appl. environ. microbiol.-1976-nagodawithana-158-62.pdf
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8/10/2019 Appl. Environ. Microbiol.-1976-Nagodawithana-158-62.pdf
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A P P L I E D
AND ENVIRONMENTAL
M I C R O B I O L O G Y , F e b .
1 9 7 6 ,
p .
1 5 8 - 1 6 2
C o p y r i g h t
©
1 9 7 6 A m e r i c a n
S o c i e t y
f o r
M i c r o b i o l o g y
V o l .
3 1 ,
N o .
2
P r i n t e d i n U.SA.
I n f l u e n c e
o f
t h e R a t e
o f E t h a n o l
P r o d u c t i o n
a n d
A c c u m u l a t i o n
o n
t h e
V i a b i l i t y
o f
S a c c h a r o m y c e s
c e r e v i s i a e
i n
R a p i d F e r m e n t a t i o n
I
TILAK W.
NAGODAWITHANA
AND
K E I T H
H .
STEINKRAUS*
C o r n e l l
U n i v e r s i t y ,
Ne w
Y o r k
S t a t e
A g r i c u l t u r a l
E x p e r i m e n t
S t a t i o n ,
G e n e v a ,
Ne w
Y o r k
1 4 4 5 6
R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 6 J u n e
1 9 7 5
W h e r e a s r a p i d
f e r m e n t a t i o n o f d i l u t e d
c l o v e r
h o n e y ( 2 5 °
B r i x )
f o r t i f i e d
w i t h
y e a s t
n u t r i e n t s
u s i n g
8 x 1 0
b r e w e r s '
y e a s t
c e l l s
p e r
m l
r e s u l t e d
i n a n
e t h a n o l
c o n t e n t
o f
9 . 5
( w t / v o l ;
1 2
v o l / v o l )
i n
3
h
a t 3 0
C ,
d e a t h
r a t e o f
t h e
y e a s t
c e l l s
d u r i n g
t h i s
p e r i o d wa s
e s s e n t i a l l y l o g a r i t h m i c .
W h e r e a s
6 h wa s
r e q u i r e d
t o
r e a c h
t h e s a m e e t h a n o l c o n t e n t a t 1 5
C ,
t h e y e a s t c e l l s r e t a i n e d
t h e i r v i a b i l i t y .
U s i n g
a
l o w e r
c e l l
p o p u l a t i o n
( 6
x
1 0 7
c e l l s / m l ) ,
a
l e v e l
a t
w h i c h
t h e f e r m e n t a t i o n
w a s n o
l o n g e r
r a p i d ,
t h e
y e a s t c e l l s a l s o r e t a i n e d
t h e i r
v i a b i l i t y
a t 3 0
C .
E t h a n o l
a d d e d t o
t h e medium w a s much
l e s s
l e t h a l
t h a n
t h e
same
o r
l e s s
q u a n -
t i t i e s
o f
e t h a n o l
p r o d u c e d b y t h e c e l l
i n
r a p i d
f e r m e n t a t i o n .
I t wa s c o n s i d e r e d
p o s s i b l e
t h a t e t h a n o l wa s
p r o d u c e d
s o
r a p i d l y
a t 3 0
C
t h a t i t
c o u l d
n o t
d i f f u s e
o u t
o f
t h e
c e l l a s
r a p i d l y
a s
i t wa s
f o r m e d . T h e
h y p o t h e s i s
wa s
p o s t u l a t e d t h a t
e t h a n o l
a c c u m u l a t i n g
i n
t h e
c e l l
wa s
c o n t r i b u t i n g
t o
t h e
h i g h
d e a t h r a t e a t 3 0
C .
I t w a s
f o u n d
t h a t
t h e i n t r a c e l l u l a r
e t h a n o l c o n c e n t r a t i o n
r e a c h e d
a
l e v e l o f
a p p r o x i m a t e l y
2
x
1 0 1 1 e t h a n o l
m o l e c u l e s / c e l l
i n
t h e
f i r s t
3 0 min
o f f e r m e n t a -
t i o n a t
3 0 C .
A t
1 5
C ,
w i t h
t h e
same
c e l l
c o u n t ,
i n t r a c e l l u l a r e t h a n o l c o n c e n -
t r a t i o n r e a c h e d
a
l e v e l
o f
a p p r o x i m a t e l y
4
x
1 0 1 e t h a n o l
m o l e c u l e s / c e l l
a n d
v i a b i l i t y r e m a i n e d h i g h .
A l s o ,
a t
3 0 C w i t h a
l o w e r
c e l l
p o p u l a t i o n ( 6
x
1 0 7
c e l l s / m l ) ,
u n d e r w h i c h
c o n d i t i o n s
f e r m e n t a t i o n
wa s
n o
l o n g e r
r a p i d ,
i n t r a -
c e l l u l a r
e t h a n o l
c o n c e n t r a t i o n
r e a c h e d
a
s i m i l a r
l e v e l
( 4
x
1 0
m o l e c u l e s
e t h a n o l / c e l l )
a n d t h e c e l l s
r e t a i n e d
t h e i r
v i a b i l i t y .
A l c o h o l
d e h y d r o g e n a s e
( A D H )
l o s t
i t s
a c t i v i t y
i n b r e w e r s '
y e a s t
u n d e r c o n d i t i o n s
o f r a p i d
f e r m e n t a t i o n
a t
3 0 C
b u t r e t a i n e d i t s
a c t i v i t y
i n
c e l l s u n d e r
s i m i l a r
c o n d i t i o n s
a t
1 5
C . ADH
a c t i v i t y
w a s a l s o
r e t a i n e d
i n
f e r m e n t a t i o n s
a t 3 0
C w i t h c e l l
p o p u l a t i o n s
o f
6
x
1 0 7 / m l .
I t
w o u l d
a p p e a r
t h a t a n
i n t r a c e l l u l a r l e v e l o f
a b o u t 5
x
1 0 1
e t h a n o l
m o l e c u l e s / c e l l i s n o r m a l
a n d
t h a t
t h i s
l e v e l d o e s n o t d a m a g e
e i t h e r
c e l l v i a b i l i t y
o r ADH
a c t i v i t y . H i g h e r i n t r a c e l l u l a r
e t h a n o l
c o n c e n t r a t i o n s , s u c h
a s
2
x
1 0 1 1
m o l e c u l e s e t h a n o l / c e l l
( a
f o u r f o l d
i n c r e a s e
i n
i n t r a c e l l u l a r
e t h a n o l
c o n c e n t r a -
t i o n ) ,
a r e
a c c o m p a n i e d
b y i n a c t i v a t i o n o f ADH a n d l o s s o f c e l l v i a b i l i t y .
B y u s i n g
7
x
1 0 8
c e l l s
o f
b r e w e r s ' y e a s t p e r
m l ,
2 5 °
B r i x h o n e y s o l u t i o n s
f o r t i f i e d
w i t h
n i t r o -
g e n , p h o s p h a t e ,
a n d m i n e r a l s
w e r e f e r m e n t e d
t o
9 . 5 ( w t / v o l ; 1 2
v o l / v o l )
e t h a n o l
i n 2 . 5 t o
3
h
a t
3 0 C ( 6 ) .
U n d e r
t h e s e c o n d i t i o n s
o f r a p i d
f e r m e n t a t i o n ,
d e a t h
r a t e o f t h e c e l l s
w a s
h i g h ,
w i t h
o n l y 2 . 1
o f
t h e c e l l s s u r v i v i n g
a t
t h e
e n d
o f
t h e f e r m e n t at i o n .
When t h e
f e r m e n t a t i o n
t e m p e r a t u r e w a s d e c r e a s e d t o 1 5 C
a n d
t h e
c o n t e n t o f d i s s o l v e d o x y g e n i n t h e medium w a s
m a i n t a i n e d a t 1 3 , f e r m e n t a t i o n t i m e t o 9 . 5
( w t / v o l ) e t h a n o l
i n c r e a s e d
t o 6 h , b u t
t h e y e a s t
c e l l s
r e t a i n e d
t h e i r v i a b i l i t y ( 6 ) . R a p i d
f e r -
m e n t a t i o n s u s i n g h i g h
c e l l
p o p u l a t i o n s r e q u i r e
J o u r n a l
P a p e r
n o .
2 1 2 8 ,
Ne w Y o r k S t at e A g r i c u l t u r a l
E x p e r i m e n t
S t a t i o n .
h i g h e r
l e v e l s
o f
v i t a m i n s
a n d
m i n e r a l s t h a n
s l o w e r f e r m e n t a t i o n s a t l o w e r
t e m p e r a t u r e s
o r
t h o s e
u s i n g
s m a l l e r
p o p u l a t i o n s ( N a g o d a -
w i t h a n a a n d S t e i n k r a u s ,
u n p u b l i s h e d d a t a ) .
H o w e v e r ,
e v e n
i n
t h e
p r e s e n c e
o f
t h e
h i g h e r
l e v e l s
o f v i t a m i n s
a n d
m i ne r a l s , b r e w e r s ' y e a s t ,
t h e
m o s t
r a p i d
f e r m e n t i n g y e a s t we h a v e e n -
c o u n t e r e d ,
l o s e s i t s
v i a b i l i t y much m o r e r a p i d l y
a t
3 0
C t h a n
i t
d o e s
a t
l o w e r
t e m p e r a t u r e s .
T h e
e f f e c t o f e t h a n o l o n y e a s t m e t a b o l i s m
h a s
b e e n s t u d i e d ( 1 ,
3 , 9 ;
F .
F .
P i r o n t i , P h . D .
t h e s i s , C o r n e l l U n i v . , I t h a c a ,
N . Y . ,
1 9 7 1 ) .
U n d e r
P i r o n t i s
c o n d i t i o n s , e t h a n o l a p p e a r e d
t o i n h i b i t
y e a s t
c e l l
g r o w t h
a t
r e l a t i v e l y
l o w
c o n c e n t r a -
t i o n , w h e r e a s t h e f e r m e n t a t i v e a c t i v i t y o f t h e
c e l l s
s e e m e d t o
t o l e r a t e
e t h a n o l
u n t i l
i t s c o n -
c e n t r a t i o n
a p p r o a c h e d a p p r o x i m a t e l y
20
( v o l /
1 5 8
onD e c em b er 2 1 ,2 0 1 4
b y g u e s t
h t t p: / / a em. a s m. or g /
D ownl o a d e
d f r om
8/10/2019 Appl. Environ. Microbiol.-1976-Nagodawithana-158-62.pdf
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VIABILITY
L O S S
IN RAPID
FE R M EN TA T I ON
v o l ;
1 6 . 2 6 w t / v o l ) .
T h e e f f e c t o f e t h a n o l o n
g r o w t h r a t e s
a n d e t h a n o l p r o d u c t i o n wa s
shown
t o b e n o n c o m p e t i t i v e
i n h i b i t i o n ,
c o n f i r m e d b y
L i n e w e a v e r - B u r k p l o t s
( 1 ) .
I n h i b i t i o n
b y e t h a n o l wa s i n v e s t i g a t e d a f t e r
t h e
c o n c e n t r a t i o n
o f
y e a s t
c e l l s
r e a c h e d m a x i -
mum v a l u e i n t h e s h o c h u - m o l d e d
r i c e
f e r m e n t a -
t i o n ( 5 ) .
T h e d e c r e a s e i n t h e r a t e o f
e t h a n o l
p r o d u c t i o n wa s s ho wn t o
b e d i r e c t l y r e l a t e d t o
t h e d e c r e a s e i n t h e number
o f v i a b l e y e a s t
c e l l s .
A d d e d
t h i a m i n e e n a b l e d y e a s t e n z y m e s
t o
t o l e r a t e t h e a moun t o f e t h a n o l
t h e c e l l w o u l d
n o r m a l l y
p r o d u c e
b u t
n o t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s
( 9 ) .
T h e
e x p e r i m e n t s r e p o r t e d w e r e u n d e r t a k e n
t o a t t e m p t
t o d e t e r m i n e t h e
p a r t
r a t e
o f
e t h a n o l
p r o d u c t i o n
o r
a c c u m u l a t i o n
c o n t r i b u t e s
t o
l o s s
o f
v i a b i l i t y i n r a p i d
f e r m e n t a t i o n s
w i t h
b r e w e r s '
y e a s t
a t 3 0
C .
MAT E R IAL S AND
METHO S
Y e a s t s t r a i n s .
A b r e w e r s ' s t r a i n o f
S a c c h a r o m y c e s
c e r e v i s i a e w a s
k i n d l y
s u p p l i e d
b y M a r i o F r a t i ,
G e n e s e e
B r e w i n g
C o . , R o c h e s t e r ,
N . Y .
T h e
b r e w e r s '
y e a s t
w a s o b t a i n e d a s a s o l i d
p a s t e c o n t a i n i n g
f r o m
3 . 8 5
x
1 0 9
t o 4 . 0 4
x
1 0 9
c e l l s / g . The y e a s t
w a s
w a s h e d w i t h
c i t r a t e - p h o s p h a t e b u f f e r , pH 6 . 8 ,
a n d
c e n t r i f u g e d
t o
r e c o v e r t h e
c e l l s
t o
b e
u s e d i n
t h e
e x p e r i m e n t s .
Y e a s t
c o u n t s .
B a s e d u p o n
t h e
number
o f
y e a s t
c e l l s d e s i r e d
i n
t h e i no cu l a t e d
m e d i u m , a
g i v e n
w e i g h t , g e n e r a l l y 1
k g o f y e a s t p a s t e , w a s
s l u r r i e d
w i t h
1
l i t e r
o f t h e m e d i u m .
A f t e r
t h o r o u g h
d i s p e r -
s i o n ,
a 1 - m l
s a m p l e w a s
d i l u t e d
s e r i a l l y
a n d
p l a t e d
i n
d u p l i c a t e
t o o b t a i n t h e i n i t i a l
v i a b l e
c o u n t .
T h e
c u l t u r e medium u s e d
f o r
p o u r
p l a t e s c o n t a i n e d 1 . 5
m a l t o s e , 1 . 5
m a l t e x t r a c t ( D i f c o ) ,
a n d
1 . 5
a g a r
( D i f c o ) .
T h e
p l a t e s
W v e r e
i n c u b a t e d a t 3 0
C f o r 4 8 h ,
a n d
t h e f i n a l c o l o ny c o u nt w a s t a k e n a s t h e a v e r a g e
o f
t h e t w o
p l a t e s f o r t h e d i l u t i o n c o n t a i n i n g
3 0 t o
3 0 0
c o l o n i e s / p l a t e .
C a l c u l a t i o n s
i n v o l v i n g c e l l p o p u -
l a t i o n s w e r e b a s e d
u p o n
v i a b l e p l a t e
c o u n t s .
T h e
p e r c e n t a g e
o f v i a b i l i t y w a s d e t e r m i n e d
b y d i v i d i n g
t h e v i a b l e
c o u n t
a t
t h e d e s i r e d
f e r m e n t a t i o n
t i m e
o f
t h e i n i t i a l
v i ab l e c ou nt . I f
m u l t i p l i c a t i o n
o c c u r r e d ,
t h e
p e r c e n t a g e
o f
v i a b i l i t y
t h u s r o s e a b o v e 1 0 0 .
F e r m e n t a t i o n
m e d i u m . C l o v e r h o n e y
s t o r e d a t
1
C
w a s
d i l u t e d w i t h
w a t e r t o p r o v i d e t h e
2 5 0
B r i x
s u g a r
s u b s t r a t e .
A
b a s a l l e v e l o f
0 . 2 5 g o f
A c t i f e r m
p e r
l i t e r
( B u d d e
&
W e s t e r m a n n , New Y o r k , N . Y . ) ,
a
y e a s t
v i t a m i n
m i x t u r e ,
w a s a d d e d t o
t h e
f e r m e n t a -
t i o n
medium
a n d
t h i s
l e v e l i s
r e f e r r e d t o
a s
X . T h e
0 . 2 5
g
o f A c t i f e r m
p e r
l i t e r
c o n t a i n e d 1 2 . 5
u g o f
b i o t i n ,
2 5 0 M g o f p y r i d o x i n e , 1 . 8 7 m g o f m e s o - i n o s i t o l ,
2 . 5 m g o f c a l c i u m p a n t o t h e n a t e ,
5
m g o f
t h i a m i n e ,
2 5 m g
o f p e p t o n e ,
a n d 2 1 5
m g
o f
a m m o n i u m s u l f a t e .
T h e
medium w a s a l s o
s u p p l e m e n t e d
w i t h
1 . 0 g o f
( N H 4 ) 2 S O 4 ,
0 . 5
g
o f
K : 1 P 0 4 ,
0 . 2
g
o f
M g C l 2 ,
0 . 0 5
g
o f
N a H S O 4 ,
a n d 5 . 0
g
o f
c i t r i c
a c i d p e r l i t e r
a s
p e r
f o r m u l a
I
( 1 0 ) .
T h e b a s i c l e v e l
o f
m i n e r a l
s a l t s -
c i t r i c a c i d
s u p p l e m e n t
w a s r e f e r r e d t o
a s Y .
C e r t a i n
f e r m e n t a t i o n s
i n t h i s
s t u d y
w e r e
c o nd u c t e d u s i n g
a
2Y l e v e l
o f m i n e r a l s a l t - c i t r i c a c i d
s u p p l e m e n t
a n d
4X c o n c e n t r a t i o n
( 1 g o f v i t a m i n s
[ A c t i f e r m ]
p e r
l i t e r ) . T h e pH o f t h e
f e r m e n t a t i o n medium
w a s
a d j u s t e d t o
4 . 2 . I t
t h e n
w a s
p a s t e u r i z e d
a t 7 6 . 5
C
f o r
3 0
min
a n d
c o o l e d
t o
f e r m e n t a t i o n
t e m p e r a t u r e
b e f o r e
i n o c u l a t i o n .
A p p a r a t u s .
A
M i c r o f e r m l a b o r a t o r y
f e r m e n t o r
m o d e l 2 1 4
(New
B r u n s w i c k S c i e n t i f i c C o . ,
New
B r u n s w i c k , N . J . ) w i t h
1 4 - l i t e r f e r m e n t o r s
( w o r k i n g
c a p a c i t y ,
7
l i t e r s )
w a s
u s e d .
T h e
f e r m e n t a t i o n s
w e r e c a r r i e d o u t a t
1 5 o r 3 0 C a n d
w i t h 1 3 d i s -
s o l v e d
o x y g e n ( u n l e s s o t h e r w i s e
s p e c i f i e d ) w i t h
a g i t a t i o n
a t
3 0 0
r p m .
A
f e r m e n t o r s a m p l e r ( N e w
B r u n s w i c k
m o d e l S 2 1 ) w a s
u s e d
t o
s a m p l e
medium
d u r i n g
f e r m e n t a t i o n .
A
d i s s o l v e d o x y g e n
c o n t r o l l e r
m o d e l D O - 6 0 b y
Ne w
B r u n s w i c k
C o . ,
w a s u s e d
i n
c o n j u n c t i o n
w i t h
t h e
a b o v e
t o
m e a s u r e a n d c o n t r o l
o x y g e n
l e v e l .
P r e p a r a t i o n
o f
c e l l - f r e e
e x t r a c t .
S a m p l e s
( 2 5
m l )
w e r e
w i t h d r a w n f r o m t h e
f e r m e n t i n g
medium
a t
d e s i r e d
t i m e i n t e r v a l s
a n d
c h i l l e d
i m m e d i a t e l y
u s i n g
a
d r y i c e - e t h a n o l
m i x t u r e ;
a l l
s u b s e q u e n t o p e r a t i o n s
w e r e c a r r i e d o u t
a t
0
t o
4
C .
e l l s w e r e
h a r v e s t e d
b y c e n t r i f u g a t i o n
a t 9 , 0 0 0
x
g
f o r
1 0
min
i n
S o r v a l l
c e n t r i f u g e ,
m o d e l
S S - 3 ,
w a s h e d t w i c e
w i t h 1 2 . 5 - m l
p o r t i o n s
o f
0 . 1
M
c i t r a t e - p h o s p h a t e
b u f f e r
( p H 6 . 8 ) ,
a n d
c e n t r i f u g e d
a t
9 , 0 0 0
x
g
f o r
1 0 m i n .
T h e v o l u m e s
o f a l l t h r e e
s u p e r n a t a n t s
w e r e d e t e r m i n e d ,
a n d
1 - m l
s a m p l e s
w e r e
s e t a s i d e f o r
e t h a n o l
a n a l y s i s .
T h e c e l l p e l l e t
w a s
t h e n s u s p e n d e d
i n 1 2 . 5
m l
o f
0 . 1 M c i t r a t e - p h o s p h a t e b u f f e r , pH 6 . 8 ,
a n d 1
m l
o f
t h e
t h o r o u g h l y m i x e d s u s p e n s i o n
wa s
s u i t a b l y
d i l u t e d
f o r
d e t e r m i n a t i o n
o f
c e l l
n u m b e r
b y
d i r e c t
m i c r o s c o p i c c o u n t
u s i n g a n
A m e r i c a n
O p t i c a l
B r i g h t
L i n e h e m a c y t o m e t e r .
T h e r e m a i n i n g
y e a s t
s u s p e n -
s i o n
wa s
d i s i n t e g r a t e d b y
s o n i c
o s c i l l a t i o n ( S o n i f i e r
c e l l
d i s r u p t o r ,
m o d e l
W
1 8 5 D ,
H e a t
S y s t e m s - U l t r a -
s o n i c s I n c . , P l a i n v i e w ,
N . Y . )
f o r a t o t a l
o f 6
m i n ,
s u b j e c t i n g
t h e c e l l
t o
a
p e r i o d
o f
3 0
s
o f
s o n i c
o s c i l l a -
t i o n f o l l o w e d
b y
a
p e r i o d
o f
1
min
o f
c o o l i n g .
A
1 - m l
amount o f
t h e
s o n i c a t e d
s u s p e n s i o n
wa s
s u i t a b l y
d i l u t e d t o
d e t e r m i n e t h e
p o p u l a t i o n
o f
u n r u p t u r e d
c e l l s
b y
d i r e c t
m i c r o s c o p i c
c o u n t .
The t r e a t m e n t
r u p t u r e d
a p p r o x i m a t e l y 6 0
o f t h e
c e l l s
i n
t h e
s u s p e n s i o n .
T h e
c e l l
d e b r i s
wa s
r e m o v e d
b y
c e n -
t r i f u g i n g
a t
3 2 , 8 0 0
x
g
f o r 1 5
m i n .
H a v i n g
mea-
s u r e d t h e
v o l u m e
o f
t h e
c e l l
e x t r a c t ,
i t
wa s
h e l d
a t
1 C u n t i l f u r t h e r
u s e . T h e e x t r a c t
wa s
s u b s e -
q u e n t l y a n a l y z e d
f o r e t h a n o l
b y
g a s - l i q u i d
c h r o m a -
t o g r a p h y .
T h e e t h a n o l
c o n t e n t
o f
t h e e x t r a c t
wa s
u s e d
t o c a l c u l a t e t h e e t h a n o l
c o n t e n t
o f
t h e
r u p -
t u r e d c e l l s .
M o l e s o f e t h a n o l w e r e
c o n v e r t e d
t o
m o l e c u l e s
o f e t h a n o l
p e r
c e l l
b y m u l t i p l y i n g b y
A v o g a d r o s
n u m b e r a n d
d i v i d i n g b y
t h e
t o t a l
number
o f
r u p t u r e d
c e l l s .
C a r l e
g a s c h r o m a t o g r a p h ,
m o d e l
9 0 0 0 , e q u i p p e d
w i t h a f l a m e
i o n i z a t i o n d e t e c t o r
wa s
u s e d
f o r
t h e
s e p a r a t i o n
a n d
q u a n t i t a t i o n
o f
e t h a n o l
u s i n g p r o c e -
d u r e s
d e s c r i b e d
e a r l i e r
( 6 ) .
ADH
a s s a y . A l c o h o l d e h y d r o g e n a s e
( A D H )
a c t i v -
i t y
w a s m e a s u r e d b y
a
p r o c e d u r e b a s e d
o n
p r e v i o u s
m e t h o d s ( 2 , 7 ) , m o d i f i e d
a s
f o l l o w s .
3 - m l amount
o f
b u f f e r , pH
8 . 8
( 2 ) , c o n t a i n i n g
1 0
M l
o f
1 . 5
m g
o f
e t h a n o l
p e r
ml
a n d
0 . 0 5
ml
o f t h e c e l l - f r e e
e x t r a c t ,
V O L .
3 1 ,
1 9 7 6
1 5 9
onD e c em b er 2 1 ,2 0 1 4
b y g u e s t
h t t p: / / a em. a s m. or g /
D ownl o a d e
d f r om
8/10/2019 Appl. Environ. Microbiol.-1976-Nagodawithana-158-62.pdf
http://slidepdf.com/reader/full/appl-environ-microbiol-1976-nagodawithana-158-62pdf 3/5
1 6 0
NAGODAWITHANA
AND
STEINKRAUS
w a s t r a n s f e r r e d
d i r e c t l y
t o a
c u v e t t e ( 1 - c m
l i g h t
p a t h ) ,
a n d
t h e
o p t i c a l
d e n s i t y
a t
3 4 0
n m w a s d e t e r -
m i n e d . T w e n t y
m i c r o l i t e r s
o f
0 . 1 5 M n i c o t i n a m i d e
a d e n i n e d i n u c l e o t i d e
( N A D )
w a s
t r a n s f e r r e d t o
t h e
c u v e t t e
w i t h
a s y r i n g e
a n d
m i x e d
i m m e d i a t e l y
w i t h
a
p l a s t i c r o d ,
a n d t h e
c h a n g e
i n o p t i c a l d e n s i t y a t
3 4 0
n m w a s
m o n i t o r e d e v e r y
3 0 s
d u r i n g
t h e
f i r s t 3
m i n .
From
t h e s t a n d a r d
c u r v e
f o r r e d u c e d
NAD
( N A D H ) ,
t h e
o p t i c a l d e n s i t y r e a d i n g
a t 3 4 0
n m w a s
d i r e c t l y c o n v e r t e d
t o
t h e
a m o u n t
o f NADH
p l u s H+
f o r m e d
i n
t h e c u v e t t e w i t h
t i m e
f o r t h e p a r t i c u l a r
r u n . T h e i n i t i a l
r a t e o f
NADH p l u s
H+ f o r m e d
p e r
m i n u t e w a s
c a l c u l a t e d f r o m
t h e
g r a p h ,
s h o w i n g
t h e
i n cr e a se o f
NADH
p l u s
H+ w i t h t i m e
f o r t h e
p a r t i c u -
l a r r u n . S i n c e
NAD
a n d e t h a n o l
w e r e a d d e d i n
e x c e s s ,
t h e
r e a c t i o n r a t e
w a s d e p e n d e n t
o n t h e
a c t i v i t y o f
ADH
i n
t h e 0 . 0 5 - ml
c e l l - f r e e e x t r a c t
a d d e d
t o t h e c u v e t t e . P r o t e i n
i n
t h e
c e l l - f r e e
e x t r a c t w a s
d e t e r m i n e d
b y t h e
m e t h o d o f
L o w r y e t
a l . ( 4 )
u s i n g
b o v i n e
a l b u m i n
s e r u m
a s t h e
s t a n d a r d .
T h e
s p e c i f i c
a c t i v i t y o f ADH
=
m i c r o m o l e s
o f
NADH p l u s H+
f o r m e d
p e r
m i n u t e / m i l l i g r a m
o f
p r o t e i n .
R E S U L T S
AND
DISCUSSION
W h e r e a s
r a p i d
f e r m e n t a t i o n
( d e f i n e d
a s
f e r m e n t a t i o n
i n w h i c h
t h e e t h a n o l
c o n t e n t
r i s e s f r o m
0 t o 9 . 5 [ w t / v o l ;
12 v o l / v o l ]
i n 6
h
o r
l e s s ) u s i n g
8
x
1 0 8
c e l l s / m l
a t
3 0
C r e s u l t e d
i n
a n
e t h a n o l
c o n t e n t o f
9 . 5
( w t / v o l ; 1 2
v o l / v o l )
i n
3
h ,
d e a t h r a t e o f
t h e
y e a s t c e l l s
9
0 I
5 ' C
Ua
8
3 O ~
2
E
\
° 1 0
3 0 ° C
~
@
30°C
HOURS
F I G . 1 .
E f f e c t o f
i n i t i a l
c e l l p o p u l a t i o n
on
v i a b l e
c e l l c o u n t
d u r i n g
f e r m e n t a t i o n
u s i n g b r e w e r s '
yeast
a t
1 5
and
3 0 C . 1 3
d i s s o l v e d
oxygen
( D . O . ) .
d u r i n g
t h i s
p e r i o d
w a s e s s e n t i a l l y
l o g a r i t h m i c
( F i g .
1 ) . A l t h o u g h
i t
r e q u i r e d
6
h
t o r e a c h
t h e
s a m e
e t h a n o l
c o n t e n t
a t
1 5
C ,
t h e
y e a s t
c e l l s
r e t a i n e d
t h e i r
v i a b i l i t y . U s i n g
a
l o w e r
c e l l
p o p u l a t i o n
( 6
x
1 0 7
c e l l s / m l ) ,
a
l e v e l
a t w h i c h
t h e
f e r m e n t a t i o n
w a s
n o
l o n g e r
r a p i d
a t
3 0
C ,
t h e y e a s t c e l l s a l s o
r e t a i n e d t h e i r
v i a b i l i t y .
I t w a s f o u n d
t h a t 9 . 4 ( w t / v o l )
e t h a n o l
p r o -
d u c e d
b y
t h e c e l l s d u r i n g
f e r m e n t a t i o n
a t
3 0
C
w a s much
m o r e l e t h a l
t h a n
e v e n
1 3 . 8
( w t / v o l )
e t h a n o l
a d d e d
t o
a
s i m i l a r c e l l p o p u l a t i o n
i n t h e
d i l u t e d
h o n e y
b a s e ( F i g .
2 ) .
O n l y
1 5 . 5
o f
t h e
c e l l s
i n o c u l a t e d s u r v i v e d
3
h
o f f e r m e n t a t i o n
t o
9 . 4
e t h a n o l
( w t / v o l )
a t 3 0
C , w h e r e a s
5 7 . 5
o f t h e c e l l s
i n o c u l a t e d
s u r v i v e d 3
h
i n
t h e s a m e
medium
i n w h i c h
t h e e t h a n o l
c o n t e n t
w a s
i n -
c r e a s e d
t o 1 2
( w t / v o l )
b y
a d d i t i o n
o f
e t h a n o l .
T h e
i n t e r n a l
e t h a n o l
c o n t e n t
o f
c e l l s
w a s
d e t e r m i n e d
d u r i n g
f e r m e n t a t i o n
u s i n g
8
x
1 0 8
c e l l s / m l
a t
3 0 C .
I t
w a s f o u n d
t h a t
t h e
h i g h e r
c o n c e n t r a t i o n
o f b r e w e r s ' y e as t
c e l l s
( 8
x
1 0 8
c e l l s / m l )
c o n t a i n e d
a
h i g h e r
e t h a n o l
c o n t e n t
( 1 . 6
x
1 0 1
e t h a n o l
m o l e c u l e s / c e l l )
a f t e r 3 0 - m i n
f e r m e n t a t i o n
a t 3 0 C t h a n
t h e
same c o n c e n t r a -
t i o n
o f c e l l s f e r m e n t i n g
a t 1 5
C ,
w h i c h c o n -
t a i n e d
3 . 9
x
1 0
e t h a n o l
m o l e c u l e s / c e l l
( T a b l e
1 ) . T h e
l o w e r
p o p u l a t i o n
o f c e l l s
( 6 . 3
x
1 0 7
1 0 0
9 0
80
8 E T H A N O L
WN
0 ° C
\
~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ E X T E R N A L
7 0
6 0
9 4
E T H A N O I
W / V
1 0
( F E R M E N T A T L O N )
0
0
2
3
H O U R S
F I G . 2 .
L o s s
o f v i a b i l i t y
o f b r e w e r s '
y e a s t
c e l l s
a t
3 0
C
i n
2 5 °
B r i x
h o n e y
s o l u t i o n s
c o n t a i n i n g
i n c r e a s -
i n g c o n c e n t r a t i o n s
o f
a d d e d ( e x t e r n a l )
e t h a n o l
c o m -
p a r e d
w i t h l o s s o f v i a b i l i t y
d u r i n g r a p i d
f e r m e n t a -
t i o n w h e n
e t h a n o l
i s
b e i n g p r o d u c e d
b y t h e
c e l l s .
A P P L .
E N V I R O N .
M I C R O B I O L .
onD e c em b er 2 1 ,2 0 1 4
b y g u e s t
h t t p: / / a em. a s m. or g /
D ownl o a d e
d f r om
8/10/2019 Appl. Environ. Microbiol.-1976-Nagodawithana-158-62.pdf
http://slidepdf.com/reader/full/appl-environ-microbiol-1976-nagodawithana-158-62pdf 4/5
VIABILITY
LOSS
IN
RAPID FERMENTATION
1 6 1
c e l l s / m l )
a t
3 0
C
h a d a n i n t e r n a l
e t h a n o l
c o n -
t e n t
s i m i l a r
t o t h e c e l l s
f e r m e n t i n g
m o r e
s l o w l y
a t 1 5
C ( 3 . 9
x
1 0 1
m o l e c u l e s
e t h a n o l / c e l l ) .
T h i s
ma y b e r e l a t e d
t o
t h e r e l a t i v e l y
g r e a t e r
v o l u m e
o f f r e e
l i q u i d w i t h
t h e
l o w e r
c e l l
p o p u l a -
t i o n ,
w h i c h w o u l d
f a c i l i t a t e
d i f f u s i o n
o f
e t h a n o l
f r o m
t h e
c e l l s
d u r i n g
f e r m e n t a t i o n .
A t
1 5 C t h e i n t r a c e l l u l a r
e t h a n o l
c o n c e n t r a -
t i o n d i d n o t
i n c r e a s e a b o v e
5 . 3
x
1 0
m o l e c u l e s /
c e l l d u r i n g
t h e
f i r s t
2
h o f r a p i d
f e r m e n t a t i o n ,
w h e r e a s
e t h a n o l i n
t h e
h i g h
c e l l
p o p u l a t i o n
f e r m e n t i n g
a t
3 0 C r e m a i n e d
a t
t h e 2
x
1 0 1 1
m o l e c u l e s / c e l l
l e v e l .
N o r
w a s t h e r e
a n y
s i g -
n i f i c a n t
i n c r e a s e
i n t h e n u m b e r
o f
e t h a n o l
m o l e c u l e s
w i t h i n
t h e c e l l s a t
t h e l o w e r
c e l l
p o p u l a t i o n
l e v e l d u r i n g
t h e
f e r m e n t a t i o n . T h e
T A B L E
1 .
C o m p a r i s o n
o f
t h e
m o l e c u l e s o f
e t h a n o l
f o u n d
w i t h i n
y e a s t
c e l l s a t d i f f e r e n t
s t a g e s o f
f e r m e n t a t i o n
M o l e c u l e s
o f e t h a n o l p e r
a v e r a g e
c e l l
T i m e
( h )
8
x
1 0 1
c e l l s /
8 x
1 0 c e l l s /
6 . 3
x
1 0 7 c e l l s /
ml a t 1 5 C
m l a t 3 0 C
ml a t
3 0
C
( c e l l s
r e m a i n ( c e l l s
d i e r a p -
( c e l l s r e m a i n
v i a b l e )
i d l y )
v i a b l e )
0 3 . 7
x
1 0 1
6 . 4
x
1 0
4 . 4
x
1 0
0 . 5
3 . 6
x
1 0 1 . 6
x
1 0 '
3 . 9
x
1 0
1
4 . 9
x
1 0
2 . 0
x
1 0 4 . 5
x
1 0
2
5 . 3
x
1 0
1 . 6
x
1 0 1 1 5 . 0
x
1 0
I n i t i a l
v i a b l e
c e l l
c o u n t
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1 0 : 8 4 5 - 8 6 4 .
2 .
B o n n i c h s e n ,
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1 9 6 5 .
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d e t e r m i n a t i o n
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a l c o h o l
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3 .
H o l z b e r g , I . ,
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K .
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S t e i n k r a u s .
1 9 6 7 .
A k i n e t i c
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a l c o h o l i c
f e r m e n t a t i o n
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B i o t e c h n o l .
B i o e n g .
9 : 4 1 3 - 4 2 7 .
V O L .
3 1 ,
1 9 7 6
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b y g u e s t
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D ownl o a d e
d f r om
8/10/2019 Appl. Environ. Microbiol.-1976-Nagodawithana-158-62.pdf
http://slidepdf.com/reader/full/appl-environ-microbiol-1976-nagodawithana-158-62pdf 5/5
162
NAGODAWITHANA
AND
STEINKRAUS
4 . L o w r y ,
0
H . , N .
J .
R o s e b r o u g h ,
A . L . F a r r ,
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1 9 5 1 .
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F o l i n
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B i o l .
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1 9 3 : 2 6 5 - 2 7 5 .
5 .
N a g a t a n i ,
M . ,
Y .
K u b a ,
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1 9 6 9 .
K i n e t i c s
o f p r o d u c t
i n h i b i t i o n
i n
s h o c h u
m a k i n g .
J .
F e r m e n t .
T e c h n o l .
4 7 : 7 2 3 - 7 2 8 .
6 .
N a g o d a w i t h a n a ,
T .
W . ,
C .
C a s t e l l a n o ,
a n d
K .
H .
S t e i n k r a u s .
1 9 7 4 .
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o f d i s s o l v e d
o x y g e n,
t e m p e r a t u r e ,
i n i t i a l c e l l
c o u n t ,
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c o n c e n t r a -
t i o n on t h e
v i a b i l i t y
o f S a c c h a r o m y c e s
c e r e v i s i a e
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r a p i d f e r m e n t a t i o n s .
A p p l .
M i c r o b i o l .
2 8 : 3 8 3 - 3 9 1 .
A P P L .
E N V I R O N .
M I C R O B I O L .
7 .
R a c k e r ,
E .
1 9 5 5 . A l c o h o l
d e h y d r o g e n a s e
f r o m
B a k e r ' s
y e a s t ,
p .
5 0 0 - 5 0 3 .
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S .
P .
C o l o w i c k a n d
N .
0 .
K a p l a n ( e d . ) ,
M e t h o d s
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1 . A c a -
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Y o r k .
8 . R a h n ,
0 .
1 9 2 9 . T h e
d e c r e a s i n g
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f e r m e n t a t i o n .
J .
B a c t e r i o l .
1 8 : 2 0 7 - 2 2 6 .
9 .
R a h n ,
0 .
1 9 5 2 .
A c i d
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a l c o h o l
t o l e r a n c e
i m p a r t e d
b y t h i a m i n e .
G r o w t h
1 6 : 5 9 - 6 3 .
1 0 . S t e i n k r a u s ,
K .
H . , a n d
R . A .
M o r s e .
1 9 6 6 . F a c t o r s
i n f l u e n c i n g
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f e r m e n t a t i o n
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p r o d u c t i o n .
J . A p i c .
R e s .
5 : 1 7 - 2 6 .
onD e c em b er 2 1 ,2 0 1 4
b y g u e s t
h t t p: / / a em. a s m. or g /
D ownl o a d e
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