“arrays de cdna” curso de postgrado genómica, proteómica y bioinformática (enero-05)
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“Arrays de cDNA” Curso de Postgrado Genómica, Proteómica y Bioinformática (Enero-05). Carles J. Ciudad . Grupo de Terapia anticancerosa. Departamento de Bioquímica I Biologia Molecular. Fac Farmacia. UB. ([email protected]). Una Vieja Idea con una tecnología moderna. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
“Arrays de cDNA”Curso de Postgrado
Genómica, Proteómica y Bioinformática (Enero-05)
Carles J. Ciudad.
Grupo de Terapia anticancerosa. Departamento de Bioquímica I Biologia
Molecular. Fac Farmacia. UB.
Una Vieja Ideacon una tecnología moderna
• Determinar la expresión génica a mRNA
• Un Array es un Multi-Northern
• Técnica basada en la hibridación
• Arrays (250-8000 genes), tamaño grande.
Marcaje radiactivo
• Microrarrays (hasta 40,000 genes) micro.
Marcaje fluorescente
APLICACIONES DE LOS ARRAYS
• DEFINIR PERFILES DE EXPRESIÓN GENICA (EN DIFERENTES TEJIDOS, ESTADOS DE
DESARROLLO, TRATAMIENTOS: complementar funcionalmente el proyecto genoma humano)
• ESCRUTINIO DE MUCHOS GENES SIMULTÁNEAMENTE (ventajas respecto RT-PCR, RNAse protection, Northern analysis)
• INVESTIGAR PROCESOS NORMALES Y PATOLÓGICOS (comparación de tejidos)
• DESCUBRIR DIANAS TERAPÉUTICAS
PLATAFORMA BD-CLONTECHDISPOSICIÓN GENES
NATURALEZA DE LOS ARRAYS• LO CONSTITUYEN CENTENARES DE cDNAs
INMOBILIZADOS SOBRE MEMBRANAS DE NILÓN (8X12cm) CARGADAS POSITIVAMENTE (dup o singli)
• CADA cDNA CONTIENE 200-600bp, (10ng) (AMPLIFICADAS DE REGIONES DE mRNA SIN COLA DE POLI-A, ELEMENTOS REPETITIVOS O ALTAMEN-TE HOMÓLOGOS, Y QUE NO HIBRIDEN CON OTRAS SECUENCIAS DE GENES PRESENTES EN EL ARRAY)
• SON ESPECÍFICO DE ESPECIE• CONTIENEN CONTROLES NEGATIVOS
(PLÁSMIDOS,BACTERIOFAGOS), Y POSITIVOS (HOUSEKEEPING GENES) QUE PUEDEN UTILIZARSE PARA NORMALIZAR
METODOLOGÍA DE UN ARRAY
• ATLAS HUMAN CANCER 1.2K• Membranas de Nilón (8X12cm):
1176 GENES
• Cada cDNA (10 ng, 200-600 bp)
• Específicos de Especie
• Sin secuencias repetitivas o de alta similaridad.
• MARCAJE cDNA
• -[32P]-dATP
• MMLV-RT
• Primers específicos
• Purificación G-50
• Hibridación
• ANALISIS• “Phosphorimaging”
• Normalización
• Interpretación resultados
POLI A+ o RNA TOTAL
32P o 33P
Arrays, solo 1000?No, 8000
Normal vs Diabético
NORMALIZACIÓN EN LOS ARRAYS
• LAS MEMBRANAS PUEDEN MOSTRAR DIFERENTES GRADOS DE HIBRIDACION
• DIFERENCIAS EN LA CALIDAD DEL RNA O EN LA SINTESIS DE LOS cDNAs
• NORMALIZACIÓN UTILIZANDO HOUSEKEEPING GENES
• NORMALIZACIÓN UTILIZANDO TODOS LOS GENES DEL ARRAY (GLOBAL NORMALIZATION)
CUANDO SE CONSIDERAN DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS ?
• GENERALMENTE CUANDO HAY DIFERENCIAS DE 2 o MAS VECES (INCLUSO MENOS DE 2 VECES EN EL CASO DE MENSAJES SOBRE-ABUNDANTES)
• EN EL CASO DE CAUSAR REDUCCIONES DE LA EXPRESIÓN (ALREDEDOR DE 0.5 VECES)
K562
(Leucemia mieloide crónica)
HT29
(Cáncer de colon)
I. Análisis genómico de los cambios de expresión
II. Identificación de posibles dianas para el diseño de quimiosensibilizadores en la terapia con Metotrexato
Genómica de la resistencia al MTX
Dosis respuesta al MTX en K562
CUANTIFICACIÓN DE LOS RESULTADOS DE LOS EXPERIMENTOS CON ARRAYS
GeneSpring(Silicon Genetics)
ARRAY SCATTERING.CNT
ARRAY SCATTERING.MTX
FILTERING-OVER2
LIST-OVER 2
GRAPH-NUC-METABOLISM
CLUSTERING QUERY
TREE-DOSE RESPONSE MTX
COMPROBACION DE LOS RESULTADOS
• RT-PCR CUANTITATIVO (En genes con diferencias de 2-5 veces >70% positivos; en superiores a 5 veces >90% positivos)
• NORTHERN ANALYSIS
• RNAse PROTECTION
• WESTERN ANALYSIS
• ANALISIS DE PROTEINAS EN 2D
Validación de los resultadospor RT-PCR cuantitativa
IMPDH2
MTX (M)
CNT 3x10-8 M 3x10-7 M0
50
100
150
200
250
300
Niv
el e
s d
e m
RN
A
pa
ra
la I
MP
DH
(% r
es
pe
cto
el
co
ntr
ol)
Expresión de la IMPDH en células K562 tratadas con Mtx 24h
APRT
Sonda Taq-Man
SÍNTESIS DE NUCLEÓTIDOS PÚRICOS
INHIBIDORES DE LA IMPDH
IMP
ADENILSUCCINATO
XANTILATO
AMP
GMPIMPDH
ADENILSUCCINATO LIASA
ADENILSUCCINATO SINTETASA
O
O
O
CH3
HOHO
CH3
CH3O
ACIDO MICOFENÓLICO
O
OH
OH OH
S N
CONH2
TIAZOFURINA
O
OH
OH OH
CONH2
BENZAMIDA RIBÓSIDO
CÈL.LULES RESISTENTS A 10-7 M DE MTX
0
20
40
60
80
100
120
CONTROL 10-7M 3X10-7M 10-6M 3X10-6M 10-5M
BENZAMIDA RIBÒSID (M)
MTX+BR
BR
MTX
BENZAMIDA RIBÒSID
EXPERIMENTO HT29 RESISTENTES AL MTX
HT29 CONTROL HT29 RESISTENTES A 10-5 M
MEMBRANA HT29 CNT
MEMBRANA HT29 RESISTENTES AL MTX
9 genes sobreexpresados
15 9 38
1123
resistentestratamiento 24h
Genes sobreexpreados en tratamientos cortos y en células HT29 resistentes al Metotrexato
CELL CYCLE - cell division prote in kinase 5 (CDK5) - NEDD5 protein homologONCOGENES AND TUMOR SUPRESSORS - metastasis suppressor kangai 1; - shb proto-oncogene - c-myc purine-b inding tr anscription factor puf
DNA RECOMBINATION AND RE PAIR - proliferat ing cyclic nuclear ant igen (PCNA); INTRACE LLULAR TRANSDU CER - B-cell recepto r-associated p rotein (hBAP)TRANS LATION - elongation factor 1 alpha (EF1 alpha)POST-TRANSCR IPT IONAL MODIFICAT ION - progesterone receptor-associated P48 protein
SYNTHESIS
Genes infraexpreados en tratamientos cortos y en células resistentes al Mtx
27 genes infraexpresados
11 28 73
1073
resistentestratamiento 24h
APOPTOSIS ASSOCIATED PROTEINS - tumor necrosis factor receptor (TNFR) + TNFR2 - CD40 receptor-associated factor 1 (CRAF1)CELL SIGNALING - transforming growth factor-beta (TGF-beta; TGFB) - B-cell growth factor 1 precursor (BCGF1) - SCGF-beta - CXC chemokine precursor - chemokine LEC precursorCYTOSKELETON MOTILITY PROTEIN
- growth-arrest-specific protein 2 (GAS2)- vimentin (VIM)
ONCOGENES AND TUMOR SUPRESSORS - tre2 protein-oncogene - myelodysplasia/myeloid leukemia factor 2 (MLF2)TRANSCRIPTION - early growth response protein 1 (hEGR1)CELL RECEPTOR - muscarinic acetylcholine receptor M4 (CHRM4)INTRACELLULAR TRANSDUCERS - calvasculin; S100 calcium-binding protein A4 - serine/threonine-protein kinase PCTAIRE 3 (PCTK3) - casein kinase I gamma 2 (CKI-gamma 2) - HRSPROTEIN TURNOVER - placental plasminogen activator inhib2 (PAI-2; PLANH2) - endothelial plasminogen activ inhib1 prec (PAI1; PLANH1) - protein C inhibitor (PROCI; PCI) - matrix metalloproteinase 15 (MMP15) - matrix metalloproteinase 16 precursor (MMP16) - matrix metalloproteinase 9 (MMP9)EXTRACELLULAR MATRIX PROTEINS - netrin-2 - tenascin-RFUNCTIONALLY UNCLASSIFIED - septin 2 homolog; KIAA0128 - clones 23920 & 23921 - KIAA0022 GENE
0
20
40
60
80
100
120
0 0,1 0,3 1 3
VIMENTINA TRANSFECTADA (µg)
Efecto de la sobreexpresión de Vimentina sobre la resistencia al Mtx
CÉLULAS HT29 RESISTENTES A 10-5 M MTX
SU
PE
RV
IVE
NC
IA(%
RE
SP
EC
TO
CO
NT
RO
L)
MTX 10-5 M
MTX 10-5 M+ vimentina
TIPOS DE ARRAYS REALIZADOS
• ANÁLISIS GENÓMICO DE LOS CAMBIOS DE EXPRESIÓN QUE TIENEN LUGAR EN CÉLULAS TRATADAS O RESISTENTES AL METOTREXATO.
• ANÁLISIS GENÓMICO DE LOS PROCESOS APOPTÓTICO Y ANGIOGÉNICO (MERCK-FARMA)
• ANÁLISIS GENÓMICO DE DIFERENTES ESTADIOS DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER (R.Franco)
• ANÁLISIS GENÓMICO DE DROGAS HIPOLIPEMIANTES (JC Laguna)
• IDENTIFICAR POSIBLES DIANAS PARA UN TRATAMIENTOS ESPECÍFICOS EN CADA CASO.
Plataforma ABI
ABI-Arrays
Equipo ABI
Plataforma Affymetrix
Arrays de Affymetrix
Arrays fotolitográficos
Activación fotolitográfica
Ampliación Array Affymetrix
DetallesTécnica
ArrayAffymetrix
cRNA synthesis
Overview Expression Arrays
Hibridación Array Affymetrix
Detección Array Affymetrix
Tipos de Arrays de Affymetrix
Types of Genome Microarrays by Affymetrix
GeneChips Human Genome Arrays
Detector Affymetrix
Microarray Affy HGU133A.2
Pathways - Translation Factors
NODOS
INTERACCIONES BIOLÓGICAS
PathwayAssist