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Publié le: 2012-08-27

Isolement des souches d’actinomycètes productrices de substances antifongiques

Isolation of actinomycetes strains producing antifungal substances

Auteur :Elarbi Boussaber, Issam Meftah Kadmiri, Lahoucine HilaliAbderraouf Hilali

Catégorie : Environnement > Biologie

ScienceLib Editions Mersenne : Volume 4 , N ° 120801ISSN 2111-4706

www.sciencelib.fr

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Isolement des souches d’actinomycètes productrices de substances antifongiques

Isolation of actinomycetes strains producing antifungal substances

Elarbi Boussaber*1, Issam Meftah Kadmiri1, Lahoucine Hilali1, Abderraouf Hilali1.

1-Université Hassan premier. Faculté des sciences et techniques. Laboratoire d’agroalimentaire

et santé. BP 577. Settat (MAROC).

*Auteur correspondant : Elarbi Boussaber, Faculté des sciences et techniques. Laboratoire

d’agroalimentaire et santé. BP. 577. Settat (MAROC). E-mail : [email protected]

N° de téléphone : +212663697650

RESUME

Au cours des dernières années, les Champignons phytopathogènes ont été contrôlés

principalement par l’utilisation des fongicides synthétiques d’origine chimique qui permettent

de protéger les cultures et les récoltes contre ces organismes nuisibles. Pourtant, leur emploi

inconsidéré pourrait faire courir des risques aux consommateurs et déstabiliser dangereusement

les écosystèmes. Les microorganismes sont actuellement considérés comme des agents très

prometteurs pour assurer une protection phytosanitaire performante. L’usage des antifongiques

microbiologiques en font des alternatives viables à la lutte chimique. En effet, plus d’une

centaine de bactéries, notamment les actinomycètes, ont été identifiées comme ayant un potentiel

d’utilisation dans la lutte biologique. Le présent travail consiste donc à isoler des souches

d’actinomycètes productrices de substances antifongiques, à partir de trois écosystèmes

marocains différents. Ainsi, vingt-neuf souches d'actinomycètes ont été isolées sur trois milieux

de culture choisis en fonction des données de la littérature (Olson, Bennett et GLM), à partir

d'échantillons de sol prélevés de forêt, de dunes phosphatées et de décharge de poterie. L’activité

antifongique des souches d’actinomycètes isolées a été mise en évidence sur milieu de culture

Bennett par deux techniques de diffusion sur gélose. Parmi les 29 souches d’actinomycètes

isolées, 25 (86.20 %) ont montré une activité antifongique vis-à-vis d’au moins un champignon

étudié. Les extraits des trois actinomycètes représentatifs ont montré une activité inhibitrice

intéressante, surtout la souche SP13’ qui s’est révélée plus efficace et présente une intense

activité antifongique. Il apparaît donc nécessaire de s’orienter vers l’application de la lutte

biologique contre les champignons phytopathogènes à l’aide de bactéries actinomycétales.

Elarbi Boussaber

ScienceLib Editions Mersenne : Volume 4 , N ° 120801 ISSN 2111-4706

mailto:[email protected]

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Mots-clés : Actinomycètes, substance antifongique, lutte biologique, champignons

phytopathogènes.

ABSTRACT

In recent years, phytopathogenic fungi were mainly controlled by the use of chemical fungicides

to protect crops against these pests. Nevertheless, the regular use of fungicides can potentially

pose a risk to the environment, particularly if residues persist in the soil or migrate off-site and

enter waterways, which lead to adverse impacts to the health of terrestrial and aquatic

ecosystems. Microorganisms are currently considered as very promising for effective plant

protection. The uses of microbial fungicides are viable alternatives to chemical control. Indeed,

more than a hundred of bacteria, including actinomycetes, have been identified as having

potential for use in biological control. The present work aimed to isolate strains of actinomycetes

producing antifungal substances from three different Moroccan biota. Thus, twenty-nine

Actinomycete strains have been isolated on three media selected among the most frequently cited

in the literature (Olson, Bennett, and GLM). The strains were isolated from samples collected

from forest soil, phosphate rock dunes and discharge of pottery. Antifungal activity of the strains

of actinomycetes isolated has highlighted on medium Bennett by two techniques of diffusion on

agar. Among the 29 strains, 25 (86.20%) have shown antifungal activity with at least a studied

fungus. Three actinomycetes extracts showed interesting inhibitory activity, especially the strain

SP13' which was more effective and showed intense antifungal activity. It therefore appears

necessary to move towards the application of biological control fungi phytopathogenes using a

bacteria.

Keywords: Actinomycetes, antifungal substance, biological control, phytopathogenic fungi.

INTRODUCTION

Les champignons sont les principaux microorganismes responsables des pertes en agriculture,

83% des maladies des plantes sont dues aux champignons, 17% étant provoquées par des

bactéries et des virus. La FAO estime qu’au moins 25% de la récolte mondiales des denrées

agricoles est contaminée par les mycotoxines (Manfred et al., 2000).

Rhizopus stolonifer est un champignon phytopathogène responsable d’une maladie connue sous

le nom de moisissure chevelue de certaines plantes (Dennis, 1975 ; Daubeny et al, 1980 ; Emond

Elarbi Boussaber


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et al, 1996), en particulier la fraise, la carotte, la pomme, la prune, la pêche et la poire (Ogawa et

al, 1963 ; Wilson et al, 1987 ; Snowdon, 1990).

Penicillium expansum est une espèce de champignon microscopique responsable de la

pourriture des fruits (surtout pommes, poires et coings) (Roussel et al, 2007).

Fusarium culmorum est un agent phytopathgène responsable de divers symptômes tels que fonte

des semis, pourriture racinaire, fusariose de l'épi, pourriture de la tige, etc. chez de nombreuses

espèces de plantes mono et dicotylédones, en particulier chez les céréales (Wiese, 1977). C'est

l'un des champignons responsables de la pourriture sèche du tubercule de la pomme de terre

(Booth et Waterson, 1964).

Penicillium digitatum est un agent de pourriture des fruits, surtout les agrumes. Il est connu

comme étant la pourriture verte des oranges et citrons (Taqarort et al, 2004).

Ces maladies ont été contrôlées principalement par l’utilisation des fongicides synthétiques

d’origine chimique. Cependant, d’une part, la lutte chimique génère des impacts négatifs

énormes sur l’environnement et, d’autre part, l’utilisation intempestive, inconditionnelle et

irrationnelle des fongicides chimiques provoque le développement de la résistance chez les

champignons phytopathogènes. Pour ces raisons, ce travail s’inscrit dans le cadre de la recherche

des molécules antifongiques capables de jouer un rôle important dans la lutte biologique contre

ces champignons. Ces molécules sont souvent recherchées à partir des microorganismes isolés

d’échantillons prélevés de différents écosystèmes, dans le but de découvrir des taxons originaux

et par-là de nouvelles molécules biologiquement actives. Les actinomycètes (bactéries dont la

croissance donne lieu à des colonies constituées de filaments), sont les plus prolifiques de tous

les micro-organismes en tant que producteurs de molécules à activités biologiques. Environ 75%

des antibiotiques découverts entre 1971 et 1980 appartiennent aux actinomycètes (Iwai et

Takahashi, 1992). Le but de ce travail est de chercher à isoler des souches d’actinomycètes

productrices de substances à activité inhibitrices contre des champignons phytopathogènes à

partir des échantillons de sol prélevés de trois écosystèmes de paramètres physicochimiques

différents.

Elarbi Boussaber


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MATERIEL ET METHODES

Prélèvement, analyse et traitement des échantillons

Les prélèvements des échantillons ont été effectués durant les mois de Novembre et Décembre à

partir de trois sites différents (Forêt de Settat, décharge de poterie de Boujad et dune phosphatée

d’Oued-Zem) situés dans la région Chaouia Ouardigha au centre du Maroc. Les trois

échantillons de sol ont été prélevés selon la technique de Pochon Tardieux (1962) qui consiste à

prélever à l’aide d’une grande spatule stérile, après avoir écarté les cinq à dix premiers

centimètres de la couche superficielle du sol, 100g de terre et les déposer sur une feuille

d’aluminium stérile ; puis, après avoir retiré les pierres et racines, 50g de l’échantillon trié sont

placés dans un flacon stérile et transportés au laboratoire.

Les propriétés physicochimiques des trois échantillons [pH (pochon et Tardieu 1962), salinité,

conductivité (Rodier, 1996) et humidité (Demeo, 1984)] sont mesurées dès l’arrivée au

laboratoire.

1g de chaque échantillon de sol est séché à l’air puis mélangé avec 0.1g de CaCO3 et incubé à

28°C pendant sept jours dans une atmosphère saturée d’humidité (Cavalla et Eberlin, 1994).

Isolement, purification et conservation des actinomycètes

Une série de dilutions de 10-1 à 10-5 dans de l’eau physiologique (NaCl 9g.l-1) stérile a été

préparée à partir de chaque échantillon. Après agitation au vortex pendant 10 min (Hilali et al.,

2002), 0,1 ml de chaque dilution est ensemencé à la surface des boites de Pétri contenant l’un des

trois milieux de cultures (Olson, Bennett et GLM) additionnés ou non d’antifongiques et

d’antibiotiques (Anphotéricine B :75µg.ml-1, Actidione 40µg.ml-1, Acide nalidixique : 10µg.ml-

1 ) (Davet et al., 1997 ; Hilali, 2006 et Kitouni, 2007).

Après incubation à 28°C de deux à trois semaines, les colonies se rapprochant par leur aspect

macroscopique aux actinomycètes ( Hilali, 2006) sont observées au microscope (Grossissement

x 100) à l'état frais. Après coloration de Gram, seules les souches à coloration de Gram positive

et d’aspect filamenteux sont dénombrées, puis, repiquées par la méthode des stries sur les mêmes

milieux de culture utilisés pour l’isolement et purifiées sur le milieu de Bennett exempt

d’antifongiques et d’antibactériens (Bastide et al, 1986). Cette dernière opération est répétée

jusqu’à obtention de souches pures (Cheraiti et al, 2012) puis, conservées, d’une part, à 4 °C sur

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des géloses inclinées avec un repiquage tous les deux mois (Hilali et al, 2002) et, d’autre part,

à -20°C en suspension en présence de glycérol à 20% (v/v) (Kitouni, 2007).

Activité antifongique des souches d’actinomycètes isolées

L’activité antifongique des actinomycètes isolés vis-à-vis des quatre champignons concernés,

(R.stolonifer, P. expansum, P. digitatum et F. culmorum) qui sont des souches de la collection de

l’Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) de Settat, a été effectuée sur trois

milieux (Bennett, Olson et GLM) par deux techniques de diffusion en gélose : La technique de la

double couche (Shomura et al, 1979) et la technique des cylindres d’agar (Ichikawa et al, 1971 ;

Lee et Hwang, 2002)

Dans les deux techniques, les boites de Pétri sont incubées à 28°C pendant 48 heures. Le

diamètre des zones d’inhibition sont mesurés en millimètre du bord de la souche actinomycétale

ou du cylindre d’agar à la limite de la zone où il n’y a pas inhibition du microorganisme cible

(Badji et al., 2005; Boughachiche et al., 2005).

Tests de sensibilité de R. stolonifer, de P. digitaum, de P. expansum et de F.culmorum aux

extraits d’actinomycètes.

Parmi les souches actives, trois isolats (SP13’, SPO3 et SFr3’) ont été choisis, selon leur

importance à inhiber la croissance des phytopathogènes pour faire les tests de sensibilité. Les

souches d'actinomycète concernées ont été cultivées en trois fioles d'Erlenmeyer de 500ml

contenant chacune 100ml du milieu dont la composition (sauf l'agar) est identique au milieu

utilisé dans les tests d’activité. Après incubation des milieux ensemencés par les souches

concernées à 28°C dans un bain d'eau agité pendant huit jours, 50ml de chaque culture sont

centrifugés à 5000 tr/min pendant 20min. Les surnageants sont utilisés directement pour réaliser

les tests de sensibilité (Bastide et al, 1986)

Un milieu gélosé, Potato Dextrose Agar (PDA) fraichement préparé, contenant 2%, 5%, 10% et

15% du surnageant à tester, est ensemencé une fois refroidi avec les spores de champignons dont

on veut évaluer la résistance. Après 48 à 72 heures d’incubation, on note s’il y a eu lieu ou non

croissance du champignon (Thibodeau et al, 2002).

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RESULTATS ET DISCUSSION

Analyse physicochimique des échantillons

Tableau 1: Propriétés physicochimiques des échantillons.

Le tableau 1 montre que l’échantillon prélevé de la décharge de poterie est caractérisé par un pH

alcalin et une conductivité élevée par rapport aux autres échantillons. D’après Lee et Hwang

(2002), le taux d’humidité de tous les échantillons est élevé (supérieur à 13), ceci est expliqué

par la période des prélèvements qui ont été réalisés durant la saison pluvieuse.

Isolement des actinomycètes à partir des échantillons de sol

Après 7 à 21 jours d’incubation à 28 °C, le dénombrement des colonies d’actinomycètes sur les

trois milieux de culture complémentés ou non en antibiotiques et antifongiques a conduit aux

résultats rassemblés dans la figure1.

Figure1: Evolution du nombre de colonies d'actinomycètes dénombrées selon le milieu de culture -ENT : échantillon non traité; ET: échantillon traité; MC.SAB: milieu de culture sans antibiotiques; MC.AB : milieu de culture avec antibiotiques-

Lieu de prélèvement Code pH Salinité Conductivité

µs.cm-1 Humidité

Sol de décharge de poterie SP 8,11 0,22 465 20 Sol de forêt SFr 7,3 0,09 200 14

Sol phosphaté SPO 7,23 0,15 309 20

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Le traitement des échantillons de sol par le CaCO3 et l’addition des antibiotiques dans les

milieux de culture font augmenter le nombre de colonie sur tous les milieux utilisés. Quand les

échantillons ne sont pas traités et/ou le milieu de culture n’est pas complémenté en antibiotiques,

on constate que le plus grand nombre de colonies a été enregistré sur le milieu d’Olson,

cependant, lorsque les échantillons ont été, préalablement, traités et le milieu de culture a été

additionné d’antibiotiques, le plus grand nombre de colonies d’actinomycètes dénombrées a été

enregistré sur le milieu GLM. Cela revient à la composition des milieux de culture; le milieu

GLM est riche en matières organiques, ce qui favorise le développement de tous les

microorganismes. Or, en traitant les échantillons et en complémentant ces milieux en

antibiotiques, on sélectionne le développement des actinomycètes. Le milieu d’Olson est moins

riche en substances organiques et contient du Propionate de sodium qui agit comme

antifongique (Hilali, 2006), ce qui favorise la croissance des bactéries parmi lesquelles se

trouvent les actinomycètes.

Activité antifongique des souches d’actinomycètes isolées

L’activité antifongiques des souches d’actinomycètes isolée a été mise en évidence sur le

milieude culture Bennett par la technique de la double couche et la technique des cylindres

d’agar. Les résultats obteus sont rassemblés dans les tableau 2 et 3, d’oú il en ressort que 86.20%

des actinomycètes présentant une activité inhibitrice vi-à-vis d’au moins un des quatre

champignons étudiés. Les souches SP13’, SPO6 et SFr3’ qui ont été isolées successivement de la

décharge de poterie, du sol phosphté et du sol de forêt, ont montré une activité antifongique

interessance. Elles ont été choisies donc pour effectuer les tests de sensibilité des champignons

étudiés.

Tableau 2 : cliblage initiale des souches d’acctinomycètes isolées.

Lieu de prélèvement Code

Nombre de souches d'actinomycètes

isolées

Nombre de souches d'actinomycètes

actives

Décharge de poterie SP 19 16

Sol phosphaté SPO 5 5

Sol de forêt SFr 5 4 Total 29 25

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Tableau 3 : Activité antimicrobienne des souches d’actinomycètes isolées

NT : Non testé

Ces valeurs représentent les moyennes des diamètres des zones d’inhibition obtenus par les

deux techniques utilisées pour la mise en évidence de l’activité antifongique.

Lieu de prélèvement Isolats

Diamètres des zones d’inhibition en mm Moyenne en mm R.stolonifer P.expansum F.culmorum P.digitatum

Sol de décharge de

poterie

SP1 10 0 8 10 7 SP2 10 1 8 14 8,25 SP3 7 1 12 15 8,75 SP4 0 0 0 10 2,5 SP6 15 0 8 17 10 SP8 12 0 3 15 7,5 SP9 10 9 0 1 5 SP1’ 13 0 0 0 3,25 SP2’ 0 6 0 4 2,5 SP3’ 9 9 7 10 8,75 SP4’ 3 5 0 5 3,25 SP6’ 8 1 15 3 6,75 SP7’ NT 0 2 5 2,33 SP8’ 0 14 NT 6 6,66 SP10’ 4 10 14 4 8 SP11’ 6 0 16 6 7 SP12’ 0 0 0 0 0 SP13’ 14 15 NT 17 15,33 SP14’ 0 0 0 0 0

Sol de forêt

SFr1’ 16 12 6 3 9,25 SFr2’ 7 3 0 3 3,25 SFr3’ 11 18 10 0 9,75 SFr4’ 0 0 7 10 4,25 SFr5’ 0 0 0 0 0

Sol phosphaté

SPO1 7 5 3 0 3,75 SPO2 12 0 3 0 3,75 SPO3 15 13 4 7 9,75 SPO4 0 5 0 0 1,25 SPO6 NT 9 10 15 11,33

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Tests de sensibilité de R. stolonifer, de P. digitaum, de P. expansum et de F.culmorum aux

extraits d’actinomycètes.

Le tableau 4 présente les tests de croissance des quatre champignons, après une incubation de

24 à 72 heures à 28 °C dans des milieux gélosés contenant différentes concentrations des

surnageants des souches d’actinomycètes représentatives.

Tableau 4 : Effets des extraits d’actinomycètes sur la croissance des champignons étudiés

+ : Croissance normale ; ++ : Croissance forte ; - : inhibition totale de la croissance.

L’effet des extraits d’actinomycètes sur la croissance fongique dépend de la concentration du

surnagent et du champignon testé. Tous les extraits d’actinomycètes étudiés ne sont pas

efficaces à une concentration de 2% pour inhiber la croissance des quatre champignons. Le

surnageant de l’isolat SFr3’ semblait stimuler la croissance P.digitatum alors qu’à une

concentration de 5%, 10% et 15% il inhibe la croissance successivement de P.expasum,

R.stolonifer et du F.culmorum. La croissance de ce dernier est inhibée par les trois surnageants

d’actinomycètes à une concentration de 15% de SPO6 et de SFr3’ et à une concentration de

10% de SP13’. Celui-ci apparait donc comme le plus prometteur pour lutter contre ces quatre

champignons phytopathogènes.

CONCLUSION

Cette étude a consisté à isoler et sélectionner des bactéries actinomycétales productrices de

substances antifongiques à partir des échantillons de sol prélevés de différents écosystèmes

R.stolonofifer P.expansum P.digitatum F.culmorum Composition du milieu de culture 2% 5% 10% 15% 2% 5% 10% 15% 2% 5% 10% 15% 2% 5% 10% 15%

PDA + Surnageant du

SP13’ + - - - + + - - + + - - + + - -

PDA + Surnagent du

SPO6 + + + + + + + - + + - - + + + -

PDA + Surnagent du

SFr3’ + + - - + - - - + + ++ ++ + + + -

Témoin (PDA seul) + + + +

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marocains. Parmi l’ensemble des souches isolées, trois d’entre elles (SP13’, SPO6 et SFr3’) ont

présenté une importante activité inhibitrice vis-à-vis de quatre champignons phytopathogènes.

La souche Sp13’, qui a montré une forte activité antifongique, a été isolée d’un écosystème

pollué ayant un pH alcalin et une salinité élevée par rapport aux autres écosystèmes, ce qui

incite à orienter la recherche de substances bioactives à partir des bactéries actinomycétales

vers l’exploitation des écosystèmes inhabituels (pollués, salins, arides etc.).

Les résultats obtenus à partir des tests de sensibilité de R. stolonifer, de P. digitaum, de

P.expansum et de F.culmorum aux extraits d’actinomycètes pourraient être exploités de deux

manières, la première consiste à utiliser les actinomycètes comme moyen de lutte biologique

contre les maladies végétales d’origine fongique (les surnageants des actinomycètes étudiés ont

inhibé la croissance des champignons phytopathogènes), et la deuxième consiste à exploiter les

autres propriétés physiologiques des actinomycètes (sécrétion d’enzymes, production

d’hormones végétales, induction des mécanismes de défense chez les végétaux etc.) (Beaulieu

et Lerat, 2009) pour améliorer la croissance des plantes (le surnageant de SFr3’ a favorisé la

croissance de P. digitatum).

A la lumière de ces résultats, on peut conclure que les actinomycètes sont d'excellents candidats

producteurs de substances capables de fournir une alternative écologique fiable, efficace pour

le bio-contrôle de ces champignons phytopathogènes. Cependant pour valoriser ces résultats, il

serait intéressant de :

- Identifier les trois souches qui ont montré une large et forte activité antifongique ;

- Optimiser des paramètres culturaux afin d’améliorer la production d’antifongiques ;

- Identifier et caractériser le principe actif des souches d’actinomycètes représentatives et

évaluer leurs effets au champ ou en entrepôt afin de les utiliser comme fongicides

biologiques ou comme stimulateurs de la croissance des plantes.

Elarbi Boussaber


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substance antifongique

risk to the environment

lahoucine hilali1