/90-513_CIENCIA_Y_RESTAURACION_DEL_RIO_GUADIAMAR/90-

513/17_NIVELES_DE_METALES_PESADOS_Y_ARSENICO_EN_LAS_AVES

_DE_DONHANA_Y_SU_ENTORNO.PDF

Baos R et al. 2002. Short-term Adaptation of Microalgae in Highly Stressful

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Eur. J. Phycol. (2002), 37 : 593–600. # 2002 British Phycological Society

DOI: 10.1017}S096702620200392X Printed in the United Kingdom

593

Short-term adaptation of microalgae in highly stressful

environments : an experimental model analysing the resistance

of Scenedesmus intermedius (Chlorophyceae) to the heavy

metals mixture from the Aznalco! llar mine spill

R. BAOS1, L. GARCI; A-VILLADA2, M. AGRELO3, V. LO; PEZ-RODAS2, F. HIRALDO1

AND E. COSTAS2

"EstacioU n BioloU gica de Donh ana, Consejo Superior de Investigaciones CientıUficas, Avd. de MarıUa Luisa s}n, PabelloU n del PeruU ,41013, Seville, Spain

#GeneU tica, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense, 28040, Madrid, Spain

$Departamento NBQ, F.N. La Maranh osa, Ministerio de Defensa, PO Box 1105, Madrid, Spain

(Received 30 August 2002; accepted 15 July 2002)

The toxic spill of acid wastes rich in heavy metals}metalloids (AWHM) from the Aznalco! llar mine in April 1998,

threatening the Don4 ana National Park, is considered to be the worst environmental disaster related to acute pollution in

Spanish history. The aim of this work was to study the adaptation of microalgae (which play an important role as primary

producers) from AWHM sensitivity to AWHM resistance by using the alga Scenedesmus intermedius as an experimental

model. The Malthusian parameter (m) and the carrying capacity (K) were reduced by mud and soil samples collected from

the affected area. A dose–effect analysis showed that fitness progressively diminished with increasing sample concentration.

A fluctuation analysis demonstrated that AWHM-resistant cells arose by rare spontaneous mutations that occurred

randomly prior to the incorporation of the AWHM. The rate of spontaneous mutation from AWHM sensitivity to AWHM

resistance was 2±12¬10−& mutants per cell division. A competition experiment between wild-type AWHM-sensitive cells and

AWHM-resistant mutants showed that in small populations the AWHM-resistant mutants are driven to extinction in the

absence of selection for AWHM resistance. The resistant phenotypes are maintained in the absence of AWHM as the result

of a balance between spontaneous mutation and natural selection, so that about 43 AWHM-resistant mutants per million

cells are present in the absence of AWHM. Our experimental model suggests that mutation is essential for adaptation of

microalgal populations to environmental changes. Rare spontaneous pre-adaptive mutation is enough to ensure the survival

of microalgal populations in contaminated environments when the population size is large enough.

Key words : adaptation, Aznalco! llar, Don4 ana National Park, microalgae, mutation, resistance, toxic spill

Introduction

Human activities are altering biosphere-level pro-

cesses and causing a biodiversity crisis (Woodruff,

2001), such as by water pollution resulting from

environmental catastrophes in rivers, marshes and

estuaries. As an example, the toxic spill of acid

wastes rich in heavy metals}metalloids (AWHM)

from the processing of pyrites at Aznalco! llar mine is

considered to be the worst environmental disaster

related to acute pollution ever recorded in Spanish

history (Grimalt et al., 1999). The Aznalco! llar mine

accident happened on April 1998 when the tailing

pond was breached, threatening the Don4 ana

National Park, one of the most important wildlife

sites for the breeding and wintering of many birds

Correspondence to: E. Costas. Fax ­34 9 3943769. e-mail

vlrodas!vet.ucm.es

including endangered ones. Approximately

4¬10' m$ of acid water and 2¬10' m$ of toxic mud

containing large amounts of Fe (34–37%), S (35–

40%), Zn (0±8%), Pb (0±8%), As (0±5%), Cu

(0±2%), Sb (0±05%), Co (0±0062%), Tl (0±005%), Bi

(0±005%), Cd (0±0025%), Ag (0±0025%), Hg

(0±0015%) and Se (0±001%) were released into the

Agrio River and then entered the Guadiamar River,

which is a major tributary of the Guadalquivir

River (Grimalt et al., 1999). The toxic spill flooded

a zone of 400 m on both sides of these rivers. A mud

layer 1±7 m thick was left around the mine. Even

40 km downstream, the mud layer was still a few

centimetres thick, and affected approximately

4500 ha of adjacent land. The polluted water con-

tinued downstream for a further 20 km.

The Don4 ana marshland is situated in the delta of

the Guadalquivir River (SW Spain). Because of its

594R. Baos et al.

international importance, 132000 ha of Don4 ana

have been protected under national, EU, or in-

ternational laws and conventions. Parts of the area

have been designated as a Ramsar Site (an in-

ternationally important wetland under the Ramsar

Convention) and Biosphere Reserve (UNESCO,

1981), and the area was inscribed as a World

Heritage Site in 1994 (Pain et al., 1998). In summary,

Don4 ana National Park harbours 803 plant and 458

animal species, 361 of which are birds, representing

70% of all European waterbird species.

The toxic spill of the Aznalco! llar mine had a great

impact on the microalgal community of Agrio,

Guadiamar and Guadalquivir rivers. The spill

caused the complete disappearance of aquatic com-

munities in the affected area, and 7 months later the

recovery of these communities was still poor (Prat et

al., 1999).

Numerous studies have shown that heavy metals

and metalloids are extremely toxic to microalgae in

both laboratory cultures and natural populations.

Microalgae are susceptible to arsenic (Blanck et al.,

1984, 1988), which has a significant effect on the

structure and physiology of the phytoplankton

community in lakes (Knauer et al., 1999). In

addition, organotin compounds have inhibitory

effects on the growth of Scenedesmus (Fargaso' va! &Kizlink, 1996). Uranium is toxic to Chlorella

(Franklin et al., 2000), mercury decreases photo-

synthetic efficiency of cyanobacteria even at micro-

molar concentrations (Lu et al., 2000), and copper

exposure has dramatic effects on algal communities

(Nor, 1987). Moreover, synergies among the com-

ponents of the heavy metals could increase the

environmental hazards.

However, it has also been reported that micro-

algae from contaminated sites appear to have

adapted to high arsenic concentrations whereas

algae from unpolluted lakes remain sensitive

(Knauer et al., 1999). Rapid adaptation of micro-

algae to environmental changes resulting from

water pollution has been demonstrated recently

(Costas et al., 2001; Lo! pez-Rodas et al., 2001).

Unfortunately, the evolution of microalgae sub-

sequent to a catastrophic environmental change is

insufficiently understood. Most of the theoretical

and experimental backgrounds to genetic mech-

anisms to adaptation have been carried out in

Mendelian populations of sexual diploid organisms

(Dobzhansky, 1955; Mayr, 1963; Lewontin, 1974;

Kimura, 1989; Spiess, 1989), whereas microalgae

are usually haploid with asexual reproduction and

form large populations of large clonal families

(Costas, 1990). Consequently, to determine whether

microalgae are able to adapt to acid wastes rich in

heavy metals is of considerable interest.

The main objectives of this work were: (i) to

explore the effects of this contamination episode on

microalgal populations and (ii) to estimate the

capability of microalgae to adapt to the toxic spill of

acidic heavy metals (AWHM) threatening the

Don4 ana National Park. We studied unialgal lab-

oratory populations of Scenedesmus intermedius

(Chlorophyceae) as an experimental model because

Scenedesmus spp. are among the most abundant

microalgal species in the affected area (Prat et al.,

1999). Furthermore, we have detected S. intermedius

in heavy-metal-contaminated tailing ponds of the

Aznalco! llar mine. We analysed: (i) the impact of

mud and soil samples collected in the affected area

on the growth and survival of S. intermedius cells,

(ii) the occurrence of AWHM-resistant (AWHMr)

cells in cultures of AWHM-sensitive (AWHMs)

cells, including the rate of transformation from

AWHM sensitivity to AWHM resistance, and the

nature of the AWHMr cells (i.e. AWHMr cells

arising by direct and specific acquired adaptation in

response to the AWHM versus AWHMr cells

arising by rare spontaneous mutations occurring

randomly prior to AWHM exposure), and (iii) the

mechanisms of maintenance of AWHMr mutants in

microalgal populations (including the fitness of

wild-type cells and AWHMr mutants in the presence

or absence of AWHM and the competitive relations

between wild-type and AWHMr cells).

Materials and methods

Experimental organisms

Haploid vegetative cells of Scenedesmus intermediusChodat (Chlorophyceae), wild-type strain Si31Mwt fromthe algal culture collection of Universidad Complutense(Madrid), were grown axenically in cell culture flasks(Greiner) with 20 ml of BG-11 medium (Sigma-Aldrich)at 20 °C with a photon irradiance of 60 µmol m−# s−"

from fluorescent tubes under continuous light. This strainwas isolated from a reservoir in Segovia (Spain). Cellswere maintained in mid-log exponential growth by serialtransfers of a cell inoculum to fresh medium once amonth. Prior to the experiments, the culture of Si31Mwtwas re-cloned (by isolating a single cell) to preventaccumulation of previous spontaneous mutants. Cultureswere maintained as axenically as possible, and onlycultures without detectable bacteria were used in theexperiments.

AWHM sample collection

Four samples collected in the area affected by the spill ofAWHM were studied: near the mine (S1), Aznalca! zar(S2), Puente de Don Simon (S3) and Cangrejo Grande(S4). One more sample, Palacio de Don4 ana (S5), locatedin an unaffected area, was used as a control site. Thesample characteristics (how the sample was affected bythe toxic spill and heavy metal}metalloid contents) aresummarized in Table 1. Following the procedure ofSimo! n et al. (1999), at all sampling points, two squareplots were laid out (25 m¬25 m). At each corner and inthe centre of the plots, samples of mud (S1 and S3) or soil

Adaptation of Scenedesmus intermedius to the AznalcoU llar mine spill 595

Table 1. Characterization of the samples from the toxic

spill at the Aznalco! llar mine

Heavy metal

concentration

(µg g−")

Samples collected in Don4 ana

S1 S2 S3 S4 S5

TM STM TM STM US

Co 36 10 35 15 10

Cu 2095 113 850 35 20

Zn 12925 353 4511 71 60

As 2998 89 1815 15 4

Cd 39 1 20 0 0

Sb 245 5 39 1 1

Tl 49 2 25 1 1

Pb 7661 252 5632 44 33

TM, toxic mud; STM, soil affected by toxic mud; STW, soil

affected by toxic water ; US, unaffected soil. The results are

expressed in dry weight.

at 0–10 cm depth (S2, S4 and S5) were taken. All sampleswere dried and screened (2 mm screen size). Next, 250 gof each sample category from the five sampling points perplot were mixed and homogenized, stored in plasticcontainers or polyethylene bags until analysis. S1 and S3were taken in May}June 1998 (approximately 1 monthafter the toxic spill), S2 and S4 in October}November1998, after the first cleaning activities, and S5 wascollected in March 1999.

A two-step bulk sample digestion method, in Teflonreactors, was used for heavy metal analysis of mud andsoils (S1–S5). This method was devised by Querol et al.(1996). Solutions obtained from the digestion of sampleswere analysed by inductively coupled plasma massspectrometry (ICP-MS). The accuracy of the analysis waschecked against certified reference materials (SO-4Canadian Certified Reference Materials Projects) andwas expressed with a coefficient of variation of ! 10%.Analytical precision, expressed as the relative standarddeviation, ranged between 3% and 10% for all theelements studied.

Effect of AWHM

The effect of four different AWHM samples (S1, S2, S3,S4) on algal cells was analysed as follows: A stocksolution was prepared by mixing 20 ml of each AWHMsample and 200 ml of BG-11 medium (Sigma-Aldrich) for18 h under continuous agitation; after 6 h decanting, thesolution was filtered through 0±22 µm filters (Millipore) tomake it axenic. Each stock solution was inoculated with10&³10$ cells from mid-log exponentially growingcultures. The control cultures contained S5, and S0samples contained only BG-11 medium.

The effect of the different samples (S0–S5) was esti-mated by calculating the fitness under conditions of r andK selection of triplicates of each AWHM sample andcontrols as previously described (Lo! pez-Rodas et al.,2001). In short, fitness under conditions of r selection inan uncrowded environment was estimated as theMalthusian parameter (m), in mid-log exponentiallygrowing acclimated cultures, as : N

t¯N

!emt, where N

t

and N!are the cell numbers at time t and 0 respectively.

Fitness under conditions of K selection in a crowded

environment was determined as the carrying capacity(K), estimated as the maximal cell density reached by theculture in saturated phase (about 22–24 days). Experi-ments and controls were counted blind (i.e. the personcounting the test did not know the identity of the testedsample), using a haemocytometer, by at least two in-dependent persons. The number of samples in each casewas determined using the progressive mean procedure(Williams, 1977), which assured a counting error of³1%.

In addition, a dose–effect study was performed simi-larly using 1}1000, 1}100 and 1}10 dilutions of stocksolution from S1.

Analysis of transformation from AWHM sensitivity toAWHM resistance

A Luria–Delbru$ ck fluctuation analysis was used toinvestigate the nature of the transformation fromAWHM sensitivity to AWHM resistance (i.e. to dis-tinguish between AWHMr cells arising by rare spon-taneous pre-adaptive mutations occurring randomly dur-ing replication of organisms prior to the incorporation ofAWHM and AWHMr cells arising through physiologicalor specifically acquired post-selective adaptation in re-sponse to AWHM) and, subsequently, to estimate therate of occurrence of AWHMr cells. Since Luria &Delbru$ ck (1943) introduced fluctuation analysis forbacteria as a combined experimental and statisticalprocedure based on the variation in the occurrence ofresistant variants, subsequent theoretical and experimen-tal studies have modified the fluctuation test to be usedwith organisms from bacteria to human cells (Cole et al.,1976; Kendall & Frost, 1988; Tlsty et al., 1989; Jones etal., 1994; Rossman et al., 1995; Asteris & Sarkar, 1996;Crane et al., 1996). Recently, Lo! pez-Rodas et al. (2001)have further modified the Luria–Delbru$ ck fluctuationanalysis to be used with microalgae: plating is replaced bythe addition of liquid medium containing the selectiveagent.

In the first set of experiments, C¯ 100 parallel culturetubes were inoculated with N

!E 10# Si31Mwt cells (a

number small enough to ensure that no pre-existingmutants are present), and grown axenically as identicallyas possible under non-selective conditions. At the end ofthe growing period (when each culture reached a con-venient number of cells, N

tE 5±1¬10%), the cells were

transferred to selective liquid medium containingS3 sample at 1}10 concentration. For the second set ofexperiments, 50 aliquots of approximately 5±2¬10% cellsfrom the same parental population were separatelytransferred to tubes containing the same selective mediumas set 1.

Acid wastes rich in heavy metals}metalloids killed thewild-type AWHMs cells but allowed the growth ofAWHMr cells. Liquid cultures were monitored using aZeiss Axiovert inverted microscope. After the cells weredetected in liquid cultures, they were counted blind usingsettling chambers by at least three independent persons.Cultures were monitored over at least 60 days (therebyensuring that a single mutant cell could establish a denseculture).

The proportion of cultures showing no mutant coloniesafter plating in the first set of experiments (P

!estimator)

was used to calculate the mutation rate as follows: P!¯

e−µ(Nt−N!) (Luria & Delbru$ ck, 1943; Griffiths et al., 1996),

596R. Baos et al.

where P!is the proportion of cultures showing no mutant

colonies after plating, (Nt®N

!) is the number of cell

divisions, and µ is the mutation rate.

Characterization of AWHM-resistant mutants

Fitness of five randomly isolated (from different cultures)AWHMr mutants and wild-type AWHMs cells wascharacterized under conditions of r and K selection inBG-11 medium without AWHM as well as in mediumcontaining 1}10 and 1}100 S3 sample}medium. Theexperiments were carried out just as in the dose–effectstudy.

Competition between wild-type and AWHM-resistantmutants

A competition experiment between wild-type cells andAWHMr mutants was carried out as previously described(Costas et al., 1998). Five replicates of mixed cultureswere established by mixing 10& AWHMr mutants and 10&

AWHMs wild-type cells. The cultures were maintainedby adding 562 µl of the culture and 2438 µl of fresh BG-11 medium (without AWHM) once a week. The objectivewas to attain about 3±5 days of exponential growth(competition under r selection) and about 3±5 days ofsaturation (competition under K selection). Samples fromeach replicate were grown in 1}10 AWHM}BG-11mediumonce aweek to check for the presence of AWHMr

mutants.

Results

Fitness under conditions of r and K selection of

wild-type microalgae was significantly diminished

( p! 0±05, Kruskal–Wallis H-tests) by S2 and S4,

and dramatically reduced by S1, with respect to S0

and S5 controls (Fig. 1). When microalgal cultures

were treated with S3, most cells died in less than 5

fitness (r selection)

fitness (K selection)

1

0

S0 S5 S2 S4 S1 S3

Samples

Fitn

ess

Fig. 1. Relative fitness under conditions of r and K

selection of Scenedesmus intermedius wild-type cells as

affected by the same dose of different AWHM samples

(S1–S5). Relative fitness is represented as a fraction of

untreated controls (mean³SD).

fitness (r selection)

fitness (K selection)

1

00·000 0·001 0·01 0·1

Dose

Fitn

ess

Fig. 2. Relative fitness under conditions of r and K

selection of Scenedesmus intermedius wild-type cells as

affected by different doses of AWHM (S1). Relative fitness

is represented as a fraction of untreated controls

(mean³SD).

Table 2. Fluctuation analysis of the occurrence of

AWHM-resistant variants in Scenedesmus intermedius

strain Si31Mwt

Set 1 Set 2

No. of replicate cultures 100 50

No. of cultures containing the following

no. of AWHM resistant cells ml−" :

0 34

! 1000 35

1000–10000 22 48

" 10000 9 3

Variance}mean (of the no. of AWHM-

resistant cells per replicate)

" 100 1±2

Mutation rate (mutants per cell division) 2±12¬10−&

days; there were no living cells after 7 days, and the

Malthusian parameter was m¯ 0.

A dose–effect analysis using the S1 sample shows

that the maximal cell density reached by the culture

in the saturated phase (carrying capacity, K) was

severely diminished even by concentrations as low

as 1}1000 S1 sample}medium (Fig. 2). As expected,

fitness under conditions of r selection of wild-type

cells was also progressively diminished with in-

creasing S1 concentration.

A fluctuation analysis was carried out to study the

spontaneous occurrence of AWHMr variants in

cultures of AWHMs cells. Our first aim was to

determine the nature of the resistance of the

AWHMr cells. The data presented in Table 2 show

that the low variation in set 2 experiments indicates

that any large fluctuations in set 1 must be due to

processes other than sampling error. In the set 1

experiment the variance significantly exceeded the

Adaptation of Scenedesmus intermedius to the AznalcoU llar mine spill 597

Table 3. Relative fitness under conditions of r and K selection of S. intermedius wild-type cells (strain Si31Mwt) and

AWHM-resistant mutants in medium with and without AWHM (sample S3)

Fitness under

AWHM concentration (v}v)

0 1}100 1}10

Wild-type

Resistant

mutant Wild-type

Resistant

mutant Wild-type

Resistant

mutant

r selection 1³0±07 0±51³0±07 0±96³0±19 0±53³0±11 0 0±31³0±16

K selection 1³0±17 0±56³0±15 0±53³0±15 0±53³0±09 0 0±38³0±19

Values are mean³SD.

Table 4. Presence of AWHM-resistant cells in mixed

cultures (50% AWHM-resistant, 50% AWHM-sensitive

wild-type) evaluated at 1 week intervals under competition

Weeks under competition

1 2 3 4

Replicate :

I ­ ­ ­ ®II ­ ® ® ®III ­ ® ® ®IV ­ ­ ® ®V ­ ­ ® ®

Controls :

Wild-type ® ® ® ®AWHMr mutants ­ ­ ­ ­

­ indicates ability to grow in liquid medium containing AWHM.

Controls were pure cultures of wild-type and AWHM-resistant

cells respectively.

mean (variance}mean" 100; p! 0±05 Pre! scese!nyi

test – Mayr, 1963) indicating that : (i) AWHMr

variants arose by rare spontaneous mutation, and

not through direct and specific acquired adaptation

in response to an environmental selection, and (ii)

AWHM is not facilitating the occurrence of

AWHMr cells. In addition, transmission of AWHM

resistance through successive generations has been

examined by ascertaining the maintenance of the

AWHMr phenotype (in five replicates of AWHM-

resistant mutants) for 45 generations of serial

subculture in the absence of the selecting AWHM.

Our second aim was to estimate the rate of

mutation from AWHM sensitivity to AWHM

resistance. Spontaneous mutation rate (µ)

AWHMsensitivity!AWHMresistance (using the P!

estimator) was 2±12¬10−&. This mutation rate was

estimated with high standards of reliability, repro-

ducibility and precision (Table 2).

Fitness under conditions of r and K selection of

AWHMr mutants was estimated in the absence and

in the presence of two different AWHM concen-

trations (Table 3), in an attempt to characterize the

population behaviour of AWHMr mutants. An

important reduction in both the Malthusian par-

ameter and the carrying capacity of AWHMr

mutants with respect to the wild-type cells was

observed in the absence ofAWHM (S3). In contrast,

when both kinds of cells were grown in the presence

of 1}10 AWHM (S3)}medium, only the AWHMr

mutants were able to grow.

The results of the competition experiment be-

tween AWHMr mutants and wild-type cells show a

quick displacement of the AWHMr mutants by the

wild-type sensitive phenotype (Table 4). After only

4 weeks of competitive interaction in the absence of

AWHM, the AWHMr phenotype was driven to

extinction by the wild-type.

Discussion

We are working on an insufficiently studied aspect

of evolution: the adaptation of microalgae sub-

sequent to a catastrophic environmental change. It

is known that low doses of a heavy metal (even in

the micromolar range) dramatically reduce the

growth and photosynthesis of microalgae from

cyanobacteria to Chlorophyceae (Knauer et al.,

1999; Franklin et al., 2000; Lu et al., 2000).

Complex interactions and synergies have been

revealed when several metals and other substances

act simultaneously. In addition, physical par-

ameters modify the toxicity of heavy metals. As an

example, the toxicity of uranium and copper is

highly pH-dependent (Franklin et al., 2000). Conse-

quently, we used the AWHM samples themselves in

an attempt to develop an experimental model as

close to reality as possible.

AWHM collected from different sites of the

Don4 ana area were differentially toxic to

Scenedesmus intermedius in relation to their heavy

metal concentration. Mud samples, S1 and S3, were

maximally toxic to S. intermedius as well as having

the highest concentrations of heavy metals and As,

whereas the soil AWHM samples S4 and S2 showed

the lowest toxicity. S5, collected in a pristine

control site, did not exhibit any toxic effect on the

experimental organisms. As expected, the fitness

598R. Baos et al.

of S. intermedius progressively decreased with

increasing concentrations of AWHM, but concen-

trations as low as 1}1000 AWHM}medium severely

diminished the cell density reached by the culture

in the saturated phase, and concentrations of

1}100 severely diminished cell growth, whereas

1}10 concentrations caused massive destruction of

algal cells.

In areas close to the mine, where the mud

thickness was greatest, the concentration of heavy

metals was probably similar to or even exceeded

those we assayed experimentally in this study

(Simo! n et al., 1999). Our soil AWHM samples were

collected 6 months after the spill, when sludge

removal was being carried out in some places, and,

in spite of that, we could see effects on cell growth.

All these factors suggest that there must have been

a massive destruction of algal populations and,

therefore, a heavy decrease in productivity through-

out the whole river ecosystem. Indeed, in situ studies

carried out 7 months after the toxic spill showed

that the recovery of the aquatic communities was

still poor (Prat et al., 1999).

After establishing that AWHM samples were

toxic to algal cells, our main aim was to study the

adaptation of microalgae under comparable con-

ditions to those occurring in situ. We therefore

treated S. intermedius laboratory cultures with

lethal concentrations of samples collected from the

affected area (AWHM samples). It is well estab-

lished that algal populations can respond to the

chronic presence of a chemical by the development

of resistance. Communities established under ar-

senate stress in laboratory experiments are more

tolerant to arsenate than communities grown at

background levels of arsenate (Blanck et al., 1988).

In addition, increased tolerance to a pollutant could

be interpreted as evidence of a chemical impact at

the community level (Blanck, 1984).

When a microalgal culture was treated with the

S3 sample, the culture became clear after some days

due to destruction of the sensitive cells by the

sample. However, after further incubation for a few

days, the culture sometimes increased in density

again, due to growth of an algal variant that was

resistant to the action of the S3 sample. The key to

understanding the adaptation of microalgae to

AWHM-contaminated environments could be

analysis of this algal variant.

The main aim of the present study was to

distinguish between AWHMr cells arising by rare

spontaneous mutations occurring randomly during

replication of organisms in non-selective conditions

(i.e. prior to addition of the AWHM) and AWHMr

cells arising through specifically acquired adap-

tation in response to environmental selection (i.e.

through physiological adaptation after incor-

porating the AWHM). Although it has long been

assumed that only pre-adaptive spontaneous

mutations occur, Cairns et al. (1988) and Hall

(1988) have proven the occurrence of adaptive

mutation. This is a process that, during selection,

produces mutations that relieve the selective press-

ure whether or not other, non-selected mutations

are also produced. Adaptive mutations and other

related phenomena have been reported in bacteria

and yeast, but not in other microorganisms, and

it is conceivable that adaptive mutation plays an

important role in evolution of microorganisms

(Foster, 2000).

Luria–Delbru$ ck fluctuation analysis is an ap-

propriate procedure to discriminate between pre-

selective and post-selective mutations (Luria &

Delbru$ ck, 1943; Lea & Coulson, 1949; Cole et al.,

1976; Cairns et al., 1988; Tlsty et al., 1989;

Dijkmans et al., 1994). It has been used widely in

Chlamydomonas to distinguish between spon-

taneous and induced streptomycin-resistant

mutants (Gillham & Levine, 1962) ; to analyse N-

methyl-N «-nitro-N-nitrosoguanidine- and 5-fluoro-

deoxyuridine-induced mutations (Gillham, 1965;

Wurtz et al., 1979) ; and to characterize the occur-

rence of cadmium-resistant mutants (Collard &

Matage, 1990). Recently, fluctuation analysis has

been used for studying adaptation from herbicide

sensitivity to herbicide resistance in microalgae

and for estimating mutation rates (Costas et al.,

2001; Lo! pez-Rodas et al., 2001). Here, fluctuation

analysis unequivocally demonstrated that the S3

AWHM sample was not inducing AWHMr cells,

but that AWHM resistance occurred by rare spon-

taneous mutation prior to addition of AWHM.

The observed heritability of the AWHMr pheno-

type over several generations of serial subculture in

the absence of the selecting agent also suggests that

AWHM resistance is attributable to mutant geno-

types.

On the other hand, calculation of mutation rates

of AWHM sensitivity to AWHM resistance is not a

trivial question because our experimental model

suggests that, as AWHM was lethal to most wild-

type strains, only spontaneously arising AWHMr

mutants would be able to survive in such environ-

ments. Consequently, mutation rates offer insights

into the evolutionary capabilities of microalgal

populations in AWHM-contaminated environ-

ments. The mutation rate was 2±12¬10−& AWHMr

cells per cell division. It has been theoretically and

experimentally demonstrated that P!-based esti-

mation is very useful (Li & Chu, 1987; Mandelbrot,

1974). Although rates of spontaneous mutation to

resistance to water pollution have not been

measured in other microalgae, our rates are higher

than those for antibiotic resistance and for herbicide

resistance in microalgae (Sager, 1985; Lo! pez-Rodas

et al., 2001), and similar to that generating bleached

Adaptation of Scenedesmus intermedius to the AznalcoU llar mine spill 599

mutants in Euglena (Nicolas et al., 1962). Such

mutation rates, coupled with rapid growth rates, are

presumably high enough to ensure the adaptation

of microalgae to water contamination.

In contrast to molecular evolution (which is a

continuous process that often occurs over long

periods of time at a nearly constant rate, even if

there are variations in rate among lineages), or to

phenotypic evolution (which is perceived as a highly

irregular process with long periods of stasis in-

terrupted by short bursts of change) (Gould &

Eldredge, 1977), adaptation of algal populations to

modern pollution-derived environmental hazards

seems to be the result of a rare instantaneous event.

Adaptation of microalgae to environments with

modern contamination (such as herbicides or 2,4,6-

trinitrotoluene) by this type of rare instantaneous

event has been demonstrated recently (Costas et al.,

2001; Lo! pez-Rodas et al., 2001). Mutation seems to

be essential in understanding how algal populations

adapt to contaminated environments. Organisms

may possess the ability to regulate their mutation

rate in response to environmental conditions

(Kepler & Perelson, 1995), and differential mutation

rates across genes may be adaptations (Maley,

1997). The competitive ability of clonal cultures of

microalgae growing asexually is improved by selec-

tion acting on new genetic variation that has arisen

by mutation (Costas et al., 1998). What is more, in

asexual organisms, adaptation is fastest when the

rate of mutation equals the harmonic mean of

selection coefficients of mutants (Allen-Orrh, 2000).

Since algicide resistance presumably occurs by

random rare mutations before microalgae come

into contact with the algicide, the mechanism of

maintenance of the resistant mutants in natural

populations is a central problem for ecological

genetic studies ofmicroalgae. TheAWHMr mutants

exhibited a diminished fitness that limited their

survival in natural populations in the absence of

AWHM, so that in small populations, the AWHMr

mutants are driven to extinction by competition.

However, recurrent mutation occurs from a normal

wild-type allele to an AWHM-resistant allele that is

detrimental in fitness in the absence of the AWHM

contamination. New resistant mutants arise in each

generation, but most of these mutants are

eliminated sooner or later by natural selection, if

not by chance (Spiess, 1989). At any one time there

will be a certain number of AWHMr mutants as the

result of balance between new resistant cells arising

from spontaneous mutation and resistant cells

eliminated by natural selection. The average num-

ber of such mutants will be determined by the

balance of the mutation rate and the rate of selective

elimination as: µ(1®q)¯ q(1®s), where µ is the

mutation rate, q is the allele frequency of the mutant

and s is the selection coefficient of the mutant (Crow

& Kimura, 1970; Spiess, 1989). In our case, after

estimating the mutation rate as µ¯ 2±12¬10−& and

the selection coefficient as s¯ 0±49, the average

number of AWHMr mutants in the absence of the

AWHM is about 43 mutants per million cells.

In conclusion, and employing ‘Occam’s razor’,

spontaneous pre-selective mutants (as ‘hopeful

monsters ’) are enough to ensure the adaptation of

the enormous natural populations of microalga to

catastrophic environmental changes, as well as to

antibiotics, herbicides and 2,4,6-trinitrotoluene

(Costas et al., 2001; Lo! pez-Rodas et al., 2001).

However, contaminant-resistant phenotypes show

reduced growth and saturation density. Conse-

quently, although microalgal populations are able

to survive events such as an AWHM spill, important

ecological parameters (such as primary production

and biomass) could be severely diminished.

Acknowledgements

This work was supported by Spanish DGES PB96-

0576-C03-01 and DGI REN2000-0771 HID. We

thank Drs Javier Juste and Luis Ferrero, and Elena

Carrillo for help and advice. We are grateful to the

two anonymous referees for helpful comments on

the manuscript.

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1

Table S1. Data on reproductive parameters from white storks (Ciconia ciconia) breeding in the study area after the Aznalcóllar mine spill (1999-2005). Bird code identifies individuals. Sex: 1= males, 2= females. Age in years. Group: 0= hatched before the spill, 1= hatched after the spill. * The exact number of eggs laid could be not determined.

Bird code Sex Cohort Year of breeding

Age Group # eggs # fledglings

CC102 1 1992 1999 7 0 * 4

CC146 1 1993 1999 6 0 2 0

CC146 1 1993 2000 7 0 3 0

CC147 1 1993 1999 6 0 4 3

CC147 1 1993 2000 7 0 4 2

CC153 1 1994 1999 5 0 4 2

CC153 1 1994 2000 6 0 * 0

CC153 1 1994 2001 7 0 3 3

CC154 1 1994 2001 7 0 * 4

CC157 1 1994 2001 7 0 5 2

CC196 1 1994 1999 5 0 3 2

CC196 1 1994 2000 6 0 4 0

CC196 1 1994 2001 7 0 4 1

CC227 1 1997 2003 6 0 4 3

CC227 1 1997 2004 7 0 4 0

CC290 1 1997 2000 3 0 * 3

CC290 1 1997 2001 4 0 3 2

CC290 1 1997 2002 5 0 3 2

CC290 1 1997 2003 6 0 4 3

CC290 1 1997 2004 7 0 4 2

CC299 1 1997 2000 3 0 4 2

CC299 1 1997 2001 4 0 4 4

CC299 1 1997 2002 5 0 4 3

CC300 1 1997 2002 5 0 4 0

CC300 1 1997 2003 6 0 4 0

CC301 1 1997 2002 5 0 3 0

CC302 1 1997 2000 3 0 4 0

CC302 1 1997 2001 4 0 4 3

CC302 1 1997 2002 5 0 3 0

CC302 1 1997 2004 7 0 4 3

CC309 1 1997 2000 3 0 * 2

CC309 1 1997 2001 4 0 * 1

CC309 1 1997 2002 5 0 3 *

CC309 1 1997 2004 7 0 4 2

CC109 1 2000 2004 4 1 5 0

CC109 1 2000 2005 5 1 4 0

CC116 1 2000 2003 3 1 5 0

CC116 1 2000 2004 4 1 3 2

CC116 1 2001 2005 4 1 4 1

CC119 1 2002 2005 3 1 4 1

CC12 1 1998 2003 5 1 4 0

CC12 1 1998 2004 6 1 4 2

CC12 1 1998 2005 7 1 4 1

CC120 1 2000 2003 3 1 4 0

CC125 1 2000 2003 3 1 1 0

CC127 1 2000 2004 4 1 3 2

2

Bird code Sex Cohort Year of breeding

Age Group # eggs # fledglings

CC13 1 1998 2002 4 1 3 0

CC13 1 1998 2004 6 1 4 3

CC13 1 1998 2005 7 1 3 0

CC131 1 2000 2003 3 1 3 2

CC131 1 2000 2004 4 1 3 1

CC131 1 2000 2005 5 1 3 0

CC132 1 2000 2005 5 1 4 0

CC134 1 2000 2003 3 1 3 2

CC134 1 2000 2004 4 1 4 0

CC137 1 2002 2005 3 1 1 0

CC14 1 1999 2002 3 1 4 2

CC14 1 1999 2004 5 1 3 3

CC159 1 2001 2004 3 1 * 1

CC159 1 2001 2005 4 1 3 2

CC16 1 1999 2002 3 1 4 1

CC160 1 2001 2004 3 1 4 0

CC160 1 2001 2005 4 1 4 0

CC161 1 2001 2005 4 1 2 2

CC162 1 2001 2004 3 1 5 *

CC162 1 2001 2005 4 1 3 0

CC163 1 2001 2004 3 1 3 3

CC163 1 2001 2005 4 1 1 0

CC168 1 2001 2004 3 1 4 2

CC171 1 2001 2004 3 1 4 2

CC171 1 2001 2005 4 1 5 0

CC173 1 2002 2005 3 1 2 0

CC175 1 2001 2004 3 1 1 1

CC175 1 2001 2005 4 1 4 0

CC180 1 2001 2005 4 1 4 0

CC236 1 2002 2005 3 1 4 0

CC237 1 2002 2005 3 1 2 1

CC243 1 2002 2005 3 1 4 2

CC246 1 2002 2005 3 1 3 0

CC325 1 1998 2003 5 1 * 2

CC325 1 1998 2004 6 1 2 2

CC325 1 1998 2005 7 1 2 1

CC326 1 1998 2001 3 1 3 2

CC326 1 1998 2002 4 1 3 *

CC326 1 1998 2004 6 1 4 2

CC326 1 1998 2005 7 1 4 1

CC33 1 1999 2002 3 1 4 2

CC330 1 1998 2002 4 1 4 3

CC330 1 1998 2004 6 1 5 3

CC330 1 1998 2005 7 1 4 0

CC331 1 1998 2004 6 1 4 2

CC331 1 1998 2005 7 1 4 0

CC334 1 1998 2004 6 1 3 2

CC334 1 1998 2005 7 1 4 0

CC336 1 1998 2001 3 1 4 2

CC336 1 1998 2002 4 1 4 1

CC336 1 1998 2003 5 1 1 0

CC336 1 1998 2004 6 1 4 3

CC336 1 1998 2005 7 1 5 0

3

Bird code Sex Cohort Year of breeding

Age Group # eggs # fledglings

CC337 1 1998 2004 6 1 5 2

CC338 1 1998 2002 4 1 * 0

CC338 1 1998 2003 5 1 4 4

CC339 1 1998 2002 4 1 3 *

CC339 1 1998 2003 5 1 * 2

CC36 1 1999 2004 5 1 4 2

CC36 1 1999 2005 6 1 4 2

CC37 1 1999 2004 5 1 3 2

CC37 1 1999 2005 6 1 4 2

CC38 1 1999 2003 4 1 4 0

CC41 1 1999 2002 3 1 4 0

CC42 1 1999 2002 3 1 4 2

CC42 1 1999 2005 6 1 2 0

CC44 1 1999 2003 4 1 * 3

CC44 1 1999 2004 5 1 3 *

CC44 1 1999 2005 6 1 4 3

CC46 1 1999 2003 4 1 5 3

CC46 1 1999 2004 5 1 4 2

CC46 1 1999 2005 6 1 4 2

CC48 1 1999 2003 4 1 4 2

CC48 1 1999 2004 5 1 3 2

CC48 1 1999 2005 6 1 4 0

CC49 1 1999 2002 3 1 4 2

CC49 1 1999 2003 4 1 4 0

CC49 1 1999 2005 6 1 4 3

CC58 1 1999 2002 3 1 1 1

CC58 1 1999 2003 4 1 4 3

CC58 1 1999 2004 5 1 3 2

CC58 1 1999 2005 6 1 4 2

CC59 1 1999 2004 5 1 2 0

CC6 1 1998 2002 4 1 4 1

CC6 1 1998 2004 6 1 4 2

CC6 1 1998 2005 7 1 4 2

CC60 1 1999 2002 3 1 4 *

CC61 1 1999 2002 3 1 3 0

CC65 1 1999 2002 3 1 4 *

CC66 1 1999 2003 4 1 4 3

CC9 1 1998 2001 3 1 5 3

CC92 1 2000 2003 3 1 2 0

CC94 1 2000 2003 3 1 3 3

CC94 1 2000 2004 4 1 4 *

CC94 1 2000 2005 5 1 5 0

CC96 1 2000 2004 4 1 4 2

CC96 1 2000 2005 5 1 4 2

CC98 1 2000 2003 3 1 4 2

CC98 1 2000 2004 4 1 4 3

CC98 1 2000 2005 5 1 4 1

CC104 2 1992 1999 7 0 4 2

CC145 2 1992 1999 7 0 3 2

CC148 2 1993 1999 6 0 * 2

CC148 2 1993 2000 7 0 4 1

CC229 2 1997 2000 3 0 2 0

CC231 2 1997 2000 3 0 4 0

4

Bird code Sex Cohort Year of breeding

Age Group # eggs # fledglings

CC283 2 1997 2000 3 0 2 2

CC289 2 1997 2000 3 0 3 0

CC294 2 1997 2000 3 0 3 2

CC305 2 1997 2000 3 0 3 0

CC308 2 1997 2000 3 0 3 0

CC310 2 1997 2000 3 0 4 0

CC212 2 1994 2001 7 0 3 3

CC283 2 1997 2001 4 0 * 1

CC289 2 1997 2001 4 0 4 3

CC294 2 1997 2001 4 0 4 1

CC308 2 1997 2001 4 0 * 3

CC310 2 1997 2001 4 0 4 0

CC229 2 1997 2002 5 0 5 0

CC231 2 1997 2002 5 0 4 3

CC283 2 1997 2002 5 0 3 2

CC289 2 1997 2002 5 0 3 0

CC308 2 1997 2002 5 0 3 2

CC310 2 1997 2002 5 0 4 3

CC229 2 1997 2003 6 0 1 0

CC231 2 1997 2003 6 0 2 0

CC305 2 1997 2003 6 0 2 1

CC306 2 1997 2003 6 0 4 3

CC308 2 1997 2003 6 0 4 3

CC310 2 1997 2003 6 0 4 0

CC229 2 1997 2004 7 0 1 0

CC289 2 1997 2004 7 0 4 3

CC305 2 1997 2004 7 0 3 2

CC306 2 1997 2004 7 0 4 0

CC308 2 1997 2004 7 0 2 0

CC320 2 1998 2001 3 1 4 1

CC321 2 1998 2001 3 1 5 2

CC7 2 1998 2001 3 1 4 4

CC10 2 1998 2002 4 1 5 0

CC320 2 1998 2002 4 1 4 0

CC321 2 1998 2002 4 1 * 0

CC329 2 1998 2002 4 1 4 0

CC47 2 1999 2002 3 1 2 1

CC52 2 1999 2002 3 1 4 2

CC53 2 1999 2002 3 1 1 0

CC56 2 1999 2002 3 1 1 1

CC57 2 1999 2002 3 1 4 *

CC64 2 1999 2002 3 1 4 2

CC68 2 1999 2002 3 1 * 3

CC8 2 1998 2002 4 1 3 0

CC110 2 2000 2003 3 1 2 2

CC112 2 2000 2003 3 1 4 0

CC123 2 2000 2003 3 1 4 0

CC133 2 2000 2003 3 1 4 2

CC135 2 2000 2003 3 1 3 0

CC15 2 1999 2003 4 1 4 3

CC321 2 1998 2003 5 1 3 0

CC323 2 1998 2003 5 1 3 0

CC333 2 1998 2003 5 1 3 0

5

Bird code Sex Cohort Year of breeding

Age Group # eggs # fledglings

CC34 2 1999 2003 4 1 4 2

CC39 2 1999 2003 4 1 3 2

CC47 2 1999 2003 4 1 3 3

CC50 2 1999 2003 4 1 5 3

CC56 2 1999 2003 4 1 4 3

CC62 2 1999 2003 4 1 4 3

CC64 2 1999 2003 4 1 4 0

CC121 2 2000 2004 4 1 4 2

CC124 2 2000 2004 4 1 3 1

CC126 2 2000 2004 4 1 4 2

CC128 2 2000 2004 4 1 5 0

CC130 2 2000 2004 4 1 4 0

CC133 2 2000 2004 4 1 4 0

CC15 2 1999 2004 5 1 3 2

CC170 2 2001 2004 3 1 4 *

CC174 2 2001 2004 3 1 4 4

CC179 2 2001 2004 3 1 4 2

CC319 2 1998 2004 6 1 4 2

CC328 2 1998 2004 6 1 4 2

CC333 2 1998 2004 6 1 4 0

CC39 2 1999 2004 5 1 3 0

CC43 2 1999 2004 5 1 3 2

CC47 2 1999 2004 5 1 4 *

CC50 2 1999 2004 5 1 4 2

CC56 2 1999 2004 5 1 5 3

CC62 2 1999 2004 5 1 4 3

CC64 2 1999 2004 5 1 4 0

CC68 2 1999 2004 5 1 4 0

CC121 2 2000 2005 5 1 4 2

CC124 2 2000 2005 5 1 3 0

CC126 2 2000 2005 5 1 4 0

CC128 2 2000 2005 5 1 4 0

CC130 2 2000 2005 5 1 3 1

CC133 2 2000 2005 5 1 4 0

CC139 2 2002 2005 3 1 2 0

CC15 2 1999 2005 6 1 4 2

CC158 2 2001 2005 4 1 4 0

CC166 2 2001 2005 4 1 4 0

CC170 2 2001 2005 4 1 4 2

CC172 2 2001 2005 4 1 2 1

CC174 2 2001 2005 4 1 4 2

CC179 2 2001 2005 4 1 5 0

CC186 2 2001 2005 4 1 4 3

CC251 2 2002 2005 3 1 4 1

CC319 2 1998 2005 7 1 4 2

CC333 2 1998 2005 7 1 4 0

CC34 2 1999 2005 6 1 3 0

CC39 2 1999 2005 6 1 4 1

CC43 2 1999 2005 6 1 4 0

CC47 2 1999 2005 6 1 5 0

CC50 2 1999 2005 6 1 4 2

CC56 2 1999 2005 6 1 4 0

CC62 2 1999 2005 6 1 4 1

6

Bird code Sex Cohort Year of breeding

Age Group # eggs # fledglings

CC68 2 1999 2005 6 1 4 0

CC91 2 2000 2005 5 1 4 3

PROGRAMA DE FORMACIÓN Y ESPECIALIZACIÓN EN LÍNEAS DE

INVESTIGACIÓN DE INTERÉS PARA EL SECTOR INDUSTRIAL.

BECA DE POSTGRADO convocatoria B.O.E. 29/08/02

INFORME

Becaria: Raquel Baos Sendarrubias

Centro: Estación Biológica de Doñana

VºBº Director del trabajo:

Fdo: Fernando Hiraldo

1

ESTRÉS AMBIENTAL EN POBLACIONES DE AVES SILVESTRES.

SISTEMA INMUNE Y CONSERVACIÓN

INTRODUCCIÓN En la actualidad los conocimientos sobre inmunología en aves se derivan casi exclusivamente de

los estudios llevados a cabo en especies domésticas. No obstante, desde hace algún tiempo, los métodos empleados para estimar la respuesta inmune se han convertido en una valiosa herramienta dentro de la toxicología, ecología e incluso en los estudios de comportamiento en poblaciones de aves silvestres 1, 7. Variables relacionadas con el sistema inmune, como el conteo total o diferencial de leucocitos, la producción de anticuerpos en respuesta a células sanguíneas de cordero (SRBC) y la respuesta a la inyección de fitohemaglutinina (PHA skin test) se hallan entre las más comúnmente utilizadas 3,10. Sin embargo, no todas estas medidas proporcionan la misma información en relación al impacto que sobre el sistema inmune provoca la exposición a patógenos, contaminantes o cualquier otra perturbación ecológica a la que se hallen sometidos los individuos.

Entre los contaminantes, los metales pesados han demostrado ser potentes inmunotóxicos. La rotura de la balsa minera que la empresa Boliden-Apirsa tenía en Aznalcóllar (Sevilla), y como consecuencia de ello, el vertido de una gran cantidad de metales pesados y metaloides en el entorno del Parque Nacional de Doñana (abril 1998), constituyen el marco idóneo para el estudio de la respuesta inmune en la colonia de cigüeñas (Ciconia ciconia) situada en la Dehesa de Abajo, a menos de 1 km de la zona directamente afectada por el vertido.

OBJETIVOS El objetivo que se perseguía con la realización de esta propuesta era fundamentalmente evaluar

si la exposición a metales pesados y arsénico derivada del vertido de Aznalcóllar afecta al sistema inmune en pollos de cigüeña blanca nacidos en la colonia de la Dehesa de Abajo. Para ello se propuso estudiar tanto la respuesta inmune humoral como la celular, relacionándola con el contenido en metales pesados y arsénico.

MATERIAL Y MÉTODOS El experimento se llevó a cabo en un total de 50 pollos de cigüeña procedentes de 26 nidos

distintos. Respuesta Inmune Humoral Protocolo de muestreo Para valorar la respuesta inmune mediada por linfocitos B, los pollos de cigüeña fueron

sensibilizados mediante la inyección de dos antígenos: 1) DNP-KLH (dinitrophenol –keyhole limpet hemocyanin), y 2) células sanguíneas de cordero (SRBC).

El protocolo general consistió en inmunizar, subcutánea e intramuscularmente en el caso de DNP-KLH, e intraperitonealmente para SRBC, a los pollos con una primera dosis del antígeno preparada según se detalla en Smits & Baos, 2003. Siete días después de recibir esta primera dosis se les suministró una dosis de recuerdo para estimular la respuesta “secundaria”. Las muestras de sangre para la determinación de anticuerpos y metales pesados se tomaron antes de inyectarles el antígeno en cada una de estas dos ocasiones (respuesta “pre” o control, y respuesta “primaria”) y 7 días después de suministrarles la dosis de recuerdo (respuesta “secundaria). La sangre se alicuotó en tubos heparinizados y se mantuvo a 4ºC hasta su procesamiento en el laboratorio.

Procesamiento de las muestras y análisis de laboratorio Una vez en el laboratorio, parte de las muestras se centrifugaron para la obtención de suero, que

se congeló a –80ºC hasta el momento de ser ensayado (concentración de anticuerpos). El resto de las muestras se conservaron a –20ºC para el análisis de metales pesados y arsénico.

2

La cuantificación de anticuerpos producidos en respuesta a DNP-KLH se llevó a cabo mediante la técnica del radio-inmuno-ensayo (ELISA) en el Toxicology Centre de la Universidad de Saskatchewan (Saskatoon, Canada) bajo la supervisión de la Dra. Judit E. Smits. La concentración de anticuerpos versus SRBC se determinó mediante el comúnmente denominado hemagluttination assay (HA). Para detalles sobre los métodos de cuantificación ver Smits & Bortolotti, 2001 y Smits & Baos, 2003.

La determinación del sexo se llevó a cabo mediante técnicas moleculares en el Laboratorio de Ecología Molecular de la Estación biológica de Doñana.

Respuesta Inmune Celular La respuesta inmune celular, mediada por linfocitos T, se estimó mediante la inyección de un

agente mitógeno (fitohemaglutinina). Detalles en Tella et al., 2000; Jovani et al., 2003. Determinación de metales pesados y arsénico La concentración de Cu, Pb, Cd y As se determinó mediante espectrofotometría de absorción

atómica en cámara de grafito. Para el Zn se utilizó espectrofotometría de absorción atómica en llama. Los análisis fueron realizados en el Instituto de Química Orgánica General (CSIC, Madrid).

Análisis estadísticos La capacidad de respuesta al antígeno se determinó mediante test de la t para muestras

relacionadas (“pre” vs respuesta “secundaria”). El estudio de la relación entre la respuesta inmune (tanto humoral, como celular) y el contenido

en metales pesados y arsénico, se llevó a cabo mediante GLM-mixtos (utilizando el macro Glimmix y el paquete estadístico SAS). La concentración de anticuerpos expresada como incremento entre respuesta “pre” vs respuesta “secundaria” (caso de la respuesta humoral) y como la diferencia de grosor en la membrana interdigital después-antes de inyectar PHA (caso de la respuesta celular) fueron utilizadas como variables dependientes. El sexo, la jerarquía en el nido (grande, mediano/s o pequeño) y el nº de pollos se introdujeron en el análisis como factores fijos, mientras que la edad, la condición física y la concentración de Cu, Pb, Zn, Cd y As fueron tratadas como covariables. El modelo fue ajustado a una distribución normal y la función de enlace utilizada fue la identidad. Por último, el nido de origen se introdujo como variable aleatoria para evitar pseudorreplicación. El proceso de modelado se realizó mediante pasos hacia atrás. A partir de un modelo saturado que consideró todas las variables, se eliminaron sucesivamente los términos menos significativos hasta que todos los efectos retenidos mejoraron el ajuste del modelo final. El nivel de significación elegido fue p=0.05.

RESULTADOS Los resultados que a continuación se exponen son preliminares, a falta de cuantificar los niveles

de anticuerpos para algunas de las muestras colectadas. Por tanto, las conclusiones que se deriven de este estudio son sólo parciales y podrían verse modificadas cuando dispongamos de todos los datos.

Respuesta Inmune humoral Producción de anticuerpos en respuesta a DNP-KLH De los 31 individuos analizados hasta la fecha, 12 (38.7%) no fueron capaces de mostrar

respuesta “primaria”, pero todos ellos (100%) respondieron a la dosis de recuerdo (respuesta “secundaria”). El incremento en la producción de anticuerpos (“pre” vs repuesta “secundaria”) fue significativo (t=13.98, gl=29, p<0.001).

De las variables testadas en el GLM-mixto, sólo el Cu mostró un efecto significativo (F1,10=18.05, p=0.002) sobre la respuesta inmune: menor respuesta cuanto mayor es la concentración de Cu en sangre.

El nido de nacimiento tuvo un efecto significativo (Z= 2.15, p=0.02). Producción de anticuerpos en respuesta a SRBC En este caso, 14 de los 31 individuos analizados (45.2%) no mostraron respuesta “primaria”,

mientras que 12 no fueron capaces de mostrar respuesta “secundaria” (38.7%). También en este caso el incremento en la producción de anticuerpos fue significativo (t=9.5, gl=30, p<0.001).

La concentración de Pb en sangre fue la única de las variables testadas que resultó significativa en cuanto a la respuesta inmune (F1,10=7.82, p=0.02). Al igual que ocurría en el caso del Cu, el Pb se comporta como un inmunosupresor, de forma que cuanto mayor es la concentración de Pb en sangre, menor es la respuesta inmune humoral.

3

Respuesta Inmune Celular El GLM-mixto llevado a cabo para determinar cuáles de las variables testadas influyen en la

respuesta inmune celular mostró un efecto significativo (negativo) del Cu sobre la respuesta inmune celular (F1,22=8.08, p=0.01).

Relación entre la respuesta inmune humoral y la celular La correlación entre la respuesta celular (PHA) y la humoral no resultó significativa, ni en el

caso del DNP-KLH (rP=0.3, p=0.11, N=30), ni en el caso de SRBC (rP –0.06, p=0.74, N=31). DISCUSIÓN La magnitud de la respuesta humoral depende de la existencia de un población competente de

linfocitos B, con capacidad funcional para producir anticuerpos. En este estudio, la producción de anticuerpos en pollos de cigüeña fue estimulada mediante la aplicación de dos antígenos distintos y cuantificada utilizando también distintos métodos. El porcentaje de individuos que mostraron respuesta secundaria puede ser utilizado como indicativo de la efectividad del antígeno. Así, mientras el 100% de los individuos analizados mostraron respuesta “secundaria” al DNP-KLH, el porcentaje de pollos que respondieron secundariamente a SRBC fue del 61%. Numerosos trabajos realizados para estudiar la respuesta inmune humoral utilizando RBCs han demostrado la incapacidad de los pollos de distintas especies para responder a este antígeno 4,6. Por el contrario, y aunque son pocos los estudios llevados a cabo utilizando DNP-KLH, todos los individuos a los que se les ha suministrado este antígeno han respondido favorablemente 9.

La interpretación de la respuesta inmune humoral frente a la inyección de RBCs no es tarea fácil, puesto que se trata de células cuyas membranas presentan una elevada cantidad de antígenos distintos a los que los animales inmunizados pueden responder. Por el contrario, el complejo DNP-KLH tiene un solo antígeno, lo que resulta mucho más útil cuando lo que se trata es de detectar variaciones sutiles.

Aunque desde el punto de vista inmunológico la comparación directa entre la respuesta humoral y la celular, medidas en la forma aquí descrita, es inviable (el mecanismo que provoca la respuesta difiere según se trate de una u otra, los métodos de cuantificación son distintos, etc.), una aproximación podría obtenerse estudiando si los individuos que presentan una mayor respuesta celular muestran también una mayor respuesta humoral. En principio, los individuos inmunodeprimidos serían susceptibles de mostrar un patrón similar en ambas. En nuestro caso no hemos detectado relación alguna entre los dos tipos de respuesta, sin bien la metodología empleada no es la más adecuada. Estudios al respecto deberían llevarse a cabo con posterioridad.

Por lo que respecta a la exposición a metales, tanto la respuesta humoral al DNP-KLH como la respuesta celular parecen estar relacionadas con la concentración de Cu en sangre. Aunque los metales actúan como inmunotóxicos, y algunos de ellos, como el Pb, el Cd o el As provocan efectos sobre el sistema inmune a dosis muy bajas 2, no se ha encontrado en la bibliografía referencia alguna acerca de un comportamiento similar por parte del Cu. Las aves muestran una alta tolerancia a este metal, que actúa como micronutriente en los organismos vivos. Además, los niveles medidos se encuentran dentro del rango normal para otras especies. No obstante, la consistencia de los resultados en los dos tipos de respuesta hace necesario un análisis más exhaustivo de los datos.

En el caso de la estimulación frente a SRBC, es el Pb y no el Cu el que tiene un efecto significativo sobre la respuesta inmune humoral. La exposición crónica a niveles bajos de Pb se ha asociado a una peor respuesta inmune tanto en mamíferos 2, como en aves 11. Experimentos llevados a cabo con aves acuáticas demostraron que la exposición a este metal afectaba a la producción de anticuerpos versus SRBC 11. Sin embargo, la concentración de Pb en los individuos que presentaban este tipo de respuesta era mucho más elevada que los niveles medidos en los pollos de cigüeña objeto de estudio.

Por último, el hecho de que dos metales distintos aparezcan relacionados con una menor respuesta inmune según la técnica empleada en su evaluación, nos lleva a pensar en la posibilidad de que sea la interacción entre distintos metales lo que esté detrás de la respuesta observada. El análisis del resto de las muestras que aún faltan por determinar puede ayudar a confirmar estos resultados, por lo que, en su defecto, no podemos aventurarnos a concluir que la exposición a Cu y Pb altere el funcionamiento del sistema inmune en los pollos de cigüeña nacidos en la Dehesa de Abajo, ni las posibles implicaciones que este hecho podría tener desde el punto de vista de la conservación.

NOTA: El segundo de los objetivos planteados en la memoria del proyecto era diseñar una

metodología para estimar la afección del sistema inmune en poblaciones de aves silvestres. La revisión bibliográfica necesaria para ello se está llevando a cabo actualmente, razón por la que no aparece incluida en este informe.

4

REFERENCIAS

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Ž .The Science of the Total Environment 242 1999 309]323

Trace elements in blood collected from birds feeding inthe area around Donana National Park affected by the˜

toxic spill from the Aznalcollar mine´

V. Benitoa, V. Devesaa, O. Munoza, M.A. Suner a, R. Montoroa,U, R.˜ ˜Baosb, F. Hiraldob, M. Ferrer b, M. Fernandezc, M.J. Gonzalezc´ ´

a ( )Instituto de Agroquımica y Tecnologıa de Alimentos, IATA, CSIC , Apdo Correos 73, 46100 Burjassot, Valencia, Spain´ ´b ( )Estacion Biologica de Donana, Pabellon del Peru srn CSIC , Se¤illa, Spain´ ´ ˜ ´

cDepartamento de I. A. y Quımica Ambiental, IQOG, CSIC, Juan de la Cier¤a, 3, 28006-Madrid, Spain´

Abstract

A long-term monitoring plan was established to study if bird populations around Donana National Park were˜affected by the toxic spill from the Aznalcollar mine. The concentrations of Zn, Pb, As, Cu, Sb, Co, Tl and Cd in the´blood of 11 bird species feeding in the area were determined. The parameters which most affect the accumulation oftrace elements in the birds studied are, firstly, species and, secondly, trophic position, sex, days of exposure andweight. In some individuals, Zn and Cu occurred at higher levels than the reference values for contaminated areas.Concentrations of Pb and Cd in a considerable number of individuals were higher than those found in birds fromuncontaminated areas. The present data, together with the lack of data on blood metal concentration prior to thespill, do not offer any conclusive evidence of the influence of the spill on avian blood metal concentrations. Q 1999Elsevier Science B.V. All rights reserved.

Keywords: Acid mine waste; Heavy metals; Arsenic; Donana National Park; Blood; Birds˜

U Corresponding author. Tel.: q34-963900022; fax: q34-963636301.Ž .E-mail address: rmontoro@iata.csic.es R. Montoro

0048-9697r99r$ - see front matter Q 1999 Elsevier Science B.V. All rights reserved.Ž .PII: S 0 0 4 8 - 9 6 9 7 9 9 0 0 3 9 8 - 8

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1. Introduction

On the 25 April 1998, a dam retaining 5 Hm3

of pyritic sludge gave way and released heavymetals to the Guardiamar River. The most abun-dant metals, considered highly toxic for wildlife,

Žwere Zn, Pb, As, Cu, Sb, Co, Tl and Cd Wood,.1974 . Although great efforts have been made to

remove the sludge, soils have been contaminatedŽwith variable amounts of these elements Simon

.et al., authors in this issue . The contaminatedsurface represents a relatively small percentage ofthe protected area of Donana wetlands, but some˜of the affected locations are important feedingand breeding grounds for nesting and winteringwaterfowl, thus a significant part of these popula-tions could be affected by the contamination.Land birds may not be affected to the sameextent as aquatic birds, since their feeding areagenerally does not extend into the contaminatedpart, although species that cover large distances,such as some raptors, may be affected.

The Donana National Park is a Biosphere Re-˜Ž .serve Comision de Expertos, 1992 and the whole´

area is considered to be of special interest forŽspecies of waterfowl Garcıa et al., 1989; Manez,´ ´˜

.1991; Garcıa-Novo, 1995 . Donana is a breeding´ ˜ground and wintering area for species such as the

Ž .Spanish imperial eagle Aquila adalberti , con-sidered in the European Union to be one of the

Žbirds in greatest danger of extinction Ferrer,.1993 . In addition, some sedentary birds, and birds

that winter in Donana are hunted in neighbour-˜ing areas, and this may provide a link by whichcontamination could reach human populations.

Ž .The Scientific Research Council CSIC wasinstructed by the Spanish Government to monitorthe effect that contamination by heavy metals andarsenic may have on wildlife in the ecosystems ofDonana. For the reasons stated above, and be-˜cause aquatic birds are considered good indica-tors of contamination in wetlands since they accu-mulate metals and As in various organs, theywere included among the various groups of ani-mals studied. In the short term, the aim of moni-toring was to determine whether contaminationby metals affected summer avian mortalityŽ .Hernandez et al., authors in this issue . A long-´

term monitoring plan sampling living animals wasalso established to identify the sublethal effectsthat this contamination episode may have on indi-vidual birds and future bird populations.

To achieve these aims, concentration of metalsin blood were measured since blood reflects thecurrent status of a toxic substance in the bodyand is increasingly used in wildlife sampling pro-

Ž .grams Henny and Meeker, 1981 . It is knownthat the concentration of Cd and Pb in blood is agood short-term and long-term indicator of con-

Ž .tamination Garcıa-Fernandez et al., 1995, 1997 .´ ´As far as As and Co are concerned, there is noevidence if blood concentration of these elementsrepresents a short- or a long-term exposure, al-though in humans arsenic levels in blood have ashort biological half-life and reflect recent expo-

Žsure Cornelis et al., 1995; Nicolas and Descotes,.1996 . Moreover, there is also a great difference

between organisms in the retention of arsenic inŽ .erythrocytes Eisler, 1994 . Large amounts of Zn

are initially stored in the human liver, but it alsotends to accumulate in red blood cells and bones,whilst copper is initially bound to serum albuminand later more firmly bound to alpha-cerulop-lasmin, the liver and bone marrow being the maincopper storage organs. Trivalent forms of anti-mony generally concentrate in red blood cells,while pentavalent compounds are found in plasma.Ž .Hammond and Beliles, 1980 .

The toxic effects of the various heavy metalsand arsenic on birds have been documented. Lead

Žcan cause bird mortality Ramo et al., 1992; Ma-. Žteo et al., 1998 , have sublethal effects Ochiai et

.al., 1992 , or a negative effect on reproductionŽ .Burger, 1995 , depending on the dose. High dosesof Cd can cause death, and sublethal effects havebeen described in birds at lower concentrationsŽ .Bokori et al., 1995 . Arsenic, especially in itsinorganic forms, can bring about the death of anindividual, produce sublethal effects and affect

Ž .reproduction Eisler, 1994 . There are no knownstudies on the effects of Sb and Tl on birds, butsublethal effects have been described in both

Žadult rats and fetuses Alkhawajah et al., 1996;Barroso Moguel et al., 1996; Albiser et al., 1997;

.Poon et al., 1998 . Zn, Cu and Co are essentialelements for birds, but they can be toxic in high

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concentrations, and various sublethal effects haveŽbeen described Ramey and Sterner, 1995;

.Martınez and Dıaz, 1996; Ewing et al., 1998 .´ ´Moreover, when studying the effects of an

episode of local contamination on various species,one must bear in mind that there are numeroussources of individual variation. Among those mostfrequently quoted are: physiological characteris-tics related to rates of absorption and assimilationŽ . ŽPeterle, 1991 ; trophic position and weight Painand Amiard-Triquet, 1993; Garcıa-Fernandez et´ ´

. Ž .al., 1997 ; sex Finley et al., 1976 , and ageŽ .Garcıa-Fernandez et al., 1996, 1997 . Moreover,´ ´the distance of breeding grounds from the spilland the length of time that birds have beenexposed to its effects may affect the degree ofavian contamination.

The aim of this paper is to present the firstdata on metal concentrations in the blood ofbirds found in Donana during the breeding sea-˜son, and to determine whether these levels corre-spond to areas contaminated by heavy metals andarsenic or to uncontaminated areas. Finally, Gen-

Žeralised Linear Models Nelder and Wedderburn,.1972; McCullagh and Nelder, 1983 were used to

determine the importance that the various sourcesof variation mentioned above may have in ex-plaining the contamination observed in individualspecimens.

2. Materials and methods

2.1. Sampling procedure

The birds initially included in the samplingmainly fed in the wetlands, since it was unlikelythat other birds would be affected by this con-tamination episode. Sufficient species were se-lected to represent the various trophic levelsfound in the wetland bird community of Donana.˜Breeding had already started, and thus the collec-tion of samples to some extent was conditioned.For many of the species selected significant num-bers of samples were not obtained, and results forthese species are therefore not included in thispaper. The species for which the concentration ofmetals in blood was analysed are given in Table 1,

which includes species, number of individuals ofeach species sampled, position in the food chain,weight, days of exposure to the spill, sex, age,sampling point and social and ecological interest.The weights assigned to each one of the studiedspecies and introduced in the analysis as continu-ous variable were taken directly from the bibliog-

Žraphy Cramp and Simmons, 1977, 1980, 1983,.1985 , selecting the weight of individuals belong-

ing to the analysed species, sampled in the sameŽ .season spring]summer in places next to Donana.˜

Days of exposure were calculated as the differ-ence between the dates of capture and toxic spill.The locations of the sampling stations are shownin Fig. 1.

A molecular technique based on the structuraldifference of sex chromosomes was used to de-termine the sex of the specimens captured. Un-like mammals, male birds have two identical sex

Ž .chromosomes ZZ , whereas the females are het-Ž . Ž .erogametic ZW Lessels and Mateman, 1996 ;

consequently, the DNA sequences of the W chro-mosome belong exclusively to females. Griffiths

Ž . Ž .et al. 1996 described a gene CDH-W which isfound in the W chromosome in females, with theexception of ostriches and related species; thisknowledge was applied and the specimens weresexed by means of Polymerase Chain ReactionŽ .PCR .

When drawing up the sampling program, weattempted to sample a particular species on vari-ous dates and at various distances from the areadirectly affected by the spill. The latter was im-practical, since many of the species live in coloniesand only a single colony was accessible during thesample collection period, thus it was not possibleto consider this variable when sources of variationwere studied.

Ž .The greater flamingo Phoenicopterus ruber wasincluded in the sampling } although its closestbreeding colony is 135 km from the site of thespill } because monitoring of marked birds re-vealed that they frequently visit Donana to feed˜during the breeding period and the winter season.

ŽThe specimens were captured in the nest pul-. Žlets or in their feeding grounds young birds;

.adults , using various trapping methods. For eachspecimen, 2 ml of blood was taken from the radial

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Fig. 1. Map of the area studied and the sampling stations.

1. Dehesa de Abajo 6. La Algaida. 11. El Pinar de San Agustın.´2. Matasgordas 7. Cano de Guadiamar. 12. El Puntal.˜3. Cano de la Escupidera. 8. Marilopez. 13. Odiel, Ayamonte. Huelva.˜ ´4. Veta Hornitos. 9. Veta La Palma 14. Fuente de la Piedra. Malaga.´5. La FAO. 10. Las Pajareras.

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vein. The specimens collected were marked withplastic rings that could be identified individuallyat a distance to allow monitoring of individuals inthe future.

2.2. Treatment of samples

Blood was kept frozen from collection toŽ .preparation. Blood 1 ml was taken and added to

Ž . Ž9 ml of 0.5% wrv Triton X-100 Merck Farma y.Quımica, S.A., Valencia, Spain . The solution was´

mechanically shaken for 30 s and then shakenvigorously in an ultrasound bath for 30 min. Themixture was centrifuged at 2000 rev. miny1 for 5min. Aliquots of 1 ml were taken and the precipi-tate was discarded. The aliquots obtained werestored at ]208C prior to elemental analysis. An

ŽMSE Minor centrifuge Pacisa, S.A., Madrid,. ŽSpain , a Vortex MS2 Minishaker IKA

Labortechnik, Merck Farma y Quımica, S.A.,´.Barcelona, Spain and a Selecta Ultrasons P bath

Ž .J.P. Selecta, S.A., Barcelona, Spain were used.

2.3. Determination of As, Cd, Co, Cu, Pb, Sb and Tl

The determination of As, Cd, Co, Cu, Pb, Sband Tl in whole blood samples was accomplishedby graphite furnace Zeeman-effect atomic ab-

Ž .sorption spectroscopy. A Perkin-Elmer PE lon-Ž .gitudinal AC Zeeman AAnalyst 600 atomic ab-

sorption spectrometer, equipped with a trans-versely heated graphite atomiser and a built-infully computer-controlled AS-800 autosamplerŽ .Perkin Elmer Hispania, S.A., Madrid, Spain ,and PE pyrolitic graphite coated tubes with aninserted L’vov platform were used. Calibrationwas performed with the method of Additions

Ž .Standard Curve. Deionised water 18 MV cmŽobtained with a Milli-Q water system Millipore.Inc., Millipore Iberica, Madrid, Spain was used´

for the preparation of reagents and standards. Allchemicals including standards and solutions were

Žof pro analysi quality or higher: nitric acid rsy1 . y11.38 g ml , 1000 mg l standards of As, Cd,

Co, Cu, Pb, Sb, Tl, palladium powder, magnesiumnitrate hexahydrate and ammonium dihydrogen

Žphosphate as matrix modifiers Merck Farma y.Quımica, S.A., Valencia, Spain were used. All´

glassware, Eppendorf vials, and disposable sam-pling cups were treated with 10% nitric acid for 1week, and then rinsed three times with Milli-Qwater, before use. Between uses, glassware wasplaced in 10% nitric acid for 24 h. Method detec-

Ž y1 . Žtion limits were: As 0.006 mg l , Cd 0.0001 mgy1 . Ž y1 . Ž y1 . Žl , Co 0.001 mg l , Cu 0.013 mg l , Pb

y1 . Ž y1 . Ž0.002 mg l , Sb 0.002 mg l and Tl 0.002 mgy1 .l . The precision as measured by triplicate anal-

ysis, expressed as the relative standard deviationŽ .R.S.D. was as follows: As 4%, Cd 5%, Co 5%,Cu 2%, Pb 4%, Sb 3% and Tl 3%. The range ofrecovery evaluated by spiking blood samples witheach of the elements was 85]115%.

Accuracy for Pb and Cd was established byanalysing a certified reference sample of bovine

Ž .blood CRM-195 from the Institute for Refer-Ž .ence Materials and Measurements IRMM . The

Žvalues found Pb: 413"17; Cd: 5.40"0.69 mgy1 .l overlapped with the interval found for the

Žcertified values Pb: 416"9; Cd: 5.37"0.24 mgy1 .l . For As, Cu and Co, a CRM sample or

ŽTORT-2 lobster hepatopancreas, Canada Natio-.nal Research Council, CNRC was used. The

values obtained for these elements in our CRManalyses were consistent with the certified values.

2.4. Determination of zinc

In the determination of Zn by flow injection-flame-atomic absorption spectrometry, a PEModel 3300 atomic absorption spectrometerequipped with a PE flow injection analysis system

Ž .for atomic spectroscopy FIAS-400 and an au-Ž .tosampler PE AS-90 were used. Precision was

established by analysis of an A-13 reference sam-ple of animal blood obtained from the Internatio-

Ž .nal Atomic Energy Agency IAEA . The recordedŽ y1 .values 13.6"0.6 mg g overlapped with the

Ž y1 .certified interval for this element 13"1 mg g .The evaluation of Zn recovery in spiked bloodsamples was 95%. The method detection limit forthis element was 0.23 mg ly1.

2.5. Statistical analysis

Ž . ŽA Generalised Linear Model GLM , Nelderand Wedderburn, 1972; Dobson, 1983; McCullagh

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.and Nelder, 1983 was used to derive a mathemat-ical description of individual variations in concen-trations of metals and arsenic in blood. Models ofthis kind are used when determining the individ-ual effect of several variables on a given pheno-

Žmenon Donazar et al., 1993; Bustamante, 1997;´.Forero et al., 1999; Tella et al., 1999 . Gener-

alised Linear Models can be considered as aparticular case of multiple linear regression. Threecomponents must be defined for a GLM: a linearpredictor, an error function and a link function. A

Ž . Ulinear predictor LP is defined as LPsa qb x1qcU x q . . . where a is a constant to be esti-2mated; b, c, . . . are parameters to be estimatedfrom observed data; and x , x . . . are the ex-1 2planatory variables. The error function dependson the nature of the data. The concentration ofthe various metals in blood was ln-transformedand a normal error distribution was assumed forthe models. An identity link was used as linkfunction. In this case the model does not differfrom a multiple linear regression with a ln-trans-formed-dependent variable. The explanatory vari-ables considered were introduced into the model

Ž .as factors species, sex, trophic position or cont-Žinuous variables days of exposure to the spill and

.weight . Although age is relevant as a factor ofŽindividual variation Garcıa-Fernandez et al.,´ ´

.1996, 1997 , it was not included in the statisticalanalysis since most of the individuals sampled

Ž .were pullets Table 1 . We fitted each explanatoryvariable to the observations using the GLM pro-

Ž .gram Baker, 1987 following a modification of atraditional forward stepwise procedure. Eachvariable was tested in turn for significance, andonly those significant at the 5% level were in-cluded in the model. Recent papers have criti-cised automatic stepwise procedures as they arenot necessarily able to select the most influential

Žvariable from a subset James and McCulloch,.1990 . The modification of the stepwise modelling

procedure involved testing the alternative modelsthat were obtained when the second or the third

Žmost significant variable was included provided.that it was significant at the 5% level , instead of

the most significant one at each step. This For-ward Stepwise Branching Modelling ProcedureŽ .Donazar et al., 1993 eventually gave a set of´

different models which mostly converged into asingle model or a set of models from which simi-lar relationships could be inferred.

The expression of the model becomes:

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3. Results

Table 2 shows the total blood metal content ofthe species sampled, and Table 3 gives the per-centage of individuals of each species with higherlevels of metals than those reported in the litera-

Žture for birds in uncontaminated areas Pb, As. Ž .and Cd or contaminated areas Cu and Zn .

Data for birds in uncontaminated areas were notfound for the latter elements. Reference valueswere not found for Co, Sb and Tl levels in theblood of birds. For each element, in the case of

Ž .measurements below the limit of detection LOD ,the value introduced in the database was that ofLOD.

3.1. Zinc

The zinc contents found in the species studiedŽ . y1Table 2 varied between 0.3 and 8.6 mg l . Thespecies that presented the highest mean level ofthis metal was the gadwall, followed by the yel-low-legged gull. The mean value found in glossyibis was notably low. Twenty percent of the gad-

Ž .wall individuals analysed Table 3 presented val-ues even higher than those established for birds

Ž y1in contaminated areas 7.5 mg kg wet weightŽ . .ww , Falandysz et al., 1988 , this being the onlyspecies in which an individual exceeded the refer-ence values.

3.2. Lead

The levels of Pb ranged between 0.002 andy1 Ž .0.454 mg l Table 2 . The species with the

highest mean levels of lead in blood was themallard, followed by the gadwall. Some individualspecimens of mallard had levels close to 0.5 mgkgy1, a value indicative of lead poisoning in swans

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( )V. Benito et al. r The Science of the Total En¤ironment 242 1999 309]323 317

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( )V. Benito et al. r The Science of the Total En¤ironment 242 1999 309]323318

Ž .Blus et al., 1991 . The values found in ducks inuncontaminated areas by other authors are

y1 Ž .around 0.062 mg l Dieter et al., 1976 . Noindividuals of spoonbill, yellow-legged gull or great

Žcrested grebe exceeded the reference value Ta-.ble 3 .

3.3. Arsenic

Levels of As ranged between 0.006 and 0.181y1 Ž .mg l Table 2 . The highest mean contents

were found in the white stork, spoonbill andgadwall, in all cases they were less than the refer-

Žence value for uncontaminated areas 0.02 mgy1 .l , Burger and Gochfeld, 1997 . Nevertheless,

some individuals of five species studied presentedlevels that exceeded the reference value. Therewas great variability in arsenic levels betweenspecimens of the same species. The high numberof species with levels below the detection limit

Žwas also noteworthy pochard, grey heron, greaterflamingo, great crested grebe and yellow-legged

.gull .

3.4. Copper

Levels of Cu content found was between 0.067y1 Ž .and 1.530 mg l Table 2 . The species with the

highest copper blood levels were the white stork,gadwall and yellow-legged gull. These mean val-ues are lower than those found in the literature

Ž y1for contaminated areas 1.15 mg kg ww; Van

.Eeden and Schoonbee, 1996 . Only a few exam-ples of white stork had levels above or around

Ž .this value Table 3 .

3.5. Antimony and thallium

None of the species analysed presented valuesŽ y1which exceeded the detection limits 0.002 mg l

.for both metals .

3.6. Cobalt

The Co range varied between 0.001 and 0.110y1 Ž .mg l Table 2 , with particularly high levels

found in the greater flamingo, spoonbill and yel-low-legged gull. The species with the lowest meanlevel was the great crested grebe.

3.7. Cadmium

Cd concentrations were between 0.0001 andy1 Ž .0.029 mg l Table 2 . The species that had the

highest mean concentrations were the glossy ibis,black kite and mallard, in descending order. Whenthe individual values for each of the species werecompared with the reference values found in the

Žliterature for uncontaminated areas 0.001 mgy1 .l ; Garcıa-Fernandez et al., 1995 , only five of´ ´

the eleven species included in the study had indi-viduals that exceeded the reference value. It mustbe emphasised, however, that in three of thesefive species the percentage of individuals with

Table 4Ž .Variables factors and continuous that are significant at 5% in the Generalised Linear Models

a bElement Model 1 Model 2

Accounted Factors Continuous Accounted Factors ContinuousŽ . Ž .deviance % variable deviance % variable

Zn 71.98 Species ] 52.77 Trophic ]

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As 15.90 Species ] 9.27 Trophic Days

a Ž .Model 1: all the variables studied have been included species; trophic level, sex, days of exposure and weight .b Model 2: the variable ‘species’ has been omitted in all cases.

( )V. Benito et al. r The Science of the Total En¤ironment 242 1999 309]323 319

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( )V. Benito et al. r The Science of the Total En¤ironment 242 1999 309]323320

levels above the reference values was very high,and in the case of the glossy ibis it was 100%.

4. Discussion

Two model groups were fitted for As and eachof the metals except Sb and Tl, which were not-detected in most of the birds studied. In Model 1

Žall the variables were included species, trophic.level, weight, time elapsed since the spill and sex ,

while in Model 2 the species variable was omittedin all cases. Various significant models were foundin both groups. In each case only the best modelswere selected, i.e. those with the smallest residual

Ž .deviance Table 4 .When we considered Model 1, models were

obtained that explained a high percentage of theoriginal deviance for all the metals except AsŽ .Table 5 . Moreover, for all the metals the bestmodel included only one variable, species, andnone of the other factors or continuous variablesconsidered was significant at the level chosenŽ .5% . The various models predict a different be-haviour for each species according to the metalbeing considered. For example, the glossy ibis wasthe species least contaminated by Cu or Zn; simi-larly, the white stork was the species with thehighest concentration of Cu in blood, whereas Znwas the ninth in the order of Zn concentrationcoming after the gadwall, yellow-legged gull,pochard, black kite, mallard, spoonbill, grey heron,and great crested grebe.

In the models that did not include speciesŽ .Model 2 , the factors and continuous variablesthat are significant at the 5% level varied from

Ž .one metal to another Tables 4 and 6 . In allcases the models explained a good part of thedeviance, except in the case of As. Nevertheless,for all the metals the deviance explained wasalways less in Model 2 than Model 1. For Zn, theModel 2 included only trophic position, predictingthe highest values in the carrion consumers andthe lowest values in the invertebrate predators. Inthe case of Pb, Model 2 included trophic positionand sex as significant; this model predicts a lowerconcentration of Pb in females from each trophiclevel. For Cd, Model 2 includes trophic position

and two continuous variables, days and weight, assignificant, with metal concentration increasing asweight and possible days of exposure to the spilldecrease. For Cu, Model 2 includes one factor,trophic position, and one continuous variable,weight; within each trophic level, the Cu concen-tration in blood tends to increase with bird weight.For Co, only trophic position is significant; Model2 predicts the greatest concentration in inverte-brate predators and the smallest concentration infish predators. For As, Model 2 includes twosignificant variables, trophic position as a factorand days as a continuous variable, with the metalconcentration increasing as the possible days ofexposure to the spill decrease. The GeneralisedLinear Models show that when the species towhich an individual belongs is considered sepa-rately from its trophic position, in all the metalsstudied species is the variable that most con-tributes to explaining the variability of metal con-centration in blood. This may be linked with thephysiological characteristics of species related totheir ability to absorb and excrete metals. Insome species of mammals the level of metal con-tamination has been related more to inability toexcrete metals than to their trophic position. Nev-ertheless, we cannot discard the possibility thatthe importance of species is linked with ecologicalfactors such as longevity, ability to move else-where, differences in microhabitat, and feedinghabits, which were not considered in this studyand yet are known to affect the level of contami-nation of an individual.

5. Conclusions

ŽAmong the various metals studied, some such.as Zn and Cu tended to be present in all the

Ž .individuals, whereas others such as Sb and Tlwere not detected in any of the specimens ex-

Žamined. In the case of Zn and Cu the onlymetals for which blood values proceeding from

.studies of contaminated areas were found onlytwo species showed individuals with higher levelsthan the reference values. The reference limit forZn was exceeded by 20% of the gadwall speci-mens, while 3% of the white stork specimens had

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higher levels of Cu than the reference values. Inthe cases of Pb and Cd, the levels of a consider-able number of individuals were higher than thereference values for birds in uncontaminated ar-eas. However, with the data obtained it is notpossible to give an opinion on whether the con-centration of metals found in blood had beenaffected by the spill or not, since this may beinfluenced by the physiological response of thespecies to distinct metals, and by the greater orlesser bioavailability of those metals. The refer-ence values should also be interpreted with care,since they do not refer to the same types ofspecies as those analysed. Furthermore, there isno data for levels of metals and arsenic in bloodbefore the spill to facilitate a comparison with thevalues obtained. The possible presence of metalbefore the spill must also be considered. In addi-tion, the concentration of some elements in blood,such as arsenic, may be a poor indicator of thelevel of contamination of an individual.

Nevertheless, given the toxicity of the metalsand arsenic still present in the area aroundDonana, it is advisable to continue long-term˜monitoring of metals and the metalloid As inblood, since many additional data are required toestablish sublethal effects in the species studied.Owing to the individual variation found, a largenumber of species should be included in theprotocol for monitoring the effects of the spill onbird fauna in Donana. We recommend the inclu-˜sion of threatened species feed in the marshesŽ .Blanco and Gonzalez, 1992 . When the selection´has been made, it is necessary to bear in mind thetrophic level.

Acknowledgements

Funds for this study were provided by the Con-sejo Superior de Investigaciones Cientıficas´Ž .CSIC for which the authors are deeply indebted.

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Age-related variation in the adrenocortical response to stress in nestling white storks (Ciconia ciconia) supports the developmental hypothesis

Julio Blas a,¤, Raquel Baos b, Gary R. Bortolotti a, Tracy A. Marchant a, Fernando Hiraldo b

a Department of Biology, University of Saskatchewan, Sask., Canada S7N 5E2b Department of Applied Biology, Estación Biológica de Doñana, C.S.I.C. Avda. Ma Luisa s/n, Pabellón del Perú, Apdo 1056, E-41013 Sevilla, Spain

Received 16 August 2005; revised 25 January 2006; accepted 24 February 2006Available online 19 April 2006

Abstract

The post-natal development of the adrenocortical response to stress was investigated in European white storks. Sixty wild nestlingsaged 24–59 days old were subjected to a standardized capture and restraint protocol, and the time-course pattern of the response to stresswas assessed through determination of circulating corticosterone in blood samples collected at Wve Wxed times during the 45-min periodfollowing capture. The time course of the response was best Wt to a third-order function of handling time, and showed a strong eVect ofage. Although age did not aVect baseline titers and all birds showed a positive post-capture increase in circulating corticosterone, age hada positive eVect on the relative increase from baseline titer, the recorded time to reach maximum level, and the acute concentration after10 min following capture and restraint. While young nestlings displayed very little response to capture, the response near Xedging resem-bled the typical adrenocortical pattern widely reported in fully developed birds. Our results concur with those found in altricial and semi-altricial species, and suggest that non-precocial birds follow a similar mode of development of the hypothalamic–pituitary–adrenal(HPA) axis. The fact that HPA sensitivity to stress is functional suggests that young storks gradually develop emergency responses ofadaptive value and are able to overcome acute perturbations in spite of their parental dependence, at least during the last two-thirds ofpost-natal development. According to the Developmental Hypothesis, such gradual changes would allow nestlings to respond to pertur-bations as a function of the speciWc behavioral and physiological abilities of their age. The potential sources of stress that nestlings haveto face during development (i.e., weather conditions, dietary restrictions, and social competition) are discussed according to developmen-tal changes in behavioral and physiological abilities.© 2006 Elsevier Inc. All rights reserved.

Keywords: Development; Ontogeny; Stress; Corticosterone; Age; White stork Ciconia ciconia; Developmental Hypothesis

1. Introduction

In birds, short-term activation of the hypothalamic–pituitary–adrenal (HPA) axis in response to a suite of per-turbations (e.g., harsh weather, decreased food resources,and predators; WingWeld and Silverin, 2002) results in therelease of corticosterone (cort) into the blood. Elevated corttriggers emergency responses such as changes in locomotoractivity (Astheimer et al., 1992; Breuner et al., 1998),decreased nocturnal oxygen consumption (Astheimer et al.,

* Corresponding author. Fax: +1 306 966 4461.E-mail addresses: julio.blas@usask.ca, julioblas@terra.es (J. Blas).

0016-6480/$ - see front matter © 2006 Elsevier Inc. All rights reserved.doi:10.1016/j.ygcen.2006.02.011

1992), lipogenesis (Gray et al., 1990; Holberton, 1999; Jenniet al., 2000; Piersma et al., 2000), increased foraging (Bray,1993; Koch et al., 2002, 2004; WingWeld et al., 1990), andmobilization of body energy resources (Jenni et al., 2000;WingWeld et al., 1995). These responses redirect animals toa life-saving state (“emergency life-history stage” WingWeldet al., 1998) allowing them to overcome the source of stressand recover homeostasis in the best possible physical condi-tion. Moreover, the inability of individuals to adjust theirphysiology and behavior to unpredictable perturbationsmay elevate their circulating cort to chronic levels, with det-rimental consequences to cognitive ability, growth, immunedefenses, body condition, reproduction, and survival(reviewed in Kitaysky et al., 2003; Sapolsky et al., 2000).

J. Blas et al. / General and Comparative Endocrinology 148 (2006) 172–180 173

Birds modulate baseline and stress-induced glucocorticos-teroid levels to meet the speciWc physiological and behav-ioral requirements associated with diVerent life-historystages. For example, according to the Migration Modula-tion hypothesis, migrating birds elevate baseline cort tofacilitate migratory fattening while corticosterone stressresponse is reduced to avoid catabolism of skeletal muscle(Holberton, 1999; Holberton et al., 2000; Jenni et al., 2000;Long and Holberton, 2004; Piersma et al., 2000). Duringbreeding, baseline and stress-induced cort levels are alsomodulated as a function of the diVerent reproductive stages(e.g., mating, laying, and brooding, Lormée et al., 2003;O’Reily and WingWeld, 2003; Blas et al., 2006), and speciWcadaptations such as the parental hyperphagia exhibited bybrooding doves are facilitated by elevated baseline cort(Koch et al., 2002, 2004).

Although there is a growing body of literature on therole of cort in adult birds, the function of the HPA axis andassociated responses to stress during development hasreceived little attention until recently. Adrenocorticalresponsiveness to standardized stressors such as humanhandling seems highly variable among bird species duringontogeny. While mallards (Anas platyrhynchos) can rapidlyelevate plasma cort to acute levels in response to captureand handling as soon as they hatch (Holmes et al., 1990),northern mockingbirds (Mimus polyglottos) show little, ifany, cort response to handling during life as nestlings (Simsand Holberton, 2000). Intermediate stages of responsive-ness during development as nestlings, with age-relatedincreases in stress-induced cort elevations, have beenreported in American kestrels (Falco sparverius, Love et al.,2003a) and Magellanic penguins (Sphenicus magellanicus,Walker et al., 2005). Such inter-speciWc variability has beenpostulated to reXect the species-speciWc life-history strategyalong the precocial–altricial spectrum (Starck and Ricklefs,1998), leading to the formulation of the DevelopmentalHypothesis (e.g., Kitaysky et al., 2003; Schwabl, 1999; Simsand Holberton, 2000). The Developmental Hypothesis isbased on the following arguments: (1) because the physio-logical and behavioral capacity of a developing bird toovercome a perturbation depends on the degree of post-hatching parental dependence, the physical bond to a nest,and the capacity to thermoregulate, locomote, and forage,young birds may be limited in their abilities to performmany of the adult-like responses to overcome stressful situ-ations (see Starck and Ricklefs, 1998). As a consequence (2)an adult-like adrenocortical response to stress may exposeyoung to chronic cort elevations, with potentially deleteri-ous consequences for development such as reduced growth,inadequate thyroid function, and reduced cognitive capa-bilities (Hayward and WingWeld, 2004; Kitaysky et al.,2003; Kühn et al., 1998). According to these arguments, theDevelopmental Hypothesis predicts that inter-speciWc vari-ation in the adrenocortical response to stress of hatchlingsreXects the species-speciWc degree of altricial development.Therefore, true altricial species such as northern mocking-birds that hatch almost naked, blind, unable to locomote or

thermoregulate, and depend on their parents for food andprotection are expected to show little or no response tostress as nestlings (i.e., hyporesponsive period). At the otherextreme of the developmental spectrum, precocial specieshatch with sight, covered with down and are able to ther-moregulate, locomote, and feed independently of their par-ents, and therefore the hypothesis predicts fulladrenocortical function in response to stressors such ashuman handling during early post-hatching stages, asoccurs in 1-day-old hatchling mallards (Holmes et al.,1990). A second prediction that derives from the Develop-mental Hypothesis at the intra-speciWc level is a positiveassociation between the adrenocortical response to stressand nestling age. Although during early stages post-hatch-ing non-precocial species are expected to show littleresponse to stress, nestlings develop physiological andbehavioral abilities useful in dealing with a perturbation,which may be modulated by the elevation of cort to acutelevels. For example, studies performed on nestling seabirdsshow that cort elevation facilitates begging and aggression,two forms of adaptive responses to cope with food stress inearly life (Kitaysky et al., 2001b, 2003). Therefore, at least innon-precocial species, the adrenocortical response to stressof nestlings is expected to increase with age, eventuallyreaching adult-like responses near Xedging, when the youngare able to show many of the adult-like behavioral andphysiological responses in emergency situations. This pre-diction is supported by studies performed on nestlings ofsemi-altricial species such as the American kestrel (Loveet al., 2003a) and Magellanic penguin (Walker et al., 2005).

To date, studies on developmental changes in HPAstress response of nestlings are limited to only three non-precocial species (see references above and Love et al.,2003b; Sockman and Schwabl, 2001). Additional datarelated to the Developmental Hypothesis during nestlingstages come from studies showing age-related changes inbaseline cort (Kern et al., 2001; Schwabl, 1999), or studiesfocused on other topics (e.g., anthropogenic disturbances,sibling competition, body condition, nutritional state, andbegging behavior) that report age eVects in the HPA stressresponse with developmental covariates: boobies Sula spp.(Nuñez de la Mora et al., 1996; Ramos-Fernández et al.,2000; Tarlow et al., 2001), hoatzins Opisthocomus hoazin(Mullner et al., 2004), and kittiwakes Rissa spp. (Kitayskyet al., 1999, 2001a,b, 2003). In addition, a number of studiesreport age eVects on baseline cort titers during the periods,of Xedging and natal dispersal (BelthoV and Dufty, 1995,1998; Dufty and BelthoV, 1997; Heath, 1997; Kern et al.,2001; Love et al., 2003a,b). Considering that over 7600avian species across 148 families have non-precocial modesof development (del Hoyo et al., 1994; Starck, 1993), andthe wealth of variability in life-history strategies within theprecocial–altricial spectrum (Starck and Ricklefs, 1998), thetopic calls for additional research from a wider range ofspecies.

Sex is another endogenous trait that could potentiallyexplain intra-speciWc variation in the development of the

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HPA response to stress. Sex diVerences in glucocorticoster-oid levels have been reported in adult birds, and arethought to be the result of the diVerent roles of males andfemales during breeding (Lormée et al., 2003; O’Reily andWingWeld, 2003). Although nestlings are unable to repro-duce, and so potential sex diVerences in adrenocorticalresponse to stress must be attributed to other factors, pre-and post-natal exposure to glucocorticosteroids can inter-fere with the sexual diVerentiation of behavior (Ward,1972), and result in the permanent modiWcation of oVspringtraits (Montano et al., 1991; Roberts et al., 1997; Sachserand Kaiser, 1996; Shapiro and Insel, 1990). Furthermore,neonatal sex steroids can have organizational eVects on thefunction of the HPA axis in male rats (McCormick et al.,1998), suggesting that sexual diVerences in adrenocorticalfunction may occur during early development, althoughthis has only been tested in two avian species (Americankestrel: Love et al., 2003a; Sockman and Schwabl, 2001;canary: Schwabl, 1999).

We investigated post-natal development of the adreno-cortical response to stress in white storks (Ciconia ciconia),a large ciconiform (3100–3600 g) widely distributedthroughout Africa and Europe (del Hoyo et al., 1994).Storks show an altricial type of development (Skutch,1976), as hatchlings are unable to thermoregulate or loco-mote, depend completely on their parents for food andshelter, and stay in an open nest during the 60–90 days ofnestling growth and development (Redondo et al., 1995;Tortosa and Castro, 2003). However, as hatchlings show aloose downy plumage and open eyes, they may, dependingon the classiWcation, be considered as semi-altricial (Nice,1962), or semi-altricial-1 (Starck, 1993). Previous studiesindicate that nestling storks respond to environmental per-turbations by modulating their adrenocortical levels, andalso that age has a positive eVect on acute cort levels (Blaset al., 2005). However, to make the age-speciWc pattern ofHPA response of storks comparable with existing litera-ture, and to discuss ontogenic variation in light of theDevelopmental Hypothesis, additional information and ahigher resolution in the course of a time response to experi-mental handling is required. In this sense, the determinationof circulating cort levels at several time-intervals followingexposure to capture allows a better assessment of HPAresponsiveness of young than a single measurement takenat a Wxed time, as speciWc parameters shaping the timecourse of the response (e.g., relative increase from baselinetiter, time to reach maximum level, and absolute acute con-centration) may depend on age. Our objectives were (1) toestablish when during post-natal development cort levelselevate in response to a stressor, and (2) to investigate qual-itative and quantitative changes in the response with age.These aims were accomplished by evaluating the ability ofnestlings of diVerent ages to release cort in response to astandardized “capture-stress protocol” (WingWeld, 1994).Based on the Developmental Hypothesis, we predicted thatcorticosterone levels would increase above initial baselinelevels more rapidly and/or more robustly with age, to

eventually reach maximal adrenocortical responsiveness tocapture and handling close to the age of Xedging.

2. Materials and methods

2.1. Field sampling

Fieldwork was conducted in June 2000 at two breeding sites in south-ern and mid-western Spain (provinces of Sevilla and Caceres). Selectednests had either two or three nestlings, but blood sampling was always per-formed on two chicks per nest, which were the oldest and youngest. Afteraccessing a nest with a ladder, storks were captured by hand and immedi-ately brought down to the ground. The Wrst blood sample was takenwithin the Wrst minute post-capture, and the synchronized work of severalworkers allowed simultaneous sampling of two birds per nest. Nestlingswere held in the shade in open plastic boxes covered with opaque clothand additional blood samples were collected from the brachial vein at 2,10, 30, and 45 min after capture. After blood sampling, nestlings (N D 60)were banded and their wing chord and body mass were measured beforereturning them to the nest. All Weld activities were performed between 8:00and 11:00 a.m. to minimize potential diel eVects. Blood samples were keptin ice coolers until centrifuged (3000 rpm for 10 min) the same day of cap-ture, and plasma was frozen and stored at ¡80 °C. Nestling age, whichranged from 24 to 59 days, was estimated according to a regression equa-tion of age on wing chord (age D 5.068 + 0.117£ wing chord, r D 0.99,N D 12, P < 0.01) calculated with data from nestlings of the Spanish popu-lation whose hatching date was known (Chozas, 1983).

2.2. Laboratory analyses

Plasma cort was determined through radioimmunoassay followingstandard methods described elsewhere (Wayland et al., 2002). Antiserumand puriWed cort for the standards were purchased from Sigma Chemicals;[3H]cort was purchased from New England Nuclear. Corticosterone mea-surements were performed on reconstituted organic ethyl ether extracts ofthe plasma samples. Extraction eYciency was estimated to be consistentlygreater than 90%, and each extract was measured in duplicate tubes. Aver-age assay precision (assessed by including an internal control with 0.080 ngcort ml¡1) was 0.084 ng ml¡1. The minimum detection limit of the assaywas 0.10 ng ml¡1. Samples were measured over several separate assays,with intra- and inter-assay coeYcients of variation of 7.08 and 7.99%,respectively. In the white stork both sexes look alike, and we resorted tomolecular sexing of the birds by using the cellular fraction of the blood asa source of DNA. For this analysis, primers 945F, cfR, and 3224R wereused, following the method of Ellegren (1996).

2.3. Statistical analyses

To test whether age and sex aVect the response to stress, and also tostudy how these factors shape the time-course patterns of cort secretion,we performed repeated measures analyses as well as speciWc tests onselected parameters of the curves. First, we tested whether nestlings showany adrenocortical responsiveness to our capture and handling. Individualresponses were qualitatively classiWed as either positive or negativedepending upon a bird’s ability to elevate cort post-capture by 10% aboveits recorded baseline concentration (i.e., positive response). Lowerincreases (<10%) or absence of changes were classiWed as negativeresponses. The threshold value was decided a priori based on the intra-and inter-assay coeYcients of variation of the cort RIAs, which werealways below 8%. The percent increase was also analyzed quantitatively,as a function of age, sex, and the interaction age £ sex, while controllingfor potential sources of pseudoreplication (see below).

We then considered the whole response to capture and handling in arepeated measures analysis. Our data matrix comprised 300 corticosteronevalues, corresponding to 60 birds each subjected to a single stress series(i.e., Wve blood samples collected at Wxed times following capture). Becauseseveral observations came from a given individual, corticosterone values

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were not totally independent. In addition, the observations of a given indi-vidual were not independent from the measures taken from a sibling, orfrom the other individuals sharing a given colony. Although the potentialeVects of the speciWc colony, nest, and individual were not the focus of ourstudy (but see Blas et al., 2005), all these factors had to be controlled toavoid pseudoreplication. To solve this problem, we analyzed our data bymeans of Generalized Linear Mixed Models GLMMs, using the macroGLIMMIX for SAS/STATS (for details see Breslow and Clayton, 1993;WolWnger and O’Connell, 1993). Compared to a classical repeated mea-sures ANOVA, data analysis through GLMM allows one to incorporaterandom, categorical, and continuum eVects as independent variables, andthus control for potential pseudoreplication due to the individual, nest,and colony (random variables) while studying the signiWcance and esti-mating the magnitude of the categorical (sex) and continuous (time, age)variables of interest, as well as their interactions. Because corticosteroneobservations were normally distributed (K–S D 0.037, PD 0.2), we used anormal distribution of errors and the default identity link function (seeCrawley, 1993; SAS, 1997). The models were constructed following a back-ward procedure, where the least signiWcant terms were sequentiallyremoved until obtaining a minimum adequate model that only retainedsigniWcant eVects at >5% rejection probability (Crawley, 1993; McCullaghand Nelder, 1989). Handling time was also included as a squared term,allowing us to test whether maximum cort values occur in intermediatepositions along the 45-min response, through quadratic (time2) and cubic(interaction time £ time2) data Wtting. Because in a previous study wealready showed that body condition, brood hierarchies and brood size donot aVect plasma cort in nestling white storks from two- and three-chickbroods (Blas et al., 2005), and in order to focus our analyses on the onto-genic, endogenous (i.e., non-environmental) factors modulating the stressresponse, the former variables were not included in the models. For statis-tical purposes, rather than grouping birds in diVerent age categories, agewas considered a continuous variable, allowing us to increase the degreesof freedom in the analyses. We also did so because we could not select apriori the age of the chicks in the nests that were accessible for sampling,and because the Developmental Hypothesis predicts gradual age-relatedchanges in cort. Therefore, both in the analyses and in the resulting Wgures,the eVect of age corresponds to a continuum, although we also groupedthis variable in discrete categories for illustrative purposes. The signiWcantinteractions were always analyzed post hoc, applying the Bonferroni cor-rection with the aim of avoiding a false discovery rate. Finally, we testedage, sex, and interaction eVects on maximum cort titers while controllingfor other sources of pseudoreplication (i.e., nest and colony) in theGLMMs.

3. Results

All birds but one showed a positive adrenocorticalresponse to capture and handling, elevating their cort levelsabove 10% of the recorded baseline. The percent increasewas nonetheless highly variable, ranging from 12 to 980%depending on age (GLMM: F1,28D 5.84, PD 0.022, ND60),but not sex (sex: F1,27D0.28, PD 0.599, sex£ age: F1,26D0.01, PD 0.993, ND60). In the population as a whole, max-imum cort values for the sampling times taken corre-sponded to the sample at 45 min post-capture, which wassigniWcantly higher than baseline (ANOVA F1,118D121.5,P < 0.001) although statistically similar to the sample takenafter 30 min of restraint (ANOVA F1,118D107.3, PD0.970).The repeated measures analysis along the full capture andrestraint series (ND 300 samples) also revealed a strongeVect of age on the time course of the response, which wasbest Wtted to a third-order function of handling time. TheWnal model showed that the time at maximum cort secre-tion and the absolute maximum titers was dependent on the

individual’s age (Table 1, Fig. 1B). The youngest nestlingstended to increase baseline levels shortly after capture butslightly decrease thereafter. As they grew older, cort secre-tion continued for longer times, delaying the time whenmaximum titers are attained and showing higher concen-trations. The model explained a high proportion of therecorded variability in plasma cort (i.e., 75% deviance). Nei-ther sex alone nor sex interacting with age or handling timeshowed any signiWcant eVect on circulating cort (Table 1).

When the analysis was performed separately on eachsampling time (�D 0.01 after applying Bonferroni correc-tion), age and sex aVected neither baseline cort concentra-tion nor cort values recorded 2 or 10 min post-capture(Table 2). However, after this time age had a positive eVecton plasma titers (Table 2, Fig. 2). Maximum cort titerswere, regardless of sampling time, higher in older birds(GLMM: age F1,28D13.67, P < 0.001) and there was a non-signiWcant trend for sex diVerences (sex: F1,28D4.18,PD0.0503; age£ sex:, F1,27D0.78, PD 0.384).

4. Discussion

Stork nestlings responded to our standardized protocolby showing a quantitative change in circulating cort follow-ing capture. However, the magnitude of the adrenocorticalresponse to handling was highly variable among individu-als, and age had a positive eVect on diVerent parametersdeWning the 45-min time-course pattern of cort secretion,including the relative increase from baseline titers, the timeto reach maximum levels, and the absolute acute concentra-tions after 10 min of handling and restraint. Although our

Table 1Results from the GLMM analyzing ontogenic eVects (i.e., age and sex) onbaseline and stress-induced corticosterone (N D 300 samples), along the45 min of experimental handling and repeated sampling of 60 birds

Test values and associated probabilities are shown for the random eVects,the Wxed terms that were retained by the Wnal model, and the non-signiW-cant Wxed eVects when excluded during the backwards procedure. Themodel was constructed using a normal distribution of errors and identitylink function.

Estimate St. Error Test value P

Random eVectsBird (n D 60) 16.7848 6.7169 Z D 2.50 0.0062Nest (n D 30) 9.4873 7.1781 Z D 1.32 0.0931Colony (n D 2) 21.9258 33.8683 Z D 0.65 0.2587Residual 41.5586 3.8339 Z D 10.84 <0.0001

Fixed eVectsIntercept 24.3948 5.9700 — —Age ¡0.1252 0.1096 F1,234 D 1.30 0.2547Sex — — F1,235 D 2.63 0.1064Time 0.3203 0.4944 F1,234 D 0.42 0.5177Time2 ¡0.05787 0.0160 F1,234 D 13.15 0.0004Age £ Time 0.04185 0.0098 F1,234 D 18.18 <0.0001Age £ Time2 ¡0.00051 0.0002 F1,234 D 5.72 0.0176Age £ Sex — — F1,233 D 0.44 0.5076Sex£ Time — — F1,234 D 0.22 0.6373Sex£ Time2 — — F1,233 D 0.73 0.3925Time£ Time2 0.00094 0.0002 F1,234 D 27.00 <0.0001

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sample did not include birds from the earliest developmen-tal stages (to avoid potential negative eVects associatedwith sampling), the gradual age-related pattern we found(Figs. 1A and B) suggests that nestlings below 24 days mayshow little adrenocortical response to capture. Our resultsWtted initial predictions of the Developmental Hypothesis:the response to stress developed gradually as chicks agedresulting in a pattern near Xedging that resembles typicaladrenocortical responses of fully developed birds (i.e., pro-gressive elevations along 45–60 min following capture,WingWeld, 1994).

With regard to the proximate basis for the age-pattern,two studies have provided evidence that the response tostress in altricial birds reXects changes within the hypotha-lamic–pituitary component of the HPA system, rather thana maturation of the adrenal glands (Sims and Holberton,2000; Walker et al., 2005). Following intra-jugular injec-tions of adrenocorticotropic hormone (ACTH), nestlingmockingbirds and penguins showed cort levels several fold

Fig. 1. Circulating corticosterone (ng ml¡1) along the time course of theresponse to capture and handling. (A) Means § SE corticosterone atdiVerent time points (as indicated in the X-axis), after grouping the 60individuals in several age-intervals of similar amplitude (total number ofobservations: N D 300). Note that age (in days) was always considered acontinuous variable in the analyses and the represented discrete categories(uncorrected for potential sources of pseudoreplication such as samplingsite and nest) were created only for illustrative purposes. (B) Age-relatedchanges in cort values predicted from the GLMM model. Numbers besideWgure lines indicate the post-hatching age of the nestlings in days.

above the maximum elevations elicited by capture andrestraint, indicating that the adrenal glands were functionaland therefore that the maturation processes controlling theage-pattern of the response to stress take place within thehypothalamo–pituitary portion of the HPA axis. The factthat HPA sensitivity to stress is functional when the birdsare still in the nest suggests that young storks may gradu-ally show emergency responses of some adaptive value.According to the Developmental Hypothesis, gradualchanges would allow nestlings to respond to perturbationsas a function of the speciWc behavioral and physiologicalabilities that characterize post-hatching age. The questionsnow are (1) what kind of perturbations would nestlingshave to face while in the nest, (2) what kind of responses,adequate to face such perturbations, are acquired graduallyduring development, and (3) what is the evidence for a cor-ticosterone-mediated eVect on the expression of the latterresponses.

Young white storks inhabit open nests, normally 1–2 mdiameter platforms at the top of trees, poles or buildings,where there is little protection from the elements. Weatherconditions represent a real environmental perturbation foryoung storks as they are known to have a strong eVect onnestling mortality (Carrascal et al., 1993; Jovani and Tella,2004). In cold weather, cort elevations may reduce oxygenconsumption that lowers extended metabolic rate, and pro-mote gluconeogenesis and mobilization of body energystores as is known to occur in adults (Astheimer et al., 1992;Buttemer et al., 1991; Honey, 1990). Furthermore cort ele-vations modulate locomotor activity in adult birds (Asthei-mer et al., 1992; Breuner et al., 1998), and so increased

Table 2Results from the GLMM models (A–E) analyzing circulating corticoste-rone as a function of age and sex, separately at the Wve diVerent timespost-capture (ND 60 per sample time)

Test values and associated probabilities are shown for the Wxed terms thatwere retained by the Wnal models and the non-signiWcant terms whenexcluded during the backwards procedure. The models were constructedusing a normal distribution of errors and identity link function. � level wasset to 0.01 after applying Bonferroni correction.

Model EVect df F value P

(A) 1 min post-capture Age 1,28 0.18 0.6707Sex 1,29 0.97 0.3325Age ¤ Sex 1,27 0.13 0.7216

(B) 2 min post-capture Age 1,29 2.17 0.1512Sex 1,28 0.00 0.9467Age ¤ Sex 1,27 1.18 0.2877

(C) 10 min post-capture Age 1,29 4.88 0.0353Sex 1,28 3.48 0.0727Age ¤ Sex 1,27 0.04 0.8440

(D) 30 min post-capture Age 1,29 18.09 0.0002Sex 1,28 0.04 0.8510Age ¤ Sex 1,27 2.15 0.1539

(E) 45 min post-capture Age 1,29 18.48 0.0002Sex 1,28 2.12 0.1568Age ¤ Sex 1,27 3.28 0.0813

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Fig. 2. Association between circulating corticosterone (ng ml¡1) and nest-ling age (in days) for diVerent handling and restraint times. Baseline val-ues correspond to blood samples taken within 1 min following capture. Pvalues into Wgures indicate the signiWcance of the age eVect and lines rep-resent the predicted values according to the Wtted GLMM models.

locomotor activity of nestlings may allow them to selectparts of the nest to avoid temperature extremes (Glasseyet al., 2006). The ability to regulate body temperature andlocomote changes gradually with age. Thermoregulatorycapabilities are not fully attained until nestling storks areabout 20 days old (Tortosa and Castro, 2003). This is theestimated age when HPA stress response starts to develop(Figs. 1A and B) and although chicks still have limitedlocomotor activity (Bernis, 1975), up to this age there is oneadult permanently at the nest providing shelter. The lack orreduced ability of the younger age groups to show HPAstress response is hypothesized to be an adaptation (Simsand Holberton, 2000; Walker et al., 2005), because theirreduced skills to evade the perturbation may lead to chron-ically elevated cort levels, with detrimental consequences togrowth and development (Kitaysky et al., 2003). At 30–40days of age storks are in the mid-point of development,they are able to stand up and walk around the nest, andtheir HPA stress response is also intermediate (Fig. 1A). Bythe end of the nestling period young storks show a strongadrenocortical response similar to adults of many bird spe-cies (Figs. 1A and B). At this age nestlings are almosttotally covered by a deWnitive feather coat, fully able tomove around the nest platform (Bernis, 1975), and showincreased rates of Xight exercises (Redondo et al., 1995).Adults leave nestlings unattended for long periods, andmay limit the activity at the nest during the day to feedingbouts (Bernis, 1975), suggesting that nestlings are able tomeet the challenge associated with weather as well as adultscan.

The stress associated with food deprivation constitutesanother potential source of perturbation for altricial young.Several studies indicate that circulating cort elevates in nes-tlings seabirds and penguins in response to food shortages(Kitaysky et al., 1999, 2001a; Walker et al., 2005). The proba-bility of food stress is expected to increase gradually as nes-tlings age because their energy demands along developmentincrease with body mass. The physiological ability of nes-tlings to overcome a period of food stress may also improvewith age, as increased body mass involves larger muscles andbody fat stores which constitute the main source of energyunder conditions of limited food supply, and mobilization ofenergy stores is facilitated by the elevated cort levels triggeredby emergency situations (Sapolsky et al., 2000). Nestlingstorks also display speciWc behaviors to elicit food deliveryfrom parents (Cramp and Simmons, 1980). The intensity ofbegging behavior is likely to increase with age, as youngimprove their motor skills. Furthermore, experimental eleva-tions of cort levels in seabird chicks have been shown to elicitbegging behaviors (Kitaysky et al., 2001b, 2003). Therefore,the gradual maturation of the HPA responses to stress couldparallel both increased exposure to food stress, and thecapacity to accumulate and use body energy stores and per-form begging behaviors.

Recent experimental work has also shown that cortplays a role in the expression of aggressive behaviors(Kitaysky et al., 2003), and this association is supported by

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observational studies where social hierarchies within abrood correlate with between-sibling diVerences in circulat-ing glucocorticoids (Love et al., 2003b; Ramos-Fernándezet al., 2000; Schwabl, 1999; Tarlow et al., 2001). Althoughprevious evidence suggests that cort does not play a role inthe organization of within-brood social hierarchies in whitestorks (Blas et al., 2005), the strongest expression of nestlingaggressive behavior is directed to unrelated, kleptoparasiticnestlings rather than to siblings (Redondo et al., 1995). Ifnestling HPA response to stress is associated with aggres-sion to repel intruders, we may expect an increase in theintensity of this behavior during the last weeks of nestlingdevelopment as reported in a previous study (Redondoet al., 1995).

Despite the strong eVect of age on the HPA response tostress, baseline cort levels were independent on the degreeof post-natal development. Age-related increases in base-line cort have been reported in nestlings of some non-preco-cial species (e.g., Schwabl, 1999; Love et al., 2003a) and thiseVect is often explained as a mechanism to facilitate thetransition from nestling to Xedging stages through the posi-tive eVects of elevated baseline cort on locomotor activity,food searching behaviors, and learning processes that maybe critical in the preparation to independence (for studieson adrenocortical responses in birds during Xedging stages,see BelthoV and Dufty, 1995, 1998; Dufty and BelthoV,1997; Heath, 1997; Kern et al., 2001; Love et al., 2003b).However, the elevations of baseline cort to facilitate Xedg-ing may occur just a few days prior to independence ratherthan following a gradual age-pattern, and this may explainwhy we and some other studies (Mullner et al., 2004; Simsand Holberton, 2000; Walker et al., 2005) did not detectsuch an eVect.

In summary, our study demonstrates that the ontogenicdevelopment of the HPA stress response in white storks is agradual process. Although other factors such as the clear-ance rates of circulating cort and the concentration of bind-ing globulins may play a role in the described patterns(Breuner and Orchinik, 2002; Breuner and Hahn, 2003), ourresults concur with those found in other altricial and semi-altricial birds and Wt the predictions of the DevelopmentalHypothesis.

Acknowledgments

This work was supported by the Isabel Maria LópezMartínez Memorial Scholarship in a postdoctoral grant toJ.B., the Spanish Ministerio de Educación Cultura yDeporte in a Predoctoral FPU fellowship to R.B., aNSERC grant to G.R.B., the Project B0S2002-00857 of theSpanish Ministerio de Ciencia y Tecnología, and fundsfrom Junta de Andalucía. R. Jovani, J.L. Tella, L. Bor-tolotti, and two anonymous referees made comments thatconsiderably improved earlier drafts. We thank the manypeople who helped during Weld sampling, especially A.Román, J.C. Núñez, S. Cabezas, A. Tamayo, J. Ramírez,M.C. Quintero, J.L. Arroyo, C. Sánchez, B. Jiménez, R.

Tobar, C. Alonso, R. Álvarez, and R. Rodríguez, J.A.Godoy kindly performed the molecular sexing of the birds.

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Stress response during development predicts fitness in a wild, long lived vertebrate

J. Blas, G. R. Bortolotti, J. L. Tella, R. Baos, and T. A. Marchant

doi:10.1073/pnas.0700232104 published online May 15, 2007; PNAS

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Stress response during development predicts fitnessin a wild, long lived vertebrateJ. Blas*†‡, G. R. Bortolotti*, J. L. Tella†, R. Baos†, and T. A. Marchant*

*Department of Biology, University of Saskatchewan, 112 Science Place, Saskatoon, SK, Canada S7N 5E2; and †Department of Applied Biology, EstacionBiologica de Donana, Consejo Superior de Investigaciones Cientificas, Avenida de Marıa Luisa s/n, Pabellon del Peru, Apdo 1056, 41013 Seville, Spain

Edited by Gordon H. Orians, University of Washington, Seattle, WA, and approved April 9, 2007 (received for review January 10, 2007)

Short-term elevation of circulating glucocorticosteroids (GCs) invertebrates facilitates the adoption of a distinct emergency lifehistory state, which allows individuals to cope with perturbationsand recover homeostasis at the expense of temporarily suppress-ing nonessential activities. Although GC responses are viewed as amajor evolutionary mechanism to maximize fitness through stressmanagement, phenotypic variability exists within animal popula-tions, and it remains unclear whether interindividual differences instress physiology can explain variance in unequivocal componentsof fitness. We show that the magnitude of the adrenocorticalresponse to a standardized perturbation during development isnegatively related to survival and recruitment in a wild populationof long lived birds. Our results provide empirical evidence for a linkbetween stress response, not exposure to stressors, and fitness ina vertebrate under natural conditions. Recent studies suggest thatvariability in the adrenocortical response to stress may be main-tained if high and low GC responders represent alternative copingstrategies, with differential adaptive value depending on environ-mental conditions. Increased fitness among low GC responders,having a proactive personality, is predicted under elevated popu-lation density and availability of food resources, conditions thatcharacterize our study population.

animal personality � corticosterone � glucocorticosteroids � reproduction �survival

Exposure to environmental perturbations constitutes a majorselective force in natural populations. Animals have evolved

behavioral and physiological strategies to avoid the deleteriouseffects of stressors, and among vertebrates, the adrenocorticalresponse is one of the most conserved physiological mechanismsaimed at this end (1–3). In response to modifying factors (e.g.,decreased food resources, predation, harsh weather), vertebratesactivate the hypothalamous–pituitary–adrenal axis, which trig-gers a rapid release of glucocorticosteroids (GCs) from theadrenal glands into the bloodstream (4). Elevations of circulatingGCs, in turn, redirect individuals into a distinct emergency lifehistory state (3) with changes in physiology and behavior (e.g.,increased gluconeogenesis and mobilization of fat stores, sup-pressed territorial and reproductive behavior, irruptive migra-tion; refs. 2 and 4), aimed at coping with the perturbation andrecovering homeostasis at the expense of temporarily suppress-ing nonessential activities. The quantification of circulating GCtiters has become a useful tool in psychology, animal husbandry,and conservation biology because elevations of plasma levelsconstitute a physiological marker of exposure to stress (e.g., refs.5–7), and the latter has deleterious effects on fitness. However,even within animal populations exposed to constant environ-ments there is a strong interindividual variability in the adreno-cortical response to standardized stressors (8–10), and it remainsunknown whether such natural variability exerts an impact onfitness. Only recently, studies in fish, birds, and mammals,including humans, suggest that interindividual differences instress-coping responses are key attributes defining personalitytypes (10–14), and variability in natural populations is main-tained through different payoffs on adaptive capacity and vul-

nerability to disease. We tested whether individual variation inthe GC response to stress early in life has long-term conse-quences to unequivocal components of fitness: survival andreproduction. As a study model we used the European whitestork (Ciconia ciconia), a large water bird that shows deferredbreeding and a maximum life span of �33 years under naturalconditions (15). In June 2000 we assessed the physiologicalresponse to a standardized perturbation in 35 wild nestlingshatched in a colony near Seville, Spain. Using the capture andrestraint protocol (16), we collected a blood sample within thefirst minute after capture (baseline sample) and a second bloodsample after 45 min of restraint (stress-induced sample). Theconcentration of circulating corticosterone was determined inthe blood samples, and during the next 5 years (2001–2005) wemonitored survival and recruitment through intensive and ex-tensive field surveys of banded birds on a very large scale.

Results and DiscussionFrom 6,723 field observations of individuals fitted with largeplastic alpha-numeric bands, we gathered positive resightings on13 (37%) experimental birds. Survival probability was negativelyrelated to stress-induced corticosterone levels (�2 � 5.59, P �0.05; Fig. 1), positively related to body condition (�2 � 5.01, P �0.05) and age at sampling (�2 � 5.53, P � 0.05) and no othersignificant effect was found (Table 1). Although increasedmortality among high GC responders may suggest a potential fornatural selection to operate on stress physiology, there is ageneral agreement that this force exerts its effects by maximizingreproduction of the adapted individuals, even at the expense ofhealth and survival (17). For this reason, we also analyzed theprobability of recruitment of white storks into the breedingpopulation. Of the 35 nestlings subjected to experimental as-sessment of stress response, 9 birds (26%) were recruited asbreeders. The probability of recruitment was negatively relatedto stress-induced GC levels (�2 � 5.50, P � 0.05) and positivelyrelated to nestling age at blood sampling (�2 � 4.39, P � 0.05)with no other significant effect found (Table 1 and Fig. 2).

Our study provides empirical evidence of a link between thephysiological response to stress early in life and both reproduc-tion and survival in a vertebrate and clearly indicates superiorlong-term fitness among phenotypes with reduced GC stressresponses. Recent studies in wild populations of mammals, birds,and reptiles have reported associations between baseline (18) orchronic (6, 7) GC levels and survival. However, this associationis ultimately confounded by differential exposure to stressors

Author contributions: J.B. and G.R.B. designed research; J.B., J.L.T., and R.B. performedresearch; T.A.M. contributed analytic tools; J.B. and J.L.T. analyzed data; and J.B. wrote thepaper.

The authors declare no conflict of interest.

This article is a PNAS Direct Submission.

Freely available online through the PNAS open access option.

Abbreviation: GC, glucocorticosteroid.

‡To whom correspondence should be addressed. E-mail: julio.blas@usask.ca ormalaga@julioblas.org.

© 2007 by The National Academy of Sciences of the USA

8880–8884 � PNAS � May 22, 2007 � vol. 104 � no. 21 www.pnas.org�cgi�doi�10.1073�pnas.0700232104

among individuals, affecting circulating GC levels, or relates toshort-term survival (7). In contrast, our results relate long-termsurvival and recruitment to the nature of an individual’s phys-iological response to a standardized source of stress. Becausebaseline corticosterone had no effect on stork fitness (Table 1),and it was unrelated to experimentally induced GC titers (Pear-son r � 0.128, P � 0.47), our findings suggest a link betweenfitness and stress physiology rather than exposure to stressors.With regard to the effects of nestling age on survival andrecruitment reported here, our assessment of developmentalresponse to stress took place during 2 consecutive days; there-fore, nestling age reflects variability in hatching date within thestork colony. Laying date has an almost ubiquitous associationwith parental quality in seasonal breeding birds, with good-quality individuals breeding earlier in the season (19). Older,earlier-hatched nestlings may thus be the offspring of high-quality breeders, showing enhanced survival and recruitment asa result of better genes, better parental care, or both. Thepositive effect of mass residuals on survival is consistent with anintuitive notion that the physical condition of nestlings is also amajor determinant on individual fitness, possibly linked toparental quality and/or timing of breeding (20). With regard tothe negative association between adrenocortical function andboth survival and recruitment, there is evidence that the behav-ioral and physiological response to stress is consistent over time(8, 10, 12). High GC responders may trigger more often, or more

robust, emergency responses to other sorts of perturbations, notonly during development but also later in life. In the long term,frequent activation of the hypothalamous–pituitary–adrenal axismay lead to chronic exposure to elevated GC levels, withdeleterious consequences on growth and maturity, immune andreproductive function, brain function, and cognitive abilities (2,4, 21, 22), all of which may affect survival and reproduction. Ourresults are consistent with studies conducted on laboratory ratsestablishing a positive association between GC stress responseand mortality risk (10). However, the latter animal model(Sprague–Dawley rats, Rattus norvegicus) was artificially se-lected to develop spontaneous tumors in adulthood (23), and itremained unclear whether the association between the stressresponse and fitness was applicable to vertebrates outside of acontrolled laboratory setting, and more important, whetherother critical components of fitness such as reproduction couldtrade off the proposed benefits of a reduced GC response onlongevity.

Although phenotypic plasticity may account for the reportedvariability in GC response, genetic selection and inbreeding alsoprovide evidence for a strong genetic component to adrenocor-tical function (9, 12, 24, 25). The GC response to stress, throughits effects on fitness, is expected to be a trait subjected to strongnatural selection, but natural variability will occur if divergentselective forces vary among populations or within a populationover time. Research on humans (11) and other animals (12–14)suggests that variability in adrenocortical responses representsalternative strategies with associated payoffs on adaptive capac-ity and vulnerability to disease that change according to envi-ronmental conditions. Behavior under conditions of mild stress

Fig. 1. Probability of survival to adulthood as a function of stress-inducedcorticosterone and body condition during development. (Top and Bottom)The actual recorded levels of stress-induced corticosterone in individuals thatsurvived and did not survive, respectively (shaded bars indicate mean � SEMcorticosterone, and open dots represent individual values). (Middle) Thepredicted survival function according to the statistical model. The modelpredictions have been generated for a range of body condition estimates(maximum, minimum, and average condition scores according to study sam-ple) to illustrate the simultaneous effects of both stress-induced response andbody condition on survival probability. The probability of survival decreases asstress-induced corticosterone levels increase; however, for a given level ofcorticosterone, the survival probability is higher when the bird is in goodcondition.

Fig. 2. Probability of recruitment into the breeding population as a functionof stress-induced corticosterone and nestling age (in days) at sampling. (Topand Bottom) The actual recorded levels of stress-induced corticosterone inrecruited and nonrecruited individuals, respectively (shaded bars indicatemean � SEM corticosterone, and open dots represent individual values).(Middle) The predicted probability of recruitment according to the statisticalmodel. The model predictions have been generated for a range of ages toillustrate the simultaneous effects of both stress-induced response and nest-ling age on recruitment probability.

Blas et al. PNAS � May 22, 2007 � vol. 104 � no. 21 � 8881

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shows consistent patterns in all vertebrates: exploratory activity,boldness, and aggressiveness covary in the same way and shapedistinct behavioral strategies also referred to as personalities orcoping styles (12, 13). In fact, the adrenocortical response tostress and other neuroendocrine traits seems to be causallylinked, possibly through pleiotropy, gene linkage, or coselection(26), to these behavioral strategies (10, 12, 13, 24, 25). Proactiveindividuals (also called bold, aggressive, hawk personalities orfast explorers; refs. 12, 13, 24, and 25) typically show reduced GCelevations, but high activation of the sympathetic axis thatfacilitates the ‘‘fight or flight’’ response to stress. On the otherhand, reactive individuals (also called shy, cooperative, dovepersonalities or slow explorers) are characterized by high GCsecretion but low sympathetic activation in response to stress thatfacilitate the ‘‘freeze and hide’’ coping strategy (10, 12, 13, 24,25). The success of proactive vs. reactive coping strategies ispostulated to vary as a function of population density andpredictability of food resources, with proactive individuals beingmore successful when density is high and food is stable andabundant (13, 25, 27, 28). Interestingly, our study colony of whitestorks has experienced a pronounced growth during the last 25years, and with �400 nests is currently the largest Spanish colony(29), and surely one of the largest and most dense in the world.In addition, the unique environment surrounding the colony(i.e., marshes of Donana National Park) offers high predictabil-ity and abundance of food resources. Our results, therefore,concur with a conceptual framework that predicts selection oflow GC responders, proactive phenotypes under similar envi-ronmental scenarios (13, 27, 28), and provides a parsimoniousevolutionary explanation for the reported link between fitnessand adrenocortical function.

Materials and MethodsAssessment of the Adrenocortical Response to Stress and Traits ofNestlings. We used the ‘‘capture and restraint paradigm’’ (16) toassess baseline GCs (blood samples collected within the firstminute after capture) and stress-induced adrenocortical re-sponse (blood samples collected 45 min after capture) throughdetermination of circulating corticosterone levels. Nestlingstorks respond to short-term human handling by activating theirhypothalamous–pituitary–adrenal axis (30). Our criterion for

selecting this estimate of stress-induced response after 45 min ofrestraint was based on previous work reporting that the corti-costerone response to handling tends to peak and reach a plateaubetween 30 and 45 min in stork nestlings �30 days of age or older(31). To avoid the effects of differential exposure to uncon-trolled sources of environmental perturbation, we sampled birdsfrom a single breeding colony (Dehesa de Abajo, marshes ofDonana, southwest Spain), during a 2-day period, and between8 and 11:00 a.m. to minimize potential diel effects. Afteraccessing a nest, storks were immediately brought down to theground for serial blood sampling. Blood samples were kept in icecoolers until centrifuged (7,000 � g, 10 min) the same day ofcapture, and plasma was frozen and stored at �80°C for furtherdetermination of corticosterone levels. Plasma corticosteronewas determined through RIA in duplicate tubes followingstandard methods as described (30–32). Antiserum and purifiedcorticosterone for the standards were purchased from Sigma–Aldrich (Oakville, Canada); [3H]corticosterone was purchasedfrom New England Nuclear (Woodbridge, Canada). Corticoste-rone measurements were performed on reconstituted organicethyl ether extracts of the plasma samples; extraction efficiencywas �90%, average assay precision was 0.084 ng�ml�1, theminimum detection limit of the assay was 0.10 ng�ml�1, andintraassay and interassay coefficients of variation were �8%.The study colony was located in the vicinity of an area affectedby a mine spill containing lead in 1998 (33). Because lead haspreviously been shown to affect circulating glucocorticoids (34),we also determined blood levels of lead in the collected samplesfollowing methodology as described (34) and with the aim ofcontrolling for potential effects on survival and recruitment (seebelow). All of the birds showed blood lead levels �200 �g/liter,the threshold value reported to cause sublethal effects in birds(35). Before returning the birds to their nests, they were bandedwith plastic-coded leg bands that allowed identification in thefield, and their wing chord and body mass were measured.Because male and female white storks look alike, we resorted tomolecular sexing of the birds (36). Nestling age, which rangedfrom 29 to 59 days old, was estimated according to a regressionequation of age on wing chord (37). A body condition index wascalculated as the individual’s residual value from a regression oflog10 body mass on log10 wing chord. To avoid unnecessary

Table 1. Results from the generalized linear models assessing the probability of survival andrecruitment as a function of nestling traits

Dependentvariable Predictor Estimate SEM �2 P

Survival* Intercept �6.5038 4.8762 1.78 0.1823Baseline corticosterone, ng�ml�1 — — 0.67 0.4115Stress-induced corticosterone, ng�ml�1 �0.1260 0.0631 5.59 0.0181Age 0.2155 0.1125 5.53 0.0187Body condition 25.3771 13.4716 5.01 0.0252Brood size — — 3.39 0.0656Blood lead levels, �g�liter�1 — — 3.51 0.0608Sex — — 0.19 0.6628

Recruitment† Intercept �4.2608 4.1365 1.06 0.3030Baseline corticosterone, ng�ml�1 — — 0.07 0.7891Stress-induced corticosterone, ng�ml�1 �0.1262 0.0627 5.50 0.0191Age 0.1623 0.0895 4.39 0.0361Body condition — — 1.63 0.2012Brood size — — 1.97 0.1606Blood lead levels, �g�liter�1 — — 1.18 0.2775Sex — — 1.17 0.2796

*Binomial distribution of errors and logit link function. Explained deviance: 25.03%.†Binomial distribution of errors and logit link function. Explained deviance: 19.30%.

8882 � www.pnas.org�cgi�doi�10.1073�pnas.0700232104 Blas et al.

suffering or pain to study subjects we followed protocols inconcert with Spanish laws and prioritized ethical considerationsover scientific goals.

Estimation of Survival and Recruitment Probabilities. During theperiod 2001–2005, we gathered information on survival andrecruitment through intensive and extensive field surveys ofbanded birds both at the local, national, and internationalscales. Our focal colony has been intensively monitored duringthe last two decades. Annual monitoring included accuratenest counts, breeding outcome, and marking of most f ledglingswith plastic-coded leg bands easily readable at distance byusing spotting scopes, to determine survival, recruitment, anddispersal of individuals (see, e.g., ref. 38). The same intensivemonitoring was conducted within a radius of �40 km, coveringthe marshes and surroundings of Donana National Park, thiswhole study area holding �2,000 nests of white storks in 2004(29). Field surveys to monitor nests and identify bands ofmarked birds were conducted 5 days a week, from mid-February to late July, covering all of the colonies and the mainfeeding areas for the species. During the period 2001–2005 weresighted 1,078 birds previously born in our study area.Additionally, we consulted the national banding and resightingdata bank at Estacion Biologica de Donana (Seville, Spain),which compiles information on �20,000 white storks bandedacross Spain and further resighted elsewhere worldwide. Thisprocess yielded information on 5,645 additional birds resightedin the same period and would allow detection of long-distancedispersers. The frequency of birds dispersing from our largestudy area seems negligible; only one of the 5,645 resightingsobtained across Spain and neighboring countries in Europeand Africa corresponded to a stork born in Donana (i.e., only1 of 1,079 birds born in Donana and later resighted elsewhere),which moved �100 km for its first breeding attempt. Thisfrequency yields a probability of dispersal away from the studyarea �0.093% (i.e., 1/1,079). Considering that this estimationis very conservative (because it does not take into accountindividuals that died and were never resighted elsewhere afterbanding), we may expect that �1 individual (i.e., 0.032 indi-viduals) of the 35 birds comprising our experimental sampleactually dispersed away from the study site. This probability israther negligible to have any effect on the reported results andconclusions. Average age of first breeding in our population is3.37 � 0.9 years (n � 361; J.L.T. and R. Jovani, unpublished

data), which is similar to that found in other populations[e.g., 3.4 years (39)], and thus the 5-year period of monitoringafter the adrenocortical assessment seems reasonable fordetecting most recruits. In fact, only 2.2% of birds recruited at6 years old.

Modeling survival through capture–mark–recapture tech-niques requires large sample sizes (18), which are difficult toobtain through work such as ours. We thus relied on the analysisof return rates (e.g., ref. 40), assuming that postf ledging mor-tality occurred in individuals not resighted during the 5-yearperiod after blood sampling, and that nonrecruited birds diedbefore reaching first-breeding age. These seem to be reasonableassumptions, given the population traits and the intensive mon-itoring effort described above. Generalized linear models(GLMs) were used (40, 41) for analyzing the probability ofsurvival and probability of recruitment in relation to baselineand stress-induced corticosterone, age, sex, brood size, bodycondition, and blood levels of lead. For this kind of binary data(fledglings surviving or recruited � 1, and fledglings not sur-viving or not being recruited � 0), a binomial error and a logisticlink function are adequate, resulting in a GLM that approachesa logistic regression (42). Each explanatory variable was testedfor significance following standard backwards procedures, wherethe nonsignificant factors and covariates are sequentially re-moved from the saturated model. The result is the most adequatemodel for explaining the variability in the response variable,where only the significant explanatory variables are retained.

We thank F. Hiraldo, R. Jovani, J. M. Terrero, F. J. Vilches, M. C.Quintero, A. Roman, J. C. Nunez, S. Cabezas, G. Garcıa, D. Serrano, A.Tamayo, J. Ramırez, J. L. Arroyo, C. Sanchez, B. Jimenez, R. Tobar, C.Alonso, R. Alvarez, N. Pastor, R. Rodrıguez, J. A. Godoy, the Equipode Seguimiento de Procesos Naturales, and the Oficina de Anillamientode la Estacion Biologica de Donana for help and the hundreds ofvoluntary ornithologists that annually monitor banded white storksacross Spain. The Consejerıa de Medio Ambiente-Junta de Andalucıaand the Ayuntamiento de Puebla del Rıo provided permits to work at thestork colony. J.B. was supported by the Programa Integrado de InsercionProfesional of the Spanish Ministerio de Educacion y Ciencia/EuropeanCommunity, and R.B. was supported by a predoctoral Formacion deProfesorado Universitario fellowship from the Spanish Ministerio deEducacion y Cultura. Financial support was provided by ResearchProject B0S2002-00857 of the Spanish Ministerio de Ciencia y Tecno-logıa (to J.L.T.), the Junta de Andalucıa (to J.L.T.), and a NaturalSciences and Engineering Research Council grant (to G.R.B.).

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Environment International 34 (

Unexpected high PCB and total DDT levels in the breeding population of redkite (Milvus milvus) from Doñana National Park, south-western Spain

Belén Gómara a, María José González a, Raquel Baos b, Fernando Hiraldo b,Esteban Abad c, Josep Rivera c, Begoña Jiménez a,⁎

a Department of Instrumental Analysis and Environmental Chemistry, Institute of Organic Chemistry, CSIC. Juan de la Cierva 3, 28006 Madrid, Spainb Department of Applied Biology, Estación Biológica de Doñana, CSIC. Avda. Ma Luisa s/n, Pabellón del Peru, 41013 Sevilla, Spain

c Department of Ecotechnologies, IIQAB. CSIC. Jordi Girona 18-26, 08034 Barcelona, Spain

Received 4 January 2007; accepted 16 July 2007Available online 28 August 2007

Abstract

This study provides information on the current status of contamination by organochlorines (DDTs, PCBs, PCDDs and PCDFs) in the declining redkite (Milvus milvus L.) population breeding in the Doñana National Park (DNP), south-western Spain. Analyses were performed in addled eggscollected between 1999 and 2001. DDE concentrations ranged from 0.1 to 33.5 μg/g ww, representing more than 86% of the total DDTs. Of thesamples studied, 50% showed DDE levels above those associated with reproductive impairment in other raptor species. Concentrations of orthoPCBs (average 36.8 μg/g ww±37.7) in 50% of the eggs were much higher than levels reported to cause reduced hatching success, embryo mortality,and deformities in birds (N20 μg/g ww). It is remarkable that average ortho PCB and DDE concentrations showed an increase of one order ofmagnitude compared to previous data for the species during the 80s. Total PCDD/Fs showed levels in the low pg/g range (7.2–42 pg/g ww), havingPCDDs and PCDFs similar contributions in most samples. Total mean TEQs were 238 pg/g (ww), being the range 7.02–667 pg/g (ww). Spatialvariation within DNPwas observed for PCBs, DDTs, as well as for TEQs. Since some eggs exceeded the NOEL (67%) and LOEL (33%) reported forother raptor species, we would expect the red kite to experience detrimental effects to dioxin-like toxicity. Our results suggest that organochlorinecontaminants should be regarded as an element of concern in the population under study, in addition to other conservation problems already reported.Further investigations should be undertaken to identify potential sources of these chemicals in DNP, and to find out if organochlorine contamination ispresent in other predator species in the area, as well as their potential health effects on individuals and/or populations.© 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Keywords: PCDDs; PCDFs; PCBs; TEQs; DDTs; Eggs; Raptors; Red kite; Doñana National Park; Spain

1. Introduction

Several case studies reported in humans and wildlifedemonstrate that contamination by organochlorine compoundshas become a generalised problem (Colborn, 1995). After the70s, a number of investigations revealed some organochlorinesas the main cause of certain wildlife population declines(Peakall et al., 1975; Fyfe et al., 1988). Nowadays contamina-tion by this class of compounds continues to be an element ofconcern in top predators such as raptors, with a particularconcern posed by species at risk (Merino et al., 2005; Jiménez

⁎ Corresponding author. Tel.: +34 91 5622900x431; fax: +34 91 5644853.E-mail address: bjimenez@iqog.csic.es (B. Jiménez).

0160-4120/$ - see front matter © 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.doi:10.1016/j.envint.2007.07.002

et al., 2007). The red kite (Milvus milvus), is a medium-sizedraptor species endemic to the western Palearctic, the IberianPeninsula being the southern edge of its distribution. The threelargest populations (in Germany, France and Spain, whichtogether hold more than 75% of the global population) alldeclined during the period 1990–2000 (Seoane et al., 2003),and overall the species declined by almost 20% during thedecade of the 90s, being catalogued as Near Threatened (NT) atglobal-European scale (BirdLife International, 2005). In Spain,the species showed an overall decline in the breeding populationof up to 43% for the period 1994 to 2001–02, and surveys ofwintering birds in 2003–04 suggest a similarly large decline incore wintering areas (BirdLife International, 2005). This declinehas been mainly attributed to human persecution, especially

74 B. Gómara et al. / Environment International 34 (2008) 73–78

through illegal poisoning (Viñuela, 2005), however additionalfactors related to environmental pollution (e.g., chlorinatedpollutants) have not been widely studied and their potential rolein the population decline of the species remains unknown. Arecent study concerning red kites from the Island of Menorca(Spain) reported high levels of PCBs in failed eggs, suggestingthat a more detailed study to clear up possible deleterious effectsof PCBs on this species should be done (Jiménez et al., 2007).

At this point, ecologically sensitive areas present a particularinterest since in general, they represent important refuges forthreatenedwildlife species. An example of this is DoñanaNationalPark (DNP), a 50,720 Ha protected area in south-western Spainthat holds a unique biological diversity in Europe, especially theMarshes (García-Novo and Marín, 2006). Doñana Marshes (alsoknown as Guadalquivir Marshes) is world-renowned for its densepredator populations (Valverde, 1967), including some of themostendangered species of the world, such as the Spanish imperialeagle (Aquila adalberti) and the Iberian lynx (Lynx pardinus), andis one of the major wintering and stopover sites for waterbirdsbreeding throughout the Western Palearctic (García-Novo andMarín, 2006). In the Guadalquivir Marshes, a relatively smallbreeding population of red kites, whose number of pairs declinedfrom 41 in 1987 to 19–20 in 2000 (Máñez, 2001), coexists withmigratory birds fromCentral Europe duringwinter (Heredia et al.,1991). The red kite is listed as a species at critical risk of extinctionat regional scale (Máñez, 2001), being the resident population ofDoñana almost the unique breeding nucleus remaining inAndalusia (Viñuela, 2005). Recently, Sergio et al. (2005) havereported illegal poisoning and high rates of competition and nestpredation as some of the main conservation problems of thispopulation, but contamination was not evaluated in their study.The present study provides information on the actual status ofcontamination by organochlorines (DDTs, PCBs, PCDDs andPCDFs) in the breeding red kite population of Doñana NationalPark,which could be relevantwhen adopting strategies to preservethe conservation status of the species in this area.

2. Materials and Methods

2.1. Sampling

Failed eggs from the population of red kite breeding at Doñana NationalPark (south-western Spain) were used to investigate the organochlorinecontaminants load. Twelve addled eggs, found intact at the nest, were sampledbetween 1999 and 2001. Eggs were obtained from ten different nests. Sampleswere kept frozen at −20 °C until analysis. The egg content was freeze dried priorto analysis. On average, lipid percent was 8 and percent moisture was 79.

2.2. Residue analyses

The contaminants examined were DDTs (DDTand its two main metabolites,DDE and TDE), PCBs (ortho PCBs # 28, 52, 95, 101, 123+149, 118, 114, 153,132+105, 138, 167, 156, 157, 180, 170, 189, 194; non-ortho PCBs # 81, 77,126, 169) and all the 2,3,7,8-substituted PCDDs and PCDFs.

2.3. Reagents and standards

All reagents used for the analysis were of trace analysis grade. Hexane,sulphuric acid (95%–97%) and silica gel were supplied by Merck Co.(Darmstadt, Germany) and granular anhydrous sodium sulphate by J.T. Baker

(Deventer, The Netherlands). Acetone and toluene were purchased from SDS(Peypin, France). PCDD/F congeners were obtained from WellingtonLaboratories (Ontario, Canada) and PCBs and DDTs were obtained fromDr. Ehrenstorfer (Augsburg, Germany).

2.4. Analytical procedure

Sample treatment involved three steps as previously described in detail byMerino et al. (2005). Basically, eggs extraction was carried out using a solidphase matrix dispersion procedure. Then, clean up was performed usingmultilayer columns filled with neutral silica, silica modified with sulphuricacid, and silica modified with potassium hydroxide. The final fractionation stepwas achieved using Supelclean™ Supelco ENVI™-Carb tubes (Bellefonte, PA,USA). Three fractions were collected: The first fraction contained the bulk ofPCBs and DDTs; the second and third fractions contained non-ortho substitutedPCBs and PCDD/Fs, respectively. Congener separation and quantification ofortho PCBs and DDTs were carried out by high resolution gas chromatography(HRGC) using a Hewlett Packard 6890 gas chromatograph equipped with a63Ni electron capture micro-detector (Palo Alto, CA, USA) as described byGómara et al. (2002). Non-ortho PCB congeners were determined by GCcoupled to an ion trap detector (ITD) in the tandem mass spectrometry (MS/MS) operation mode as reported by Gómara et al. (2006) using a Varian CP-3800 gas chromatograph coupled to a Saturno 2000 ion trap detector (PaloAlto, CA, USA). Resolution and quantification of PCDDs and PCDFs wereperformed by high resolution gas chromatography coupled with high resolutionmass spectrometry (HRGC-HRMS) on a GC 8000 series gas chromatograph(Carlo Erba Instruments, Milan, Italy) equipped with a CTC A 200S autosampler (Water Instruments, Manchester, UK) and coupled to an AutospecUltima mass spectrometer (Micromass, Manchester, UK), using a positiveelectron ionization source and operating in the selected ion monitoring mode at10,000 resolving power (10% valley definition), as previously described byMerino et al. (2005). Quantification of non-ortho PCBs and PCDD/Fs wascarried out by the isotopic dilution technique following procedures from EPA(U.S. EPA, 1994).

Quality assurance criteria were based on the application of the qualitycontrol and quality assurance measures, which included the analysis of blanksamples covering the complete analytical procedure. Additional evaluation toensure good quality data was obtained by the participation in severalintercalibration studies covering a wide variety of biotic matrices. The resultswere consistent with the consensus means given by the inter-laboratoryorganizations (NIST/NOAA, 2003; Becher et al., 2004; Becher et al., 2005).

Concentrations are expressed on a wet weight (ww) basis. 2,3,7,8-TCDDequivalents (TEQs) were estimated for PCDD/F congeners and dioxin-likePCBs with an assigned TEF value, based on the bird toxic equivalency factors(TEFs) reported in 1998 by the World Health Organization (Van den Berg et al.,1998).

3. Results and discussion

Table 1a shows data concerning DDT and PCB concentrations ofeach sample analyzed. Total mean DDTs were 9.5±11.1 μg/g, being therange 0.2–34 μg/g. Average DDE concentration was 9.3±10.8 μg/g,ranging from 0.1 to 33.5 μg/g and representing more than 86% of thetotal DDTs. 50% of the eggs had levels of this metabolite higher thanthose associated with reproductive impairment in bald eagles(Haliaeetus leucocephalus) (6 μg/g of DDE, Elliot and Harris, 2001/2002).

Concentrations of ortho PCB congeners ranged from 0.5 to 110 μg/g(average 36.8±37.7μg/g). PCB 153 and 180were themain contributorsto total concentrations, accounting both with a 60%, followed by PCB138 with a percentage contribution of 15% (Fig. 1). Concentrations ofortho PCBs in 50% of the eggs were much higher than levels(N20 μg/g ww) reported to cause reduced hatching success, embryomortality, and deformities in raptor species (Elliot and Harris, 2001/2002). Furthermore, average values found in the present study for orthoPCBs, as well as DDTs, are almost one order of magnitude higher than

Table 1aPCB and DDT concentrations in red kite eggs, expressed in ng/g and pg/g on afresh weight basis (f.w.)

Congener Arithmeticmean

SD Median Geometricmean

Range

Ortho PCBs (ng/g, f.w.)28 55 72 21 26 2–23552 35 30 22 22 2–9195 102 103 63 51 4–303101 960 1175 440 245 6–3298123+149 133 148 70 59 3–501118 992 1111 729 365 21–3197114 87 80 61 40 0.9–218153 11,023 11,455 8298 4063 161–33,785132 7 21 0 19 b0.02–74105 126 121 79 63 4–320138 5783 6103 4340 2147 89–17,535183 1729 1777 1188 586 17–5095167 146 140 103 65 4–358156 608 739 322 201 5–2135157 56 51 41 28 2–137180 10,513 10,527 8359 3741 128–30,211170 2407 2497 1821 861 33–7467189 86 129 32 28 3–391194 1973 1969 1617 759 32–5985Σ ortho PCBs 36,822 37,696 29,114 13,562 517–109,933

Non-ortho PCBs (pg/g, f.w.)81 57 a 46 a 44 22 a b0.03–12877 113 111 61 75 15–393126 1122 1064 840 454 0.8–3074169 160 130 150 53 0.2–405Σ non-ortho

PCBs1438 1236 1179 812 16–3730

DDTs (ng/g, f.w.)DDE 9316 10,888 4711 3654 152–33,549TDE 0.20 0.37 0 0.11 0.03–1DDT 207 202 129 103 3–608Σ DDTs 9524 11080 4872 3795 177–34,158a n=9.

Fig. 1. Relative contribution of individual congeners of ortho-PCBs

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levels reported in previous studies conducted in the 80s in the samespecies. Earlier studies by González et al. (1983) in addled eggs fromred kites collected in 1981, reported mean PCB concentrations of 2 ppmon a fresh weight basis. That study also reported DDE at low ppm levels(0.4 ppm) and DDTwith a mean value of 0.3 ppm. Current PCB levelsare also much higher than average values of 1.15 μg/g found in blackkite (Milvus migrans) eggs collected in 1998 in the same area (Jiménezet al., 2000). In contrast to black kites, an ecologically similar sympatricraptor breeding at Doñana, and although the diet of the two species issimilar (Veiga and Hiraldo, 1990), breeding red kites are year-roundresidents in the Guadalquivir Marshes, being thus more exposed to thelocal sources of pollutants. Research studies conducted in red kite eggsfrom the Mediterranean Island of Menorca, where the breedingpopulation have also experienced an overall decline during the lastdecade (De Pablo, 2004) also revealed PCB concentrations above thethreshold value reported for negative effects (Jiménez et al., 2007),while this was not the case for DDE, as found in Doñana. Since legal useof the pesticide DDT was banned in Spain in 1977 (Zumbado et al.,2005), it was expected that both DDT and its main metabolite DDE,should show a decreasing tendency since then, especially DDT.However, the present study reveals the opposite trend in the case ofDDE, i.e., a high increase in its average levels compared to samplescollected in the 80s, and similar DDT levels to those reported twodecades ago. This may indicate the existence of currently unknownsources of DDT besides residues of technical DDT used in agriculturebefore 1977 that deserve further investigation.

Besides the high concentrations found, it is also important to notethat both DDE and ortho PCB levels were highly variable amongsamples (standard deviations were in both cases higher than averagevalues; see Table 1a). Since we knew the exact location where eachaddled egg was collected, we tried to identify common patterns ofvariation among sampling locations. Results showed that DDE andortho PCB concentrations were significantly higher in eggs collectedfrom the southern part of Doñana National Park (nests located nearestto the Atlantic coast) compared to samples from both the BiologicalReserve (BR, at the core of the park) and the northern part of the parkgrouping together (U-Mann Whitney test, Z values≥2.55, p≤0.011,Table 2). No differences between sampling locations were found inrelation to the frequency of eggs with ortho PCB and DDE levels

to total ortho-PCB levels in red kite eggs from Doñana, Spain.

Table 1bConcentrations of 2,3,7,8-substituted PCDDs and PCDFs and calculated TEQs for PCBs and PCDD/Fs in red kite eggs, expressed in pg/g on a fresh weight basis (f.w.)

Congener Arithmetic mean SD Median Geometric mean Range

2378 TCDF 2.12 2.20 1.35 1.09 0.07–7.1512378 PeCDF 0.84 0.65 0.56 0.62 0.17–2.1923478 PeCDF 6.59 3.60 7.12 5.53 1.75–12.5123478 HxCDF 0.66 0.41 0.55 0.56 0.20–1.77123678 HxCDF 0.46 0.21 0.40 0.42 0.18–0.93234678 HxCDF 0.31 0.17 0.30 0.25 b0.04–0.66123789 HxCDF 0.10 0.06 0.09 0.09 b0.03–0.211234678 HpCDF 0.24 0.31 0.18 0.14 b0.02–1.171234789 HpCDF 0.12 0.09 0.09 0.10 b0.04–0.32OCDF 0.24 0.23 0.13 0.17 b0.06–0.752378 TCDD 2.45 1.46 2.27 1.95 0.39–4.6212378 PeCDD 2.85 1.34 3.01 2.54 1.12–5.18123478 HxCDD 0.55 0.20 0.55 0.51 0.21–0.85123678 HxCDD 1.81 0.87 1.77 1.62 0.68–3.77123789 HxCDD 0.26 0.30 0.18 0.19 0.08–1.201234678 HpCDD 0.68 0.37 0.54 0.61 0.31–1.45OCDD 2.71 2.38 1.70 1.61 b0.06–6.80Total PCDDs 11.3 5.53 9.84 9.90 3.21–18.7Total PCDFs 11.7 6.76 10.63 9.80 4.02–23.3Total PCDD/Fs 23.0 12.0 19.34 19.9 7.22–42.0

TEQs (pg/g, f.w.)TEQs PCDDs 5.38 2.72 5.33 4.66 1.81–8.70TEQs PCDFs 8.95 5.61 8.39 7.29 2.80–20TEQs mono-ortho PCBs 101 109 72 41 1.48–320TEQs non-ortho PCBs 122 110 95 64 0.81–327Total TEQs 238 220 171 137 7.02–667

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above those reported to cause detrimental effects in reproduction(Fisher exact test: ortho PCBs, p=0.21; DDE, p=0.06).

Concerning non-ortho PCBs, concentrations were in the range0.01–3.7 ng/g (average 1.4±1.2 ng/g), being PCB 126 the most

Fig. 2. Relative contribution of each individual 2,3,7,8-substituted dibenzo-p-diopolychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDDs) and polychlorinated dibenzofurans (PC

abundant congener as reported in this and other raptor species (Jiménezet al., 2007). Total PCDD/Fs showed levels in the low pg/g range(7.22–42 pg/g), having PCDDs and PCDFs similar contributions inmost samples (Table 1b). Most of the 2,3,7,8-substituted congeners

xin and 2,3,7,8-substituted dibenzofuran to the sum of the concentrations ofDFs) in red kite eggs from Doñana, Spain.

Table 2Median values and range (in brackets) of ortho PCBs, non-ortho PCBs, DDE, DDT, PCDDs, PCDFs and TEQs (wet weight basis) calculated for eggs (n=12) of Redkites (Milvus milvus) from southern Doñana National Park (southern DNP) and both the Biological Reserve (BR) and northern Doñana National Park (northern DNP)

Σ orthoPCBsμg/g

Σ non-orthoPCBsng/g

DDEμg/g

DDTμg/g

TotalPCDDspg/g

TotalPCDFspg/g

TotalTEQspg/g

Southern DNP (n=4) 78.33 ⁎ 3.08 ⁎⁎ 20.91 ⁎ 0.46 ⁎⁎ 16.1 15.3 527.5 ⁎⁎

(43.87–109.93) (1.79–3.73) (7.32–33.55) (0.26–0.61) (9.1–18.7) (8.1–23.3) (292–667)BR and northern DNP (n=8) 5.47 0.57 1.56 0.07 8.53 6.84 100.45

(0.52–58.08) (0.02–1.29) (0.15–14.74) (0.003–0.24) (3.2–18.6) (4–19.9) (7–201)

U-Mann Whitney test: ⁎ pb0.05; ⁎⁎ pb0.01.

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were detected in all samples, with some exceptions. 1,2,3,7,8,9-HxCDF, 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF and OCDF were under the limit of de-tection (LOD) in most cases.

The 2,3,4,7,8-PeCDF was the most abundant congener, contribut-ing with almost a 30% (Fig. 2). Among PCDDs, the most abundantcongeners were 2,3,7,8-TCDD, 1,2,3,7,8-PeCDD and OCDD account-ing with a 10% each one (Fig. 2).

We found no differences between sampling locations either in PCDDor PCDF levels (U-Mann Whitney test, Z-values≤1.71, p≥0.089,Table 2), although average concentration of non-ortho PCBs was againhigher in the southern DNP (U-Mann Whitney test, Z-value=2.72,p=0.007, Table 2). Although no detailed information is availableregarding differences between sampling locations in prey items collectedduring the breeding season, studies on winter ecology of radiotaggedbirds showed that adult resident kites remain in the proximity of their nestall year round, with small home ranges when foraging, especially in thecase of females (Heredia et al., 1991). Therefore, it seems likely thatdifferences observed between the southern DNP and both the BR andnorthern DNP are due to different type and/or proportion of prey items,with individuals breeding nearest the coastal line preying on morecontaminated food than birds nesting inland. In addition, it should beconsidered that foraging habits of the red kite include visits to rubbishdumps duringwinter (Heredia et al., 1991),which could also contribute tothe contaminants load, especially PCBs, found in the species. Clearly,further investigation is needed in order to identify the particular sources ofexposure to these chemicals and the origin of the spatial variation detectedwithin the DNP.

In Fig. 3, it can be observed that, with the exception of one sample(Mm10), non-ortho PCBs were the major contributors to calculated

Fig. 3. Relative contribution of the sum of ortho polychlorinated biphenyls (ortho-Pdibenzofurans (PCDFs) and polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDDs) to total tox

TEQs, with a percentage of 50%, ortho PCBs contributing with a 43%and the remaining 7% contributed by PCDD/Fs. Total mean TEQs inred kites were 238 pg/g, being the range 7.02–667 pg/g, with samplescollected in the southern part of the Park showing, again, the highestvalues (Z-value=2.72, p=0.007, Table 2).

The no observed effect level (NOEL) and lowest observed effect level(LOEL) based on CYP1A induction in bald eagles (H. leucocephalus)has been reported by some authors to be 100 and 210 pg/g TEQs,respectively (Elliot et al., 2001). Although species-sensitivity may play arole, applying these guidelines to red kites in our study, we would expectthe species to experience detrimental effects to dioxin-like toxicity, sincesome eggs exceeded the NOEL (67%) and LOEL (33%). It should beremarked that all samples collected in the southern DNP showed levelsabove LOEL (Fisher exact test: p=0.002). No differences were foundbetween sampling locations regardingNOEL (Fisher exact test: p=0.21).

4. Conclusions

The high PCB and DDE concentrations found in red kite eggsfrom Doñana could represent a serious element of risk for thepopulation breeding in this area of particular interest. It isremarkable that 50% of the samples showed ortho PCBconcentrations higher than a threshold value of 20 μg/g suggestedfor reproductive effects of PCBs. Half of the samples showedDDE concentrations above the threshold level associated withreproductive impairment in other raptor species, such as the baldeagle. Even more remarkable than the high PCB and DDEconcentrations reported, is the increase of one order of magnitude

CBs), non-ortho polychlorinated biphenyls (non-ortho-PCBs), polychlorinatedic equivalent quantities (TEQs) in red kite eggs from Doñana, Spain.

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observed in the concentrations of these organochlorines whencompared to samples of the species collected two decades ago.

With the information available to date, it is unknown whetherthe detrimental effects reported in other bird species at the levelsfound in our study are contributing to the decline of the breedingred kite population in DNP. However, our results suggest thatorganochlorine contaminants should be regarded as an element ofconcern in the population under study, in addition to otherconservation problems already reported. Moreover, since Doñanais an important refuge for wintering red kites from CentralEurope, this concern should be extended to other Europeanpopulations, which may also be exposed to these persistentorganic pollutants while wintering in the marshes.

Therefore, special attention should be given to the sources andfate of these chemicals inDNP. In this regard, further investigationsshould be undertaken to find out if organochlorine contaminationis present in other predator species in the area, as well as theirpotential health effects on individuals and/or populations.

Measures in order to minimise the exposure to these chemicalsshould be applied by the local and regional authorities in order topreserve the conservation status of the red kite, listed as a speciesat critical risk of extinction at regional scale, and Near Threatenedat global-European scale. Despite the high level of protection ofthis area, Doñana seems to be far from an isolated pristineenvironment. Pollution monitoring studies are strongly encour-aged in this and other protected areas.

Acknowledgements

This study was funded by Consejería de Medio Ambiente dela Junta de Andalucía. We thank F.G. Vilches, J.M. Terrero, G.García, A. Sánchez, M.C. Medina, H. Lefranc, F.J. Hernández,and S. Cabezas for their assistance during fieldwork. B. Gómarawishes to thankMinisterio de Educación y Ciencia and CSIC forher grant. R. Baos received financial support from the SpanishMinisterio de Educación y Ciencia through a FPU fellowship.

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ENVIRONMENTAL LEVELS - POSTERS

AN STUDY O F THE TOXIC EQUIVALENTS DERIVED F R O M PCDDs, PCDFs AND DIOXIN-LIKE PCBs IN T W O BIRD SPECIES {Ciconia

ciconia and Milvus migrans) NESTING IN A PROTECTED AREA P O N A N A NATIONAL PARK, SPAIN).

BJim^nez'. B. Gomara', R. Baos , F. Hiraldo*, E. Eljarrat"*, J. Rivera' and M.J. Gonzalez'

Dept. Instrumental Analysis and Environmental Chemistry, Institute of Organic Chemistry, CSIC. Juan de la Cierva 3, 28006 Madrid, Spain. Department of Applied Biology , Dofiana Biological Station, CSIC, Av. Maria Luisa s/n, 41013 Sevilla, Spain. Department of Ecotechnologies, Research and Development Centte, CSIC, Jordi Girona, 18-26, 08034 Barcelona, Spain.

Introduction There is growing evidence that PCDDs, PCDFs and PCBs are exfremely harmful lo living organisms, especially when they bioaccumulate through foodwebs'. In recent years there has been increasing concem regarding environmental esttogens. Environmental chemicals with known esfrogenic effects include: polychlorinated biphenyls (PCBs), polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDDs) and polychlorinated dibenzofurans (PCDFs). Reported adverse effecis in wildlife are declines in populations, increases in cancers, reduced reproductive funclion and dismpted development of immune and nervous systems. These chemicals have been shown to mimic or antagonise the action of endogenous hormones of particular interest. Due to the widespread distribution of these xenoesfrogens, there is a need for screening and risk evaluation of these endocrine dismpters *.

Aspects of black kite {Milvus milvus) and stork {Ciconia ciconia) life history make them a useful species for contaminant monitoring. They are long-lived birds and breeding pairs show a high degree of nest sile fidelity, thereby permitting long-term monitoring of individualnesting territories. Effects of chlorinated pollulanls has nol been widely studied in this species. Previous studies' at Dofiana National Park (PND) have demonstrated that PCBs were already present in eggs collected during the period 1980-1990.

The present study was designed in order to determine organochlorine levels (PCBs,PCDDs and PCDFs) in eggs from black kites {Milvus milvus) and storks {Ciconia ciconia) breeding near the marshes in Donana National Paric. Therefore, the isomer specific analysis of these substances in eggs samples of two bird species from Doiiana National Park (PND) was performed. The goal of this study was to determine the levels of PCDDs and PCDFs and to compare these samples to samples collected in olher areas. The toxicological significance of these levels and a comparison of our data to those reported for other bfrds populations are discussed.

MATERIAL and METHODS Sampling Unhatched eggs of white stork specimens {Ciconia ciconia) and black kites (Milvus migrans) were obtained fh>m nests localed in the area of Dofiana National Park (PND) during the breading season

ORGANOHALOGEN COMPOUNDS Vol. 46 (2000) 542

ENVIRONMENTAL LEVELS - POSTERS

of 1998. Eggs samples were frozen and stored at-20° C until use. Samples for residue analysis were lyophilised and quantities of approximately 1.5 grams of lyophilised eggs were used for analysis.

Analytical determination. Extraction and clean up. Exfraction and clean up were performed as previously described in detail elsewhere". Basically this consisted of low pressure chromatography on neufral and base-modified silica gel and activated carbon dispersed on glass fibres. Three fractions were eluted from the carbon column for each sample. These contained ortho-subslituted PCBs, non-ortho-substituted PCBs and PCDD/Fs, respectively. Further cleanup was done using silica gel impregnated with sulphuric acid, and Florisil®. Prior to tiie initial exttaction of samples, a mixture o/'Ci2 PCDD/Fs and non-ortho substimted PCBs intemal standards, was added.

Quantiflcation. Resolution and quantification of PCDDs, PCDFs and co-planar PCBs were performed by HRGC-HRMS using a VG AutoSpec Ultima (VG Analytical, Manchester, UK) coupled to a Fisons Series 8000 (8060) gas chromatograph. A minimum resolution of 10,000 was used when operating with the HRMS instmment. Methods blanks were routinely analysed, and no contributions were detected. Resolution and quantification of mono-ortho PCBs was carried out by HRGC-ECD using a Varian GC Instt-ument CX Series, STAR 3400. A fiised silica capillary DB-5 column (60m, 0.25 mm id., 0.25pm film tiiicknessJ&W Scientific, USA) and a DB-DIOXIN column were used. The carrier gas was Helium al a column head pressure of 175 Kpa.

RESULTS AND DISCUSSION Total PCDDs and PCDFs. All 2,3,7,8-substittiled PCDDs and PCDFs were delected in all tiie samples sttidied. Total PCDD/F levels ranged from 4.56 ppt to 69.56 pg/g on a wet weight basis in all the while storks (Ciconia ciconia) studied. Regarding the black kites studied {Milvus migrans) total levels ranged from 10.40 to 13.46 pg/g on a wet weight basis. Regarding the contribution of PCDDs and PCDFs to lotal levels, in general a higher percentage contribution was found from PCDDs, which in some cases conttibuted up to 88% while in the case of PCDFs their confribution was always lower than that ofPCDDs. This situation was observed for both all white storks and black kites studied.

Several tendencies were observed depending on the individual studied: Individuals with the highest contribution to total levels coming from 2,3,4,7,8-PnCDF with a contribution ranging from 37 to 27%. Also an important contribution comes from 2,3,7,8-TCDD and 2,3,4,7,8-PnCDD. Individuals with the highest contribution to total levels coming from OCDD with a percentage contribution ranging from 31 to 67%.

- Importanl conttibutions coming from 1,2,3,4,7,8-HxCDD, 1,2,3,6,7,8-HxCDD, OCDD and 2,3,4,7,8-PnCDF with similar contribution percentages ranging from 14 to 21% respectively.

Co-planar PCBs and Non-coplanar PCBs. Total levels for co-planar PCBs (#77, 126 and 169) found in white storks ranged froni4 to 78.77 pg/g on a wet weight basis. Levels found in black kites ranged from 39 to 52 pg/g on a wet weight basis. In general it was always found that PCB #126 was the most abundant followed by PCB #77 and PCB #169.

ORGANOHALOGEN COMPOUNDS Vol. 46 (2000) 543

ENVIRONMENTAL LEVELS - POSTERS

Average total non-coplanar PCBs exhibited 1.38pj'g (wet basis) inC. c/co«/a and 1.15 p/g in A/. migrans. It can be seen an important contribution of congeners PCB # 153, 180, 170 and 194. It can be seen that PCB levels corresponding lo the period of 1998 are lower than levels found in previous years in Spain'*'*" and also much lower than levels found in other counfries *'".

Calculated TEQs for PCDDs and PCDFs. 2,3,7,8-TCDD equivalents (TEQs) were estimated for PCDD/F congeners based on the Bird Toxic Equivalency Factors (TEFs) reported by the World Health Organisation*. Total calculaled TEQs ranged from 1.66 to 2.17 pg/g (wet weight basis) in black kites specimens and from 1.14 to 6.21 pg/g (wet basis) in white storks. There were always some congeners which contributed markedly to total calculated TEQs. In the case of PCDDs the congener 2,3,7,8-TCDD always contributed with a percentage ranging from 9 to 17 %. The congener 1,2,3,7,8-PnCDD contributed to total calculated TEQs with a perceniage ranging from 20 lo 32% and the loxic 2,3,4,7,8-PnCDF contributed to total TEQs with a percentage ranging from 21 to 28%. Regarding the remaining congeners their conttibution was always lower that the previously mentioned congeners, being their conttibution in general under 1%, except in the case of congeners 1,2,3,6,7,8-HxCDD which in some cases reached contributions up to 5%.

Dioxin Toxic Equivalents (TEQs) of biochemically active planar PCBs. Calculated TEQs for co-planar PCBs in white storks ranged from 1.15 to 6.30 pg/g on a wet basis, while in black kites the range was found lo be from 3.12 lo 4.02. PCB # 126 was the most important conttibulor to total TEQs followed by PCB # 77 and PCB # 169.

When the confribution from PCDD/Fs to total toxicity is compared with that of PCBs it can be seen that it is lower than that coming from PCBs (non-ortho and mono-ortho). It should be noted that TEQs in this study were calculaled based on new TEFs reported by WHO in 1998*. In some individuals it was found that the largest percentage contribution to total toxicity came from mono­ortho PCBs, with percentages ranging from 44 up to 58%. Another case is that of individuals in which the highest confribution came from non-ortho PCBs with percentages ranging from 39 to 46%. The last situation is dial of individuals in whichthe most important confribution came from PCDDs and PCDFs with percentages ranging from 40% lo 66%.

The situation find in the birds studied is quite different from that found in the aquatic environment. For example in marine mammals regarding PCDD/Fs toxicities it has been reported that in general their contribution to overall toxicity was always lower than that coming from mono- and non-ortho PCBs *'.

Acknowledgments. This research was founded by Wildlife Monitoring Project (16/98) financed by CSIC. The authors would like to thank Laura Herrero for sample analysis and staff from Reserva Biologica de Dofiana for collecting samples.

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0048-9697/02/$ - see front matter� 2002 Elsevier Science B.V. All rights reserved.PII: S0048-9697Ž02.00283-8

Isotopic identification of the sources of lead contamination forwhite storks(Ciconia ciconia) in a marshland ecosystem(Donana,˜

S.W. Spain)

Andrew A. Meharg *, Deborah J. Pain , Robert M. Ellam , Raquel Baos , Valerie Olive ,a, b c d c

Amanda Joyson , Nicola Powell , Andy J. Green , Fernando Hiraldoa,c a d d

aDepartment of Plant and Soil Science, Aberdeen University, Cruickshank Building, St. Machar Drive, Aberdeen AB24 3UU, UKbRSPB, The Lodge, Sandy, Bedfordshire SG19 2DL, UK

cScottish Universities Research and Reactor Centre, Scottish Enterprise Technology Park, Rankine Avenue,East Kilbride G75 0QF, UK

dDonana Biological Station, Avenida Maria Luisa, Pabellon del Peru, 41013 Seville, Spain˜

Received 28 February 2002; accepted 26 June 2002

Abstract

White storks (Ciconia ciconia) fed in contaminated waters resulting from the Aznacollar acid mining-sludgespillage into the R. Guadiamar, which feeds the eastern flank of the Guadalquivir marshes(Donana), S.W. Spain.˜The sludge was rich in a range of toxic elements, and in organic pollutants such as the aromatic amines. Storks didnot exhibit elevated metals in their blood immediately following the accident, but chick blood collected the yearfollowing the accident showed genotoxic damage compared to the controls. In this study lead isotope analysis wasused to assess if the storks had ingested sludge-derived contaminants. The sludge lead isotope ratio was distinct fromthat of the Donana sediments. The stork blood lead isotope ratios exactly matched that of the sludge. It was concluded˜that the storks had ingested sludge-derived contaminants. A detailed study of the lead contamination along the R.Guadiamar and the R. Guadalquivir(of which the Guadiamar is a tributary) was also conducted to place the whitestork colony lead exposure in the context of the spatial contamination of the storks’ habitat.� 2002 Elsevier Science B.V. All rights reserved.

Keywords: Donana; Lead-isotopes; White storks˜

1. Introduction

The Guadalquivir marshes(Donana), S.W.˜Spain, support globally threatened bird and otheranimal species, and large tracts of the marshes

*Corresponding author. Tel.:q44-1224-272-264; fax:q44-1224-272-703.

E-mail address: a.meharg@abdn.ac.uk(A.A. Meharg).

have been designated an Important Bird Area(Heath et al., 2000), a World Heritage Site, aRamsar Site and a UNESCO Biosphere Reserve.During April 1998 the Aznacollar mine tailingslagoon failure contaminated the Guadiamar river,which feeds the eastern flank of Donana, with;5˜million m of metal rich sludge(Pain et al., 1998;3

Meharg et al., 1999). The sludge contained 0.8%

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Fig. 1. Map of Donana showing the designated parks and study˜sites. The investigated stork colony was at the Dehesa deAbajo.

zinc, 0.8% lead, 0.5% arsenic, 0.2% copper, 0.05%antimony, 0.005% thallium, 0.0015% mercury,0.0025% cadmium and 0.001% selenium(Grimaltet al., 1999). The sludge also had a low pH(c.pH2), resulting in high mobility and solubility of thecontaminating metals(Alastuey et al., 1999; Gar-ralon et al., 1999). These metals are known to betoxic to exposed birds(Beyer et al., 1996). Thesludge was also contaminated with aromaticamines(Querol et al., 1999).

The year following the accident, white storks(Ciconia ciconia) from a colony close to the areaaffected by the spillage had an elevated incidenceof genetic damage compared to birds from distantcolonies (Pastor et al., 2001). The white storksfrom this colony were observed feeding in contam-inated zones immediately after the accident(Painet al., 1998). However, blood of white storkssampled 16 days after the accident did not showany notable elevation in metal levels(Benito etal., 1999). To investigate the apparent discrepancybetween observed genotoxic effects and low bloodmetal levels we determined stork blood lead iso-tope ratios. Lead isotopes can be used to sourcelead exposure in wildlife(Hobson, 1999; Scheu-hammer and Templeton, 1998). Stork blood leadisotope ratios were related to ratios of the contam-inated sludge and background sediments from theDonana parks to ascertain where the storks had˜obtained their lead. To complement the lead iso-tope study, lead contamination along the affectedstretches of the Guadiamar were quantified andmapped.

2. Materials and methods

2.1. Survey of lead contamination

A detailed survey of lead contamination wasconducted along the R. Guadiamar during theautumn of 1998. Sediment samples were collectedfrom the dry riverbed for the R. Guadiamar. Thearea surveyed included the upper zones of theGuadiamar valley that had been directly impactedby the acidified pyrite sludge(Lopez-Pamo et al.,1999), and the Entremuros, a canalised stretch ofthe Guadiamar river within the Donana parks˜system, which was directly metal contaminated by

acidified water which preceded the mining sludgedown the valley(Garralon et al., 1999) (Fig. 1).Sampling points are illustrated on Fig. 2. Controlsamples were collected parallel to the Entremuros,50 m away from the canal bank. The Guadiamarriverbank below the Entremuros was sampled toits confluence with the R. Guadalquivir(Fig. 1).The R. Guadalquivir riverbank was also sampledfor comparison as it passes through the highlypopulated catchment of Seville. Sample locationswere recorded on a Global Positioning System(GPS). Sediment to a depth of 10 cm was sampledusing a corer. Sediment samples were oven driedand 2 mm sieved. A sub-sample(;0.2 g) wasthen digested in 4 ml of Aristar nitric acid on ablock digester at 1208C until the samples went

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Fig. 2. Lead contamination of R. Guadiamar and Guadilquivirriver sediments. The grids on the map are at 10 km intervals.The units of the legend given on the map are mgykg lead soildry weight.

clear. The samples, after appropriate dilution, wereanalysed for lead using flame-atomic absorptionspectroscopy and appropriate quality controls.

2.2. Lead isotope ratios

Blood samples were obtained from 10 whitestork chicks in June 1999, one breeding seasonafter the accident in 1998, from the colony atDehesa de Abajo(Figs. 1 and 2), alongside theEntremuros at the southernmost limit reached bythe sludge. This is the colony from which birds

were reported to have had a high burden of geneticdamage.

Sludge from the accident was collected from theimpacted areas. Sediment samples were obtainedfrom the Entremuros and from an adjacent non-impacted sites during sampling conducted duringSeptember–October(1998) following the acci-dent. Blood, sediments and sludge were digestedin nitric acid and hydrogen peroxide. Lead isotoperatios, and total blood lead concentrations, in thedigests were then determined by ICP-MS(VGPQIIq) as outlined in Farmer et al.(1996). Thesediment samples were from the same survey asthose used for total lead determinations. Instru-mental mass bias is determined daily by measure-ment of the NIST981 standard. Samples arecorrected for mass bias by applying an identicalcorrection to that required to achieve the certifiedvalues for NIST981. Subsequently, NIST981 is runevery fourth sample as an unknown. Typical pre-cision (2 S.D.) for these bias corrected NIST981s is -0.01% within a given analytical session.Isotope ratios are determined in peak jumpingmode with 3 points per peak using five 90 sintegrations.

3. Results and discussion

Studies on the impact of the mining accident onDonana have shown that lead levels in the Entre-˜muros were elevated compared to the backgroundlevels in the rest of the Donana National and˜Natural Parks(Pain et al., 1998; Garralon et al.,1999). Our study shows that this contaminationwith lead was restricted to the upper reaches ofthe Entremuros(Fig. 2). The map of lead concen-trations along the Guadiamar and Guadalquivirrivers showed that the Guadiamar upstream of theEntremuros is considerably more contaminatedthan the rest of the river system, with lead levelsover 100 mgykg observed compared to 10–20mgykg, typical of the rest of the sites. The veryupper reaches of the Entremuros were in placescontaminated with levels above 200 mgykg. Thelower reaches of the Guadiamar, below the Entre-muros, and the Guadiaquivir are relatively uncon-taminated. The findings from our survey are inagreement with other surveys of metal concentra-

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Fig. 3. Lead isotope ratios for bird bloods and Donana envi-˜ronmental media. The histograms show the mean isotope ratio,and error bars are"S.E. of the mean. Values for the Aznacollarore were obtained from Stos-Gale et al.(1995).

tions conducted for the upper reaches of theGudiamar, above the Entremuros, and for theEntremuros itself(Cabrera et al., 1999; Pain et al.,1998; Vidal et al. 1999; Pain et al., in press).Limited analysis of sediments at the confluence ofthe Guadiamar and the Guadalquivir, and for theBay of Cadiz at the mouth of the Guadalquivir,report lead levels of 20 mgykg (Gomez-Parra etal., 2000), in agreement with the findings of ourstudy(Fig. 2).

Sediments from stretches of the Guadiamar Riv-er that pass the stork colony at the Dehesa deAbajo were elevated in lead content(Fig. 2). It isfrom this stretch, adjacent to contaminated riceand cotton fields(Grimalt et al., 1999) and theupper contaminated parts of the Entremuros, thatstorks were observed feeding after the accident(Pain et al., 1998). The rice and cotton fieldsadjacent to the R. Guadiamar were contaminatedby the accident. Donana white storks feed on˜aquatic vertebrates and invertebrates(Negro et al.,2000). The storks continued to feed on fish andcrayfish from these still contaminated stretcheslong after the accident, and still do so. Thus, eventhough stork blood lead levels were not high whenmonitored just after the accident(Benito et al.,1999), the habitat in which they live is leadcontaminated, and contaminated with a range ofother metals and organic pollutants present in thesludge such as aromatic amines.

3.1. Total blood lead contamination

Blood lead levels in waterfowl are consideredelevated at concentrations above 200 ngyml wetwt., and concentrations above 400 ngyml areindicative of poisoning(Pain, 1996). The medianlead level in the blood of stork chicks analysedwas 168 ngyml (ns10), below what is consideredas harmful for a range of bird species, althoughthere is not much data on lead toxicity thresholdsin Ciconiformes(Franson, 1996). Subsequent anal-ysis of blood for genetic damage, using the Cometassay of chicks from the Dehesa de Abajo colony,at the same time as the bloods taken for leadisotope analysis reported here, showed that thiscolony population had more DNA aberrations thanstorks from nearby colonies not impacted by the

accident(Pastor et al., 2001). Although blood leadlevels in stork are not particularly elevated, andare below threshold levels for lead poisoning,evidence from the blood lead isotope ratios pre-sented below shows that the lead did originatefrom the spill.

3.2. Lead isotope analysis

Lead isotopic composition was used to reveal ifthe sources of blood lead contamination could beapportioned. The results showed that the 208:206ratio did not discriminate well between the samples(Figs. 3 and 4), and ONEWAY ANOVA showedthat their was no significant difference in this ratiobetween uncontaminated parks, the Entremuros,

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Fig. 4. Scatter plot for lead isotope values of individual sam-ples, from which the means in Fig. 3 were calculated. Storksare represented by the circles, sludge by squares, Entromurosby diamonds and non-impacted Park samples by triangles.

sludge and stork blood samples. The 208:207 and206:207 ratios, however, were highly indicative ofsource, with the ANOVA being significant at theP-0.001 level for both ratios. The pyrite sludgewas very distinct compared to the uncontaminatedparks, and identical to Aznacollar ore(Figs. 3 and4). The Entremuros was directly metal contami-nated by acidified water that preceded the sludgedown the valley(Fig. 2). The isotope ratios forEntremuros sediment were intermediate betweensludge and non-impacted, nearby sediments,though closer to the non-impacted sediments, indi-cating slight contamination by the accident, inagreement with the total lead survey presented inFig. 2.

From the plot presented in Fig. 4 it is noteworthythat there was no observable contamination ofDonana samples from leaded petrol, which in W.˜

Europe carries the signature of Australian ore,which has low 208:207 ratios and high 208:206ratios(Hopper et al., 1991).

Blood from white storks, had lead isotope ratiosmatching those of the pyrite sludge(Figs. 3 and4). The stork population at the Dehesa de Abajois largely resident, and therefore, pollutants presentin tissues and bloods are mainly due to localexposure sources. Chicks born one year after theaccident have lead isotope ratios identical to thecontaminated sludge, and distinct from the back-ground parks signature(Figs. 3 and 4). This leadcould have been transferred from the mother tothe egg, andyor could have been derived fromfood collected in the contaminated zones and fedto the chicks. If the storks were foraging incontaminated and uncontaminated zones of thepark, it is likely that the lead isotope signaturefrom the sludge will be dominant due to the highlead concentrations found on the sludge. The leadderived from the accident may also be in a morebioavailable form than lead naturally in thesediments.

Blood lead levels, and indeed other metal con-taminants, were not particularly high immediatelyfollowing the accident(Benito et al., 1999), or forlead in chicks born the year following the accident(this study), and lead itself is not consideredparticularly genotoxic. Lead isotopes are, however,a good marker of the source of contamination towhich the storks have been exposed: contaminatedsludge, containing many metals and other toxins.The individual and interactive effects of the widerange of toxic elements found in the sludge arenot known. Also, the sludge contained the knowncarcinogens, the aromatic amines(Querol et al.,1999). Levels of these amines have not beenreported in bird tissues following the accident. Itseems clear that exposure to the accident is causinggenotoxic damage to the white stork population.Unpublished data also shows that this populationhas very high levels of bill and leg deformities,further corroborating the molecular analysis ofgenotoxic effects(unpublished author’s data). Theblood lead isotope ratios reported in Figs. 3 and 4unambiguously show that the dominant lead expo-sure source to the white storks is lead derivedfrom the Aznacollar accident, obscuring the back-

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ground parks signature. Thus, the white storkchicks were still being exposed to accident derivedtoxicants over a year after the spill.

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Predominance of BDE-209 and other higher brominated diphenyl ethers in eggs ofwhite stork (Ciconia ciconia) colonies from Spain

Juan Muñoz-Arnanz a, Mónica Sáez a, José I. Aguirre b, Fernando Hiraldo c, Raquel Baos c,Grazina Pacepavicius d, Mehran Alaee d, Begoña Jiménez a,⁎a Department of Instrumental Analysis and Environmental Chemistry, Institute of Organic Chemistry, CSIC. Juan de la Cierva 3, 28006 Madrid, Spainb Department of Zoology and Physical Anthropology, Faculty of Biology, Complutense University of Madrid, 28040 Madrid, Spainc Department of Applied Biology, Estación Biológica de Doñana, CSIC. Avda. Américo Vespucio s/n, 41092 Sevilla, Spaind Aquatic Ecosystem Protection Research Division, Environment Canada, 867 Lakeshore Road, P.O. Box 5050, Burlington, Ontario L7R 4A6, Canada

⁎ Corresponding author. Department of InstrumentaChemistry, Institute of Organic Chemistry, CSIC, JuanSpain.

E-mail address: bjimenez@iqog.csic.es (B. Jiménez).

0160-4120/$ – see front matter © 2010 Elsevier Ltd. Aldoi:10.1016/j.envint.2010.11.013

a b s t r a c t

a r t i c l e i n f o

Article history:Received 15 March 2010Accepted 26 November 2010Available online 28 December 2010

Keywords:PBDEsBDE-209EggsBirdsWhite storkDoñana National Park

Polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) are ubiquitous pollutants for which there is still a lack of knowledgeabout the environmental behavior and fate of the higher brominated congeners (octa- to deca-BDEs). In thisstudy, the PBDE content and congener profiles in failed eggs from two colonies of white stork (Ciconia ciconia) inSpain were studied. The average total PBDE concentration was 1.64 ng/g (wet weight, w.w.) for the rural colonyand 9.08 ng/g (w.w.) for the urban colony. Higher brominated BDEs dominated the congener profiles of bothcolonies. Of particular interestwas the determination of BDE-209 as the dominant congener accounting for 44.1%and 38.6% of the total PBDE content in the rural and urban colonies, respectively. BDE-202, considered anindicator of BDE 209 debromination, was detected in 83% and all of the samples from rural and urban colonies,respectively. The observed congener profile in which BDE-207NBDE-208NBDE-206 does not correspond to anyknown technical PBDE mixture and is evidence for possible BDE-209 degradation.

l Analysis and Environmentalde la Cierva 3, 28006 Madrid,

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1. Introduction

Polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) are a family of bromi-nated flame retardants (BFRs) with 209 possible congeners of varyingdegrees of halogenation. These compounds have been used profuselyover the past few decades to prevent fire in a wide array of consumerproducts including plastics, electronic circuitry, polyurethane foams,and textiles among others. The fact that these are non-matrix boundadditives facilitates their release from the products that contain them.That, along with their lipophilicity and resistance to chemicaldegradation, has resulted in their ubiquitous distribution in theenvironment (Hites, 2004; Yogui and Sericano, 2007). The nature andenvironmental behavior of some PBDEs fulfill the criteria for beingrecently considered as persistent organic pollutants (POPs) under theStockholm Convention (UNEP, 2009). Growing evidence of someBDEs' deleterious effects regarding ecosystems and human health hasled to the ban of the three commercial formulations of PBDEs in theEuropean Union. Specifically, the penta- and octa-mixtures werebanned in Europe as of 2004, followed by the ban on the deca-BDE

formulation in 2008 (European Court of Justice, 2008). BesidesEurope, Canada banned the production of all PBDEs in 2006 (CanadaGazette, 2006) and in the United States, manufacturers voluntarilyceased production of the penta- and octa-formulations by the end of2004 and some restrictions on the deca-BDE have already been placedin some states. Recently, the two manufacturers of deca-BDE in theUnited States have committed to phase out total production,importation, and sales of this formulation by the end of 2013 (USEnvironmental Protection Agency, 2009). With the exception of theseexamples in the United States, Canada, and Europe, there are no otherregulations governing the production or use of the deca-BDE mixture.

Decisions to ban or phase out the deca-BDE formulation are inresponse to increasing information showing that BDE-209 couldbioaccumulate in different organisms and degrade and metabolizeinto less brominated, more bioavailable, persistent, and toxiccongeners (Stapleton et al., 2004; Kierkegaard et al., 2007; Van denSteen et al., 2007; Segev et al., 2009). However, even though PBDEsare one of the most studied groups of pollutants, there is still animportant gap in knowledge regarding the environmental behaviorand fate of BDE-209 and the higher brominated BDEs. The number ofscientific papers studying these congeners is still small in comparisonto the high number of studies focused on PBDEs. This may partially bedue to several challenges involved in the analytical determination ofthese congeners (photolytic and thermal degradation), combinedwith a lack of commercially available analytical standards which has

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only recently been remedied (Stapleton, 2006; Kierkegaard et al.,2009).

The use of birds as bioindicators or sentinels of environmentalhealth has been recognized for some time (Furness, 1993). Birds thatare near or at the top of the food chain are susceptible tobioaccumulation and biomagnification. Consequently, these speciesmay be more sensitive to the effects of contaminant exposure andbioaccumulation. The use of infertile eggs has been extensivelyreported and regarded as a useful non-destructive tool for the study ofcontaminants in bird populations (Merino et al., 2005; Jiménez et al.,2007). Regarding PBDE content and congener profiles, several studiesconducted on birds have revealed remarkable interspecies variability(Law et al., 2006). These differences are attributed not only to distinctmetabolic rates but also to diet and habitat since the availability anduse of PBDEs in different ecosystems and environments influences theexposure of birds to PBDEs.

For instance, most avian species having an aquatic-based dietshow a common congener profile dominated by BDE-47, -99, -100,-153, and -154. Moreover, if detected, higher brominated BDEcongeners such as BDE-183 and particularly BDE-209 are found atvery low concentrations. This has been partially explained by the lowbioavailability of BDE-209 due to its high molecular weight andhydrophobicity and its tendency to bind to soil and sediment. Interrestrial food webs, the presence of BDE-183 and -209 was firstreported in 2004 by Lindberg et al. in top predators such as peregrinefalcons. Since then, several studies have detected levels of BDE-209and some nona-, octa- and hepta-BDEs in falcons and other birds ofprey from Norway (Herzke et al., 2005), Switzerland (Naert et al.,2007), Sweden (Johansson et al., 2009), China (Chen et al., 2007; Gaoet al., 2009), and the United States (Chen et al., 2008; Holden et al.,2009; Chen et al., 2010). With the exception of some birds of preyfrom China and the United States, both the reported concentrations ofhigher brominated BDEs, including BDE-209, and their contribution tothe total PBDE content have been low.

The objective of this study was to investigate the PBDE content andcongener profile in the white stork as a top predator with differentfeeding habits depending on the foraging area. Special attention waspaid to the higher brominated BDE congeners. For that purpose, whitestork eggs were obtained from two colonies with marked differencesin terms of their habitats. One of the colonies (Madrid colony) waslocated in an urban/industrial area, near the city of Madrid, wherenests were built in anthropogenic habitats where the presence of

Fig. 1. Geographic distribution of the white stork colon

rubbish dumps could provide the storks with a constant food source(Martínez, 1995). The other colony inhabited Doñana National Park(DNP) and its surroundings (DNP colony) in southwestern Spain,which is considered an ecologically sensitive rural area and sanctuaryfor numerous bird species. In this colony, white storks were observedto breed in open nests at the top of wild olive trees located in a naturalarea far from urban or industrial influences. Therefore, the DNP storksconsume a natural diet involving terrestrial and aquatic species suchas crayfish, terrestrial insects, earthworms, and amphibians amongothers.

2. Materials and methods

2.1. Sample collection

A total of 33 addled eggs of white stork were collected. Twenty-three were obtained from Doñana National Park during the breedingseasons of 1999–2000, and ten eggs were collected from Madridduring the breeding season of 2005 (Fig. 1). Nests were carefullymonitored during the breeding period and all of them were sampledat the same time intervals, so it was assumed that all eggs had thesame water loss. Samples were stored at−80 °C until analysis. Beforeresidue analysis, eggs were examined, and none of them wasembryonated. Egg content was used for chemical analysis and theremaining eggshell was kept for further structural analysis.

2.2. Analytical procedure

The whole egg content was lyophilized and quantities of approx-imately 2 g were used for residue analysis according to the analyticalprocedure described in detail elsewhere (Merino et al., 2005). Briefly,samples were spiked with

13C-labeled surrogate standards and the

extraction was based on a matrix solid phase dispersion (MSPD)procedure. Further cleanup was performed by using acidic and basicsilica gel multilayer columns. A final fractionation of the studiedcompounds and other possible interferences was carried out by usingSupelclean™ Supelco ENVI™-Carb tubes. Three fractions were eluted:the first fraction contained the bulk of PBDEs along with ortho-PCBsandDDTs,whereas the second and third fractions containednon-orthosubstituted PCBs and PCDD/Fs, respectively. The first fraction contain-ing PBDE congeners was used in the present work. Non-ortho-PCBsand PCDD/Fs obtained in the second and third fractions constituted

ies sampled. DNP stands for Doñana National Park.

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part of a separated work (Muñoz-Arnanz et al., 2008). Lipid content ofeach sample was calculated gravimetrically (additional detailsprovided in Supplementary Information).

Prior to instrumental analysis,13C12-BDE 138 or

13C12-BDE 139were

added to all extracts as injection standards to correct for instrumentvariability. Twelve tri- to hepta-substituted PBDE congeners (BDE-17,-28, -47, -66, -85, -99, -100, -153, -154, -183, -184, and -191) wereanalyzed by high resolution gas chromatography low resolution massspectrometry (HRGC–LRMS) using a 6890 N gas chromatographcoupled with a 5975 quadrupole mass spectrometer (Agilent, PaloAlto, CA) operated in selected ion monitoring mode (SIM) withelectron capture negative ionization (ECNI). The GC injection port wasconfigured for 1 μL pulsed hot splitless injections (5 psi during 4 min)at a temperature of 260 °C. Gas chromatographic separation prior toMS was achieved using a 15 m×0.20 mm×0.20 μm DB-5MS lowbleed column (J&W Scientific, USA). The GC column was maintainedat 120 °C for 4.2 min, then ramped at 30 °C/min to 200 °C, rampedagain at 5 °C/min to 275 °C, ramped once again at 40 °C/min to 300 °Cand maintained for 10 min, and finally ramped at 10 °C/min to 310 °Cand held for 2 min. Helium was used as the carrier gas at a constantflow rate of 1.5 mL/min. Methane was used as reaction gas. Thetemperatures of the transfer line, source, and quadrupole were set at300 °C, 150 °C, and 150 °C, respectively. The identification of targetcompounds was based on detection, at the corresponding retentiontime, of m/z 79 and 81 (corresponding to bromine atoms) plus 2 moreions corresponding to the cluster of [M-HxBry]- which were specific toeach congener.

Sixteen higher brominated PBDE congeners, from octa- to deca-substituted (BDE-194, -195, -196, -197+204, -198+199+200+203,-201, -202, -205, -206, -207, -208, and -209) were analyzed by highresolution gas chromatography high resolution mass spectrometry(HRGC–HRMS) using a Micromass AutoSpec Ultima coupled to anAgilent 6890 GC equipped with a CTC A200s autosampler. The GCinjection port was configured for 1 μL split/splitless injections at atemperature of 280 °C. Gas chromatographic separation prior toMSwasachieved using a 15 m×0.25 mm×0.10 μm DB-5HT column (J&WScientific, USA). The GC column was maintained at 100 °C for 2 min,then ramped at 25 °C/min to 250 °C, ramped at 1.5 °C/min to 270 °C,

Table 1Arithmetic mean, median, range and detection frequencies (% > LOD) of PBDE concentraDetected.

DNP (n=23)

Congeners Mean Median Range Perce

BDE-17 0.019 0 ND–0.218 13.6BDE-28 0.029 0.010 ND–0.183 59.1BDE-47 0.023 0 ND–0.172 36.4BDE-66 0.0001 0 ND–0.003 4.5BDE-85 0.032 0 ND–0.674 22.7BDE-99 0.046 0 ND–0.339 50BDE-100 0.052 0 ND–0.460 27.3BDE-153 0.090 0 ND–0.522 40.9BDE-154 0.097 0.037 ND–0.744 95.5BDE-183 0.064 0.041 0.003–0.289 100BDE-184 0.003 0 ND–0.023 18.2BDE-191 0.030 0 ND–0.330 31.8BDE-194 0.004 0 ND–0.070 17.4BDE-195 0.0003 0 ND–0.007 4.3BDE-196 0.048 0.031 ND–0.187 95.7BDE-197+204 0.086 0.065 ND–0.287 95.7BDE-198+199+200+203 0.017 0.014 ND–0.074 82.6BDE-201 0.016 0.011 ND–0.079 95.7BDE-202 0.013 0.008 ND–0.086 82.6BDE-205 0.0002 0 ND–0.005 8.7BDE-206 0.019 0.010 ND–0.162 65.2BDE-207 0.167 0.072 ND–1.24 91.3BDE-208 0.060 0.024 ND–0.465 91.3BDE-209 0.724 0.327 ND–6.74 95.7ΣPBDEs 1.64 0.832 0.214–9.50

ramped at 25 °C/min to 325 °C and held for 5 min. Helium was used asthe carrier gas in constant pressure mode. Analyte ionization wasperformed by electron ionization (EI) at an electron voltage rangingfrom 30 to 40 eV depending on the optimization parameters of theinstrument. Source and transfer line temperatures were both set at280 °C and the resolving power of the analyzer was 10,000. Qualityassurance/control criteria are provided in the SupplementaryInformation.

2.3. Data analysis

All concentrations are given in wet weight (w.w.). For comparativepurposes, the mean content of lipids in the analyzed eggs was 7.32 ±0.96 % in the case of DNP and 7.18 ± 0.73 % in the case of Madrid.Samples with concentrations below the detection limits wereassigned a value of zero. Statistical analyses were carried out withSigmaPlot for Windows version 11.0 (Systat Software Inc., CA, USA).Data were not normally distributed (Shapiro–Wilk test, pb0.05). Thedata were log10-transformed in order to meet normality. The level ofsignificance was set at α=0.05.

3. Results and discussion

3.1. Congener patterns and levels

PBDEs were found in all the samples analyzed (Table 1). Of the 28 different PBDEcongeners measured in this study, 17 were in at least 50% of the white stork eggs. Thefollowing fifteen congeners were found in both colonies: BDE-154,-183,-196, -197,-198, -199, -200, -201, -202, -203, -204, -206, -207, -208, and 209. Interestingly, 12 ofthese 15 congeners contained 8 or more bromine atoms which had only been scarcelyreported in wildlife to date. It is also worth noting that BDE-47, -99,-100, and -153,often dominant in biological samples, were not detected in some samples (Table 1). Thestudy of the relative contributions of PBDEs revealed amarked presence of deca-, nona-,and octa-BDEs in comparison to the rest of congeners (Fig. 2). Specifically, 70% and 87%of BDE congeners from DNP and the Madrid colony, respectively, had 8 or morebromine atoms. Of special relevance is the contribution of BDE-209 which has beenpreviously reported in terrestrial food webs. In this study, however, not only was itdetected in over 95% of the eggs analyzed but it also accounted for the highestcontribution to the total PBDE content in both colonies.

Theaverageconcentration for total PBDEs inwhite storks fromDNPwas1.64 ng/gw.w.(median value, 0.832 ng/g), ranging between 0.214 and 9.50 ng/g. The levels found for

tions (ng/g w.w.) in white stork eggs from the colonies of Madrid and DNP. ND: Not

Madrid (n=10)

ntageNLOD Mean Median Range PercentageNLOD

0.0003 0 ND–0.003 10ND ND ND 00.107 0.111 ND–0.150 90

5 0.0009 0 ND–0.008 100.008 0 ND–0.069 200.089 0 ND–0.311 300.034 0 ND–0.114 300.086 0 ND–0.389 300.161 0.156 0.009–0.259 1000.690 0.629 0.309–1.24 100ND ND ND 00.003 0.007 ND–0.020 300.086 0.081 ND–0.146 88.9

5 ND ND ND 00.703 0.553 0.166–1.60 1000.638 0.521 ND–1.27 88.90.286 0.153 0.064–0.840 1000.224 0.158 ND–0.505 88.90.105 0.087 0.023–0.292 100

0 ND ND ND 00.218 0.126 0.036–0.952 1001.47 1.20 0.435–3.85 1000.657 0.498 0.157–1.91 1003.50 2.71 0.603–8.46 1009.08 6.59 2.79–20.5

Fig. 2. PBDE congener profiles of both colonies of white stork. Error bars represent 25 and 75 percentiles.

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the Madrid colony were significantly higher (pb0.001), with an average concentration of9.08 ng/gw.w. (median value, 6.59 ng/g) for total PBDEs and ranging from 2.79 to 20.5 ng/g. Since a positive correlation between PBDE levels and the degree of urbanization andindustrial development has been previously described (Chen et al., 2008), these resultswere a priori expected given the differences in the levels of anthropogenic influencesbetween the two sites (i.e. rural vs. urban/industrial). To the best of our knowledge, thereare no previous studies reporting PBDE concentrations in white storks, making itimpossible to evaluate temporal trends within this species. In addition, it is important tonote that these eggswerenot collected in the sameyear—theeggs fromDNPwere collectedduring the breeding seasons of 1999–2001 and those from the Madrid colony weresampled in 2005. However, concentrations of PBDEsmeasured in the stork eggs from bothcolonies are within the range reported for eggs of other avian species of the Europeancontinent having lower and higher trophic positions than thewhite storks. Concentrationsin thewhite stork eggs were similar to the concentrations reported in the eggs of the greattit (0.36–12.1 ng/gw.w.),which is a species at a lower trophicposition and that consumes astrictly terrestrial diet of invertebrates and plant parts (Van den Steen et al., 2009).Compared to PBDE concentrations in the peregrine falcon eggs (77–406 ng/g w.w.), aspecies that has one of the highest trophic positions since it consumes other avian species,PBDE levels in the eggs of the storks were lower (Herzke et al., 2005).

In light of these values, it seems likely that PBDE levels for white storks are partiallyrelated to their relative position in the food web. Nevertheless, the possible influence ofdifferent PBDE mixture uses in different areas cannot be disregarded.

3.2. Differences among colonies

There were distinct differences between the two colonies in relation to thecontribution of each homolog group to the total ΣPBDEs (Fig. 3). Contrasting with thehigher BDE-209 burden in the Madrid colony, the ratio [BDE-209]/[octa- and nona-BDEs]was 0.8 for the Madrid colony and 1.7 for the DNP colony. These differences may beattributed to different dietary habits or metabolic rates of these two colonies. Since bothcolonies aremadeupof the same specieswith different dietary habits, it ismore likely thatdiet was the main factor contributing to these differences. This hypothesis is alsoconfirmed by the congener pattern observed for lower brominated BDE congeners. A

Fig. 3. Relative contribution of each PBDE homolog group to ΣPBDEs in each colony.

higher abundance of congeners such as BDE-47, -99, -100, -153, and -154 have beengenerally found in most aquatic food webs in comparison to terrestrial food webs. This isthe particular case formost of these lower BDE congeners for DNP storks in comparison tothe Madrid specimens (Figs. 2 and 3). It is known that white storks from Madrid mainlyfeed at garbage dumps, whereas white storks from DNP partially feed on aquaticvertebrates and invertebrates (e.g. crayfish). Therefore, these differences for lowerbrominated BDE congeners between the two colonies are more likely to be related to dietrather than to the use of different technical PBDE mixtures.

3.3. BDE-209. Bioaccumulation and debromination

BDE-209 has been previously reported as the dominant congener in someterrestrial species such as red foxes (Voorspoels et al., 2006) and grizzly bears(Christensen et al., 2005). To date, BDE-209 has been only detected as the dominantcongener in some terrestrial birds of prey in China (Chen et al., 2007; Gao et al., 2009)and the United States (Park et al., 2009). In this study, the BDE-209 contribution to thetotal PBDE content was as high at 38.6% and 44.1% for theMadrid and DNPwhite storks,respectively. This is a remarkable finding that supports growing evidence that BDE-209is bioavailable and has a tendency to bioaccumulate in some terrestrial species. Ourresults also agree with those reported by Chen et al. (2007) who found that amongthose species for which BDE-209 accounted for the highest contribution, the mostcontaminated birds showed the lowest BDE-209 relative burdens. The relativecontribution of BDE-209 in DNP white storks is statistically higher (pb0.001) thanthat of Madrid white storks, whereas the ΣPBDEs is statistically greater for the latterbirds. This finding, however, contrasts with data reported by Park et al. (2009), whofound not only greater PBDE contents in urban peregrine falcons but also greater BDE-209 contributions. In that study, the authors support their findings postulating a directuptake of BDE-209 in urban foodwebs based on fewer biological transfers. According tothis hypothesis, fewer biological transfers would indicate a less preferential uptake oflower brominated BDEs in comparison to BDE-209. While this may be correct, in thecase of the white stork, a higher relative content of BDE-209 corresponds to a lowerrelative content of nona-BDEs and vice versa. Again, this distinction between the twowhite stork populations is likely to be associated with uptake differences rather thandissimilar metabolic rates.

The detection of some of the higher BDE congeners may serve to further supportthe existing evidence for BDE-209 biodegradation or/and environmental debromina-tion. Thus, the congener profile found in the white storks for the debrominationproducts BDE-207NBDE-208NBDE-206 differed from the congener profiles describedfor the technical octa-BDE (BDE-207NBDE-206NBDE-208) and deca-BDE formulation(BDE-206NBDE-207NBDE-208) (La Guardia et al., 2006). Moreover, it also differedfrom the common profile found in abiotic matrices where BDE-206 is detected as thedominant nona-BDE congener (Holden et al., 2009). Our results are in agreement withdata reported for eggs from US peregrine falcons (Chen et al., 2008) and Europeanstarlings in a BDE-209 exposure study (Van den Steen et al., 2007), suggesting that partof these nona-BDE congeners may stem from either biodegradation or simpledebromination of BDE-209. The congener BDE-202 was detected in all and about 83%of the egg samples from theMadrid and DNP colonies, respectively. The presence of thiscongener has never been reported in any commercial PBDE mixture (Stapleton et al.,2006). Ruling out this technical origin, the detection of BDE-202 in the white stork eggsstudied may result from two different sources as follows: (i) debromination of BDE-209in the environment and subsequent uptake and bioaccumulation and/or (ii) as ametabolic product of higher BDE congeners. BDE-202 has been found previously inother studies on biota and postulated as a BDE-209 debromination product(Christensen et al., 2005).

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3.4. Toxicological considerations

It is known that, in general, for birds and other oviparous species, the transfer fromthe mother to eggs of those contaminants with low Kow is favored over thosecompounds with a higher Kow value (Wu et al., 2009). Other parameters such as themolecular geometry and size, the degree of halogenation, or the rate of metabolismgreatly influence the transfer as well. As a result, each group of organohalogencompounds may exhibit a different behavior in the maternal transfer. Specifically forPBDEs, it has been described how the transfer of the higher brominated BDE congenersis hindered in glaucous gulls (Verreault et al., 2006). Assuming a similar outcome in thematernal transfer for white storks, the relative weight of octa-, nona-, and deca-BDEsinto the total PBDE content of adult white storks could be greater than what has beendetected in eggs.

Several studies exist that have found a negative correlation between ΣPBDEs andreproductive success in different bird species (Fernie et al., 2009). The concentrationsfound for both colonies of white stork in this study are far below the suggestedthreshold of 1000 ng/g associated with reduced reproductive performance in ospreys(Henny et al., 2009). Nevertheless, the different interspecies sensitivity towardscontaminants cannot be ignored. This, together with the increasing evidence ofbioaccumulation and debromination of the higher brominated BDE congeners, shouldbe an element taken into account to further support worldwide restriction/regulationpolicies on the deca-BDE technical formulation.

4. Conclusions

The present study emphasized BDE burdens dominated by thehigher BDEcongeners in two colonies ofwhite stork fromdifferent areasof Spain. The contributionof BDE-209was remarkably high inbirds fromthese two colonies, afinding scarcely reported todate. The abundanceofother higher BDEs, such as nona-BDEs, was markedly different in bothcolonies, suggesting distinctly different uptake of the congeners thatwas likely heavily influenced by dietary differences between the twocolonies. The congener profile BDE-207NBDE-208NBDE-206, alongwith the presence of BDE-202, found in thewhite stork eggs analyzed inthis study further supports the hypothesis that BDE-209 undergoesbiodegradation or/and environmental debromination to lower BDEcongeners. Results from this study contribute to increase the environ-mental information on DecaBDE and therefore could help to supportdecisions to ban or phase out the deca-BDE formulation.

Acknowledgments

The authors would like to thank EGMASA, CSIC (Project Intramuralde Frontera Ref. 200680F0162), and the Regional Government ofMadrid (Project P-AMB-000352-0505) for their financial support.Dr. Sáez acknowledges her postdoctoral contract through project P-AMB-000352-0505.

Appendix A. Supplementary data

Supplementary data to this article can be found online atdoi:10.1016/j.envint.2010.11.013.

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Dechlorane plus and possible degradation products in white stork eggs from Spain

Juan Muñoz-Arnanz a, Mónica Sáez a, Fernando Hiraldo b, Raquel Baos b, Grazina Pacepavicius c,Mehran Alaee c, Begoña Jiménez a,⁎a Department of Instrumental Analysis and Environmental Chemistry, Institute of Organic Chemistry, CSIC. Juan de la Cierva 3, 28006 Madrid, Spainb Department of Applied Biology, Doñana Biological Station, CSIC. Avda. Américo Vespucio s/n, 41092 Sevilla, Spainc Aquatic Ecosystem Protection Research Division, Environment Canada, 867 Lakeshore Road, P.O. Box 5050, Burlington, Ontario, Canada L7R 4A6

⁎ Corresponding author.E-mail address: bjimenez@iqog.csic.es (B. Jiménez).

0160-4120/$ – see front matter © 2011 Elsevier Ltd. Aldoi:10.1016/j.envint.2011.03.025

a b s t r a c t

a r t i c l e i n f o

Article history:Received 2 February 2011Accepted 31 March 2011Available online 6 May 2011

Keywords:DPEggsBirdsWhite storkDoñana National ParkSpain

The occurrence of the emerging chlorinated flame retardant Dechlorane Plus (DP) and three of its possibledegradation products was investigated in white stork eggs from two colonies in Spain. The average DPconcentrations were 401 pg/g wet weight (w.w.) for the urban/industrial colony and 105 pg/g w.w. for the ruralcolony. One possible degradation product, anti-[DP-1Cl], was found in approximately 10% of the samples. Nosignificant stereoisomer enrichments were detected in any colony based on the average anti-DP fractionalabundances found which agrees with previous studies in herring gulls. The relationship between DP and PBDEcontents in both colonies was explored leading to different scenarios, i.e. no correlation was found in the urbancolony but theywere statistically correlated in the rural colony. To the best of our knowledge, this is thefirst studyto report DP in a species from a terrestrial food web, and also to report a DP degradation product in biota.

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© 2011 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1. Introduction

Stricter policies have been placed on some brominated flameretardants (BFRs) such as polybrominated diphenyl ethers (PBDEs)which were recently included in the Stockholm Convention onPersistent Organic Pollutants (United Nations Environment Pro-gramme, UNEP, 2009). There are, however, other FRs that areextensively used that remain unregulated. This is the case ofDechlorane Plus (DP, C18H12Cl12, CAS-13560-89-9), which was firstsynthesized in the late 1960s as a substitute for Dechlorane or Mirex(C10Cl12). DP has since been used in commercial polymeric productssuch as cable coatings, electronic connectors and plastic roofingmaterials (Hoh et al., 2006). Currently, DP is an unregulated FR, eventhough it is considered to be a high production volume (HPV)chemical and thereby subject to the United States EnvironmentalProtection Agency's HPV challenge (US Environmental ProtectionAgency, 2010). Its current use may increase since it has been recentlyregarded as a possible replacement for the Deca-BDE mixture in theEuropean Union (The European Commision, 2007).

Technical DP is synthesized by a Diels–Alder reaction between 2equivalents of hexachlorocyclopentadiene and 1.5 equivalents of 1,5-cyclooctadiene to form two stereoisomers: syn- and anti-. It is sold in threedifferent commercial mixtures: DP-25, DP-35 and DP-515. These threeformulations share a similar syn-: anti-isomer composition differing from

each other in their particle size (Wu et al., 2010). There is little publishedinformation about the toxicity of DP other than the report provided by itsonly manufacturer in the US (OxyChem, Niagara Falls, NY) whichhighlights some ecotoxicological effects in fish and potential effects onrabbit reproduction, such as increase of liver and ovary weights (USEnvironmental Protection Agency., 2004).

The environmental presence of bothDP isomerswasfirst reported in2006 in air and sediment from the Great Lakes (Hoh et al., 2006). Sincethen it has been further reported in air (Ren et al., 2008; Venier andHites, 2008), sediment (Qiu et al., 2007; Sverko et al., 2008), tree bark(Qiu andHites, 2008), household dust (Zhu et al., 2007), biota (Gauthieret al., 2007; Gauthier and Letcher, 2009; Ismail et al., 2009; Kang et al.,2010; Shi et al., 2009; Tomy et al., 2007, 2008; Wu et al., 2010), andhumans (Ren et al., 2009). These findings suggest that despite its size(654 Da) and its high lipophilicity (log Kow=9.3), DP is a ubiquitousspecies, that is bioavailable and bioaccumulative to a certain extent.Moreover, a different biomagnification potential for each of the DPstereoisomers has been observed in aquatic food webs (Tomy et al.,2007, 2008;Wuet al., 2010)which is likely related to the differentwatersolubility and environmental degradation potential of each isomer (Wuet al., 2010). Furthermore, recent studies have reported the presence ofDP degradation products either by dehalogenation or retro-Diels–Alderprocesses (Sverko et al., 2008, 2010).

Despite the increasing number of recent scientific publications theknowledge about the environmental occurrence, behavior and fate ofDP is still limited (Wu et al., 2010). The purpose of this study was toshed some light on the current knowledge gap in the occurrence of DPand some of its possible degradation products in biota from terrestrial

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foodwebs. Most studies dealing with DP in biota have been conductedon aquatic ecosystems (Gauthier et al., 2007; Gauthier and Letcher,2009; Ismail et al., 2009; Kang et al., 2010; Shi et al., 2009; Sverkoet al., 2010; Tomy et al., 2007, 2008; Wu et al., 2010) and to ourknowledge this is the first study on DP conducted on a species with amainly terrestrial diet.

The present work was focused on the white stork (Ciconia ciconia)from two different colonies in Spain. Previous studies have demonstrat-ed that this species, as a top predator, could be used as a suitable sentinelspecies for the monitoring of persistent organic contaminants indifferent habitats (Muñoz-Arnanz et al., 2008, 2011). Specifically,differences in content and DP isomeric profiles were investigated ineggs obtained fromwhite storkswith different foraging areas. One of thecolonies, near the city of Madrid (Spain), was selected as representativeof an urban and industrial area. The other colony, Doñana National Park(DNP),was selected as an example of an ecologically sensitive rural area,far from urban and industrial influences, and sanctuary for numerousbird species in south-western Spain.

2. Materials and methods

2.1. Sample collection

A total of 33 failed eggs of white stork were obtained from twodifferent colonies located in Doñana National Park (south-westernSpain) and Madrid (central Spain) (Fig. 1). Further details about thesampleswere described in a previouswork (Muñoz-Arnanz et al., 2011).

2.2. Analytical procedure

The whole egg content was lyophilized and quantities of approx-imately 2 g were used for residue analysis. Lipid content of each samplewas determined gravimetrically as described elsewhere (Muñoz-Arnanz et al., 2011). Briefly, the extraction consisted of a matrix solidphase dispersion (MSPD)-based procedure. Further clean-upwas basedon acid and basic silica gel multilayer columns and a final fractionationusing Carbon (Supelclean Supelco ENVITM-Carb) was carried out inorder to obtain three analytical fractions. The first fraction containedthe bulk of PBDEs, ortho-PCBs and DDTs, whereas the second and thirdfractions contained non ortho substituted PCBs and PCDD/Fs, respec-tively. Tomy et al. (2007) and Wu et al. (2010) found that DP wasextracted in a similarmanner and efficiency as PBDEs; therefore DPwasanalyzed in the first fraction of all egg samples. The second and third

Fig. 1. Geographic location of the white stork colonies studied. DNP stands for DoñanaNational Park.

fractions were analyzed in several samples to confirm the absence ofDP.

2.3. Chemicals

The following standards were purchased from Wellington labora-tories (Guelph, Ontario, Canada): DP stereoisomers, syn- and anti-, DPmonoaduct 1,5-DPMA, DP suggested dechlorinated degradates anti-[DP-1Cl] and anti-[DP-2Cl] (Fig. 2), and injection standards

13C12-

labeled BDE-138 and -139. Acetone and toluene purchased from SDS(Peypin, France) and n-hexane purchased from Merck (Darmstadt,Germany) were of Pestipur or equivalent grade.

2.4. Analytical determination

Both DP stereoisomers, syn- and anti-, 1,5-DPMA, anti-[DP-1Cl]and anti-[DP-2Cl] were analyzed by high resolution gas chromatog-raphy high resolution mass spectrometry (HRGC–HRMS) using aMicromass Autospec Ultima coupled to an Agilent6890 GC equippedwith a CTC A200s autosampler. The GC injection port was configuredfor 1 μL split/splitless injections at a temperature of 280 °C. Gaschromatographic separation prior to MS was achieved using a15 m×0.25 mm×0.10 μm DB5HT column (J&W Scientific, USA).TheGC column was maintained at 100 °C for 2 min, then ramped at 25 °C/min to 250 °C, ramped at 1.5 °C/min to 260 °C, ramped at 25 °C/min to325 °C and held for 10 min. Helium was used as the carrier gas inconstant pressure mode. Sample ionization was performed byelectron ionization (EI) at an electron voltage ranging from 30 to40 eV depending on the optimization parameters of the instrument.Source and transfer line temperatures were both set at 280 °C and theresolving power of the analyzer was 10,000. The identification oftarget compounds was based on detection, at the correspondingretention time, of the following pairs ofm/z ions: 271.82102/273.8072(syn- and anti-DP), 237.8492/235.8521 (anti-[DP-1Cl]), 203.8881/201.8911 (anti-[DP-2Cl]), 381.9012/379.9041 (1,5-DPMA). The peakswere quantified when the isotope ratio between the two monitoredions was within 20% of the standard value. In our study, all sampleswhere dechloranes were found above their LOQ, the isotopic ratio wasconsistently under 15% of the theoretical value. The LOQ wascalculated based on a signal-to-noise ratio of 10. The average LOQcalculated for each DP isomer in the analyzed samples was 0.786 pg/gand 0.539 pg/g for the anti- and syn-isomer, respectively.

Quality criteria were based on the application of quality controland quality assurance measures, which included the processing andanalysis of method blank samples subjected to the complete analyticalprocedure. DP isomers were detected above their LOQs in mostprocedural blanks. The measured levels were subtracted from thecorresponding batch of samples associated to each blank. Care wastaken to minimize exposure to UV light throughout the wholeanalytical procedure.

2.5. Data analysis

All concentrations are given in wet weight (w.w.). For comparativepurposes, the mean lipid content was 7.32±0.96% in the eggs fromDNP and 7.18±0.73% in the eggs from Madrid. Statistical analyseswere carried out with SigmaPlot for Windows version 11.0 (SystatSoftware Inc, CA, USA). Concentration data were not normallydistributed even after log-transformation (Shapiro–Wilk test,pb0.05). Therefore, a Mann–Whitney test was performed to comparecontaminant levels between both colonies of white storks, and linearcorrelations between contaminant burdens were expressed asSpearman's rank correlation coefficients (rs) where the α forsignificance was set at 0.05.

Fig. 2. Structures of Dechlorane Plus (DP), anti-DP, syn-DP, [DP-1Cl], [DP-2Cl] and 1,5-DPMA (Dechlorane Plus monoadduct).

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3. Results and discussion

3.1. Levels of DP and degradates

Dechlorane Plus was found in all the eggs analyzed (Table 1). The averageconcentration for total DP in white storks from DNP was 105 pg/g w.w. (median value84.6 pg/g), ranging between 2.58 and 468 pg/g. The levels found for the Madrid colonywere significantly higher (Mann–Whitney, p≤0.001), with an average concentration of401 pg/g w.w. (median value 306 pg/g) for total DP ranging from 56.8 to 1400 pg/g.Based on the nature of products in which DP is employed, and similarly to what hasbeen previously described as well for PBDE and PCB contents (Van den Steen et al.,2009), higher levels in urban than in rural environments were a priori expected. In theurban colony, a 4-fold higher DP average concentration was observed. Similar resultswere reported on a survey on air samples in China, where themean DP concentration inurban areas was about 5 times higher than that in rural areas (Ren et al., 2008).

Table 1Average, median, range and detection frequencies of syn- and anti-DP, anti-DP fractional abunthe colonies of Madrid and DNP. ƒanti are provided with their standard deviations (±SD) sin

Madrid (n=10)

Average Median Range %N

Total DP 401 306 56.8–1400 10anti-DP 267 203 bLOQ–1010 9syn-DP 134 113 bLOQ–383 9ƒanti (±SD) 0.64 (±0.07) 0.65 0.55–0.73 –

ΣPBDEs 9080 6590 2790–20500 10

DP concentrations inwhite storks werewell below values found in herring gull (Larusargentatus) eggs from theLaurentianGreat Lakes, theonlybird species inwhichDP levels ineggs have been reported up to date. The average DP concentration for these herring gullcolonies ranged between 1500 and 4500 pg/g w.w. (Gauthier et al., 2007). The fact thatherring gulls are an aquatic species and white storks, a mainly terrestrial species maypartially account for the DP concentration differences observed. Moreover, the coloniesfrom the Laurentian Great Lakes are geographically located in the proximity of a DPmanufacturing plant and thereforemore likely are exposed to higher environmental levelsof this chemical. Additionally, presently unknown DP bioconcentration and bioaccumula-tion effects may be involved.

Neither the retro-Diels–Alder product 1,5-DPMA nor the dehalogenation product anti-[DP-2Cl] were detected above their quantification limits in any sample. The other DPdehalogenation product investigated in this study, anti-[DP-1Cl], was found in about 10% ofthe samples from each colony. To the best of our knowledge, the average concentrations of2.35 pg/g in DNP and 0.548 pg/g in Madrid are reported here for the first time in biota.

dance values (ƒanti) and total PBDE concentrations (pg/g w.w.) in white stork eggs fromce they follow normal distributions. PBDEs data from Muñoz-Arnanz et al. (2011).

DNP (n=23)

LOQ Average Median Range %N LOQ

0 105 84.6 2.58–468 1005.6 73.0 56.7 0.59–345 1001.3 40.6 29.2 2.44–135 100

0.66 (±0.12) 0.68 0.40–0.87 -0 1640 830 210–9500 100

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3.2. Isomeric DP ratios

Syn- and anti-DP were quantified in about 96 and 91% of the samples from DNP,respectively. Both stereoisomers were detected and quantified in all the samples fromMadrid. In order to study the possible stereoselective enrichment of DP isomers, thefractional abundance of the anti-isomer (ƒanti) was calculated as ƒanti=[anti-DP] /([anti-DP]+[syn-DP]). The average values for ƒanti=0.66±0.12 for DNP was similar tothat calculated for Madrid ƒanti=0.64±0.07. In addition, these results were similar tothe technical DP value of ƒanti=0.65 reported by Tomy et al. (2007). Nevertheless, adifferent value has been reported by Hoh et al. (2006) for technical DP whereƒanti=0.75-0.80. According to these data, and depending on the technical valueconsidered, it appears that, if any, only a slight enrichment of the syn-isomer could havetaken place through the food web of the white stork in both study areas. This situationis also similar to the stereoisomer enrichment described in eggs of herring gulls withƒanti=0.69±0.08 (Gauthier and Letcher, 2009).

Previous reports in the literature suggested that the anti- isomer would be morereactive and thereby susceptible to biological attack based on it less hindered spatialconformation (Hoh et al., 2006). In addition, it has been demonstrated that the anti-isomer degrades faster under UV light than the syn-isomer (Sverko et al., 2008).However, different stereoisomer enrichments have been found throughout differentaquatic food webs. Tomy et al. (2007) have described an anti-isomer biomagnificationthrough the food web of Lake Winnipeg and at the same time the absence of astereoisomer biomagnification in the food web of Lake Ontario. On the contrary, Wuet al. (2010) have described a net syn-enrichment through the food web from areservoir close to an electronic waste recycling site in south China.

3.3. DP vs PBDEs

PBDE levels in eggs of both white stork colonies were analyzed in a previous study(Muñoz-Arnanz et al., 2011). Similarly, to what has been described for DPconcentrations, the average concentration of PBDEs was about 5.5 times higher insamples from Madrid compared to those of the DNP colony (Table 1). PBDEconcentrations were 1 to 2 orders of magnitude higher than those of total DP. Despitethese differences in concentrations and based on their common nature as flameretardants, a possible correlation between DP and PBDE levels was investigated (Fig. 3).Spearman's rank coefficients for the Madrid colony showed no clear correlation

DNP(n= 22)

rs=0.616

p=0.0023

PBDE Concentration (ng/g w.w.)

0 2 4 6 8 10

Tota

l D

P C

on

cen

trat

ion

(p

g/g

w.w

.)

0

200

400

60010900

11000

Madrid(n=8)

rs=0.214

p=0.578

0 20 120 1300

200

400

600

8001300

1400

1500

Fig. 3. Scatter plots of total DP vs total PBDE contents in both colonies of white stork.

between DP and PBDEs (pN0.05), even after ignoring two samples regarded as outliers.In contrast, a certain correlation was found in the colony of DNP (rs=0.616,p=0.0023). Since DP has been postulated as a possible replacement for the Deca-BDE mixture, the common occurrence of DP and BDE-209 was studied as well. Theresults were almost identical to those found for DP and total PBDE content, i.e. levelswere not correlated in the Madrid colony (rs=0.190, p=0.619) and correlated in thecolony of DNP (rs=0.608, p=0.00352). This was expected as BDE-209 was thepredominant BDE congener in white storks reaching mean contributions of about 38and 44% in the urban and rural colonies, respectively. Currently, there is not enoughevidence to indicate similar bioaccumulation behaviors in biota, and specifically inthese bird species, for these two types of contaminants. However, it is unexpected tofind such a different outcome for the same species depending on the colony. Theseresults might be linked to the ease at which certain flame retardants are released fromcommercial products containing them. Thus, in the city of Madrid where it isreasonable to assume a greater release of FRs in general and of PBDEs in particular, thedifferences between the environmental contents of DP and PBDEs may change acutelyin time leading to non-equilibrium conditions and therefore confounding a clearcorrelation. This could be especially enhanced in the case of a more limited set ofsamples such as the Madrid colony (n=10). On the contrary, DNP is likely to be underthe influence of more diffuse sources of FR contaminants and likely under higherequilibrium conditions. Furthermore, the set of samples for DNP colony is considerablygreater (n=23), which in turn would ease the finding of possible correlations.

4. Conclusions

To the best of our knowledge, in this study, we have described forthe first time the presence of DP in birds from amainly terrestrial foodweb. Both stereoisomers were found with a fractional abundancesimilar to that reported for the technical product. Our findings inwhite stork eggs are in contrast with stereoisomer enrichmentsdetected in some aquatic food webs. The occurrence of anti-[DP-1Cl]in biota, postulated as a dechlorination DP product, constitutes anadditional and important relevance of our study not previouslyreported yet. It seems that there is growing evidence for DPenvironmental ubiquity, and that the current knowledge about thisFR as a contaminant is still very limited. The levels reported up to datein different environmental matrices tend to be orders of magnitudelower than those of other FRs such as PBDEs. However, currently DP iswidely used and it will likely be used in higher quantities if it is chosenas a replacement for other regulated FRs. There is a need for furtherstudies to gain a better understanding of the environmentaloccurrence, behavior and fate of this chemical.

Acknowledgments

The authors thank EGMASA, CSIC (Project Intramural de Frontera Ref.200680F0162) and the Regional Government ofMadrid (Project P-AMB-000352-0505) for their financial support. Dr. Sáez acknowledges herpostdoctoral contract through project P-AMB-000352-0505. The Moni-toring team (ICTS, Reserva Biológica de Doñana, EBD-CSIC) and J.I.Aguirre are thanked for the field sampling.

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Nuria Pastor1, Raquel Baos2, Miguel LoÂpez-LaÂzaro3,Roger Jovani2, Jose L.Tella2, Nabil Hajji1,Fernando Hiraldo2 and Felipe CorteÂs1,4

1Department of Cellular Biology, Faculty of Biology, University of Seville,Avenida Reina Mercedes no. 6, 41012 Seville, Spain, 2Department ofApplied Biology, EstacioÂn Biologica de DonÄana, CSIC, Spain and3Department of Pharmacology, Faculty of Pharmacy, University of Seville,Spain

A total of 330 white storks (Ciconia ciconia) and 138 blackkites (Milvus migrans) were blood sampled during fourconsecutive years in an area heavily contaminated as aconsequence of a massive spillage of toxic acid miningwaste rich in heavy metals that impacted on the DonÄanaNational Park (south western Spain), in April 1998. Thealkaline single cell gel electrophoresis (Comet) assay wasperformed as a genotoxicity test, in order to assesswhether the high level of DNA damage ®rst detected by us1 year after the disaster was still present in birds in eachof the successive 3 years. Our results clearly show that,when compared with control individuals from non-pol-luted areas, white storks and black kites born in the con-taminated area for a period of up to 4 years after the toxicaccident have suffered an increase of at least 2- to 10-foldin the level of their genetic damage through the study per-iod. Taken as a whole, these observations seem to indicatethat the toxic spill still appears to be affecting the wildlife4 years after the mining disaster and that attempts atcleaning up the waste have proved ineffective based onDNA damage detection.

Introduction

The spill of toxic acid mining waste from the processingof pyrite ore in Aznalcollar (south west Spain) in April1998 has been considered as one of the worst environ-mental disasters to have ever happened in western Europe,posing a threat to the DonÄana National Park. Many birdspecies, including protected ones, use this Reserve of theBiosphere (designated as such in 1981) as a breeding andwintering site, making it one of the most important wildlifesites in Europe (Grimalt et al., 1999).

Ecologically sensitive areas surrounding the marshlandsof the park were ¯ooded with acidic mud rich in heavymetals brought by the river Guadiamar, causing consistentdecreases in pH. In addition to the presence in thecontaminating sludge waste of high levels of heavy metalssuch as arsenic, cadmium, lead, copper and zinc, the acidconditions facilitated the solubilization of these metals,leading to water concentrations lethal to aquatic wildlife(Pain et al., 1998).

When monitoring for genotoxicity in the environment isneeded, an issue of major importance is the selection of

representative organisms as sentinels as well as the develop-ment of sensitive and reliable tests such as those designed forthe evaluation of DNA damage. Regardless of the possibleunique features of the contamination event, it is also veryimportant that the assays of choice have been widely validatedby different laboratories and can be used to monitor virtuallyany potentially endangered wild species.

As to the selection of sentinel organisms, the white stork(Ciconia ciconia) and the black kite (Milvus migrans) areappropriate bird species for evaluating the potential effects ofthe toxic spill on wildlife of the DonÄana area, because they arelong-lived species that occupy a high position in the aquaticand terrestrial trophic webs, respectively. While white storksusually prey on a variety of invertebrate and vertebrate speciesin marshlands (Negro et al., 2000), black kites do so mainly onvertebrates, such as rabbits (Veiga and Hiraldo, 1990). Diet isone of the most important factors explaining the accumulationof heavy metals readily observed in wetland birds in the areaaround DonÄana within a few months after the spill (HernaÂndezet al., 1999; Benito et al., 1999). As many of these heavymetals, such as As, Pb, Cd, Cu and Hg, have been reported asgenotoxic, mutagenic and even carcinogenic (LeBlanc andBain, 1997; Yager and Ostrosky-Wegman, 1997), we carriedout an investigation 1 year after the toxic spill on the possiblelevel of genotoxic damage present in white storks (Pastor et al.,2001a) and black kites (Pastor et al., 2001b) born in and aroundthe affected area.

The alkaline single cell gel electrophoresis (SCGE) orComet assay (Singh et al., 1988) was performed onperipheral blood lymphocytes from young birds sampled inthe contaminated area and compared with referenceanimals, since this test has been demonstrated as suitableto detect genotoxic DNA damage in such different systemsas onion roots (Navarrete et al., 1997), trout (Belpaemeet al., 1996), mussels (Wilson et al., 1998) and differenttissues of mice (Miyamae et al., 1998). The Comet assayhas a number of clear advantages that make it a test ofchoice in environmental studies. While classical cytogenetictechniques, such as detection of chromosomal aberrationsor sister chromatid exchanges, have been useful in manyinstances, the large number of small chromosomes thatmake up the karyotype of many animals (mainly ®sh,reptiles and birds) has clearly made these methods useless.The main advantage of the Comet assay stems from itsindependence of cell division (an unavoidable prerequisitefor cytogenetic techniques) as well as the possibility ofmeasuring DNA damage in single cells, which in turnallows the assessment of inter-individual variations in acell population.

In an early study, the analysis of individual cells (comets)from storks and kites born in the DonÄana area indicated a highlevel of genotoxic damage, as shown by a signi®cant increase

4To whom correspondence should be addressed. Tel: +34 95 4557039; Fax: +34 95 4610261; Email: cortes@us.es

A 4 year follow-up analysis of genotoxic damage in birds of theDonÄana area (south west Spain) in the wake of the 1998 mining wastespill1

Mutagenesis vol. 19 no. 1 pp. 61±65, 2004 DOI: 10.1093/mutage/geg035

Mutagenesis vol. 19 no. 1 ã UK Environmental Mutagen Society 2004; all rights reserved. 61

in DNA migration observed in cells from exposed animals,compared with that seen in control animals sampled in non-contaminated areas (Pastor et al., 2001a,b). The present reportdescribes the results from a 4 year follow-up investigation inthe same areas and shows an increase in the previously reportedharmful effects of genotoxicants in this threatened importantwildlife reserve.

Materials and methods

Collection sites and birds sampled

Blood sampling ®eldwork was conducted in successive yearsfrom 1999 to 2002 in the Dehesa de Abajo, where one of thelargest colonies of storks from the Western Palearctic is sited(~300 breeding pairs). This colony is located less than 1 km

Fig. 1. Average tail moments of white stork (left column) and black kite (right column) nestlings sampled during four consecutive years after the mining wastetoxic spill around DonÄana National Park (south west Spain). The y-axis indicates the number of individuals within each category of average tail moment.Sample sizes (n) are indicated for each species and year. Control values were in all cases signi®cantly lower, mainly located in the interval 0±0.05, i.e. at least~10- to 20-fold lower than that found in birds sampled at or near the contaminated area (not shown).

N.Pastor et al.

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from the area affected by the toxic spill in April 1998 (seePastor et al., 2001a for a map of the study area). Black kiteswere sampled in and around the DonÄana National Park (Foreroet al., 1999), in the vicinity of the contaminated area. Between1 and 4 nestlings in the case of storks and 1 and 3 kite nestlingsper nest were sampled 10±15 days prior to ¯edging. A total of330 storks and 138 kites were sampled for comet analysisthrough the study period.

Sex is a factor that has been claimed to be related to theaccumulation of some metals in birds from DonÄana a fewmonths after the spill (Benito et al., 1999). Both sexes of whitestorks and black kites look alike, so gender was determined bymolecular procedures using DNA extracted from the cellularfraction of a few drops of blood (Negro et al., 2000). Inaddition, we investigated whether nestling age is a possiblesource of individual variation. Birds were aged according to aregression equation for age on the length of the wing for storks(see Negro et al., 2000). Data for the seventh primary featherlength were ®tted to a least squares linear regression for eachindividual in order to age kite nestlings (VinÄuela andBustamante, 1992).

Blood sampling and lymphocyte preparation

Blood collection from birds and lymphocyte isolation werecarried out as reported elsewhere (Pastor et al., 2001a,b).Brie¯y, blood samples (1 ml) were collected from the brachialvein, placed in vials (Soria Greiner, Spain) with EDTA as ananticoagulant and transported in coolers to the laboratory onthe day of collection. Isolation of lymphocytes was performedby centrifugation in a density gradient (2000 r.p.m., 30 min)using a lymphocyte separation medium (Ficoll-Paque;Seromed). Finally, cells were washed in phosphate-bufferedsaline (PBS) and lymphocyte concentrations were adjusted to~105 cells/ml PBS.

Comet assay

The protocol of Singh et al. (1988) was basically followed,with some modi®cations to make it suitable for birdlymphocytes, as reported elsewhere (Pastor et al., 2001a,b).In short, the standard slides were immersed vertically in 1%normal melting point agarose (NMA) at 55°C and left verticalto allow the agarose to solidify. The slides were then kept at4°C until they were used.

About 10 000 lymphocytes from each bird were mixed with85 ml of low melting point agarose (LMA) (0.7% in PBS)(FMC) at 37°C and then the cell suspension was rapidlypipetted onto the ®rst agarose layer, spread using a coverslipand kept at 4°C for 8 min for the LMA to solidify.Subsequently the coverslips were removed and a third layerof 100 ml LMA (0.7%) at 37°C was added, covered with acoverslip and again allowed to solidify at 4°C for 8 min. Afterthe top layer of agarose had solidi®ed, the slides wereimmersed in a chilled lysing solution made up of 2.5 MNaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris±HCl, 1% sodiumsarcosinate, pH 10, with 1% Triton X-100 and 10% DMSOadded just before use. They were kept at 4°C in the dark for atleast 1 h to lyse the cells and to allow DNA unfolding.

After removing the slides from the lysis solution, they weresubsequently drained and placed on a horizontal gel electro-phoresis unit, side by side. The slides were then covered withchilled fresh alkaline solution (1 mM Na2EDTA, 170 mMNaOH) at 4°C and pH 12.8, which allows the detection of bothdouble- and single-strand breaks as well as alkali-labile sites(Fairbairn et al., 1995). Before proceeding with electrophor-

esis, the slides were maintained in the solution for 20 min toallow unwinding of the DNA. Finally, electrophoresis wascarried out at low temperature (4°C) for 20 min at 1.6 V/cm and300 mA. In order to prevent additional DNA damage due tophotolysis, all steps described above were carried out underyellow light or in the dark.

The last steps after electrophoresis consisted of gentlywashing the slides in neutralization buffer (0.4 M Tris±HCl, pH7.5) to remove alkali and detergent and staining with 50 mlDAPI (5 mg/ml) in Vectashield (H-1000 mounting medium for¯uorescence; Vector Laboratories).

Fifty randomly selected lymphocyte comet images wereanalyzed from each sampled bird. The slides were examined at2003 magni®cation using a 203 objective on a ¯uorescencemicroscope (Olympus Vanox AHBT3, excitation ®lter 550 nmand barrier ®lter 590 nm). Measurements were made usingCASys image analysis software (Synoptics Ltd, UK) and theparameter chosen was tail moment (tail length 3 tail intensityor percent migrated DNA) (Olive et al., 1990).

Statistical analysis

Individual average tail moments were log-transformed to attainnormality, thus allowing the application of parametric statis-tics. Since genotoxic damage could be in¯uenced by bothcommon parents and rearing conditions, we considered siblingsas non-independent analysis units. We therefore used nestidentity as a random factor in generalized linear mixed models(GLMMs) with a normal distribution and identity link function,using the GLIMMIX macro of SAS (see for example Tellaet al., 2001). In this way, we performed a kind of ANCOVAwhere year and sex were introduced as ®xed factors and age ascovariate. Non-signi®cant effects (P > 0.05) were removed in abackward procedure starting with a saturated model with all thevariables ®tted to average tail moment. Differences in averagetail moment between species were tested for signi®cance usingStudent's t-test.

Results

Most of the stork nestlings sampled near the contaminated areathroughout the ensuing years showed tail moments in theinterval 0.1±0.5 (Figure 1). However, most of the kite nestlingssampled from 2000 onwards were in the interval 1.0±5.0(Figure 1). In both species, especially the black kite, thesevalues are several orders of magnitude higher than thatconsistently observed in control birds, where, on a per yearbasis, the highest tail moments were located in the interval 0±0.05 (Pastor et al., 2001a,b).

Results of the GLMMs showed highly signi®cant effects ofyear on genotoxicity for both white storks (F3,101 = 17.41,P < 0.0001) and black kites (F3,25 = 33.73, P < 0.0001) whilecontrolling for nest of rearing, which also had a signi®canteffect on genotoxicity for both species (C.ciconia Z = 4.62,P < 0.0001; M.migrans Z = 1.85, P = 0.032). This resultindicates that genotoxic damage was more similar betweensiblings born in the same nest than among nestlings born indifferent nests, independent of the year. On the other hand, sexand age of nestlings did not affect their levels of genotoxicity(white storks, all P values >0.16; black kites, all P values>0.11) and thus these variables were not retained in the models.

Looking at inter-year differences in white storks (Figure 1),nestlings sampled in 1999 and 2000 had similar genotoxicburdens in their lymphocytes (F1,101 = 0.32, P = 0.576), butlower than birds sampled in 2001 (F1,101 = 34.69, P < 0.0001)

Genotoxic damage due to a mining waste spill

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and 2002 (F1,101 = 32.55, P < 0.0001). There were no statisticaldifferences in mean tail moments between the 2001 and 2002sampling periods (F1,101 = 0.01, P = 0.932).

In black kites, an abrupt increase in genotoxicity wasdetected from 1999 to 2000 (F1,25 = 96.27, P < 0.0001), whenthe highest damage was recorded (Figure 1). Mean tailmoments in nestlings sampled during 2001 and 2002 weresimilar (F1,25 = 0.49, P = 0.493), but lower than the mean forbirds sampled in 2000 (F1,25 = 19.01, P = 0.0002).

On the other hand, it is worth mentioning that the level ofgenotoxic damage observed in black kites was higher than inwhite storks, regardless of the year considered (P < 0.0001 forall Student's t-test). As Figure 1 shows, kite nestlings are moreseverely affected, with most of the individuals showing thehighest categories of damage.

Discussion

As reported in recent years, the Comet assay (Fairbairn et al.,1995) can be considered a methodology of choice for thedetection of genotoxic damage, especially due to its sensitivityin detecting DNA single-strand breaks and alkali-labiledamage in individual cells (Singh et al., 1988; Gedik et al.,1992). While it is commonly necessary to perform differentmodi®cations depending upon the type of cell chosen, thismethodology has been used in the detection of DNA damageafter in situ exposure to water borne genotoxicants inerythrocytes of ®sh (Pandrangi et al., 1995; Belpaeme et al.,1996), as well as of amphibians (Ralph et al., 1996; Ralph andPetras, 1997). In our pioneer studies, the ®rst to our knowledgeto use the Comet assay in birds (Pastor et al., 2001a,b), weanalyzed DNA damage in peripheral blood lymphocytes fromstorks and kites born in the DonÄana area shortly after a toxicspill of mine waste (April 1998). Our present 4 year follow-upresults indicate that, despite time since the ecological disaster,the exposed stork and kite populations show a consistent andelevated level of genotoxic damage through time as comparedwith reference birds sampled in non-contaminated locations(Pastor et al., 2001a,b). Moreover, levels of DNA damage haveincreased since our early reports (Pastor et al., 2001a,b)(Figure 1). To our knowledge, this is the ®rst long-termmonitoring of genotoxic damage in wild populations of birds,therefore interpretation of our results requires caution in theabsence of published sources dealing with similar cases.

There is unquestionable evidence of the deleterious effectsof metals, such as Fe, As, Pb, Cd, Cu, Zn, Tl and Hg (Fan et al.,1995; LeBlanc and Bain, 1997), some of which (i.e. Cd, Pb andAs) have been reported to be genotoxic, mutagenic and evencarcinogenic (LeBlanc and Bain, 1997; Yager and Ostrosky-Wegman, 1997). Accordingly, it is not unlikely that heavymetals might have played an important role in the protractedhigh level of genotoxic damage observed by us in storks andkites from DonÄana, still present 4 years after the contaminationepisode. In addition to the ingestion of metals in the diet (thebioaccumulation process), soil and sediments become animportant means of exposure (Beyer et al., 1994) for birds,because they may ingest substantial amounts of soil andsediments while feeding. In this regard, despite the immediateremoval of covering sludge from the affected area and soilremediation activities carried out by the Andalusian author-ities, up to February 1999 soils affected by the Aznalcollarmining spill contained signi®cant residual contamination,especially of arsenic (GalaÂn et al., 2002). Sediments from

stretches of the Guadiamar river that pass the stork colony atDehesa de Abajo had an elevated lead content, and isotopiclead identi®cation demonstrated that the spill was the dominantlead exposure source for the white stork chicks born in thiscolony in 1999 (Meharg et al., 2002). Successive clean-upoperations have been shown to be effective and levels of heavymetals and As have been reported as lower in both the bioticand abiotic compartments of the DonÄana ecosystem. In general,metal concentrations in water and sediment from theGuadiamar river and Entremuros marshlands have decreasedsince the spill, although in July 2001 they were still higher thanthose measured at reference points, with some high metal peaksat certain times of sampling, indicating only a partial recoveryof that zone and additional sources of metals not related to thespill (Toja et al., 2003).

Besides the heavy metals present in the DonÄana environmentas a consequence of the accidental toxic spill, other factorshave traditionally threatened the wildlife in this importantreserve of the biosphere (Albaiges et al., 1987). Intensiveagriculture activity, mostly growing rice in the surroundingmarshes, with the use of high levels of pesticides andfertilizers, could have contributed to the present situation, aswell as in the past (HernaÂndez et al., 1987; Rico et al., 1987).

Taken as a whole, the results reported here after gatheringthe data from a 4 year follow-up study give us informationabout the long-term consequences of the DonÄana contamin-ation episode, still apparently damaging the reserve in spite ofthe remedial measures taken so far. The increase in genotoxicdamage observed during the study period cannot be easilyexplained solely on the basis of the heavy metal contamination,mainly because levels have tended to decrease in all of thecompartments potentially involved (sediments, diet, etc.). Inthis regard, analyses of the relationship between individualgenotoxic damage and metal concentrations are essential tohighlight this hypothesis. Determination of aromatic com-pounds in bird samples for the more recent years could alsohelp us ®gure out the origin of the observed damage. Moreover,more investigation is needed on the similarity in genotoxicdamage between nestlings born in the same nest, which couldindicate heritable genetic damage and/or a common diet, withimplications for contaminant accumulation.

Taking into account the high level of genetic damage,sublethal effects such as lower reproductive success or lowersurvival rates could become apparent in the populations ofbirds living in this important wildlife area in the near future.Long-term monitoring is needed to assess whether thegenotoxic damage detected in these birds might have anyfurther effect on the population dynamics of these species.

Acknowledgements

Many people helped in the ®eld. We especially thank the Equipo deSeguimiento de Procesos Naturales, EstacioÂn BioloÂgica de DonÄana and M.C.Quintero, R.Rodriguez, F.G.Vilches, G.GarcõÂa, J.Blas, J.M.Terrero, S.Cabezas,P.RodrõÂguez and M.GarcõÂa. Funds were provided by Project B0S2002-00857 ofthe Ministerio de Ciencia y TecnologõÂa y Fondos Feder, TelefoÂnica MoÂviles SAand Junta de AndalucõÂa (Convenio 02020059).

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Received on July 31, 2003; revised on September 19, 2003;accepted on September 22, 2003

Genotoxic damage due to a mining waste spill

65

Toxicologic Pathology, 33:441–448, 2005Copyright C© by the Society of Toxicologic PathologyISSN: 0192-6233 print / 1533-1601 onlineDOI: 10.1080/01926230590953097

Skeletal Pathology in White Storks (Ciconia ciconia) Associated WithHeavy Metal Contamination in Southwestern Spain

JUDIT E. G. SMITS,1 GARY R. BORTOLOTTI,2 RAQUEL BAOS,3 JULIO BLAS,2 FERNANDO HIRALDO,3 AND QIANLE XIE4

1Department of Veterinary Pathology, 2Department of Biology, University of Saskatchewan, Saskatoon, SK S7N 5B4, Canada3Estacion Biologica de Donana, C.S.I.C., 41013 Sevilla, Spain, and

4Trent University, Peterborough, ON, Canada

ABSTRACT

In 1998, a mine tailings dyke in southwestern Spain broke, flooding the Agrio-Guadiamar river system with acid tailings up to the borders of oneof the largest breeding colony of white storks in the western Palearctic, Dehesa de Abajo. Over the following years, a high proportion of nestlingsdeveloped leg defects, prompting this study. Ten fledglings with leg deformities from the spill area were compared with 11 normal storks of the sameyear class from another region far from the spill. However, metals were analyzed as a continuum rather than by site, as reference birds also containedhigh levels of metals. Gross pathology of the legs was supported by histopathology, which showed that bone remodeling activity was greater in thedeformed storks, which also had more irregular subperiosteal bone, and tended to have higher residual islets of cartilage in their metaphyses, which, inturn were related to metal contaminant residues. Both Ca and P in bone were affected independently by metals. Deformed birds had lower serum bonealkaline phosphatase. Bone malformations, measured by leg asymmetry, was only partially explained by bone metals, indicating that a combinationof factors was involved with the abnormal development in these young storks.

Keywords. Skeletal pathology; white storks; toxic metals; bone alkaline phosphatase; deformities; environmental contamination.

INTRODUCTIONIn April 1998, an environmental disaster struck southwest-

ern Spain. The tailings dyke from an iron pyrite mine inAznalcollar (Sevilla) broke open, flooding the valleys of theAgrio and Guadiamar rivers up to the border of the DonanaNational Park, a critical breeding and wintering site for manyspecies of threatened and endangered animals (Grimalt et al.,1999). The slurry of toxic acidic mud and water covered anarea 40 km long and 0.5 km wide, was approximately 2 ×106 m3 in volume and contained potentially toxic elementssuch as Pb, Zn, As, Cu, Cd, and other sulphide-related ele-ments (Grimalt et al., 1999). Of particular concern was theproximity of the inundation to Dehesa de Abajo, the loca-tion of one of Western Europe’s largest breeding colony ofwhite storks (Ciconia ciconia). The tailings flooded the rivervalley and marshes as close as 1 km from the colony. Thechemical nature of the tailings, plus hydrological, geomor-phological details, as well as effects on soil, groundwater,plants, invertebrates, fish and birds in 1998, were detailed inan issue of Science of the Total Environment (1999) devotedto examining this accident.In the years since the spill, researchers have documented

different problems in the nestling storks. Genotoxic damagehas been tracked in the colony for several years (Pastor et al.,

Address correspondence to: Dr. Judit E. G. Smits, Department ofVeterinary Pathology, Western College of Veterinary Medicine, Univer-sity of Saskatchewan, Saskatoon, SK S7N 5B4 Canada; e-mail: judit.smits@usask.ca

Abbreviations: AP, alkaline phosphatase; ANOVA, analysis of variance;BAP, bone alkaline phosphatase; DdA, Dehesa de Abajo; HPF, high powerfield; LSI, liver somatic index; MT, tarsometatarsal bone; OP, organophos-phate; PCA, principle component analysis; PC1, first principle component;PC2, second principle component; PC3, third principle component.

2004). Since the spill, a variable but substantial proportionof the nestlings were discovered to have deformed legs andbills that had not been documented previously in this or anyother stork colony in Spain. The peak in deformities occurredin 2001, with nearly 10% of the nestlings being affected tosome degree (R. Baos, unpublished). As detailed below, legswere consistently affected just distal to the tarsal joint, withthickening, local malformation, and lateral or medial devia-tions of the lower leg. In some nestlings, the bill, especiallythe maxilla, was curved dorsally or laterally.Our objective was to conduct a comprehensive examina-

tion characterizing the nature and extent of physiological andanatomical aberrations in young storks in relation to metalcontaminant loads in tissues. To this end, deformed juvenilesfrom Dehesa de Abajo (DdA) were compared with anothersmall group of storks of the same age collected from differ-ent breeding sites in Caceres province, an area over 200 Kmaway from the spill . Pathological plus other morphologi-cal and physiological endpoints were compared between thegroups of birds.

MATERIALS AND METHODS

Animals. In 2001, 10 nestling storks with obviously de-formed tarsometatarsal (MT) bones were collected from theDdA colony adjacent to the spill site just prior to reach-ing fledging age (birds ranged from 40–55 days old), andwere housed in the Acebuche wildlife recuperation center(Donana National Park, Huelva) for 3 months. Eleven storks,also young of the year and apparently healthy (except theyhad fallen from their nests or suffered some other misadven-ture) were collected from a wildlife recovery center “Sierrade Fuentes” in the neighbouring area of Extremadura. Birdswere housed in groups of 5 or 6 colony mates, in 4 openpens. Pens (4w × 6d × 3h m) were enclosed with solid mesh

441

442 SMITS ET AL. TOXICOLOGIC PATHOLOGY

walls, open wire fronts, and roofs with partial cover. Birdshad access to small ponds within their enclosures, and weremaintained on a standard diet of various species of marinefishpurchased fromafish-processing factory,whichproducesfish for human consumption. Any fish that were too small orotherwise unsuitable for the human foodmarket, made up thediet of the storks. Their diet was not analyzed for metals, butwas assumed to meet human food quality criteria. Once thebirds arrived at the wildlife recovery centre, their legs wereradiographed. The storks remained in the rehabilitation cen-tre for 3 months before it was logistically possible to conductthe necropsy examinations. All work was conducted underthe proper Animal Care Protocols.Study areas. The colony referred to asDdA,was located in

a natural area (Puebla del Rıo, province of Sevilla, 6◦10′16′′W: 37◦12′33′′N), while the Caceres birds came from a varietyof habitats in the Extremadura region of southwestern Spain.The linear distance between the origins of these 2 groupsof birds was greater than 200 km. The DdA colony was farfrom urban environments, close to a permanent water source(within 2 km of a marsh in Donana National Park which isa very productive ecosystem), with nests in wild olive trees.Details of the origins of the birds that came from the Caceresrehabilitation center were not available.Pathology. Storks were humanely euthanized by overdos-

ing with Halothane inhalation anaesthetic. Their heads wereplaced into a plastic bag containing halothane soaked cottonswabs, until respiratory and cardiac arrest within 30 to 45 sec-onds. Body mass was determined immediately. A completenecropsy examination was conducted. Because of the leg de-formities inDdAbirds, length of both right and leftMTbones(i.e., area of leg spanning the tarsometatarsal bone)weremea-sured to the nearest mm and the difference between the 2 wasused to describe the degree of leg asymmetry. All joints, mus-culoskeletal system and viscera were examined, and themassof the liver, bursa of Fabricius, and spleen were recorded. Or-gan mass was expressed as “somatic indices” (SI) (e.g., (liverSI = (liver mass/(body mass − liver mass)) ×100). Samplesof liver and kidney were wrapped in xylene rinsed foil andfrozen in sample bags at−20◦C. Tarsometatarsal bones wereimmersed in 10% neutral buffered formalin.From the proximal epiphysis, extending 2 to 3 cm distally

along the shaft, to encompass the area of the deformations,the MT bones were sectioned midsagitally. The bones werethen placed in decalcification solution (20% formic acid inwater) until they were demineralized sufficiently for properhistological preparation. To avoid information bias, the eval-uation of the bone sections was carried out by the pathol-ogist unaware of the animals’ identification or origin. TheH&E-stained bone sections were examined microscopicallyfor evidence of pathology. After consultation with a col-league/osteopathologist, the bones were assessed accordingto the following features. The osteal-periosteal surface wasdescribed as smooth or irregular (Figure 1a and b). Afterexamination of 6 high power fields (HPF: 200× magnifica-tion), the occurrence of irregularly shaped islets of cartilagein the diaphyseal or cortical bone around the growth platewasscored as “mild” if there were 0–1 islets per HPF, moderateif there were 2–4 per HPF, and marked, if there were greaterthan or equal to 5 per HPF. The remodeling activity in the

bone was determined based upon the presence of an open,haphazard pattern of newly formed bone with remaining col-lagen and occasional round osteoblasts visible (Figure 2a).Remodeling was most easily determined using a polarizingfilter to distinguish it from the well organized, lamellar, par-allel pattern of older bone (Figure 2b). It was categorizedas mild if <10% of each field showed remodeling, moder-ate if 10–50% showed newly forming bone, and marked if>50% showed remodeling activity. When remodeling activ-ity changed along the bone section, themost commonly notedpattern was recorded for that case.Clinical pathology. Prior to euthanasia, a blood sample

was taken from each bird. Because of the important role ofCa and P in bone development, levels of both minerals wereassessed in serum using an automated instrument (Hitachi912 automatic analyzer, Montreal, Canada). In veterinarymedicine, serum levels reported as total alkaline phosphatase(AP) are the sum of AP isoenzymes from the liver, intestine,and bone. Because of the specific role of bone AP, whichis produced at the highest rate by osteoblasts during bonegrowth and development (Hoffman and Solter, 1999), wemeasured the total, hepatic and bone AP, to determine if therewas a detectable change in bone AP activity associated withthe deformed long bones. Serum levels of bone AP weredetermined using an adaptation of the mammalian assay byHoffman et al. (1994).Mineral and metal analysis. Liver and kidney samples

from these storks were placed into a drying oven in coveredporcelain dishes for several days until all moisture was gonefrom the tissues. A 2 cm slice of eachMT bone was sectioned3 cmdistal to the proximal epiphysis, individually bagged andsubmitted to the analytical laboratory at the Department ofGeological Sciences, University of Saskatchewan. The driedliver and kidney samples were then ground and homogenizedusing a corundum grinder. Aliquots of the powdered tissues(0.1 g) were placed into Teflon vials with 2 ml double dis-tilled, ultrapure HNO3 and a few drops of H2O2. Vials wereleft open in a clean fume hood until the reaction subsided.Vials were then capped and placed on a hot plate at 100◦Cuntil samples were completely digested and a clear solutionwas formed.The vial was then opened so the liquid could evaporate

at 70◦C until it reached ambient dryness, 1 ml HNO3 wasadded to the residue and the vials capped for 1 hour until allresidues were dissolved, the solution was diluted with deion-ized water to 100 ml, and stored at 4◦C until analysis. For thebone samples, the sections were crushed with an agate pes-tle, ground and homogenized with corundum grinder, 0.1 gof the powder was used for digestion following the proce-dure described above. Analysis for metals was performedusing a Platform collision cell inductively coupled plasmamass spectrometer (ICP-MS, Micromass, Manchester, UK).A low flow Meinhard concentric nebulizer (Glass Expan-sion, Hawthorne, Australia) was employed. A water-cooled(4◦C) Scott type double-pass spray chamber was also usedto generate homogeneous sample aerosols. Calibration wasachieved using a series of multi-element standards (1, 5, 10,20 ppb), and a calibration curve was established. Rhodiumwas used as an internal standard to correct for sample ma-trix effects and instrument drift. Three standard reference

Vol. 33, No. 4, 2005 LEG DEFORMITIES IN STORKS EXPOSED TO METALS 443

Figures 1–2

FIGURE 1.—Comparison of (A) smooth, or (B) irregular osteal-periosteal surface of the tarsometatarsi in storks with varying levels of metals in their long bones(H&E bar = 200 µm). 2.—Remodelling activity in the proximal tarsometatarsi was described as (A) “immature” if there was primarily open, haphazard boneformation, or (B) “mature” if there was primarily parallel, laminar bone formation. (H&E, bar = 50 µm).

materials were used for the data quality control; a river waterstandard SLRS-4, a dogfish liver standardDOLT-2 and a dog-fish muscle standard DORM-2 (National Research Councilof Canada, Ottawa, Canada).Statistical analyses. Although we present the metal

residues in liver and kidney as well as bone to allow com-parison with findings by other researchers, we limit all sta-tistical analyses to metal levels in the bones. The rationalefor the latter is that all the birds had been on the same stan-dard fish diet at the rehabilitation centre for 3 months, al-lowing differences that might have originally existed in theliver and kidney to disappear. Bone metal concentrationswere assumed to be unchanged from the time the fledglingswere taken from their original colonies. Bone elements arequite stable in full-sized animals compared with rapidlygrowing nestlings (Scheuhammer, 1987 and referencestherein).The full biological impact of metals was unlikely to be

revealed by repeated testing of individual elements, as thereare numerous interactions and correlations among the metalsthemselves. Therefore, we used principal component anal-

ysis (PCA) to derive fewer and independent variables. In 1analysis we took this approach for 9 elements in the bonethat we interpret as contaminants (Pb, Co, Cr, Ti, Zn, Sn,V, Ba, Sr). For a second analysis we used 5 normal, physio-logically important elements in the bone (Ca, P, Mg, Na, S).For these PCAs, we chose elements that were consistentlydetectable and that were, or could be transformed to be, nor-mally distributed. The PCA of contaminants resulted in threecomponents accounting for 63.7% of the total variability:PC1 explained 29.7%, and PC2 explained 21.7%, and PC3explained 12.3% of the variance in the data set. Examinationof the relative loading of the variables on the 3 components,and subsequent correlation analyses, yielded the followinginterpretation. PC1 was largely an axis of V, Ba, Sr, and Crall varying positively. PC2 was Zn and Ti (positively), andCo, Sn, and Cr (negatively). PC3 was largely influenced bya positive relationship with Pb and Co. For the PCA of thenormal bone elements 2 components explained 91.0% of thevariance: (PC1 70.6%, PC2 20.4%). Ca, P, Mg, and Na wereall highly, and positively associated with PC1, whereas PC2was primarily influenced by S.

444 SMITS ET AL. TOXICOLOGIC PATHOLOGY

TABLE 1.—Metal contaminants (median, minimum and maximum concentrations) in kidney, liver and bone of white storks exposed to a mine tailing spill insouthwestern Spain (Dehesa de Abajo—DdA) and from a reference area in Caceres.

Tissue Colony Al ppm Ti ppm V ppb Cr ppb Co ppb Cu ppm Zn ppm As ppb Se ppm Sn ppb Sr ppm Pb ppb

Kidney DdA 26571110–7256

2842622542–33456

494235–1420

13542–2043

251171–534

1712–26

11189–139

1558635–2950

8.65.0–10.7

736348–1144

0.5880.408–0.784

310203–604

Caceres 39601959–11612

2552822417–33238

383299–692

14562–4054

276166–512

2312–26

10871–126

1664666–3406

6.64.1–13.4

774292–1231

0.4720.363–0.798

58783–1403

Liver DdA 2109942–33882

2715724205–34954

19181–316

15281021–2137

10165–158

3621–51

292223–339

32361266–6072

7.45.6–9.0

555244–1597

0.1910.140–0.309

9327–236

Caceres 44631107–11592

2648021353–30415

165100–234

866339–2767

14371–185

3019–88

317176–445

33751621–4697

5.33.1–8.7

781286–2171

0.1470.094–0.271

26423–1031

Bone DdA 00–6.2

185123–273

704130–1936

8110–1473

1270–277

0.0030–1.2

550–94

00–104

00–6.0

23981–439

229.2159.2–305.1

8820–2779

Caceres 00–76.5

196109–229

243162–1348

74321–1233

190121–327

00–0.8

390–185

00–338

287142–341

134.368.5–236.2

20080–12178

We used ANOVA where nonsignificant interactions andvariables were removed iteratively, to obtain the most parsi-moniousmodel that explained variation in the dependent vari-able. Two-tailed tests were performed using SPSS (Norusis,1993), and we considered results significant at the 0.05 level.For the analysis of leg asymmetry, itwas not valid to simply

compare birds on the basis of location since all deformedbirds came from the same location. However, it was clear thatindividuals varied in the degree of leg deformity and so wederived the variable, absolute leg asymmetry, i.e., differencein length between the right and left metatarsi. In theANOVAswe thus used this variable, and location as a factor.

RESULTS

Metal contamination by location. Table 1 shows clearlythat neither birds from the reference location nor from the

FIGURE 3.—Radiographs of (a) abnormal tarsometatarsal bones in a stork from DdA compared with (b) normal limbs from a reference area stork.

spill site were free of metal contamination. In fact, for someof the metals, concentrations were higher in the “reference”birds. For the PCA analysis of bone metals, location was notsignificant for PC1 (F1,19 = 1.672, p = 0.211), marginallynonsignificant for PC2 (F1,19 = 3.837, p = 0.065) and sig-nificant for PC3 (F1,19 = 5.436, p = 0.031) in which the dif-ference was driven by the higher Pb in bones of the Caceresbirds.Gross pathology. Radiographic evidence of leg deformi-

ties are shown in Figure 3. The deformed, healed bones werelocally thicker with a triangular, rather than round, cross sec-tion. In all affected birds, the cortical bone just distal to thetibiotarsal joint was abnormally thickened with callus for-mation and varying severity of valgus deviation of the distalportion of the limbs. There was no radiographic evidence ofdecreased cortical thickness or density, or of any generalized

Vol. 33, No. 4, 2005 LEG DEFORMITIES IN STORKS EXPOSED TO METALS 445

increase in lucencyof the cortices over the length of the bones.No fracture lines were visible.Histopathology. A Chi-square test revealed remodeling

bone score to be dependent on location, as birds in Cacereshad minimal to moderate bone remodeling whereas thosefrom DdA had moderate to active remodeling activity(Pearson Chi-Square Test, p = 0.015). The nature of thesurface of the osteum/periosteum was similarly dependenton location (Fisher’s Exact Test, p = 0.001). There was nostatistically significant effect of location on scores for the car-tilage islets in the bone, although this may be due to the smallsample size, as the trend was for 70% of birds in Caceres, vsonly 33% in DdA, to have low amounts of residual cartilagein their metaphyses. When contaminant levels, as describedusing PCA, were examined in relation to histological scores,there was no difference among scores for bone remodelingor surface of the osteum/periosteum; however, PC2 valuesincreased as the occurrence of residual islets of cartilage in-creased (F2,16 = 5.412, p = 0.016) (Figure 4).Leg asymmetry, associated pathology, and clinical bio-

chemistry. Legs of DdA birds were more asymmetrical thanthe reference birds (F1,17 = 10.123, p < 0.005). Leg de-formities, as measured on a continuous scale of leg asym-metry, were associated with a number of other physiolog-ically relevant variables. When the histological appearanceof the osteal/periosteal surface was smooth, leg asymmetrywas significantly less than if the birds had irregular bonesurfaces (F1,17 = 6.819, p = 0.018) (Figure 5). Consider-ing the bone remodeling activity, the leg asymmetry in-creased significantly with increasing evidence of remodel-ing (F2,14 = 4.981, p = 0.023) (Figure 6). The presence anddensity of cartilaginous islets in the proximal tarsometarsalsections of bone was independent of the symmetry of the legbones (F1,15 = 0.787, p = 0.473).In the ANOVAs, body mass and sex were never found to

be significantly related to leg asymmetry and so were alwaysdropped from models. Using asymmetry as the dependentvariable, both effect of location and levels of bone alkalinephosphatase (BAP) levels in plasma (F1,17 = 4.483, p< 0.05)

FIGURE 4.—Level of remodeling activity in tarsometatarsi related to asym-metry in bone length.

FIGURE 5.—Subperiosteal bone surface was more irregular in birds with moreasymmetrical legs.

were significantly different between DdA and Caceres birds.For birds in both locales, increasingly asymmetrical legs haddecreasing amounts of the bone enzyme BAP (Figure 7).We could not detect an association between asymmetry andeither PC1 (p > 0.13) or PC2 (p > 0.71) of the normal boneminerals. Of the organs measured, only liver showed anyrelationshipwith limbpathology.As liver somatic index (liversize relative to body mass) increased, leg asymmetry alsoincreased (F1,17 = 8.805, p = 0.009), while again locationexplained considerable variance (F1,17 = 14.088, p= 0.002).The degree of leg asymmetry was also examined with re-

spect to the 3 PCAs based on metal contaminants. Althoughlocation was considered as well, it was dropped from the finalmodel, and PC3 remained significant (F1,18 = 10.385, p =0.005). However, the relationship was unexpected, as boneswith low PC3 scores (i.e., driven by low Pb levels) were mostasymmetrical.

FIGURE 6.—The density of islets of cartilage in diaphyseal bone is related tocontaminant metal burdens in the bone.

446 SMITS ET AL. TOXICOLOGIC PATHOLOGY

FIGURE 7.—Serum levels of bone alkaline phosphatase (BAP) are higher instorks with more symmetrical bones.

Body and organ mass. Independent ANOVAs were con-ducted for the dependent variables of liver, bursa and spleensomatic indices, as well as body mass. The initial modelsused sex, location, and the 3 PCA contaminant-independentvariables. For bodymass, sex (F1,17 = 11.717, p= 0.003) andPC3(F1,17 = 5.406, p= 0.033) were significant, where maleswere heavier (as is known for this species), as were birds withhigher PC3 levels. For the liver somatic index, PC3was againa significant covariate (F1,18 = 5.102, p= 0.037). Neither thesplenic nor bursal indices were significantly associated withthe PCA for metals.Normal bone elements. In the multivariate analysis of nor-

mal bone constituents, we considered length of right metatar-sus as a potential covariate. There was no significant effectof the three PCA contaminant variables on PC1 of the nor-mal bone minerals. However, for PC2 of bone minerals, therewere significant effects of metatarsal length (F1,16 = 8.752,p = 0.009), and PC1 of metal contaminants (F1,16 = 5.099,p = 0.038). Because Ca and P are the 2 major elements com-prising bone, they were examined individually in relation tothe PCAof contaminantmetals. InANOVAsweused boneCa(and subsequently P) as the dependent variable, and consid-ered sex and location as factors. We considered body mass,P (or subsequently Ca) in bone and the 3 components ofthe PCA of contaminants as potential covariates. In the finalsignificant model, Ca was explained by body mass (F1,16 =9.748, p= 0.007), P in bone (F1,16 = 369.785, p< 0.001), andPC1 metals (F1,16 = 6.188, p = 0.024). Similar analysis ofbone P levels showed significant effects of bodymass (F1,15 =11.701, p = 0.004, Ca in bone (F1,15 = 441.029, p < 0.001),location (F1,15 = 6.347, p = 0.024) and PC2 metals (F1,15 =4.722, p = 0.046). In addition, PC1 proved, predictably, tobe significantly correlated with Ca:P ratio (rs = 0.644, p =0.002), but PC2 and PC3 were nonsignificant.

DISCUSSION

In this study we examined physiological and anatomicalaberrations in juvenile storks in relation to metal residues

in bones. Fledglings were collected from the DdA colonyadjacent to the inundated area because of having deformedtarsometarsal bones. Through pathology, biochemistry, andtissue residue analyses, we describe the toxicology and ex-plore the nature of the physiological disturbances that haveresulted in bone problems.Leg asymmetry was an important feature related to bone

contaminant levels. The leg deformities were most likely theresult of fractures which occurred at an early stage during thenestling period, and, because nestlings do not bear weighton their legs until about 45 to 50 days of age, the fracturescould heal through apositional bone production. The con-sistent location of the leg pathology at the proximal end ofthe tarsometatarsus indicates that physical stress occurs atthis site. Radiographs taken after fledging when the birdswould have reached maximum skeletal size, did not showdeficient cortical bone compared with the legs of the ref-erence birds, although the bones would have gone throughsubstantial changes during the nestling period, readily mask-ing or correcting early defects in mineralization. Metals,once bound in bone matrix, are considered non-mobilizable(Klaassen, 2001). The metals were not different between thebirds from DdA and Caceres, so it is possible that the rateor timing of exposure to those metals would have played animportant role in expression of toxicity in young, quicklydeveloping birds. Maybe very young storks are fed on morecontaminated, smaller, filter-feeders so they get higher dosesof mud-associated contaminants early in life. Field observa-tions indicate that one important prey item for DdA nestlingsis the red swamp crayfish Procambarus clarkii (Negro et al.,2000), which can accumulate metals in their tissues. Crayfishcaptured in the spill area in 2000 had metal levels exceedingthat allowed for human consumption (Sanchez-Lopez et al.,2003).The limb deformities were originally suspected to be due

to toxicity by metals associated with the spill, that could di-rectly disturb bone formation. Cadmium and Pb as well as Alare known to interfere with bone turnover and Cametabolism(Goyer et al., 1994;Berglund et al., 2000).As it turned out, thelevels of toxic metals were often lower in the affected birdsthan those from the reference site distant from the tailings ac-cident. The Pb in tissues from the DdA storks was confirmedas coming from the Aznalcollar mine spill through isotopicidentification (Meharg et al., 2002). Of the metals used forPCA analyses, only Pb, Co, and Znwere identified in themudslurry. The remaining metals included in the analyses (V, Ba,Sr, Cr, Ti) were identified as coming from the natural riversediments unaffected by the spill (Alastuey et al., 1999).By using multivariate analyses, relationships between

toxic metal concentrations and essential bone componentsbecame evident. Using a PCA allowed us to recognize physi-ological costs associated with exposure to a complex mixtureof metals in an acid matrix. Sulfur levels in the bones had asignificant relationship with contaminant metals possibly im-plying that this essential mineral was being compromised inbirds with higher metal contamination. Calcium and optimalCa:P ratios, which are critical for normal bone developmentand remodeling, were linked to the combination of toxic met-als in the bone. Because blood Ca is tightly regulated in thebody through hormonal and renal controls, and the Ca:P ra-tio was abnormal, it stands to reason that the P, which was

Vol. 33, No. 4, 2005 LEG DEFORMITIES IN STORKS EXPOSED TO METALS 447

associated with metal concentrations, and which was differ-ent between the 2 populations, was not being properly regu-lated in the DdA birds.Bone alkaline phosphatase is normally produced during

active growth and remodeling in bone. It should be present inserum at relatively higher levels in animals that are growingquickly (Hoffmann and Salter, 1999). In other studies froma larger group of nestling storks, those which had slightlydeformed limbs had significantly higher BAP than eithernormal or severely deformed chicks (Smits, unpublished),perhaps indicating that they were mounting a successful at-tempt to remodel the damaged bones. However, in the currentstudywith full sized birds, decreasedBAP levels were associ-atedwithmore severe leg asymmetry, although histologicallythose limbs appeared to be at an active stage of remodelling.The lower BAP activity indicated defective or static devel-opment in bone that had never properly matured. Accordingto recent studies in passerines, increased serum BAP is seenduring the finalmaturation andmineralization of bone (Tilgaret al., 2004).Increased liver mass is a nonspecific response associated

with induction of enzymes involved in biotransformation ofenvironmental contaminants to enhance their polarity and fa-cilitate their excretion (Klaassen, 2001). The relatively largerlivers seen in the storks with more severely affected legs, al-though a nonspecific response, is consistent with an increaseddetoxification effort by animals dealing with contaminant ex-posure. Because many metals were higher in the physicallynormal birds from the reference area, other sources and typesof xenobiotics must be acknowledged as potential contrib-utors to the hepatic differences in these birds. There is noindication that other factors such as trauma, or other physicalor genetic factorsmay have been responsible for the observedlimbdefects. In smallmammals (Mus spretus) collected in thespill area, biochemical responses indicate the simultaneousoccurrence of organic pollutants as well as the contaminantmetals (Bonilla-Valverde et al., 2004).In DdA, storks generally forage in nearby marshes and

rice paddies, feeding their nestlings crayfish, fish, insects,and other invertebrates (Negro et al., 2000). Both the DdApopulation (Jovani and Tella, unpublished) and other popula-tions of storks are known to forage in garbage dumps (Tortosaand Caballero, 2002), which likely explains the chicken offalthat has been identified in the regurgitation of nestling storksalong with the more normal dietary items.The toxic mud resulting from the breached tailings dyke

was removed within several months (Hudson-Edwards et al.,2003).Besides the residualmine contaminants, theDdAstorkpopulation is also close (within 3 km) to a vast delta area ofrice production, which, during the breeding season of thestorks, receives frequent applications of agrochemicals tosupport crop production and control pests. It was not pos-sible to obtain reliable information about the compounds be-ing used. However, from speaking with local agronomists,or by finding recently emptied pesticide containers, it wasevident that both carbamate (carbaryl) and organophosphatecompounds (malathion, fenitrothion, and triclorfon), alongwith several types of fungicides were being used in the deltaregion. Cholinesterase-inhibiting compounds undergo exten-sive biotransformation in all forms of life, with very speciesspecific routes and rates of metabolism (Ecobichon, 2001).Organophosphorous (OP) esters stimulate the cytochrome

P450 isoenzyme system. The normal role of P450 enzymes isto enhance eventual excretion of metabolic breakdown prod-ucts. One theory that could be explored is that in cases of lowgrade, subchronic exposure to OPs, other phosphoric acidsmay bemetabolized and excreted at an increased rate becauseof the overall upregulation of this enzyme system that is rel-atively indiscriminant, thus causing a disturbance of normalP regulation.Lower BAP was seen in the deformed birds, which was

indicative of retarded or arrested bone maturation (Figure 2a,b). PC3associatedmostwithPb levels,wasmaking a negativecontribution to bonematuration also. Themetals appear to beat least in part responsible for increasing hepatic detoxifica-tion efforts (and thus higher liver SI) assuming that metaloth-ionine synthesis (the major protein produced to protect thebody against toxic metals) is one contributing factor, alongwith induced biotransformation activity within the liver, plushepatic storage of metals. One could speculate on a potentialrole of Se, which was higher in DdA birds, that could offersome protection against the metal residues. Selenium has thecapacity to form stable associations with somemetals, block-ing them from forming ligands with the sulfhydryl groups ofessential enzyme systems (Sugiura et al., 1976).We have shown with this study, that the relationship be-

tween bone malformations and metal contamination occursin a complex manner which cannot be explained by one ortwo metals. The juvenile storks with leg deformities were af-fected in part by toxic elements, but the metals alone do notexplain the pathology that developed. Physiological costs ofexposure to toxic metals have been exacerbated by unknownfactors thatmay be related to the intense agricultural activitiesoccurring in proximity to the affected colony. Rice produc-tion is one conspicuous source of xenobiotic inputs that is notoccurring in the reference area. We know that the DdA popu-lation had higher genotoxic damage than did storks sampledfrom distant locations (Pastor et al., 2004).Although we could not prove a direct link with any par-

ticular metal, something about the contaminant burdens wasaffecting bone development. Clearly, a combination of fac-tors is involved with the abnormal development seen in theseyoung storks that requires further investigation.

ACKNOWLEDGMENTS

The authors are indebted to G. Garcıa, J. M. Terrero, H.Lefranc, and R. Rodrıguez for their able field assistance.J.L.Tella and the Ayuntamiento de Puebla del Rıo providedlogistic support and access to theDdA stork colony.We thankConsejerıa deMedioAmbiente—Junta deAndalucıa for pro-viding permits, and theAcebuchewildlife recovery centre fortending the birds. Sierra de Fuentes wildlife recovery center(Consejeria de Agricultura yMedio Ambiente—Junta de Ex-tremadura) provided the reference birds. The wildlife/storkmonitoring program (16/98) was financed by CSIC. Thiswork was supported by fellowships from the Spanish Min-isterio de Educacion Cultura y Deporte (to RB and JB), andgrants from EGMASA and the European Community (JB).The work was also supported by Canadian NSERC grants (toGB and JS).

REFERENCES

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448 SMITS ET AL. TOXICOLOGIC PATHOLOGY

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1

EFECTOS DEL VERTIDO TÓXICO DE AZNALCÓLLAR

SOBRE LA CIGÜEÑA BLANCA, LOS ANSERIFORMES Y

EL MILANO NEGRO EN DOÑANA

INFORME FINAL

Noviembre 2003

Convenio de colaboración entre la Consejería de Medio Ambiente de la Junta de

Andalucía y el Consejo Superior de Investigaciones Científicas

2

Investigador responsable: José Luis Tella

Estación Biológica de Doñana (C.S.I.C.), Sevilla

Equipo investigador: Raquel Baos, Roger Jovani, Fernando Hiraldo

Estación Biológica de Doñana (C.S.I.C.), Sevilla

Colaboradores: Nuria Pastor, Felipe Cortés

Departamento de Biología Celular, Universidad de Sevilla

Gemma Gómez, Begoña Jiménez

Instituto de Química Orgánica General (C.S.I.C.), Sevilla

Judit E. Smits, Gary Bortolotti

Universidad de Saskatchewan, Canadá

S. Merino, G. Tomás

Museo Nacional de Ciencias Naturales (C.S.I.C.), Madrid

W. Hoffman

Univesidad de Illinois, USA

3

ÍNDICE

1. Introducción general ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 4

2. Efecto del vertido tóxico de Aznalcóllar en la supervivencia de la cigüeña blanca ... . 6

3. Efecto del vertido tóxico en la reproducción de la cigüeña blanca ... ... ... ... ... ... ... ..11

3.1 Estudio longitudinal en la colonia de cigüeña blanca de la Dehesa de Abajo... 12

3.1.1 Tamaño de puesta ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 12

3.1.2 Efecto de la climatología en la supervivencia de los pollos ... ... ... ... ... ... .20

3.1.3 Efecto de la climatología en la reproducción ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 27

3.1.3 Crecimiento de la colonia y efectos densodependientes en la reproducción 32

3.1.4 Efecto de la extensión de arrozales en la reproducción ... ... ... ... ... ... ... . 36

3.1.5 Estudio multivariante del efecto del vertido en la reprodcucción ... ... ... .. 41

3.2 Estudio del éxito reproductor de la cigüeña blanca criando a distintas

distancias del vertido tóxico de Aznalcóllar ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 49

4. Niveles de metales pesados y arsénico en aves de Doñana y su entorno... ... ... ... ... 62

5. Malformaciones en pollos de cigüeña blanca en el área de Doñana y su entorno... .. 76

6. Respuesta inmune celular y metales pesados en pollos de cigüeña blanca nacidos en la

Dehesa de Abajo ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 106

7. Daño genotóxico en los pollos de cigüeña blanca y milano negro nacidos en Doñana y

su entorno. Relación con metales pesados y arsénico. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 116

8. Sinopsis ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..130

9. Bibliografía ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 135

4

1. INTRODUCCIÓN GENERAL El vertido tóxico de la Mina de Aznalcóllar (propiedad de Boliden Apirsa S.L.), en Abril

de 1998, es junto al vertido de fuel del petrolero Prestige el accidente ecológico más

importante que se ha producido en España. Esto es debido tanto a su magnitud (cuatro

millones de m3 de agua ácida y dos millones de m3 de lodos con elevados niveles de

metales pesados, vertidos sobre 4.286 ha, Grimalt & Macpherson 1999), como al hecho

de que se produjera en una zona tan importante para la conservación del patrimonio

natural como es el entorno del Parque Nacional de Doñana.

En Abril de 1998 se produjo la rotura de la balsa de decantación de la mina

ubicada en el término municipal de Aznalcóllar en la Provincia de Sevilla. Como

consecuencia del vertido se inundaron de lodos ácidos ambas márgenes del río

Guadiamar a lo largo de unos 60 Km de su cauce, desde la balsa hasta el límite del

Parque Nacional de Doñana, en la zona denominada de Entremuros, amenazando de

forma directa el entorno de dicha reserva de biodiversidad.

Aunque los niveles de contaminantes han sido estudiados a lo largo de la zona

afectada por el vertido tóxico, los efectos de esta catástrofe ecológica sobre los

organismos vivos a medio y largo plazo son aún desconocidos. Entender cómo puede

afectar este vertido al ecosistema de Doñana resulta esencial tanto para abordar con

eficacia la correcta gestión de este espacio natural, como para enfrentarse en el futuro a

potenciales catástrofes de esta índole.

En este informe final del proyecto “Efectos del vertido tóxico de Aznalcóllar

sobre la cigüeña blanca, los anseriformes y el milano negro en Doñana” dentro del

convenio de colaboración entre la Consejería de Medio Ambiente de la Junta de

Andalucía y el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), se aborda el

efecto del vertido sobre la cigüeña blanca (Ciconia ciconia), los anseriformes y el milano

negro (Milvus migrans) en Doñana, aunque con especial atención a la cigüeña blanca.

Esto es debido a la idoneidad de esta especie para el estudio que se ha planteado:

1. Se trata de una especie de larga vida (Barbraud et al. 1999), permitiendo así

examinar los efectos subletales de los contaminantes a largo plazo.

5

2. Al alimentarse tanto de invertebrados como de vertebrados acuáticos y terrestres

se sitúa en los eslabones más altos de la cadena trófica de las marismas de

Doñana.

3. Es una de las especies en las que se ha comprobado la acumulación de

importantes cantidades de metales y As tras el vertido tóxico de Aznalcóllar

(Benito et al. 1999). En concreto, el Pb analizado en muestras de cigüeña blanca

corresponde a la traza isotópica detectada en las muestras de lodos tóxicos de la

mina de Aznalcóllar (Meharg et al. 2002).

4. Nidifica tanto en zonas afectadas como no afectadas por el vertido, permitiendo la

comparación horizontal entre zonas contaminadas y no contaminadas.

5. Los parámetros demográficos de esta población de cigüeñas han sido seguidos

desde 1973. Este hecho ofrece una ocasión única para llevar a cabo

comparaciones longitudinales en el tiempo y con ello entender a fondo las

repercusiones de la contaminación a medio y largo plazo.

Por todo ello, la cigüeña blanca resulta ser una especie idónea para estudiar los

efectos del vertido tóxico de Aznalcóllar sobre la avifauna de larga vida de Doñana. Este

informe se centra en el estudio de biomarcadores (o bioindicadores, LeBlanc & Bain

1997), que son aquellas variaciones en los organismos que permiten medir las

consecuencias de las exposiciones a sustancias tóxicas. En este trabajo se pretende

utilizar estos indicadores (estado de salud, fecundidad, supervivencia) para medir de qué

modo el vertido ha afectado a las poblaciones de aves.

6

2. EFECTO DEL VERTIDO TÓXICO DE AZNALCÓLLAR EN LA

SUPERVIVENCIA DE LA CIGÜEÑA BLANCA INTRODUCCIÓN:

La supervivencia es un parámetro básico para entender la evolución de una población en

el tiempo (Stearns 1999). Es por esto que estudiar el efecto del vertido tóxico de

Aznalcóllar sobre la supervivencia de los individuos nos puede dar valiosa información

sobre el efecto del vertido tóxico sobre la dinámica poblacional.

En este apartado del informe analizamos si la probabilidad de reavistamiento de

un individuo esta afectada por haber nacido antes o después del vertido tóxico de 1998.

MÉTODOS:

Para abordar el estudio del efecto del vertido tóxico sobre la supervivencia de la

cigüeña blanca nos hemos centrado en la información disponible para los pollo anillados

en la colonia de la “Dehesa de Abajo” (Puebla del Río, Sevilla). Se ha escogido esta

colonia de cigüeña blanca por estar situada a escasos 3 kilómetros de la zona hasta donde

llegaron los lodos tóxicos de la mina de Aznalcóllar. Además, los pollos de las parejas

reproductoras en la colonia se vienen anillando desde 1986 con anillas de plástico con un

código alfanumérico que permite su lectura a distancia con la ayuda de telescopios

terrestres, lo que posibilita el control de la supervivencia de las cigüeñas sin necesidad de

ser recapturadas.

Para contestar a la pregunta de si el hecho de haber nacido durante o después del

vertido esta afectando a la supervivencia de las cigüeñas se ha realizado una

aproximación complementaria. Para ello hemos comparado la proporción de cigüeñas

anilladas como pollos antes o después del vertido que han sido vistas en años posteriores.

Se han comparado por separado para cada edad entre 1 y 5 años las tasas de

reavistamientos entre 1998 y 2003 de cigüeñas nacidas antes del año 1998 o en el año

1998 o posterior. La edad máxima de 5 años esta constreñida por la máxima edad que

puede tener en el 2003 una cigüeña nacida el año del vertido (1998) o posterior. Para

cada edad se ha realizado un test de la χ2 para ver si la diferencia es significativa. Además

7

se ha hecho el estudio con los reavistamientos en la propia colonia de la Dehesa de Abajo

y en la totalidad de Doñana y su entorno.

RESULTADOS:

Desde 1986 hasta el 2002 se han anillado un total de 3.498 pollos con anillas de plástico

de lectura a distancia (ver tabla 1 por datos por año), y desde 1989 hasta 2003 se han

realizado un total de 826 lecturas de cigüeñas en la propia colonia de la Dehesa de Abajo

y 1997 incluyendo las lecturas realizadas en Doñana y su entorno. (contabilizando una

sola lectura por individuo y año, ver tabla 1 para los datos pormenorizados por años y

cohortes).

Tabla 1. Número de anillamientos (en negrita) y cigüeñas vistas entre enero y agosto en

la colonia de la Dehesa de Abajo. Los números de cigüeñas vistas hacer referencia a

número de cigüeñas distintas en un mismo año, o sea, que una cigüeña vista 4 veces en

un mismo año contabiliza como una sola observación. En cada fila se representa el

número de anillamientos y posteriores lecturas de cigüeñas nacidas (en negrita) y vistas

en la colonia en años posteriores. Por ejemplo, en el 2001 se anillaron 575 pollos de los

cuales 6 se vieron en el año 2002 y 23 se vieron en la colonia en el 2003.

86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 0 1 2 3 86 65 0 0 3 12 8 1 0 0 0 1 0 2 5 2 2 3 2 87 98 0 1 6 4 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 88 126 0 8 7 2 1 0 0 0 0 1 3 2 1 1 0 89 125 5 3 1 1 0 0 0 0 0 4 4 4 3 3 90 115 0 0 2 0 0 2 1 4 8 7 4 6 4 91 195 0 0 0 0 3 0 3 10 9 12 8 8 92 143 0 0 0 0 0 3 9 8 10 5 9 93 104 0 0 0 0 4 5 4 4 3 3 94 220 0 0 3 12 21 17 11 13 1495 74 0 0 2 6 8 8 4 3 96 0 0 0 0 0 0 0 0 97 355 1 11 27 34 31 3598 330 3 30 31 29 2699 401 3 16 38 350 256 1 26 301 575 6 232 316 2

8

Tabla 2. Similar a la Tabla 1, pero incluyendo los reavistamientos en la totalidad de

Doñana y su entorno 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02 0386 65 2 11 5 15 10 3 1 1 2 5 3 2 3 3 87 98 11 5 13 6 1 3 2 1 1 88 126 7 21 18 2 6 6 4 2 1 1 6 3 1 2 89 125 21 13 10 8 7 4 6 3 4 14 7 8 10 6 90 115 7 10 9 4 10 2 6 13 7 4 6 6 91 195 3 15 8 7 13 11 6 23 12 16 13 1792 143 5 8 6 10 4 8 16 13 12 10 1493 104 1 2 6 6 10 11 9 6 6 7 94 220 5 31 22 26 46 27 24 27 2695 74 7 12 5 17 9 8 5 4 96 0 97 355 13 51 46 45 47 4998 330 50 68 58 56 5699 401 42 52 71 8000 256 19 39 5501 575 17 5802 316 16

El análisis del porcentaje de individuos nacidos antes/después del vertido tóxico

que fueron posteriormente vistos en la colonia de la Dehesa de Abajo muestra una ligera

tendencia a una mayor recuperación de individuos de 2 y 3 años de edad nacidos después

del vertido respecto a los nacidos antes del vertido. De todas formas esta tendencia no se

observa para las cigüeñas de 1, 4 y 5 años de edad (Tabla 3). La Tabla 4 muestra los

resultados cuando se consideraron las lecturas realizadas en toda la zona de Donñana de

los individuos nacidos en la Dehesa de Abajo. También se observa en esta ocasión una

cierta tendencia a presentar una tasa de reavistamiento mayor después del vertido en las

clases de edad 1, 3, y 4.

Tabla 3. Porcentaje de individuos nacidos en la colonia de la Dehesa de Abajo y vistos en

la colonia en años posteriores dependiendo de su edad y de haber nacido antes o después

del vertido tóxico.

ANTES DESPUÉS Edad (años) Anill. Vistos % Anill. Vistos % χ2 p-valor 1 355 1 0.28 1878 15 0.80 0.504 0.478 2 355 11 3.10 1562 95 6.08 4.493 0.034 3 429 29 6.76 987 99 10.03 3.284 0.070 4 649 52 8.01 731 64 8.76 0.208 0.648 5 753 64 8.50 330 26 7.88 0.098 0.754

9

Tabla 4. Porcentaje de individuos nacidos en la colonia de la Dehesa de Abajo y vistos en

la colonia o en Doñana y entorno de Doñana en años posteriores dependiendo de su edad

y de haber nacido antes o después del vertido tóxico.

ANTES DESPUÉS Edad (años) Anill. Vistos % Anill. Vistos % χ2 p-valor 1 355 13 3.66 1878 144 7.67 6.534 0.0105 2 355 51 14.37 1562 217 13.89 0.041 0.8402 3 429 51 11.89 987 184 18.64 7.22 0.0072 4 649 88 13.56 731 136 18.6 4.653 0.0310 5 753 112 14.87 330 56 16.97 0.559 0.4548 CONCLUSIONES:

El análisis de la supervivencia de poblaciones salvajes como la que nos ocupa entraña

grandes dificultades estadísticas porque el hecho de no ver un individuo en un cierto año

puede ser debido a distintos factores: estar muerto, no estar en la zona de estudio, o estar

en la zona de estudio pero no haberse podido detectar. Por lo tanto distintos procesos

pueden conducir a similares patrones.

Además, cuando el esfuerzo de reavistamiento de individuos es variable

interanualmente es muy difícil extraer conclusiones no sesgadas de los datos. Esto es

posiblemente lo que ha sucedido a la hora de analizar la supervivencia de los pollos

nacidos antes y después del vertido, puesto que aún y controlando por la edad de los

individuos, la probabilidad de reavistamiento ha ido aumentando (gracias en parte a la

financiación de este proyecto) en el transcurso de los años. Por lo tanto, el aumento

aparente en la supervivencia de los pollos nacidos después del vertido que se ha

encontrado en este apartado del informe puede estar respondiendo a un aumento del

esfuerzo de reavistamiento, más que a un aumento real en la tasa de supervivencia.

Por todo esto, estamos en curso de realizar en las próximas semanas (y presentar a

la Junta de Andalucía) análisis estadísticos con programas específicos de captura-

recaptura en los que es posible controlar estadísticamente por estos factores de

probabilidad de recaptura. De esta manera podremos calcular parámetros de

supervivencia no sesgados, con los que poder responder no sólo si los pollos nacidos

después del vertido presentan mayor o menor supervivencia que los nacidos con

anterioridad, sino también poder analizar si la supervivencia de los adultos que estaban

10

vivos durante el vertido del 1998 se vieron afectados negativamente por la

contaminación. No obstante, los primeros resultados de estos análisis, aunque todavía

preliminares, parecen sugerir un aumento de la mortalidad juvenil tras el vertido tóxico.

11

3. EFECTO DEL VERTIDO TÓXICO DE AZNALCÓLLAR EN LA

REPRODUCCIÓN DE LA CIGÜEÑA BLANCA INTRODUCCIÓN: El éxito en la cría junto con la supervivencia es parte indispensable para entender la

dinámica de una población (Stearns 1999). En este apartado del informe se aborda la

pregunta de cuál ha sido el efecto del vertido tóxico de Aznalcóllar sobre la reproducción

de la cigüeña blanca en Doñana y su entorno.

Para poder contestar a esta pregunta se han realizado dos aproximaciones

complementarias:

En primer lugar se ha hecho un estudio en el tiempo de la reproducción de la

cigüeña blanca en la colonia de la Dehesa de Abajo. Esta aproximación ha sido posible

gracias a una larga serie de datos de unos 20 años (según la variable considerada)

recopilada por el Equipo de Seguimiento de la Estación Biológica de Doñana (C.S.I.C.).

Para saber si el vertido ha tenido algún efecto sobre la reproducción de la colonia primero

se ha estudiado qué otros factores regulan la población. Para ello se ha analizado el efecto

de la climatología, la extensión de arrozales y la densodependencia sobre la reproducción

(productividad y tasa de vuelo), y después se ha estudiado si el vertido tóxico ha tenido

algún efecto sobre esta reproducción.

En segundo lugar se ha hecho un estudio en el espacio, comparando la

reproducción en 2002 y 2003 de distintas colonias de Sevilla y Huelva a distintas

distancias del vertido tóxico, y por lo tanto con diferentes probabilidades de haberse visto

afectadas por el vertido. En esta segunda aproximación, puesto que la climatología y los

arrozales es similar en las distintas colonias en un mismo año, no ha sido necesario

controlar por estas variables, pero si que se ha estudiado el efecto de la densodependencia

a distintas escalas sobre la reproducción.

12

3.1 ESTUDIO LONGITUDINAL EN LA COLONIA DE CIGÜEÑA BLANCA DE

LA DEHESA DE ABAJO

3.1.1 TAMAÑO DE PUESTA

INTRODUCCIÓN:

En este apartado del informe se pretende estudiar si el vertido tóxico ha afectado al

tamaño de puesta (número de huevos en un nido) de la cigüeña blanca en la colonia de la

Dehesa de Abajo. El tamaño de puesta fija el máximo de pollos que puede sacar adelante

una pareja en un año, y por lo tanto su estudio es relevante para entender la dinámica de

la población. El estudio de la evolución de los factores que influyen a las hembras a la

hora de decidir cuantos huevos poner en un año concreto tiene una larga historia (Lack

1947, Monaghan & Nager 1997, Bennet & Owens 2002). En especies de larga vida como

es el caso de la cigüeña blanca el balance entre la reproducción presente y la

reproducción en próximos años (valor reproductivo residual) tiene gran relevancia,

puesto que no invertir mucha energía en un año “malo” puede permitir guardar fuerzas

para años posteriores más propicios para la cría (Stearns 1999).

Por lo tanto, para poder abordar la pregunta de si el vertido tóxico ha tenido algún

efecto sobre el tamaño de puesta de la cigüeña hay que controlar por factores cambiantes

anualmente que puedan estar afectando a las decisiones de las hembras, y una vez

conocidos estos factores ver como ha afectado el vertido tóxico.

La puesta de los huevos en la colonia de la Dehesa de Abajo empieza a principios

de Marzo (un mes antes que empiecen a nacer los pollos). Por lo tanto, como medida de

las condiciones ambientales que las hembras perciben antes de la puesta de los huevos se

ha estudiado el estado de inundación de la marisma. Como medida del estado de

inundación de la marisma hasta justo antes de la puesta de los huevos se ha utilizado la

lluvia acumulada desde Septiembre hasta Febrero.

Además, en una colonia en constante crecimiento como es el caso de estudio, las

hembras pueden percibir la densidad de parejas reproductoras como una fuente de

competencia a la hora de alimentar a los pollos (Forero et al. 2002), o incluso como

fuente potencial de agresiones por parte de otras parejas (Bryan 1991, Frederick, 1986).

Bajo este escenario, las hembras podrían decidir reducir el tamaño de puesta a medida

que incrementara el número de parejas en la colonia, como se ha visto en la población de

13

garcilla cangrejera (Ardeola ralloides) de la Camarga francesa (Hafner et al. 2001). Por

lo tanto, también se ha estudiado la relación entre el tamaño de puesta y el tamaño de la

colonia antes de abordar el efecto del vertido tóxico.

MÉTODOS:

Desde 1981 hasta el 2003 se ha recopilado información apropiada sobre tamaño de puesta

en la Dehesa de Abajo en diez años distintos. Para ello se han realizado visitas periódicas

a la colonia de cigüeñas con un espejo pegado a la punta de un palo largo con el que se

inspeccionaba el contenido de los nidos sin tenerse que subir a ellos, aumentando así la

velocidad de inspección y disminuyendo las molestias a la colonia.

Se han considerado como datos apropiados para este estudio los provenientes del

registro directo de número de huevos en el nido, realizándose en la mayoría de los casos

más de una visita al nido antes de la eclosión de los huevos, para asegurarse que el

tamaño de puesta era el definitivo. Además, también se han considerado válidos los datos

de tamaño de puesta calculados a partir de nidos en los que se registró el número de

pollos de edad inferior a cinco días. Los datos de siete años en los que se registró el

tamaño de puesta de un número inferior a 8 nidos no se han contemplado en el análisis

puesto que además de aportar poca información, podrían representar una submuestra

sesgada de la población (p.ej. nidos tardíos).

Los datos de precipitación se ha obtenido de la página en Internet de la Reserva

Biológica de Doñana (C.S.I.C): http://www-rbd.ebd.csic.es

Para mayor claridad se presentan primero las relaciones del tamaño de puesta con

cada variable por separado y después se aborda un estudio multivariante del efecto

conjunto de las dos variables ambientales (lluvia invernal y tamaño de colonia) sobre el

tamaño de puesta.

RESULTADOS:

La precipitación acumulada en invierno ha resultado ser variable en los años de que se

dispone de información sobre el tamaño de puesta (Figura 1), desde menos de 200 mm.

hasta casi 800 mm. Asimismo, el tamaño de colonia ha pasado de 37 parejas el primer

año de estudio hasta un máximo de 280 parejas. Por lo tanto, se dispone de variabilidad

14

suficiente para estas dos variables como para justificar el estudio de su posible efecto

sobre el tamaño de puesta.

Figura 1. Evolución de la precipitación invernal y del tamaño de la colonia de cigüeña

blanca de la Dehesa de Abajo en los diez años entre el 1981 y el 2003 de los que se

dispone de información de tamaño de puesta.

Plot 1

Año

1980 1982 1984 1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004

Pre

cipi

taci

ón d

e S

eptie

mbr

e a

Febr

ero

0

200

400

600

800

Núm

ero

de p

arej

as

0

50

100

150

200

250

300

Excluyendo el mínimo de tamaño de puesta de 1981, el resto de años presentó un

tamaño de puesta bastante estable, entre los 3.2 y los 3.8 huevos por nido (Figura 2).

La precipitación acumulada en invierno no presentó una relación significativa con

el tamaño de puesta (rs = 0.236, n = 10, p = 0.500; Figura 3), y el tamaño de la colonia

presentó una relación positiva con el tamaño de puesta marginalmente significativa (rs =

0.576, n = 10, p = 0.082; Figura 4).

15

Figura 2. Evolución del tamaño de puesta en diez años entre el 1981 y el 2003 en la

colonia de cigüeña blanca de la Dehesa de Abajo. Las barras de error representan los

límites superior e inferior del 95%. Los números hacen referencia al número de nidos de

los que se dispone de información de tamaño de puesta para cada año.

Año

1980 1982 1984 1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004

Tam

año

de p

uest

a

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0Año del vertido tóxico

24

44 44

36

68

132

230

193228

72

16

Figura 3. Relación entre el tamaño de colonia y el tamaño de puesta en la colonia de

cigüeña blanca de la Dehesa de Abajo.

Precipitación entre Septiembre y Febrero

200 400 600 800

2.5

3.0

3.5

4.0

Antes del vertido tóxicoDespués del vertido tóxico

Tam

año

de p

uest

a

Figura 4. Relación entre el tamaño de colonia y el tamaño de puesta en la colonia de

cigüeña blanca de la Dehesa de Abajo.

Número de parejas

0 50 100 150 200 250 300

Tam

año

de p

uest

a

2.5

3.0

3.5

4.0

Antes del vertido tóxicoDespués del vertido tóxico

17

La media del tamaño de puesta antes del vertido (media (desviación tipica) = 3.33

(0.83)) fue ligeramente inferior a la media del tamaño de puesta después del vertido

tóxico (media (desviación tipica) = 3.57 (0.95); test t-Student, t= -3.717, p < 0.0001,

Figuras 5 y 6). La inclusión o no del año 1981 (ver Figura 2) no afectó a los resultados.

Figura 5. Histograma del tamaño de puesta antes del vertido (años 1981, 1982, 1983,

1989).

Tamaño de puesta

654321

Núm

ero

de n

idos

100

80

60

40

20

0

18

Figura 6. Histograma del tamaño de puesta después del vertido (años 1999, 2000, 2001,

2002, 2003).

Tamaño de puesta

654321

Núm

ero

de n

idos

500

400

300

200

100

0

Controlando estadísticamente por la precipitación invernal, el tamaño de puesta

no cambió significativamente entre antes y después del vertido (GLM lluvia invernal χ21

= 0.56, p = 0.4563; efecto del vertido tóxico χ21 = 2.44, p = 0.1183). De la misma

manera, cuando se controló estadísticamente por el efecto del tamaño poblacional, el

efecto positivo que se había encontrado del vertido sobre el tamaño de puesta

desapareció, aunque se mantuvo marginalmente significativo (GLM número de parejas

en la colonia χ21 = 3.12, p = 0.0771; efecto del vertido tóxico χ2

1 = 2.98, p = 0.0845).

CONCLUSIONES:

Aunque el tamaño medio de puesta los años después del vertido fue significativamente

más alto que los años antes del vertido tóxico, hay que tener en cuenta que este

incremento fue de 3.33 a 3.58 huevos, poniendo de manifiesto que este resultado

estadístico ha sido significativo por el elevado tamaño muestral disponible, pero no a

causa de un aumento biológicamente relevante para la población.

19

Además, cuando se controló estadísticamente por el efecto del tamaño poblacional

la diferencia en tamaño de puesta entre antes y después del vertido desapareció.

En conclusión, el tamaño de puesta se ha mantenido prácticamente estable entre

antes y después del vertido tóxico. Por lo tanto, abordamos los próximos apartados del

informe, que tratan sobre el posible efecto del vertido en la reproducción, partiendo de la

base de que las variaciones interanuales en éxito de reproducción son debidas en

mayormente a diferencias en el éxito en la cría de los pollos, y no al número de huevos

puestos.

20

3.1.2 EFECTO DE LA CLIMATOLOGÍA EN LA SUPERVIVENCIA DE LOS

POLLOS

INTRODUCCIÓN:

La supervivencia de los pollos en el nido se ha visto en numerosos estudios que se puede

ver afectada por eventos de climatología adversa (Schipper 1978, Coulter & Bryan 1995,

Adamcik et al. 1999, Dawson & Bortolotti 2000).

Para poder evaluar el efecto del vertido tóxico sobre el éxito de la cría de las

cigüeñas es de máxima importancia entender los mecanismos que regulan en condiciones

naturales su reproducción, para poder discernir que parte de las diferencias entre años en

la reproducción es explicada por diferencias en factores extrínsecos al vertido, y que parte

está explicada por el efecto del vertido tóxico.

Como se ha puesto de manifiesto en el apartado anterior del informe, el tamaño de

puesta se ha mantenido estable entre antes y después del vertido. Por lo tanto, para

entender el éxito de la cría de las cigüeñas es clave entender los mecanismos que afectan

al éxito en la cría de los pollos. Un factor muy relevante en especies semialtriciales como

la cigüeña blanca (en las que los pollos permanecen en el nido hasta que son capaces de

volar) es la adquisición de la capacidad de termoregular autónomamente. Esto es debido a

que estas especies nacen con poca protección de plumas, requiriendo de la atención de los

padres para aumentar o disminuir su temperatura corporal según sean las condiciones del

ambiente. Es por esto que los pollos de las especies como la cigüeña blanca son

especialmente sensibles a las condiciones meteorológicas adversas durante las primeras

semanas de vida. Tortosa & Castro (2003) han estudiado en detalle la termorregulación

en los pollos de cigüeña blanca en colonias cercanas a la Dehesa de Abajo, y han descrito

que los pollos consiguen termorregular autónomamente a partir de los 15-20 días de edad.

En la Dehesa de Abajo los nidos están expuestos tanto al sol como a la lluvia, puesto que

se sitúan en lo altos de acebuches. Por lo tanto, variaciones interanuales en las

condiciones climatológicas son una fuente potencial de variaciones interanuales en el

éxito de cría de las cigüeñas.

En este apartado del informe se evalúa 1. Cuál es esta etapa crítica en el

desarrollo de los pollos de cigüeña blanca y 2. Se cuantifica qué efecto ha tenido la

climatología sobre la supervivencia de los pollos entre años.

21

MÉTODOS:

Para estudiar el efecto de la edad de los pollos sobre su probabilidad de mortandad se

requiere de un seguimiento detallado de la cría, puesto que (como veremos más adelante)

la mortandad se concentra en los primeros días de vida, y por lo tanto un seguimiento

poco fino puede pasar por alto información relevante. Para este informe se ha conseguido

recopilar información de alta calidad de los siguientes años: 1988, 1989, 1990, 1993 y

desde 1998 hasta 2003. Estos años, cuando se registraba el contenido de los nidos desde

el suelo con la ayuda de un espejo al extremo de un palo largo, se apuntaba la clase de

edad a la que pertenecían los pollos del nido. Esto se realizaba muy rápidamente con la

ayuda de ilustraciones de pollos de edad conocida, distinguiendo 5 clases de edad (1: de 1

a 10 días; 2: 11-20; 3: 21-33; 4: 34-45; 5: 46-59).

Con las repetidas observaciones de los mismos nidos a lo largo de la época

reproductora se pudo estudiar la mortandad de los pollos a distintas clases de edad a

partir de la diferencia en número de pollos entre visitas sucesivas. Con esta información

se calculó la probabilidad de que un pollo en cada clase de edad entre la 1 y la 4 llegara

vivo a la clase de edad 5, y por probabilidades condicionadas se calculó para cada clase

de edad entre la 1 y la 4 la probabilidad de llegar vivo a la siguiente clase de edad.

Para estudiar el efecto de la climatología sobre la mortandad de los pollos

utilizamos los datos meteorológicos de la estación meteorológica de la “Dehesa Nueva”

(Aznalcázar), a unos 10 km de la zona de estudio, subministrados por el Instituto

Nacional de Meteorología. Como que la mayoría de los pollos mueren entre el día de

nacimiento y los 20 días de vida (ver resultados), tuvimos que utilizar un método que nos

permitiera hacer comparables las tasas de mortandad entre años, ya que si no estaríamos

sobrestimando la mortandad en aquellos años en los que la primera inspección de los

nidos fuera cuando los pollos estaban más pequeños, y por lo tanto con mayor

probabilidad de morir. Para ello lo que se hizo fue utilizar los datos de pollos vistos

durante la clase de edad 1 (entre 1 y 10 días de vida) cuyo nido fuera visitado al menos

16 días más tarde (como mínimo en la clase de edad 3). Además se excluyeron periodos

entre visitas que supusieran una edad final del pollo mayor de 60 días. De esta manera

conseguimos que la tasa de mortandad no estuviera afectada por el número de días del

periodo puesto que ya se había superado la fase crítica, y al mismo tiempo se evitaba que

un pollo que había volado del nido se registrara como muerto (puesto que los pollos

abandonan el nido a partir de los 60 días, Redondo et al. 1995).

22

Para definir qué meses son los más relevantes para la supervivencia de los pollos

se estudió la fecha de nacimiento desde 1999 hasta 2003. La fecha de nacimiento de cada

nido se calculó con el ala del pollo más grande de cada nido con la ecuación presentada

por Chozas (1983):

Día de nacimiento = Día de medida del ala - (5.068+ 0.117*Ala).

Debido al clima mediterráneo de la zona de estudio se hipotetizó a priori que la

mortandad de los pollos por estrés térmico se podían producir tanto por periodos

lluviosos y de temperaturas bajas como por periodos con temperaturas máximas

extremas. Por lo tanto, nuestra hipótesis de partida fue que tanto el total de lluvia caída

durante el tiempo en que los pollos son pequeños en la colonia, como la media de las

temperaturas máximas del mismo periodo podían estar afectando la mortandad de los

pollos. Se utilizó la climatología entre el 1 de Abril y el 15 de Mayo puesto que el

análisis de las fechas de nacimiento indicó que era en estas fechas cuando la mayoría de

pollos de la colonia pasan por sus clases de edad 1 y 2 (ver resultados).

Puesto que los pollos de un mismo nido comparten muchas características y

sufren similares condiciones ambientales, la supervivencia de los hermanos no se puede

considerar como unidades de análisis independiente. Es por esto que utilizamos Modelos

Lineales Generalizados Mixtos introduciendo el nido de nacimiento como efecto

aleatorio. Como variable dependiente se utilizó la suerte de cada pollo al final del periodo

(1: vivo, 0: muerto) y como variables independientes la lluvia acumulada caída entre el 1

de Abril y el 15 de Mayo y la media de las temperaturas máximas diarias. Se implementó

el modelo con una distribución de error binomial y una función de enlace logit (Littell et

al. 1996). Por lo tanto, en el caso que nos ocupa, el Modelo Lineal Generalizado Mixto

que se implementó equivale a una regresión lineal, pero con la ventaja estadística que se

está controlando estadísticamente por la similaridad entre los pollos de un mismo nido, y

por lo tanto por la pseudoreplicación de los datos.

RESULTADOS:

La mortandad de los pollos se acumuló sobretodo en las dos primeras clases de edad, o

sea, entre el día de nacimiento y los 20 días de edad (Tabla 1).

23

Tabla 1. Tabla de vida de la estancia de los pollos en el nido. “% Vivos” es la

probabilidad de un pollo de una clase de edad de llegar a la clase de edad 5 (ente 46 y 59

días); px representa la probabilidad de pasar de una clase de edad a la siguiente. “% Total

muertos” es el porcentaje de mortandad que acumula cada clase de edad del total de

pollos que mueren durante su estancia en el nido.

Clase de Edad

Rango de Edades (en días) Muertos Total % Vivos px

% Total muertos

1 1-10 137 142 50.9 0.640 73.2 2 11-20 31 120 79.5 0.864 17.8 3 21-33 32 369 92.0 0.937 7.0 4 34-45 4 213 98.2 0.982 1.9

La fecha de nacimiento de los pollos en la colonia entre 1998 y 2003 varió

ligeramente, pero el grueso de los pollos en todos los años pasó sus primeras semanas de

vida en el nido entre el 1 de Abril y el 15 de Mayo (Figura 1).

24

Figura 1. Diagrama de cajas de la fecha de nacimiento de los pollos entre 1998 y 2003.

Las cajas indican el 50% de los valores, las barras de error los límites del 10 y 90% y los

círculos los valores extremos. Los números en el interior de las cajas indican el número

de nidos de los que se dispone de información de la fecha de nacimiento.

70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Año

1998

1999

2000

2001

2002

2003

127

160

128

204

106

31

Fecha de nacimiento

1 de Abril ------- ------- 15 de Mayo

La climatología y la supervivencia fue muy variable entre años (Figura 2 y 3).

La temperatura tuvo un efecto positivo sobre la supervivencia de los pollos

(GLMM F1,886 = 43.86, P < 0.0001), pero cuando se introdujeron las dos variables

climatológicas en el modelo, la temperatura máxima no se retuvo en el modelo (GLMM

F1,887 = 2.64, P = 0.1048), y solo se conservó el efecto negativo de la lluvia (GLMM

F1,885 = 49.02, P < 0.0001; Fig 3) sobre la supervivencia de los pollos.

25

Figura 2. Climatología durante los años de que se dispone de información sobre la

supervivencia de los pollos.

Año

1988 1989 1999 2000 2001 2002 2003

mm

de

lluvi

a en

tre 1

Abr

il - 1

5 M

ayo

0

50

100

150

200

250

Med

ia d

e te

mpe

ratu

ras

máx

imas

(ºC

)

21

22

23

24

25

26

27

Figura 3. Supervivencia de los pollos desde la clase de edad 1 (1-10 días) hasta después

de pasar la fase crítica de mortandad (cuando ya tienen más de 20 días). Ver texto para

detalles.

Año

1988 1989 1999 2000 2001 2002 2003

Sup

ervi

venc

ia d

e lo

s po

llos

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

26

Figura 3. Relación entre la lluvia entre el 1 de Abril y el 15 de Mayo y la supervivencia

de los pollos.

mm de lluvia entre el 1 Abril - 15 Mayo

0 50 100 150 200 250

Sup

ervi

venc

ia d

e lo

s po

llos

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

CONCLUSIONES:

Los resultados de este apartado del informe ponen de manifiesto la importancia de la

lluvia como agente regulador de la mortalidad de pollos de cigüeña blanca en la colonia

de la Dehesa de Abajo.

En resumen, se ha encontrado que la mortalidad de los pollos se concentró durante

sus primeros días de vida, siendo especialmente elevada en aquellos años en que llovió

más durante la estancia de los pollos en el nido. Por lo tanto, la lluvia entre el 1 de Abril y

el 15 de Mayo de cada año es una variable a tener en cuenta a la hora de comparar el

éxito reproductor entre antes y después del vertido tóxico de Aznalcóllar.

27

3.1.3 EFECTO DE LA CLIMATOLOGÍA EN LA REPRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN:

La climatología es sabido que afecta a la reproducción de las aves (Steenhof et al. 1997,

Bennetts et al. 2000, Stevenson & Bryant 2000, Rodríguez & Bustamante 2003), y que

este efecto puede ser muy distinto dependiendo de la zona geográfica (Redpat et al 2000).

En el caso de las cigüeñas, se ha demostrado un efecto negativo de la lluvia caída en

Mayo sobre su reproducción en una población del centro de la Península Ibérica

(Carrascal et al 1993). Moritzi et al. (2001) también encontraron un efecto negativo de la

lluvia sobre la reproducción de la cigüeña en Suiza, y también un efecto positivo de la

temperatura. Sásvari & Hegyi (2001) documentan el efecto perjudicial de las bajas

temperaturas sobre la tasa de vuelo de las cigüeñas en Hungría. Además, en otras

especies de ciconiformes americanas, la lluvia también se ha visto que está relacionada

con el decrecimiento del éxito reproductor (Frederick & Callopy 1989). En nuestra

colonia de estudio se ha puesto de manifiesto en el capítulo anterior que la precipitación

durante la estancia de los pollos de temprana edad en el nido disminuye la probabilidad

de supervivencia de los mismos. Por lo tanto, hay fuertes evidencias que apoyan el efecto

de la lluvia sobre la reproducción de la cigüeña en la colonia de la Dehesa de Abajo.

Como que la lluvia caída en Abril y Mayo es especialmente variable interanualmente, es

de esperar que la lluvia pueda estar enmascarando el posible efecto del vertido tóxico

sobre el éxito de cría de las cigüeñas.

En este capítulo del informe se analiza cómo afecta la lluvia caída durante la fase

crítica de la estancia de los pollos en el nido, a la reproducción (productividad y tasa de

vuelo) de la cigüeña en la Dehesa de Abajo, con el propósito de ser capaces de corregir

por este potencial efecto a la hora de estudiar el efecto del vertido tóxico sobre la

reproducción de la cigüeña blanca.

28

MÉTODOS:

A partir de datos diarios de precipitación registrados en la estación meteorológica de la

“Dehesa Nueva” a 10 Km de la zona de estudio, se ha calculado para cada año el total de

precipitación registrada entre el 1 de Abril y el 15 de Mayo.

Se han calculado dos variables del éxito de cría: la productividad y la tasa de

vuelo. La productividad es el número de pollos volados en la colonia dividido por el

número de parejas reproductoras en ese año. Por lo tanto, este cuociente incluye aquellos

nidos en los que había establecida una pareja de cigüeñas pero de los que no llegó a volar

ningún pollo. La tasa de vuelo hace referencia al número de pollos volados en la colonia

dividido por el número de parejas que tuvieron éxito en la cría. Por lo tanto, estas dos

variables contienen información complementaria que nos puede ayudar a entender la

dinámica de la colonia.

La productividad se pudo calcular para 18 años entre 1981 y 2003, y hubo datos

suficientes para calcular la tasa de vuelo en 21 años. Para ello se visitaron los nidos

repetidas veces hacia al final de la época de cría para registrar el número de pollos que

llegaban a volar en cada nido. Esto se realizó con un espejo en lo alto de un palo largo

para inspeccionar el contenido del nido desde el suelo, y también con la ayuda de

catalejos terrestres para las últimas fases de la estancia de los pollos en los nidos.

RESULTADOS:

En la Figura 1 se ha graficado la evolución de la precipitación ente el 1981 y el año 2003

así como la productividad y la tasa de vuelo, haciéndose aparente la estocasticidad de la

lluvia entre años.

29

Figura 1. Variación anual en la precipitación entre el 1de Abril y el 15 de Mayo (barras),

así como la productividad (cuadrados) y la tasa de vuelo (triángulos) en la colonia de

cigüeña blanca de la Dehesa de Abajo.

Año

1980 1983 1986 1989 1992 1995 1998 2001 2004

Pre

cipi

taci

ón d

e 1A

bril

a 15

May

o

0

50

100

150

200

Núm

ero

de p

ollo

s / n

ido

0

1

2

3

0

1

2

3ProductividadTasa de vuelo

Año del vertido tóxico

Como se ve en la Figura 1 la reproducción de la colonia presenta decrecimientos

locales en algunos de los años de máximos de precipitación, aunque muchos años de altas

precipitaciones presentan valores altos de reproducción (p.ej. 1989, o 1998) y años de

muy baja precipitación pueden presentar reproducciones bajas (p.e.j. 1995), produciendo

una relación negativa pero no significativa estadísticamente ente la precipitación entre el

1 de Abril y el 15 d Mayo y la productividad (rs = -0.319, n = 18, p = 0.197; Figura 2) y

la tasa de vuelo (rs = -0.040, n = 21, p = 0.865; Figura 3) de la colonia.

30

Figura 2. Relación entre la precipitación entre el 1 de Abril y el 15 d Mayo y la

productividad de la colonia de cigüeña blanca de la Dehesa de Abajo.

Precipitación de 1Abril a 15 Mayo

0 50 100 150 200

Pro

duct

ivid

ad

0

1

2

3

Antes del vertido tóxicoDespués del vertido tóxico

Figura 3. Relación entre la precipitación entre el 1 de Abril y el 15 d Mayo y la tasa de

vuelo de la colonia de cigüeña blanca de la Dehesa de Abajo.

Precipitación de 1Abril a 15 Mayo

0 50 100 150 200

Tasa

de

vuel

o

1

2

3

Antes del vertido tóxicoDespués del vertido tóxico

31

CONCLUSIONES:

Aunque se ha visto en un capítulo anterior que la precipitación afecta a la supervivencia

de los pollos, cuando se comparó la reproducción a lo largo de los años con la lluvia

caída durante la estancia de los pollos de temprana edad en el nido no se encontró una

relación fuerte. De todas formas, en el caso de la productividad la falta de significación

estadística parece ser debida más a una carencia de tamaño muestral, más que a una

ausencia de real de efecto (ver Figura 2). Por lo tanto, con la sospecha de que realmente

existe una relación negativa entre la lluvia y la reproducción, recuperaremos el análisis de

esta variable en capítulos posteriores del informe para corregir posibles efectos de la

climatología sobre la reproducción que podrían enmascarar el efecto del vertido tóxico.

32

3.1.3 CRECIMIENTO DE LA COLONIA Y EFECTOS

DENSODEPENDIENTES EN LA REPRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN:

La colonia de la Dehesa de Abajo se fundó en el 1973 cuando tres parejas de cigüeña

blanca empezaron a criar construyendo los primeros nidos en lo alto de los acebuches de

la Dehesa. Actualmente el número de parejas reproductoras asciende hasta las 250-280.

La reproducción se sabe que está afectada por procesos que dependen de la

densidad (procesos densodependientes, Bennetts et al. 2000, Selås 2001, Elmberg 2003,

Nummi & Saari 2003). En el caso de las aves coloniales la densidad de conspecíficos se

ha demostrado que puede afectar al éxito en la cría (Pienkowski & Evans 1982). A causa

del enorme crecimiento que ha vivido la colonia de la Dehesa de Abajo desde 1973

pasando a ser una de las colonias más grandes de Europa, es de esperar que la

densodependencia sea un proceso regulador de la reproducción de la cigüeña en la

colonia. Por lo tanto, en el caso de la cigüeña blanca en la Dehesa de Abajo nuestra

hipótesis de partida fue es que el número de parejas de la colonia puede tener un efecto

negativo sobre su reproducción debido a peleas durante la fase de puesta de los huevos o

cría de los pollos (Bryan & Coulter 1991, Reville 1991, Coulter & Bryan 1995), o por

agotamiento de los recursos alimenticios alrededor de la colonia (Forero et al. 2002), lo

que haría más costosa la obtención de alimento.

En este capítulo se analiza el crecimiento de la colonia desde su formación hasta

el año 2003, y se estudia la relación entre el tamaño de la colonia y la reproducción de las

cigüeñas desde 1979 hasta el año 2003.

MÉTODOS:

Los métodos utilizados para este apartado no difieren de los utilizados en capítulos

anteriores en cuanto al trabajo de campo. Sólo añadir que los datos anteriores a 1981 se

han extraído de un estudio publicado por Rubio et al. (1983).

El número de parejas se ha calculado como el número de nidos en que se detectó

la cría (presencia de huevos y pollos), más aquellos nidos en los que hubo evidencias de

33

cría (cáscaras) o que había evidencias de que había habido una pareja (nido arreglado con

material nuevo, avistamiento de la pareja con comportamiento reproductor a través de

catalejos terrestres, etc.).

RESULTADOS:

La evolución del número de parejas reproductoras ha seguido los pasos propios de una

población en expansión sin estar limitada por la disponibilidad de emplazamientos para

la nidificación (Oro & Ruxton 2001, Figura 1). Primero pasó por unos años de poco

crecimiento y después adoptó un crecimiento exponencial. Por último, parece que

actualmente está un poco estabilizada, aunque solo los próximos años de estudio podrán

decirnos si se trata de una saturación real o solo un simple receso en el crecimiento de la

colonia.

Figura 1. Evolución del número de parejas (círculos), la productividad (cuadrados) y la

tasa de vuelo (triángulos) en la colonia de cigüeñas blanca de la Dehesa de Abajo.

Año

1972 1976 1980 1984 1988 1992 1996 2000 2004

Núm

ero

de p

arej

as

0

50

100

150

200

250

300

Núm

ero

de p

ollo

s / p

arej

a

0

1

2

3Año del vertido tóxico

34

Como se ve en la Figura 1 la reproducción de la colonia ha seguido una pauta

descendiente con el aumento del número de parejas reproductoras, produciendo una

relación estadísticamente significativa ente el tamaño de la colonia y su productividad (rs

= -0.547, n = 20, p = 0.012; Figura 2) y su tasa de vuelo (rs = -0.489, n = 20, p = 0.029;

Figura 3).

Figura 2. Relación entre el número parejas de cigüeña blanca y su productividad (número

de pollos volados por pareja reproductora) en la colonia de la Dehesa de Abajo.

Número de parejas

0 50 100 150 200 250 300

Pro

duct

ivid

ad

0

1

2

3

Antes del vertido tóxicoDespués del vertido tóxico

35

Figura 3. Relación entre el número parejas de cigüeña blanca y la tasa de vuelo (número

de pollos volados por pareja con éxito en la cría) en la colonia de la Dehesa de Abajo.

Número de parejas

0 50 100 150 200 250 300

Tasa

de

vuel

o

1

2

3Antes del vertido tóxicoDespués del vertido tóxico

CONCLUSIONES:

Como se había predicho a partir de la información de otras especies coloniales, y de las

particularidades de la colonia de estudio, el aumento en el número de parejas en la

colonia de la Dehesa de Abajo afecta negativamente a la reproducción de las cigüeñas,

tanto en su productividad como en su tasa de vuelo.

Por lo tanto, el tamaño de la colonia se perfila como una variable muy relevante a

la hora de entender la demografía de esta colonia, mereciéndose ser tenida en cuenta a la

hora de evaluar el efecto del vertido tóxico sobre la reproducción de esta colonia.

36

3.1.4 EFECTO DE LA EXTENSIÓN DE ARROZALES EN LA

REPRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN:

Los recursos alimenticios son en muchas poblaciones de aves un factor limitante para su

crecimiento (Högstedt 1981, Steenhof et al. 1997, Begon 1999, Elmberg et al 2003). Por

lo tanto, el estudio del efecto de la fluctuación interanual en la disponibilidad de recursos

tróficos puede ser clave para entender la dinámica poblacional, y por lo tanto necesario

para entender el posible efecto de un episodio crítico de contaminación como el que se

plantea en este informe.

La dieta de la cigüeña blanca en la Dehesa de Abajo se basa principalmente en el

cangrejo rojo americano. Los cangrejos americanos viven en madrigueras que ellos

mismos excavan en el fango, concentrándose en canales de riego y en los arrozales

propiamente dichos. Cuando el arrozal se inunda los cangrejos que están en los arrozales

se vuelven activos, siendo presa fácil de las cigüeñas.

A partir de la década del 1920 y sobretodo a partir de 1940 las antiguas Marismas

del Guadalquivir han sufrido una radical transformación para su adecuación al cultivo del

arroz, consistiendo principalmente en la desecación y la canalización del agua para el

riego (Prados 1995).

El cultivo del arroz aunque se ha adaptado perfectamente al terreno, es un cultivo

muy exigente en cuanto a cantidad de agua de riego y a requerimientos de niveles bajos

de concentración de sal en el agua. Esto ha comportado que en los años de sequía se

destine menos agua al cultivo del arroz, con la consiguiente disminución de las Ha.

dedicadas a este cultivo.

Desde la formación de la colonia de la Dehesa de Abajo en el año 1973 la

superficie de arrozal ha crecido continuamente, siendo en 1973 de unas 23.000 Ha

(Prados 1995) pasando a tener 26.140 Ha. en 1982 y 36.675 Ha. en el 2003. Durante este

periodo, se han dado en la colonia unos cuantos años (1972, 1983, 1989, 1993, 1994 y

1995) en los que el agua destinada al cultivo del arroz se redujo, disminuyendo

drásticamente la superficie de arrozal disponible como sustrato de alimentación para las

cigüeñas.

37

En este capítulo se aborda el papel de la superficie de arrozal sobre la

reproducción de la colonia de la Dehesa de Abajo.

MÉTODOS:

La información referente a la superficie ocupada por el arrozal entre los años 1982 y

2003 se ha obtenido de la Dirección General de Producción Agraria. Los datos para 1979,

1980 y 1981 se han extraído de los datos aportados por Prados (1995). Estos datos hacen

referencia a las hectáreas en las que se ha cultivado el arroz, independientemente de la

producción que se extrajera de esa superficie. Se ha utilizado este valor, y no un valor de

producción porque la cantidad de cangrejo disponible para las cigüeñas está

presumiblemente más condicionada por la superficie de campos inundados por el cultivo

del arroz que por las condiciones que puedan regular la producción de arroz.

Se ha analizado el efecto de la superficie de arrozal sobre la productividad y la

tasa de vuelo como está definido en capítulos anteriores.

RESULTADOS:

Viendo la Figura 1 resulta evidente que las fluctuaciones en la cantidad de superficie

dedicada al cultivo del arroz fueron sincrónicas con las fluctuaciones del éxito en la

reproducción de las cigüeñas de la Dehesa de Abajo, tanto si consideramos la

productividad (número de pollos por pareja reproductora en la colonia) como si

consideramos la tasa de vuelo (número de pollos por pareja con éxito en la cría). De todas

formas, también se hace patente que la relación entre la superficie de arrozales y la

productividad desaparece después del vertido tóxico, cuando los niveles de arrozal están

muy altos y sin fluctuación, pero en cambio la productividad es bastante más baja y sigue

fluctuando mucho en años consecutivos.

38

Figura 1. Evolución de la superficie dedicada al cultivo del arroz en la provincia de

Sevilla (barras) y la evolución de la productividad (cuadrados) y la tasa de vuelo

(triángulos) en la colonia de cigüeña blanca de la Dehesa de Abajo.

Año

1978 1980 1982 1984 1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004

Sup

erfic

ie d

e ar

roza

l (H

a)

0

10000

20000

30000

40000

50000

Núm

ero

de p

ollo

s / n

ido

0

1

2

3

4

Superficie de arrozalProductividadTasa de vuelo

Año del vertido tóxico

Analizando por separado la relación entre la reproducción y la superficie de

arrozal antes y después del vertido se constata que antes del vertido había una relación

positiva entre la superficie de arrozal y la productividad (rs = 0.502, n = 14, p = 0.067;

Figura 2) y la tasa de vuelo en la Dehesa de Abajo (rs = 0.560, n = 17, p = 0.020;

Figura 3), pero que esta relación desaparece después del vertido tóxico, tanto para la

productividad (rs = -0.145, n = 6, p = 0.784; Figura 2) como para la tasa de vuelo (rs = -

0.377, n = 6, p = 0.461; Figura 3).

39

Figura 2. Relación entre la superficie cultivada con arroz y la productividad en la colonia

de cigüeña blanca de la Dehesa de Abajo.

Superficie de arrozal (Ha)

0 10000 20000 30000 40000

Pro

duct

ivid

ad

0

1

2

3

Antes del vertidoDespués del vertido

Figura 3. Relación entre la superficie cultivada con arroz y la tasa de vuelo en la colonia

de cigüeña blanca de la Dehesa de Abajo.

Superficie de arrozal (Ha)

0 10000 20000 30000 40000

Tasa

de

vuel

o

1

2

3

Antes del vertido tóxicoarrozdesp vs tasades

40

CONCLUSIONES:

Los resultados de este apartado demuestran una estrecha relación entre el cultivo del

arroz y la reproducción en la colonia de cigüeñas de la Dehesa de Abajo antes del vertido

tóxico de Aznalcóllar. Por el contrario, después del vertido no parece existir relación

entre estas dos variables. De hecho, la reproducción en la Dehesa de Abajo después del

vertido es muy inferior a la esperada si tenemos en cuenta que después del vertido la

extensión de arrozal ha continuado creciendo pero no así la productividad, que incluso ha

tendido a descender. Esto se hace especialmente patente en las Figuras 2 y 3, donde se ve

que los años posteriores al vertido se encuentran por debajo de la recta que une los puntos

de los años de antes del vertido.

Por lo tanto, la extensión del cultivo del arroz se presenta como una variable

importante para entender la demografía de la población, aunque podría ser que otros

factores como la densodependencia pudieran explicar por qué después del vertido el éxito

de cría de las cigüeñas ha continuado disminuyendo a pesar de que los arrozales han

continuado creciendo.

41

3.1.5 ESTUDIO MULTIVARIANTE DEL EFECTO DEL VERTIDO

TÓXIXO EN LA REPRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN:

Para testar el efecto del vertido tóxico sobre la reproducción de las cigüeñas en la Dehesa

de Abajo es necesario controlar por los factores que hemos visto en apartados anteriores

del informe que estaban afectando a la reproducción de la cigüeña blanca desde antes del

año 1998 cuando se produjo el vertido tóxico de la mina de Aznalcóllar. Con este

propósito abordamos en el presente apartado el análisis del efecto del vertido tóxico sobre

la productividad y la tasa de vuelo controlando estadísticamente en el mismo análisis por

la climatología, la superficie cultivada por arrozal y la densodependencia para poder

discernir que parte de la variación entre años es debida a variaciones causadas por el

vertido tóxico, y que fluctuaciones son debidas a otros fenómenos que ya estaban

operando en la población des de antes del vertido.

MÉTODOS:

Para analizar el efecto del vertido tóxico sobre la reproducción hemos extraído los

residuos de cada año para la regresión lineal de la relación entre la productividad y la tasa

de vuelo y cada una de las variables que hemos visto en apartados anteriores que puede

afectar a la reproducción de las cigüeñas en la colonia de la Dehesa de Abajo:

precipitación entre el 1 de Abril y el 15 de Mayo, tamaño de colonia, y superficie de

arrozal. Los residuales son la “distancia” perpendicular de cada punto que representa

cada año en el gráfico y la recta ajustada para la nube de puntos de la relación. Por lo

tanto, un residuo positivo informa de que ese año (ese punto) presentaba mayor éxito de

reproducción si tenemos en cuenta la variable considerada.

Se ha comparado para cada factor regulador de la reproducción y para las dos

variables de éxito reproductor de la colonia un test de la t de Student para comparar los

residuales entre los años anteriores y posteriores al vertido tóxico.

42

RESULTADOS:

En la Figura 1 se presentan las fluctuaciones en el tiempo de las tres variables que se ha

visto en apartados anteriores del informe que afectan a la reproducción de la cigüeña

blanca en la colonia de la Dehesa de Abajo.

Figura 1. Fluctuaciones de la precipitación acumulada entre el 1 de Abril y el 15 de Mayo

(mm, en barras verticales), superficie cultivada por arroz en la provincia de Sevilla (Ha.,

círculos blanco), y número de parejas reproductoras en la colonia de la Dehesa de Abajo

(triángulos).

Año

1980 1982 1984 1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004

Sup

erfic

ie d

e ar

roza

l (H

a.)

0

10000

20000

30000

40000

50000

Pre

cipi

taci

ón 1

Abr

il - 1

5 M

ayo

Núm

ero

de p

arej

as

0

50

100

150

200

250

300

PrecipitaciónSuperficie de arrozalNúmero de parejas

Año del vertido tóxico

De manera sintética, las fluctuaciones de estas tres variables que hemos visto en

apartados anteriores del informe que están afectando a la reproducción de las cigüeñas en

la colonia de la Dehesa de Abajo, se pueden resumir como sigue: 1. El número de parejas

ha aumentado año tras año desde los años 80 hasta el 2001 estabilizándose o incluso

disminuyendo un poco en el 2002 y 2003. 2. La superficie ocupada por el cultivo del

arroz ha aumentado paulatinamente a lo largo de los años, aunque con seis años de muy

baja superficie cultivada. 3. La lluvia caída ente durante la estancia de los pollos de edad

43

temprana en el nido (1 Abril – 15 Mayo) tiene un comportamiento caótico a lo largo de

los años, con mínimos en los años 1991, 1995 y 2001 y máximos en 1989, 1996, 1998 y

2000.

Figura 2. Fluctuación de la productividad y la tasa de vuelo a lo largo de los años en la

Dehesa de Abajo.

Año

1980 1982 1984 1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004

Núm

ero

de p

ollo

s / n

ido

0

1

2

3

ProductividadTasa de vuelo

Año del vertido tóxico

La Figura 2 muestra como ha fluctuado la productividad y la tasa de vuelo a lo

largo de los años.

En síntesis, se aprecia una tendencia a la baja de la reproducción, con

fluctuaciones apreciables en años consecutivos. Además, se aprecia que después del

vertido la reproducción ha seguido con su línea descendente, aunque los mínimos de

reproducción después del vertido son parecidos a los mínimos que se estaban dando antes

del vertido.

Controlando estadísticamente por la precipitación, la productividad antes del

vertido fue ligeramente superior a la productividad después del vertido, aunque la

diferencia no resultó ser significativa (test t-Student, t = 1.070, p = 0.299, Figura 3). Por

44

el contrario, la menor tasa de vuelo después del vertido si que resultó ser significativa

cuando se controló estadísticamente por la precipitación (test t-Student, t = 2.584, p =

0.020, Figura 3).

Figura 3. Efecto del vertido tóxico sobre la productividad y la tasa de vuelo de las

cigüeñas de la colonia de la Dehesa de Abajo controlando estadísticamente por la

precipitación de cada año entre el 1 de Abril y el 15 de Mayo.

Res

iduo

s de

repr

oduc

ción

vs.

pre

cipi

taci

ón

-1

0

1

ProductividadTasa de vuelo

Antes Después

Controlando estadísticamente por el tamaño poblacional, la productividad de la

colonia no fue afectada por el vertido tóxico (test t-Student, t = -0.515, p = 0.613, Figura

4), y lo mismo sucedió para la tasa de vuelo (test t-Student, t = -1.232, p = 0.234, Figura

4).

45

Figura 4. Efecto del vertido tóxico sobre la productividad y la tasa de vuelo de las

cigüeñas de la colonia de la Dehesa de Abajo controlando estadísticamente por el número

de parejas en la colonia en los distintos años.

Res

iduo

s de

repr

oduc

ción

vs.

núm

ero

de p

arej

as

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

ProductividadTasa de vuelo

Antes Después

Controlando estadísticamente por el efecto de la superficie cultivada por arroz, la

tasa de vuelo fue menor después que antes del vertido tóxico (test t-Student, t = 2.195, p

= 0.041, Figura 5), y la productividad fue menor aunque la diferencia no resultó ser

estadísticamente significativa (test t-Student, t = 1.696, p = 0.109, Figura 5).

46

Figura 5. Efecto del vertido tóxico sobre la productividad y la tasa de vuelo de las

cigüeñas de la colonia de la Dehesa de Abajo controlando estadísticamente por la

superficie dedicada al cultivo del arroz.

Res

iduo

s de

la re

prod

ucci

ón v

s. s

uper

ficie

de

arro

zal

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

ProductividadTasa de vuelo

Antes Después

CONCLUSIONES:

En la Figura 6 se muestra un esquema sinóptico del estudio que se ha realizado del efecto

del vertido sobre la reproducción de la cigüeña blanca en la colonia Dehesa de Abajo.

Como se puede apreciar, el éxito reproductor de la colonia ha decrecido paulatinamente a

medida que ha ido incrementando el número de parejas. Además de este decrecimiento

paulatino hay que añadir decrecimientos puntuales (entre años sucesivos) en la

reproducción de la cigüeña en años en que la superficie de arrozal decreció drásticamente

(p.ej. 1983 o 1989). Después del vertido tóxico, los niveles de arrozal han permanecido

muy altos, e incluso han aumentado su extensión; en la Figura X del Capitulo X vemos

una foto aérea de junio del 2002 cómo el arrozal copa actualmente la gran parte de la

zona de las antiguas Marismas del Guadalquivir fuera de la zona del Parque de Doñana.

47

No obstante, el éxito reproductor de la cigüeña despúes del vertido resulta muy inferior al

que cabría esperar a tenor del aumento del arrozal en los últimos años. Por último, parece

ser que decrecimientos posteriores al vertido podrían achacarse a la precipitación durante

la estancia de los pollos en el nido. Este fenómeno (también visto en el apartado de la

supervivencia de los pollos) es curioso puesto que no parece que se estuviera dando con

la misma intensidad antes del vertido. De hecho, el éxito reproductor se ve claramente

mermado tras el vertido una vez que se controla estadísticamente por el efecto de la

lluvia. A este descenso en el éxito reproductor parece estar contribuyendo la aparición de

pollos con malformaciones que, como hemos visto en el Capitulo X, son más sensibles a

la mortalidad provocada por las lluvias. Por lo tanto, aunque con la debida cautela, este

estudio sugiere que el vertido tóxico de Aznalcóllar de 1998 ha provocado un descenso

en el éxito reproductor de la cigüeña blanca en la Dehesa de Abajo.

48

Figura 6. Esquema resumen del efecto del vertido sobre la reproducción de la cigüeña

blanca en la colonia de la Dehesa de Abajo.

Precipitación de 1Abril a 15 Mayo

0 50 100 150 200

Pro

duct

ivid

ad

0

1

2

3

Antes del vertido tóxicoDespués del vertido tóxico

Res

iduo

s de

repr

oduc

ción

vs.

pre

cipi

taci

ón

-1

0

1

ProductividadTasa de vuelo

Antes Después

Año

1980 1982 1984 1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004

Supe

rfici

e de

arr

ozal

(Ha.

)

0

10000

20000

30000

40000

50000

Pre

cipi

taci

ón 1

Abr

il - 1

5 M

ayo

Núm

ero

de p

arej

as

0

50

100

150

200

250

300

PrecipitaciónSuperficie de arrozalNúmero de parejas

Año del vertido tóxico

Año

1980 1982 1984 1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004

Núm

ero

de p

ollo

s / n

ido

0

1

2

3

ProductividadTasa de vuelo

Año del vertido tóxico

Res

iduo

s de

repr

oduc

ción

vs.

núm

ero

de p

arej

as

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

ProductividadTasa de vuelo

Antes Después

Res

iduo

s de

la re

prod

ucci

ón v

s. s

uper

ficie

de

arro

zal

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

ProductividadTasa de vuelo

Antes Después

Número de parejas

0 50 100 150 200 250 300

Prod

uctiv

idad

0

1

2

3

Antes del vertido tóxicoDespués del vertido tóxico

Número de parejas

0 50 100 150 200 250 300

Tasa

de

vuel

o

1

2

3Antes del vertido tóxicoDespués del vertido tóxico

Superficie de arrozal (Ha)

0 10000 20000 30000 40000

Pro

duct

ivid

ad

0

1

2

3

Antes del vertidoDespués del vertido

Superficie de arrozal (Ha)

0 10000 20000 30000 40000

Tasa

de

vuel

o

1

2

3

Antes del vertido tóxicoarrozdesp vs tasades

Precipitación de 1Abril a 15 Mayo

0 50 100 150 200

Tasa

de

vuel

o

1

2

3

Antes del vertido tóxicoDespués del vertido tóxico

DENSODEPENDENCIA

ARROZALES

LLUVIA

*n.s.

n.s.n.s.

*n.s.

49

3.2 ESTUDIO DEL ÉXITO REPRODUCTOR DE LA CIGÜEÑA

BLANCA CRIANDO A DISTINTAS DISTANCIAS DEL VERTIDO

TÓXICO DE AZNALCÓLLAR

INTRODUCCIÓN:

Los lodos y el agua contaminada de la mina de Aznalcóllar recorrieron muchos

kilómetros en dirección Sur, pasando muy cerca de numerosos nidos de cigüeña, y a

escasos kilómetros de muchos otros.

En este informe se ha abordado en profundidad el efecto del vertido tóxico sobre

la colonia de cigüeñas de la Dehesa de Abajo. En este capítulo se pretende extender el

estudio del efecto del vertido tóxico a las demás colonias de cigüeñas que crían en o

alrededor de Doñana, para contestar a la pregunta de si el vertido tóxico está afectando

actualmente a las poblaciones de cigüeña 4 y 5 años después del vertido tóxico.

Por lo tanto, a diferencia de los capítulos anteriores, en éste se aborda la pregunta

del efecto del vertido tóxico concentrándonos en dos años, y estudiando la reproducción a

distintas distancias al vertido. De esta forma, de las variables que se estaban estudiando

en capítulos anteriores, sólo mantiene su potencial importancia la densodependencia,

puesto que las variables climatológicas, y la superficie de arrozal son constantes para las

colonias en un mismo año. Es cierto que las distintas colonias tienen distinta cantidad de

arrozal en sus cercanías, pero creemos que este factor no tiene que afectar de manera

significativa a nuestro estudio, puesto que la mayoría de colonias de las marismas del

Guadalquivir se encuentran situadas muy cerca de los arrozales.

En otras especies de aves, se ha descrito que las parejas solitarias o en colonias de

pequeño tamaño tienen mayor éxito de cría (Pienkowski et al. 1982). En cambio, en otras

se ha visto la situación contraria (Tella 1996). Por lo tanto, es necesario hacer un estudio

detallado en cada caso para entender cual es el efecto del tamaño de la colonia en la zona

y la especie de estudio.

Además, también se ha visto en otras especies coloniales que no sólo es

importante la densidad de parejas en una colonia dada, sino que también es relevante el

efecto negativo que puede tener la proximidad a otras colonias de la misma especie que

pueden actuar como competidores por el alimento (Ferrer & Donazar 1996, Fernandez et

al. 1998, Forero et al. 2002). Por lo tanto, en este apartado del informe, antes de evaluar

50

el efecto de la distancia de cada colonia a la zona afectada por el vertido tóxico, se evalúa

el posible efecto densodependiente sobre la reproducción a distintos radios de la colonia.

MÉTODOS:

Durante las épocas reproductoras de 2002 y 2003 se ha realizado un esfuerzo especial por

controlar la casi totalidad (más del 95%) de los nidos de cigüeña blanca que se

encuentran en Doñana y su entorno, llegando hasta por encima de la autopista Sevilla-

Huelva por el Norte, hasta la vertical de Mazagón por el Oeste, hasta la autopista Sevill-

Cádiz por el Este, y hasta Sanlúcar de Barrameda por el Sur (Figura 1).

En cada nido controlado se ha hecho un seguimiento durante toda la estación

reproductora para poder registrar su estado de ocupación y su éxito reproductor. Los

nidos han sido cartografiados y se ha calculado su distancia lineal más corta a la zona

afectada por el vertido tóxico, considerando la zona afectada hasta dónde llegaron las

aguas contaminadas de la mina de Aznalcóllar en Abril de 1998 (desde la mina de

Aznalcóllar hasta la estación de bombeo de “Los caracoles”).

Puesto que se ha visto que la densidad de nidos de una colonia puede afectar al

éxito de cría de las parejas de la colonia (como se ha visto en un apartado anterior de este

informe; REF), se ha estudiado este potencial efecto densodependiente antes de

considerar la relación entre la proximidad al vertido y el éxito reproductor de las

cigüeñas.

Para controlar por este potencial efecto densodependiente se ha optado por

realizar una aproximación a múltiples escalas para poder identificar a que escala puede

estar afectando la densodependencia entre colonias. Para ello se ha calculado el número

de nidos ocupados a distintas áreas de radio creciente de 1, 5, 10 y 15 Kilómetros. La

información de que se dispone sobre zona de influencia de una colonia de cigüeña blanca

en la Península Ibérica es escasa, aunque Alonso et al (1991) y Carrascal etl al. (1990)

describieron unos desplazamientos hasta las zonas de alimentación de hasta 3.9 Km. Por

lo tanto, con los radios seleccionados para este estudio se cubre con creces el rango

posible en el que puede estar afectando la densodependencia entre colonias.

51

RESULTADOS:

En total se controló la ocupación y éxito reproductor de 87 y 94 colonias (946 y 1099

nidos) en 2002 y 2003, respectivamente. La distribución de frecuencias del tamaño de las

colonias (Figuras 2 y 3) pone de manifiesto que la gran mayoría de las colonias fueron de

pequeño tamaño (de menos de 24 parejas) y que pocas sobrepasaron las 50 parejas.

Figura 1. Localización y tamaño de las colonias estudiadas en 2003.

Figura X. Distribución de frecuencias de número de parejas por colonia de cigüeña

blanca en Doñana y su entorno en 2002.

Número de parejas

239

- 263

215

- 239

191

- 215

167

- 191

143

- 167

119

- 143

95 -

119

72 -

95

48 -

72

24 -

48

0 - 2

4

Núm

ero

de c

olon

ias

80

60

40

20

0

Número de parejas reproductoras por

colonia:12-1011-2526-5051-83117250

Sevilla

Mina de Aznalcóllar

Arrozales

Doñana

Dehesa de Abajo

Recorrido delvertido tóxico

52

Figura 2. Distribución de frecuencias de número de parejas por colonia de cigüeña blanca

en Doñana y su entorno en 2003.

Número de parejas23

9 - 2

63

215

- 239

191

- 215

167

- 191

143

- 167

119

- 143

95 -

119

72 -

95

48 -

72

24 -

48

0 - 2

4

Núm

ero

de c

olon

ias

100

80

60

40

20

0

Además, se consiguió obtener una muestra representativa de distintas distancias

de las colonias al vertido, teniendo una buena representación de colonias a menos de 5

kilómetros del vertido (algunas a menos de 100m del vertido), hasta algunas colonias a

mas de 40 Km. del vertido tóxico, siendo abundantes las colonias a más de 15 Km

(Figura 3).

53

Figura 3. Distribución de frecuencias de la distancia de las colonias de cigüeña blanca

estudiadas para este apartado del informe al vertido tóxico.

Distancia al vertido tóxico43

- 48

38 -

43

33 -

38

29 -

33

24 -

29

19 -

24

14 -

19

10 -

14

5 - 1

0

0 - 5

Núm

ero

de c

olon

ias

30

20

10

0

El éxito en la reproducción de las cigüeñas tuvo una relación muy baja con la

densidad de conspecíficos calculada en las colonias y a distintos radios de las colonias

(Tabla 1, Figura 4 y 5; ver Figura 6 para mayor claridad de los resultados de las

regresiones). Los pocos resultados estadísticamente significativos al p-valor<0.05 son

debidos a la inclusión en los análisis de la colonia de la Dehesa de Abajo. De todas

formas, se aprecia que a diferencia del 2003 en que no se percibe efecto

densodependiente alguno, en 2002 los datos sugieren un cierto efecto densodependiente

consistente en productividad y tasa de vuelo en el radio de 10Km.

Por lo tanto, se puede concluir que el efecto densodependiente, de existir, afecta

de manera muy poco relevante a la reproducción de la cigüeña blanca en el estado actual

de la población, siendo la excepción un cierto efecto densodependiente en 2002 en un

radio de 10 Km y alguna colonia puntual con gran número de parejas como es el caso de

la colonia de la Dehesa de Abajo.

54

Figura 4. Relación entre el número de nidos en la colonia y a distintos radios desde la

colonia con la productividad y la tasa de vuelo de la colonia. Datos de la temporada de

cría del 2002.

0 100 200 300

0

1

2

3

4

0 100 200 300

Núm

ero

de p

ollo

s / n

ido

0

1

2

3

4

5

0 100 200 300 400

0

1

2

3

4

5

0 100 200 300 400 500

0

1

2

3

4

5

Número de nidos

0 200 400 600

0

1

2

3

4

5

ProductividadTasa de vueloProductividadTasa de vuelo

Número de nidos

Nidos de la colonia

Nidos en un radio de 1 Km.

Nidos en un radio de 5 Km.

Nidos en un radio de 10 Km.

Nidos en un radio de 15 Km.

55

Figura 5. Relación entre el número de nidos en la colonia y a distintos radios desde la

colonia con la productividad y la tasa de vuelo de la colonia. Datos de la temporada de

cría del 2003.

0 100 200 300

0

1

2

3

4

5

0 100 200 300 400

0

1

2

3

4

5

Número de nidos

0 100 200 300 400 500

Núm

ero

de p

ollo

s / n

ido

0

1

2

3

4

5

0 200 400 600

0

1

2

3

4

5

ProductividadTasa de vuelo

Tasa de vueloProductividad

0 200 400 600

0

1

2

3

4

5

Número de nidos

Nidos de la colonia

Nidos en un radio de 1 Km.

Nidos en un radio de 5 Km.

Nidos en un radio de 10 Km.

Nidos en un radio de 15 Km.

56

Tabla 1. P-valores de la regresión lineal entre el número de parejas en la colonia (Radio

0) y alrededor de las colonias a distintos radios (radio 1, 5, 10, 15 Kilómetros). “Con” y

“Sin” en la columna “Dehesa” hace referencia a la inclusión o no de los valores de la

Dehesa de Abajo en el análisis.

Dehesa Año Radio 0 Radio 1 Radio 5 Radio 10 Radio 15

con 0.054 0.061 0.024 0.031 0.097

sin

2002

0.233 0.248 0.087 0.074 0.152

con 0.493 0.407 0.995 0.764 0.462

PRO

DU

CTI

VID

AD

sin

2003

0.572 0.857 0.710 0.555 0.355

con 0.395 0.412 0.277 0.114 0.219

sin

2002

0.451 0.535 0.346 0.139 0.251

con 0.731 0.219 0.195 0.228 0.810

TASA

D

E V

UEL

O

sin

2003

0.881 0.214 0.211 0.247 0.844

57

Figura 6. Representación gráfica de los p-valores de la Tabla 1. Se ha indicado con una

línea horizontal el p-valor de 0.05.

p-va

lor r

egre

sión

núm

ero

de p

arej

as /

éxito

repr

oduc

tor

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Productividad en 2002 con Dehesa de AbajoProductividad en 2002 sin Dehesa de AbajoProductividad en 2003 con Dehesa de AbajoProductividad en 2003 sin Dehesa de AbajoTasa de vuelo en 2002 con Dehesa de AbajoTasa de vuelo en 2002 sin Dehesa de AbajoTasa de vuelo en 2003 con Dehesa de AbajoTasa de vuelo en 2003 sin Dehesa de Abajo

p = 0.05

0 1 5 10 15 Radio alrededor de la colonia (Km)

Puesto que las colonias con mayor número de parejas en un radio de 10 Km en

2002 se localizaron cerca del vertido cerca del vertido (Figura 7), se han realizaron los

análisis del efecto de la proximidad al vertido con y sin tener en cuenta el posible efecto

de la densodependencia en un radio de 10 Km. en 2002.

58

Figura 7. Relación entre la densidad de parejas a un radio de 10km en 2002 y la

proximidad al vertido tóxico de Aznalcóllar.

Distancia al vertido tóxico

0 10 20 30 40 50

Núm

ero

de p

arej

as e

n un

radi

o de

10

Km

0

100

200

300

400

500

En 2002, la productividad de las colonias de cigüeña blanca fue mayor cuanto más

lejos del vertido tóxico (GLM χ21 = 8.12, p = 0.0044, Figura 8). La relación con la

distancia al vertido se mantuvo cuando se controló estadísticamente por la densidad en un

radio de 10 Km. (densidad radio 10Km: GLM χ21 = 4.78, p = 0.0287; distancia al vertido:

GLM χ21 = 4.28, p = 0.0386). Este resultado se mantuvo cuando se extrajo la colonia de

la Dehesa de Abajo de los análisis (densidad radio 10Km: GLM χ21 = 3.30, p = 0.0691;

distancia al vertido: GLM χ21 = 4.32, p = 0.0376).

En 2002, la tasa de vuelo también resultó ser mayor cuanto más alejados estaban

los nidos del vertido tóxico (GLM χ21 = 6.08, p = 0.0136, Figura 8). Cuando se controló

estadísticamente por la densidad a menos de 10 Km de radio, la relación pasó a ser

marginalmente significativa (densidad radio 10Km: GLM χ21 = 2.58, p = 0.1087;

distancia al vertido: GLM χ21 = 3.76, p = 0.0526). Este resultado se mantuvo cuando se

extrajo la colonia de la Dehesa de Abajo de los análisis (densidad radio 10Km: GLM χ21

= 2.26, p = 0.1327; distancia al vertido: GLM χ21 = 3.71, p = 0.0541).

59

En 2003, ni la productividad (GLM χ21 = 1.12, p = 0.2899), ni la tasa de vuelo

(GLM χ21 = 0.34, p = 0.5618, Figura 9) presentaron ninguna relación con la proximidad

al vertido tóxico.

Figura 8. Relación entre la distancia lineal en Kilómetros al vertido tóxico y la

productividad y tasa de vuelo de las cigüeñas en el año 2002.

Distancia al vertido tóxico (Km)

0 10 20 30 40 50

Pro

duct

ivid

ad

0

1

2

3

4

0 10 20 30 40 50

Tasa

de

vuel

o

0

1

2

3

4

Distancia al vertido tóxico (Km)

60

Figura 9. Relación entre la distancia lineal en Kilómetros al vertido tóxico y la

productividad y tasa de vuelo de las cigüeñas en el año 2003.

Distancia al vertido tóxico

0 10 20 30 40 50

Pro

duct

ivid

ad

0

1

2

3

4

Distancia al vertido tóxico

0 10 20 30 40 50

Tasa

de

vuel

o

0

1

2

3

4

61

CONCLUSIONES:

Actualmente, la población de cigüeñas blancas de las Marismas del Guadalquivir está en

crecimiento. En los años 60 el profesor Valverde describe la distribución de la cigüeña

blanca como ocasional, sólo encontrándose algunos nidos dispersos y una colonia con un

máximo de 30 parejas en los eucaliptos de Coto del Rey (Valverde 1960). Ya en 1986

Lázaro et al. publican el censo nacional de cigüeña blanca realizado en 1984, constatando

que las poblaciones de Sevilla y Huelva continuaban presentando niveles poblacionales

muy bajos. Hasta 1988 aún se estaba registrando un cierto declive en la Andalucía

occidental, aunque la situación empezaba a ser variable dependiendo de la zona

geográfica (Senra & Alés, 1992). Como se describe en este informe, actualmente hay

más de 1000 parejas en las marismas del Guadalquivir, y su número sigue aumentando.

Por ejemplo, entre el 2002 y el 2003 se pasó de 946 a 1099 nidos ocupados (153 más en

2002 que en 2003), lo que supone un crecimiento del 14%.

El efecto de la densodependencia sobre el éxito reproductor se ha visto que es

bajo, aunque variable entre años. Todo esto apunta hacia el hecho de que el crecimiento

de la cigüeña en las Marismas del Guadalquivir aún no ha cesado, y que la saturación

sólo es claramente detectable en colonias concretas en las que la densidad de parejas es

muy alta como en el caso de la Dehesa de Abajo.

La distancia de las colonias al vertido tóxico se relacionó de manera distinta en

2002 y 2003. En el 2002, tanto la productividad como la tasa de vuelo se vieron reducidas

en las proximidades del vertido tóxico, incluso cuando se controló por la densidad de

conspecíficos y se introdujo, o no, la colonia de la Dehesa de Abajo en los análisis.

Por lo tanto, se concluye que hay indicios de que las colonias más próximas al

vertido tóxico, cuatro años después de producirse pueden verse aún afectadas por

contaminación, aunque los mecanismos que regulan este efecto son desconocidos. De

todos modos, hay que poner de relieve el hecho de que este extenso estudio transversal se

ha realizado sólo durante dos años, y que por lo tanto con la información disponible no se

puede prever el alcance de este efecto.

62

4. NIVELES DE METALES PESADOS Y ARSÉNICO EN AVES DE DOÑANA Y

SU ENTORNO

INTRODUCCIÓN

La salud de los ecosistemas naturales es el principal objetivo de las actuaciones

medioambientales, y una de sus amenazas más importantes es la contaminación mediada

por el hombre (Walker et al., 1997). En el caso de las aves, los metales pesados, al igual

que otro tipo de contaminantes como PCBs, dioxinas, etc., afectan negativamente a la

salud de los individuos pudiendo provocar su muerte (Henny et al., 1987), o lo que es

más frecuente, efectos subletales, que resultan aún más peligrosos para la viabilidad de

las poblaciones (Snyder et al., 1973).

En el marco del Convenio suscrito por la Junta de Andalucía y la Estación

Biológica de Doñana (CSIC) para el seguimiento de las poblaciones de Cigüeña blanca

(Ciconia ciconia), Milano negro (Milvus migrans) y los Anseriformes tras el vertido de

Aznalcóllar, se ha continuado durante los dos últimos años (2002 y 2003) con las tareas

de captura y muestreo de individuos para el estudio de metales pesados (Cu, Zn, Pb, y

Cd) y arsénico en sangre. En este último informe se detallan los resultados de Cu, Zn, Pb,

Cd y As en pollos de cigüeña blanca (C. ciconia) y milano negro (M. migrans) nacidos en

la área de Doñana y su entorno, comparándolos con los niveles encontrados en años

anteriores (1998-2001). Las muestras de cigüeña corresponden a pollos muestreados en la

colonia de la Dehesa de Abajo. En el caso de las aves acuáticas, sólo el calamón

(Porphyrio porphyrio) pudo ser capturado en la zona que estuvo afectada por el vertido

(Entremuros) en la invernada 2001/02, el resto de especies se capturaron en zonas no

afectadas.

Para la cigüeña y el milano negro, el estudio de los efectos que estos metales

podrían tener sobre aspectos como la respuesta inmune o el daño en el ADN se estudian

dentro de los apartados correspondientes de este informe.

63

MÉTODOS

Los pollos de cigüeña blanca (C. ciconia) y milano negro (M. migrans), se capturaron en

nido.

Para las aves acuáticas, los individuos muestreados en sangre se capturaron con

diferentes tipos de nasas o a mano en período de mancada. Se trató de capturar

ejemplares que se alimentaran en la zona afectada por el vertido, aunque la falta de agua

en Entremuros y, por consiguiente, la ausencia de aves, hizo que la mayor parte de ellos

se muestrearan en zonas no contaminadas, lo más próximas posible a la zona afectada. En

la Tabla 1 aparecen las localidades y el período de muestreo para los ejemplares cuya

sangre ha sido analizada.

A cada ejemplar se le extrajeron entre 1 y 2 ml de sangre de la vena radial, que

fueron conservados a –80 ºC hasta su posterior análisis en el laboratorio.

Análisis de metales pesados y arsénico

Los análisis de metales pesados y arsénico fueron realizados en el Instituto de Química

Orgánica General, IQOG (CSIC) (Madrid). Cu, Pb, Cd y As se determinaron mediante

espectrofotometría de absorción atómica en cámara de grafito. El Zn se analizó mediante

absorción atómica en llama. Los límites de detección metodológicos para cada metal son:

Cd = 0.25 ppb; Pb =1.7 ppb; Cu = 3 ppb; As =24 ppb; y Zn =0.3 ppm. Para más detalles

sobre la metodología analítica de metales pesados y arsénico ver Baos et al. (2001) y

Benito et al.(1999).

Análisis estadístico

En el caso de la invernada, el escaso tamaño de muestra para algunas especies hizo que

las comparaciones estadísticas entre distintos períodos sólo fueran posibles para

calamones P. porphyrio (zona contaminada y no contaminada), fochas Fulica atra (zona

no contaminada) y ánade real Anas platyrhynchos. Durante la reproducción, sólo la

cigüeña C. ciconia y el milano M. migrans ofrecieron un tamaño muestral suficiente para

establecer dichas comparaciones entre años.

64

Para cada metal se utilizaron test paramétricos (ANOVA seguido de HSD Tukey)

o no paramétricos (Kruskal-Wallis seguido de U de Mann-Whitney dos a dos aplicando

la corrección de Bonferroni) en función de que se cumplieran o no los requisitos de

normalidad y homogeneidad de varianzas, respectivamente.

Las diferencias se consideraron significativas cuando p<0.05.

Los valores de metales y arsénico no detectados por la metodología fueron

introducidos en los análisis como la mitad del límite de detección correspondiente a cada

uno de ellos.

Se utilizó el valor de 200 ppb como referente de intoxicación subclínica por Pb

(Pain et al. 1997). Para el Cd y el As, la falta de valores de referencia en sangre de aves,

indicativos de intoxicación por estos metales, nos llevó a extrapolar los valores utilizados

normalmente en el caso de los humanos. Así, los niveles de Cd en sangre de adultos no

excesivamente expuestos a este metal se sitúan generalmente por debajo de 10 ppb

(Hammond & Beliles, 1980). En el caso del As, valores por encima de 50 ppb se

consideran resultantes de una exposición excesiva a este metaloide. Las comparaciones

entre años se realizaron mediante análisis de frecuencias (Chi-cuadrado X2). Cuando las

diferencias resultaron significativas se prosiguió con comparaciones dos a dos utilizando

la corrección de Bonferroni (α=0.05 dividido por el número de comparaciones

realizadas).

RESULTADOS

Invernada

Como se ha comentado anteriormente, de las especies estudiadas, sólo el calamón (P.

porphyrio) pudo ser capturado en zona contaminada durante el invierno 2001/02. La

comparación de los niveles en sangre entre los individuos capturados este invierno y los

capturados en inviernos anteriores nos permitirá saber cómo ha evolucionado la

contaminación en Entremuros y el riesgo que puede suponer para las aves visitar esta

zona. Por otro lado, el escaso tamaño de muestra para algunas especies de aves acuáticas

hizo que las comparaciones estadísticas entre distintos períodos sólo fueran posibles para

calamones (zona contaminada y no contaminada), fochas (zona no contaminada) y ánade

real.

65

Cobre

Los niveles de este metal disminuyen en las tres especies para las que fueron posibles las

comparaciones entre invernadas, si bien ese descenso sólo resulta significativo en el caso

de la focha (Tabla 2).

Cinc

Los niveles medios de Zn para los ejemplares de calamón capturados en Entremuros

durante la invernada 2001/02 superan significativamente a los registrados en los dos

inviernos anteriores (2000/01 y 1999/00), equiparándose a los de la invernada 1998/99.

Sin embargo, en la zona no contaminada, las diferencias entre la última invernada,

2002/03, y los inviernos 1999/00 y 2000/01 no resultaron significativas (Tabla 2). En el

caso de las otras dos especies muestreadas en la invernada 2001/02 (la focha y el ánade

real), la concentración de este metal fue similar a la de inviernos anteriores.

Plomo

En zona contaminada los calamones muestreados durante la invernada 2001/02 presentan

niveles similares a los de las dos invernadas anteriores (1999/00 y 2000/01), lejos de los

niveles altos alcanzados en el invierno 1998/99. Lo mismo ocurre en zona no afectada

durante la invernada 2002/03. Para el ánade real no se aprecian diferencias significativas

en 2001/02 respecto a los niveles medidos en las invernadas 1998/99 ó 1999/00. Por el

contrario, el Pb parece aumentar de forma significativa este invierno (2001/02) en la

focha (Tabla 2).

Cadmio

Para todas las especies estudiadas, y en el caso del calamón, tanto en la zona contaminada

como en la no contaminada, la concentración de este metal parece incrementarse durante

las dos últimas invernadas, si bien ese aumento sólo es significativo para P. porphyrio en

zona contaminada respecto a la invernada 1999/00 (Tabla 2).

66

Arsénico

Los niveles de As se sitúan en todos los individuos muestreados durante la invernada

2001/02 por debajo de los límites de detección metodológicos, confirmando la tendencia

a la baja que ya se observaba en inviernos anteriores para este metaloide (Tabla 2). Sólo

durante la invernada 2002/03 los calamones capturados en la zona no afectada por el

vertido parecen haber incrementado, aunque sólo ligeramente, sus niveles de As en

sangre (Tabla 2).

Por lo que respecta al número de individuos intoxicados por alguno de los metales

estudiados, la prevalencia en cuanto a los ejemplares que superan los niveles aceptados

como indicativos de intoxicación subclínica por Pb (200 ppb Pain et al. 1997) sigue

siendo elevada, situándose en el 80 % para el ánade real en 2001/02, que no experimenta

diferencias significativas en este sentido respecto a las invernadas 1998/99 (X2 =0.1,

p=0.76) y 1999/00 (X2 =0.24, p=0.62); 67 % para el porrón común (A. ferina), porcentaje

igual al obtenido en la invernada 1999/00; y 8% en el caso de las fochas, que tampoco

experimentan cambios significativos respecto a las muestreadas en la invernada 1999/00

(X2 =0.03, p=0.68). Ninguno de los calamones muestreados en la zona de Entremuros

durante la invernada 2001/02 presentaron niveles de Pb en sangre indicativos de

toxicidad por este metal, y sólo uno de los muestreados en 2002/03 (6.3%) presentó

niveles por encima del nivel considerado letal para las aves acuáticas (>500 ppb, Pain et

al., 1997). En el caso de los ánsares, la concentración de Pb en dos de los tres individuos

muestreados en la invernada 2001/02 es muy alta, de hecho se trataba de ejemplares

moribundos con síntomas claros de plumbismo (heces líquidas y verdosas, extrema

delgadez, etc) y presencia de perdigones de Pb en la molleja.

Respecto al Cd, sólo una focha (7.7%) y un calamón (11.1%) de los muestreados

en 2001/02 estuvieron excesivamente expuestos a este metal en 2001/02. Ninguno de los

individuos muestreados durante las dos últimas invernadas mostraron niveles de As

excesivamente elevados en sangre, y sólo una focha (8%) presentó niveles superiores a

los citados en la bibliografía como típicos de zona contaminada para el Zn (7.5 ppm,

Falandysz et al. 1988).

67

REPRODUCCIÓN

Acuáticas

El escaso tamaño muestral para todas las especies muestreadas durante este período hace

inviable la comparación estadística con épocas reproductoras anteriores (Tabla 3). No

obstante, atendiendo a los rangos de variación de cada metal, se puede observar que los

niveles de Cu parecen incrementarse en el ánade friso Anas strepera y en el calamón P.

porphyrio, y descienden en el ánade real Anas platyrhynchos, al menos respecto a los

niveles medidos en 1999, 2000 y 2001 para esta última especie. En relación al Zn, los

niveles se mantienen dentro del mismo rango observado para el resto de períodos

reproductores. El Pb parece estar más bajo que en reproducciones anteriores en los tres

individuos de ánade real capturados en 2002, y lo mismo se puede decir para el porrón A.

ferina. Al igual que ocurriera durante la invernada, los niveles de Cd parecen aumentar

ligeramente y se sitúan por encima del límite de detección de la metodología, aunque

siguen siendo bajos. La concentración de As en todos los individuos muestreados se sitúa

próxima al límite de detección de metodológico, siendo, por tanto, bastante baja.

Respecto a los niveles indicativos de intoxicación por alguno de los metales

estudiados, sólo uno de los dos ánades frisos A. strepera capturados durante la primavera

de 2002 tenía niveles de Pb en sangre indicativos de intoxicación subclínica por este

metal (Tabla3).

Cigüeña blanca (C. ciconia)

Cobre

En la Figura 1 se puede observar cómo la media para este metal varía de forma

significativa a lo largo del período de estudio (F 5,334 = 11.4, p<0.001). Los niveles de Cu

en 2002 y 2003 no difieren significativamente entre sí (HSD Tukey p=1), ni de los de los

individuos muestreados en 2000 (HSD Tukey p=0.91 para 2002; HSD Tukey p=0.94 para

2003) y 2001 (HSD Tukey p=0.88 para 2002; HSD Tukey p=0.93 para 2003), situándose

los cuatro últimos períodos de muestreo (2000-2003) por debajo de los niveles medidos

en 1998 y 1999 (HSD Tukey p<0.001).

Plomo

68

Las diferencias en cuanto a los niveles de Pb entre los seis períodos de estudio (Figura 1)

resultaron significativas (F 5,334 = 4.89, p<0.001). En la Figura 1 se observa cómo los

niveles más bajos para este metal se alcanzaron en el año 2000, cuya media difiere

significativamente de la de 2002 (HSD Tukey p=0.001), pero no de la 2003 (HSD Tukey

p=0.094). Aunque se observa un descenso en la media de Pb para el último de los

períodos estudiados (2003), la diferencia respecto a 2002 no resulta significativa (HSD

Tukey p=0.91), y tampoco lo es respecto a la media de 1998, 1999 y 2001 (HSD Tukey

p>0.786).

Dos individuos en 1998 (13.4%), uno (1.96%) en 2001 y también uno (1.08%) en

2002, superaron el umbral de intoxicación subclínica (200 ppb) para este metal en aves

acuáticas (Pain et al., 1997).

Cinc

La media para este metal difiere de forma significativa a lo largo del período de estudio

(F 5,306 = 49.67, p<0.001). Los resultados de Zn para los dos últimos muestreos (2002 y

2003) no difieren entre sí (HSD Tukey p=0.99), pero son significativamente más

elevados que los medidos en 2000 (HSD Tukey p=0.001, en ambos), y 2001 (HSD Tukey

p<0.001), rompiendo así la tendencia al descenso que se había observado para este metal

desde 1999, y mostrando valores similares a los de ese año (HSD Tukey p=0.781 para

2002; HSD Tukey p=0.981 para 2003).

Cadmio

La media para el Cd en 2003 supera de forma significativa a la del año anterior (U Mann-

Whitney=1585,5, p=0.002), aunque ambas no difieren de la de 1998 (U Mann-Whitney

=534.5, p=0.15 para 2002; U Mann-Whitney = 368, p=0.91). Los niveles de Cd en sangre

se situaron por debajo del límite de detección de la metodología en los períodos

reproductores 2000 y 2001, tal y como se observa en la Figura 1.

Arsénico

Aunque las diferencias entre los distintos períodos de muestreo resultaron significativas

(Kruskal –Wallis X 2 =27.88, g.l.=5, p<0.001), los niveles de As no sufrieron cambios de

69

esta índole entre los dos últimos períodos de muestreo (U Mann-Whitney =2321.5,

p=0.99). En comparación con el resto de los años, sólo las diferencias entre 2001 y 2002

(U Mann-Whitney =1713 p<0.001), y entre 2001 y 2003 (U Mann-Whitney =816

p<0.001) fueron significativas (Figura 1).

Como ya se comentó en el apartado de métodos, no hay datos de referencia en

sangre de aves en cuanto a intoxicación por As. En humanos, niveles superiores a 50 ppb

en sangre son indicativos de una exposición excesiva a este metal (Hammond & Beliles,

1980). El 26.7% de los individuos muestreados en 1998, 14.71% en 1999, 12.76% en

2000, 9.38% en 2001, 4.3% en 2002 y 0% en 2003, presentaron niveles de As en sangre

indicativos de exposición a este metal. Las diferencias entre los cinco períodos de

estudio resultaron significativas (X2 = 16.9, gl=5, p=0.005), si bien las comparaciones dos

a dos realizadas con posterioridad (α =0.003, Bonferroni), sólo mostraron diferencias

significativas entre 1998 y los dos últimos períodos de muestreo: 2002 (X2 = 9.42, gl=1,

p=0.002) y 2003 (X2 = 14.2, gl=1, p=0.0002).

Milano negro (M. migrans)

Cobre

En la Figura 2 se puede apreciar cómo la media para este metal en 2002 se sitúa por

debajo de la de todos los años anteriores, sin embargo las diferencias entre todas ellas no

resultaron significativas (F 4,443 = 1.34, p=0.26), por lo que se puede afirmar que los

niveles de Cu no experimentaron variaciones para los pollos de este especie a lo largo del

período de estudio.

Plomo

Por lo que respecta a este metal, y tal y como ocurriera también para el Cu (ver Figura

2), la media de Pb en 2002 se sitúa por debajo de cualesquiera de las de los años

anteriores (Kruskal-Wallis X2 = 33.07, g.l.=4, p<0.001), siendo ese descenso significativo

respecto a cada uno de ellos (U Mann-Whitney p<0.001, en todos los casos).

Por lo que respecta a los individuos intoxicados por Pb: 1.3% (N=160) en 1998,

1.2 (N=167) en 1999, 4.92 % (N=61) en 2000, 0% en 2001 (N=38) y 4.54 % (N=22) en

2002, fueron los porcentajes indicativos de intoxicación subclínica por este metal (200

70

ppb, Pain et al., 1997); las diferencias entre los distintos muestreos no resultaron

significativas (X2 = 5.65, gl=4, p=0.23).

Cinc

También para este metal los niveles medidos en 2002 se sitúan por debajo de los medidos

en años anteriores (Figura 2), y las diferencias entre los cinco períodos de muestreo

resultaron significativas (Kruskal-Wallis X2 = 61.76, g.l.=4, p<0.001), sin embargo, dos a

dos, la media para 2002 no difiere de ninguna de la de los otros años estudiados (U

Mann-Whitney p>0.006 ).

De los pollos muestreados para este metal en sangre, presentaron niveles por

encima de los encontrados en la bibliografía para zonas contaminadas (7.5 ppm,

Falandysz et al., 1988): 3.13% en 1998 (N=160), 1.2% en 1999 (N=167), 1.64 en 2000

(N=61) y 0% en 2001 (N=38) y 2002 (N=22). Las diferencias entre muestreos no

resultaron significativas (X2 = 3.22, gl=4, p=0.52).

Cadmio

Los niveles de Cd difieren significativamente a lo largo del período de estudio (Kruskal-

Wallis X2 = 42.94, gl=4, p<0.001), presentando los pollos nacidos en 2002 una menor

concentración de Cd en sangre que los nacidos en 2001 (U Mann-Whitney=48.5,

p<0.001) (Figura 2)

Superaron el umbral indicativo de exposición a este metal en humanos (10 ppb,

Hammond & Beliles, 1980), un 2.5 % de los pollos muestreados en 1998 (N=160), 1.2 %

en 1999 (N=167), y 0 % para el resto de los períodos de estudio. Las diferencias entre

estas frecuencias no resultaron significativas (X2 = 3.3, gl=4, p=0.51).

Arsénico

En el caso del As, también las diferencias entre los pollos muestreados a lo largo del

período 1998-2002 resultaron significativas (Kruskal-Wallis X2 =125.5, gl=4, p<0.001)

(Figura 2). La tendencia a la baja observada para este metaloide desde 1999 se rompe en

2002, si bien el aumento experimentado respecto a los dos períodos anteriores (2000 y

2001) no resultó significativo en ninguno de los dos casos (p>0.014). No obstante, los

71

niveles para el 2002 se hallan lejos de los medidos en 1999, cuando se alcanzaron los

valores más altos para este metaloide (máximo 1999=1559 ppb; máximo 2002=165.9

ppb).

Respecto al porcentaje de individuos con niveles de As en sangre superiores al

umbral indicativo de exposición excesiva, encontramos que el 10.63 % (N= 160) en

1998, 18.85 % (N=167) en 1999, 14.75 % (N=61) en 2000, 5.26 % (N=38) en 2001 y

22.73 % (N=22) en 2002, superaron las 50 ppb indicativas de exposición excesiva en

humanos. Las diferencias entre los 5 períodos de muestreo (1998-2002) resultaron

significativas (X2 = 31.58, gl=4, p<0.001), pero las comparaciones dos a dos que se

llevaron a cabo posteriormente (α= 0.005, Bonferroni) mostraron que sólo en 1999 el

porcentaje de individuos con niveles de As en sangre indicativos de exposición excesiva

a este metal superó significativamente al que se encontró en 1998 (X2 = 22.7, gl=1,

p<0.001) y 2001 (X2 = 11.43, gl=1, p=0.0007).

DISCUSIÓN

En base a los resultados comentados más arriba para las aves acuáticas, durante la

invernada parece claro que el Cu tiende a disminuir en todas las especies muestreadas, y

el As se mantiene por debajo del límite de detección de la metodología, o ligeramente por

encima de este valor. Por el contrario, en base a esos mismos resultados, los niveles de

Zn parecen aumentar en la zona contaminada de Entremuros para la única especie

capturada en ella (calamón), que también incrementa sus niveles de Cd en esa misma

zona. El aumento en los valores de este metal es generalizado al resto de especies, sin

embargo, excepto un ejemplar de calamón capturado en Entremuros, y una focha, el resto

de los individuos presentan niveles casi un orden de magnitud por debajo de los que en

humanos indican exposición a este metal. Como ya se comentaba en informes anteriores

(Baos et al. 2001), desde que ocurriera el vertido, y aunque la tendencia observada era a

la baja, algunos metales experimentan picos de contaminación que podrían estar

relacionados tanto con la movilización de los metales en suelos y sedimentos que aún

permanecen contaminados en la zona próxima a la mina, como con la probable existencia

de otras fuentes de contaminación distintas al vertido que deberían ser estudiadas. Con la

información de que disponemos a la hora de entregar este informe no podemos descartar

ninguna de las dos posibles causas, por lo que sería aconsejable seguir investigando en

este sentido. Lo que sí es evidente es que las aves acuáticas de las Marismas del

72

Guadalquivir siguen presentando niveles altos de Pb en relación directa con la actividad

cinegética. El hecho de que en la zona afectada por el accidente de Aznalcóllar los

niveles de este metal sigan siendo bajos, e incluso inferiores a los observados en

invernadas anteriores, parece confirmar que el Pb medido en la sangre de las acuáticas

muestreadas no tiene su origen en el vertido, sino en los perdigones de Pb provenientes

de la caza.

Por lo que respecta a la época reproductora, los niveles medidos en especies

acuáticas son bajos en todos los casos. Quizá lo más destacable sea que, siguiendo con la

tendencia observada en años anteriores durante esta misma época, sólo un individuo de

todos los analizados presenta niveles de Pb indicativos de intoxicación subclínica por este

metal (Pain et al., 1997). El hecho de que la prevalencia en cuanto a la intoxicación por

Pb en época reproductora o durante la mancada sea menor que durante la invernada ha

sido estudiado por otros autores, y relacionado con la ausencia de actividad cinegética

durante esos mismos períodos (DeStefano et al., 1991; Pain et al., 1997; Miller et al.,

2001). Esto, unido a la elevada prevalencia de individuos intoxicados por este metal

durante la invernada, señalan a la caza como origen más que probable de la

contaminación por Pb en las aves acuáticas de las Marismas del Guadalquivir,

requiriendo una pronta actuación por parte de la autoridad competente para solucionar

este problema.

En cuanto a los pollos de cigüeña y milano negro, la comparación en los

resultados de metales pesados y arsénico de los dos últimos períodos reproductores (2002

y 2003) respecto a los anteriores, muestra un cierto comportamiento diferencial entre las

dos especies, excepto en el caso del Cu, con valores similares a los medidos en años

anteriores en la cigüeña e incluso más bajos para el milano (Figuras 1 y 2). Así, mientras

en el milano negro los niveles de Zn, Pb y Cd tienden a disminuir en todos los casos

(sólo en el As se observa un ligero incremento respecto a los individuos muestreados en

2000 y 2001), los pollos de cigüeña muestreados en 2002 y 2003 tienen más Zn y más Cd

que los muestreados en años anteriores, incluso en el caso del Cd, los niveles de 2003

superan de forma significativa a los medidos el año anterior. El Zn es un metal al que las

aves muestran una alta tolerancia (Ewan, 1978), por lo que a pesar del aumento

observado en 2002 respecto a 2000 y 2001, no es de esperar que ese aumento comporte

efectos significativos en la salud de los individuos. Además, los niveles en todos los

casos son bajos, y lejos de los que podrían llegar a provocar efectos subletales (Benito et

al., 1999). Esto último se puede comentar igualmente del Cd. Aunque los niveles para

73

este metal durante los dos últimos años superan los medidos en años anteriores, es

necesario señalar que se hallan casi un orden de magnitud por debajo del nivel que en

humanos se considera propio de individuos expuestos a este metal (Hammond & Beliles,

1980).

Tanto en la cigüeña como en el milano, el As presenta un ligero incremento en el

2002 respecto al anterior período reproductor (Figuras 1 y 2), aunque la media se sitúa

por debajo de los niveles medidos durante los primeros años después del vertido en

ambas especies. Incluso en la cigüeña se observa un ligero descenso en 2003. Cuando lo

que se compara es el porcentaje de individuos con niveles que podrían sugerir una

exposición “excesiva” a este metaloide, la tendencia al descenso, especialmente durante

los dos últimos períodos de muestreo se confirma en el caso de la cigüeña, mientras que

en el milano no se observan cambios significativos respecto a otros años, siendo elevado

en todos ellos (entre un 5.3 y un 22.7%, según qué año se considere).

Aunque los niveles de metales para estas dos especies son en 2002 y 2003 bajos

en todos los casos, el aumento detectado para el Cd y el Zn en la cigüeña, y para el As en

el milano, harían aconsejable un seguimiento más prolongado de ambas especie, sobre

todo en relación a los efectos subletales que estos niveles, aunque bajos, podrían causar a

los individuos, afectando con ello a la viabilidad futura de sus poblaciones.

74

Figura 1. Niveles de metales pesados y arsénico en sangre de pollos de cigüeña (Ciconia

ciconia) nacidos en la Dehesa de Abajo. Las barras indican la media y su error estándar.

El número de individuos (N) aparece debajo de cada grupo.

509364516715N =

AÑO

200320022001200019991998

Cob

re (p

pb)

700

600

500

400

300509364516715N =

AÑO

200320022001200019991998

Plom

o (p

pb)

110

100

90

80

70

60

50

40

30

509336516715N =

AÑO

200320022001200019991998

Cin

c (p

pm)

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5509364516615N =

AÑO

200320022001200019991998

Cad

mio

(ppb

)

1.4

1.2

1.0

.8

.6

.4

.2

0.0

509364476815N =

AÑO

200320022001200019991998

Ars

énic

o (p

pb)

50

40

30

20

10

75

Figura 2. Niveles de metales pesados y arsénico en sangre de pollos de milano negro

(Milvus migrans) nacidos en la Doñana y su entorno. Las barras indican la media y su

error estándar. El número de individuos (N) aparece debajo de cada grupo.

223861167160N =

AÑO

20022001200019991998

Cob

re (p

pb)

400

380

360

340

320

300

280223861167160N =

AÑO

20022001200019991998

Plo

mo

(ppb

)

60

50

40

30

20

10

223861167160N =

AÑO

20022001200019991998

Cin

c (p

pm)

5.8

5.6

5.4

5.2

5.0

4.8

4.6

4.4223860167160N =

AÑO

20022001200019991998

Cad

mio

(ppb

)

3.6

3.1

2.6

2.1

1.6

1.1

.6

.1

223859167160N =

AÑO

20022001200019991998

Ars

énic

o (p

pb)

160

140

120

100

80

60

40

20

0

76

5. MALFORMACIONES EN POLLOS DE CIGÜEÑA BLANCA EN EL

ÁREA DE DOÑANA Y SU ENTORNO

INTRODUCCIÓN

En las poblaciones de aves silvestres la aparición de individuos con malformaciones es

un fenómeno bastante habitual. Sin embargo, cuando la frecuencia de individuos

afectados se sitúa por encima de lo que de una forma natural es previsible que ocurra

(entre un 0 y un 2%, según Hoffman et al., 1988), puede interpretarse como un indicio de

que la salud de la población se está viendo mermada.

Las anomalías más habituales incluyen varios tipos de lesiones como rotaciones

en pico y patas, defectos en los ojos (incluso carencia de ellos), en el plumaje, asimetría

de las alas, etc. La aparición de estas anomalías puede tener lugar, tanto durante el

desarrollo del embrión, como después de él y, en casos graves, pueden ocasionar la

muerte del individuo, afectando con ello al éxito reproductor de las poblaciones y a su

viabilidad futura.

Las malformaciones en picos y otras partes córneas, así como en huesos y otras

estructuras, se han relacionado con la exposición a metales pesados y arsénico (Stanley et

al., 1994; Mora, 1996). Sin embargo, también pueden estar causadas por parásitos,

enfermedades infecciosas, deficiencias nutricionales, traumatismos e incluso pueden

tener un origen genético (Albers et al., 2000), por lo que su interpretación como

indicadores de exposición a contaminantes, y concretamente a metales pesados, debe

hacerse con precaución.

Tras el accidente de Aznalcóllar, y como parte del seguimiento iniciado en toda el

área para determinar los posibles efectos del desastre sobre la avifauna, y más

concretamente sobre la cigüeña (que es la especie que nos ocupa), además del

anillamiento de los pollos, y de información sobre parámetros reproductivos, se ha

registrado cualquier tipo de malformación externa observada durante el manejo de los

pollos, además de tomar muestras de sangre para análisis de metales pesados y otros.

77

En este capítulo se estudia la aparición de malformaciones en las colonias de

cigüeña de las Marismas del Guadalquivir tras el vertido tóxico de Aznalcóllar y su

evolución en el tiempo. El seguimiento se llevó a cabo en mayor detalle en la colonia de

la Dehesa de Abajo por las razones que se argumentan en la introducción general de este

informe. Las relaciones potenciales entre las malformaciones y características ligadas,

tanto al individuo como al nido de nacimiento, fueron también estudiadas y se detallan a

continuación. Asimismo, se estudian los niveles de metales pesados y arsénico en sangre

y su relación con la presencia o ausencia de malformaciones, así como el efecto de dichas

malformaciones sobre el estado de salud de los pollos y su supervivencia en el nido. Por

último, y también con el propósito de profundizar en el origen de esta patología, se

muestran los primeros resultados de los estudios histológicos y relacionados con el

metabolismo óseo que, en colaboración con la Dra. J. Smits, (Departmento de Patología

Veterinaria) y el Dr. G. Bortolotti (Departamento de Biología) de la Universidad de

Saskatchewan (Canadá), y el Dr. W. Hoffman, de la Universidad de Illinois (USA), se

han desarrollado en el marco de este proyecto.

MÉTODOS

Presencia de malformaciones en las colonias de cigüeña asentadas en las Marismas

del Guadalquivir Antes-Después del vertido de Aznalcóllar.

Para poder determinar si el vertido está o no relacionado con las malformaciones

detectadas en los pollos de cigüeña es necesario conocer la prevalencia de este fenómeno

en el área antes del accidente de Aznalcóllar. Asumiendo que la mayor parte de las

malformaciones son registradas durante el proceso de marcaje y manejo de los pollos, nos

remontamos 5 años atrás al vertido (1993) para determinar si en las colonias que han sido

objeto de seguimiento a lo largo del período de estudio, se habían detectado con

anterioridad este tipo de malformaciones. En este sentido es necesario señalar que, tanto

antes como después del vertido, el seguimiento de las colonias fue llevado a cabo por las

mismas personas (integrantes del Equipo de Seguimiento de Procesos Naturales de la

Estación Biológica de Doñana), evitando con ello el posible sesgo del observador.

Los datos revisados con este propósito abarcan el período comprendido entre

1993 y 2003.

78

Evolución de las malformaciones en la colonia de cigüeñas de la Dehesa de Abajo.

Factores asociados al riesgo de sufrir malformaciones.

En la colonia de la Dehesa de Abajo, además de la presencia o ausencia de

malformaciones, y por los motivos expuestos anteriormente en este informe, se llevó a

cabo un seguimiento más exhaustivo de estas malformaciones, intentando con ello poder

aproximarnos a su origen y estudiar sus posibles efectos sobre la salud de los individuos

y de la población, así como sus repercusiones futuras en la viabilidad de la misma.

La posible relación entre malformaciones y variables intrínsecas al individuo,

como el sexo, o relacionadas con el nido de nacimiento, como la fecha de puesta, el

tamaño de puesta, y la jerarquía en el nido (pollos grandes, medianos o pequeños), fueron

estudiadas a fin de determinar cuáles podrían ser los factores de riesgo que favorecerían

que un pollo presentara algún tipo de malformación. En este análisis se consideraron

todos los pollos deformes nacidos en el período 1999-2002, más una muestra aleatoria de

pollos no deformes, para el mismo rango de edad, nacidos durante el mismo período.

El sexo de los pollos se determinó mediante procedimientos moleculares en

Laboratorio de Ecología Molecular de la Estación Biológica de Doñana.

Análisis estadísticos

Para estudiar las variaciones interanuales en cuanto al porcentaje de individuos afectados

(Chi cuadrado X2) sólo se consideraron los pollos detectados como deformes durante el

proceso de anillamiento (datos comprables entre sí).

Puesto que manifestar o no malformación puede estar potencialmente relacionado

con el hecho de compartir los mismos padres o las mismas condiciones de cría, los pollos

de un mismo nido no pueden ser considerados como unidades muestrales independientes.

Por ello, el nido se considera un factor aleatorio en el Modelo Lineal General Mixto

(macro GLIMMIX paquete estadístico SAS, Litell et al., 1996) realizado al efecto. La

distribución fue binomial (0=no deforme, 1=deforme) y la función de enlace logística. De

esta forma se llevó a cabo un análisis en el que el año, el sexo y la jerarquía en el nido

(pollo grande, mediano o pequeño) se introdujeron como factores, mientras que la fecha

de puesta y el tamaño de puesta se consideraron como covariables.. El proceso de

modelado se realizó mediante pasos hacia atrás (procedimiento backwards), esto es, a

partir de un modelo saturado que consideró todas las variables, se eliminaron

79

sucesivamente los términos menos significativos (p>0.05) hasta que todos los efectos

retenidos mejoraron el ajuste del modelo final.

Debido al escaso número de pollos deformes detectados durante los períodos

reproductores de 2000 y 2003, y para aportar fiabilidad a los análisis estadísticos, ambos

períodos se excluyeron del modelo antes descrito.

Relación entre malformaciones y niveles de metales pesados y arsénico en pollos de

cigüeña nacidos en la Dehesa de Abajo.

Además del marcaje de los pollos con anillas de metal y plástico, y de anotar medidas

como la longitud del ala y el peso, a cada uno de los individuos muestreados, tanto

deformes como no deformes, se les extrajo una muestra de sangre de la vena radial para

análisis de metales pesados y arsénico. La sangre (1.5 ml approx.) fue conservada en

viales heparinizados y congelada in situ a –80ºC , manteniéndola a esta temperatura hasta

su análisis en el laboratorio (Instituto de Agroquímica y Tecnología de los Alimentos-

Valencia; Instituto de Química Orgánica General-Madrid).

Cobre, plomo, cadmio y arsénico se analizaron mediante espectrofotometría de

absorción atómica en cámara de grafito, mientras que para el cinc se utilizó

espectrofotometría de absorción atómica en llama. Para más detalles sobre la metodología

de análisis ver Benito et al., (1999) y Baos et al. (2001).

Los límites de detección metodológicos son: Cd 0.25 ppb, Pb 1.7 ppb, Cu 3 ppb,

As 24 ppb y Zn 0.3 ppm.

La fecha de puesta se calculó a partir de la fecha de nacimiento (ver capítulo 3)

del pollo de más edad en el nido, restándole los días correspondientes al período de

incubación (33 días).

Análisis estadístico

Para determinar si la presencia de malformaciones está relacionada con la concentración

de metales en sangre se realizó un GLM (GENMOD procedure) considerando el nido

como unidad de análisis. La variable dependiente se ajustó a una distribución binomial

(0=nidos sin pollos deformes; 1=nidos con, al menos, un pollo deforme) y la función de

enlace utilizada fue logística. En los nidos en los que se detectó la presencia de algún

pollo con malformaciones externas, la concentración de metales que se consideró en el

análisis fue la del individuo deforme en el caso de que sólo uno de los pollos del nido

80

presentara malformaciones, o la media si eran más de uno los pollos con malformaciones.

En los nidos en los que ningún pollo presentaba malformaciones se utilizó la media de las

concentraciones para cada metal si había más de un pollo en el nido. Cuando los niveles

de metales y arsénico en sangre estaban por debajo del límite de detección, se introdujo

en el modelo la mitad de dicho límite.

El proceso de modelado fue mediante pasos hacia atrás a partir de un modelo

inicial saturado que incluyó todas las variables independientes, esto es, además de la

concentración de metales y arsénico,: año, fecha de puesta, tamaño de puesta, y cada una

de las interacciones de estas variables con el año de muestreo. Los datos de 2000 y 2003

no se consideraron debido al escaso número de pollos deformes detectados durante

ambos años.

Efecto de las malformaciones sobre distintos bioindicadores del estado de salud de

los pollos de cigüeña nacidos en la Dehesa de Abajo.

En este caso se consideran como bioindicadores del estado de salud de los individuos la

respuesta inmune celular (ver capítulo 6), el daño en el ADN (ver capítulo 7), la

condición física y las proteínas de estrés. La metodología utilizada para medir la

respuesta inmune celular y el daño genotóxico se detalla en los correspondientes

capítulos de este informe.

La condición física es un parámetro muy utilizado en estudios de ecología animal

porque resulta fácil de calcular e interpretar. Consiste en relativizar el peso del individuo

respecto su tamaño en un análisis de regresión. De esta manera aquellos pollos que

presentan un residuo positivo son los pollos que por su tamaño corporal pesan más.

Las proteínas del estrés se descubrieron en 1960 en las moscas de la fruta (género

Drosophila) y pronto se identificaron en muchos otros organismos. Son unas proteínas

muy conservadas a nivel evolutivo, encontrándose en todos los tejidos y en todas las

especies que se han analizado hasta el momento a nivel mundial. Las funciones más

importantes que desempeñan estas proteínas son la producción y degradación de otras

proteínas, estabilización de microfilamentos y regulación del sistema inmune. Aunque el

primer factor estresante que se encontró fue el calor (de ahí el nombre de “heat shock

proteins” en inglés), muchos otros factores se han ido identificando a lo largo del tiempo.

Por ejemplo, estas proteínas se producen en respuesta a citoquinas, parásitos o metales

pesados. Se han estudiado dos proteínas de estrés en sangre, la HSP60 y la HSP70.

81

Análisis estadísticos

Para analizar los datos los pollos se han clasificado de la siguiente manera según las

malformaciones que presentaban: 1= pollo sin malformaciones y sin hermanos con

malformaciones; 2= pollo sin malformaciones pero con hermano/s con malformaciones;

3= pollo con malformaciones leves o con articulaciones hinchadas; y 4= pollo con

malformaciones muy evidentes.

Los análisis estadísticos se han hecho con los pollos a los que se les realizó la

prueba del sistema inmune (sólo 2002) por ser de los que se tiene información más

detallada acerca de su estado de salud. Para cada variable estudiada se ha realizado un

análisis univariante con Modelos Lineales Generalizados Mixtos usando el macro

GLIMMIX en el paquete estadístico SAS, incluyendo el nido de nacimiento como factor

aleatorio. De esta manera se controla por la covarianza en sistema inmune entre los

hermanos de un mismo nido y al mismo tiempo se extrae un estimador de esta

covarianza. A causa del reducido número de muestras analizadas para las proteínas de

estrés, se afinó el análisis estadístico comparando los pollos malformados con sus

hermanos malformados y con un pollo no malformado de otro nido en dos análisis

apareados (t de Student apareada). El emparejamiento del pollo con malformaciones con

un pollo de otro nido sin malformaciones se hizo procurando que esta “pareja” fuera lo

más parecida al primero, excepto en el hecho de presentar o no malformaciones. Además

se escogieron sólo individuos claramente sin malformaciones o claramente con

malformaciones.

Efecto de las malformaciones sobre la supervivencia de los pollos de cigüeña en la

Dehesa de Abajo durante su estancia en el nido.

El número de pollos que manifiestan algún tipo de malformación externa durante sus

primeros días de vida es prácticamente imposible de determinar ya que, aunque se han

detectado pollos de corta edad claramente deformes, parece bastante probado que la

mayor parte de ellos desarrollan estas anomalías a lo largo de su crecimiento (obs.

personal). Además, como se ha visto anteriormente (ver capítulo 3.1.2), la probabilidad

de muerte en el nido es más elevada precisamente durante los primeros días de vida.

El porcentaje de pollos con malformaciones cambia radicalmente entre un año y el

siguiente (ver resultados). Por tanto, sería una buena aproximación considerar que el

82

porcentaje de pollos deformes cada año es el máximo porcentaje encontrado en el período

de estudio (1998-2003), esto es 2001, 6.3% (máximo para datos correspondientes al

anillamiento y, por tanto, comparables entre años dentro del período de estudio). Hay que

tener en cuenta que esta es una aproximación conservativa puesto que, muy

probablemente, algunos de los pollos que desarrollaron malformaciones en 2001

murieron antes de ser detectados. No obstante, asumiendo de forma conservativa que en

el año 2001 sobrevivieron todos los pollos con malformaciones, podemos calcular la

supervivencia de los pollos deformes para el resto de los años dividiendo el número de

pollos con malformaciones que se podría esperar que aparecieran cada año (porcentaje de

2001 multiplicado por el número de pollos anillados cada año) entre el número real que

se detectó. De esta manera si se detectaran todos los pollos predichos, la supervivencia

sería del 100% y si no se detectara ninguno sería del 0%.

Como se menciona en un apartado anterior de este informe, la supervivencia de

los pollos en nido puede verse afectada por fenómenos meteorológicos adversos. En el

caso de la colonia de la Dehesa de Abajo se ha encontrado que la mortandad de los pollos

fue especialmente elevada en aquellos años en que más llovió durante la permanencia de

los pollos en el nido (ver resultados en capítulo 3.1.2). Ello permitiría hipotetizar que los

años en que la lluvia caída entre el 1 de abril y el 15 de mayo fue más elevada, la

supervivencia de los pollos con malformaciones sería menor. Por este motivo, además del

año también se consideró la precipitación caída en este período en el análisis estadístico

realizado al efecto (Chi-Cuadrado X2).

RESULTADOS

Presencia de malformaciones en las colonias de cigüeña asentadas en las Marismas

del Guadalquivir Antes-Después del vertido de Aznalcóllar.

Tal y como se observa en la Figura 1 ninguno de los pollos de cigüeña manejados en el

área de estudio presentaron malformaciones externas en el período comprendido entre

1993 y 1997, ambos inclusive. Tampoco en 1998. En cambio, a partir de 1999 la

presencia de malformaciones, fundamentalmente en la colonia de la Dehesa de Abajo, es

una constante, registrándose en ella, año tras año, pollos con algún tipo de malformación

externa (Figura 2). El resto de las colonias en las que se han detectado pollos con

83

malformaciones son: Casa Nieves (1999, 2000 y 2001); La Cañada de los Pájaros (1999,

2000, 2001 y 2003); Matasgordas (2000); nido situado en la caseta transformadora entre

Villafranco del Guadalquivir y el desvío a Veta La Palma (2000) y en El Acebuche

(2001). En estas colonias no todos los nidos fueron revisados en todos los períodos

reproductores, por lo que no es posible dar un porcentaje de individuos afectados que

resulte comparable, tanto entre años, como entre colonias.

En el caso de La Dehesa de Abajo, el seguimiento que de esta colonia viene

haciéndose desde la década de los ochenta, revisando todos los nidos y marcando todos

los pollos nacidos en ella, ha permitido tener un registro mucho más pormenorizado de

las malformaciones detectadas, lo que nos va a permitir profundizar algo más en sus

posibles causas y en los posibles efectos que pudieran tener sobre la colonia.

Figura 1. Colonias de cigüeña objeto de seguimiento Antes del vertido de Aznalcóllar

(1993-1997).

Figura 2. Colonias de cigüeña objeto de seguimiento Después del vertido de Aznalcóllar

(1998-2003).

Sevilla

Mina de Aznalcóllar

Arrozales

Doñana

Dehesa de Abajo

1993-1997

Colonias SIN pollos con deformaciones

84

Evolución de las malformaciones en la colonia de cigüeñas de la Dehesa de Abajo.

Factores asociados al riesgo de sufrir malformaciones.

Desde que se iniciara el seguimiento de esta colonia en la década de los ochenta hasta

1999 no se habían detectado en ella pollos con malformaciones externas (Figuras 1 y 2,

Tabla 1). A partir de esta fecha, la presencia de malformaciones se ha repetido todos los

años, aunque en proporción variable (GLM χ24 = 26.57, p < 0.0001). El máximo se

contabilizó en 2001, con un 9.1 % de los pollos deformes.

Tabla 1. Número, y porcentaje respecto al total anillados, de pollos de cigüeña nacidos en

la colonia de la Dehesa de Abajo con malformaciones externas. La línea punteada separa

los años anteriores (1993-1997) de los posteriores al vertido (1998-2003).

Sevilla

Mina de Aznalcóllar

Arrozales

Doñana

Dehesa de Abajo

1998-2003

Colonias SIN pollos con deformaciones

Colonias CON pollos con deformaciones

85

Imágenes de pollos con malformaciones en pico y

patas nacidos en la Dehesa de Abajo.

Las malformaciones detectadas afectan fundamentalmente al pico y a las patas. En

el caso del pico, la más común de estas malformaciones consiste en la curvatura de

ambas mandíbulas hacia arriba, aunque también se observan picos desviados

lateralmente. En las patas se observan engrosamientos en la zona distal del tibiotarso y

proximal del tarsometatarso.

Tabla 2. Resultados del modelo GLMM realizado para determinar los posibles factores

de riesgo asociados a las malformaciones en pollos de cigüeña blanca (C. ciconia)

nacidos en la Dehesa de Abajo.

1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003

sin malformaciones 104 220 74 0 355 350 375 280 540 303 151

con malformaciones 0 0 0 0 0 0 22 3 54 17 5

total pollos 104 220 74 0 355 350 397 283 594 320 156

% con malformaciones 0 0 0 . 0 0 5.5 1.1 9.1 5.3 3.3

86

Respecto a las variables testadas en el modelo GLMM para profundizar en los

factores de riesgo que podrían estar asociados a estas malformaciones, resultaron

significativas la jerarquía en el nido, y el sexo, mientras que la fecha de puesta lo fue

marginalmente (Tabla 2). Así, los pollos más pequeños del nido se detectan como

deformes en mayor proporción que los medianos o los más grandes (Figura 3). De igual

modo, los machos con malformaciones fueron detectados en una proporción

significativamente mayor que las hembras (Figura 4). Por último, de acuerdo a ese

mismo modelo, la fecha de puesta también parece afectar a la probabilidad de presentar

malformaciones, siendo mayor en los pollos más tardíos.

El nido de nacimiento tuvo efecto significativo (Z=7.1, p<.0001).

Variable F d.f. p Estima Err. Std. t pIntercepto -5.889 1.8735 -3.14 0.0019sexo 23.52 1,315 <.0001

macho 1.2126 0.25 4.85 <.0001hembra 0 . . .

fecha de puesta 3.31 1,315 0.0698 0.0437 0.02405jerarquía nido 58.04 2,315 <.0001

grande -2.5833 0.2503 -10.32 <.0001mediano -1.4834 0.2599 -5.71 <.0001pequeño 0 . . .

resto de variables >0.2

87

Figura 3. Proporción de pollos con malformaciones externas en función de su jerarquía

en el nido (grande, mediano o pequeño). Las barras de error representan el intervalo de

confianza 95%.

Figura 4. Proporción de pollos con malformaciones externas en función del sexo. Las

barras de error representan el intervalo de confianza 95%.

9310189 9410683N =

200220011999

mal

form

acio

nes

(0=n

o; 1

=sí)

,30

,24

,18

,12

,06

0,00

SEXO

macho

hembra

676959 345539 918374N =

200220011999

mal

form

acio

nes

(0=n

o; 1

=sí)

.4

.3

.2

.1

0.0

-.1

grande

mediano

pequeño

88

Relación entre malformaciones y niveles de metales pesados y arsénico en pollos de

cigüeña nacidos en la Dehesa de Abajo.

Los resultados del GLM realizado a nivel de nido muestran que tanto el Cu, como el Zn

están relacionados con la presencia de malformaciones (Tabla 3). En los nidos en los que

alguno de los pollos presentaba malformaciones externas, la concentración de Cu es

significativamente más elevada que en los nidos en los que ninguno de los pollos

manifestaba este tipo de anomalías morfológicas. El efecto positivo (para los nidos con

pollos malformados) del Cu es consistente a lo largo del período de estudio. Por el

contrario, el efecto del Zn varía en función del año, así mientras en 1999 los nidos con

pollos malformados tenían niveles más elevados de este metal que los no malformados,

en 2001 y 2002 la tendencia es la contraria (Figura 5).

También el número de huevos parece afectar al hecho de que los pollos

manifiesten o no malformaciones, siendo mayor la probabilidad de encontrar pollos

deformes en los nidos donde el tamaño de puesta es mayor. No obstante, dada la baja

significación (p= 0.04), este resultado podría ser un artefacto: cuanto mayor es el número

de huevos, mayor será el número de pollos y en consecuencia, también será mayor la

probabilidad de que alguno de los pollos sea deforme, por lo que debería interpretarse

con precaución.

Tabla 3. Resultados del modelo GLM realizado para estudiar el efecto de la exposición a

metales pesados y arsénico, junto con otras variables relacionadas con el nido de

nacimiento, sobre la probabilidad de presentar malformaciones externas en pollos de

cigüeña blanca (C. ciconia) nacidos en la Dehesa de Abajo.

Variable X 2 d.f. p Estima Err. Std. X 2 pIntercepto 5,4682 4,5036 1,47 0,2247año 24,96 2 <,0001cobre (ppb) 5,51 1 0,0189 0,009 0,0043cinc (ppm) 6,17 1 0,013año*cinc 21,69 2 <,0001

1999 1,5642 0,6085 6,61 0,01022001 -3,101 1,6899 3,37 0,06652002 -4,2927 1,5591 7,58 0,0059

tamaño de puesta 4,09 1 0,0432 0,7901 0,4053

89

132318 392032N =

200220011999

Cob

re (p

pb)

800

700

600

500

400

300

200132317 392032N =

200220011999

Plo

mo

(ppb

)

250

200

150

100

50

0

-50

1318 3931N =

20021999

Cad

mio

(ppb

)

12

10

8

6

4

2

0

-2131718 39832N =

200220011999

Cin

c (p

pm)

5

4

3

2

1

132318 392032N =

200220011999

Ars

énic

o (p

pb)

100

80

60

40

20

0

90

Figura 5. Niveles de metales pesados y arsénico en sangre para nidos en los que uno o

más pollos presentaron algún tipo de malformación externa (cajas blancas) o sin

malformaciones (cajas grises). La caja representa la amplitud intercuartil que contiene el

50% de los valores centrales y la línea negra que aparece en su interior es la mediana. En

el caso del Cd, todos los valores correspondientes a 2001 se situaron por debajo del límite

de detección de la metodología.

Efecto de las malformaciones sobre distintos bioindicadores del estado de salud de

los pollos de cigüeña nacidos en la Dehesa de Abajo.

La Figura 6 muestra la relación entre las distintas categorías de individuos respecto a su

estado de malformaciones y los cinco bioindicadores estudiados. El efecto de las

malformaciones sobre la respuesta inmune celular fue marginalmente significativo

(F3,94=2.17, p=0.09). El efecto de las malformaciones sobre la condición física fue más

patente, resultando estadísticamente significativo (F3,94=4.00, p=0.01), lo mismo que el

efecto de las malformaciones sobre el daño genotóxico (F3,19=3.90, p=0.02).

91

Figura 6. Relación entre las distintas categorías de individuos respecto a su estado de

malformaciones y los cinco bioindicadores estudiados.

671318N =

malformaciones

4321

daño

gen

otóx

ico

1.6

1.4

1.2

1.0

.8

.6

.4

.2

0.0

151637117N =

malformaciones

4321

resp

uest

a in

mun

e ce

lula

r

1.8

1.7

1.6

1.5

1.4

1.3

151637117N =

malformaciones

4321

cond

ició

n fís

ica

.0

.0

0.0

-.0

-.0

-.1

-.1

150

160

170

180

190

200

210

HSP70 hermano sano HSP70 pareja sana HSP70 hermanomalformado

clase de pollo

HSP

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

HSP60 hermano sano HSP60 pareja sana HSP60 hermanomalformado

clase de pollo

HSP

60

Figura 1. Relaciones entre el estatus de cada individuo respecto a las malformaciones de patas y pico y distintas variables indicadoras de su estado de salud. Ver texto para las distintas categorías.

92

La Tabla 4 presenta los resultados de diferencias en HSP entre los individuos con

malformaciones y sus hermanos sin malformaciones y con pollos sin malformaciones de

otros nidos.

Tabla 4. Estadísticos de la diferencia en los niveles de las proteínas de estrés HSP70 y

HSP60 de los pollos con y sin deformaciones. Ver texto para la clasificación de los pollos

y el diseño muestral.

Como se puede ver, los individuos que sufrieron malformaciones presentaron

menor condición física, menor respuesta inmune, niveles más elevados de proteínas de

estrés y mayor daño genotóxico. Es especialmente relevante que los pollos con hermanos

con malformaciones tendieron a presentar menor respuesta inmune que los pollos no

malformados sin hermanos con malformaciones.

Efecto de las malformaciones sobre la supervivencia de los pollos de cigüeña en la

Dehesa de Abajo durante su estancia en el nido.

La supervivencia de los pollos con malformaciones varía de forma significativa a lo largo

del período de estudio (GLM χ21 = 290.73, p < 0.0001, Figura 7), viéndose afectada de

forma negativa por la precipitación caída entre el 1 de Abril y el 15 de Mayo (GLM χ21 =

201.48, p < 0.0001, Figura 7).

Diferencia

Media Error típ. t gl

Sig. (bilateral)

HSP70 hermano sano - pareja sana -4.384 3.412 -1.285 3 0.289

HSP70 pareja sana - hermano malformado -17.631 2.605 -6.77 4 0.002

HSP70 hermano sano - hermano malformado -12.017 6.827 -1.76 6 0.129

HSP60 hermano sano - pareja sana -21.695 7.021 -3.09 3 0.0537

HSP60 hermano sano - hermano malformado -25.654 8.288 -3.095 6 0.021

HSP60 pareja sana - hermano malformado -13.301 11.49 -1.158 4 0.311

93

Figura 7. Supervivencia de los pollos durante su permanencia en el nido en función de la

precipitación caída entre el 1 de Abril y el 15 de Mayo.

En la Figura 7 se aprecia cómo la supervivencia de los pollos durante su estancia en el

nido se ve afectada por la lluvia, y cómo, además, ese efecto es más acusado en el caso de

los pollos con algún tipo de malformación externa.

Malformaciones en pollos de cigüeña nacidos en la Dehesa de Abajo (2001-2003).

Histopatología y Metabolismo óseo.

Los resultados que a continuación se exponen derivan de los trabajos llevados a cabo en

colaboración con la Dra. J. Smits y el Dr. G. Bortolotti de la Universidad de

Saskatchewan (Canadá), y el Dr. W. Hoffman, de la Universidad de Illinois (EEUU).

Este apartado no se ajusta al esquema seguido hasta el momento (introducción, métodos,

etc), sino que consta de una pequeña introducción en la que se describe el trabajo

realizado hasta el momento en relación a este tema, los resultados más relevantes y, por

último, unas conclusiones parciales y propuestas de trabajo.

Año

1999 2000 2001 2002 2003

Sup

ervi

venc

ia

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Pre

cipi

taci

ón d

el 1

de

Abr

il al

15

de M

ayo

(mm

)

0

50

100

150

200

250

Pollos deformesPollos NO deformes

94

METABOLISMO ÓSEO

INTRODUCCIÓN

Para poder determinar la naturaleza de las malformaciones que presentaban los pollos

nacidos en la Dehesa de Abajo, en 2001, y con el permiso de la Junta de Andalucía,

algunos de los pollos que presentaron malformaciones ese año fueron retirados de la

colonia y llevados al Centro de Recuperación del Acebuche. El examen radiológico de

estos pollos desveló que las malformaciones en sus patas afectaban al hueso. Por este

motivo, nos pusimos en contacto con la Dra. J. Smits, quién manifestó la importancia de

estudiar dos parámetros bioquímicos que, junto con otros estudios complementarios,

podrían ayudar a determinar el origen de estas malformaciones.

El primero de estos parámetros es la fosfatasa alcalina (FA). De esta enzima

existen tres formas isoméricas: la isoenzima hepática, la intestinal y la isoenzima ósea. Es

precisamente esta última la que resulta más interesante de cara al estudio de las

malformaciones.

La isoenzima ósea de la FA (FAO) es liberada por los osteoblastos (células

encargadas de formar el hueso), y sus niveles son especialmente elevados cuando el

hueso está creciendo o renovándose, es decir, cuando existe actividad ósea. De ahí que

los individuos jóvenes, sobre todo aquellos en los que el crecimiento se produce de una

forma muy rápida, como las cigüeñas (en especies semialtriciales, como es el caso, los

pollos alcanzan la talla adulta antes de abandonar el nido), se caractericen por tener

niveles altos de esta isoenzima en suero. Aunque hay algún estudio sobre niveles de FA

en pollos de cigüeña, nunca antes se habían estudiado las distintas isoenzimas en esta

especie. El método fue puesto a punto por el Dr. W. Hoffman, una autoridad mundial en

el tema.

Además de la FA, se estudiaron los niveles de Ca y P, minerales estrechamente

relacionados con el metabolismo óseo. El cociente entre estos dos minerales (Ca:P) está

sometido a un estricto control homeostático, del que depende el correcto crecimiento de

los huesos y el desarrollo normal de los pollos.

Por otro lado, la falta de referencias acerca del patrón normal de variación de

estos parámetros fisiológicos en la especie hizo necesario incluir en el estudio una

95

colonia control que nos permitiera establecer comparaciones con la Dehesa de Abajo.

Dada la dificultad de encontrar fuera de las Marismas del Guadalquivir una colonia que

cumpliera los requisitos necesarios para ser considerada como control (aunque no

expuestas al vertido, en la mayor parte de las colonias de cigüeñas con las que hemos

trabajado los niveles de metales pesados y As son superiores a los medidos en Doñana)

(Baos et al., 2001), se seleccionó como colonia de referencia Matasgordas, dentro del

Parque Nacional de Doñana, pero más alejada de la zona afectada por el vertido que la

Dehesa de Abajo.

RESULTADOS

FAO (fosfatasa alcalina, isoenzima ósea)

Estudios llevados a cabo en otras especies han demostrado que los niveles de FAO en

suero están positivamente correlacionados con la edad hasta que los huesos alcanzan su

tamaño definitivo (meseta en los niveles de FAO). Por ello, tanto en la Dehesa de Abajo

como en Matasgordas, se muestrearon pollos de distintas edades, agrupándose en tres

categorías: 1) hasta 31 días; 2) entre 31 y 40 días, y 3) más de 41 días de edad.

Uno de los primeros resultados de este estudio es que la cigüeña, a diferencia del

resto de las especies de aves estudiadas hasta el momento, no produce la isoenzima

intestinal, por lo que el contenido total en FA determinado mediante los procedimientos

bioquímicos habituales corresponde, exclusivamente, a las isoenzimas hepática (FAH) y

ósea (FAO).

En el caso de los pollos nacidos en Matasgordas (2003, N=31) los resultados de

los análisis mostraron un incremento significativo en los niveles de FAO con la edad (r2

= 0.46, p=0.025). En la Figura 8 se puede observar que los pollos pertenecientes al

primer grupo de edad, esto es, menos de 31 días, tienen niveles más bajos de FAO que

los pollos de más de 31 días; entre los 31 y los 56 días de edad los niveles de FAO

tienden a estabilizarse.

En el caso de la Dehesa de Abajo (2003, N=53), el patrón de variación con la

edad no es tan claro (r2 = 0.16), presentando niveles similares de FAO los pollos

pertenecientes a los dos primeros grupos de edad.

96

Figura 8. Niveles de FAO (isoénzima ósea de la fosfatasa alcalina) en pollos de cigüeña

nacidos en la Dehesa de Abajo y Matasgordas (control) para los tres grupos de edad

considerados. Las barras indican la media y el error estándar de la media.

Calcio (Ca), Fósforo (P). Tasa Ca:P

Independientemente del grupo de edad considerado, la concentración de Ca en suero es

significativamente más elevada en la Dehesa de Abajo (p=0.002) (Figura 9). Por el

contrario, los niveles de P son más bajos en esta colonia que en Matasgordas para los

pollos pertenecientes al grupo de edad de más de 41 días (p=0.025) (Figura 9).

12119 141615N =

Edad (días)

>4131-40<30

FAO

700

600

500

400

Dehesa de Abajo

Matasgordas

97

Figura 9. Niveles de Fósforo en pollos de cigüeña nacidos en la Dehesa de Abajo y

Matasgordas (control). Las barras indican la media y el error estándar de la media.

En otras especies de aves el rango normal de variación para el cociente Ca:P es

1:1-1.5:1, aunque valores ligeramente por encima de este rango también se consideran

normales.

En el caso de Matasgordas, el cociente Ca:P osciló entre 1.2:1 en los pollos más

pequeños (<30 días) y 1.6:1 en los de más edad (>41 días). A falta de otros datos que

puedan servirnos como referencia, consideraremos estos valores como el rango normal de

variación Ca:P en pollos de cigüeña.

121110 181718N =

Edad (días)

>4131-40<30

Fósf

oro

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

Dehesa de Abajo

Matasgordas

98

Los pollos nacidos en la DdA (2003) mostraron una gran variabilidad en cuanto a

los valores de Ca:P, oscilando entre 1.6:1 y 2.1:1 (Figura 10).

Figura 10. Ca:P en pollos de cigüeña nacidos en la Dehesa de Abajo y Matasgordas

(control). Las barras indican la media y el error estándar de la media.

Si comparamos los niveles de Ca:P en ambas colonias (Figura 10) podemos

observar que, mientras en Matasgordas, e independientemente de la edad, el cociente

Ca:P está bien regulado y el error estándar es pequeño, en la Dehesa de Abajo la

variabilidad es mucho mayor. La diferencia entre ambas colonias es especialmente

acusada para los pollos de más de 41 días: 12 de los 14 pollos pertenecientes a este grupo

de edad (85.7%) tienen valores de Ca:P que van desde 1.6:1 a 4:1.

Debido al escaso número de pollos deformes detectados durante el 2003 no ha

sido posible comparar estadísticamente los niveles de Ca, P y Ca:P entre pollos con y sin

malformaciones para este período. Sin embargo, en la Figura 10 se observa que los pollos

deformes tienen niveles más elevados de Ca:P que los que no presentan malformaciones.

Asimismo, los niveles de P son más bajos en los pollos con malformaciones (Figura 11).

12118 1817182N =

Edad (días)

>4131-40<30

Ca:

P2,4

2,2

2,0

1,8

1,6

1,4

1,2

1,0

Dehesa de Abajo

Matasgordas

99

Estos resultados son consistentes con los encontrados en 2002 (no se muestran en este

informe): los niveles de P en pollos deformes nacidos en 2002 fueron significativamente

más bajos que los de pollos no deformes nacidos ese mismo año. Respecto al cociente

Ca:P , y también para 2002, de 50 pollos estudiados (deformes y no deformes),

aproximadamente la mitad de ellos tenían valores por encima de 2:1, aproximándose, en

el caso de los deformes, a 3:1.

Figura 11. Niveles de Fósforo en pollos de cigüeña nacidos en la Dehesa de Abajo en

2003. Las barras indican la media y el error estándar de la media.

214 282724N =

Edad (días)

>4131-40<30

Fósf

oro

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

,5

malformaciones

no

sí

100

Figura 12. Ca:P en pollos de cigüeña nacidos en la Dehesa de Abajo en 2003. Las barras

indican la media y el error estándar de la media.

ANÁLISIS HISTOPATOLÓGICOS EN HUESO

INTRODUCCIÓN

El estudio histopatológico de los huesos (tarsometatarso) procedentes de individuos con

malformaciones se llevó a cabo en los pollos que fueron retirados de la Dehesa de Abajo

en junio de 2001 y mantenidos en cautividad en el Centro de Recuperación del Acebuche

hasta Septiembre de ese mismo año. Para determinar posibles alteraciones en el tejido

óseo de estos individuos era imprescindible disponer de pollos no deformes de su misma

edad con los que poder compararlos. Para ello, se recurrió a Centros de Recuperación en

Cáceres. Los pollos procedentes de estos centros eran individuos irrecuperables sin

214 282724N =

Edad (días)

>4131-40<30

Ca:

P

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

,5

malformaciones

no

sí

101

signos evidentes de malformaciones externas. Ambos grupos fueron mantenidos en

cautividad y alimentados con la misma dieta. Tres meses después de su ingreso en el

Acebuche, cuando contaban entre 4 y 5 meses de edad, tanto los individuos procedentes

de la Dehesa de Abajo como los de Cáceres fueron eutanasiados para poder llevar a cabo

el examen histopatológico de sus huesos. Basándonos en el conocimiento adquirido con

otras especies de aves, y puesto que en el momento de ser eutanasiados todos ellos eran

ya juveniles que habían alcanzado la talla adulta algunos meses antes, no era de esperar

que encontráramos evidencia alguna de actividad.

RESULTADOS

El examen histológico se basó en tres parámetros indicativos de actividad ósea: 1)

frecuencia de islotes de cartílago; 2) morfología de la interfase hueso-periostio; 3)

estructura de la matriz ósea.

1) En el examen histológico realizado se observó la presencia residual

de islotes de cartílago en la parte cortical del eje óseo, evidenciando así una cierta

actividad. Estos islotes fueron mínimos en 7 de los 10 juveniles nacidos en

Cáceres, mientras que en 6 de los 9 individuos deformes nacidos en la Dehesa de

Abajo fueron más abundantes. No obstante, las diferencias no resultaron

significativas (p = 0.28).

2) Aunque algunos de los juveniles procedentes de Cáceres aún

presentaban cierta actividad relacionada con el crecimiento, esta observación fue

más frecuente en los individuos deformes procedentes de la Dehesa de Abajo. La

mayor parte de la actividad que tiene lugar en los huesos que están creciendo se

inicia en la superficie situada entre el periostio y la matriz ósea. Nueve de los 10

individuos nacidos en la Dehesa de Abajo y sólo 1 de los 10 procedentes de

Cáceres mostraron irregularidades en esta superficie (p=.001), y con ello una

estimulación anormal del crecimiento.

3) La apariencia al microscopio del hueso en formación es claramente

distinta a la del hueso ya maduro, en el que la actividad ha cesado. El primero de

ellos, esto es, el hueso en formación, presenta una estructura mucho más

desorganizada. El examen histológico demostró que la estructura ósea de los

juveniles deformes nacidos en la Dehesa de Abajo era significativamente más

desorganizada que la de los nacidos en Cáceres (p = 0.015): todos los huesos

102

procedentes de la Dehesa de Abajo frente a sólo la mitad de los de Cáceres

presentaron estructura desorganizada.

Conclusiones parciales

Los resultados del examen histopatológico de los huesos procedentes de individuos

deformes (Dehesa de Abajo) y no deformes (Cáceres) no son concluyentes, aunque se

han podido detectar diferencias entre ambos grupos después de tres meses en cautividad.

Además, la producción de anticuerpos (resultados no mostrados) en los individuos con

malformaciones fue menor que la de los juveniles nacidos en Cáceres. Ambos hechos

indican que las cigüeñas nacidas en la Dehesa de Abajo presentan alteraciones

fisiológicas respecto al control, incluso después de haber pasado la mitad de su vida con

una dieta normalizada y presumiblemente libre de contaminantes.

Por lo que respecta a la FA, no se encontraron diferencias entre los niveles de

FAO de los pollos muestreados en la Dehesa de Abajo y los muestreados en Matasgordas

para ninguno de los grupos de edad considerados. Se puede concluir, por tanto, que la

FAO no es un biomarcador suficientemente sensible para detectar los posibles factores

que contribuyen al desarrollo de las malformaciones en los pollos de cigüeña nacidos en

la Dehesa de Abajo. Por el contrario, las diferencias entre esta colonia y la de referencia

(Matasgordas) para los niveles de Ca, P, Ca:P fueron muy evidentes. Además, en 2002,

la comparación entre pollos con y sin malformaciones dentro de la Dehesa de Abajo

también mostraron diferencias importantes para estos parámetros. Los niveles de Ca y P

en sangre varían dentro de un margen muy estrecho, regulados principalmente por dos

hormonas: la calcitonina y la hormona paratiroidea. La actividad de estas hormonas es

vital para el desarrollo normal de los huesos, así como para otros requerimientos

homeostáticos. En el caso de la Dehesa de Abajo el rango de variación para el P es muy

amplio, con niveles bastante altos en los pollos más pequeños, y muy bajos en los más

grandes. Por este motivo el margen de variación en la tasa Ca:P, a diferencia de lo que

ocurre en Matasgordas, es muy amplio, cuando lo normal en ejemplares jóvenes que

están creciendo es que se sitúe entre 1:1 y 1.5:1 para que el desarrollo de sus huesos sea

adecuado. Aunque este estudio no fue diseñado para identificar los mecanismos por los

que la tasa Ca:P se ve alterada en los pollos de la Dehesa de Abajo, es probable que este

desequilibrio en el contenido mineral del hueso sea la causa de las malformaciones. El

siguiente paso sería investigar por qué los niveles de estos parámetros bioquímicos están

103

alterados en la Dehesa de Abajo, y si el vertido tiene alguna relación con ello. Sin duda,

una buena aproximación sería estudiar en profundidad las hormonas encargadas de

regular los niveles de Ca y P en sangre (calcitonina y hormona paratiroidea o PTH), al

tiempo que se estudian estos parámetros relacionándolos con los niveles de metales

pesados y arsénico. Asimismo, deberían tenerse en cuenta las posibles interacciones

(efectos aditivos o sinérgicos) entre metales pesados y otros contaminantes ambientales

no asociados al vertido de Aznalcóllar. Las cigüeñas de esta colonia se alimentan en los

campos de cultivo próximos (arrozales), donde se utilizan una gran cantidad de

agroquímicos que también pueden dar lugar a alteraciones metabólicas.

DISCUSIÓN

Como se ha visto en las Figuras 1 y 2, la presencia de malformaciones en pollos de

cigüeña sólo se detecta a partir de 1999, un año después de que ocurriera el accidente de

Aznalcóllar, extendiéndose a partir de entonces a varias de las colonias situadas en las

Marismas del Guadalquivir. En el caso de la Dehesa de Abajo, el porcentaje de

individuos afectados se sitúa entre los más altos de los registrados en la literatura

científica en poblaciones de aves silvestres (hasta 9.1% en 2001) (Fox et al., 1991;

Larson et al., 1996). Además, el porcentaje real de individuos deformes podría haber

sido mucho mayor de lo que aquí se muestra ya que, como se ha visto, la mayor parte de

los pollos que mueren en el nido lo hacen durante los primeros días después de su

nacimiento, mientras que el registro de malformaciones se lleva a cabo durante el

anillamiento de los pollos (30-40 días de edad). Si a esto añadimos que la reducción de

pollada suele afectar a los pollos más pequeños del nido y que, como se ha visto, son

estos mismos pollos los que tienen mayor probabilidad de presentar malformaciones, el

porcentaje real de individuos deformes en la Dehesa de Abajo podría haber sido bastante

más elevado. Por otro lado, es importante señalar que no todos los pollos deformes se

vieron afectados de igual forma. Aunque la mayor parte de las deformaciones fueron muy

evidentes, en algunos casos fue bastante complicado distinguir un individuo no deforme

de uno con malformaciones leves. Esto podría indicar que las malformaciones no son un

fenómeno discreto que afecta a determinados individuos en la población, sino que podría

tratarse de un continuo que está afectando a toda la colonia pero que sólo algunos

individuos son capaces de expresar atendiendo a características intrínsecas, como su

104

condición física, sistema inmune, etc. De esta forma, los pollos deformes serían sólo la

punta del iceberg que alertaría sobre el deterioro de la salud global de la población.

Respecto a los factores de riesgo que podrían determinar la presencia o ausencia

de malformaciones, además de la jerarquía en el nido, el sexo también parece estar

relacionado con la presencia de malformaciones externas. Así, consistentemente a lo

largo del período de estudio, se han detectado más machos que hembras con algún tipo de

malformación. Este hecho supondría que la probabilidad de presentar malformaciones es

más elevada en el caso de los machos que en el de las hembras, pero podría estar

ocurriendo precisamente lo contrario, que las hembras se vean afectadas en mayor

proporción que los machos, y mueran antes de ser detectadas. No obstante, no tenemos

evidencia alguna de que esto sea lo que esté ocurriendo. El efecto significativo del nido

en este mismo análisis indica que la probabilidad de presentar malformaciones es mayor

entre pollos hermanos que entre pollos de nidos distintos. Los pollos nacidos en el mismo

nido comparten los mismos padres, pero también las mismas molestias por parte de sus

conespecíficos, inclemencias meteorológicas, dieta, etc. A falta de estudios que nos

permitan determinar si estas malformaciones podrían tener un cierto “componente

hereditario” (estos estudios se están llevando a cabo en estos momentos), los estudios

llevados a cabo en colaboración con universidades de Canadá y USA han desvelado que

los pollos nacidos en la Dehesa de Abajo presentan alteraciones metabólicas relacionadas

con los niveles de Ca y P en sangre, y que esas alteraciones parecen ser más acusadas en

el caso de los pollos que presentan algún tipo de malformación. El crecimiento de los

huesos y el normal desarrollo de los pollos depende del equilibrio homeostático en los

niveles de estos dos minerales. Los estudios relacionados con la isoenzima ósea de la

fosfatasa alcalina y el examen histopatológico de los huesos deformes también

demuestran alteraciones fisiológicas respecto a los individuos control. No obstante, el

origen de todas estas alteraciones es aún desconocido.

La mayor parte de los estudios en los que se ha documentado la presencia de

pollos con malformaciones han señalado a los contaminantes como la causa de las

mismas (Fox et al., 1991; Bowerman, 1994; Larson et al., 1996). Zn, Pb, As, Cu y Cd

fueron los metales presentes en mayor proporción en el vertido de Aznalcóllar, en el que

también se detectó la presencia de una cantidad bastante significativa de aminas

aromáticas (Alzaga et al., 1999). La colonia de la Dehesa de Abajo está situada a menos

de 1km de la zona donde se detuvo el vertido. Adultos de esta colonia fueron observados

alimentándose en el área afectada por el agua y los lodos tóxicos inmediatamente después

105

del mismo (Pain et al., 1998) y Meharg et al. (2002) han demostrado que la marca

isotópica del Pb en la sangre de pollos nacidos en esta colonia en 1999 coincide con la

registrada en el lodo, concluyendo con ello que el Pb encontrado en la sangre de las

cigüeñas tiene su origen en el vertido. En este contexto, los análisis llevados a cabo para

determinar la posible relación entre las malformaciones y los niveles de metales pesados

y arsénico en sangre han mostrado que, en los nidos en los que algún pollo presentaba

malformaciones los niveles de Cu son más elevados que en los nidos en los que no había

pollos deformes. Lo mismo ocurre en el caso del Zn, aunque sólo en 1999; para 2001 y

2002 la tendencia es la contraria. Cu y Zn son elementos esenciales, esto es necesarios

para el correcto funcionamiento del organismo, a los que las aves muestran, además, una

alta tolerancia. Por otro lado, los niveles medidos en este estudio se sitúan muy por

debajo de los que podrían llegar a causar problemas de intoxicación (Falandysz et al.,

1988).

No hay que olvidar que, además de los metales vertidos en el accidente de

Aznalcóllar, la actividad agrícola de la zona, fundamentalmente dedicada al cultivo del

arroz, supone el uso de una gran cantidad de pesticidas y fertilizantes (Albaigés et al.,

1987), que también pueden dar lugar a alteraciones del metabolismo. Incluso las

interacciones entre distintos tipos de contaminantes (efectos aditivos, sinérgicos, etc),

podrían contribuir a estos desórdenes metabólicos, y por tanto, a la aparición de

malformaciones. Estas malformaciones, por otro lado, podrían llegar a tener

repercusiones negativas en la dinámica poblacional de la especie, si como se ha visto,

además de mermar la salud de los individuos (los pollos deformes presentaron una menor

condición física, menor respuesta inmune, mayor daño en el ADN, y un mayor contenido

en proteínas de estrés que los no deformes), la supervivencia de los pollos en nido es

menor en el caso de los individuos deformes, sobre todo, ante determinados estreses

ambientales como fenómenos de climatología adversa, disponibilidad de recursos, etc.

La aparición de pollos deformes en otras colonias de la zona hace que la situación sea aún

más preocupante. Por estos motivos, sería conveniente seguir investigando en el posible

origen de las alteraciones metabólicas detectadas, responsables de estas malformaciones,

y sus posibles repercusiones en parámetros demográficos como el éxito reproductor o la

supervivencia futura de los individuos.

106

6. RESPUESTA INMUNE CELULAR Y METALES PESADOS EN POLLOS DE

CIGÜEÑA BLANCA (Ciconia ciconia) NACIDOS EN LA DEHESA DE ABAJO

INTRODUCCIÓN

En la naturaleza, las aves, al igual que el resto de los seres vivos, se hallan expuestas a

una gran diversidad de agentes patógenos, e incluso no patógenos que pueden llegar a

serlo en situaciones de grave inmunodeficiencia. De ahí que el sistema inmune se

considere una pieza clave para la salud de los individuos y sus poblaciones.

El sistema inmune se ve afectado por diversos factores ambientales (Tella et al.,

2000a; Alonso-Álvarez & Tella 2001), y los contaminantes han demostrado ser uno de

ellos debido al estrés que causan en los organismos (Zeakes et al., 1981), pudiendo llegar

incluso a afectar a su eficacia biológica. En este sentido estudios recientes han

encontrado un nexo de unión entre la respuesta inmune de los individuos y su

supervivencia (González et al., 1999; Tella et al., 2000b), sugiriendo que el estudio de los

efectos de los contaminantes sobre el sistema inmune puede aportar valiosa información

acerca de los mecanismos subyacentes a los efectos subletales provocados por esos

contaminantes.

Dentro de los contaminantes inorgánicos, los metales pesados se incluyen entre

los más potentes inmunotóxicos, y algunos de ellos muestran efectos adversos sobre el

sistema inmune a concentraciones por debajo de las que normalmente causan signos

evidentes de intoxicación (Exon, 1984). Así, por ejemplo, en mamíferos el plomo afecta

tanto a la respuesta celular como a la humoral (inmunodepresivo) y favorece la aparición

de tumores. Estudios recientes han demostrado que el cadmio puede inhibir algunas de

las funciones llevadas a cabo por los macrófagos (movilidad, citotoxicidad), la

producción de linfoquinas o la interacción entre antígeno y membrana celular en los

linfocitos T. El arsénico parece estimular el sistema inmune a dosis bajas, mientras que

dosis altas tienen efectos inmunodepresivos (Exon, 1984). Otros metales como cobalto,

cromo, cobre o manganeso, alteran el sistema inmune en mamíferos.

En este contexto, la rotura de la balsa de áridos de la mina de Aznalcóllar

proporcionó un escenario único para evaluar los efectos que la contaminación por metales

pesados y arsénico podría tener sobre la respuesta inmune de los pollos de cigüeña

nacidos en la colonia de la Dehesa de Abajo.

107

Tradicionalmente los estudios sobre el sistema inmune en aves han estado

restringidos a aspectos patológicos y fisiológicos llevados a cabo en pollos de granja en

condiciones de laboratorio (Goto et al., 1978; Laudert et al., 1993). No obstante, desde

hace algún tiempo, los tests empleados para estimar la respuesta inmune se han

convertido en una valiosa herramienta dentro de la toxicología, ecología e incluso en los

estudios de comportamiento en poblaciones de aves silvestres (Bishop et al., 1998).

Variables relacionadas con la función inmune como el conteo diferencial de leucocitos, la

producción de linfocitos B (productores de anticuerpos) en respuesta a SRBC (eritrocitos

de cordero) y la respuesta celular tras la inyección de un agente mitógeno

(phytohaemagglutinin) están entre las más utilizadas (Fairbrother & Fowles, 1990). Sin

embargo, no todos los tests empleados proporcionan la misma información acerca de los

efectos que la exposición a contaminantes, o cualquier otra perturbación ambiental,

pueden llegar a tener sobre el sistema inmune. En el caso de las aves, la mayor parte de

los trabajos publicados están relacionados con la inmunidad celular mediada por

linfocitos T (CMI, siglas en inglés de Cell Mediated Immunity), uno de los tres

componentes básicos del sistema inmune en los vertebrados (Norris & Evans, 2000), y la

técnica más empleada, por su sencillez y rapidez en el campo, es el denominado PHA-

skin test (Smits et al., 1999).

En este apartado además del posible efecto de Cu, Pb, Cd, Zn y As sobre la

respuesta inmune celular estimada mediante PHA-skin test, se estudian otros factores

relacionados tanto con el individuo (condición física, sexo, edad, etc.), como con el nido

de nacimiento (número de pollos en el nido, la jerarquía en el nido, etc). Algunos de estos

factores han mostrado efectos significativos sobre este tipo de respuesta en otros estudios

llevados a cabo en aves (Tella et al., 2000a, 2000b; Sorci et al., 1999; Tella et al., 2001;

Fargallo et al., 2002).

MÉTODOS

Entre 1999, 2001 y 2002 se midió la respuesta inmune celular a un total de 577 pollos de

cigüeña nacidos en la colonia de la Dehesa de Abajo. A 223 de los 577 (38.6%) se les

extrajo, además, una muestra de sangre para determinar la concentración de metales

pesados y arsénico, y de ellos, 218 fueron también muestreados para estudiar el daño

genotóxico en su ADN (ver capítulo 7). A estas cifras, hay que añadir 59 pollos que

108

fueron muestreados para estimar respuesta inmune (contabilizados dentro de los 577) y

daño en el ADN pero de los que no disponemos de datos de metales en sangre. Aunque el

experimento también ha sido llevado a cabo en 2003, los análisis de metales y arsénico

para este período reproductor no han finalizado a la hora de analizar los datos, razón por

la que no se tienen en cuenta en este capítulo del informe.

A los 577 pollos utilizados en el experimento a lo largo del período de estudio, se

les inyectó, entre los 38 y los 65 días de edad, una pequeña cantidad (0.1 ml de 2 mg/ml

PHA-P, Sigma) de una antígeno vegetal (phytohaematogglutinin) en la zona interdigital

de la pata izquierda. Previamente se midió el espesor del punto de inyección con un

micrómetro digital (precisión 0.001 mm) y se volvió a medir 24 horas después de la

inyección. La respuesta inmune celular estimulada por el antígeno se estima como la

diferencia entre la medida final y la inicial (Smits et al. 1999; Tella et al. 2000ab). Cada

medida se realiza tres veces consecutivamente y se calcula la media para minimizar el

error. El proceso es muy rápido (2-3 minutos) y no causa estrés a los pollos.

Los métodos relacionados con la extracción, conservación y análisis de sangre

para determinar niveles de metales pesados y arsénico se detallan en el capítulo

correspondiente de este informe (capítulo 4). Lo mismo se puede decir en el caso del

daño genotóxico (capítulo 7).

Puesto que, como se ha dicho anteriormente, la respuesta inmune puede verse

afectada por otros factores, tanto intrínsecos al individuo (sexo, condición física,

presencia o no de malformaciones, daño genotóxico), como relacionados con el nido de

nacimiento (fecha de puesta, tamaño de puesta, número de pollos en nido o jerarquía en

el nido), además de la concentración de metales en sangre, también estos factores se

consideraron en los análisis que a continuación se detallan. Para más detalle a este

respecto, ver Jovani et al. (2003).

Análisis estadísticos

Los análisis se realizaron mediante Modelos Lineales Generalizados Mixtos utilizando el

macro GLIMMIX del paquete estadístico SAS (Litell et al., 1996, McCullag & Nelder,

1989). En ellos el nido de nacimiento se consideró un factor aleatorio. De esta manera se

controla por la covarianza en sistema inmune entre los hermanos de un mismo nido y, al

mismo tiempo, se extrae un estimador de esta covarianza. El año, el sexo, la jerarquía en

109

el nido (pollo único, primero, segundo, tercero o cuarto) y la presencia o ausencia de

malformaciones se introdujeron en el modelo como factores fijos, mientras que la edad,

la condición física (calculada para cada año por separado), la fecha de puesta, el tamaño

de puesta, el número de pollos en el nido, el daño genotóxico (estimado mediante el

ensayo del cometa, ver capítulo 7 de este informe) y la concentración de Cu, Pb, Zn, Cd y

As fueron tratadas como covariables. Para valorar la consistencia de las posibles

relaciones entre la respuesta inmune celular y cada una de las variables independientes

antes mencionadas a lo largo del período de estudio, las interacciones entre el año de

muestreo y cada una de estas variables independientes también se introdujeron en el

análisis, así como las interacciones entre metales pesados dos a dos. El modelo fue

ajustado a una distribución normal y la función de enlace utilizada fue la identidad. El

proceso de modelado se realizó mediante pasos hacia atrás (procedimiento backwards),

esto es, a partir de un modelo saturado que consideró todas las variables, se eliminaron

sucesivamente los términos menos significativos hasta que todos los efectos retenidos

mejoraron el ajuste del modelo final. El nivel de significación considerado fue α =0.05.

Independientemente de los efectos que, de forma individual, pudieran provocar

cada uno de los metales aquí estudiados sobre la respuesta inmune celular, la exposición

simultánea a todos ellos podría dar lugar a efectos distintos sobre dicha respuesta de los

originados aisladamente por Cu, Pb, Zn, Cd o As. Los estudios llevados a cabo para

determinar el efecto de los contaminantes sobre el sistema inmune consideran la

exposición a un solo contaminante, ya sea de naturaleza orgánica o inorgánica, pero no se

ha encontrado en la bibliografía revisada ningún trabajo en que se haya estudiado la

exposición simultánea a varios de ellos. En nuestro caso, el vertido tóxico contenía

cantidades variables de distintos metales pesados, además de otros contaminantes de

naturaleza orgánica, como aminas aromáticas (Alzaga et al., 1999). Por este motivo,

hemos creído conveniente estudiar, además del efecto de cada uno de los metales sobre la

respuesta inmune celular (individualmente), el efecto que podría tener la exposición

simultánea a Cu, Zn, Pb, Cd y As mediante el cálculo de una nueva variable que reflejara

el contenido de estos cinco metales. Para ello se determinó previamente la media y

desviación estándar de cada metal para cada uno de los años en que se llevó a cabo el

experimento. Posteriormente se calculó la diferencia entre cada dato y la media del metal

correspondiente al año en que hubiese sido muestreado el pollo, y se dividió por la

desviación estándar de ese mismo metal y año. De esta forma se obtiene un valor

110

estandarizado a media cero para cada metal y año de muestreo. La concentración

estandarizada de cada uno de los metales se sumó a la del resto para obtener un único

valor que refleja el contenido de metales pesados y arsénico de cada individuo. Se

excluyeron los individuos para los que alguno de los metales no fue medido. Los valores

no detectables por la metodología empleada en la determinación de los metales pesados

se incluyeron en los cálculos como la mitad del límite de detección, siguiendo el mismo

criterio que el utilizado en los análisis estadísticos.

La variable así calculada se introdujo en un nuevo Modelo General Lineal Mixto,

igual al descrito en el párrafo anterior, pero en el que la concentración de metales pesados

y arsénico fue sustituida por la nueva variable resultante de sumar las concentraciones

estandarizadas o residuos de Cu, Pb, Zn, Cd y As para cada año. En este caso, además de

las interacciones entre el año y el resto de variables independientes, también se

incluyeron en el modelo las interacciones entre la nueva variable y el resto de

independientes, bajo la hipótesis de que el efecto de, por ejemplo, el sexo, la condición

física, etc., sobre la respuesta inmune podría estar modulado por el contenido total en

metales pesados y arsénico. Este supuesto no pudo testarse en el modelo que incluye los

metales como variables independientes de forma individual debido al escaso tamaño

muestral.

RESULTADOS

Las Tablas 1, 2 y 3 muestran los resultados para cada uno de los modelos GLMM

testados.

Tabla 1. Resultados del modelo GLM mixto realizado para estudiar el efecto de la

exposición a metales pesados y arsénico, junto con otras variables intrínsecas al individuo

y relacionadas con el nido de nacimiento, sobre la respuesta inmune celular (CMI) en

pollos de cigüeña blanca (C. ciconia) nacidos en la Dehesa de Abajo. Modelo A.

111

Tabla 2. Resultados del modelo GLM mixto realizado para estudiar el efecto de la

exposición a metales pesados y arsénico, junto con otras variables intrínsecas al individuo

y relacionadas con el nido de nacimiento, sobre la respuesta inmune celular (CMI) en

pollos de cigüeña blanca (C. ciconia) nacidos en la Dehesa de Abajo. La variable que

representa en este caso la exposición a metales pesados y arsénico es la que resulta de

sumar las concentraciones estandarizadas por año, de Cu, Zn, Pb, Cd y As. Modelo B.

Variable F d.f. p Estima Err. Std. t pintercepto -0.0123 0.5399 -0.02 0.9818año 17.13 2,80 <.0001fecha de puesta 14.89 1,80 0.0002 0.0081 0.0043año*fecha de puesta 15.62 2,80 0.0001

1999 -0.0578 0.0105 -5.53 <0.00012001 -0.016 0.0084 -1.91 0.05992002 0 . . .

edad 0.05 1,80 0.8267año*edad 6.56 2,80 0.0023

1999 -0.04 0.0121 -3.32 0.00142001 -0.0224 0.0104 -2.17 0.03322002 0 . . .

condición física 10.35 1,80 0.0019 1.4848 0.4615 3.22 0.0019daño genotóxico 5.51 1,80 0.0214 -0.1069 0.0456 -2.35 0.0214resto de variables >0.1262

Variable F d.f. p Estima Err. Std. t pIntercepto 1.3339 0.2439 5.47 <.0001año 17.87 2,316 <.0001fecha de puesta 21.14 1,316 <.0001año*fecha de puesta 15.96 2,316 <.0001

1999 -0.047 0.0083 -5.65 <.00012001 -0.0074 0.0055 -1.34 0.18082002 0 . . .

condición física 12.18 1,316 0.0006año*condición física 6.48 2,316 0.0017

1999 2.4009 0.751 3.2 0.00152001 -0.3155 0.7087 -0.45 0.65652002 0 . . .

resto de variables >0.1025

112

En ambos modelos se observa que la respuesta inmune celular se ve afectada por

la condición física de los pollos y la fecha de puesta. En el primero de ellos (A), esto es el

que considera los metales pesados de forma independiente (Tabla 1), la interacción entre

el año y ambas variables sugiere que la relación entre la respuesta inmune y la condición

física, y entre respuesta inmune y fecha de puesta cambia según el año. Así, el efecto de

la condición física es positivo en 1999 y 2002, pero neutro en 2001, mientras que la fecha

de puesta tiene un efecto negativo en 1999, neutro en 2001 y positivo en 2002. Ninguna

del resto de las variables afecta significativamente a la respuesta inmune celular,

incluyendo la concentración de metales pesados y arsénico.

En el segundo de los modelos (B), además de la condición física y la fecha de

puesta, tienen efecto significativo sobre la respuesta inmune celular el daño genotóxico y

la edad del pollo, ésta última en interacción con el año (Tabla 2). De acuerdo con este

modelo los pollos de cigüeña con mayor daño genotóxico son los que, consistentemente a

lo largo del período de estudio, muestran una peor respuesta inmune celular. La relación

con la edad difiere según el año que se considere, siendo neutra en 1999 y 2001, y

positiva en 2002.

En ambos modelos el nido de nacimiento tuvo un efecto significativo sobre la

respuesta inmune celular (Z=3.72, p=0.0001 (A) y Z=2.09, p=0.018 (B)).

Tabla 3. Resultados del modelo GLM mixto realizado para estudiar el efecto de la

exposición a metales pesados y arsénico, junto con otras variables intrínsecas al individuo

y relacionadas con el nido de nacimiento, sobre la respuesta inmune celular (CMI) en

pollos de cigüeña blanca (C. ciconia) nacidos en la Dehesa de Abajo. La variable que

representa en este caso la exposición a metales pesados y arsénico es la que resulta de

sumar las concentraciones estandarizadas por año, de Cu, Zn, Pb, Cd y As. Modelo C.

113

El Modelo C resulta de un modelo saturado inicial igual al utilizado en el caso del

B, pero que no incluye el daño genotóxico entre las variables independientes. En este

tercer modelo la variable resultante de la suma de las concentraciones estandarizas de Cu,

Pb, Zn, Cd y As tuvo un efecto negativo sobre la respuesta inmune, tanto como variable

simple, como en su interacción con la condición física (Tabla 3). El resto de variables que

tuvieron un efecto significativo sobre la respuesta inmune en el Modelo (C) son la

condición física y la fecha de puesta, como en los dos anteriores, y el número de pollos

en nido, de forma que los pollos procedentes de nidos con un mayor número de

individuos en el momento de ser muestreados son los que muestran una mayor respuesta

inmune (Tabla 3).

DISCUSIÓN

Como se ha visto en el apartado de resultados, la respuesta inmune celular de los pollos

de cigüeña nacidos en la Dehesa de Abajo está determinada, fundamentalmente, por la

condición física y la fecha de puesta, y en uno de los modelos, (B), por la edad. No

obstante, la relevancia, dirección e intensidad de estas relaciones depende del año. Así, el

efecto de la fecha de puesta fue negativo, neutro o positivo, dependiendo del año de

Variable F d.f. p Estima Err. Std. t pIntercepto 0.78118 0.4524 1.73 0.0866año 9.33 2,59 0.0003número de pollos 5.81 1,59 0.0191 0.103 0.0738año*número de pollos 3.45 2,59 0.0383

1999 -0.1484 0.1081 -1.37 0.1752001 0.2608 0.1553 1.68 0.09852002 0 . . .

fecha de puesta 4.44 1,59 0.0394año*fecha de puesta 9.29 2,59 0.0003

1999 -0.0547 0.0127 -4.3 <.00012001 -0.0126 0.0172 -0.74 0.46432002 0 . . .

condición física 10.93 1,59 0.0016año*condición física 4.78 2,59 0.0119

1999 3.3483 1.1602 2.89 0.00542001 -0.4147 1.4143 -0.29 0.77042002 0 . . .

contaminación metálica 4.34 1,59 0.0415contaminación metálica*condición físicaresto de variables >0.1316

4.23 1,59 0.0442

114

estudio; la relación con la condición física fue positiva en 1999 y 2002, aunque neutra en

2001, mientras que la edad tuvo efecto neutro en 1999 y 2001, y positivo en 2002.

Aunque se trata de un tema bastante controvertido (Norris & Evans, 2000), en

general parece estar aceptado que la respuesta inmune se ve influenciada por las

fluctuaciones que, a corto plazo, tienen lugar tanto en los procesos demandantes de

energía, como en la disponibilidad de recursos. Ambos hechos implicarían que

diferencias interanuales en las condiciones ambientales podrían afectar a la respuesta

inmune (Moller, 2002). Más aún, la distinta localización en el tiempo de episodios

desfavorables (por ejemplo, fenómenos climatológicos adversos) dentro de un mismo

período reproductor podría, igualmente, afectar a la respuesta inmune (Christe et al.,

2001). Esta podría explicar por qué en 2002 los pollos más tardíos son los que

presentaron una mayor respuesta inmune cuando en aves es común que las condiciones

de reproducción empeoren a medida que avanza la época de cría: las intensas lluvias

caídas a comienzos de la estación reproductora de 2002 podrían haber mermado el

sistema inmune de los pollos más tempranos, y no haber afectado a los más tardíos,

aunque esta hipótesis aún no se ha analizado exhaustivamente.

La condición física tuvo un efecto positivo sobre la respuesta inmune en dos de

los tres períodos reproductores estudiados, corroborando los resultados encontrados en

estudios previos (Alonso & Tella 2000), y apoyando lo que se menciona en la

introducción de este apartado acerca del uso de la respuesta inmune como un indicador de

salud.

Aunque sólo en 2002, la edad también tuvo un efecto positivo sobre la respuesta

inmune celular, lo que podría estar relacionado con el desarrollo del sistema inmune a

medida que el pollo crece.

El efecto significativo del nido en ambos modelos implica que la respuesta

inmune de pollos hermanos es más parecida entre sí que entre los pollos nacidos en nidos

distintos. Sin duda, el hecho de compartir el mismo tipo de recursos, estar sometidos a los

mismos cuidados parentales, etc. determina que la variabilidad de la respuesta sea menor

entre pollos hermanos que entre pollos nacidos en nidos distintos (Tella et al. 2002).

A pesar de que el daño genotóxico sólo resulte significativo en el modelo que

considera la exposición a metales pesados y arsénico en una única variable (modelo B),

su efecto es consistente en los tres años de estudio, siendo los pollos que tienen un mayor

daño genotóxico en su ADN los que manifiestan una menor respuesta inmune celular.

115

Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio en aves silvestres, y probablemente

en cualquier otro orden animal, que relaciona ambas variables, haciéndolo además en tres

años distintos. Dada la variabilidad direccional entre años de las relaciones encontradas

entre el resto de los factores estudiados y la respuesta inmune celular (Jovani et al.,

2003), la consistencia en la dirección de la relación entre el daño en el ADN y la

respuesta inmune resulta aún más relevante.

Por lo que respecta al efecto de los contaminantes sobre la respuesta inmune

celular, ninguno de los dos primeros modelos (A y B) retienen la concentración de

metales pesados o la variable calculada para testar su exposición simultánea, como

efectos significativos. Aunque los metales actúan como inmunotóxicos, y algunos de

ellos, como el Pb, el Cd o el As provocan efectos sobre el sistema inmune a dosis muy

bajas (Exon, 1984), los niveles medidos en los pollos de cigüeña nacidos en la colonia de

estudio no parecen afectar a la respuesta inmune celular, o al menos no lo suficiente para

que su efecto resulte significativo. No obstante, cabe señalar que, en un tercer modelo

generado a partir del B, pero sin incluir el daño genotóxico entre las variables

independientes (Modelo C), la variable resultante de la suma de las concentraciones

estandarizas de Cu, Pb, Zn, Cd y As tuvo un efecto negativo sobre la respuesta inmune,

tanto como variable simple, como en su interacción con la condición física. Este último

resultado implica que el efecto de la exposición simultánea a estos metales sobre la

respuesta inmune celular depende de la condición física del individuo, así, los pollos que,

expuestos a una misma concentración de metales, se hallen en mejor condición física,

serán los que muestren una mayor respuesta inmune. Este resultado evidencia la

importancia, fundamentalmente en ambientes contaminados por metales pesados, de

todos aquellos factores que, afectando a la condición física (disponibilidad de recursos,

experiencia reproductora de los progenitores, etc.) afectan a la respuesta inmune de los

individuos y por tanto, a su eficacia biológica y a la viabilidad futura de las poblaciones.

116

7. DAÑO GENOTÓXICO EN POLLOS DE CIGÜEÑA BLANCA (Ciconia ciconia)

Y MILANO NEGRO (Milvus migrans) NACIDOS EN DOÑANA Y SU ENTORNO.

RELACIÓN CON METALES PESADOS Y ARSÉNICO.

INTRODUCCIÓN

Fe, Zn, Pb, As, Cu, Sb, Tl, o Cd, son sólo algunos de los metales que se vertieron en las

inmediaciones del Parque Nacional de Doñana como consecuencia de la rotura de la

balsa de áridos de la mina de Aznalcóllar en 1998. Entre un 5% y un 15 % de estos

metales, algunos presentes en concentraciones bastante elevadas, se infiltraron en el

suelo, y los procesos de oxidación aumentaron su movilidad y biodisponibilidad para las

cadenas tróficas (Grimalt et al., 1999).

Metales como Fe, As, Cu, Sb o Cd participan en reacciones red-ox induciendo

estrés oxidativo y provocando, siempre que se supere la capacidad antioxidante de las

células, que distintas biomoléculas puedan resultar alteradas, siendo especialmente

relevante el daño en el ADN. Pb, Cd y As, además de abundantes en el vertido, son

conocidos carcinogénicos en humanos (Rojas et al., 1999). Antes de continuar, hay que

reseñar que, debido a la escasez de referencias bibliográficas en aves sobre daño

genotóxico y exposición a metales pesados, la información que a continuación se expone

está referenciada en humanos, asumiendo que, al igual que en el caso de otros efectos

causados por este tipo de contaminantes (inhibición enzimática, etc), el ADN de las aves

podría verse afectado por los metales de una forma similar a cómo lo hace el ADN de los

mamíferos. Así, el cadmio puede provocar daños tanto de una forma directa, mediante la

inducción de roturas en la doble hélice de ADN (Hassoun & Stohs, 1996), como

indirecta, mediante la producción de radicales libres (Zhong et al., 1990), la inhibición de

las enzimas involucradas en los mecanismos de reparación (Hartwig, 1998), o la

reducción de los niveles de glutatión, encargado de eliminar esos radicales libres.

El efecto genotóxico del Pb ha sido estudiado en varios sistemas (Johnson, 1998),

encontrándose resultados contradictorios dependiendo de que los estudios se realizaran in

vivo o in vitro. Algunos de los efectos provocados por este metal parecen tener su origen,

al menos parcialmente, en su interferencia en los procesos de reparación de la doble

117

hélice, potenciando de ese modo la genotoxicidad de otros agentes dañinos, y/o formando

parte de la denominada reacción Fenton, y generando con ello radicales hidroxilo,

oxígeno elemental y otras especies reactivas de oxígeno altamente dañinas (ROS) para la

molécula de ADN.

El arsénico es un metaloide que se obtiene como subproducto de las explotaciones

mineras de cobre y plomo. Aunque los compuestos formados por este metaloide se

consideran débilmente mutagénicos en bacterias y células animales, exhiben propiedades

clastogénicas en distintos tipos de células, tanto in vivo como in vitro (Hartmann & Speit,

1994; Wang & Rossman, 1996). Estudios recientes indican que el As podría ser un

potente mutagénico al generar especies reactivas de oxígeno y nitrógeno que actuarían

como mediadores en su actividad mutagénica. Schaumloffel & Gebel, (1998)

demostraron, mediante el ensayo del cometa, que la forma trivalente de As induce daño

en el ADN de linfocitos humanos.

Cobre y cinc, los otros dos elementos estudiados en este informe, son metales

esenciales que desempeñan un importante papel en gran número de procesos biológicos

relacionados con el crecimiento y desarrollo de los organismos vivos. Los efectos

genotóxicos y mutagénicos del Cu han sido estudiados en varios sistemas, aunque los

resultados son contradictorios. Desde la pasada década, parecen tomar fuerza

algunashipótesis que apuntan el carácter mutagénico del Cu vía producción de ROS. Por

ultimo, aunque el Zn parece que manifiesta una cierta actividad genotóxica, no está

considerado como mutágenico dentro del grupo de metales pesados (Leonard et al.,

1986).

Con el objetivo de evaluar el posible daño genotóxico producido por estos metales

red-ox se estandarizó, para adaptarlo a las células sanguíneas de las aves, la electroforesis

de células individuales (SCGE), técnica conocida también como “ensayo del cometa”

(Fairbairn et al., 1995). Este ensayo permite detectar con gran sensibilidad las roturas en

las cadenas de ADN debidas al estrés oxidativo, y es actualmente la técnica más utilizada

para evaluar daños en el ADN en prácticamente cualquier tipo de organismo vivo

empleado como bioindicador de contaminación ambiental. En nuestro caso, se han

utilizado como bioindicadores células sanguíneas (linfocitos) de pollos de cigüeña blanca

(C. ciconia) y milano negro (M. migrans) nacidos en el área de Doñana y su Entorno,

comparándose con individuos control muestreados en zonas no afectadas. Los muestreos

se han llevado a cabo durante los períodos reproductores de 1999, 2000, 2001, 2002 y

118

2003, si bien las muestras correspondientes a este último período aún no han podido ser

analizadas.

En este capítulo del informe, se estudia la posible relación entre el daño

genotóxico (ensayo del cometa) en linfocitos de cigüeñas y milanos negros nacidos en la

zona de influencia del vertido, y niveles de Cu, Zn, Pb, Cd y As en sangre. Puesto que la

exposición a metales pesados se ha demostrado que está relacionada con variables

intrínsecas al individuo, como el sexo, la edad, la condición física, etc., estos factores

podrían también influir en el daño genotóxico potencialmente causado por estos

contaminantes. De igual modo, el efecto significativo del nido en un trabajo

recientemente publicado (Pastor et al., 2003) con estos mismos datos justifica el estudio

de las variables que, estando relacionadas con el nido de nacimiento, podrían afectar al

daño en el ADN, esto es fecha de puesta, tamaño de puesta, número de pollos en nido,

jerarquía en el nido, etc.

MÉTODOS

A lo largo del período de estudio (1999-2002) se han analizado para evaluar daño en el

ADN 330 muestras en el caso de la cigüeña, y 138 para el milano negro. El número de

individuos para cada período reproductor aparece reflejado en la Figura 1. En el caso de

la cigüeña, el estudio se llevó a cabo en la colonia de la Dehesa de Abajo, mientras que

para el milano negro, las muestras corresponden a pollos nacidos en la población de esta

especie asentada en las Marismas del Guadalquivir (Forero et al., 1999).

Muestreo en campo y aislamiento de linfocitos

A cada uno de los pollos muestreados se le extrajo aproximadamente 1 ml de sangre de la

vena radial, que fue almacenada en viales de plástico con EDTA como anticoagulante y

conservada en fresco (20ºC) hasta llevarla al laboratorio en el mismo día de su recogida.

El aislamiento de los linfocitos se realizó mediante centrifugación en gradiente de

densidad (2000 r.p.m., 30 min) utilizando Ficoll como medio de separación. Finalmente

las células fueron lavadas en PBS (phosphate-buffer saline) y ajustadas a una

concentración de 105 células/ml.

119

La extracción de sangre para la cuantificación de metales pesados y arsénico se

realizó simultáneamente a la extracción de la muestra para el estudio del daño

genotóxico. En este caso, la sangre (1.5 ml, aprox.) se conservó a –80 ºC en viales

heparinizados hasta el momento de su análisis en el laboratorio (Instituto de Agroquímica

y Tecnología de los Alimentos, Valencia; Instituto de Química Orgánica General,

Madrid).

Los niveles de cadmio, plomo, cobre y arsénico se determinaron mediante

espectrofotometría de absorción atómica (AAS) en cámara de grafito. Para el Zn se

utilizó espectrofotometría de absorción atómica (AAS) en llama. Los límites de detección

de la metodología se detallan en el capítulo correspondiente de este informe. Para más

detalle ver Baos et al., (2001) y Benito et al. (1999).

Además del posible efecto de los metales pesados sobre el daño genotóxico,

también se consideraron los efectos que otras variables relacionadas con el individuo y el

nido de nacimiento podrían tener sobre este bioindicador. Estas variables aparecen

resumidas en la Tabla 1.

Ensayo del cometa

El protocolo utilizado fue, básicamente, el diseñado por Singh et al. (1988) con algunas

modificaciones para adecuarlo a los linfocitos de las aves. Para más detalles sobre la

técnica empleada ver Pastor et al. 2001a, 2001b, 2003.

De cada individuo se seleccionaron aleatoriamente 50 células que fueron

examinadas mediante microscopía de fluorescencia. Las medidas oportunas fueron

realizadas mediante el analizador de imágenes del programa CASys (Synoptics Ltd, UK),

y el parámetro seleccionado para estimar el daño genotóxico fue el momento de cola,

resultado de multiplicar la longitud de la cola por su intensidad o porcentaje de DNA

migrante (Olive et al., 1990).

Análisis estadístico

Para comprobar si los niveles de metales pesados y arsénico, así como el resto de las

variables que aparecen resumidas en la Tabla 1 afectan al daño en el ADN se llevaron a

cabo modelos GLM mixtos (utilizando el macro GLIMMIX del paquete estadístico

120

SAS). Al igual que en el capítulo anterior, y por el mismo motivo argumentado en él, el

primero de estos modelos (A) incluye todas las variables recogidas en la Tabla 1, excepto

la que resulta de sumar la concentración estandarizada de cada metal (Cu, Pb, Zn, Cd,

As). Esta variable es la que se incluye en el modelo (B) sustituyendo en él a las

concentraciones de Cu, Pb, Zn, Cd y As (variables simples). El resto de variables

independientes se consideran en ambos. Tanto en (A) como en (B), la variable respuesta

(dependiente) es la media del momento de cola de las 50 células muestreadas por

individuo. El modelo se ajusta a una distribución normal previa transformación

logarítmica de la variable respuesta, y la función de enlace utilizada es la identidad

(McCullagh & Nelder, 1989). Con el objetivo de controlar fuentes de pseudorreplicación

potencial, el nido es tratado como un factor aleatorio (Littell et al. 1996). El proceso de

modelado se realiza nuevamente mediante pasos hacia atrás. Esto es, a partir de un

modelo saturado que consideró todas las variables (Tabla 1) se eliminaron sucesivamente

los términos menos significativos (p>0.05) hasta que todos los efectos retenidos

mejoraron el ajuste del modelo final. Las interacciones entre el año de muestreo y el resto

de variables independientes también fueron incluidas en los modelos para ver la

consistencia en la dirección de los efectos a través del tiempo. En el modelo (A) también

se incluyeron las interacciones dos a dos entre los metales, aunque sólo para la cigüeña.

En el modelo (B), además de las interacciones entre año y el resto de variables

independientes, también se incluyeron las interacciones entre la variable resultante de la

suma de los niveles estandarizados de metales y el resto de independientes, aunque sólo

en el caso de la cigüeña. El tamaño muestral para el milano no permitió testar este

posible efecto.

121

Tabla 1: Variables consideradas en los modelos GLM mixtos realizados para evaluar los

posibles efectos de los metales pesados y arsénico, así como otras variables ambientales

sobre el daño genotóxico en pollos de cigüeña blanca (Ciconia ciconia) y milano negro

(Milvus migrans).

Factores fijos: Año Período de muestreo (1999, 2000, 2001 ó 2002)

Orden Nac. Orden de nacimiento del individuo

(único, primero, segundo, tercero o cuarto),

atendiendo a la longitud del ala (cigüeña) o de la

séptima primaria (milano)

Sexo Macho o hembra

Deforme Manifestación o no de malformaciones externas

Covariables: Nº de pollos Número de pollos en el nido de donde procede el

individuo muestreado (1, 2, 3 ó 4 pollos

para cigüeñas, y 1 ó 2 en el caso de los milanos)

T. Puesta Número de huevos en el nido de donde procede la

muestra (sólo en el caso de las cigüeñas).

Fecha Puesta Fecha en la que se puso el primer huevo en el nido del

que procede la muestra

Cond. física Índice de condición corporal estimado mediante un

análisis de regresión por RMA (Reduced Major Axis)

entre el logaritmo del peso y el logaritmo del ala

(cigüeña) o de la sétima primaria (milano).

Edad Edad del individuo expresada en días

Cu, Pb, Cd. Modelo (A). Concentración de cada uno de ellos en

Zn, As sangre expresada en ppb, excepto para el Zn, quelos

está en ppm.

122

Metales Modelo (B). Suma de los niveles estandarizados a

media 0 para cada metal (más detalles sobre el cálculo

de la variable en el capítulo sobre respuesta inmune y

metales pesados).

Factores aleatorios:

Nido Nido de procedencia del individuo muestreado

RESULTADOS

Los estudios realizados con anterioridad han demostrado que los pollos de cigüeña y

milano son unos buenos bioindicadores para la evaluación del daño genotóxico (Pastor et

al.2001ab, 2003). De estos estudios se desprende que: 1) las células de los pollos

muestreados en Doñana tienen mayor daño en su ADN que las de los pollos de las

mismas especies nacidos en áreas control (Pastor et al., 2001ab); 2) el daño observado en

los pollos nacidos en Doñana se ha incrementado a lo largo del período de estudio en

ambas especies (Pastor et al., 2003; ver Figura 1). Como novedad en este informe se

estudian los posibles efectos que metales y arsénico pudieran tener sobre el daño

observado en el ADN de pollos de cigüeña y milano nacidos en el área afectada por el

vertido tóxico.

Las Tablas 2, 3, 4 y 5 muestran los resultados, para cada especie, de los modelos

GLMM realizados para explicar el daño genotóxico en función de los niveles de metales

pesados y arsénico, variables relacionadas con el individuo y con el nido de nacimiento.

123

Figura 1. Valores medios del momento de cola para pollos de cigüeña (C. ciconia) a la

izquierda, y de milano negro (M. migrans) a la derecha, muestreados durante 4 años

consecutivos después del vertido tóxico de Aznalcóllar. El eje de ordenadas indica el

número de individuos dentro de cada categoría del momento de cola (eje de abscisas). El

tamaño muestral aparece representado para cada especie y período de mustreo.

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

0/0.5 0.05/0.1 0.1/0.5 0.5/1.0 1.0/5.0 5.0/100

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

0/0.05 0.05/0.1 0.1/0.5 0.5/1.0 1.0/5.0 5.0/100

20

40

60

80

100

M. migransC. ciconia

1999

2000

2001

2002

N=84

N=51

N=101

N=94

N=45

N=32

N=39

N=22

M. migransC. ciconia

1999

2000

2001

2002

N=84

N=51

N=101

N=94

N=45

N=32

N=39

N=22

C. ciconia

1999

2000

2001

2002

N=84

N=51

N=101

N=94

N=45

N=32

N=39

N=22

124

Tabla 2. Resultados del modelo GLM mixto realizado para estudiar el efecto de la

exposición a metales pesados y arsénico, junto con otras variables intrínsecas al individuo

y relacionadas con el nido de nacimiento, sobre el daño genotóxico (ensayo del cometa)

en pollos de cigüeña blanca (C. ciconia) nacidos en Doñana (Dehesa de Abajo). Modelo

A.

Tabla 3. Resultados del modelo GLM mixto realizado para estudiar el efecto de la

exposición a metales pesados y arsénico, junto con otras variables intrínsecas al individuo

y relacionadas con el nido de nacimiento, sobre el daño genotóxico (ensayo del cometa)

en pollos de cigüeña blanca (C. ciconia) nacidos en Doñana (Dehesa de Abajo). La

variable que representa en este caso la exposición a metales pesados y arsénico es la que

resulta de sumar las concentraciones estandarizadas por año, de Cu, Zn, Pb, Cd y As.

Modelo B.

Según los modelos GLMM, de las variables testadas en el caso de la cigüeña sólo

la condición física tiene un efecto significativo sobre el daño genotóxico, de forma que

los pollos en peor condición física son los que presentan un mayor daño en su ADN

(Tablas 2 y 3). El resultado es el mismo si el modelo considera la concentración de

metales y arsénico de forma individual (modelo A, Tabla 2), o lo hace de forma conjunta

Variable F d.f. p Estima Err. Std. t pIntercepto -0.2799 0.0592 -4.73 <.0001año 17.42 3,98 <.0001condición física 4.34 1,98 0.0397 -0.8225 0.3946resto de variables >0.2962

Variable F d.f. p Estima Err. Std. t pIntercepto -0.2799 0.0592 -4.73 <.0001año 17.42 3,98 <.0001condición física 4.34 1,98 0.0399 -0.8216 0.3945resto de variables >0.2384

125

(modelo B, Tabla 3). Tanto en el modelo (A) como en el (B), el nido de nacimiento tiene

un efecto significativo sobre el daño genotóxico (Z=4.82, p<.0001).

Tabla 4. Resultados del modelo GLM mixto realizado para estudiar el efecto de la

exposición a metales pesados y arsénico, junto con otras variables intrínsecas al individuo

y relacionadas con el nido de nacimiento, sobre el daño genotóxico (ensayo del cometa)

en pollos de milano negro (M. migrans) nacidos en Doñana. Modelo A.

Tabla 5. Resultados del modelo GLM mixto realizado para estudiar el efecto de la

exposición a metales pesados y arsénico, junto con otras variables intrínsecas al individuo

y relacionadas con el nido de nacimiento, sobre el daño genotóxico (ensayo del cometa)

en pollos de milano negro (M. migrans) nacidos en la Doñana. La variable que representa

en este caso la exposición a metales pesados y arsénico es la que resulta de sumar las

concentraciones estandarizadas por año, de Cu, Zn, Pb, Cd y As. Modelo B.

Variable F d.f. p Estima Err. Std. t pIntercepto 6.0873 1.8794 3.24 0.0016año 3.58 3,18 0.0346condición física 0.01 1,18 0.9241año*condición física 5.29 3,18 0.0086

1999 -0.6637 1.0362 -0.64 0.52992000 -2.5087 1.2049 -2.08 0.05192001 -4.2433 1.2497 -3.4 0.00322002 0 . . .

fecha de puesta 3.66 1,18 0.0718año*fecha de puesta

1999 0.0601 0.0229 2.63 0.01712000 0.1042 0.0294 3.54 0.00232001 0.0784 0.0222 3.54 0.00232002 0 . . .

edad 1.19 1,18 0.29año*edad

1999 0.0558 0.0212 2.63 0.0172000 0.0769 0.0305 2.52 0.02152001 0.0399 0.0212 1.88 0.07612002

resto de variables >0.9692

126

Para el milano negro, además de la condición física, tienen efecto significativo

sobre el daño genotóxico la fecha de puesta y la edad, aunque esta última sólo en el

modelo (A) (Tabla 4).

A diferencia de lo que ocurría en el caso de la cigüeña, para la que el efecto de la

condición física tenía el mismo signo a lo largo de todo el período de estudio (1999-

2002), en el milano la dirección del efecto, tanto de esta variable, como de la fecha de

puesta y de la edad varía según el año. Así, mientras que para 1999 y 2002 la relación

entre condición física y daño genotóxico es positiva, en 2001 es negativa y neutra en

2000; el efecto de la fecha puesta es positivo en 2000 y 2001, negativo en 2002 y neutro

en 1999, por último, la edad tiene un efecto positivo en 2002, negativo en 2001 y neutro

en 1999 y 2000.

El nido de nacimiento no parece tener efecto significativo sobre el daño

genotóxico en el modelo (A) (Z=0.82, p=0.207), y sólo marginalmente en el (B) (Z=1.43,

p=0.081).

DISCUSIÓN

A lo largo de los últimos años el ensayo del cometa se ha convertido en la metodología

más utilizada para evaluar daños en el ADN debido a su sensibilidad y eficacia en

distintos sistemas biológicos (Fairbairn et al., 1995). Los tres artículos científicos que,

hasta la fecha, han sido publicados por nuestro grupo de investigación sobre este tema

Variable F d.f. p Estima Err. Std. t pIntercepto 1.405 0.4212 3.33 0.0012año 4.5 1,20 0.0143condición física 0.23 1,20 0.637año*condición física 4.16 3,20 0.0192

1999 -0.88 1.0636 -0.83 0.41782000 -2.6624 1.2359 -2.15 0.04362001 -3.8824 1.2778 -3.04 0.00652002 0 . . .

fecha de puesta 6.91 1,20 0.0022año*fecha de puesta

1999 0.006 0.0106 0.57 0.5762000 0.0316 0.0093 3.38 0.0032001 0.0335 0.0095 3.52 0.00222002 0 . . .

resto de variables >0.0901

127

(Pastor et al., 2001ab y 2003) son los únicos en los que se ha utilizado la técnica del

cometa para evaluar daño genotóxico en aves, y más concretamente en poblaciones

silvestres. Por ello, y a falta de otros estudios que sirvan de referencia, la interpretación

de los resultados que aparecen en estos artículos, y de los que a continuación se exponen,

debe hacerse con precaución.

En Pastor et al., 2001ab y 2003 (ver ANEXO) se discuten los resultados obtenidos

acerca de la evaluación del daño observado en los pollos de cigüeña y milano nacidos en

Doñana, comparándolo con el encontrado en individuos de la misma especie en áreas

control, así como la evolución de ese daño dentro de Doñana en ambas especies. Por este

motivo en este capítulo sólo se discutirán los resultados del estudio realizado para

determinar si los metales pesados y arsénico están o no relacionados con el daño

observado.

Según los modelos GLMM llevados a cabo con esta finalidad, en ninguna de las

dos especies, Cu, Zn, Pb, Cd y As están relacionados con el daño genotóxico observado

en ellas. Tanto en los modelos que incluyeron individualmente la concentración de cada

metal y de As, como en los que lo hicieron de forma conjunta, el efecto de estos

contaminantes no resultó significativo (Tablas 2-5). Aunque el carácter genotóxico,

mutágenico e incluso carcinogénico de algunos de estos metales es de sobra conocido

(Rojas et al.,1999), no parece que las concentraciones en que se han medido en los pollos

de cigüeña y milano nacidos en Doñana a lo largo del período de estudio, son

suficientemente elevadas para dañar la molécula de ADN en la forma en que el ensayo

del cometa detecta estos daños. No obstante, esto no implica, necesariamente, que el

vertido no pueda estar relacionado con el daño observado mediante esta técnica. Según

los estudios llevados a cabo por Alzaga et al. (1999), además de metales pesados y As,

los lodos vertidos en el accidente de Aznalcóllar contenían cantidades importantes de

otros contaminantes como las aminas aromáticas, fuertemente genotóxicas, cuya posible

implicación no ha sido estudiada. Por otro lado, carecer de estudios previos que evalúen

este mismo tipo de daño antes de que se produjera la rotura de la balsa, tampoco ayuda a

concluir si el vertido está o no detrás del daño observado. Estudios llevados a cabo con

ratones (Mus spretus) en la Reserva Biológica de Doñana, el polo químico de Huelva e

Isla Cristina (Huelva) antes de que se produjera el accidente (Ieradi et al., 1998)

concluyeron que los individuos muestreados en Doñana tenían un daño en su ADN (test

de micronúcleos) equiparable al detectado en el polo químico de Huelva y por encima de

128

los de Isla Cristina, considerada en este estudio como zona control. La técnica empleada

para cuantificar este daño fue distinta a la utilizada en nuestro caso pero, aún así, este

resultado plantea la duda de que el daño que ahora estamos midiendo en las aves no

existiera ya antes del vertido. Es más, el hecho de que ese daño haya aumentado a lo

largo del período de estudio, cuando los niveles de metales han descendido en,

prácticamente, todos los compartimentos del ecosistema (PICOVER) desde el accidente,

tampoco apoya la hipótesis de que el vertido sea, al menos, de forma exclusiva, el

causante del daño observado en los pollos de cigüeña y milano estudiados. El uso

generalizado de pesticidas (organofosforados, carbamatos, DDT, etc) y fertilizantes en

los arrozales que bordean este espacio natural (Albaigés et al., 1987) podrían contribuir al

daño en el ADN (Clements et al., 1997; Garaj-Vrhovac & Zeljezic, 2000,2002)

observado en estas especies. Incluso las interacciones entre distintos tipos de

contaminantes podrían explicar buena parte de la variabilidad observada. A este respecto

también conviene mencionar el carácter genotóxico de las toxinas producidas por ciertas

cianobacterias tóxicas. En 2001 la mortandad de flamencos en los lucios de Veta las

Piedras y Las Casas estuvo causada por la proliferación masiva de distintas especies de

cianofíceas tóxicas, en su mayor parte Mycrocystis aeruginosa (López Rodas et al., 2001,

Alonso-Andicoberry et al., 2002). Las toxinas producidas por este alga causan daños en

el ADN según un estudio in vitro llevado a cabo con linfocitos humanos en el que se

utilizó la técnica del cometa para cuantificar ese daño (Mankiewicz et al., 2002). Según

el informe de López-Rodas et al. (2001), condiciones como agua estancada, luz, altas

temperaturas, eutrofia y estabilidad meteorológica podrían contribuir a la proliferación

anómala de estas algas. Estas condiciones son habituales en muchas de las lagunas que,

en algunos casos de forma artificial, subsisten durante el verano en Doñana, y que las

aves utilizan como fuente de alimento. Lo mismo podría decirse de los arrozales que

bordean el Parque Nacional, donde las cigüeñas y muchas otras especies de aves que se

reproducen en Doñana, encuentran buena parte de los recursos necesarios para alimentar

a sus pollos. En cualquier caso, sería conveniente investigar si todas estas posibles causas

están o no relacionadas con el daño genotóxico observado.

Al igual que ocurriera en el caso de la respuesta inmune (ver capítulo 6), la

condición física está relacionada con el daño en el ADN, siendo los pollos que están en

mejor condición física los que tienen menor daño, tanto en el caso de la cigüeña como en

el del milano, aunque en este último la dirección del efecto varía según el año. Además

129

de la condición física, las variables relacionadas con el daño genotóxico en el milano son

la fecha de puesta y la edad, las mismas que resultaron significativas en los modelos que

pretendían explicar la respuesta inmune en el caso de la cigüeña (ver capítulo 6). En el

apartado anterior (ver capítulo 6) de este informe veíamos cómo, en el caso de esta

especie (cigüeña) la respuesta inmune estaba relacionada con el daño genotóxico. En este

apartado, además de los modelos que se muestran en resultados, se llevó a cabo otro

GLMM en el que la respuesta inmune celular se considera también como variable

independiente, al igual que su interacción con el año. Para los tres años en que

disponíamos de información acerca de ambos parámetros (1999, 2001 y 2002), la

tendencia observada fue la misma que la que ya se comentó en el capítulo

correspondiente a la respuesta inmune: a mejor respuesta inmune menor daño genotóxico

(F1,82=4.49, p=0.037). Además de la respuesta inmune el modelo incluyó también la

condición física como efecto significativo (F1,82=4.26, p=0.042).

El nido de nacimiento tuvo un claro efecto sobre el daño genotóxico en la

cigüeña, aunque no tanto en el milano. Por tanto, puede que el hecho de compartir los

mismos recursos, los mismos padres y cuidados, o estar expuestos a los mismos factores

ambientales, como puede ser las molestias de conespecíficos, fenómenos climatológicos

adversos, etc. afecten al daño genotóxico. Estudios en relación a esto último están siendo

llevados a cabo en estos momentos, aunque los resultados aún no están disponibles.

En conclusión, la exposición a Cu, Pb, Zn , Cd y As, ya sea de forma individual o

simultánea, no parece estar relacionada con el daño observado en el ADN en pollos de

cigüeña y milano nacidos en Doñana. No obstante, no se descarta la interacción entre

estos metales y otro contaminantes como origen de ese daño. Factores relacionados con la

salud de los individuos, como la condición física o la respuesta inmune, están

relacionados con el daño genotóxico, siendo éste mayor, por regla general, en los

individuos en peor condición física y en los que muestran una menor respuesta inmune.

El aumento del daño en el ADN a lo largo del período de estudio aconseja seguir

investigando sus causas, así como las consecuencias últimas que este daño podría derivar

en parámetros tales como supervivencia, capacidad reproductora y posibles defectos

hereditarios.

130

8. SINOPSIS

1. Se ha detectado un aumento en la probabilidad de reavistamiento en los

individuos nacidos después del vertido tóxico respecto a los nacidos antes del vertido

tóxico, pero se sospecha que esto puede ser debido a un artefacto metodológico

(incremento en el esfuerzo de reavistamiento en años recientes) más que a un aumento

real de la supervivencia después del vertido. Actualmente se está procediendo a

comprobar, mediante complejos análisis estadísticos específicos para datos de captura-

recaptura, cuál de estas dos posibilidades es la correcta. Por lo tanto el resultado de este

apartado del informe queda abierto hasta haber analizado los datos controlando por el

esfuerzo de recaptura para poder calcular las tasas de supervivencia sin sesgos. No

obstante, lo resultados todavía preliminares de estos análisis parecen indicar que se ha

producido una mayor mortalidad juvenil tras el vertido tóxico.

2. El tamaño de puesta se ha mantenido relativamente estable entre antes y

después del vertido tóxico. Por lo tanto, las diferencias que se han encontrado en el éxito

reproductor son debidas a diferencias en el éxito en la cría de los pollos, y no en al

número de huevos puestos.

3. La lluvia se ha revelado como agente regulador de la mortandad de pollos

de cigüeña blanca en la colonia de la Dehesa de Abajo. La mortandad de pollos se

concentró durante sus primeros días de vida y fue especialmente elevada en aquellos años

en que llovió más durante dicho periodo de tiempo.

4. La lluvia caída durante la estancia de los pollos en el nido explica cierta

parte de la variación interanual en el éxito reproductor de la colonia.

5. El incremento en el número de parejas en la colonia de la Dehesa de Abajo

ha afectado negativamente a la reproducción de las cigüeñas, tanto en su productividad

como en su tasa de vuelo.

6. La superficie cultivada por arroz en el entorno guarda estrecha relación

con el éxito reproductor de la colonia de cigüeñas de la Dehesa de Abajo antes del vertido

131

tóxico de Aznalcóllar. Por el contrario, después del vertido no se ha encontrado dicha

relación entre estas dos variables. De hecho, la reproducción en la Dehesa de Abajo

después del vertido es muy inferior a la anterior al vertido si tenemos en cuenta que

después del vertido la extensión de arrozal ha continuado creciendo pero no así el éxito

reproductor, que incluso ha tendido a descender.

El análisis detallado de la reproducción muestra que a partir del vertido se ha

producido un descenso en el éxito reproductor que no se ve explicado satisfactoriamente

por el conjunto de factores anteriores (número de parejas, extensión de arrozales y

lluvia). A ello podría contribuir una elevada mortalidad de pollos con malformaciones,

especialmente en años lluviosos. Por lo tanto, aunque con la debida cautela, sugerimos a

la luz de los resultados de nuestro estudio que el vertido tóxico de Aznalcóllar de 1998 ha

provocado una reducción en el éxito reproductor de la cigüeña blanca en la Dehesa de

Abajo.

7. En el año 2002 (aunque no en 2003), la productividad de las 86 colonias

de cigüeña blanca estudiadas fue menor cuanto mas cercanas se encontraron del vertido,

independientemente de su tamaño. Este hecho también sugiere que el vertido pudiese

estar afectando a largo plazo la reproducción de esta especie en el entorno de Doñana.

8. En resumen, el éxito reproductor de la colonia ha decrecido

paulatinamente a medida que ha ido incrementando el número de parejas. Además de este

decrecimiento paulatino hay que añadir decrecimientos puntuales (entre años sucesivos)

en la reproducción de la cigüeña en años en que la superficie de arrozal decreció

drásticamente (p.ej. 1983 o 1989). Por último decrecimientos posteriores al vertido se

asocian a la lluvia caída durante la estancia de los pollos en el nido. Esto se podría

explicar por el hecho que después del vertido, los años con más lluvia la mortalidad de

los pollos con malformaciones es muy elevada, pudiendo conducir a una reducción del

éxito reproductor de la colonia. Por lo tanto, aunque con suma cautela sugerimos a la luz

de los resultados de nuestro estudio que el vertido tóxico de Aznalcóllar de 1998 ha

disminuido el éxito reproductor de la cigüeña blanca en la Dehesa de Abajo, como

mínimo en los años de elevada precipitación primaveral.

132

9. Se han encontrado indicios en 2002 (pero no en 2003) de que el éxito de

cría de las colonias más próximas al vertido tóxico pueden estar aun afectadas por la

contaminación del vertido.

10. Durante las invernadas 2001/02 y 2002/03, las aves acuáticas muestreadas

presentaron niveles de cobre y arsénico similares a los de las mismas especies en

inviernos anteriores, e incluso más bajos en el caso del cobre. Tampoco experimentan

cambios los niveles de plomo, que siguen siendo elevados, superando en algunos casos,

como en el del ánade real, el umbral de intoxicación subclínica para este metal en un 80

% de los ejemplares muestreados. El cinc parece incrementarse en la zona contaminada

para los calamones muestreados durante el invierno 2001/02. También aumenta la

concentración de cadmio, aunque los niveles para este metal se sitúan lejos de los que

pueden suponer algún riesgo para la salud de los individuos.

11. Los niveles de metales pesados y arsénico durante la reproducción 2002 en

especies de aves acuáticas son bajos en todos los casos y no experimentan grandes

cambios respecto a los medidos en años anteriores.

12. En el caso de la cigüeña y el milano negro, los niveles de cobre descienden

en ambas especies, lo mismo que cinc, plomo y cadmio en el caso del milano negro. Por

el contrario, el arsénico se incrementa en esta especie durante el 2002, llegando al 22.3%

la cifra de individuos con una concentración de este metaloide en sangre por encima de

los niveles que en humanos se consideran indicativos de una exposición excesiva a

arsénico. Cinc y cadmio aumentan en la cigüeña, aunque para ambos metales los niveles

medidos se sitúan lejos de los umbrales que se consideran peligrosos. El plomo no sufre

importantes variaciones respecto a años anteriores y el arsénico muestra una cierta

tendencia a disminuir en esta especie.

13. La presencia de malformaciones en pollos de cigüeña en las colonias

situadas en las Marismas del Guadalquivir sólo aparece a partir de 1999, un año después

de que se produjera el vertido de Aznalcóllar, y se repite desde entonces cada temporada

reproductora. En el caso de la Dehesa de Abajo, el porcentaje de pollos con

malformaciones varía a lo largo del período de estudio (1998-2003), alcanzándose el

máximo en 2001, con un 9.1% de los individuos nacidos ese año con malformaciones en

133

sus picos y/o patas. Aunque la causa última de estas malformaciones está aún por

determinar, parece bastante probada su relación con alteraciones en el metabolismo del

calcio y del fósforo, minerales implicados en el crecimiento y desarrollo de los pollos y

sometidos a un estricto control homeostático en condiciones normales. A excepción del

cobre y del cinc, los metales pesados aquí estudiados no parecen estar relacionados con

las malformaciones observadas. El uso de pesticidas y fertilizantes en los campos de

cultivo cercanos, e incluso las interacciones entre metales y otro tipo de contaminantes

(PCBs, compuestos organofosforados, etc) podrían ser la causa de esas alteraciones

metabólicas. La salud de los individuos estimada mediante la condición física, respuesta

inmune, daño genotóxico y proteínas de estrés, fue menor en el caso de los pollos que

presentaron malformaciones externas. La supervivencia de los pollos que presentaron

algún tipo de malformación varía a lo largo del período de estudio y se ve afectada,

incluso en mayor proporción que en los pollos no deformes, por la lluvia. Esto podría

suponer un grave riesgo para la viabilidad de la población, sobre todo si el porcentaje de

individuos afectados es tan elevado como el encontrado durante estos años. Se

desconocen los efectos que las malformaciones podrían tener sobre la supervivencia de

los pollos una vez que estos abandonan el nido, o en su reproducción futura, si es que

llegan a sobrevivir lo suficiente como para reproducirse.

14. La respuesta inmune celular de los pollos de cigüeña nacidos en la Dehesa

de Abajo está relacionada positivamente con la condición física. Otros parámetros

relacionados con esta respuesta son la fecha de puesta y la edad, si bien la dirección e

intensidad de sus efectos depende del año de estudio. La exposición simultánea a cobre,

plomo, cinc, cadmio y arsénico parece afectar negativamente a la respuesta inmune,

siendo su efecto más acusado para los individuos que se hallan en peor condición física.

15. Tanto en el caso de la cigüeña, como en el del milano negro, el daño en el

ADN (“ensayo del cometa”) se ha incrementado a lo largo del período de estudio, sobre

todo en el caso del milano negro. En ninguna de las dos especies ese daño parece estar

relacionado con la concentración de metales pesados y arsénico medidos en sangre,

aunque no se descartan efectos derivados de su interacción con otro tipo de tóxicos. La

condición física de los pollos está relacionada negativamente con el daño genotóxico.

134

16. El nido de nacimiento tuvo efecto significativo, tanto en el caso de la

respuesta inmune, como en el caso del daño en el ADN, de forma que los pollos nacidos

en el mismo nido presentan valores más parecidos entre sí que con pollos nacidos en

nidos distintos. Las causas de este efecto están siendo estudiadas en este momento.

17. Respuesta inmune y daño genotóxico están negativamente relacionados en

los pollos de cigüeña nacidos en la Dehesa de Abajo en los tres años en los que se

estudiaron conjuntamente ambos parámetros.

135

9. BIBLIOGRAFÍA

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