apport de la biologie moleculaire et des tests rapides · 2017-06-27 · apport de la biologie...
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APPORT DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE ET DES TESTS RAPIDES Pr Jean-Philippe LAVIGNECHU Nîmes – INSER MU1047
XXIVe Journée Annuelle CCLIN Sud-Est - Lyon
Problématiques des épidémies: risques infectieux émergents
• Modification Quantitative
• Modification Qualitative
Nouveaux sous-types
Résistance de l’agent aux anti-infectieux
Modifications antigéniques
Echappement aux vaccins
Echappement aux tests de dépistage
Acquisition de facteurs de pathogénicité
Nouveaux modes de transmission = bioterrorisme
Causes et mécanismes de l’émergence
Modification du microorganisme : pression de sélection, mutation,...?• Virus de la grippe, BHRe, C. difficile O27, …
Modification du comportement humain: guerre, camps de réfugiés, urbanisation, effondrement des systèmes de santé publique, élevages intensifs…• Tuberculose multiR, MERS-CoV, Grippe aviaire…
Modification de l’environnement : émergence des vecteurs• Dengue, Chikungunya, Ebola…
Modifications des possibilités diagnostiques : progrès scientifiques• Découverte de nouveaux agents pathogènes
Causes et mécanismes de l’émergence
Modification du microorganisme : pression de sélection, mutation,...?• Virus de la grippe, BHRe, C. difficile O27, …
Modification du comportement humain: guerre, camps de réfugiés, urbanisation, effondrement des systèmes de santé publique, élevages intensifs…• Tuberculose multiR, MERS-CoV, Grippe aviaire…
Modification de l’environnement : émergence des vecteurs• Dengue, Chikungunya, Ebola…
Modifications des possibilités diagnostiques : progrès scientifiques• Découverte de nouveaux agents pathogènes
Causes et mécanismes de l’émergence
Modification du microorganisme : pression de sélection, mutation,...?• Virus de la grippe, BHRe, C. difficile O27, …
Modification du comportement humain: guerre, camps de réfugiés, urbanisation, effondrement des systèmes de santé publique, élevages intensifs…• Tuberculose multiR, MERS-CoV, Grippe aviaire…
Modification de l’environnement : émergence des vecteurs• Dengue, Chikungunya, Ebola…
Modifications des possibilités diagnostiques : progrès scientifiques• Découverte de nouveaux agents pathogènes
Causes et mécanismes de l’émergence
Modification du microorganisme : pression de sélection, mutation,...?• Virus de la grippe, BHRe, C. difficile O27, …
Modification du comportement humain: guerre, camps de réfugiés, urbanisation, effondrement des systèmes de santé publique, élevages intensifs…• Tuberculose multiR, MERS-CoV, Grippe aviaire…
Modification de l’environnement : émergence des vecteurs• Dengue, Chikungunya, Ebola…
Modifications des possibilités diagnostiques : progrès scientifiques• Découverte de nouveaux agents pathogènes
Problématique de l’hygiénisteImportante évolution des
connaissances• Diminution très importantes des SARM (MAIS
indicateurs Bactériémies à SARM…)• Augmentation des EBLSE• BHRe: Infos rapatriement ? Notion de voyage ?• BMR et infections communautaires• Epidémies et EHPAD
Problématique économique• Isolement = coût financier pour la structure• Difficulté d’obtenir du personnel dédié
Prévention des épidémies/préventions• SHA• Précautions standards, Précautions
complémentaires• Dépistage, Isolement
Nicolas‐Chanoine MH et al., CMR 2014
Problématique de l’infectiologue
Bon usage des antibiotiques• Réduire la consommation des
ATB toujours aussi importante
• Limiter l’usage des ATB à large spectre
Pas de nouvelles solutions antibiotiques
Alternatives ?
Données ANSM 2014
Butler MS et al., J Antibiot, 2013
Problématique du microbiologiste
Identif.: Mini 48hRésistance: Mini. 48h
JUSQU’À
Tissus mous: 7 jOs: culture 14 jBK: pls semaines
Conditions analytiques souvent longues…
Exemple du dépistage des BMR-BHRe
Milieux chromogènes:
Les difficultés: Diagnostic long: 24-48h miniMaintien de l’isolement du patientPatients à dépister ? Traçabilité des personnes contact changeant d’établissement, revenant du domicile, notion de voyage etcDépistage pendant 3 semaines
HCASE/BLSEVRE
EPC
Vrioni et al., J Clin Microbiol 2012; Malhotra-Kumar et al., J Clin Microbiol 2010; Ledeboer et al., J Clin Microbiol 2007; Réglier-Poupet et al., J Med Microbiol 2008; Moran et al., Diagn Microbiol Infect Dis 2011
SARM
ABRI
Comment améliorer la rapidité du diagnostic?
DIAGNOSTIC CLASSIQUE : Bactérie: mini. 48h jusqu’à 14jRésistance: mini. 48h
BIOLOGIE MOLECULAIREDiag en qq h
SPECTROMETRIE DE MASSEDiag en qq min
TESTS DE DIAGNOSTIC RAPIDEDiag en qq min
Biologie moléculaire: Intérêts
Rapidité
Bactéries non cultivables
Bactéries de culture lente et/ou difficile
Spécificité
Faible charge bactérienne
Traitement ATB déjà en place
Nouvelles technologies de BM
Diagnostiqueo Directement à partir du prélèvemento A partir de la culture (identification, confirmation…)
Aide à l’antibiothérapiePoint of Care
Plateformes BMMultiplexage
Réalisation rapide et facile
Personnel non spécialisé
Point of Care: Système de PCR rapide
*DIAGNOSTIC BMR-BHRe en 1h : - SARM hémoculture, nasal, SSTI- EPC- VRE (vanA)
*Autres diagnostics rapides d’épidémie: -Mycobacterium tuberculosis et résistance-Clostridium difficile et souche O27-Méningite à Entérovirus-Grippe H1N1
30 min à 2h
Multiplexage
Détection en 1 tube ou en 1 programme d’amplification de plusieurs cibles bactériennes et/ou virales et/ou
parasitaires
Problèmes à résoudre:
Eviter les compétitions, être aussi sensible en faisant plusieurs amplifications en même temps qu’en faisant une seule
Etre spécifique
Etre flexible: possibilité d’ajouter ou de remplacer des cibles (bactéries ou virus émergents, dérive génétique, bact. ou virus nouvellement identifié(e))
Etre rapide: rendus de résultats définitifs en 24-48h
Etre convivial: protocole technique et expression des résultats
Coût (30 à 150 €)
Approche syndromique
RespiFinder®, Eurogentec - Pathofinder
3 kits: *RespiFinder® 22:16 virus ARN, 2 virus ADN, 4 bactéries(Chlamydia, Mycoplasma, B. pertussis, Legionella)*RespiFinder® 19: 14 virus ARN, 1virus ADN, 4 bactéries*RespiFinder® 15: 14 virus ARN, 1 virus ADN
Reijans M et al., J Clin Microbiol 2008
4h de travail4h de travail
A VENIR: GASTROFINDER®…
Technologie Luminex
Wessels E et al., Clin Microbiol 2014 Popowitch EB et al., J Clin Microbiol 2013
5h
Staphytype96® (Alere SA- Clondiag)
Lyse-ExtractionAmplification
linéaire
Marquage Hybridation sur puce
Révélation – Analyse
Analyse des souches par biopuce à ADN
IdentificationGénotypageRésistance aux TTT
Sotto A et al., Diabetes Care 2012
Diagnostic d’infections difficiles par biopuces à ADN
Diagnostic classique : Endocardites: 3 – 21 j Ostéites: 14 jPneumopathies: 3-5 j
Diagnostic par Biopuce à ADN :Endocardites: 4 hOstéites: 3,5 hPneumopathies : 4 h
Panels: GastroIntestinal
RespiratoireMéningitesBactériémies
Nouvel outil pour approche syndromique
1h
Identification Bactéries + Virus + ParasitesPrincipales Résistances aux ATB
Comment améliorer la rapidité du diagnostic?
DIAGNOSTIC CLASSIQUE : Bactérie: mini. 48h jusqu’à 14jRésistance: mini. 48h
BIOLOGIE MOLECULAIREDiag en qq h
SPECTROMETRIE DE MASSEDiag en qq min
TESTS DE DIAGNOSTIC RAPIDEDiag en qq min
TDR: Intérêts
Rapidité: quelques minutes
Fiabilité: sensibilité, spécificité
Robustesse: facilité de transport et d’installation , conservation des réactifs à Treambiante
Simplicité: équipements légers, technicité réduite
Faible coût
TDR et infections pulmonaires
Méthode immunologique (ELISA): immunochromatographie
Détection des AG spécifiques des agents pathogènes
20-30 min
20-30 min
*Urines: S. pneumoniae (Antigène C-polysaccharidique)
*Prélèvements nasopharyngés (‘endonasal’, aspiration):Grippe (Antigène à activité intrinsèque agglutinante ou
à activité enzymatique de surface)VRS (Antigène de surface)
Grippe/VRS: Très spécifique (>90%) – Sensibilité faibleConfirme le diagnostic (mais ne l’écarte pas): outil de dépistage et non de diagnosticInutile si symptômes > 3jDétection plus facile du virus influenza AIndications: En période de circulation du virus
Pneumocoque:Sensibilité: 60-80% et >90% si bactériémie - Spécificité: 80-100%Test + plusieurs mois après une infection (Andreo et al, Respir Med 2010:397-403)Pas d’effet de l’antibiothérapie (Porcel et al., Chest 2007:1442-7)
Tests actuels sur Liq pleural (Casado Flores et al, Eur J Pediatr 2010), Liq Péricardique (Nakagawa et al, Intern Med 2010), Nez (Vuorenoja et al, Eur J Clin Microb Infect Dis 2012)
Problèmes de LectureLecture pas toujours aisée Lecteur Automatique
Chartrand C et al., Ann Intern Med, 2012; 156: 500-511. Dominguez J et al., Chest, 2001; 119: 243-249. Smith et al., J Clin Microbiol 2003
TDR et infections pulmonaires
Selles: RotaVirus – AdénoVirus – NorovirusToxines A et B - GDH C. difficile
Performances:
*Tests Rota-Adéno-Noro ont surtout une très bonne spécificité
*Méthode de screening de C. difficile: Test de la GDHspécificité excellentVPN >95%
*Mise en évidence des toxines: EIA toxines A et B (sensibilité 50-80%, spécificité 98%)
TDR et infections digestives
Exemples de Schéma décisionnel pour C. difficile
GDH
+-
Absence d’ICD
Méth. Molécul.
+-
Absence d’ICD
ICD
EIA A/B
GDH
+-
Absence d’ICD
+-
ICDMéth. Molécul.
+-
Absence d’ICD
ICD
< 1 h
Test de diagnostic rapide des EPC
Pantel A et al., JCM 2015
Rapid CARB Screen®
Sensibilité 97,6%, Spécificité 94,4%
Nordmann et al., EID 2012Rapidec CARBA NP®
Poirel L et al., JCM 2015
Sensibilité 96%, Spécificité 96%
< 2 h
Comment améliorer la rapidité du diagnostic?
DIAGNOSTIC CLASSIQUE : Bactérie: mini. 48h jusqu’à 14jRésistance: mini. 48h
BIOLOGIE MOLECULAIREDiag en qq h
SPECTROMETRIE DE MASSEDiag en qq min
TESTS DE DIAGNOSTIC RAPIDEDiag en qq min
Diagnostic plus précoce
Profil protéique des bactéries
Diagnostic par Spectrométrie de Masse :Bactérie (à partir d’une colonie): 2 min
Utilisation en routine Utilisation en Recherche
Autres utilisations de la spectrométrie
Détection de la Résistanceo Détection des SARM: notion de spectre uniqueo Détection des BLSE: via activité enzymatiqueo Détection des carbapénémases: via activité enzymatique
Identification bactérienne à partir du prélèvemento Sang (hémocultures)o Urines
PCR 16S rDNA, 23S rDNA, rpoB, van A, vanB, blaKPC, mecA etcHrabak et al., CMR, 2013
Impact des techniques rapides: diminution des durées de traitement
Impact des techniques rapides: amélioration des prises en charges
Impact des techniques rapides: aide pour l’EOH
Eradication de réservoirs environnementaux
Pantel A et al., AJIC 2015
Patient 1, Room 27, June 2012
Patient 2, Room 27, July 2013
Patient 3, Room 27, November 2013
Sink, Room 27, February 2014
Patient 4, Room 27, February 2014
Mattress, Room 27, February 2014
Patient 5, Room 28, February 2014
Unrelated strain (main clone in the region)
Impact des techniques rapides: aide pour l’EOH
Rôle des Centres Experts régionaux ++++*Détection des BMR, BHRe,*Détection des épidémies
ARS 244
ARS 247
ARS 252
ARS 298
ARS 258
ARS 261
ARS 284
ARS 260
ARS 265
ARS 271
ARS 19
ARS 21
ARS 20
ARS 160
ARS 232
ARS 53
ARS 155
ARS 157
ARS 246
ARS 250
ARS 242
Pantel A et al., EJCMID 2014
ST101
ST17
ST15
ST15
ST405
ST395
ST472
ST32
ST472
ST473
ST350
ST66
ST88
ST132
K. pneumoniae OXA‐48 E. coli OXA‐48
Conclusion
Révolution bactériologique
Biologie Moléculaire vs/avec Spectrométrie de Masse vs/avec TDR
Point crucial = LE TEMPS…
Modification des habitudes +++
Avenir: séquençage haut débit
Vers une médecine personnalisée ???