base inm. vs tecnicas15.9 2012(1).ppt
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INTRODUCCION A LA INMUNOSEROLOGIA
Conceptos de Inmunologia estrechamente asociados a la
adecuada interpretacion serológica
(A) Fundamentos de Inmunologia para la comprension de la Inmunoserología
Reconocimiento AntigénicoAntigen Recognition
Las células B pueden reconocer antígenos a través de su sIg
Las células T pueden reconocer antígenos en asociación con un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) molécula a través de su receptor de células T
B cells can recognise antigens via their sIg
T cells can recognise antigens in association with a Major Histocompatibility Complex (MHC) molecule via their T-cell Receptor.
LOS LINFOCITOS B SON LAS UNICAS CELULAS DEL
SISTEMA INMUNE IMPLICADAS EN LA PRODUCCION DE INMUNOGLOBULINAS
Immunoglobulinas
LA FUNCION DE LOS ANTICUERPOS ES UNIR EL ANTIGENO PARA NEUTRALIZARLO O DIRIGIRLO HACIA OTROS COMPONENTES DEL SISTEMA INMUNE A FIN DE ELIMINARLO (FUNCION EFECTORA) DIRECTA O INDIRECTAMENTE MEDIANTE LA PARTICIPACION DE OTRAS CELULAS
- NO TODOS LOS ANTICUERPOS TIENEN SIGNIFICADO DIAGNÓSTICO
- NO TODOS LOS ANTICUERPOS TIENEN SIGNIFICADO PATOGENICO
- NO TODOS LOS ANTICUERPOS TIENEN SIGNIFICADO EFECTOR
Immunoglobulinas
Los anticuerpos pueden estar dirigidos hacia proteinas,
carbohidratos, lipidos y acidos nucleicos.
(Antibodies to nucleic acids and lipids can be found in autoimmune diseases; Antibodies to small organic molecules can cause allergies to drugs)
Immunoglobulinas • Los anticuerpos son
glicoproteinas formadas por 2 cadenas pesadas y 2 cadenas livianas (Cada par es identico).
• Las cadenas livianas y pesadas poseen regiones variables y pueden ser de dos tipos:
ó
H chain
L chain
Immunoglobulinas
Antigen binding sites
}Variable region
Heavy Chain
Light Chain
{Constant region
Amino terminal
Carboxyl terminal
Los anticuerpos son glicoproteinas formadas por 2 cadenas pesadas y 2 cadenas livianas (Cada par es identico). Las cadenas livianas y pesadas poseen regiones variables ( o
La región variable es la responsable de
unir el Ag
Tener presente que....
El anticuerpo es la “version soluble” del Receptor B
¿CÓMO ESTA CONSTITUÍDO EL REPERTORIO DE LINFOCITOS B?
Como un linfocito B es
MONOESPECIFICO,
el repertorio
linfocitario B es la sumatoria de las
especificidades de cada linfocito B
o sus clones respectivos
Un linfocito, una sola especificidad
One Lymphocyte one specificity
Un linfocito, una sola especificidad
One Lymphocyte one specificity
¿COMO Y CUANDO SE GENERA LA DIVERSIDAD DE LOS
RECEPTORES B?
ESTA DIVERSIDAD ES PRODUCIDA POR EVENTOS GENICOS QUE SE
PRODUCEN
-BASICAMENTE- EN DOS COMPARTIMIENTOS:
MEDULA OSEA Y GANGLIO
Generación de la diversidad
Las células B de la línea germinal contienen segmentos de genes capaces de codificar el repertorio de anticuerpos. Esta diversidad es generada por eventos genicos por:
• Re-arreglos genicos- Gene re-arrangements• Diversidad de la unión - Junctional diversity• Diversidad Combinatoria - Combinatorial diversity
(variabilidad intrinseca en el emplame de H & L) • Hipermutación somática-> maduración afinidad • Somatic hypermutation ---> Affinity maturation
• La capacidad de corte y empalme del ADN es exclusiva de los linfocitos
• The ability to cut and splice DNA is unique to lymphocytes.
RECORDAR:
Donde se producen estos eventos generadores de
diversidad
No hay que confundir segmentos génicos con genes!
Don’t confuse gene segments with genes!
PRIMERO SE REORDENAN
LOS GENES DE LA CADENA
PESADA
(DE PRO-B A PRE-B)
Y AL
FINAL LOS DE LA CADENA
LIVIANA
La “recombinacion VDJ”
(de la cadena H)
se desarrolla en varias etapas
comenzando con el corte del
ADN.
Los genes RAG-1 y RAG-2 inician la recombinacion (Genes de Activ. Recombinante).
Exclusión alélica es el proceso por el cual los linfocitos expresan receptores de antígenos de sólo uno de los dos alelos de cadena liviana.
Allelic exclusion is the process by which lymphocytes express antigen receptors from only one of two possible alleles of light chains.
Exclusión AlelicaAllelic exclusion
LOS ANTIGENOS PRESENTES EN LA MO CONDICIONAN LA VIDA O MUERTE DE LOS LB
Selección negativa (deleción)Negative selection (deletion)
• El entrecruzamiento de IgM de membrana en las células B inmaduras pueden causar la muerte celular en la médula ósea
• Crosslinkage of mIgM on immature B cells can cause cells to die within the bone marrow
Las células B inmaduras que reconocen dichos auto-antígenos sufren apoptosis y son eliminados del repertorio.
Immature B cells that recognize such self antigens undergo apoptosis and are therefore
removed from the repertoire.
LA SELECCION NEGATIVA DESENCADENA LA MUERTE MASIVA DE LINFOCITOS B
(APROX. 2/3 MUEREN, OTROS PERSISTEN EN ESTADO
ANERGICO Y EL RESTO MIGRA HACIA LOS OLS)
(COMPARAR CON LOS LT DONDE MUEREN MAS DEL 90% )
–LOS LINFOCITOS B VIRGENES Y TIENEN UNA VIDA MEDIA DE 3 -8
SEMANAS
LOS LINFOCITOS MADUROS Y VIRGENES SON
TRANSPORTADOS HACIA EL GANGLIO
Desarrollo of
B-cells
Development of
B-cells
(Ganglio)
Stem cell Stem cell
Early pro-B cell Early pro-B cell
Late pro-B cell Late pro-B cell
Pre-B cell Pre-B cell
Immature B cell Immature B cell
Mature B cell Mature B cell
Plasma cell Plasma cell
IgM expressed on cell surface IgM expressed on cell surface
Secreted Ig Secreted Ig
Germline DNAGermline DNA
IgM e IgD expressed on cell surface IgM e IgD expressed on cell surface
Corte y empalme del ADN origina fragmentos génicos funcionales
Como se produce el cambio
de isotipo (switch)
(Alternative mRNA splice sites)
¡El cambio de IgM a IgD no es cambio de isotipo !
Un linfocito, una sola especificidad
One Lymphocyte one specificity
Un linfocito, una sola especificidad
One Lymphocyte one specificity
Maduración de la Afinidad
MADURACION DE LA AFINIDAD DE
LOS LINFOCITOS BLa maduración de la afinidad es un proceso
cíclico que involucra a las células B y se relaciona con la hipermutación somatica
HIPERMUTACION SOMATICA
AFINIDAD: INTERACCION RESULTANTE ENTRE LA FUERZAS DE UNION Y DE REPULSION EXISTENTES ENTRE EL
ANTIGENO Y EL ANTICUERPO. (MEDIDA DEL GRADO DE ATRACCION ENTRE EL ANTIGENO Y EL ANTICUERPO)
AVIDEZ: CUANDO LA UNION Ag-Ac ES MULTIVALENTE (IMPLICA A MAS DE UN DETERMINANTE ANTIGENICO) LA
AFINIDAD SE DENOMINA AVIDEZ. EN ESTE CASO EL ANTICUERPO UTILIZA LA TOTALIDAD DE SUS PARATOPES (2
para la IgG y 10 para IgM) PARA INTERACTUAR CON UN ANTIGENO QUE POSEE MAS DE UN EPITOPE IDENTICO.
CONCEPTO DE AVIDEZ
LOS TEST DE AVIDEZ UTILIZAN LAS PROPIEDADES DERIVADAS DE LOS EVENTOS ASOCIADOS A LA REESTIMULACION ANTIGENICA:
LA HIPERMUTACION SOMATICA
LA MADURACION DE LA AFINIDAD
Recordar
• ANTES DE LA DELECION CLONAL (SELECCION NEGATIVA), EL DESARROLLO ES INDEPENDIENTE DEL ANTIGENO (MADURACION) .EL RECONOCIMIENTO DEL ANTIGENO EN LA MEDULA OSEA DA LUGAR A LA SELECCION NEGATIVA (2/3 DE APOPTOSIS, 1/3 DE ANERGIA Y LB RESPONDEDORES)
• EL RECONOCIMIENTO DEL ANTIGENO EN LA PERIFERIA DA LUGAR A LA SELECCION POSITIVA Y ORIGINA LA EXPANSION CLONAL
RECORDAR QUE LA RESPUESTA LINFOCITARIA B FRENTE A PEPTIDOS DEPENDE DE LA COLABORACION CON LOS
LINFOCITOS T
Luego de la activación el LT colaborador expresa CD40L
La interaccion entre CD40 Y CD40L provee la “señal 2”
Recall that a B-CELL needs a signal from a T-HELPER CELL
La re-estimulación requiere de las células T colaboradoras
Recall that a B-CELL needs a signal from a T-Helper
Las citoquinas liberadas por los LT colaboradores condicionan la proliferación,
diferenciación y tipo de inmunoglobulina secretada
Where is activation happening?And what is happening?
La respuesta primaria se inicia en la paracorteza.
Células T responden a un antígeno procesado y presentado por las células dendríticas.
Células B no requieren condiciones tan rigurosas de reconocimiento
Las células T y las células B, colaboran entre si
Las células B migran hacia la periferia de los focos paracorteza donde maduran en células plasmáticas que secretan, primero, y luego IgG IgM.
Algunas células B - junto con algunas de las células T-helper - migran a los folículos primarios en la corteza.
Los folículos 1os se convierten en 2os seen areas de proliferacion (centro germinal) y diferenciación de los LB
RE-ESTIMULACION ANTIGENICA
RESPUESTA INMUNE SECUNDARIA,
TERCIARIA...............
La célula dendritica Folicular no es una CPA y tiene una participación crítica en la respuesta inmune secundaria
La respuesta secundaria y primaria difieren entre si?
La respuesta secundaria es más intensa debido a que:
1. hay más células de memoria específica para un antígeno
2. las inmunoglobulinas de las células de memoria han experimentado la maduración de afinidad y se unen al antígeno con más fuerza.
3. las células de memoria tienen una exposición mucho más amplia contra el antígeno (presentada por las células dendríticas foliculares)
4. la activación de las células de memoria requiere un estímulo más débil.
(B) InmunoensayosFundamentos
Los inmunoensayos son métodos analíticos de diagnóstico sensibles y
específicos que utilizan diversas estrategias para la detección de
antígenos, anticuerpos o moléculas de interes basándose en las propiedades de la interaccion
antígeno-anticuerpo.
Las variantes metodologicas utilizan diversas formas de visualización:
1. Generando agregados macromoleculares que permitan la
visualizaci{on a “ojo desnudo”
2.Utilizando la capacidad intrinseca de las moléculas de unir
diferentes sustancias a nivel molecular que evidencien la unión
Ag-Ac.
Variantes
Puede ser cualitativo (identificación), semicuantitativo o cuantitativo.
Antígenos
Sustancia que puede ser reconocida por uno o mas anticuerpos o receptores
antigenicos.
Cada antígeno suele presentar varios determinantes
antigénicos o epitopes.
Antígenos
Antígenos• Nativos.
• Recombinantes• Péptidos sintéticos
Anticuerpos
Anticuerpos policlonales
• La inmunización de animales inyectando antígeno por la vía adecuada, en dosis adecuadas y en el adyuvante adecuado, (inmunógeno) estimula la producción de anticuerpos con diferentes afinidades y con especificidad por diferentes determinantes antigénicos (anticuerpos policlonales).
Anticuerpos monoclonales
• Se obtienen inmortalizando células plasmáticas por fusión con células de mieloma de ratón. Las células fusionadas (hibridomas) producirán inmunoglobulinas idénticas a las que producía el plasmocito. Por dilución límite se puede aislar (clonar) cada hibridoma, mantenerlo y expandirlo en cultivo.
Anticuerpos monoclonales
Anticuerpos monoclonales
Ventajas
• Alta especificidad, reconocen un único epitopo
• Se pueden obtener en cantidades ilimitadas con las mismas características.
Desventajas
• Mayor costo
COMO EVIDENCIAR LA REACCION Ag-Ac?
• Para poder utilizar la reacción Ag- Ac en un inmunoensayo, siempre debe buscarse una forma de hacer evidente esa reacción (revelado).
• Hay diferentes metodologías de detección.
Marcado Enzima
Radioisótopo
Coloides metálicos
Látex
Fluoróforo
Hematíes Partículas de colorante
• Se puede marcar con una enzima, un radioisótopo, partículas de coloide metálico, partículas de látex, moléculas fluorescentes, hematíes, partículas de colorantes hidrofóbicos, etc.
• Método de uniónEnlace
covalente
Adsorción física
• Luego se necesita una forma de correlacionar la presencia o cantidad de la señal con la concentración de analito.
Necesidades deseables en los análisis
• Menores límites de detección• Detección de analitos de más bajo PM• Mayor especificidad• Velocidad de procesamiento de gran
número de muestras• Diagnósticos rápidos en la oficina del
médico o a nivel doméstico.
TECNICAS DE PRECIPITACION
& AGLUTINACIÓN
(interacciones primarias o a “ojo desnudo”)
La condición de solubilidad de los antígenos y anticuerpos define si la reacción progresa hacia la aglutinación o la precipitación. Si interactúan anticuerpos y antígenos de naturaleza soluble en concentraciones apropiadas, el sistema progresa en el sentido de producir la precipitación de los reactantes.
Cuando el antígeno es particulado o se encuentra localizado en la superficie de una esfera de látex o en la superficie de glóbulos rojos, la interacción con el anticuerpo progresa hacia la aglutinacion, dando lugar a la formacion de agregados macromoleculares.
REACCIONES DE PRECIPITACIÓN
Las técnicas de precipitacion se clasifican según el medio de reacción donde se desarrollan
Concentración de Ag ( g)
Pp
do
(m
g
pro
t .)
Exceso de Ag
Exceso Ac
Equivalencia
Consiste en incorporar un antisuero determinado en una capa fina de agar al que luego se le agrega igual volumen del suero o del antígeno que se desea caracterizar su reactividad. Una vez solidificado, se realizan orificios donde se incorporan diferentes diluciones del antígeno o antisuero específico. El analito (antígeno o anticuerpo, según el caso) de la muestra interactúa con el antígeno o anticuerpo incorporado a la solución de Agar, formando complejos inmunes que en la zona de equivalencia se evidencia por la presencia de un halo de precipitacion que se ubica en concéntrica y es proporcional a la cantidad de antígeno).
ID-RADIAL SIMPLE
ID-RADIALActualmente se utiliza para la cuantificación
de IgM, IgG e IgA sérica. Se coloca el agar mezclado con el antisuero antiisotipo sobre un portaobjeto. Una vez que el agar gelificó, se realizan orificios en la superficie del mismo. La inmunoglobulina presente en el suero difunde en todas las direcciones generando un halo de precipitación cuando se enfrenta al antisuero específico. El halo es proporcional a la concentración de antígeno (en este caso, la inmunoglobulina).
DIFUSIÓN RADIAL DOBLE: Su denominación se refiere a la existencia (doble) de antígenos y de anticuerpos que migran dentro del gel. Ninguno de estos componentes se incorporan al gel hasta que no esté gelificado. Una vez que el gel se ha solidificado, se realizan orificios para incorporar los reactantes y poder cuantificar el analito. Una vez agregados los constituyentes del sistema, tanto antígenos como anticuerpos se desplazan a través del gel.
REACCIONES DE AGLUTINACION
Estas técnicas permiten la
detección cualitativa y
cuantitativa de los antígenos en
solución.
Cuando los antígenos son naturalmente particulados, no es necesario recurrir a ningún soporte especial. Inversamente, cuando no se
dispone de antígenos particulados, debe recurrirse a soportes artificiales (látex, glóbulos rojos, poliestireno, etc) o incluso variantes de un
mismo soporte: se utilizan glóbulos rojos de carnero sensibilizados en la prueba de Waaler-
Rose y glóbulos rojos de conejo en la prueba de Rose-Ragan.
Cuando la técnica se desarrolla con la ayuda de soportes, se denomina
“indirecta o pasiva” .
HEMOAGLUTINACIÓNLa hemoaglutinación utiliza glóbulos rojos, ya sea en forma “directa o activa” utilizando los antígenos inherentes al glóbulo rojo o bien en “forma indirecta” fijando antígenos de interés en la superficie del glóbulo rojo u otra partícula capaz de servir de soporte (látex, carbón activado y poliestireno).
PRINCIPIOS DE LA AGLUTINACIÓN DIRECTAEn presencia de anticuerpos específicos contra epítopes de membranas, los glóbulos rojos (u otro soporte que presente los antígenos, partículas de gelatina) se aglutinan y se depositan como una alfombra (test de Coombs directo, test aglutinación pasiva de partículas para la detección de anticuerpos contra T. Pallidum). Si el anticuerpo se encuentra ausente, los glóbulos rojos se depositan en el fondo formando un grumo que se visualiza como un botón. Aquellos anticuerpos que son incapaces de desencadenar la aglutinación directa requieren otras adaptaciones metodológicas (Ver Test de Coombs indirecto).
La Aglutinación de látex posee el mismo principio pero
utiliza como soporte particulas de latex
• Se enfrenta una cantidad fija del reactivo látex a diluciones en serie del analito. Se observa a simple vista hasta qué dilución hay aglutinación.
• El límite de detección del reactivo látex se ajusta previamente por titulación de un standard internacional.
• Puede haber diferencias entre diferentes operadores.
Inmunoensayos por dispersión de luz
(Poseen el mismo fundamento que
las tecnicas de precipitacion y aglutinacion pero sustituyen
la lectura a “ojo desnudo” con Instrumentos mas
sofisticados)
Fundamento El patrón de dispersión se modifica con el tamaño de partícula, al pasar de monómeros a agregados.
La tendencia actual esta orientada a reemplazar la inmunodifusión mediante la cuantificación por nefelometría. Cuando se incorpora antígeno a una solución con exceso de anticuerpos la cantidad de inmunocomplejos formados puede determinarse por la dispersión de la luz en un nefelómetro. Los valores obtenidos se relacionan con la cantidad de antígeno.
La disponibilidad actual de anticuerpos monoclonales esta reemplazando a la IDR para la determinación de inmunoglobulinas, C3, C4, haptoglobina, ceruloplasmina y CRP en aquellos laboratorios que pueden acceder al equipo adecuado.
Inmunoprecipitación cuantitativa
Muy laborioso el análisis químico de los precipitados
+
Se sustituyó el análisis por la determinación de la turbidez de
soluciones mezcla de Ag y antisuero
Primer paso hacia nefelometría y turbidimetría automatizadas+
Marcado con partículas
Sin marcado
mUAbs
¨conc.
• Turbidimetría- Mide la luz dispersada mediante la disminución en la intensidad del rayo incidente al pasar por la muestra.Se puede realizar en un espectrofotómetro.
• Nefelometría-Mide la dispersión de luz como un incremento promedio de la luz que es dispersada a un ángulo cuando el rayo incidente pasa a través de la muestra. La mejor sensibilidad se logra cuando la fuente de luz es láser.
Se desarrollaron
métodos
mejorados de turbidimetría
y nefelometría marcando las moléculas con partículas de látex
Inmunoensayos por dispersión de luz
Fuente luminosa
Muestra
Detector
Turbidímetro
Nefelómetro
r
Las lecturas se hacen con un lector de microplacas o un espectrofotómetro manual la lectura se realiza al final de la reaccion.
INMUNOBLOT
kDa
94
43
30
14.4
SDS-PAGE
Dirección de la electroforesis
Nitrocelulosa (o PVDF)
Transferencia
Incubación con el suero problema
Conjugado enzimático
Sustrato
Producto insoluble
Sintesis• Etapas principales:• separación por electroforesis según
pesos moleculares (SDS-PAGE), • transferencia a membrana de
nitrocelulosa , incubación con suero problema,
• incubación del conjugado (por ejemplo enzimático),
• revelado y• examen contra patrón de pesos
moleculares.
INMUNFLUORECENCIA
En forma similar a otras técnicas de inmunomarcación, la inmunofluorescencia recurre a la capacidad de ciertos colorantes fluorescentes de unirse a las proteínas sin alterar sus propiedades inmunológicas. A partir de este principio, se desarrolló la inmunofluorescencia indirecta (IFI), que posibilitó su aplicación para la detección de anticuerpos autorreactivos y anticuerpos asociados a enfermedades infecciosas.
Los colorantes fluorescentes poseen la cualidad de emitir luz a una longitud de onda mayor que la que reciben.
INMUNFLUORECENCIA
INMUNFLUORECENCIA INDIRECTA
ELISA
• El ensayo sobre inmunoadsorbente ligado a enzima o ELISA (del inglés: Enzyme-linked inmunosorbent assay) es el enzimoinmunoanálisis más ampliamente utilizado. Entre las ventajas de este ensayo, se encuentran su relativo bajo costo, la seguridad y facilidad de realización, la estabilidad de los reactivos utilizados y sus amplias posibilidades de aplicación.
• Para poder realizar esta técnica es necesario que los anticuerpos o los antígenos se puedan unir covalentemente a una enzima y que este complejo retenga tanto la actividad inmunológica como la enzimática.
ELISA
• La enzima no participa en la interacción antígeno-anticuerpo, su función es catalizar una reacción que ponga de manifiesto la presencia del complejo antígeno-anticuerpo formado. Se utilizan enzimas (Tabla N° 46.1) que sean fáciles de obtener en forma pura y que tengan buena actividad. Las reacciones por ellas catalizadas dan como productos sustancias coloreadas que se pueden medir por métodos sencillos.
• Enzimas empleadas habitualmente en el enzimoinmunoensayo: Fosfatasa alcalina ; Peroxidasa de rábano picante; Glucosa 6fosfato deshidrogenasa; . Catalasa; Glucoamilasa; B D galactosidasa ; Fosfolipasa C ; . Malato deshidrogenasa ; Glucosa oxidasa
ELISA “sandwich”
ELISA competitivo
EJEMPLO DE TEST DE AVIDEZ
PARA QUE UN
“PEDAZO” DE CONOCIMIENTO SEA CONSIDERADO CIENTÍFICO
ES NECESARIO
(AUNQUE NO SUFICIENTE)
QUE PUEDA SER COMPARTIDO.