biologia trans

INFORME DE BIOLOGIA MOLECULAR INGENIERIA BIOTECNOLOGICA GRUPO C ___________________________________________________________________________________

ALEJANDRA CARDENAS REY 1610841

EDWIN ALVAREZ MONTAÑO 1610791

ASBTRACT

In this laboratory procedure that will transform E. coli with PGLO plasmid containing the

gene encoding a green fluorescent protein (GFP) is used. This gene has been taken from a

jellyfish or "living water" that is fluorescent and bioluminescent, his name Aequorea

victoria. The green fluorescent protein causes the jellyfish bloom and glow in the dark.

Followed by the transformation, the bacterium expresses the acquired jellyfish gene and

produces the fluorescent protein, which causes the colony shine bright green under

ultraviolet light. After performing the transformation, the cells are grown in LB medium in

the presence of ampicillin. Ampicillin prevents transformed bacteria do not grow in the

culture dish. Colonies of transformed cells appear white on plates containing LB medium

and ampicillin. To induce expression of the GFP gene have to grow the bacteria in the

presence of arabinose. The bacteria grown in LB with ampicillin arabinose and fluorescent

will be green instead of white.

Keywords: Escherichia coli, cloning, plasmid PGLO

RESUMEN

En este laboratorio se utilizará un procedimiento que transformará la bacteria E. coli con un

plasmido pGLO que contiene el gen que codifica para una proteína fluorescente de color

verde (GFP). Este gen ha sido extraído de una medusa o “agua viva” que es fluorescente

y bioluminiscente, su nombre: Aequorea victoria. La proteína fluorescente verdosa causa

que la medusa florezca y brille en la oscuridad. Seguido del proceso de transformación, la

bacteria expresa el gen de medusa adquirido y produce la proteína fluorescente, la cual

causa que la colonia brille de un verde brillante bajo la luz ultravioleta. Luego de realizar la

transformación, crecen las células en medio LB y en presencia de ampicilina. La

ampicilina


evita que bacterias no transformadas crezcan en el plato de cultivo. Las colonias de células

transformadas aparecen de color blanco en los platos que contienen medio LB y

ampicilina. Para inducir la expresión del gene de GFP tenemos que crecer las bacterias en

presencia de arabinosa. Las bacterias crecidas en LB con arabinosa y con ampicilina se

verán fluorescentes de color verde en lugar de blancas.

Palabras claves: Escherichia coli, Clonación, plásmido pGLO,

INTRODUCCION

La transformación es un proceso por el cual las células captan DNA libre presente en el

medio. Estas técnicas se basan en diversos tratamientos químicos o físicos que producen

microporos en la célula, lo que permite la introducción del DNA exógeno (transformación)

de modo bastante eficiente. Uno de los métodos físicos es la electroporación, consistente en

inducir la competencia mediante la aplicación de un pulso eléctrico muy breve e intenso.

Dicha competencia se puede inducir con tratamientos químicos utilizando compuestos

como el cloruro cálcico. (Inohue H, et; al 1990). Hay que tener en cuenta sin embargo que

tras estos tratamientos no todas las células del cultivo se hacen competentes. 1 La

transformación en el laboratorio es una técnica rutinaria de enorme utilidad, que nos

permite introducir prácticamente cualquier plásmido en su forma circular o superenrollada

en casi cualquier tipo de bacteria. (Old Rw. 1989). El método que se describe a

continuación es, por su simplicidad, uno de los más utilizados para transformar E. coli. Para

detectar la transformación, el DNA introducido llevará un marcador seleccionable en el

medio adecuado. El objetivo de esta práctica es introducir el plásmido recombinante

obtenido en una reacción de ligación en la estirpe de Escherichia coli. Esta estirpe está

modificada genéticamente de manera que es posible inducir en laboratorio la competencia

de las células así como mantener el plásmido de forma estable en su interior.

MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIAL Y REACTIVOS INSTRUMENTOS Y EQUIPOS


Placa sembrada con E.coli Asas de siembra

Placas agar (1 LB, 2 LB /amp,

1LB/amp/ara Pipetas

Solución de transformacion Gradilla de espuma/corcho

Caldo LB Cubeta con hielo picado

Plasmido pGLO rehidratado vial Rotulador

Baño a 42º C y termometro

Estufa a 37º C (opcional)

METODOLOGIA

Los materiales que se van a utilizar en esta práctica son: agar nutriente LB, ampicilina, arabinosa, solución de transformación, E. coli liofilizada, plásmido pGLO liofilizado.

MATERIALES

PREPARACIÓN DE LAS CAJAS CON SUS MEDIOS

Se prepara medio LB en 500ml de agua destilada para servir en 16 cajas previamente marcadas. (3-7 días antes de la transformación)

TRANSFORMACIÓN DE E. Coli CON pGLO

CAJAS CON MEDIO LB


Al igual que la ampicilina la arabinosa debe rehidratarse con 3ml de solución de transformación homogenizada en vórtex; así mismo agregar la arabinosa al agar LB/Amp, agitar y servir en 8 cajas. (3-7 días antes de la transformación).

Se rehidratan las bacterias (liofilizado de E. coli K12) añadiéndole la solución de transformación. A partir de la suspensión de E. coli K12 rehidratada se siembra en una caja con LB por cada grupo de estudiantes pues es necesario obtener colonias aisladas de la bacteria. (24-36 horas antes de la transformación).

Se deben almacenar 2 días a temperatura ambiente y luego bajo refrigeración hasta el momento de su uso

Con una pipeta estéril rehidratar la ampicilina con 3ml de solución de transformación, homogenizar en vórtex. Seguidamente añadir la ampicilina al agar LB, agitar y servir en 16 cajas previamente marcadas. (3-7 días antes de la transformación).

CAJAS CON MEDIO LB/AMP

Se deben almacenar 2 días a temperatura ambiente y luego bajo refrigeración hasta el momento de su uso

Un excesivo calentamiento (50°C) destruye la ampicilina, por lo tanto hay que regular la temperatura del agar antes de agregarla.

CAJAS CON MEDIO LB/AMP/ARA

Se deben almacenar 2 días a temperatura ambiente y luego bajo refrigeración hasta el momento de su

Un excesivo calentamiento (50°C) destruye la ampicilina, por lo tanto hay que regular la temperatura del agar antes de agregarla.

PREPARACIÓN DE BACTERIAS


Con una pipeta estéril añadir 250µl la solución de transformación en un vial que contiene el plásmido pGLO liofilizado (Se utiliza la solución de transformación porque esta estéril y no contiene nucleasas, en su lugar se puede usar agua destilada estéril). (24-36 horas antes de la transformación).

TRANSFORMACIÓN DE E. Coli CON pGLO

Rotula un tubo eppendort como +pGLO y otro como –pGLO. Pon el nombre de tu grupo. Sitúalos en la gradilla de corcho

Abre los tubos y con una pipeta estéril, añade a cada uno 250 o 150µl de la solución de transformación (CaCl2). Poner los tubos en hielo.

Con un asa de siembra estéril pincha una única colonia de la placa con E. Coli. Coge el tubo rotulado como +pGLO e introduce el asa en la solución de transformación, y gira el asa entre tus dedos índice y pulgar hasta que la colonia se disperse en la solución de transformación. Vuelve a dejar el tubo en hielo. Con otra asa estéril, repite el proceso para el tubo –pGLO.

PREPARACIÓN DEL PLASMIDO

PROCEDIMIENTO


Sitúa la solución plasmática pGLO bajo la luz UV, y anota tus observaciones. Introduce un asa estéril en la solución con el plásmido pGLO, y carga el asa de manera que se observe una capa de la solución en el aro. Es similar a la capa de jabón en un aro para hacer pompas de jabón. Introduce el asa en el tubo +pGLO. Cierra el tubo y vuelve a dejarlo en el hielo. Cierra también el tubo –pGLO, pero sin añadirle solución plasmática. Incubar los tubos en hielo 10 minutos. Asegurarse de que el fondo de los tubos están contacto con el hielo.

Mientras que los tubos permanecen en el hielo, etiquetar las placas de agar en la base de ña siguiente forma: una placa LB/amp y una LB/amp/ara como +pGLO, y otra LB/amp y otra LB/amp/ara como –pGLO.

Choque térmico. Llevar los tubos en la gradilla al baño ya preparado a 42°C, e introducirlos allí durante 50 segundos exactos. Asegurarse de colocar bien la gradilla para que el fondo de los tubos este en contacto con el agua. Pasados los 50 segundos, llevar de nuevo los tubos al hielo. El cambio de hielo al baño y viceversa debe hacerse con rapidez. Dejar los tubos en el hielo 2 minutos.


CUESTIONARIO

DISCUSIONES

El método de transformación mediante choque térmico de células competentes con cationes

divalentes es muy rutinario dada la facilidad de realización del mismo y la no necesidad de

Sacar la gradilla del hielo y dejarla en la mesa. Abre uno de los tubos, y con una nueva pipeta estéril, añade 250ml de caldo LB al tubo y ciérralo. Repetir la operación con otra pipeta estéril en el otro tubo. Incubar los tubos 10 minutos a temperatura ambiente.

Agitar los tubos golpeándolos con el dedo. Con una pipeta estéril para cada tubo, pasar 100ml de cada tubo a las placas correspondientes.Usando un asa de siembra estéril para cada

placa, extiende la suspensión por la superficie de las placas de agar pasando el asa rápidamente de izquierda a derecha. NO PRESIONAR MUY FUERTE PARA NO ROMPER EL AGAR. Seguidamente haz una columna con las placas sujetándolas con cinta adhesiva. Pon el nombre de tu grupo en la placa inferior, e incube a 37°C en posición invertida hasta el dia siguiente.


utilizar aparatos sofisticados, a diferencia de la electroporación o la biobalística. No

obstante la eficiencia del mismo puede resultar baja, según el caso. Es congruente que en el

control no haya habido expresión de pGLO, en donde no hubo colonias, así como en

medios LB/amp donde no había arabinosa. Esto se debe a que el gen de la proteína

fluorescente está inserto en el operón arabinosa en la región codificadora para las enzimas

que metabolizan la

arabinosa cuando está presente en el medio. Si la arabinosa está presente, entonces el

operón se encuentra activo y la proteína fluorescente es expresada, como se pudo observar

en las colonias +pGLO LB/amp/ara. Nuestra eficiencia fue muy pobre ya que no rebasó el

50% de las colonias transformadas.

CONCLUSIONES

En base a la investigación y el trasfondo teórico, una cepa de bacteria puede ser mutada

mediante la transformación de su material genético al insertársele un plásmido con vector

como una característica que se desea se exprese en esta. Para este caso la bacteria utilizada

fue E. coli y los rasgos que se quería que se expresaran eran resistencia a ampicilina y

fluorescencia verde.

BIBLIOGRAFIA

Inohue H, Nojima H, Okayama H (1990): High efficiency transformation of Escherichia

coli with plasmids. Gene 96:23-28. Artículo clásico optimizando el método

Old RW, Primrose SB (1989) Principles of gene manipulation. Blackwell Sci. Pub. Oxford.

pp 11-13. Resumen completo del procedimiento.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

pp. 1.74-1.84. Excelente recetario con variaciones útiles.


1. Puedo modificar genéticamente un organismo? Que organismo?

Un organismo genéticamente modificado (OGM) es aquella planta, animal, hongo o bacteria a la que se le ha agregado por ingeniería genética uno o unos pocos genes con el fin de producir proteínas de interés industrial o bien mejorar ciertos rasgos, como la resistencia a plagas, la calidad nutricional, la tolerancia a heladas, entre otras características. Aunque comúnmente el término más nombrado es “alimento transgénico” para referirse a aquel que proviene de cultivos vegetales modificados genéticamente, es importante recalcar que también se emplean enzimas y aditivos obtenidos de microorganismos transgénicos en la elaboración y procesamiento de muchos de los alimentos que ingerimos.

Son los seres vivos más utilizados en Ingeniería Genética. La más utilizada es la

Escherichia coli. Se usa prácticamente en todos los procesos de I.G.

Otra de las aplicaciones más actuales que se han hecho, ha sido modificar genéticamente

bacterias que vivan en el sistema digestivo del ser humano en un lapso mínimo de 6 meses

a 1 año, con el objetivo de disminuir el apetito. Esta investigación se basa en N-acil-


fosfatidiletanolamina, y N-acil-etanolamina, encargadas de mandar señales alhipotálamo,

que es el encargado de la ingesta de alimentos.

Son junto con las bacterias los sistemas más utilizados. El Saccharomyces cerevisiae fue el

primer sistema eucariota secuenciado completamente. Otra levadura importante es P.

pastoris, utilizada para conseguir proinsulina en cultivo discontinuo y quitinasa en cultivo

continuo. En el campo de los hongos destaca por su labor médica el Penicillium.

Otra aplicación ha sido la levadura P. pastoris se ha usado para producir grandes cantidades

de proteínas, gracias a que es capaz de crecer en los reactores hasta alcanzar muy altas

densidades celulares. Por ejemplo, se ha utilizado para producir quitinasa humana en

cultivo continuo (0,3 g/L/día) o proinsulina humana en un sistema discontinuo (1,5 g/L).

2. Para modificar genéticamente un organismo, se debe insertar un nuevo gen en cada célula del organismo. ¿Qué organismo será más apropiado para ser modificado genéticamente uno pluricelular o uno unicelular?

http://es.wikipedia.org/wiki/Penicillium

http://es.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae

http://es.wikipedia.org/wiki/Hipot%C3%A1lamo

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