b01j 13/02 fascÍculo de patente de invenÇÃo
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(11) Número de Publicação: PT 105489(51) Classificação Internacional:
B01J 13/02 (2006)
(12) FASCÍCULO DE PATENTE DE INVENÇÃO
(22) Data de pedido: 2011.01.18
(30) Prioridade(s):
(43) Data de publicação do pedido: 2012.07.18
(73) Titular(es):
ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF TISSUE ENGINEERING AND CELL BASED TECHNOLOGIES & THERAPIES (A4TEC)UNIVERSIDADE DO MINHO, DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE POLÍMEROS, 3B'S RESEARCH GROUP CAMPUS DE GUALTAR4710-057 BRAGA PT
(72) Inventor(es):
ERKAN TURKER BARAN TR
ANA CARINA LOUREIRO MENDES PT
HELENA PAULA DE SOUSA SEPÚLVEDA AZEVEDO PT
RUI LUÍS GONÇALVES DOS REIS PT
(74) Mandatário:
JOSÉ RAUL DE MAGALHÃES SIMÕESRUA CASTILHO, 167 - 2.º LISBOA1070-050 LISBOA PT
(54) Epígrafe: DISPOSITIVO, MÉTODO E SISTEMA DE FABRICO DE MICROCÁPSULAS
(57) Resumo: A PRESENTE INVENÇÃO DESCREVE UM NOVO DISPOSITIVO PARA A FORMAÇÃO DE MICROCÁPSULAS, SENDO BASEADO NA FORMAÇÃO DE MICROGOTAS NO INTERIOR DE UM TUBO DE SILICONE QUE É PERFURADO COM UMA AGULHA NÃO AFIADA COLOCADA NA POSIÇÃO VERTICAL (1). O DISPOSITIVO PRODUZ GOTAS ATRAVÉS DA INJECÇÃO VERTICAL DE UMA MISTURA HIDROFÍLICA POLÍMERO/CÉLULAS NUM FLUXO DE ÓLEO HIDROFÓBICO QUE É MANTIDO HORIZONTALMENTE NUM TUBO DE SILICONE. A INJECÇÃO DA MISTURA POLÍMERO/CÉLULAS NUM FLUXO DE ÓLEO MINERAL RESULTA NA GERAÇÃO DE GOTAS ESFÉRICAS E NA FORMAÇÃO DE UMA EMULSÃO ÁGUA EM ÓLEO DEVIDA À IMISCIBILIDADE DAS DUAS FASES. POSTERIORMENTE, AS MICROGOTAS NA FASE DE ÓLEO SÃO CONVERTIDAS EM MICROCÁPSULAS ESTÁVEIS POR GELIFICAÇÃO NUMA CÂMARA SEPARADA CONTENDO UMA SOLUÇÃO RETICULANTE IÓNICA COM FORÇA IÓNICA E PH FISIOLÓGICOS.A UTILIDADE DAS MICROCÁPSULAS GERADAS PELO DISPOSITIVO DA PRESENTE INVENÇÃO É VIRTUALMENTE ILIMITADA NAS ÁREAS DE MEDICINA REGENERATIVA, LIBERTAÇÃO CONTROLADA DE FACTORES DE CRESCIMENTO OU DE FÁRMACOS.
1
RESUMO
DISPOSITIVO, MÉTODO E SISTEMA DE FABRICO DE MICROCÁPSULAS
A presente invenção descreve um novo dispositivo
para a formação de microcápsulas, sendo baseado na
formação de microgotas no interior de um tubo de silicone
que é perfurado com uma agulha não afiada colocada na
posição vertical (1). O dispositivo produz gotas através
da injecção vertical de uma mistura hidrofílica
polímero/células num fluxo de óleo hidrofóbico que é
mantido horizontalmente num tubo de silicone. A injecção
da mistura polímero/células num fluxo de óleo mineral
resulta na geração de gotas esféricas e na formação de
uma emulsão água em óleo devida à imiscibilidade das duas
fases. Posteriormente, as microgotas na fase de óleo são
convertidas em microcápsulas estáveis por gelificação
numa câmara separada contendo uma solução reticulante
iónica com força iónica e pH fisiológicos.
A utilidade das microcápsulas geradas pelo
dispositivo da presente invenção é virtualmente ilimitada
nas áreas de medicina regenerativa, libertação controlada
de factores de crescimento ou de fármacos.
1
DESCRIÇÃO
DISPOSITIVO, MÉTODO E SISTEMA DE FABRICO DE MICROCÁPSULAS
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se ao encapsulamento de
agentes bioactivos e células em microcápsulas de
hidrogéis com uma distribuição de tamanhos uniforme. Mais
especificamente, a invenção refere-se à produção de
microgotas constituídas por misturas de polímero/células
com tamanho homogéneo, quando injectadas num fluxo de
óleo no interior de tubos elásticos.
ESTADO DA TÉCNICA
O encapsulamento de células vivas no interior de
microcápsulas é de grande relevância em cultura celular,
terapia celular e aplicações em engenharia de tecidos. A
tecnologia de microencapsulamento de células baseia-se na
imobilização de células dentro de uma matriz polimérica,
geralmente de alginato, envolvida por uma camada de poli-
lisina. As microcápsulas de hidrogel protegem as células
encapsuladas das células do sistema imunológico, formando
uma barreira que bloqueia a interacção com imunoglobina e
glóbulos brancos. As microcápsulas, produzidas com
distribuição de tamanho uniforme e forma esférica, podem
ser utilizadas como transportadores celulares e podem
facilitar a sua administração através de uma injecção com
uma seringa. Acresce ainda que as microcápsulas podem
proporcionar um ambiente tridimensional adequado para a
2
cultura de células in vitro. Microcápsulas com diâmetro
médio compreendido entre 300 e 600 µm são geralmente
consideradas óptimas para o encapsulamento de células.
Diferentes métodos de fabrico de microcápsulas têm
sido descritos na literatura. Estes métodos incluem a
utilização de diferentes sistemas capazes de gerar gotas,
tais como a técnica de formação de gotas por extrusão
(manual ou com ajuda de uma bomba de seringa) (K. Ohkawa,
T. Kitagawa, H. Yamamoto, Preparation and
characterization of chitosan-gellan hybrid capsules
formed by self-assembly at an aqueous solution interface,
Macromol. Mater. Eng., 2004, 289:33–40) processos de
“electrospray” - pulverização eléctrica (Y. Fukuia, T.
Maruyama, Y. Iwamatsua, A. Fujiia, T. Tanakaa, Y.
Ohmukaia, H. Matsuyam, Preparation of monodispersed
polyelectrolyte microcapsules with high encapsulation
efficiency by an electrospray technique, Coll. Surf. A,
2010, 370(1-3):28-34); técnicas de co-extrusão (ponta de
co-extrusão) (M. V. Sefton, J.R. Hwang, J. E. Babensee,
Selected aspects of microencapsulation of mammalian cells
in HEMA-MMA. Bioartif. Organs, 1997, 831: 260-270) ou
ainda dispositivos com maior grau de sofisticação como os
dispositvos de microfluídicos (S.-K. Hsiung, C.-T. Chen,
G.-B. Lee, Micro-droplet formation utilizing microfluidic
flow focusing and controllable moving-wall chopping
techniques. J. Micromec. Microeng., 2006, 16:2403–2410).
Embora possam ser preparadas cápsulas com algum grau
de sucesso usando os métodos acima referidos, a maioria
apresenta diversos problemas e limitações, tais como
3
dificuldade em controlar o diâmetro da microcápsula e em
gerar cápsulas com óptima combinação de propriedades em
termos de estabilidade, permeabilidade,
biocompatibilidade, entre outras. Os dispositivos de
microfluídicos surgiram recentemente como novo método de
encapsulamento. Estes dispositivos têm sido aplicados na
formação de regimes de fluxo em sistemas multi-fásicos de
água em óleo contendo gotas monodispersas. (S. Abraham,
Y. H. Park, J. K. Lee, C. S. Ha, I. Kim, Microfluidic
synthesis of reversibly swelling porous polymeric
microcapsules with controlled morphology. Adv. Mater.,
2008, 20:2177-2182). Recentemente, a tecnologia de
microfluídicos tem sido aplicada no encapsulamento de
células animais em microcápsulas de polissacarídeos. (L.
Capretto, S. Mazzitelli, G. Luca, C. Nastruzzi,
Preparation and characterization of polysaccharidic
microbeads by a microfluidic technique: Application to
the encapsulation of Sertoli cells. Acta Biomater., 2010,
6:429-435).
O fabrico de dispositivos de microfluídicos é, por
outro lado, bastante laborioso e requer técnicas de
microfabricação sofisticadas. Nestas técnicas, usa-se
tipicamente um substrato de silício cristalino, ou lâmina
de vidro, que é revestido com um polímero fotosensível
(fotoresistência). Aplica-se uma máscara, contendo um
determinado padrão desenhado na micro-escala, sobre a
fotoresistência seguido de uma exposição de feixe de
electrões ou radiação UV. Finalmente, procede-se a uma
processo de decapagem do substrato para obter micro-
canais com uma profundidade reprodutível. O substrato
4
decapado deverá ser perfurado de modo a permitir a
entrada e saída de fluidos, sendo os tubos conectores
montados nas perfurações feitas no substrato. Tem havido
enorme interesse no desenvolvimento de métodos de
encapsulamento que sejam rápidos, fáceis de manusear,
reprodutíveis e que permitam simultaneamente um controlo
sobre as propriedades das microcápsulas.
O dispositivo de tubos da presente invenção não
requer todas as etapas de microfabricação e perfuração
descritas para obtenção dos dispositivos de
microfluídicos. O tubo elástico usado na presente
invenção, disponível comercialmente numa ampla gama de
diâmetros internos, garante regimes de escoamento
convenientes. Este dispositivo de tubos exige apenas a
montagem de uma parte central e uma agulha com ponta não
afiada apoiada num suporte colocado na posição vertical.
O dispositivo quando montado é bastante flexível e pode
ser ligado a bombas peristálticas e de seringa por tubos
conectores. A presente invenção é bastante adequada para
aplicações à escala laboratorial e piloto.
O transplante de células encapsuladas em
microesferas ou microcápsulas é uma abordagem promissora
para o tratamento de doenças metabólicas e endócrinas (F.
Lim, A. M. Sun, Microencapsulated Islets as bioartificial
endocrine pancreas, Science, 1980, 210:908-910; M. V.
Sefton, W. T. K. Stevenson, Microencapsulation of live
animal cells using Polyacrylates, Adv. Polym. Sci., 1993,
107:143-197).
5
Microcápsulas para encapsulamento de células vivas
têm também aplicações nas áreas de cultura de células in
vitro e engenharia de tecidos. Existe um interesse
considerável na produção de microcápsulas ou microesferas
de tamanho uniforme para encapsular células vivas. Para
uma utilização clínica ou de laboratório bem sucedida, a
microcápsula deverá ser produzida com uma distribuição de
tamanho estreita e morfologia esférica. Preferivelmente,
os dispositivos de produção de microcápsulas deverão ser
reutilizáveis, de fácil limpeza e esterilizáveis por
técnicas convenientes, tais como autoclavagem.
Recentemente, a tecnologia de microfluídicos tem
providenciado métodos alternativos para preparar
microcápsulas com morfologia controlada e tamanho
uniforme. A maioria dos sistemas de micofluídicos foi
concebida para aplicação em encapsulamento de fármacos.
Nos últimos anos tem havido diversos estudos referindo
esta técnica para encapsulamento de células. Contudo, a
complexidade dos procedimentos de microfabricação usados
na preparação destes sistemas poderá limitar a sua
utilização prática em aplicações de microencapsulamento
celular.
O objectivo da presente invenção é o desenvolvimento
de um dispositivo para encapsulamento de células baseado
na formação de microgotas constituídas por misturas de
polímero/células quando injectadas num fluxo cruzado de
óleo que circula num tubo estreito. O dispositivo é
autoclavável e produzido com materiais biocompatíveis; a
sua configuração permite uma fácil conexão a bombas de
6
seringa e peristáltica, seringa adequada e respectivos
conectores/adaptadores.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um dispositivo para
microencapsulamento baseado na geração de microgotas
dentro de um tubo através da injecção de uma mistura de
polímero-hidrogel num fluxo de óleo. O dispositivo pode
produzir microgotas com uma distribuição de tamanhos
estreita em condições de injecção constante de misturas
de polímero/células ou polímero/agente bioactivo num
fluxo de óleo, mantidos por uma bomba de seringa e
peristáltica, respectivamente.
O gerador de microgotas descrito é capaz de
dispensar uma solução de polímero num fluxo de óleo
através de uma agulha hipodérmica com ponta não afiada
posicionada verticalmente no centro do tubo. A junção
estável da agulha no local de punção do tubo é assegurada
por um suporte da agulha elástico que pode fixar a agulha
na posição vertical e fixá-la ao tubo de forma firme.
O gerador de microcápsulas para encapsulamento de
agentes bioactivos é composto por uma plataforma, tubos
elásticos, agulha hipodérmica com ponta não afiada,
suporte da agulha e adaptadores para a seringa e
extremidades dos tubos. A plataforma, de preferência
feita de poli-(tetrafluoretileno) (PTFE), possui um
espaço aberto de forma semi-circular na posição
7
horizontal para segurar e orientar o tubo numa posição
recta e duas pinças ajustáveis para fixar o tubo no
local. A agulha hipodérmica é inserida até metade do
diâmetro do tubo em profundidade, através de um pequeno
furo, e a junção agulha/tubo é estabilizada e assegurada
pelo suporte da agulha. O mencionado suporte da agulha
tem uma parte cilíndrica oca que permite a passagem da
agulha através do canal e suporta o encaixe plástico da
agulha na parte superior. A parte cilíndrica do suporte
da agulha é côncava na parte inferior para permitir um
melhor ajuste ao tubo, segurar firmemente o tubo, e assim
vedar eficientemente o orifício. Adicionalmente, o
suporte da agulha estabiliza o tubo e a agulha, através
das suas abas semi-circulares, que podem ser coladas na
superfície do tubo.
A injecção da solução de polímero na agulha
hipodérmica é efectuada pela bomba de seringa através de
um tubo extensor que é conectado à agulha e seringa
através de adaptadores canhão seringa-tubo e tubo-
seringa, respectivamente.
A perfusão de óleo para a entrada do tubo, que é
fixado numa plataforma horizontal, é feita através de uma
bomba peristáltica. A saída do tubo é conectada a um vaso
colector que contém uma solução de gelificação com um
agente emulsificante para a formação de microcápsulas. A
solução no recipiente colector pode ser agitada durante o
processo de gelificação usando um agitador magnético
convencional.
8
Agentes superficiais activos biocompatíveis, como o
Tween-80®, podem ser utilizados na solução gelificante
para impedir a agregação das microgotas da mistura
polímero/células quando saem da parte terminal do tubo e
entram em contacto com a solução gelificante. De acordo
com a presente invenção, uma solução de polímero com
capacidade de formar um gel é utilizado para formar
microcápsulas que podem encapsular vários materiais. O
material deverá ter um tamanho suficientemente pequeno
para ser adequado no encapsulamento através do método de
formação de gotas descrito na presente invenção, mas cujo
diâmetro poderá variar desde menos de 100 micrómetros até
vários milímetros. Um dos aspectos mais relevantes da
presente invenção é a possibilidade do dispositivo gerar
microgotas com distribuição de tamanho uniforme e
controlado. O presente processo permite que células
viáveis sejam encapsuladas em microcápsulas. Deste modo,
será reconhecido que o processo desta invenção é
particularmente adequado para uso em encapsulamento de
materiais biológicos. Por conseguinte, uma das
modalidades preferidas da presente invenção enquadra-se
no contexto do encapsulamento de materiais biológicos. Os
materiais biológicos a serem encapsulados poderão ser
tecidos, organelos, células vegetais ou animais,
bactérias, entre outros. A presente invenção utiliza uma
linha celular de condrócitos de rato (células ATDC5) nas
experiências de encapsulamento de células. As células a
encapsular não se limitam apenas a células condrocíticas,
mas poderão incluir outro tipo de células, como culturas
primárias (ilhéus pancreáticos, hepatócitos,
fibroblastos, osteoblastos, condrócitos articulares,
9
células estaminais mesenquimais) bem como outras linhas
celulares estabelecidas.
O polímero formador de gel pode ser qualquer
polímero não tóxico, solúvel em água que deverá gelificar
quando em contacto com uma solução indutora de
gelificação (solução de iões multivalentes ou polímeros
carregados - polímeros polielectrólitos). O polímero
formador de gel poderá ser um polissacarídeo solúvel em
água. Polissacarídeos adequados incluem alginato de
sódio, goma de guar, goma arábica, carragenina, pectina,
goma xantana, goma gelana, quitosano. Após o contacto com
a solução indutora de gelificação, as moléculas de
polissacarídeo formam uma membrana de gel insolúvel em
água com forma de microcápsula. Outros polissacarídeos
incluem, por exemplo, ácido hialurónico, sulfato de
condroitina, sulfato de dextrano, heparina, sulfato de
heparina, heparan-sulfato. Estes polímeros podem formar
cápsulas por complexação entre polímeros
polielectrólitos. Os polímeros com capacidade de formar
géis que podem ser usados com a presente invenção não se
limitam apenas a soluções aquosas de polímeros
hidrofílicos, mas também podem ser utilizados polímeros
anfifílicos com propriedades de auto-organização
molecular em soluções fisiológicas. Além disso, polímeros
hidrofóbicos solúveis em solventes orgânicos podem ser
usados no dispositivo da presente invenção, bastando ter
uma solução aquosa imiscível na fase contínua nos tubos
de modo a obter uma emulsão do tipo óleo em água.
10
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1 ilustra uma projeção isométrica do
dispositivo de tubos para formação de microgotas
mostrando o dispositivo com as suas partes montadas e
separadas.
Figura 2 ilustra o corte de secção da parte central do
dispositivo numa vista frontal, onde a agulha é
inserida no tubo e vedada pelo suporte da agulha.
Figura 3 ilustra o dispostitivo de encapsulamento,
incluindo o sistema de tubos que geram as
microcápsulas, conjuntamente com os dispositivos de
perfusão de óleo por uma bomba peristáltica e injecção
da mistura polímero/células através de uma bomba de
seringa.
Figura 4 apresenta uma fotografia de microscopia de
fluorescência de células (linha celular de condrócitos
de rato ATDC5) encapsuladas em microcápsulas de
carboximetilxantana mostrando que as células
encapsuladas se mantêm viáveis após 21 dias de
cultura.
11
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
O aparelho microencapsulador (1) é composto
principalmente por um tubo horizontal (5) e uma agulha
vertical (7) suportados por uma plataforma de tubos (2) e
suporte da agulha (6), respectivamente.
A parte vertical do presente dispositivo consiste
num suporte da agulha (6), agulha com ponta não afiada
(7) e um adaptador (8) que conecta o canhão da agulha
(parte plástica colorida com sistema de encaixe
universal) e um tubo extensor (9). Na extremidade do tubo
extensor, o adaptador tubo-seringa (10) faz a conexão com
a seringa (11) que é montada numa bomba de seringa (12).
O tubo horizontal, no qual a agulha é inserida, é
suportado por uma plataforma (2). A plataforma contém um
canal aberto semi-circular (3) e pinças ajustáveis (4)
para fixação do tubo na forma extendida e horizontal.
Para esterilização do dispositivo por procedimentos
convenientes de autoclavagem, podem ser seleccionados
materiais de tetrafluoroetileno (PTFE) para a plataforma
e elastómero de silicone resistente ao calor (Novosil®)
para o tubo. O diâmetro do tubo e o calibre da agulha
podem variar de acordo com as necessidades específicas do
processo de encapsulamento. Os exemplos descritos
utilizam tubos de 1 mm de diâmetro interno e seringa de
calibre 21G para produzir microgotas de soluções viscosas
de polissacarídeos com diâmetros próximos de 400 µm,
proporcionando um encapsulamento de células estável. O
tamanho das microgotas poderá ser reduzido usando uma
12
agulha de menor calibre e tubo com menor diâmetro
interno. Por outro lado, o tamanho das microgotas poderá
ser aumentado pelo processo reverso.
A agulha de ponta não afiada é inserida no tubo
horizontal através do suporte da agulha. A inserção da
agulha pode ser facilitada fazendo um orifício estreito
(menor que o diâmetro da agulha) através de punção do
tubo antes de inserida. A agulha pode-se mover facilmente
no centro do tubo, através do alargamento do orifício no
suporte da agulha e parede do tubo, dado que são usados
materiais elásticos. Este método de inserção veda
fisicamente a agulha no local de inserção. Após inserção,
o suporte da agulha pode ser colocado à volta do tubo
para melhor fixação. O suporte da agulha tem dupla
função: fixa a agulha em posição vertical, evitando o seu
deslocamento do local de punção e proporciona uma vedação
eficaz no tubo, evitando fuga de líquidos. A vedação é
mais eficiente se for aplicada uma camada de cola de
silicone nas abas do suporte da agulha previamente à
inserção da agulha no tubo. Por conseguinte, a disposição
das abas em torno do tubo e a cura da cola de silicone
permite uma vedação permanente em torno do local de
punção.
O tubo extensor (9) permite uma conexão flexível
entre a seringa (11) que é montada numa bomba de seringa
(12) e a agulha (7), usando adaptadores “Luer” macho (8)
e fêmea (10). Ao permitir uma operação fácil de conexão
da seringa ao encaixe plástico da agulha, serão evitados
possíveis deslocamentos e danos da montagem.
13
O óleo mineral bioinerte, que pode ser autoclavado,
é guardado estéril num frasco de vidro (13) que é montado
com uma agulha de pipetagem com um encaixe do tipo “Luer”
e uma membrana de filtro (0.22 µm) na sua tampa para
manter a pressão atmosférica no frasco em condições
estéreis. O óleo é bombeado para fora do reservatório e
levado para o dispositivo de tubos através de uma bomba
peristáltica com batentes ajustáveis usando tubos
estéreis (15). As tensões de corte geradas dentro do
dispositivo de tubos actuam na extremidade da agulha,
formando as microgotas compostas por polímero/células. As
microgotas em óleo podem ser transportadas até ao frasco
colector (17) com a solução indutora de gelificação
usando um tubo largo e inerte (de preferência PTFE) (16)
que garante uma interacção mínima da micro-gota com a
superfície. As microgotas gelificam quando saem do tubo e
entram na solução indutora de gelificação. A agitação
deverá ser suficiente mas moderada de modo a evitar a
agregação das microcápsulas gelificadas. Nesta etapa, uma
agitação mais drástica poderá danificar as paredes
prematuras das microcápsulas formadas, em particular
quando são utilizadas barras magnéticas para agitar. O
uso de agentes biocompatíveis emulsificadores, como Tween
80®, a baixas concentrações, impede a agregação das
microcápsulas na solução indutora de gelificação. A
composição da solução indutora de gelificação poderá
variar, dependendo do método de gelificação pretendido
(como por exemplo técnicas de reticulação iónica,
complexação iónica ou gelificação por auto-organização
molecular). A solução de gelificação pode ser preparada
14
numa concentração adequada usando sais divalentes, como o
CaCl2, para polímeros aniónicos. É essencial que a força
iónica da solução reticulante seja mantida à concentração
iónica fisiológica (NaCl 0.9%) e pH 7.4 para assegurar a
viabilidade das células encapsuladas.
A solução poli-iónica deverá ser constituída por um
electrólito de carga oposta à do polielectrólito das
microcápsulas. A reacção de complexação ocorre quando os
polímeros de cargas opostas reagem (com por exemplo
interacções polissacarídeo-polissacarídeo, polissacrídeo-
proteínas/péptidos). No caso de complexação de
péptidos/proteínas com polissacarídeos, o pH deverá ser
ligeiramente inferior ao ponto isoeléctrico, enquanto o
pH do polissacarídeo deverá ser mantido a pH fisiológico.
A solução indutora de gelificação para biopolímeros com
propriedades de auto-organização molecular poderá ser
qualquer tipo de solução fisiológica (como por exemplo,
solução tampão fosfatada salina ou meio de cultura
celular), que deverá induzir a formação de gel por
processos de auto-organização molecular.
A descrição desta invenção é complementada com os
seguintes exemplos que visam proporcionar uma melhor
compreensão da mesma. Contudo, estes exemplos não deverão
ser tratados com uma natureza restritiva.
Exemplo 1 - Este exemplo demonstra a preparação de
microcápsulas por reticulação iónica do biopolímero poli-
aniónico (carboximetilxantana - derivado da goma xantana)
na presença de contra-iões. Neste método, a mistura de
15
material bioactivo (suspensão de células ATDC5 em meio de
cultura contendo 5% de carboximetilxantana) é extrudida
através do dispositivo de formação de gotas para uma
solução gelificante contendo 1.5% CaCl2 e 0.9% NaCl. Os
catiões Ca2+ reticulam a matriz de carboximetilxantana
formando quase instantaneamente um gel na forma de
esfera. As esferas são depois tratadas com poli-L-lisina
para reforçar a superfície externa das microcápsulas. As
microcápsulas apresentam forma esférica com um diâmetro
médio de 500 µm (Figura 4). Um teste de viabilidade
celular “Live/Dead assay” das células encapsuladas mostra
que as células permanecem viáveis nas microcápsulas até
21 dias em cultura.
Exemplo 2 - Este exemplo demonstra um método moderado de
encapsulamento de células desencadeado pela auto-
organização molecular de um polímero anfifílico composto
por um polissacarídeo aniónico (goma xantana) conjugado
com um grupo hidrofóbico de ácido palmítico. Neste
método, a mistura de material bioactivo (suspensão de
células ATDC5 em meio de cultura contendo 1% de
palmitoil-xantana) é extrudida através do dispositivo de
formação de gotas para uma solução tampão fosfatada
salina. Nesta solução, as gotas de palmitoil-xantana
auto-organizam-se na forma de cápsula. As microcápsulas
formadas são ocas sendo depois tratadas com poli-L-lisina
para reforçar a sua superfície externa. As microcápsulas
apresentam forma esférica com um diâmetro médio de 450
µm. A capacidade das microcápsulas de palmitoil-xantana
para manter a viabilidade e proliferação das células
encapsuladas foi confirmada pelos testes de AlamarBlue® e
16
quantificação do ácido desoxirribonucleico (ADN) das
células.
Lisboa, 18 de Janeiro de 2011
1
REIVINDICAÇÕES
1. Dispositivo de micro-encapsulamento caracterizado
por compreender um tubo elástico horizontal (5) suportado
por uma plataforma de tubos (2) e uma parte vertical
contendo um suporte da agulha (6), uma agulha não afiada
na extremidade (7) e um adaptador (8) que deverá estar
conectado entre o canhão (encaixe plástico) da agulha e o
tubo extensor (9), estando a dita agulha (7) inserida no
tubo horizontal através do mencionado suporte da agulha
(6) que permite uma vedação estanque entre o tubo
perfurado e a agulha através das suas abas fixadas com
cola de silicone contendo um agente de cura.
2. Dispositivo de micro-encapsulamento de acordo com a
reivindicação 1, caracterizado por ter uma plataforma (2)
para alinhar o tubo na posição horizontal com um canal
semi-aberto (3) e fixação por duas pinças (4) em cada
lado da mencionada plataforma para manter o tubo esticado
e na posição horizontal.
3. Dispositivo de micro-encapsulamento de acordo com as
reivindicações 1 e 2, caracterizado por compreender um
tubo extensor (9) que permite uma operação fácil e a
ligação entre a seringa (11) montada numa bomba de
seringa (12) e uma agulha inserida no tubo horizontal
através de um suporte da agulha (6) sendo a conexão do
2
tubo extensor à agulha e seringa realizada com o
adaptador canhão seringa-tubo (8) e adaptador de tubo-
seringa (10), respectivamente, permitindo um mínimo de
distorção no dispositivo montado (1) que necessita da
agulha em posição vertical e sem problemas de vedação
entre o tubo e o suporte da agulha.
4. Dispositivo de micro-encapsulamento de acordo com as
reivindicações anteriores, caracterizado por gerar
microgotas no dispositivo de tubos que são transportadas
em tubos de PTFE e libertadas numa solução gelificante
com agente emulsificante sob agitação moderada em
condições fisiológicas.
5. Dispositivo de micro-encapsulamento, de acordo com
as reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto
dos seus principais componentes serem fabricados com
materias inertes, biocompatíveis e autoclaváveis,
permitindo um fácil e rápido processo de esterilização.
6. Método de preparação de microcápsulas, caracterizado
por formação de gotas obtidas através da injecção
vertical de uma mistura hidrofílica de polímero-
hidrogel/células num fluxo hidrofóbico de óleo, mantido
horizontalmente no tubo de silicone do dispositivo
descrito na reivindicação 1, em que a injecção da mistura
polímero/célula numa corrente de óleo mineral resulta na
formação de gotas esféricas e de emulsões de água em
3
óleo, sendo as ditas gotas numa fase de óleo convertidas
em microcápsulas estáveis por gelificação numa câmara
separada contendo uma solução reticulante iónica com
força iónica e pH fisiológicos.
Lisboa, 18 de Março de 2011
1/4
Figura 1
2/4
Figura 2
3/4
Figura 3
4/4
Figura 4
M0343.04 2
Relatório de Pesquisa PORTUGAL
Refª do pedido:
105489
A. CLASSIFICAÇÃO DA MATÉRIA
B01J 13/02 De acordo com a Classificação Internacional de Patentes
B. DOMÍNIOS PESQUISADOS Documentação e bases de dados electrónicas pesquisada
WPI, EPODOC, EMBASE, MEDLINE, NPL, XPESP, ESPACENET, GOOGLE, SI-INPI C. DOCUMENTOS CONSIDERADOS RELEVANTES
Categoria* Citação do documento, com indicação, sempre que apropriado, das passagens relevantes
Relevante para a reivindicação nº
A
WO 9959715 (A1) (NASA) Todo o documento
Todas
A
EP 1702675 (A1) (GAT FORMULATION) Todo o documento
Todas
A
WO 2010111347 (A2) (ADVANCED BIONUTRITION CORP; HAREL MOTI) Todo o documento
Todas
� Mais documentos na continuação da caixa C. �Ver a família de docs. de patente em anexo. * Categorias especiais dos documentos citados: “A” “E” “L” “O” “P” “D”
Documento que define o estado da técnica em geral e que não se considera ser de particular relevância; Pedido de patente anterior mas que é publicado na mesma data ou em data posterior à do pedido; Documento que pode lançar dúvidas sobre a reivindicação de prioridade, ou que é citado para estabelecer a data de publicação de outra citação ou qualquer outra razão (como especificado); Documento que se refere a uma divulgação oral, uso, exibição ou qualquer outro meio; Documento publicado antes da data de pedido mas depois da data de prioridade. Documento citado no pedido
“T “ “X” “Y” “&”
Documento publicado depois da data de pedido ou prioridade e que não está em conflito com o pedido mas que é citado para compreender o princípio ou teoria subjacente à invenção; Documento de particular relevância; a invenção reivindicada não pode ser considerada nova nem implicar actividade inventiva quando o documento é considerado isoladamente; Documento de particular relevância; a invenção reivindicada não pode ser considerada como tendo implicado actividade inventiva quando o documento é combinado com um ou mais deste tipo de documentos, dado que a combinação é evidente para um perito na especialidade; Documento membro da mesma família de documentos de patente;
Data do termo da pesquisa
16/05/2011
Data de expedição do relatório de pesquisa
16/05/2011
INPI, Campo das Cebolas 1149-035 LISBOA Fax: 21 886 98 59
Técnico examinador:
Isaura Monteiro
Telefone: 218818110
M0343.04 3
Relatório de Pesquisa PORTUGAL
Refª do pedido:
105489
C (Continuação). DOCUMENTOS CONSIDERADOS RELEVANTES
Categoria* Citação do documento, com indicação, sempre que apropriado, das passagens relevantes
Relevante para a reivindicação nº
M0343.04 5
Relatório de Pesquisa PORTUGAL
Informação sobre os membros da família de documentos de patente
Refª do pedido:
105489
Documento de patente citado no relatório
Data de publicação Membro(s) da família Data de publicação
WO 9959715 A1 1999-11-25 AT 256497 T 2004-01-15
DE 69913685 T2 2004-10-07
EP 1079918 A1 2001-03-07
EP 1079918 B1 2003-12-17
ES 2214028 T3 2004-09-01
WO 9959554 A1 1999-11-25
WO 9959555 A1 1999-11-25
WO 9959714 A1 1999-11-25
EP 1702675 A1 2006-09-20 AU 2004298792 A1 2005-06-30
AU 2004298792 B2 2010-07-15
BR PI0417767 A 2007-04-17
CA 2550615 A1 2005-06-30
CN 1917946 A 2007-02-21
CN 100566812 C 2009-12-09
ECSP 066708 A 2006-10-31
EP 1702675 A1 2006-09-20
ES 2235642 A1 2005-07-01
ES 2235642 B2 2006-03-01
JP 2007521135 T 2007-08-02
MX PA06006735 A 2007-02-16
US 2007077308 A1 2007-04-05
US 2008102132 A2 2008-05-01
US 2011064778 A1 2011-03-17
US 2011064817 A1 2011-03-17
WO 2005058476 A1 2005-06-30
WO 2010111347 A2 2010-09-30 WO 2010111347 A3 2011-01-13