basic fibroblast growth factor

8/13/2019 Basic Fibroblast Growth Factor

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P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USAV o l . 8 3 , p p . 7 2 9 7 - 7 3 0 1 , O c t o b e r 1 9 8 6C e l l B i o l o g y

B a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r i n d u c e s a n g i o g e n e s i s i n v i t r o( e n d o t h e l i a l c e l l s / c o l l a g e n m a t r i x / p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r / u r o k i n a s e )

R . M O N T E S A N O * , J . - D . V A S S A L L I * , A . B A I R D t , R . G U I L L E M I N t , AND L . O R C I ** I n s t i t u t e o f H i s t o l o g y a n d E m b r y o l o g y , U n i v e r s i t y o f G e n e v a , 1 r u e M i c h e l - S e r v e t , 1 2 1 1 G e n e v a 4 , S w i t z e r l a n d ; a n d f L a b o r a t o r i e s f o r N e u r o e n d o c r i n o l o g y ,T h e S a l k I n s t i t u t e , 1 0 0 1 0 N o r t h T o r r e y P i n e s R o a d , L a J o l l a , CA 9 2 0 3 7C o n t r i b u t e d b y R . G u i l l e m i n , J u n e 1 6 , 1 9 8 6ABSTRACT F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r s ( F G F s ) a r e p o t e n tm i t o g e n s f o r v a s c u l a r a n d c a p i l l a r y e n d o t h e l i a l c e l l s i n v i t r o a n dc a n s t i m u l a t e t h e f o r m a t i o n o f b l o o d c a p i l l a r i e s ( a n g i o g e n e s i s )i n v i v o . A c r u c i a l e v e n t i n t h i s p r o c e s s i s t h e i n v a s i o n o f t h ep e r i v a s c u l a r e x t r a c e f l u l a r m a t r i x b y s p r o u t i n g e n d o t h e l i a lc e l l s . U s i n g a r e c e n t l y d e v e l o p e d i n v i t r o m o d e l o f a n g i o g e n e s i s ,w e s h o w h e r e t h a t h i g h l y p u r i f i e d b a s i c p i t u i t a r y FGF c a ni n d u c e c a p i l l a r y e n d o t h e l i a l c e l l s t o i n v a d e a t h r e e - d i m e n s i o n a lc o l l a g e n m a t r i x a n d t o o r g a n i z e t h e m s e l v e s t o f o r m c h a r a c t e r -i s t i c t u b u l e s t h a t r e s e m b l e b l o o d c a p i l l a r i e s . We a l s o s h o w t h a tb a s i c FGF c o n c o m i t a n t l y s t i m u l a t e s e n d o t h e l i a l c e l l s t o p r o -d u c e a u r o k i n a s e - t y p e p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r , a p r o t e a s e t h a th a s b e e n i m p l i c a t e d i n t h e n e o v a s c u l a r r e s p o n s e . T h e r e s u l t sd e m o n s t r a t e t h a t b a s i c FGF c a n s t i m u l a t e p r o c e s s e s t h a t a r ec h a r a c t e r i s t i c o f a n g i o g e n e s i s i n v i v o , i n c l u d i n g e n d o t h e l i a l c e l lm i g r a t i o n , i n v a s i o n , a n d p r o d u c t i o n o f p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r .T h e f o r m a t i o n o f new b l o o d c a p i l l a r i e s ( a n g i o g e n e s i s ) o c c u r si n a w i d e r a n g e o f i m p o r t a n t b i o l o g i c a l p r o c e s s e s i n r e s p o n s et o a n g i o g e n i c f a c t o r s r e l e a s e d b y e i t h e r n o r m a l o r t u m o r a lc e l l s 1 ) . c r u c i a l s t e p i n t h e s e q u e n c e o f e v e n t s t h a t l e a d st o t h e a n g i o g e n i c r e s p o n s e i s t h e i n v a s i o n o f t h e p e r i v a s c u l a re x t r a c e l l u l a r m a t r i x b y s p r o u t i n g e n d o t h e l i a l c e l l s ( 2 ) . T h ep r o c e s s i n c l u d e s e n d o t h e l i a l c e l l m i g r a t i o n , p r o l i f e r a t i o n , a n dp r o d u c ti o n o f e n z y m e s c a p a b l e o f m o d i f y i n g t h e e x t r a c e l l u l a rm a t r i x . We h a v e r e c e n t l y s h o w n t h a t t h e i n v a s i v e n e s s o fc a p i l l a r y e n d o t h e l i a l c e l l s c a n b e i n d u c e d e x p e r i m e n t a l l y i nv i t r o b y w e l l - d e f i n e d c h e m i c a l s i g n a l s 3 ) . C e l l s g r o w n o nt h r e e - d i m e n s i o n a l c o l l a g e n g e l s a n d t r e a t e d w i t h t h e t u m o rp r o m o t e r 4 / 3 - p h o r b o l 1 2 - m y r i s t a t e 1 3 - a c e t a t e ( P M A ) i n f i l -t r a t e t h e u n d e r l y i n g c o l l a g e n m a t r i x a n d o r g a n i z e i n t o v e s s e l -l i k e t u b u l a r s t r u c t u r e s 3 ) . A l t h o u g h p h o r b o l e s t e r s a r e n o tp h y s i o l o g i c a l l y o c c u r r i n g s u b s t a n c e s , t h e y h a v e b e d n s h o w nt o m i m i c , i n many i n s t a n c e s , t h e e f f e c t s o f e n d o g e n o u sm e d i a t o r s , s u c h a s h o r m o n e s o r g r o w t h f a c t o r s ( 4 - 7 ) . I t w a st h e r e f o r e i m p o r t a n t t o e s t a b l i s h w h e t h e r p h e n o m e n a s i m i l a rt o t h o s e i n d u c e d b y PMA c o u l d a l s o b e t r i g g e r e d b y p h y s i -o l o g i c a l a n g i o g e n i c f a c t o r s .I n t h i s s t u d y , we h a v e e x a m i n e d t h e e f f e c t o f h i g h l yp u r i f i e d b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( F G F ) o n t h e i n v a s i v ea n d p r o t e o l y t i c p r o p e r t i e s o f c u l t u r e d c a p i l l a r y e n d o t h e l i a lc e l l s . B a s i c a n d a c i d i c FGFs a r e t h e b e s t - c h a r a c t e r i z e d

a n g i o g e n i c s u b s t a n c e s . T h e y a r e p o t e n t m i t o g e n s f o r s e v e r a lc e l l t y p e s , i n c l u d i n g v a s c u l a r a n d c a p i l l a r y e n d o t h e l i a l c e l l s ,a n d a r e c a p a b l e o f i n d u c i n g a n a n g i o g e n i c r e s p o n s e i n v i v o( 8 - 1 3 ) . I n t h i s r e p o r t , we d e m o n s t r a t e t h a t b a s i c FGF i n d u c e sc u l t u r e d e n d o t h e l i a l c e l l s t o p r o d u c e u r o k i n a s e - t y p ep l a s m i n o g e n a c t i v a t o r ( u - P A ) a n d s t i m u l a t e s t h e i r m i g r a t i o ni n t o c o l l a g e n m a t r i c e s t o f o r m c a p i l l a r y - l i k e t u b u l e s . T h ep h e n o m e n o n , w h i c h m i m i c s some o f t h e e v e n t s t h a t o c c u rd u r i n g n e o v a s c u l a r i z a t i o n i n v i v o , d e m o n s t r a t e s t h a t t h ea n g i o g e n i c r e s p o n s e t o FGF i n v i v o i s a d i r e c t e f f e c t o f t h e

g r o w t h f a c t o r a n d n o t s e c o n d a r y t o a n i n f l a m m a t o r y r e -s p o n s e .MATERIALS AND METHODS

I s o l a t i o n o f F G F . B a s i c FGF w a s p u r i f i e d t o h o m o g e n e i t yf r o m b o v i n e p i t u i t a r i e s b y s u c c e s s i v e s t e p s o f ammonium s u l -f a t e p r e c i p i t a t i o n , i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p hy , a n d h e p a -r i n - S e p h a r o s e a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y 8 ) . P u r i t y o f t h e g r o w t hf a c t o r w a s e s t a b l i s h e d b y r e v e r s e - p h a s e h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y , a m i n o a c i d a n a l y s e s , N a D o d S O 4 /p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s , a n d a m i n o - t e r m i n a l s e -q u e n c e a n a l y s e s ( 1 0 ) .C e l l C u l t u r e . T h r e e - d i m e n s i o n a l g e l s o f r e c o n s t i t u t e dc o l l a g e n f i b r i l s w e r e p r e p a r e d a s d e s c r i b e d 3 ) . C l o n e dc a p i l l a r y e n d o t h e l i a l c e l l s d e r i v e d f r o m t h e b o v i n e a d r e n a lc o r t e x ( 1 4 ) w e r e a g e n e r o u s g i f t o f M. B . F u r i e a n d S . C .S i l v e r s t e i n ( C o l u m b i a U n i v e r s i t y , New Y o r k ) . T h e c e l l s w e r er o u t i n e l y s u b c u l t u r e d i n g e l a t i n - c o a t e d t i s s u e c u l t u r e f l a s k s( F a l c o n , B e c t o n D i c k i n s o n L a b w a r e , O x n a r d , C A ) i n m i n i -m a l e s s e n t i a l m e d i u m , a l p h a m o d i f i c a t i o n ( G I B C O ) s u p p l e -m e n t e d w i t h 1 5 h e a t - i n a c t i v a t e d d o n o r c a l f s e r u m ( F l o wL a b o r a t o r i e s , A y r s h i r e , S c o t l a n d ) , p e n i c i l l i n ( 5 0 0 u n i t s / m l ) ,a n d s t r e p t o m y c i n ( 1 0 0 u g / m l ) . T h e e n d o t h e l i a l c e l l s w e r eu s e d b e t w e e n p a s s a g e s 1 5 a n d 2 3 a n d w e r e s e e d e d a n d g r o w nt o c o n f l u e n c y i n 3 5 - m m c o l l a g e n - c o a t e d d i s h e s . M o r p h o l o g -i c a l c h a n g e s i n d u c e d b y FGF w e r e o b s e r v e d a n d p h o t o -g r a p h e d i n p h a s e c o n t r a s t u s i n g a Z e i s s ICM 4 0 5 i n v e r t e dp h o t o m i c r o s c o p e .P r o c e s s i n g f o r L i g h t a n d E l e c t r o n M i c r o s c o p y . T h ee n d o t h e l i a l c e l l c u l t u r e s w e r e f i x e d i n s i t u w i t h 2 . 5g l u t a r a l d e h y d e / 1 t a n n i c a c i d ( M a l l i n c k r o d t ) i n 0 . 1 M s o d i -u m c a c o d y l a t e b u f f e r ( p H 7 . 4 ) a n d f u r t h e r p r o c e s s e d a sd e s c r i b e d 3 ) . S e m i - t h i n a n d t h i n s e c t i o n s w e r e c u t p e r p e n -d i c u l a r t o t h e c u l t u r e p l a n e w i t h a n LKB u l t r a m i c r o t o m e .T h i n s e c t i o n s w e r e s t a i n e d w i t h u r a n y l a c e t a t e a n d l e a dc i t r a t e a n d e x a m i n e d i n a P h i l i p s EM 4 1 0 LS e l e c t r o nm i c r o s c o p e .PA P l a q u e A s s a y . Low d e n s i t y c u l t u r e s ( 1 . 2 x 1 0 4 c e l l s p e r3 5 - m m d i s h ) w e r e g r o w n o n p l a s t i c d i s h e s a n d w e r e i n c u b a t e df o r 2 4 h r i n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f FGF ( 3 n g / m l ) o r PMA( 2 0 n g / m l ) . T h e d i s h e s w e r e t h e n w a s h e d t h r e e t i m e s w i t h

p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e , a n d t h e c e l l s w e r e o v e r l a i d w i t h ac a s e i n / a g a r / p l a s m i n o g e n m i x t u r e a s d e s c r i b e d ( 1 5 ) . I n c o n -t r o l e x p e r i m e n t s , p l a s m i n o g e n was o m i t t e d f r o m t h e a s s a ym i x t u r e . T h e c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 ° C , a n d p h o t o -g r a p h s w e r e t a k e n 5 h r l a t e r u n d e r d a r k - f i e l d i l l u m i n a t i o n .Z y m o g r a p h i c A s s a y f o r P A s . C o n f l u e n t c u l t u r e s o fe n d o t h e l i a l c e l l s w e r e p r e p a r e d i n 35-mm p l a s t i c d i s h e s a n di n c u b a t e d f o r 2 4 h r i n 2 m l o f s er u m- f r e e m e d i u m i n t h ea b s e n c e o r p r e s e n c e o f FGF ( 3 n g / m l ) o r PMA ( 2 0 n g / m l ) . A tt h e e n d o f t h e i n c u b a t i o n , t h e c u l t u r e m e d i u m wa s c o l l e c t e d .A b b r e v i a t i o n s : FGF, f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ; P A , p l a s m i n o g e na c t i v a t o r ; t - P A a n d u - P A , t i s s u e - t y p e and u r o k i n a s e - t y p e P A s ; PMA,4 p - p h o r b o l 1 2 - m y r i s t a t e 1 3 - a c e t a t e .

7 2 9 7

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d a d v e r t i s e m e n ti n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . § 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .


2/5

7 2 9 8 C e l l B i o l o g y : M o n t e s a n o e t a l .T h e c e l l s w e r e w a s h e d t w i c e w i t h p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n ea n d h a r v e s t e d b y s c r a p i n g i n t o 0 . 5 m l o f 0 . 2 T r i t o n X - 1 0 0i n 0 . 1 M T r i s H C l . T h e c u l t u r e m e d i a a n d c e l l l y s a t e s w e r ec e n t r i f u g e d a t 1 0 0 0 x g f o r 1 0 m i n , a n d t h e s u p e r n a t a n t s w e r ec o l l e c t e d . A l i q u o t s ( 1 5 F l ) o f b o t h t h e c u l t u r e m e d i a a n d t h ec e l l l y s a t e s w e r e s u b j e c t e d t o NaDodSO4/PAGE a n dz y m o g r a p h y a s d e s c r i b e d ( 1 6 ) . P h o t o g r a p h s w e r e t a k e nu n d e r d a r k - f i e l d i l l u m i n a t i o n a f t e r 4 h r o f i n c u b a t i o n a t 3 7 0 C .I m m u n o a d s o r p t i o n s w i t h a n t i - u r o k i n a s e - t y p e a n d a n t i - t i s s u e -t y p e PAs w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d ( 1 6 ) .

RESULTSC e l l s g r o w n t o c o n f l u e n c e o n t h e s u r f a c e o f t h r e e - d i m e n s i o n -a l c o l l a g e n g e l s f o r m e d a m o n o l a y e r o f c l o s e l y a p p o s e d c e l l s( F i g . l a ) . W i t h i n 2 4 h r a f t e r t h e a d d i t i o n o f FGF ( 3 n g / m l ) ,n u m e r o u s e n d o t h e l i a l c e l l s c o u l d b e d i s t i n g u i s h e d b y t h e i ri r r e g u l a r o r d e n d r i t i c m o r p h o l o g y , a n d t h e i r p l a n e o f f o c u s ,w h i c h w a s s l i g h t l y b e n e a t h t h a t o f t h e o r i g i n a l m o n o l a y e r( F i g . l b ) . A f t e r 2 - 3 d a y s o f i n c u b a t i o n w i t h F G F , t h e s e c e l l so r g a n i z e d i n t o s h o r t b r a n c h i n g c o r d s t h a t f o r m e d a d i s c o n -t i n u o u s n e t w o r k u n d e r t h e s u r f a c e m o n o l a y e r . L o n g e r i n c u -b a t i o n s w i t h FGF f o r u p t o 5 d a y s d i d n o t r e s u l t i n f u r t h e rc h a n g e s i n t h e o r g a n i z a t i o n o f t h e c u l t u r e s . S i m i l a r e f f e c t sw e r e o b t a i n e d w i t h h i g h e r d o s e s o f FGF ( u p t o 3 0 n g / m l ) . I nc o n t r a s t , c o n c e n t r a t i o n s o f FGF


3/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 3 ( 1 9 8 6 ) 7 2 9 9b

Cg

I ? I r . - .7 . , c9

c

rs- ~_;t in 5~~ c_vY-l_' X

C9 ;

F I G . 2 . S e m i - t h i n ( a a n d b ) a n d t h i n ( c ) s e c t i o n s p e r p e n d i c u l a r t o t he c u lt u r e p l a n e o f F G F - t r e a t e d c a p i l l a r y e n d o t h e l i a l c e l l s . T u b u l a rs t r u c t u r e s e n c l o s i n g n a r r o w l u m i n a ( a r r o w s ) h a v e f o r m e d i n s i d e t h e c o l l a g e n g e l ( C g ) i n c l o s e p r o x i m i t y t o t h e s u r f a c e m o n o l a y e r . Th e t u b u l ei n c c o n s i s t s o f a s i n g l e e n d o t h e l i a l c e l l f o l d e d on i t s e l f . ( I n s e t ) H i g h e r m a g n i f i c a t i o n o f t h e area o u t l i n e d i n b l a c k , s h o w i n g t h e j u n c t i o n betweent h e c y t o p l a s m i c e x te n si o n s o f t h e e n d o t h e l i a l c e l l . ( a a n d b , x 7 5 0 ; c , x 6 7 0 0 ; I n s e t x 3 7 , 0 0 0 . )

F I G . 3 . PA p l a q u e assay. C o n t r o l ( a ) , F G F - t r e a t e d ( b ) , a n dP M A - t r e a t e d ( c ) c u l t u r e s we r e o v e r l a i d w i t h a m i x t u r e o f c a s e i n ,a g a r , a n d p l a s m i n o g e n . Z o n e s o f l y s i s o f t he s u b s t r a t e appear as d a r kp l a q u e s o n a c l e a r b a c k g r o u n d a n d i n d i c a t e t h e p r o d u c t i o n o f enzymeb y t h e c u l t u r e d c e l l s .

r e l a t e d t o t - P A o n t h e b a s i s o f t h e i r r e s p e c t i v e a b s e n c e i ns a m p l e s t h a t h a d b e e n s p e c i f i c a l l y i m m u n o d e p l e t e d p r i o r t oz y m o g r a p h y . V e r y l i t t l e a c t i v i t y was d e t e c t e d i n t h e c u l t u r emedium o r i n c e l l l y s a t e s o b t a i n e d f r o m - u n t r e a t e d c u l t u r e s( l a n e s a ) , a l t h o u g h l o n g e r i n c u b a t i o n s o f t h e zymogramr e v e a l e d t h e presence o f Mr 4 8 , 0 0 0 u - P A i n - t h e s e s a m p l e s .S a m p l e s o b t a i n e d f r o m F G F - t r e a t e d c u l t u r e s ( l a n e s b ) co n -t a i n e d i n c r e a s e d l e v e l s o f u - P A as c o m p a r e d t o u n t r e a t e dc u l t u r e s .

A n a l y s i s o f t h e s e r i a l l y d i l u t e d s a m p l e s p r o v i d e d a s e m i -q u a n t i t a t i v e e v a l u a t i o n o f t h e a m ount o f u - P A i n t h e d i f f e r e n tc u l t u r e s . As c o m p a r e d t o c o n t r o l c u l t u r e s , t h e enzy mea c t i v i t y i n t h e c e l l l y s a t e s a n d t he c u l t u re medium wasi n c r e a s e d 5 - t o 1 0 - f o l d i n F G F - t r e a t e d c u l t u r e s a n d more t h a n3 0 - f o l d i n P M A - t r e a t e d c u l t u r e s .

DISCUSSIONA l t h o u g h a n g i o g e n e s i s h a s b e e n m o s t l y s t u d i e d i n v i v o , a s ,f o r e x a m p l e , i n t he r a bb i t c or nea ( 1 7 ) o r t h e c h o r i o a l l a n t o i cmembrane o f t h e c h i c k e n e m b r y o ( 1 8 ) , t h e d e v e l o p m e n t o fm e t h o d s f o r t h e i s o l a t i o n a n d c u l t u r e o f c a p i l l a r y e n d o t h e l i a lc e l l s ( 1 9 ) h a s p r o v i d e d a n o p p o r t u n i t y t o s t u d y i n v i t r o t h ep r o p e r t i e s o f e n d o t h e l i a l c e l l s t h a t a re r e l e v a n t t o neovascu-l a r i z a t i o n . R e c e n t s t u d i e s h a v e shown t h a t p a r t i a l l y p u r i f i e d

aC e l l B i o l o g y : M o n t e s a n o e t a l .

Imm-: l p .


4/5

7 3 0 0 C e l l B i o l o g y : M o n t e s a n o e t a l .M e d i a C e l l s

Ml

9 4

67-4 3 - . =_

3 0 -

a b c a b c

p r e p a r a t i o n s o f b a s i c FGF h a d b e e n u n a b l e t o i n c r e a s e t h ep r o d u c t i o n o f PA o r c o l l a g e n as e b y c a p i l l a r y e n d o t h e l i a lc e l l s . I t w a s t h u s i m p o r t a n t t o r e e v a l u a t e t h i s p o i n t u s i n g o u rh i g h l y p u r i f i e d a n d a n g i o g e n i c a l l y a c t i v e p r e p a r a t i o n o fb a s i c F G F . T h e r e s u l t s p r e s e n t e d h e r e d e m o n s t r a t e t h a t t h ep r o d u c t i o n o f u - P A i s m a r k e d l y s t i m u l a t e d i n F G F - t r e a t e dc u l t u r e s . D i f f e r e n c e s i n t h e p r e p a r a t i o n s o f FGF a n d / o r i nt h e p r o c e d u r e s u s e d t o a s s a y f o r PAs may a c c o u n t f o r t h ed i s c r e p a n c y b e t w e e n o u r r e s u l t s a n d t h o s e r e p o r t e d p r e v i -o u s l y ( 3 0 ) . I n t e r e s t i n g l y , a n d p e r h a p s f o r t h e r e a s o n s c i t e de a r l i e r , t h e s t i m u l a t i o n o f u - P A p r o d u c t i o n b y FGF wass i g n i f i c a n t l y l e s s t h a n t h a t o b t a i n e d w i t h PMA. T h e r e l a t i v ee f f e c t i v e n e s s o f t h e s e t w o a g e n t s i n i n d u c i n g t u bu l e f o r m a t i o na n d p r o t e a s e p r o d u c t i o n i s t h u s s i m i l a r . A l t h o u g h t h e r e i s a tp r e s e n t n o e v i d e n c e f o r a r o l e o f PAs i n t he i n v as i o n o f t h ec o l l a g e n m a t r i x i n o u r c u l t u r e s y s t e m ( 3 ) , t h e c o r r e l a t i o nb e t w e e n t h e n g i o g e n i c b e h a v i o r o f e n d o t h e l i a l c e l l s i nr e s p o n s e t o F G F , t h e k n o w n a n g i o g e n i c a c t i v i t y o f FGF i nv i v o ( 8 - 1 2 ) , a n d t h e i n c r e a s e i n u - P A p r o d u c t i o n i n t h ep r e s e n c e o f F G F , s u p p o r t s t h e p r o p o s e d r o l e f o r t h i s e n z y m e( 3 4 ) a n d FGF i n t h e n e o v a s c u l a r r e s p o n s e i n v i v o .

F I G . 4 . Z y m o g r a p h i c a s s a y f o r P A s . S a m p l e s o f t h e c o n d i t i o n e dc u l t u r e m e d i a ( M e d i a ) a n d o f t h e c e l l l y s a t e s ( C e l l s ) w e r e p r o c es s e df r o m c o n t r o l ( l a n e s a ) , F G F - t r e a t e d ( l a n e s b ) , a n d P M A - t r e a t e d( l a n e s c ) c u l t u r e s a n d w e r e s u b j e c t e d t o N a D o d S O 4 / P A G E a n dz y m o g r a p h y a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s .p r e p a r a t i o n s o f a n g i o g e n i c s u b s t a n c e s c a n s t i m u l a t e t h r e ed i s t i n c t p r o c e s s e s a t t h e c e l l u l a r l e v e l : i n c r e a s e d r a t e o fm u l t i p l i c a t i o n ( 2 0 - 2 4 ) , m i g r a t i o n a n d c h e m o t a x i s ( 2 4 - 2 9 ) ,a n d p r o d u c t i o n o f v a r i o u s p r o t e a s e s i n c l u d i n g PA a n d c o l l a -g e n a s e ( 2 4 , 3 0 ) . U n f o r t u n a t e l y , t h e c u l t u r e o f c e l l s o n a p l a s t i cs u b s t r a t u m o f t i s s u e c u l t u r e d i s h e s s t i l l h a s a m a j o r l i m i t a -t i o n - i . e . , t h e l o s s o f t h r e e - d i m e n s i o n a l c e l l - m a t r i x i n t e r a c -t i o n s . To o b v i a t e t h i s s h o r t c o m i n g a n d t o a p p r o x i m a t e a sc l o s e l y s p o s s i b l e t h e i n v i v o s i t u a t i o n , we a p p l i e d t h es t r a t e g y o f g r o w i n g c a p i l l a r y e n d o t h e l i a l c e l l s o n t h e s u r f a c eo f r e c o n s t i t u t e d c o l l a g e n f i b r i l s 3 ) . B y u s i n g a t h r e e - d i m e n -s i o n a l m a t r i x , we h a v e s h o w n t h a t b a s i c F G F , a n e n d o t h e l i a lc e l l m i t o g e n w i t h p o t e n t a n g i o g e n i c a c t i v i t y i n v i v o ( 8 - 1 2 ) ,i n d u c e s c u l t u r e d c a p i l l a r y e n d o t h e l i a l c e l l s t o i n v a d e t h eu n d e r l y i n g c o l l a g e n m a t r i x a n d t o o r g a n i z e t h e m s e l v e s a sd i s t i n c t t u b u l e s r e s e m b l i n g b l o o d c a p i l l a r i e s .T h e e f f e c t o f FGF w a s n o t a s p r o n o u n c e d s t h a t o b s e r v e dw i t h p h o r b o l e s t e r s 3 ) . T h e e n d o t h e l i a l c e l l t u b u l e s f o r m e di n r e s p o n s e t o FGF w e r e s h o r t e r a n d l e s s n u m e r o u s , c o n -t a i n e d s m a l l e r l u m i n a , a n d d i d n o t p e n e t r a t e a s d e e p l y i n t ot h e c o l l a g e n m a t r i x a s t h o s e i n d u c e d b y PMA. T h e s e d i f f e r -e n c e s i n t h e b i o l o g i c a l e f f e c t s o f PMA a n d FGF may b e t h er e s u l t o f t h e i r a c t i v a t i o n o f a k e y e n z y m e i n s i g n a l t r a n s d u c -t i o n , p r o t e i n k i n a s e C ( 7 , 3 1 , 3 2 ) . E n d o g e n o u s m e d i a t o r s , l i k eF G F , a c t t h r o u g h a t r a n s i e n t r e l e a s e o f d i a c y l g l y c e r o l 7 ) ,w h i l e PMA p r o d u c e s a p e r s i s t e n t a c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s eC 7 ) . B e c a u s e p h o r b o l e s t e r s r e p r e s e n t a m o r e e f f i c i e n ta n d / o r p e r s i s t e n t s t i m u l u s f o r e n d o t h e l i a l c e l l s t h a n p h y s i o -l o g i c a l a n g i o g e n e s i s f a c t o r s , t he y s ho u l d i n du c e a q u a n t i t a -t i v e l y g r e a t e r b u t q u a l i t a t i v e l y i d e n t i c a l e f f e c t o n t h ee n d o t h e l i a l c e l l c u l t u r e s . I n d e e d , i n s p i t e o f t h e i r d i f f e r e n tm a g n i t u d e , t h e p h e n o m e n a t r i g g e r e d b y FGF a n d PMAa p p e a r q u a l i t a t i v e l y s i m i l a r a n d t h e y b o t h m i m i c t h e c r u c i a le v e n t s t h a t t a k e p l a c e d u r i n g a n g i o g e n e s i s i n v i v o - i . e . , t h ei n v a s i o n o f c o l l a g e n m a t r i c e s a n d t h e f o r ma t i o n o f c a p i l l a r ys p r o u t s .T h e s y n t h e s i s a n d s e c r e t i o n o f p t o t e a s e s , i n c l u d i n g PAsa n d c o l l a g e n a s e , b y e n d o t h e l i a l c e l l s i s t h o u g h t t o b e r e l a t e dt o t h e i n v a s i v e p r o p e r t i e s o f t h e s e c e l l s d u r i n g a n g i o g e n e s i s .B o t h p u r i f i e d p r e p a r a t i o n s o f a n g i o g e n i c a c t i v i t y a n d PMAh a v e b e e n s h o w n t o i n c r e a s e p r o d u c t i o n o f t h e s e e n z y m e s( 2 4 , 3 0 , 3 3 ) . I n a p r e v i o u s s t u d y b y G r o s s e t a l . ( 3 0 ) , c r u d e

We a r e g r a t e f u l t o D r . M . B . F u r i e a n d D r . S . C . S i l v e r s t e i n f o rg e n e r o u s l y p r o v i d i n g t h e b o v i n e m i c r o v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s u s e di n t h i s s t u d y . We a l s o t h a n k J . R i a l , G . M a r c h i , a n d R . K l e p p e r f o rs k i l l f u l t e c h n i c a l a s s i s t a n c e ; G . N e g r o f o r p h o t o g r a p h i c w o r k ; a n d N .D u p o n t a n d D e n i s e i g g i n s f o r p r e p a r i n g t h e m a n u s c r i p t . T h i s w o r kw a s s u p p o r t e d b y t h e S w i s s N a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n G r a n t s3 . 4 6 0 . 8 3 , 3 . 0 7 5 . 8 4 , a n d 3 . 4 0 4 . 8 6 .

1 . F o l k m a n , J . ( 1 9 8 5 ) A d v . C a n c e r R e s . 4 3 , 1 7 5 - 2 0 3 .2 . A u s p r u n k , D . H . F o l k m a n , J . ( 1 9 7 7 ) M i c r o v a s c . R e s . 1 4 ,5 3 - 6 5 .3 . M o n t e s a n o , R . O r c i , L . ( 1 9 8 5 ) C e l l 4 2 , 4 6 9 - 4 7 7 .4 . B l u m b e r g , P . M . ( 1 9 8 0 ) CRC C r i t . R e v . T o x i c o l . 8 , 1 5 3 - 1 9 7 .5 . D i a m o n d , L . , O ' B r i e n , T . G . B a i r d , W. M . ( 1 9 8 0 ) A d v .C a n c e r R e s . 3 2 , 1 - 7 4 .6 . W e i n s t e i n , I . B . ( 1 9 8 1 ) J . S u p r a m o l . S t r u c t . C e l l B i o c h e m . 1 7 ,9 9 - 1 2 0 .7 . N i s h i z u k a , Y . ( 1 9 8 4 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 0 8 , 6 9 3 - 6 9 8 .8 . G o s p o d a r o w i c z , D . , C h e n g , J . , L u i , G . M . , B a i r d , A . B o h l e n , P . ( 1 9 8 4 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 1 , 6 9 6 3 - 6 9 6 7 .9 . G o s p o d a r o w i c z , D . , B i a l e c k i , H . T h a k r a l , T . K . ( 1 9 7 9 ) E x p .E y e R e s . 2 8 , 5 0 1 - 5 1 4 .1 0 . E s c h , F . , B a i r d , A . , L i n g , N . , U e n o , N . , H i l l , F . , D e n o r o y , L . ,K l e p p e r , R . , G o s p o d a r o w i c z , D . , B o h l e n , P . G u i l l e m i n , R .( 1 9 8 5 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 2 , 6 5 0 7 - 6 5 1 1 .1 1 . T h o m a s , K . A . , R i o s - C a n d e l o r e , M . , G i m e ne z - Ga l l e g o , G . , D iS a l v o , J . , B e n n e t t , C . , R o d k e y , J . F i t z p a t r i c k , S . ( 1 9 8 5 )P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 2 , 6 4 0 9 - 6 4 1 3 .1 2 . E s c h , F . , U e n o , N . , B a i r d , A . , H i l l , F . , D e n o r o y , L . , L i n g , N . ,G o s p o d a r o w i c z , D . G u i l l e m i n , R . ( 1 9 8 5 ) B i o c h e m . B i o p h y s .R e s . C o m m u n . 1 3 3 , 5 5 4 - 5 6 2 .1 3 . T h o m a s , K . A . G i m e n e z - G a l l e g o , G . ( 1 9 8 6 ) T r e n d s i nB i o c h e m . S c i . 1 1 , 8 1 - 8 4 .1 4 . F u r i e , M . B . , C r a m e r , E . B . , N a p r s t e c k , B . L . S i l v e r s t e i n ,S . C . ( 1 9 8 4 ) J . C e l l B i o l . 9 8 , 1 0 3 3 - 1 0 4 1 .1 5 . V a s s a l l i , J . - D . , H a m i l t o n , J . R ei c h , E . ( 1 9 7 7 ) C e l l 1 1 ,6 9 5 - 7 0 5 .1 6 . V a s s a l l i , J . - D . , D a y e r , J . - M . , W o h l w e n d , A . B e l i n , D . ( 1 9 8 4 )J . E x p . M e d . 1 5 9 , 1 6 5 3 - 1 6 6 8 .1 7 . G i m b r o n e , M. A . , J r . , C o t r a n , R . S . , L e a p m a n , S . B . F o l k -m a n , J . ( 1 9 7 4 ) J . N a t l . C a n c e r I n s t . 5 2 , 4 1 3 - 4 2 7 .1 8 . K l a g s b r u n , M . , K n i g h t o n , D . F o l k m a n , J . ( 1 9 7 6 ) C a n c e rR e s . 3 6 , 1 1 0 - 1 1 4 .1 9 . F o l k m a n , J . , H a u d e n s c h i l d , C . C . Z e t t e r , B . R . ( 1 9 7 9 ) P r o c .N a t l . A c a d . S c i . USA 7 6 , 5 2 1 7 - 5 2 2 1 .2 0 . D ' A m o r e , P . A . , G l a s e r , B . M . , B r u n s o n , S . K . F e n s e l a u ,A . H . ( 1 9 8 1 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 8 , 3 0 6 8 - 3 0 7 2 .2 1 . S c h o r , A . , S c h o r , S . L . , W e i s s , J . B . , B r o w n , K . A . , K u m a r ,S . P h i l l i p s , P . ( 1 9 8 0 ) B r . J . C a n c e r 4 1 , 7 9 0 - 7 9 9 .2 2 . C a s t e l l o t , J . J . , J r . , K a r n o v s k y , M . J . S p i e g e l m a n , B . M .( 1 9 8 0 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 7 , 6 0 0 7 - 6 0 1 1 .2 3 . S h i n g , Y . , F o l k m a n , J . , S u l l i v a n , R . , B u t t e r f i e l d , C . , M u r r a y ,

P r o c . N a t l . Acad S c i . USA 8 3 ( 1 9 8 6 )


5/5

C e l l B i o l o g y : M o n t e s a n o e t a l .J . K l a g s b r u n , M . ( 1 9 8 4 ) S c i e n c e 2 2 3 , 1 2 9 6 - 1 2 9 8 .2 4 . M o s c a t e l l i , D . , P r e s t a , M . R i f k i n , D . B . ( 1 9 8 6 ) P r o c . N a t i .A c a d . S c i . USA 8 3 , 2 0 9 1 - 2 0 9 5 .2 5 . Z e t t e r , B . R . ( 1 9 8 0 ) N a t u r e ( L o nd o n ) 2 8 5 , 4 1 - 4 3 .2 6 . M u f f i n s , D . E . R i f i k i n , D . B . ( 1 9 8 4 ) J . C e l l . P h y s i o l . 1 1 9 ,2 4 7 - 2 5 4 .2 7 . C a s t e l l o t , J . J . , J r . , K a r n o v s k y , M . J . S p i e g e l m a n , B . M .( 1 9 8 2 ) P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USA 7 9 , 5 5 9 7 - 5 6 0 1 .2 8 . B a n d a , M . J . , K n i g h t o n , D . R . , H u n t , T . K . W e r b , Z . ,( 1 9 8 2 ) P r o c . N a t I . A c a d . S c i . US A 7 9 , 7 7 7 3 - 7 7 7 7 .2 9 . A l e s s a n d r i , G . , R a j u , K . G u l l i n o , P . M . ( 1 9 8 3 ) C a n c e r R e s .4 3 , 1 7 9 0 - 1 7 9 7 .

P r o c . N a d l . A c a d . S c i . USA 8 3 ( 1 9 8 6 ) 7 3 0 13 0 . G r o s s , J . L . , M o s c a t e l l i , D . R i f k i n , D . B . ( 1 9 8 3 ) P r o c . N a t l .A c a d . S c i . USA 8 0 , 2 6 2 3 - 2 6 2 7 .3 1 . T s u d a , T . , K a i b u c h i , K . , K a w a h a r a , Y . , F u k u z a k i , H . T a k a i , Y . ( 1 9 8 5 ) FEBS L e t t . 1 9 1 , 2 0 5 - 2 1 0 .3 2 . T a k e y a m a , Y . , T a n i m o t o , T . , H o s h i j i m a , M . , K a i b u c h i , K . ,O h y a n a g i , H . , S a i t o h , Y . T a k a i , Y . ( 1 9 8 6 ) FEBS L e t t . 1 9 7 ,3 3 9 - 3 4 3 .3 3 . G r o s s , J . L . , M o s c a t e l l i , D . , J a f f e , E . A . R i f k i n , D . B .( 1 9 8 2 ) J . C e l l B i o l . 9 5 , 9 7 4 - 9 8 1 .3 4 . R e i c h , E . ( 1 9 7 8 ) i n M o l e c u l a r B a s i s o f B i o l o g i c a l D e g r a d a t i v eP r o c e s s e s , e d s . B e r l i n , R . D . , H e r r m a n n , H . , L e p o w , I . H . T a n z e r , J . M . ( A c a d e m i c , New Y o r k ) , p p . 1 5 5 - 1 6 9 .

basic fibroblast growth factor

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