BIOMASA MICROBIANAMICROBIOLOGIA ACUÁTICA

27/04/2012FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICASKARIM MANOSALVA MEDINA

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ÍNDICE

Pág.

1. Introducción…………………………………………………………..… 62. Las bacterias y su papel en el medio acuático………………….... 73. Picoplancton autotrófico y heterotrófico……………………….…..94. Composición cuantitativa y cualitativa de las comunidades

microbianas en el océano…………………………………………......10 5. Biomasa microbiana………………………………………………..….116. Métodos de cuantificación para la determinación de

Biomasa…………………………………………………..…………..….116.1. Método Nefelométrico……………………………………..…126.2. Método de Cuenta en Placa………………………………….136.3. Filtración de membrana……………………………………....166.4. Método del NMP………………………………………………..176.5. Método Turbidimétricos……………………………………...186.6. Otros tipos de cuantificación………………………………..19

7. Ensayos Bioquímicos……………………………………………..…..207.1. Pared Celular…………………………………………………...217.2. Clorofila y pigmentos fotosintéticos……………………....227.3. Proteínas y Lípidos…………………………………………...23

8. Enfoque fisiológico de la Determinación de biomasa…………..249. La Biomasa y Cálculo de volumen de cada

grupo morfológico…………………………………………………..…2410. Carbono Celular promedio……………………………….………....2711. Importancia de microorganismos acuáticos y de

la biomasa…………………………………………………………....2812. Bibliografía………………………………………………………..….29

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INTRODUCCIÓN

Aunque la primera bacteria fue descubierta en el agua en 1676, posteriormente la

bacteriología se desarrolló gracias a las necesidades de la medicina y del conocimiento

de que muchas enfermedades eran distribuidas por el agua. Esto dio base a

investigaciones generales de las aguas continentales, descubriéndose que las aguas

servidas, provenientes de ciudades y hospitales, eran fuente de grandes cantidades de

bacterias, siendo la primera etapa a alcanzar, el control de la de la polución bacteriana

del agua. Se iniciaron así investigaciones sobre sistemática, fisiología y ecología de las

distintas especies. También recibió un gran impulso la bacteriología del agua a partir

de la bacteriología del suelo y veterinaria debido al interés que suscitara el estudio de

enfermedades de las plantas y animales.

Algunos métodos de la medicina y la agricultura comenzaron a aplicarse al medio

acuático, aunque surgieron algunos problemas como por ejemplo los inherentes a los

ciclos del azufre, del fósforo, del carbono, etc. De esta manera la bacteriología del agua

debió desarrollarse de forma autónoma, con sus propios problemas y métodos de

investigación.

El agua como medio, tiene características que le son propias, a la vez que muy

variables (pH, T°, concentración química, etc.), por otra parte el principal problema de

la bacteriología del agua no concierne a las bacterias patógenas sino a las bacterias

heterotróficas nativas, son ellas las que descomponen la materia orgánica (proteínas,

lípidos, carbohidratos), y dan destino a los productos de tales composiciones las

cuales fueron y son reconocidas como eslabones básicos de la cadena alimentaria, por

tanto fue muy importante el desarrollo de métodos para determinar el número de

bacterias y su biomasa siendo ésta la real estimación de su biovolumen.

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1. LAS BACTERIAS Y SU PAPEL EN EL MEDIO ACUÁTICO

Las bacterias heterotróficas son muy importantes en los ciclos de nutrientes del agua,

tal comportamiento fue confirmado en forma evidente a fines de la década del sesenta

y principios del setenta utilizando técnicas de trazadores radioactivos en base a C14

Pudo comprobarse que los organismos más pequeños asimilaban la mayor cantidad de

sustancia orgánica disuelta, la materia orgánica particulada solamente es utilizada por

las bacterias si previamente es hidrolizada a pequeñas moléculas, lo que las obligará a

permanecer cerca de las algas o bien adheridas a las mismas tratando de utilizar sus

exudados o la materia producida por su lisis, este conocimiento fue mejorado gracias

al desarrollo de métodos de cuantificación y biomasa, como colorantes fluorescentes e

instrumental óptico adecuado “microscopía de fluorescencia por luz reflejada”

permitiendo estimar el biovolumen y por lo tanto la biomasa de las poblaciones

bacterianas en presencia de otros microorganismos. De aquí surge la necesidad de

conocer la forma en que se establece la relación entre bacterias y otros componentes

del ecosistema acuático.

Los nutrientes inorgánicos disueltos (NID), la materia orgánica disuelta (MOD) y la

materia orgánica particulada (MOP), pueden sufrir modificaciones, como resultado de

la acción bacteriana. El fitoplacton puede proveer a las bacterias, en forma directa de

materia orgánica a través de la excreción de la desintegración de células muertas, por

otro lado las bacterias, en su conocido papel mineralizador, provee al fitoplancton con

Nutrientes que pueden ser suministrados en cantidades limitativas. En tal caso el

crecimiento fitoplanctonico puede ser directamente dependiente de la actividad

bacteriana.

También son importantes las relaciones entre bacterias y zooplancton, se sabe que es

considerable la pérdida de carbono disuelto derivado de la predación del zooplancton,

éste es utilizado por las bacterias que también colonizan la materia fecal excretada,

por otro lado puede servir como recurso alimentario único y adicional de muchos

protozoos y metazoos

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La MOD a veces en muy bajas concentraciones en el agua se perdería al no ser

consumida por la mayoría de habitantes de los ecosistemas pero las bacterias están

capacitadas para utilizarlas y volverlas a la cadena trófica como MOP (las propias

bacterias).

Otras técnicas utilizadas para determinar bacterias en el agua es la Epifluorescencia:

donde es utilizado el fluorocromo como: naranja de acridina y filtro de membrana

negro.

Imagen de bacteria en división coloreada con naranja de acridina, aumentada 125

LOS PROCARIOTES SON UBICUOS Y COLONIZAN TODO TIPO DE AMBIENTES DONDE LA VIDA SEA POSIBLE:

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2. PICOPLANCTON AUTOTRÓFICO Y HETEROTRÓFICO

BACTERIOPLANCTON PICOCIANOBACTERIAS

PICOEUCARIOTAS

Las bacterias juegan un rol importantísimo en el nivel

biogeoquímico del ciclo del carbono, representan la mayor

parte de biomasa del planeta, consumen entre el 30-40% de

la proporción fitoplanctónica, responsables de la mayoría

de la respiración en el océano, las bacteria acuáticas son

unos de los principales reservorios vivientes de C,N,P y Fe

Las bacterias fotosínteticas en el océano producen aproximadamente la mitad de O2

anual liberado estos microorganismos marinos representan la mitad de producción

primaria del planeta por ejemplo:

Synechococcus 103-105 ml Prochlorococcus 104-105 ml

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3. COMPOSICIÓN CUANTITATIVA Y CUALITATIVA DE LAS COMUNIDADES

MICROBIANAS EN EL OCEÁNO

Más de un 99 % de las poblaciones naturales microbianas marinas están

representadas con formas de bacterias pequeñas de formas cocoides , son

estrictamente oligocarbofílicas por tanto no crecen en medios nutritivos utilizados

comúnmente para los microorganismos de ambientes terrestres, altamente diversas

desde el punto de vista taxónomico y metabólico

Uno de los aspectos más discutidos en la actualidad por los ecológos microbianos

marinos es lo referente a las bacterias no cultibables. Es reconocido que sólo una

parte de las bacterias marinas han sido cultivadas. El resto las llamdas no cultibables

han sido detectadas e identificadas mediante el desarrollo de técnicas moleculares, se

dice que el bacterioplacnton se puede agrupar en :

Bacterias heterótrofas cultibables, bacterias hetérotrofas no cultibables y

fotoautótrofas que se desarrollan en las zonas de suficiente iluminación.

La microbiota planctónica en aguas oligotróficas y mesotroficas existen cocos

pequeños, bacilos cortos y formas bacilares curvadas, entre 0.3 y 0.8 µm.

En ecosistemas eutróficos las poblaciones son menos diversas y están compuestas

principalmente por formas bacilares grandes que viven librevemente, las cuales

descomponen sustancias orgánicas .

Su clasificación ha sido motivo de grandes discusiones, se siguieron acracterísticas

como obtención de energía, utilización de carbono orgánico, carcteristicas

morfológicas y fisiológicas los esqumas utilizados son: Torry Researcher Station por

Sewhan y Col (1960) y Yoshimisu y Col (1980) aún son útiles para clasificar bacterias

marinas y también existen otros modos y esquemas de clasificación.

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4. BIOMASA MICROBIANA

La biomasa microbiana es una variable ecológica importante; ya que se puede

expresar como la medición de la cantidad de bacterias en un volumen específico de

agua, sedimento , suelo.

Representa la cantidad de enregía almacenadapor un segmento particular de la

comunidad biológica. Las mediciones de la biomasa se emplean para determinar la

producción de una población y la transferencia de energía entre los diferentes

niveles tróficos del ecosistema.

Biomasa significa “Masa de bacteria viva” y puede expresarse en unidades de peso

(gramos) o unidades de enregía (calorías o joul).

Por desgracia, las mediciones directas de la biomasa como las que se realizan por

filtración o determinación del peso seco o mediante la centrifugación y medición

del volumen celular, que se practican en cultivos puros, casi nunca son aplicables

a muestras ambientales.

Estas muestras suelen medir partículas minerales y detríticas y biomasa no

microbiana conjuntamente con los microorganismos y no permiten discriminar

entre los niveles tróficos, es decir productores y consumidores. La determinación de

la biomasa microbiana suele ser imprecisa por este motivo.

4.1. Métodos Cuantitativos para la determianción de la Biomasa

El crecimiento de poblaciones se mide estimando los cambios en el número de

células, en la cantidad de algún componente de las mismas (por ejemplo, proteína)

o en el peso total seco de las células. Existen varios métodos de contar el número

de células o de determinar la masa celular (biomasa microbiana), adecuadamente

para diferentes organismos o diferentes situaciones.

La determinación cuantitativa es la parte central o medular del proceso de

estandarización de suspensiones bacterianas con fines de diagnóstico o de

experimentación, cual sea el que se desea practicar.

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Los métodos cuantitativos para una población de bacterias son:

a. Método Nefelométrico.

b. Método de Cuenta en Placa.

c. Método del Número Más Probable (NMP).

d. Método Espectofotométrico.

a. Método Nefelométrico

La estandarización turbidimétrica se hace manifiesta con el Nefelómetro de Mc

Farland, el cual es un conjunto de 10 tubos de dilución todos iguales, con tapón de

jebe, selladas; que contemplan en suspensión dos soluciones:

Cloruro de Bario (BaCl2) al 1%: Colocar en el 1° tubo 0.1 ml de BaCl2 y luego

incrementar en 0.1 ml la cantidad del reactivo en los tubos siguientes de tal

manera que el último tubo sea de 10 ml.

Ácido sulfúrico (H2SO4) al 1%: Agregar este reactivo a cada tubo en cantidad

suficiente hasta que el volumen final en cada tubo sea de 10 ml.

Los tubos se deben cerrar herméticamente para prevenir la contaminación y la

evaporación. Esto permite tener una mezcla homogénea con gránulos

precipitantes de color blanco lechoso cuya densidad asemeja al número bacterias o

microorganismos en suspensión.

La densidad de la suspensión se incrementará a mayor número de tubos, dicha

opacidad corresponderá aproximadamente al siguiente número de

microorganismos en suspensión:

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Solución de

BaCl2 al 1%

Solución de

H2SO4 al 1%

N° de

Tubo

N° de bacterias en

suspensión/ ml

0.1 9.9 1 3x108

0.2 9.8 2 6x108

0.3 9.7 3 9x108

0.4 9.6 4 1.2x109

0.5 9.5 5 1.5x109

0.6 9.4 6 1.8x109

0.7 9.3 7 2.1x109

0.8 9.2 8 2.4x109

0.9 9.1 9 2.7x109

1.0 9.0 10 3.0x109

El método no es del 100% exacto, se sabe que consiste en adecuar el tubo con el

cultivo en medio líquido y la turbidez de este se debe comparar con los tubos del

nefelómetro de Mc Farland y así obtendremos la cantidad de microorganismos en

suspensión. Los estándares más usados para trabajos experimentales son los tubos

1, 2, 3 y el 4; de los cuales el que se recomienda en diseños experimentales es el

tubo N° 03 por dar valor estándar y por su relativa proximidad con el número de

microorganismos capaces de causar septicemia y muerte en un vertebrado

experimental.

b. Método de Cuenta en Placa

Recuento en placa o recuento de colonias, este método es muy utilizado para el

recuento de células viables, una célula viable se define como aquella que es capaz

de dividirse y dar lugar a una descendencia. En este procedimiento se supone que

cada célula viable puede formar una colonia.

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Hay dos maneras de realizar un recuento en placa para viables:

b.1. El método de extensión en placa

En este método un cierto volumen de cultivo diluido, que no suele ser superior a

0.1 ml, se extiende sobre la superficie de una placa con medio sólido utilizando el

asa de Drigalsky estéril. La placa se incuba después hasta que aparecen las colonias

y se cuenta su número. Es importante que la superficie del medio esté seca de

modo que el líquido de la muestra se absorba. No se suele usar volúmenes

mayores de 0.1 ml porque el exceso de líquido no se absorbe y origina problemas

en el recuento al favorecer la extensión y mezcla de colonias.

b.2. El método de vertido en placa (siembra en profundidad)

En este método se pipetea un volumen conocido (normalmente 0.1-1.0 ml) de

cultivo en una placa Petri estéril sobre la que se añade el medio con agar fundido y

se mezcla todo con suaves movimientos de la placa sobre la superficie de la mesa

antes de dejar que se solidifique. Como la muestra se mezcla con el medio fundido,

se pueden usar volúmenes de inóculo mayores que en el método de recuento por

extensión; sin embrago con este método el organismo que se cuenta debe ser

capaz de resistir la temperatura del agar fundido a 45°C.

Métodos para el recuento en placa. En cada caso la muestra se diluye

normalmente antes de sembrar.

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En los dos métodos señalados es importante que el número de colonias que

aparezcan en las placas no sea demasiado grande, pues algunas colonias se podrían

fusionar dando estimaciones erróneas. También es importante que le número de

colonias no sea demasiado bajo para que el cálculo sea significativo. Por ejemplo,

pueden obtenerse recuentos bajos sino se disgregan los grupos de células y los

microorganismos no quedan bien dispersos. Ya que no es posible estar

absolutamente seguros de que cada colonia proviene de una célula individual, los

resultados suelen expresarse como unidades formadoras de colonias (UFC) y no

como número de microorganismos. Los recuentos también serán bajos si el medio

sólido empleado no permite el crecimiento de todos los microorganismos viables

presentes. Además el medio sólido caliente empleado para la siembra en

profundidad puede dañar o destruir las células sensibles; por eso la siembra por

extensión a veces da recuentos más altos que la siembra en profundidad.

Para obtener el número apropiado de colonias casi siempre se diluye la muestra.

Como raramente se sabe de antemano el número de células viables, normalmente

se hace más de una dilución. Lo más frecuente es realizar diluciones decimales de

la muestra, por ejemplo para hacer una dilución de 10 -1 se mezclan 0.5 ml de la

muestra con 4.5 ml de diluyente o 1 ml de la muestra con 9 ml del diluyente.

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Otro método común de siembra en placa es por filtración de membrana. El filtro es

colocado sobre un medio sólido o sobre una esponja empapada en medio líquido y

es incubado hasta que las células dan lugar a colonias separadas. El recuento de

colonias da el número de microorganismos de la muestra filtrada y pueden usarse

medios especiales para seleccionar microorganismos específicos. Esta técnica es

especialmente útil para analizar la pureza del agua.

Técnica de Filtración en membrana. Se emplean membranas con poros de

tamaño diferente según los microorganismos que se desea retener. El tiempo de

incubación de la membrana también varía según el microorganismo y el medio

de cultivo.

Colonias en los filtros de membrana. Muestras filtradas, cultivadas en diferentes

medios. (a) Medio nutriente estándar, para recuento total de bacterias. Un

indicador da a las colonias un color rojo para facilitar el recuento. (b) Medio para

coliformes fecales, que da lugar a colonias azules. (c) Agar wort (“mosto de

cerveza”), para el cultivo de levaduras y mohos.

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Las técnicas de siembra en placa son simples, sensibles y muy utilizadas para el

recuento de microorganismos viables en muestras de alimentos, agua y suelo. Sin

embargo, pueden presentar algunos problemas que dan lugar a recuentos

imprecisos.

c. Método del Número Más Probable (NMP)

Este número es calculado a partir de la observación del crecimiento, tanto con la

aparición de turbidez como con la formación de gas, en cultivos en caldo

duplicados, inoculados con porciones de 1ml de diluciones decimales de la

muestra.

Las cifras que representan resultados positivos con crecimiento en tres diluciones

sucesivas, suelen denominarse número significativo, por ejemplo, si tenemos dos

tubos positivos en la muestra directa, uno en la dilución 10 -1 y otro en la 10-2 se

obtiene el número y se coteja con la tabla de Número Más Probable con lo que

resulta un número significativo que es 210. El método está basado en series de

diluciones y cálculo estadístico del número de bacterias presentes en las diluciones

más altas.

Este método permite diagnosticar el número de coliformes totales de una muestra,

esta técnica se realiza en Caldo Laurel Sulfato Triptosa incubándolo a 35°C, se

observa la producción de gas (campana de Durham) en caldo lactosa bilis verde

BRILLA; aquí contabilizaremos a posteriori, como los microorganismos bajo la

técnica anteriormente descrita.

Algunas de las ventajas del NMP son:

La capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos

relacionados a un proceso (selectividad); por ejemplo se puede determinar

la densidad poblacional de organismos que pueden nodular leguminosas en

una muestra de suelo usando el método de infección de plantas.

Provee una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de

suelos diversificados.

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Determina sólo organismos vivos y activos metabólicamente.

Suele ser más rápido e igual de confiable que los métodos tradicionales de

esparcimiento en platos de cultivo, entre otros.

d. Métodos Turbidimétricos

Un método muy rápido y útil de obtener estimaciones del número de células son las

medidas de turbidez (medida indirecta del crecimiento microbiano). Una suspensión

celular aparece turbia a la vista porque las células dispersan la luz que atraviesa la

suspensión. Cuantas más células estén presentes, mayor será la luz dispersada y por

tanto mayor la turbidez. Se trata del método más habitual para el seguimiento del

crecimiento de un cultivo bacteriano. La medición de alícuotas o muestras del cultivo a

lo largo del tiempo, permite desarrollar curvas de crecimiento de la población

bacteriana. Ello permitirá, a su vez, la comparación de tasas de crecimiento en

diferentes condiciones, el establecimiento de las condiciones óptimas, etc.

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La turbidez puede medirse con aparatos como el fotómetro o espectofotómetro

que hacen pasar la luz a través de suspensiones celulares y detectan la cantidad de

luz emergente no dispersada. El grado de dispersión será proporcional a la

concentración de células presentes. Podemos medir la cantidad de luz que pasa a

través de esa dilución de partículas o cultivo y mediante una calibración saber el

número de partículas de la dilución aproximadamente.

Por desgracia, las mediciones directas de la biomasa indicadas anteriormente,

casi nunca son aplicables a muestras ambientales.

4.2. Otros tipos de Cuantificación

El número total y la biomasa de los microorganismos pueden ser estimados mediante

el conteo total de m.o y la microscopía directa, con el empleo de filtros de menbrana

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de acetato de celulosa y como colorante eritrosina o filtros de policarbonato

(Nucleoporo) preteñidos de negro mediante el colorante Sudán Negro para eliminar la

brillantes y posteiormente tratados con colorantes fluorescentes como el Naranja de

Acridina, el 4,6 Diamidino-2-fenilindiol, Hoescht 33825, o la Fluoroscamina, también se

puede utilizar coloración de ADN mediante citometría de flujo.

La biomasa microbiana es uno de los indicadores más importantes a determinar en los

estudios de ecología microbiana marina. La estimación de ésta a partir del número

total de m.o y el cáculo del biovolumen promedio es uno de los métodos más

empleados en estudios de ecología microbiana ya que es fácil y rápido. Entre otros

tipos de medida tenemos:

1. ENSAYOS BIOQUÍMICOS

La perspectiva más práctica para la determinación de la biomasa microbiana se

basa en pruebas para la detección de compuestos bioquímicos específicos que

indiquen la presencia de microorganismos. Entre estos tenemos:

- Mediante la determinación de algún metabolito: En el estudio de un

ecosistema se suele relacionar la cantidad de seres vivos presentes con la

concentración de un deteminado metabolito, todo metabolito emplado como

indicador de la biomasa debe mantener un valor relativamente cte en el

interior de los seres vivos, ser una sustancia característica de los seres vivos y

no estar presente en las partículas detríticas y la proporción entre el metabolito

en cuestión y el carbono debe ser relativamente constante.

- Determinación del trifosfato de Adenosina (ATP): El ATP presente en los

microorganismos puede cuantificarse con gran presicisón, como el ATP se

pierde rápidamente tras la muerte de las células; la medida de la

concentración de ATP puede usarse para determinar la Biomasa viable, se

puede aplicar:

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- Prueba de Luciferina-Luciferasa, en esta reaccion se emite luz en una

cantidad directamente proporcional a la concentración de ATP

- La cromatografía

- Se han determinado correlaciones empíricas entre las concentraciones de

ATP y de Carbono para algunos ecosistemas acuáticos. Se aplica un factor de

250-286 para establecer la conversión de valores de ATP a carbono celular en

muestras acuáticas.

- Una de las desventajas de este metodo es que la concentración de ATP puede

cambiar substancialmente cuando las condiciones nutricionales o fisiológicas se

alteran

Metódo bioquimico , presenta la desventaja de determinar la biomasa del

microplancton incluyendo también al fitoplacnton ya que los procedimientos

empleados para su separación son poco eficientes

- Componentes de la Pared Celular: Mediciones del ácido murámico como un

componente de la pared celular de las procariotas.

La relación específica entre la mureína componente de la pared celular y la

bacteria convierte la cuantificación de éste componente en una herramienta

útil para el cálculo de la biomasa bacteriana, ya que la mayoría de las bacterias

poseen ácido murámico en su pared celular.

La prueba del ácido murámico se basa en la liberación del lactato por parte del

ácido murámico y en realizar un análisis enzimático o químico para detrminar la

aconcentración de dicho lactato.

La conversión de la medida de ácido murámico (MA) en biomasa supone que

todas las bacterias Gram positivas presentan una proprción de 44 µg MA/mg

de C y que todas las Gram negativas tienen 12 µg de MA/mg de C. para el uso

adecuado de éste método es necesario calcular la proproción de bacterias gram

positivas y gram negativas que éstan presentes en la muestra, para evitar

errores en el cálculo de la biomasa.También se medir la Biomasa a partir del

LPS de las Gram negativas mediante: El lisado de amebocito de Limulus; éste

método se realiza utilizando extarcto acuoso procedente de células sanguínas

de la caracola de las Moluscas Limulus polypbemus, que reacciona

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específicamente con el lipopólisacárido y forma una solución turbia, el

gradiente de turbidez es directamente proporcional a la concentración de LPS,

permitiendo determinarse cuantitativamente; es muy sensible puede detectar

concentraciones inferiores a 10 células/ml.

- Determinación de Quitina en Hongos: La biomasa fúngica se puede determianr

mediante la medición de quitina presente en su pared celular; es sólo aplicada

para estos microorganismos, ya que es propia de ellos; la presencia de

microartrópodos pueden interferir es esta medición

- La clorofila y otros pigementos fotosintéticos: Es posible calcular la biomasa de

algas y bacterias fotosintéticas midiendo la clorofilau otros pigmentos

fotosintéticos; la clorofila a, pigmento fotosintético dominante en algas y

cianobacterias es una medida útil de la biomasa de éstos microorganismos, se

ha visto que la biomasa de los microorganismos fotosintéticos calculados a

partir de éste método se armoniza adecuadamente con la biomasa calculada a

partir de ATP.

La clorofila a puede extraerse con disolventes, como la acetona, o el metanol y

cuantificarse midiendo su absorbancia en un espectofotometro a una longitud

de onda de 665nm aunque puede ajustarse al microorganismo estudiado; por

ejemplo en bacterias rojas fotosínteticas se emplea una longitud de onda de

850 nm, así de ésta manera se puede calcular la biomasa de poblaciones

microbianas fotosintéticas diferentes en una misma muestra calculando las

diferentes clorofilas que absorben la luz en diferentes longitudes de onda.

También puede calcularse por Espectrofluorimetría.

- ADN: Las concentraciones de ADN se mantienen en proporciones

relativamente constantes en los microotganismos y éste puede emplearse

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como medida para la determinación de biomasa microbiana; mediante PCR,

Espectrofluorometría, colorantes fluorescentes como Bromuro de Etidio o

Hoechst 33258, los cálculos a partir de esta medición muestran datos

significativos

- Proteínas: Las proteínas son fácilmente cuantificable, Las proteínas

bacterianas con grupos hemo pueden ser detectadas mediante

quimioluminisencia; una de las limitaciones de éste método es que las

proteínas presentes en el medio sean en número bajas y además se sabe que

los microorganiamos poseen diferentes cantidades de proteínas debiso a esto

sólo se usa éste método cuando no hay más de una población. Tiene una

aplicación limitada para las muestras ambientales.

- Lípidos: Ya que todas las menbranas de las comunidades microbianas

presentan lípidos ; éste método muestra una gran ventaja para la

caracterización in situ de una sociedad microbiana. El ergosterol actúa como

un biomarcador de hongos , el análisis de fosfolípidos unidos a ácidos grasos

se utiliza para la determianción de biomasa microbiana y la ambundancia

relativa de poblaciones microbianas específicas, La presencia de lípidos

polares puede definir la presencia de una biomsa viable; ya que las células para

su funcionamiento necesitan tener la menbrana intacta y dicha menbrana debe

presentar lípidos polares. Por ejemplo; el analísi PLFA ; basandose en el analísis

del contenido de fosfolípidos; Franzmann et al (1996); calcularon que la

biomasa de las células bacterianas de muestras de agua estaba comprendida

entre 0,9-7,8 mg de células equivalentes de E.coli por gramo de peso seco.

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5. ENFOQUE FISIOLÓGICO DE LA DETERMINACIÓN DE LA BIOMASA

Se ha desarrollado algunos métodos de cálculo de la biomasa microbiana que , con un

enfoque fisiológico se basan en la actividad respiratoria ; más aplicado a los

microorganismos del suelo; utilizan la fumigación con Cloroformo y la posterior

medida de CO2 ; liberado a consecuencia de la mineralización de los microorganismo

muertos por fumigación por la fumigación.

6. LA BIOMASA Y EL CÁLCULO DE VOLUMEN DE CADA GRUPO MORFOLÓGICO

Los conteos directos indican la cantidad de microorganismos en un volumen específico

de agua. En muchos casos, especialmente aquellos que involucran la productividad, la

biomasa de las bacterias debe ser determinada como uno de los componentes de la

materia viva soportada por la masa de agua. La biomasa bacteriana puede ser

calculada a partir de los datos obtenidos de los conteos directos y las medidas de las

células es necesaria para determinar el volumen de cada grupo morfológico.

Para obtener el volumen de cada tipo de bacteria, estas pueden ser asimiladas a

esferas (cocos) y cilindros (bacilos), utilizando así la forma del volumen de estas figuras

geométricas, si se opta por este criterio, se debe recoger el mayor número de

mediciones posibles y agruparlas en varios rangos, teniendo en cuenta el número de

casos, para obtener el volumen medio. Ejemplo:

Cocos

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El diámetro medio de los cocos utilizados usados para el volumen medio se expresa

como:

Para este ejemplo entonces el volumen medio de los cocos de acuerdo al volumen de

la esfera sería:

Bacilos

Para calcular el volumen de los bacilos se utilizará la fórmula del cilindro:

Por lo tanto:

Así de esta manera mediante cálculos matemáticos se utiliza para bacilos considerando

su ancho medio y largo medio.

Ancho medio

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Dividiendo la fórmula enunciada en dos partes, en primer lugar se obtiene el ancho

medio, cuyo cálculo se realizará igual que los cocos

Largo medio

Se emplea la media aritmética

Siguiendo con este ejemplo el volumen medio de los bacilos sería:

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Una vez que las dimensiones medias de cada grupo de bacterias ya fueron

determinadas, la biomasa de bacterias puede ser determinada por medio de los datos

del conteo directo. El conteo directo da por ejemplo 200.000 cocos y 400.000 bacilos

en 1 ml de agua. La biomasa de las bacterias se determinará en forma separa por cada

grupo.

Cálculo de la biomasa de cocos

El volumen medio de los cocos en una masa de agua dada es, de acuerdo al ejemplo

2,03 µm3. Por lo tanto en un mililitro de agua se tendrán:

Cálculo de la biomasa de los bacilos

El volumen medio de los bacilos, en esta misma masa de agua y de acuerdo al mismo

ejemplo es de 1, 21 µm3. Por lo tanto en un mililitro de agua se tendrán:

Carbono celular promedio

Con el fin de expresar la biomasa bacteriana en gramos por mililitro, es necesario

transformar el volumen obtenido en los conteos microscópicos en carbono celular. Hay

varios valores en la bibliografía, que hacen referencia al contenido de carbono de las

bacterias, siendo uno de los más usados el factor de Watson (Watson et al., 1977), que

indica que 1 µm3 de bacterias contiene 1,21 x 10 -13 g de carbono.

De acuerdo a esto y al ejemplo anterior por regla de tres simple: Si el volumen

promedio de un coco es 2,03 µm3, contendrá 2,46 x 10 -13 g de carbono o los 4,06 x 10 5

µm3 de los cocos determinados para 1 ml de muestra, contendrá 4,9126 x 10 -8 g de C.

Un bacilo de 1,21 µm3 promedio contendrá 1,46 x 10 -13 g de C y los 484000 bacilos de 1

ml contendrán 5,8564 x 10 -8 g de carbono. En 1 ml de agua entonces tendremos 1,

0769 x 10 -7 g de carbono aportado por las bacterias.

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La expresión final de crecimiento de una bacteria es la división celular y un incremento

en el número y biomasa de células viables en la comunidad. Antes de que las células se

dividan debe haber una síntesis de componentes celulares nuevos, paredes,

membranas, proteínas, ARN y por supuesto ADN. Así el crecimiento puede ser definido

como el incremento de un componente particular de la biomasa de las células, que

culmina con la división celular

7. IMPORTANCIA DE MICROORGANISMOS ACUÁTICOS Y DE LA BIOMASA

La importancia ecológica de los microorganismos reside tanto en su abundancia y su

biodiversidad como en la función que desempeñan dentro del ecosistema en que se

desarrollan. Dentro de los componentes del bacterioplancton, las bacterias

heterotróficas constituyen el grupo más importante ya que son capaces de degradar o

mineralizar la materia orgánica presente en el medio, transfiriendo energía hacia lo

otros niveles tróficos del ecosistema. Los microorganismos son responsables del 70 a

80 % del metabolismo total y de la producción en el ambiente marino, para

comprender la función de los microorganismos en los ecosistemas marinos es

necesario conocer la estructura vertical de la microbiota , su micro distribución, la

biomasa bacterioplanctónica ,es uno de los parámetros más importantes que debe ser

considerado como fuente principal de alimento para organismos consumidores de los

subsiguientes niveles tróficos, y la participación de los m.o en la producción total ,

metabolismo y flujo energético en el ecosistema marino.

Las bacterias heterótrofas marinas son muy versátiles ya que pueden utilizar una

amplia gama de fuentes de nitrógeno, fósforo para su crecimiento como son:

aminoácidos, proteínas y ácidos nucleico.

Algunos factores abióticos y bióticos como son la cantidad y la calidad de la materia

orgánica, concentración de nutrientes, depredación, temperatura, salinidad,

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concentración de O2 disuelto, entre otros, ejercen un control en la abundancia y

crecimiento del bacterioplancton.

Por otra parte, el estrés al que se encuentran sometidos estos microorganismos en el

ambiente marino hace que estos desarrollen la capacidad de producir una serie de

sustancias que potencialmente resultan muy útiles, tal es el caso de proteínas entre

ellas algunas enzimas, polisacáridos, lípidos que presentan actividad antibiótica,

antitumoral, tensioactiva, etc.

Estas sustancias liberadas (antimicrobianos) por estos microorganismos al medio

previniendo la colonización de las especies adyacentes por competidores, actuando

como controles específicos para mantener la diversidad de especies de ecosistemas

microbianos.

Entre las múltiples aplicaciones de los m.o marinos se encuentran la capacidad de

producción de fuentes de energía (hidrógeno, metano), tratamientos de desechos

industriales(metales, plaguicidas, hidrocarburos),producción de aditivos(polímeros,

tensioactiva, adhesivos).

Además existen microorganismos marinos que son productores de gases (H2 y metano)

Y ácidos que son empleados en la industria petrolera y biolixiviación, entre otros

8. BIBLIOGRAFIA

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