b5 targeting ras 2014

8/18/2019 B5 Targeting Ras 2014

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Le proteine Ras e disordini

proliferativi Ras-dipendenti


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Ras as a target for proliferative disorders or geneticsyndromes therapy

Strategies for Ras signalling attenuation4) INIBIZIONE DELL ATTIVITA

DI RAS

mRNA Ras

1) INIBIZIONE DELL

ESPRESSIONE traduzione

Proteina Ras

2) INIBIZIONE

DELLA

LOCALIZZAZIONE

IN MEMBRANA

modificazione

post

- traduzionale

effettori

a valle

3) INIBIZIONE

DEGLI

EFFETTORI

A VALLE

Attivazione degli

effettori a valle

(

es Raf ,PI3K..)

GAP

GEF Ras Ras

m.p

nucleo Attivazione promotori Ras - dipendenti

(es. c - Fos , c - Jun , c -

Myc )ras

fos

4) INIBIZIONE DELL ATTIVITA

DI RAS

mRNA Ras

1) INIBIZIONE DELL

ESPRESSIONE traduzione

Proteina Ras

2) INIBIZIONE

DELLA

LOCALIZZAZIONE

IN MEMBRANA

modificazione

post

- traduzionale

effettori

a valle

3) INIBIZIONE

DEGLI

EFFETTORI

A VALLE

Attivazione degli

effettori a valle

(

es Raf ,PI3K..)

GAP

GEF Ras

Ras Ras

Ras

m.p

nucleo Attivazione promotori Ras - dipendenti

(es. c - Fos , c - Jun , c -

Myc )ras

ras fos

fos

RAS ACTIVITY INHIBITION

MEMBRANE

LOCALIZATION

INHIBITION

Post-traslational

modification

PROTEIN

EXPRESSION

INHIBITION

Ras protein

traslation

DOWNSTREAM

EFFECTOR

INHIBITION

Down-stream effectoractivation

Activation of Ras dependent promotors

blocking protein expression

blocking membrane localization post-translational processing (FTIs)membrane anchorage (FTs)

blocking Ras activityGTPase sensitivity (DABP-GTP)effector interaction (MCP e SulindacGDP/GTP exchange freezing inactive form with GEF-DN

blocking downstream effectors


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Inibizione dell’espressione di proteine Ras

DNA antisenso

si appaiano a mRNA codificante Ras inibendone traduzione(ingombro sterico e indirizzamento a degradazione da RNAsiH)

oligonucleotide di 15bp complementare a 5’end di mRNA codificante H-rasin NIH3T3 trasformate da oncogene H-ras riduce espressione del 90%,riduzione del potenziale tumorigenico

adenovirus portante oligonucleotide antisenso (2Kb) di K-ras in cellule di carcinoma polmonareriduce espressione e potenziale tumorigenico

sono labili! degradati da nucleasi cellulari

problemi di stabilità e distribuzione (limitazione per uso terapeutico)

molecole antisenso di nuova generazione sostituzione dei legami fosfodiesterici con fosfotioati

20mero-fosfotioato (ISIS 2503) in grado di appaiarsi al sito di inizio della traduzione di H-ras

in trials clinici RISULTATI NON POSITIVI


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RNA interference

siRNA si appaiano a mRNA codificante Ras in specifiche regioni ! RNAds riconosciuto edegradato dall’enzima RNase III Dicer

vettore virale portante un siRNA specifico per l’oncogene K-rasV12 in NIH3T3 trasformate da oncogene K-ras riduce espressione

riduzione del potenziale tumorigenico

specifici verso forme oncogeniche di Ras

nessun siRNA in trials clinici per problemi di distribuzione e stabilità (EFFICACIA DI SOMMINISTRAZIONE)

Ras interference as cancer therapy Duursma and Agami (2003) Seminars in Cancer Biology 13. 267-273


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Quercitinaflavonoideanti-ossidanticontenuto in

mele rosse (fresche buccia!) cipollemirtilliribesvino rosso etc…..

QUERCETIN INHIBITS p21-RAS EXPRESSION IN HUMAN COLON CANCER CELL

LINES AND IN PRIMARY COLORECTAL TUMORSRanelletti et al., Int. J. Cancer: 85, 438–445 (2000)

Immunocytochemical studies have revealed that 10 mMquercetin reduced the steady state levels of p21-ras proteinsin both colon cancer cell lines and primary colorectal tumors.

These findings were confirmed by Western blot and flowcytometric analysis showing that the inhibition of p21-ras

expression by quercetin was time- and concentrationdependent. Twenty-four-hour treatment with 10 mM quercetinreduced p21-ras levels to about 50% of control values.

Quercetin was similarly effective in inhibiting the expressionof K-, H-, and N-ras proteins. Moreover, the effect of

quercetin on ras oncogene expression was not dependent onthe cell cycle position of colon cancer cells and appeared tobe specific and not merely a consequence of overall inhibition

of protein synthesis. Northern blot analysis revealed thatquercetin produced in colon cancer cells an early (30 min)

reduction of the steady state levels of K-, H-, and N-rasmRNAs. This reduction was also present after 6 hr of flavonoid treatment. These effects of quercetin suggest a

possible chemopreventive role for this compound incolorectalcarcinogenesis.

Abstract


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EXCURSUS... Modificazioni post-traduzionali (acilazioni)

La localizzazione di proteine in membrana può essere dovuta al legamecovalente di un gruppo lipidico sia esso un gruppo isoprenilico (farnesyland geranylgeranyl) o un acido grasso (myristate and palmitate).Generalmente sono necessari due segnali per un’associazione stabile allamembrana plasmatica.

S-isoprenyl

Farnesyl (C15)

Geranylgeranyl (C20)

N-myristoyl (C14)

S-palmitoyl (C16)

N

H

-

G

l

y

S - C y s

S - C y s

O

S - C y s

O


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Isoprenilazione (prenilazione)

Isoprene (C5)

Farnesyl residue (C15)

Geranylgeranyl

residue (C20)

Nel citosol


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Consenso per isoprenilazione:CaaX come ultimi quattro residui

C = Cysa = alifatico

X = Gln, Met, Ser => farnesilazioneX = Leu => geranilgeranilazione

Legame tioetere allo zolfo della catena laterale della cisteina.

protein


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Il tripeptide aaX viene poi exciso e il carbissile della

nuova estremità C-terminale viene esterificato con

un gruppo metile.

Esempio proteine ras


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Associazione proteine isoprenilate a faccia citosolica membranaER

Poi trasferimento tramite Golgi al lato citosolico della membrana

plasmatica

Traffico sembra procedere tramite normali vescicole secretorie ma

anche pathway alternativo non ancora chiarito


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! ! ! ! !

!!!

! !

#$% &'()*+

%,*-+.'/( 0+*1-,2 3&45 &(/6,


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Legame di acidi grassi

Acido palmitico (C16): legame tioesterico alla catena lateraledi una Cys.

CH2

SH

protein


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Acido miristico (C14): legame ammidico al gruppo N-terminale.Primo residuo Gly.


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Acido miristico (C14): legame ammidico al gruppo N-terminale.Primo residuo Gly.

Acido palmitico (C16): legame tioesterico alla catena lateraledi una Cys.


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Modificazione con acidi grassi può coesistere con

prenilazione.

Avviene nel citoplasma.

Localizzazione finale proteine modificate: lato citosolicodella membrana plasmatica, ma anche associate a

membrane ER, Golgi, e nucleo.

Segnali non chiariti.

Palmitoilazione reversibile (tioesterasi)

=> regolazione.


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Modificazioni post-traduzionali di Ras per la localizzazione dallato interno della membrana

OCH3

O

S

H NLys

O

H N

SH

Met-Ser

O

SH

H N

Pal-CoAPATase

OCH3

O

S

H NLys

O

H N

S

Met-Ser

O

S

H N

O O

farnesilazione di cys (186) nel motivo CAAX

proteolisi degli ultimi tre residui AAXmetilazione del gruppo carbossilico C-term

Palmitoilazione di cys

Tutte le isoforme di Ras H-Ras, N-Ras e K-RasA

H N Val-Leu-Ser-OH

O

SH

FTase

OP

OP

O-

O-

O

O-

O

H N

Val-Leu-Ser-OH

O

S

1) Endoprotease2) Methyltransferase

H N

OCH3

O

S

legame tioetere


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Modificazioni posttraduzionali delle isoforme di Ras

Motivo polibasico

La regione ipervariabile può essere divisa

nel dominio di ancoraggio lipidico (porzioneC-Terminale) e nel dominio linker, contienele sequenze responsabili per l’ancoraggio

in membrana e per il traffickingintracellulare.

La membrana plasmatica non è

lateralmente omogenea e contienemolti sub-micron domini, clusterproteici e scaffolds associati alla

membrana

Le proteine Ras si localizzano sia alivello di Lipid raft (domini di

membrana arricchiti in colesteroloe sfingolipidi) sia a livello di

cluster o microdomini(nanocluster) non di tipo raft, in

modo isoforma-specifico e stato diattivazione specifico.

in lipid rafte

in nanocluster

in nanocluster


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Lipids Rafts

(Caveolae in mammalian cells)

Signal proteins may be recruitedto such membrane domains

- by scaffold proteins- by insertion of lipid anchors

- by pleckstrin homology or other lipid-binding domains

Microdomains or Aggregates of certain lipids (cholesterol and sphingolipids) in theplasma membrane

containing several different receptors and other signaling proteins

marked by the presence of caveolina


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Grazie a studi basati su microscopia elettronica e metodi biofisici sono stati misurati ilclustering, la diffusione e l’interazione di Ras nelle membrane cellulari. Tali studi hannodimostrato la diversa affinità delle isoforme H- e K-Ras per i lipid raft (domini dimembrana arricchiti in colesterolo e sfingolipidi). Non è rilevabile ne per K-Ras wt ne perK-Ras attivato (K-RasG12V) il legame ai lipid raft. L’affinità ai lipid raft di H-Ras wtcaricato con GDP è elevata e decresce per H-Ras costitutivamente attivato (H-RasG12V)

caricato con GTP. Ci sono indicazioni che N-Ras caricata con GTP ha elevata affinità per iraft.La prenilazione da sola esclude le proteine dai domini tipo raft, mentre la dualeacilazione (palmitoilazione e/o miristoilazione) porta all’associazione con i raft.E’ stato inoltre dimostrato che le forme caricate con GTP di H-Ras e K-Ras associano condistinti cluster o microdomini (nanocluster) nella membrana cellulare insensibili alcolesterolo (non di tipo raft). Da notare che i cluster con cui le forme attivate di H-Ras eK-Ras interagiscono sono dissimili e contengono set non identici di molecole segnale, ad

es galectin-3 si trova solo in nanocluster dove si localizza l’isoforma K-Ras.

Diversa distribuzione delle isoforme di Ras sulla membranacellulare

Heisenberg and Henis Cellular signalling 20:31-39 2008


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Inibizione della localizzazione in membrana delle proteine Ras

Ras

FTaseFTIs

Ras -CAAX

Inibizione della

farnesilazione

FTs

Spiazzamento di Rasdalla membrana

A

B

Inibitori della farnesil-transferasi (FTIs)A)

Acido S-trans-trans-farnesiltiosalicilico (FTs) B)

inibiscono la modificazione post-traduzionale di molecole Ras neo-sintetizzatemediata dalla farnesil-transferasimeccanismi d’azione elucidatistudi in fase clinica

Analogo della farnesil-cisteinainibisce l’associazione in membrana di Rasmeccanismo non notostudi preclinici


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Inibitori delle farnesil-transferasi (FTIs)

possono essere suddivisi in due categorie di inibitori competitivi:

composti che mimano CAAX al C-terminus di Ras riconosciuto dalla farnesil-trasferasi(FT) e competono con Ras per il legame all’enzima FT

di natura peptidicapeptido-mimetici ( "potenziale farmaceutico)

(FTI-276, FTI-277)

di sintesi chimica

tipifarnib (R115777) analogo del quinolone, lonafarnib (SCH663366)

composti che mimano e competono con il gruppo farnesil-fosfato (substratodell’enzima FT)

monoterpeni (Penilyl Alcohol, Limonene)

#

#


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Inibitori delle farnesil-transferasi (FTIs)

Diversi FTIs

si sono dimostrati efficaci nella reversione del fenotipo trasformato ras-dipendente o nellariduzione della tumorigenicità in cellule in coltura e in modelli animali ma...

in trial clinici avanzati (es. tipifarnib e analoghi) si sono dimostrati efficaci solo sualcuni tipi di tumori umani e manifestano elevata tossicità

L’efficacia di FTIs in alcuni trials clinici è probabilmente dovuta a effetti pleiotropici (la farnesil-transferasi ha come substrati oltre a Ras, RhoB, Rho-E, Rap2A, PTP-CAAX1, PTP-CAAX2, CENP-E, CENP-F, Lamin A, Lamin B eHDJ2 )L’inibitore HR12 (FTI) sembra agire inibendo specificatamente la farnesilazione di H-Ras

H-Ras è modificato solo da farnesil-transferasi (FT)K-Ras e N-Ras possono essere modificati anche da geranil-geranil-transferasi (GGT)la maggior parte delle mutazioni dei geni ras nei tumori umani è a carico di K-ras poi inmisura minore di N-Ras e ancora meno su H-Ras

Per un’azione efficace su K-Ras e N-Ras necessita l uso combinato di Inibitori di FT e diGGT, ma causa elevata tossicità


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Zarnestra! (Tipifarnib, R115777) Sarasar! (Lonafarnib, SCH66336)

farnesyltransferase inhibitors in clinical phase


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b5 targeting ras 2014

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