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A P P L i E D M i c R a o m o w G Y , N o v . 1 9 7 3 , p . 7 7 7 - 7 8 2C o p y r i g h t 0 1 9 7 3 A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y V o l . 2 6 , N o . 5P r i n t e d i n U . S . A .

A n t i m i c r o b i a l P r o p e r t i e s o f O l e u r o p e i n a n dP r o d u c t s o f I t s H y d r o l y s i s f r o m G r e e n O l i v e s '

H . P . FLEMING, W. M. WALTER, J R . , AN D J . L . ETCHELLSU . S . F o o d F e r m e n t a t i o n L a b o r a t o r y , A g r i c u l t u r a l R e s e a r c h S e r v i c e , U n i t e d S t a t e s D e p a r t m e n t o f A g r i c u l t u r e ,a n d D e p a r t m e n t o f F o o d S c i e n c e , N o r t h C a r o l i n a S t a t e U n i v e r s i t y , R a l e i g h , N o r t h C a r o l i na 2 7 6 0 7

R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 2 4 J u l y 1 9 7 3O l e u r o p e i n , t h e b i t t e r g l u c o s i d e i n green o l i v e s , a n d p r o d u c t s o f i t s h y d r o l y s i s

were t e s t e d f o r a n t i b a c t e r i a l a c t i o n a g a i n s t c e r t a i n s p e c i e s o f l a c t i c a c i d b a c t e r i ai n v o l v e d i n t h e b r i n e f e r m e n t a t i o n o f o l i v e s . O l e u r o p e i n was n o t i n h i b i t o r y , b u ttwo o f i t s h y d r o l y s i s p r o d u c t s , t h e a g l y c o n e a n d e l e n o l i c a c i d , i n h i b i t e d g r o w t h o ft h e f o u r s p e c i e s o f l a c t i c a c i d b a c t e r i a t e s t e d . A n o t h e r h y d r o l y s i s p r o d u c t ,f l - 3 , 4 - d i h y d r o x y p h e n y l e t h y l a l c o h o l , w a s . n o t i n h i b i t o r y . The a g l y c o n e o f o l e u r o -p e i n a n d e l e n o l i c a c i d were much more i n h i b i t o r y when t h e b r o t h mediumc o n t a i n e d 5% N a C l ; 1 5 0 ug o f e i t h e r c o m p o u n d per m l p r e v e n t e d g r o w t h o fL a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m . A c r u d e e x t r a c t o f o l e u r o p e i n , t e s t e d b y paper d i s kb i o a s s a y , was i n h i b i t o r y t o 3 o f 1 7 s p e c i e s o f b a c t e r i a s c r e e n e d , n o n e o f w h i c hwere l a c t i c a c i d b a c t e r i a . T h e a c i d h y d r o l y s a t e o f t h e e x t r a c t was i n h i b i t o r y t o 1 1o f t h e b a c t e r i a , w h i c h i n c l u d e d f o u r s p e c i e s o f l a c t i c a c i d b a c t e r i a a n d o t h e rg r a m - p o s i t i v e a n d g r a m - n e g a t i v e s p e c i e s . N e i t h e r c r u d e p r e p a r a t i o n was i n h i b i -t o r y t o g r o w t h o f t h e seven s p e c i e s o f y e a s t s t e s t e d . A p o s s i b l e e x p l a n a t i o n i sg i v e n f o r t h e p r e v i o u s l y r e p o r t e d o b s e r v a t i o n t h a t h e a t i n g ( 3 m i n , 7 4 C ) o l i v e sp r i o r t o b r i n i n g r e n d e r s t h e m more f e r m e n t a b l e b y l a c t i c a c i d b a c t e r i a . R e s u l t s o fa b r i n i n g e x p e r i m e n t i n d i c a t e d t h a t o l e u r o p e i n i s d e g r a d e d t o a n t i b a c t e r i a lc o m p o u n d s when u n h e a t e d o l i v e s ar e b r i n e d .

P r e s e r v a t i o n o f g r e e n o l i v e s b y b r i n i n g , a c -c o r d i n g t o t h e S p a n i s h - t y p e p r o c e s s , d e p e n d s o na l a c t i c a c i d f e r m e n t a t i o n i n t h e b r i n e . F a i l u r et o d e v e l o p p r o p e r b r i n e a c i d i t y may r e s u l t i nv a r i o u s t y p e s o f s p o i l a g e ( 5 , 1 2 , 1 3 ) . E t c h e l l s e ta l . ( 5 ) f o u n d t h a t h e a t i n g o l i v e s p r i o r t o b r i n i n gr e s u l t e d i n a r a p i d a n d p r e d i c t a b l e b r i n e f e r -m e n t a t i o n b y p u r e c u l t u r e s o f l a c t i c a c i d b a c t e -r i a , w h e r e a s b r i n e s o f u n h e a t e d o l i v e s f a i l e d t od e v e l o p a n a c i d f e r m e n t a t i o n a n d y e a s t s w e r et h e p r e d o m i n a n t m i c r o f l o r a . T h e y s u g g e s t e dt h e p o s s i b i l i t y o f a h e a t - s e n s i t i v e a n t i b a c t e r i a lc o m p o u n d i n t h e o l i v e s . M o r e r e c e n t l y , B o r b o l l ay A l c a l A e t a l . ( 2 ) c o n f i r m e d t h a t h e a t i n g o l i v e sp r i o r t o b r i n i n g e n c o u r a g e s a n a c i d f e r m e n t a -t i o n .F l e m i n g a n d E t c h e l l s ( 6 ) f o u n d t h a t e x t r a c t so f f r oz e n g r e e n o l i v e s i n h i b i t e d l a c t i c a c i db a c t e r i a . L a t e r s t u d i e s s h o w e d t h a t f r e e z i n go l i v e s c a u s e d t h e f o r m a t i o n o f a h e a t - s t a b l e ,b i t t e r p h e n o l i c c o m p o u n d w h i c h w a s d e v o i d o fa c i d h y d r o l y z a b l e r e d u c i n g s u g a r a n d i n h i b i t e dl a c t i c a c i d b a c t e r i a ; u n f r o z e n o l i v e s d i d n o t c o n -

' P a p e r n o . 4 1 0 9 , J o u r n a l S e r i e s , N o r t h C a r o l i n a E x p e r i -m e n t a l S t a t i o n , R a l e i g h , N . C .

t a i n t h i s c o m p o u n d ( 7 ) . F o r m a t i o n o f t h e i n h i b -i t o r y c o m p o u n d i n f r o z e n o l i v e s w a s a c c o m -p a n i e d b y a d e c r e a s e i n t h e c o n t e n t o f o l e u r o -p e i n , t h e n a t u r a l , b i t t e r p h e n o l i c g l u c o s i d e i no l i v e s . T h i s d e c r e a s e , a n d t h e f a c t t h a t t h ec o m p o u n d f r o m f r o z e n o l i v e s w a s much m o r ei n h i b i t o r y t o l a c t i c a c i d b a c t e r i a t h a n w a so l e u r o p e i n , s u g g e s t e d t h a t t h e i n h i b i t o r m i g h tb e a d e g r a d a t i o n p r o d u c t o f o l e u r o p e i n , p o s s i b l yi t s a g l y c o n e .I t w a s p r o p o s e d t h a t t h e i m p r o v e d b r i n ef e r m e n t a t i o n r e s u l t i n g f r o m h e a t i n g o l i v e s w a sd u e t o i n a c t i v a t i o n o f a n i n h i b i t o r - f o r m i n g s y s -tem i n t h e o l i v e s ( 7 ) . R e s u l t s w h i c h f u r t h e rs u p p o r t t h i s t h e o r y h a v e b e e n p r e s e n t e d ( H . P .F l e m i n g , J . L . E t c h e l l s , T . A . B e l l , a n d W . M .W a l t e r , J r . , B a c t e r i o l . P r o c . , p . 2 , 1 9 7 0 ) .I n l a t e r s t u d i e s , J u v e n e t a l . ( 1 0 ) f o u n d t h a tt r e a t i n g o l i v e s w i t h h o t a l k a l i b e f o r e b r i n i n ge n h a n c e d s u b s e q u e n t f e r m e n t a t i o n . I n o t h e rw o r k , t h ey r e p o r t e d t h a t o l e u r o p e i n w a s i n h i b i -t o r y t o s e v e r a l b a c t e r i a , i n c l u d i n g c e r t a i n l a c t i ca c i d b a c t e r i a ( 9 ) . L a t e r , h o w e v e r , J u v e n a n dH e n i s ( 8 ) f o u n d t h a t t h e a g l y c o n e o f o l e u r o p e i n ,o b t a i n e d b y h y d r o l y s i s o f t h e g l u c o s i d e w i t hf l - g l u c o s i d a s e , was more i n h i b i t o r y t h a n o l e u r o -7 7 7

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F L E M I N G , W A L T E R , AN D ETCHELLSp e i n t o L a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m .Th e p r e s e n c e o f a n t i m i c r o b i a l c o m p o u n d s i no l i v e s h a s b e e n s u s p e c t e d f o r s o m e t i m e . D e -C a r o a n d L i g o r i ( 4 ) f o u n d t h a t t h e w a t e r s o l u -t i o n r e m a i n i n g a f t e r o i l w a s p r e s s e d f r o m o l i v e sc o n t a i n e d a s u b s t a n c e w h i c h w a s i n h i b i t o r y t os e v e r a l b a c t e r i a , m o s t o f w h i c h w e r e g r a mp o s i t i v e . R e c e n t l y , i t w a s r e p o r t e d t h a t s a l t s o fe l e n o l i c a c i d h a v e a n t i v i r a l p r o p e r t i e s ( 1 1 ) . T h i sa c i d i s a h y d r o l y s i s p r o d u c t o f o l e u r o p e i n ( 1 4 ) .The p r e s e n t w o r k w a s u n d e r t a k e n t o d e t e r -m i n e a n t i m i c r o b i a l p r o p e r t i e s o f p r o d u c t s r e -s u l t i n g f r o m t h e h y d r o l y s i s o f o l e u r o p e i n . As e c o n d o b j e c t i v e w a s t o d e t e r m i n e i f u n h e a t e d ,g r e e n M a n z a n i l l o v a r i e t y o l i v e s w o u l d r e l e a s ea n t i m i c r o b i a l c o m p o u n d s i n t o t h e c o v e r b r i n e .

MATERIALS AND METHODSC u l t u r e s . E n t e r o b a c t e r a e r o g e n e s , E . c l o a c a e , a n da l l o f t h e y e a s t c u l t u r e s u s e d i n t h i s s t u d y w e r eo b t a i n e d f r o m t h e N o r t h e r n R e g i o n a l R e s e a r c h L a b o -r a t o r y o f t h e U . S . D e p a r t m e n t o f A g r i c u l t u r e , P e o r i a ,I l l . T h e c u l t u r e s o f P s e u d o m o n a s , E r w i n i a , X a n -t h o m o n a s , a n d C o r y n e b a c t e r i u m w e r e o b t a i n e d f r o mC . E . M a i n , D e p a r t m e n t o f P l a n t P a t h o l o g y , N o r t hC a r o l i n a S t a t e U n i v e r s i t y ; t h e r e m a i n i n g c u l t u r e sw e r e f r o m c o l l e c t i o n s i n t h e D e p a r t m e n t o f F o o dS c i e n c e . T h e l a c t i c a c i d b a c t e r i a w e r e t h o s e u s e d i ne a r l i e r t e s t s w i t h i n h i b i t o r y e x t r a c t s f r o m f r o z e n o l i v e s( 6 ) .P r e p a r a t i o n o f c r u d e e x t r a c t s . An e t h y l a c e t a t ee x t r a c t o f o l e u r o p e i n w a s o b t a i n e d f r o m h e a t e d Man-z a n i l l o v a r i e t y o l i v e s a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 7 ) . Ap o r t i o n o f t h i s e x t r a c t w a s c o n c e n t r a t e d i n v a c u o t or e m o v e t h e e t h y l a c e t a t e , a n d t h e r e s i d u e w a s d i s -s o l v e d i n 2 N H 2 S O 4 . T h i s s o l u t i o n w a s h e a t e d f o r 1 ha t 1 0 0 C . T h e h y d r o l y s a t e w a s c o o l e d , a d j u s t e d t o pH6 w i t h NaOH, a n d e x t r a c t e d w i t h e t h y l a c e t a t e . T h ei n h i b i t o r y s u b s t a n c e w h i c h i s f o r m e d a s a r e s u l t o ff r e e z i n g o l i v e s w a s o b t a i n e d a s d e s c r i b e d e a r l i e r ( 7 ) ,e x c e p t t h a t c h l o r o f o r m w a s u s e d a s t h e e x t r a c t i n gs o l v e n t i n s t e a d o f e t h y l a c e t a t e . D r y w e i g h t s o f t h et h r e e c r u d e e x t r a c t s w e r e d e t e r m i n e d .T e s t i n g c r u d e e x t r a c t s a n d p u r e c o m p o u n d s f o ra n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y . O l e u r o p e i n , t h e a g l y c o n e o fo l e u r o p e i n , e l e n o l i c a c i d , f l - 3 , 4 - d i h y d r o x y p h e n y l e t h y la l c o h o l , a n d m e t h y l - o - m e t h y l e l e n o l a t e w e r e p r e p a r e d

a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 1 4 ) . S o l u t i o n s o f t h e s e p u r ec o m p o u n d s a s w e l l a s c r u d e e x t r a c t s f r o m o l i v e s w e r es c r e e n e d f o r a n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y b y t h e p a p e r d i s kb i o a s s a y m e t h o d u s e d p r e v i o u s l y ( 6 ) . A p p r o p r i a t ev o l u m e s o f t h e s o l u t i o n s w e r e p i p e t t e d o n t o 13-mmd i a m e t e r p a p e r d i s k s , t o g i v e d e s i r e d d r y w e i g h tq u a n t i t i e s . S o l v e n t s w e r e a l l ow e d t o e v a p o r a t e b e f o r et h e d i s k s w e r e p l a c e d o n t h e s e e d e d a g a r s u r f a c e .C o n t r o l d i s k s , t o w h i c h o n l y t h e c o r r e s p o n d i n g s o l v e n tw a s a d d e d a n d e v a p o r a t e d , d i d n o t e l i c i t i n h i b i t i o nz o n e s f o r a n y o f t h e m i c r o o r g a n i s m s t e s t e d . T h ep l a t i n g medium w a s s e e d e d w i t h o n e d r o p o f a 1 6 - hc u l t u r e o f t h e t e s t o r g a n i s m g r o w n i n c u c u m b e r j u i c eb r o t h . C u c u m b e r j u i c e a g a r ( 6 ) , pH 5 . 3 , a n d T r y p t i -

c a s e s o y a g a r ( B B L ) , pH 6 . 9 , w e r e u s e d a s a s s a ym e d i a . T h e b u f f e r c a p a c i t i e s o f t h e m e d i a w e r ed e t e r m i n e d t o b e s u f f i c i e n t t o p r e v e n t d r a s t i c c h a n g e si n pH ( l e s s t h a n 0 . 5 pH u n i t s ) o f t h e m e d i a u n d e r t h ed i s k s d u e t o e x t r a c t s o r p u r e c o m p o u n d s p r e s e n t o nt h e d i s k s a t t h e l e v e l s t e s t e d .O l e u r o p e i n a n d t h e p r o d u c t s o f i t s h y d r o l y s i s w e r et e s t e d f o r t h e i r e f f e c t s o n L . p l a n t a r u m c u l t u r e d i nc u c u m b e r j u i c e b r o t h w i t h ( p H 5 . 0 ) a n d w i t h o u t ( p H5 . 3 ) a d d e d N a C l . U n d i l u t e d c u c u m b e r j u i c e b r o t h ( 2m l ) w a s p l a c e d i n 1 2 - b y 1 2 0 - m m t u b e s . T h e t u b e sw e r e c a p p e d a n d a u t o c l a v e d a t 1 2 1 C f o r 1 0 m i n .S o l u t i o n s o f t h e t e s t c o m p o u n d s ( 1 m g / m l ) i n 5%( v o l / v o l ) e t h y l a l c o h o l w e r e s t e r i l i z e d b y f i l t r a t i o nt h r o u g h 0 . 2 - , u m p o r e , a l p h a - 8 M et r i c e l m e m b r a n ef i l t e r s ( G e l m a n I n s t r u m e n t C o . ) a n d w e r e a d d e da s e p t i c a l l y t o t h e t u b e s o f s t e r i l e b r o t h . S t e r i l e w a t e ra n d 5% e t h y l a l c o h o l w e r e a d d e d t o a p p r o p r i a t e t u b e ss o t h a t t h e f i n a l v o l u m e w a s 4 m l a n d t h e c o n c e n t r a -t i o n o f e t h y l a l c o h o l w a s 1% ( v o l / v o l ) i n a l l t u b e s . T h e

pH o f t h e s o l u t i o n s a f t e r a d d i t i o n o f t h e t e s t c o m -p o u n d s w a s w i t h i n 0 . 2 pH u n i t o f t h e c o n t r o l b r o t h s .T h e t u b e s w e r e i n o c u l a t e d w i t h o n e d r o p o f a 1 6 - hc u l t u r e o f L . p l a n t a r u m g r o w n i n c u c u m b e r j u i c eb r o t h a n d w e r e i n c u b a t e d a t 3 0 C . G r o w t h o f L .p l a n t a r u m i n t h e b r o t h w a s e s t i m a t e d b y d e t e r m i n i n go p t i c a l d e n s i t i e s a t 6 5 0 n m w i t h a L u m e t r o n c o l o r i m e -t e r .B r i n i n g o f o l i v e s . W h o l e , g r e e n M a n z a n i l l o v a r i e t yo l i v e s w e r e w a s h e d i n c o l d t a p w a t e r , a n d s o m e w e r es u b j e c t e d t o h e a t i n g a n d o t h e r s t o f r e e z i n g t r e a t -m e n t s . F o r h e a t i n g , o l i v e s w e r e i m m e r s e d i n 7 4 Cw a t e r f o r 3 m i n ( 5 ) a n d t h e n c o o l e d i n t a p w a t e r . F o rf r e e z i n g , o l i v e s w e r e h e l d i n p l a s t i c b a g s o v e r n i g h t a t- 1 8 C . T h e y w e r e t h a w e d p r i o r t o b r i n i n g . A p o r t i o no f o l i v e s w a s n e i t h e r h e a t e d n o r f r o z e n a n d s e r v e d a s ac o n t r o l .B e c a u s e t h e i n h i b i t o r y s u b s t a n c e i s s e n s i t i v e t oa l k a l i ( 6 ) , t h e o l i v e s w e r e n o t a l k a l i t r e a t e d a s i sn o r m a l i n t h e S p a n i s h - t y p e b r i n i n g p r o c e s s ( 5 ) . T h ea l k a l i t r e a t m e n t , i n a d d i t i o n t o d e s t r o y i n g t h e b i t t e rp r i n c i p l e , a l s o p r o b a b l y a l t e r s t h e w a x y c o a t i n g o f t h ef r u i t w h i c h c a u s e s g r e a t e r p e r m e a b i l i t y ( 1 0 ) . I n t h ep r e s e n t w o r k t h e o l i v e s w e r e p i e r c e d t o i n s u r e r e l e a s eo f n u t r i e n t s , f o r m i c r o b i a l g r o w t h , f r o m t h e o l i v e s i n t ot h e b r i n e . A f t e r h e a t i n g o r f r e e z i n g t r e a t m e n t s , t h eo l i v e s w e r e p i e r c e d b y r o l l i n g t h e m o v e r a b e d o fh y p o d e r m i c n e e d l e s s p a c e d 1 0 mm a p a r t a n d p r o j e c t -i n g 5 mm a b o v e t h e r e t a i n i n g p l a t e .O n e - q u a r t ( 0 . 9 4 6 - l i t e r ) g l a s s j a r s w e r e p a c k e d w i t h4 7 5 g o f o l i v e s a n d 5 0 0 m l o f c o l d , s t e r i l i z e d 1 1 . 4 %N a C l ( w t / v o l ) . O l i v e s w e r e h e l d b e l o w t h e s u r f a c e o ft h e b r i n e b y p l a s t i c n e t t i n g ( 5 ) . T h e j a r s w e r e c l o s e dw i t h 70-mm d i a m e t e r , s i x - l u g , " t w i s t - o f f ' c a p s( W h i t e C a p C o . , C h i c a g o , I l l . ) a n d h e l d a t 3 C f o r 3d a y s t o a l l o w f o r e q u i l i b r a t i o n o f N a C l w i t h t h em o i s t u r e c o n t e n t o f t h e o l i v e s a n d t o p e r m i t d i f f u s i o no f n u t r i e n t s i n t o t h e b r i n e . A l l j a r s w e r e i n o c u l a t e dw i t h 1 0 m l o f a n 1 8 - h c u l t u r e o f L . p l a n t a r u m t h a t w a sg r o w n i n c u c u m b e r j u i c e b r o t h c o n t a i n i n g 4% N a C l .T h e j a r s w e r e l o o s e l y c a p p e d a n d i n c u b a t e d a t 3 0 Cf o r 1 7 d a y s .A n a l y s e s o f f e r m e n t a t i o n b r i n e s . A s s a y m e t h o d s

7 7 8 A P P L . M I C R O B I O L .

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ANTIMICROBIAL P RO P E RTIES O F OLEUROPEINf o r d e t e r m i n i n g t h e p H , t i t r a t a b l e a c i d i t y ( c a l c u l a t e das l a c t i c a c i d ) , a n d r e d u c i n g sugars i n b r i n e s h a v eb e e n d e s c r i b e d ( 5 ) .T h e a n t i m i c r o b i a l c o m p o u n d ( s ) i n o l i v e b r i n e sr e a d i l y p a r t i t i o n e d i n t o c h l o r o f o r m or e t h y l a c e t a t e ;o l e u r o p e i n p a r t i t i o n e d o n l y i n t o e t h y l a c e t a t e . T h e r e -f o r e , f o r d e t e c t i o n o f a n t i m i c r o b i a l c o m p o u n d s , 1 0 m lo f b r i n e f r o m e a c h j a r was e x t r a c t e d w i t h 5 0 m l o fc h l o r o f o r m . F i v e m i l l i l i t e r s o f t h e e x t r a c t was r e s e r v e df o r d e t e r m i n a t i o n o f u l t r a v i o l e t a b s o r p t i o n a t 2 2 4 nmw i t h a C a r y m o d e l 1 5 s p e c t r o p h o t o m e t e r , a n d t h er e m a i n d e r was c o n c e n t r a t e d i n vacuo t o 1 m l . T h i sc o n c e n t r a t e was b i o a s s a y e d b y t h e paper d i s k m e t h o db y u s i n g L e u c o n o s t o c m e s e n t e r o i d e s 4 2 as t h e t e s to r g a n i s m ( 6 ) . A n o t h e r 5 0 m l o f b r i n e was e x t r a c t e dw i t h 5 0 m l o f e t h y l a c e t a t e . T h i s e x t r a c t , w h i c h

c o n t a i n e d o l e u r o p e i n as w e l l as t h e a n t i m i c r o b i a lc o m p o u n d s , was d r i e d over Na2SO4 a n d t h e n co n ce n -t r a t e d t o 1 0 ml.Th e c o n c e n t r a t e d c h l o r o f o r m and e t h y l a c e t a t ee x t r a c t s were a n a l y z e d b y t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y( T L C ) b y u s i n g s o l v e n t s a n d p r o c e d u r e s d e s c r i b e de a r l i e r ( 7 ) .

RESULTSS c r e e n i n g o f m i c r o o r g a n i s m s f o r s e n s i t i v -i t y t o c r u d e e x t r a c t s . T a b l e 1 s h o w s r e s u l t s o fi n i t i a l s c r e e n i n g t e s t s t o d e t e r m i n e , q u a l i t a -t i v e l y , t h e s e n s i t i v i t y o f s e l e c t e d s p e c i e s o f b a c -t e r i a a n d y e a s t s t o o l i v e e x t r a c t s . T h e o l e u r o -p e i n e x t r a c t i n h i b i t e d g r o w t h o f B a c i l l u s s u b -

T A B L E 1 . A n t i m i c r o b i a l s p e c t r u m o f e x t r a c t s f r o m o l i v e s b y p a p e r d i s k b i o a s s a y aZ o n e o f i n h i b i t i o n (mm d i a m )

E x t r a c t c o n t a i n i n g A c i d h y d r o l y s a t e o f E x t r a c t o f f r o z e no l e u r o p e i n o l e u r o p e i n o l i v e sCJ A TSA CJ A TSA CJ A TSA

B a c t e r i aL a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m W SO - 1 4 2 2L . b r e v i s 5 0 - 1 5 2 6P e d i o c o c c u s c e r e v i s i a e 3 9 - 1 9 2 5L e u c o n o s t o c m e s en t e r o i d e s 4 2 - 2 5 3 2S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s 2 6 - 4 7 - 5 2 1 6B a c i l l u s s u b t i l i s N G 3 8 b NG 1 4 b NG 1 8E n t e r o b a c t e r a e r o g e n e s NRRL _- - -B - 1 9 9E . c l o a c a e NRRL B - 4 1 4 _- - -E s c h e r i c h i a c o l i - - - _ 1 5 -S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m - - 1 5 _ 1 6 -P s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s - - - - 1 5 -P . s o l a n a c e a r u m 1 7 1 6 2 1 1 8 1 8 -P . l a c h r y m a n s - - 1 4 - 1 7 -E r w i n i a c a r o t o v o r a _ _ 1 7 1 6 -E . t r a c h e i p h i l a _ _ - _ 1 4X a n t h o m o n a s v e s i c a t o r i a _ _ 2 4 3 2 -C o r y n e b a c t e r i u m m i c h i g a n e s e N G _ - _ N G 1 6Y e a s t sS a c c h a r o m y c e s r o s e i NRRL Y - 1 5 6 7 - _S . c e r e v i s i a e v a r . e l l i p s o i d e u s - -

NRRL Y - 6 3 5H a n s e n u l a s u b p e l l i c u l o s a NRRL - _Y - 1 0 9 6K l o e c k e r a a p i c u l a t a NRRL Y - 1 3 8 0 - _D e b a r y o m y c e s m e m b r a n a e f a c i e n s - _NRRL Y - 1 4 5 5P i c h i a m e m b r a n a e f a c i e n s NRRL - _Y - 1 6 2 7C a n d i d a k r u s e i NRRL Y - 1 0 5 - _a L a c t i c a c i d b a c t e r i a a n d y e a s t s w e r e t e s t e d i n c u c u m b e r j u i c e a g a r ( C J A , pH 5 . 3 ) . Th e r e m a i n i n g b a c t e r i aw e r e t e s t e d i n T r y p t i c a s e s o y a g a r ( T S A , pH 6 . 9 ) a s w e l l a s C J A . A "- " i n d i c a t e s n o z o n e o f i n h i b i t i o n ; NGi n d i c a t e s t h a t t h e b a c t e r i a d i d n o t g r o w i n t h e m e d i u m . T h e a m o u n t s o f e x t r a c t s , d r y w e i g h t , a p p l i e d t o e a c h1 3 - m m - d i a m e t e r d i s k w e r e : o l e u r o p e i n , 1 0 m g ; o l e u r o p e i n h y d r o l y s a t e , 7 . 5 m g ; e x t r a c t o f f r o z e n o l i v e s , 3 . 5 m g .b Th e z o n e o f i n h i b i t i o n r e m a i n e d c l e a r f o r s e v e r a l d a y s , b u t t h e n g r o w t h o f t h e c u l t u r e b e g a n i n t h i s r e g i o n .

7 7 9O L . 2 6 , 1 9 7 3

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FLEMING, WALTER, AN D ETCHELLSt i l i s , S t a p h y l o c o c c u s aureus, and P s e u d o m o n a ss o l a n a c e a r u m . The e x t r a c t f r o m a c i d h y d r o l y s i so f o l e u r o p e i n was i n h i b i t o r y t o g r o w t h o f a l lg r a m - p o s i t i v e b a c t e r i a t e s t e d , i n c l u d i n g f o u rs p e c i e s o f l a c t i c a c i d b a c t e r i a , B . s u b t i l i s , a n dS . aureus. T h e h y d r o l y s i s e x t r a c t a l s o i n h i b i t e d5 o f 1 1 g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a . The e x t r a c tf r o m f r o z e n o l i v e s was i n h i b i t o r y t o t h e sameb a c t e r i a as t h e o l e u r o p e i n h y d r o l y s i s e x t r a c ta n d a l s o i n h i b i t e d t h r e e o t h e r s p e c i e s . Theseven s p e c i e s o f y e a s t s t e s t e d we r e n o t i n h i b i t e db y an y o f t h e t h r e e e x t r a c t s .S e n s i t i v i t y o f l a c t i c a c i d b a c t e r i a t o o l e u r o -p e i n and p r o d u c t s o f i t s h y d r o l y s i s . Th e a g l y -c o n e o f o l e u r o p e i n a n d e l e n o l i c a c i d i n h i b i t e dg r o w t h o f a l l f o u r s p e c i e s o f l a c t i c a c i d b a c t e r i at e s t e d q u a l i t a t i v e l y b y paper d i s k b i o a s s a y( T a b l e 2 ) . Z o n e s o f i n h i b i t i o n r e m a i n e d c l e a rd u r i n g e x t e n d e d i n c u b a t i o n . O l e u r o p e i n , , 3 - 3 , 4 -d i h y d r o x y p h e n y l e t h y l a l c o h o l , a n d m e t h y l - o -m e t h y l e l e n o l a t e s h o w e d no i n h i b i t o r y a c t i o nf o r an y o f t h e s e b a c t e r i a a t 1 mg o f c o m p o u n dper d i s k .The a b o v e f i v e c o m p o u n d s were t e s t e d f o rt h e i r e f f e c t s on g r o w t h o f L . p l a n t a r u m i n b r o t hc u l t u r e w i t h o u t a d d e d NaCl ( F i g . 1 A ) . E l e n o l i ca c i d a n d t h e a g l y c o n e o f o l e u r o p e i n a t 1 0 0 , g / m lc a u s e d a b o u t 1 1 - and 6 - h d e l a y s , r e s p e c t i v e l y ,i n t h e o n s e t o f g r o w t h ; t h e r e a f t e r , t h e g r o w t hr a t e a p p r o a c h e d t h a t o f t h e c o n t r o l , ev e n when2 0 0 , g g / m l l e v e l s o f t h e s e c o m p o u n d s were p r e s -e n t . O l e u r o p e i n , f l - 3 , 4 - d i h y d r o x y p h e n y l e t h y l a l -c o h o l , and m e t h y l - o - m e t h y l e l e n o l a t e were n o ti n h i b i t o r y t o g r o w t h a t 2 0 0 A t g / m l . W h e n 5%NaCl was a d d e d t o t h e cucumber j u i c e b r o t h ,1 0 0 g g o f e i t h e r t h e a g l y c o n e o r e l e n o l i c a c i dpe r ml d e l a y e d g r o w t h , as n o t e d b y t u r b i d i t y , o fL . p l a n t a r u m f o r a b o u t 3 d a y s , a n d t h e r a t e wasr e d u c e d when g r o w t h f i n a l l y b e g a n ( F i g . 1 B ) .G r o w t h was c o m p l e t e l y i n h i b i t e d b y 1 5 0 g g o rmore o f e i t h e r o f t h e s e two c o m p o u n d s pe r ml

w h e n NaCl was p r e s e n t ( T a b l e 3 ) . A g a i n , t h eo t h e r t h r e e c o m p o u n d s were n o t i n h i b i t o r y .P r e s e n c e o f a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y i n t h eb r i n e s o f o l i v e s . O l i v e s t h a t were h e a t e d b e f o r eb r i n i n g u n d e r w e n t a c i d f e r m e n t a t i o n ; 0 . 8 5 %t i t r a t a b l e b r i n e a c i d i t y was r e a c h e d a f t e r 1 7d a y s ( T a b l e 4 ) . A s i m i l a r l e v e l o f a c i d i t y wasr e a c h e d w h e n t h e o l i v e s were h e a t e d p r i o r t of r e e z i n g . T h e p r e d o m i n a n t m i c r o b i a l f l o r a i nb o t h cases wer e r o d - s h a p e d b a c t e r i a t y p i c a l o f

0 . 3

0 . 2Ec 0 . 10I n0I-

V I 0 . 5zosi a m0-i 0 . 42n0 . 2

0 . 1

( B )5% N a C I

p I

( A )NO NaCI

INCUBATION TIME, d o y sF I G . 1 . E f f e c t o f o l e u r o p e i n a n d p r o d u c t s o f i t sh y d r o l y s i s o n g r o w t h o f L . p l a n t a r u m . T h e g r o w t hmedium was c u c u m b e r j u i c e b r o t h , w i t h a n d w i t h o u tN a C I , a n d c o n t a i n e d 1 0 0 p g o f t h e t e s t c o m p o u n d s perm l . S y m b o l s : U, o l e u r o p e i n ; 0, t h e a g l y c o n e ; A ,e l e n o l i c a c i d ; 0, 6 - 3 , 4 - d i h y d r o x y p h e n y l e t h y l a l c o h o l ;A, m e t h y l - o - m e t h y l e l e n o l a t e ; a n d 0, t h e c o n t r o l .P a n e l A , No N a C I ; p a n e l B , 5% N a C l .

T A B L E 2 . I n h i b i t i o n o f l a c t i c a c i d b a c t e r i a b y h y d r o l y s i s p r o d u c t s o f o l e u r o p e i n a s i n d i c a t e d b y p a p e r d i s kb i o a s s a y a

Z o n e o f i n h i b i t i o n (mm d i a m )B a c t e r i a Agyoe ff- 3 ,4 - d i h y - M e t h y l - o -O l e u r o p e i n A l e y u r o p e i f E l e n o l i c a c i d d r o x y p h e n y l - m e t h y le t h y l a l c o h o l e l e n o l a t e

L a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m 1 5 2 1P e d i o c o c c u s c e r e v i s i a e _ 1 6 2 6 _L a c t o b a c i l l u s b r e v i s 1 6 2 6 _L e u c o n o s t o c m e s e n t e r o i d e s 1 8 3 1 -a T e s t s w e r e made b y p l a c e m e n t o f 1 3 - m m - d i a m e t e r d i s k s c o n t a i n i n g 1 mg o f t h e t e s t c o m p o u n d s o n s e e d e dc u c u m b e r j u i c e a g a r p l a t e s . A "- " i n d i c a t e s n o z o n e o f i n h i b i t i o n .

7 8 0 A P P L . M I C R O B I O L .

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ANTIMICROBIAL PROPERTIES O F O L EUR OPEINt h e L . p l a n t a r u m c u l t u r e u s e d f o r i n o c u l a t i o n .I n h i b i t o r y a c t i v i t y w a s n o t d e t e c t e d i n e x t r a c t so f e i t h e r o f t h e s e b r i n e s . TLC a n a l y s i s o f e t h y la c e t a t e e x t r a c t s o f t h e s e b r i n e s r e v e a l e d t h a to l e u r o p e i n w a s t h e m a j o r p h e n o l i c c o m p o u n d

T A B L E 3 . E f f e c t o f o l e u r o p e i n a n d p r o d u c t s o f i t sh y d r o l y s i s o n i n h i b i t i o n o f L a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m i nb r o t h c u l t u r eI n h i b i t i o n o f g r o w t h sC o m p o u n d 5 0 1 0 0 1 5 0 ' 2 0 0 '

O l e u r o p e i n N D - ND -A g l y c o n e o f o l e u r o p e i n _ C _ C + +E l e n o l i c a c i d - c _ c + +f l - 3 , 4 - d i h y d r o x y p h e n y l - - _ _e t h y l a l c o h o lM e t h y l - o - m e t h y l e l e n o - _ -l a t ea T e s t s w e r e made i n c u c u m b e r j u i c e b r o t h c o n t a i n -i n g 5% s o d i u m c h l o r i d e . A " +" i n d i c a t e s i n h i b i t i o n o fg r o w t h a n d a "- " i n d i c a t e s n o i n h i b i t i o n , a s d e t e r -m i n e d b y o p t i c a l d e n s i t y m e a s u r e m e n t s d u r i n g t h e8 - d a y i n c u b a t i o n p e r i o d a t 3 0 C . N D , N o t d e t e r -m i n e d .' L e v e l o f c o m p o u n d ( , g g / m l ) .c G r o w t h w a s d e l a y e d f o r 2 4 h o r l e s s a t 5 0 u g / m la n d f o r 3 t o 4 d a y s a t 1 0 0 j i g / m l .

p r e s e n t ; o n l y t r a c e s o f o t h e r p h e n o l i c com-p o u n d s were d e t e c t e d .B r i n e s o f f r e s h u n h e a t e d o l i v e s , h o w e v e r , d i dn o t d e v e l o p a p p r ec i a b l e a c i d i t y d u r i n g i n c u b a -t i o n ( T a b l e 4 ) . Th e s m a l l amount o f a c i d i t y i nt h e s e b r i n e s p r o b a b l y was d u e t o t h e n a t u r a la c i d s w h i c h d i f f u s e d f r o m t h e o l i v e t i s s u e .R e s u l t s were s i m i l a r w i t h o l i v e s t h a t h a d b e e nf r o z e n , w h e t h e r o r n o t t h e y wer e h e a t e d a f t e rf r e e z i n g . C h l o r o f o r m e x t r a c t s o f t h e s e b r i n e sp o s s e s s e d a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y a n d h a d com-p a r a t i v e l y h i g h u l t r a v i o l e t a b s o r p t i o n a t 2 2 4nm, w h i c h i s t h e a b s o r p t i o n r e g i o n o f t h eo l e u r o p e i n a g l y c o n e ( 1 4 ) . The l e v e l o f o l e u r o -p e i n was n e g l i g i b l e i n e t h y l a c e t a t e e x t r a c t s o ft h e s e b r i n e s . C h l o r o f o r m e x t r a c t s o f t h e b r i n ec o n t a i n e d t w o p h e n o l i c c o m p o u n d s w i t h R a g l yv a l u e s ( R . v a l u e s r e l a t i v e t o t h a t o f t h e a g l y -c o n e ) o f 0 . 8 8 a n d 1 . 0 8 . T h e s e two c o m p o u n d swere n o t d e t e c t e d i n b r i n e s w h i c h u n d e r w e n t ana c i d f e r m e nt a t i o n.H e a t i n g o l i v e s a t 7 4 C f o r 3 m i n a f t e r t h e yh a d b e e n f r o z e n a n d t h a w e d d i d n o t r e n d e rthem f e r m e n t a b l e ( T a b l e 4 ) , d e m o n s t r a t i n gt h a t t h e a n t i b a c t e r i a l s u b s t a n c e f o r m e d b yf r e e z i n g was n o t s i g n i f i c a n t l y d e s t r o y e d . T h i sf a c t seems i m p o r t a n t , as i t was s u g g e s t e d e a r l i e r( 5 ) t h a t t h e e f f e c t o f h e a t i n r e n d e r i n g o l i v e s

T A B L E 4 . E f f e c t s o f h e a t i n g a n d f r e e z i n g o l i v e s p r i o r t o b r i n i n g o n f e r m e n t a t i o n a n d p r e s e n c e o f a n t i m i c r o b i a la c t i v i t y i n t h e c o v e r b r i n e

B r i n e a n a l y s e s ' M i c r o s c o p eO l i v e t r e a t m e n t s P r e s e n c e o f A2 Oluoen A p p e a r a n c e e x a m i n a -p r i o r t o b r i n i n g | A c i d i t y pH a n t i b a c t e - | e r o e l i o f b r i n e | brier i a l c o u n s e x t r a c t a m o u n t 'F r e s h 0 . 2 4 4 . 5 + 3 . 7 N e g l i g i b l e S l i g h t l y t u r b i d , Many y e a s t s , v e r yl i g h t b r o w n f e w b a c t e r i aH e a t e d 0 . 8 5 3 . 5 _ 2 . 1 L a r g e V e r y t u r b i d , Many r o d - s h a p e db r i g h t y e l l o w b a c t e r i a , v e r yf e w y e a s t sF r o z e n 0 . 2 2 4 . 6 + 5 . 1 N e g l i g i b l e C l e a r , d a r k A f e w y e a s t s , v e r yb r o w n f e w b a c t e r i aH e a t e d a n d t h e n 0 . 8 7 3 . 4 _ 1 . 9 L a r g e V e r y t u r b i d , Many r o d - s h a p e df r o z e n b r i g h t y e l l o w b a c t e r i a , a f e w

y e a s t sF r o z e n a n d t h e n 0 . 2 2 4 . 5 + 4 . 5 N e g l i g i b l e C l e a r , d a r k A f e w y e a s t s , v e r yt h a w e d a n d b r o w n f e w b a c t e r i ah e a t e d Ia S e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s f o r e x p l a n a t i o n o f t h e a b o v e t r e a t m e n t s . A f t e r e q u i l i b r a t i o n o f t h e o l i v e s a n dc o v e r b r i n e , a n d p r i o r t o i n o c u l a t i o n , t h e b r i n e s c o n t a i n e d a p p r o x i m a t e l y 7 . 4 % N a C l , 0 . 1 % a c i d i t y , a n d 0 . 8 %r e d u c i n g s u g a r , a n d w e r e pH 4 . 5 t o 4 . 9 .' A n a l y s e s w e r e made a f t e r i n c u b a t i o n f o r 1 7 d a y s a t 3 0 C .c D e t e r m i n e d b y p a p e r d i s k b i o a s s a y o f a c h l o r o f o r m e x t r a c t o f t h e b r i n e a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n dM e t h o d s . A "+" i n d i c a t e s a z o n e o f i n h i b i t i o n , a i n d i c a t e s n o z o n e .' D e t e r m i n e d b y a n a l y t i c a l T L C .

7 8 1O L . 2 6 , 1 9 7 3

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FLEMING, WALTER, AN D ETCHELLSmore f e r m e n t a b l e m i g h t b e d u e t o d e s t r u c t i o no f i n h i b i t o r y c o m p o u n d s .

DISCUSSIONO l e u r o p e i n , a t l e v e l s u p t o 2 0 0 A g / m l i n b r o t h

c u l t u r e , w a s n o t i n h i b i t o r y t o g r o w t h o f s p e c i e so f l a c t i c a c i d b a c t e r i a i n v o l v e d i n t h e f e r m e n t a -t i o n o f b r i n e d o l i v e s b u t d i d i n h i b i t some o t h e rs p e c i e s o f b a c t e r i a . E l e n o l i c a c i d a n d t h e a g l y -c o n e o f o l e u r o p e i n w e r e i n h i b i t o r y t o g r o w t h o fl a c t i c a c i d b a c t e r i a , p a r t i c u l a r l y w h e n t h eg r o w t h medium c o n t a i n e d 5% N a C l . Th e a g l y -c o n e i s c o m p o s e d o f e l e n o l i c a c i d b o u n d t h r o u g ha n e s t e r l i n k a g e t o f l - 3 , 4 - d i h y d r o x y p h e n y l e t h y la l c o h o l ( 1 4 ) . S i n c e t h e a l c o h o l w a s n o t i n h i b i -t o r y , e l e n o l i c a c i d a p p e a r s t o b e t h e i n h i b i t o r ym o i e t y o f t h e a g l y c o n e .J u v e n a n d H e n i s ( 8 ) r e p o r t e d t h a t r e d u c i n gt h e a m o u n t o f y e a s t e x t r a c t i n t h e i r t e s t m e -d i u m , APT b r o t h , r e s u l t e d i n i nh i b i t i o n o fg r o w t h o f L . p l a n t a r u m b y o l e u r o p e i n . O l e u r o -p e i n w a s n o t i n h i b i t o r y w h e n 0 . 5 % y e a s t e x t r a c tw a s p r e s e n t . T h e y s u g g e s t e d t h a t n u t r i e n t d e f i -c i e n c i e s i n t h e medium c a u s e d o l e u r o p e i n t o b ei n h i b i t o r y . T e s t m e d i a u s e d i n o u r s t u d i e s ,i n c l u d i n g o l i v e b r i n e s w h i c h c o n t a i n e d o l e u r o -p e i n , a p p a r e n t l y w e r e n o t n u t r i e n t d e f i c i e n t , a st h i s c o m p o u n d d i d n o t i n h i b i t l a c t i c a c i d b a c t e -r i a .N e i t h e r o l e u r o p e i n n o r p r o d u c t s o f i t s h y -d r o l y s i s w e r e i n h i b i t o r y t o t h e y e a s t s p e c i e st e s t e d . T h e t o l e r a n c e o f y e a s t s t o t h e s e c o m -p o u n d s m i g h t e x p l a i n w h y y e a s t s p r e d o m i n a t e di n b r i n e s o f u n h e a t e d o l i v e s w h i c h d i d n o tu n d e r g o l a c t i c a c i d f e r m e n t a t i o n ( 5 ) . O t h e rr e p o r t s a l s o i n d i c a t e t h a t y e a s t s a r e m o r et o l e r a n t t o o l i v e c o n s t i t u e n t s t h a n b a c t e r i a ( 1 ,4 , 9 ) .S i n c e i t w a s f i r s t d i s c o v e r e d t h a t a m i l d h e a tt r e a t m e n t o f g r e e n o l i v e s made b r i n e d o l i v e sm o r e f e r m e n t a b l e b y l a c t i c a c i d b a c t e r i a ( 5 ) , am e c h a n i s m h a s b e e n s o u g h t t o e x p l a i n t h ep h e n o m e n o n . W e t h e o r i z e , o n t h e b a s i s o fp r e s e n t i n f o r m a t i o n , t h a t g r e e n o l i v e s h a v e a ne n z y m a t i c s y s t e m w h i c h , w h e n t h e o l i v e s a r eb r i n e d , c a u s e s t h e h y d r o l y s i s o f o l e u r o p e i n t o i t sa g l y c o n e , a n a n t i b a c t e r i a l c o m p o u n d . T h e a g l y -c o n e o r o l e u r o p e i n may b e d e g r a d e d t o y i e l de l e n o l i c a c i d , a c o m p o u n d w h i c h a l s o i s a n t i b a c -t e r i a l . O l e u r o p e i n w a s p r e s e n t i n b r i n e s o fh e a t e d o l i v e s , w h e r e a s t h e a g l y c o n e o f o l e u r o -p e i n w a s n o t . L a c t i c a c i d b a c t e r i a r e a d i l y g r e wa n d p r o d u c e d a c i d i n b r i n e s o f h e a t e d o l i v e s ,f u r t h e r s u b s t a n t i a t i n g t h e n o n i n h i b i t o r y p r o p -e r t y o f o l e u r o p e i n t o t h e s e b a c t e r i a .W a l t e r e t a l . ( 1 4 ) r e p o r t e d a y i e l d o f 0 . 4 % o fp u r i f i e d o l e u r o p e i n i s o l a t e d f r o m p i t t e d Man-z a n i l l o o l i v e 8 . T h e a c t u a l o l e u r o p e i n c o n t e n t i nt h e o l i v e t i s s u e w a s h i g h e r t h a n 0 . 4 % b e c a u s e

s o m e w a s l o s t d u r i n g p u r i f i c a t i o n . A 0 . 4 % c o n -c e n t r a t i o n o f o l e u r o p e i n i n t h e o l i v e s t h e o r e t i -c a l l y w o u l d y i e l d a b o u t 2 , 7 0 0 , g o f a g l y c o n e p e rg o f o l i v e f l e s h . T h i s c o n c e n t r a t i o n i s muchh i g h e r t h a n w o u l d b e n e e d e d t o i n h i b i t l a c t i ca c i d b a c t e r i a i n t h e b r i n e ; o n l y 1 5 0 , u g o f t h ea g l y c o n e o r e l e n o l i c a c i d p e r m l w a s s u f f i c i e n t t oc o m p l e t e l y i n h i b i t g r o w t h o f L . p l a n t a r u m w h e nt h e medium c o n t a i n e d 5% N a C l .C r u e s s a n d A l s b e r g ( 3 ) s u g g e s t e d t h a t o l i v e sc o n t a i n , - g l u c o s i d a s e , w h i c h h y d r o l y z e d o l e u r o -p e i n w h e n o l i v e s w e r e f r o z e n w h i l e s t i l l o n t h et r e e . T h i s e n z y m e m i g h t h y d r o l y z e o l e u r o p e i nt o i t s a g l y c o n e w h e n u n h e a t e d o l i v e s a r e b r i n e d .

A C K N O W L E D G M E N T SW e t h a n k J . R . W e b s t e r o f t h e L i n d s a y R i p e O l i v e C o . ,L i n d s a y , C a l i f . , f o r a s s i s t a n c e i n o b t a i n in g t h e o l i v e s u s e d i nt h i s w o r k .T h i s r e s e a r c h w a s s u p p o r t e d b y a g r a n t f r o m P i c k l eP a c k e r s I n t e r n a t i o n a l , I n c . , S t . C h a r l e s , I l l .

LITERATURE CITED1 . B a l a t s o u r a s , G . D . 1 9 6 6 . T h e c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f t h eb r i n e o f s t o r e d G r e e k b l a c k o l i v e s . G r a s a s A c e i t e s .1 7 : 8 3 - 8 8 .2 . B o r b o l l a y A l c a l a , J . M . R . d e l a , F . G o n z A l e z P e l i s s 6 , a n dF . G o n z A l e s C a n c h o . 1 9 7 1 . A c e i t u n a s v e r d e s y d e c o l o rc a m b i a n t e e n s a l m u e r a . I . G r a s a s A c e i t e s 2 2 : 4 5 5 - 4 6 0 .3 . C r u e s s , W . V . , a n d C . L . A l s b e r g . 1 9 3 4 . T h e b i t t e rg l u c o s i d e o f t h e o l i v e . J . A m e r . C h e m . S o c .5 6 : 2 1 1 5 - 2 1 1 7 .4 . D e C a r o , M . , a n d M . G . L i g o r i . 1 9 5 9 . A t t i v i t a a n t i b i o t i c sd i u n e s t r a t t o d e s u n t o d a l l e a c q u e d i v e g e t a z i o n e d e l l e

o l i v e . R e n d . I s t . S u p e r . S a n i t a ( I t a l . E d . ) . 2 2 : 2 2 3 - 2 4 3 .5 . E t c h e l l s , J . L . , A . F . B o r g , I . D . K i t t e l , T . A . B e l l , a n d H .P . F l e m i n g . 1 9 6 6 . P u r e c u l t u r e f e r m e n t a t i o n o f g r e e no l i v e s . A p p l . M i c r o b i o l . 1 4 : 1 0 2 7 - 1 0 4 1 .6 . F l e m i n g , H . P . , a n d J . L . E t c h e l l s . 1 9 6 7 . O c c u r r e n c e o f a ni n h i b i t o r o f l a c t i c a c i d b a c t e r i a i n g r e e n o l i v e s . A p p l .M i c r o b i o l . 1 5 : 1 1 7 8 - 1 1 8 4 .7 . F l e m i n g , H . P . , W . M . W a l t e r , J r . , a n d J . L . E t c h e l l s .1 9 6 9 . I s o l a t i o n o f a b a c t e r i a l i n h i b i t o r , f r o m g r e e no l i v e s . A p p l . M i c r o b i o l . 1 8 : 8 5 6 - 8 6 0 .8 . J u v e n , B . , a n d Y . H e n i s . 1 9 7 0 . S t u d i e s o n t h e a n t i m i -c r o b i a l a c t i v i t y o f o l i v e p h e n o l i c c o m p o u n d s . J . A p p l .B a c t e r i o l . 3 3 : 7 2 1 - 7 3 2 .9 . J u v e n , B . , Z . S a m i s h , a n d Y . H e n i s . 1 9 6 8 . I d e n t i f i c a t i o no f o l e u r o p e i n a s a n a t u r a l i n h i b i t o r o f l a c t i c f e r m e n t a -t i o n o f g r e e n o l i v e s . I s . J . A g r . R e s . 1 8 : 1 3 7 - 1 3 8 .1 0 . J u v e n , B . , Z . S a m i s h , Y . H e n i s , a n d B . J a c o b y . 1 9 6 8 .M e c h a n i s m o f e n h a n c e m e n t o f l a c t i c a c i d f e r m e n t a t i o no f g r e e n o l i v e s b y a l k a l i a n d h e a t t r e a t m e n t s . J . A p p l .B a c t e r i o l . 3 1 : 2 0 0 - 2 0 7 .1 1 . R e n i s , H . E . 1 9 7 0 . I n v i t r o a n t i v i r a l a c t i v i t y o f c a l c i u me l e n o l a t e . A n t i m i c r o b . A g . C h e m o t h e r . 1 9 6 9 , ' p .1 6 7 - 1 7 2 .1 2 . V a u g h n , R . H . 1 9 5 4 . L a c t i c a c i d f e r m e n t a t i o n o f c u c u m -b e r s , s a u e r k r a u t a n d o l i v e s , p . 4 1 7 - 4 7 8 . I n L . A .U n d e r k o f l e r a n d R . J . H i c k e y ( e d . ) , I n d u s t r i a l f e r m e n -t a t i o n s , v o l . 2 . C h e m i c a l P u b l i s h i n g C o . , I n c . , NewY o r k .1 3 . V a u g h n , R . H . , H . C . D o u g l a s , a n d J . R . G i l l i l a n d . 1 9 4 3 .P r o d u c t i o n o f S p a n i s h - t y p e g r e e n o l i v e s . C a l i f o r n i aA g r i c u l t u r a l E x p e r i m e n t S t a t i o n B u l l e t i n 6 7 8 .1 4 . W a l t e r , W . M . , J r . , H . P . F l e m i n g , a n d J . L . E t c h e l l s .1 9 7 3 . P r e p a r a t i o n o f a n t i m i c r o b i a l c o m p o u n d s b y h y -

d r o l y s i s o f o l e u r o p e i n f r o m g r e e n o l i v e s . A p p l . M i c r o -b i o l . 2 6 : 7 7 3 - 7 7 6 .

7 8 2 A P P L . M I C R O B I O L .