burapha science journal volume 26 no september …

วารสารวทยาศาสตรบรพา ปท 26 (ฉบบท 3) กนยายน – ธนวาคม พ.ศ. 2564

BURAPHA SCIENCE JOURNAL Volume 26 (No.3) September – December 2021 บทความวจย

1516

Glochidiol จากไครมด (Glochidion eriocarpum) เสรมฤทธกบยาเตตราซยคลน ในการยบยงการเจรญของเชอแบคทเรยฉวยโอกาส

Antibacterial Activity of Glochidiol from Glochidion eriocarpum Enhanced Tetracycline against Opportunistic Bacteria

วสาตร คงเจรญสนทร * และ วรฒม สมนก

Wisatre Kongcharoensuntorn* and Warut Somnuk ภาควชาชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา

Department of Biology, Faculty of Science, Burapha University Received : 2 October 2020 Revised : 17 January 2021

Accepted : 2 February 2021

บทคดยอ

สาร Glochidiol จากไครมด (Glochidion eriocarpum) มฤทธทางชวภาพตางๆมากมาย เชน ฤทธตานอาการอกเสบ ฤทธตานเซลลมะเรง ฤทธตานแบคทเรย เปนตน งานวจยนสนใจศกษาประสทธภาพของสาร Glochidiol ในการยบยงการเจรญของเชอแบคทเรยฉวยโอกาสและแบคทเรยแกรมลบดอยา โดยการหาคา Minimal Inhibitory Concentration (MIC) และคา Fractional Inhibitory Concentration Index (FICI) ดวยวธ Broth dilution test พบวาเมอใชสาร Glochidiol เพยงอยางเดยวสามารถยบยงการเจรญของเชอ B. subtilis และ Methicillin-resistant S. aureus (MRSA) ไดดทสดใหคา MIC เทากน คอเทากบ 128 µM จากเชอ 11 สายพนธทน ามาทดสอบ แตไมสามารถยบยงเชอ Acinetobacter baumannii ดอยา, Proteus mirabilis, P. vulgaris และ Pseudomonas aeruginosa ดอยา นอกจากน Glochidiol สามารถเสรมฤทธกบยาเตตราซยคลนในการยบยงการเจรญของเชอ E. coli ATCC 25922 และ P. aerugiosa ATCC27853 โดยมคา FICI เทากบ 0.5156 และ 0.5313 ตามล าดบ แตไมเสรมฤทธกบยาแอมพซลลนเพอยบยงการเจรญของเชอ E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 จากนนไดศกษาหาเวลาทเหมาะสมทสดในการยบยงการเจรญของแบคทเรย E. coli ATCC 25922 และ P. aerugiosa ATCC 27853 ดวย Time-kill assay พบวาสามารถยบยงการเจรญของเชอ E. coli ATCC 25922 และ P. aerugiosa ATCC 27853 ไดดทสดในชวโมงท 4 และ 6 ตามล าดบ หลงจากไดรบยาเตตราซยคลน ปรมาณเทากบ 1/2 เทาของ MIC ของยาเตตราซยคลน รวมกบสาร Glochidiol เทากบ 1/32-1/64 เทาของ MIC ของ Glochidiol ตามล าดบ

ค าส าคญ : Glochidiol ; ไครมด ; การเสรมฤทธ ; เตตราซยคลน ; แบคทเรยฉวยโอกาส



1517

Abstract The various biological activities of pure compound, Glochidiol from Khrai mot (Glochidion eriocarpum) are

anti- inflammatory, anti-cancer and anti-microbial activity. In this study, synergistic effect of Glochidiol against opportunistic bacteria and drug- resistant gram negative bacteria was investigated. The Minimal Inhibitory Concentration (MIC) value and Fractional Inhibitory Concentration Index (FICI) were determined for synergistic effect by Broth diffusion test. Among eleven tested bacteria, Glochidiol alone showed the best antibacterial activity to inhibit the growth of B. subtilis and Methicillin- resistant S. aureus (MRSA) and had MICs equal as 128 µM. However, Glochidiol showed no antibacterial activity against drug- resistant Acinetobacter baumannii, Proteus mirabilis, P. vulgaris and drug- resistant P. aeruginosa. Moreover, combination of Glochidiol with tetracycline showed partially synergistic effect against E. coli ATCC 25922 and P. aerugiosa ATCC 27853 with FICI of 0.5156 and 0.5313, respectively. On the other hand, Glochidiol mixed with ampicillin had no effect against E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853. Then, Time-kill assay were tested and indicated that the specific times, mostly decreased the growth of E. coli ATCC 25922 and P. aerugiosa ATCC 27853 were at 4 and 6 hours after treatment

with ½ MICs of tetracycline and 1/32-1/64 MICs of Glochidiol, respectively.

Keywords : glochidiol ; Glochidion eriocarpum ; synergistic effects ; tetracycline ; opportunistic bacteria *Corresponding author : E-mail : [email protected]



1518

บทน า ในปจจบนสถานการณการตดเชอแบคทเรยฉวยโอกาสถกจดเปนหนงในปญหาสาธารณสขทส าคญของโลกรวม ทงประเทศไทย เชอทเปนสาเหตของโรคตดเชอแบคทเรยฉวยโอกาสในโรงพยาบาลทพบมากทสด คอ Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa และ Acinetobacter baumannii เปนตน ซงมกจะพบการระบาด และพบอบตการณการดอยาของเชอแบคทเรยเหลานในหอผ ปวยวกฤตเพมสงขนเปนประวตการณ 20 ปทผานมา เชน E. coli กอใหเกดโรคทางเดนปสสาวะรวมกบตดเชอในทกระบบของรางกาย P. aeruginosa และ A. baumannii ท าใหเกดโรคปอดบวมและภาวะตดเชอของผ ปวยวกฤต เปนตน (Fair and Tor, 2014; Schroeder et al., 2017) นอกจากนเชอแบคทเรยเหลานยงพบอบตการณ การดอยาทสงขน เนองจากแบคทเรยปรบตวดวยกลไกดอยาทหลากหลาย และมกจะดอยากลมเพนนซลลน (แอมพซลลน) อะมโนกลยโคไซด และเตตราซยคลน (Tiwari et al., 2013) ท าใหยาปฏชวนะทใชอยในปจจบนรกษาไมไดผลจงตองเลอกใชยาปฏชวนะอนพนธทแรงขน (Cheesman et al., 2017;. Schroeder et al., 2017) ผลของการดอยาของแบคทเรยเหลาน ท าใหผ ปวยทมารกษาตวในโรงพยาบาล เชน โรคมะเรง หรอจากการผาตด ไตวาย และตบวาย ตดเชอซ าซอนเพมเตมจากแบคทเรยฉวยโอกาสดอยา และเขาสระยะวกฤต จงเปนสาเหตใหผ ปวยเสยชวตเมอรกษาตวอยในโรงพยาบาลยาวนาน (Gupta & Birdi, 2017) จากปญหาดงกลาวขางตน ท ายาปฏชวนะทใชรกษาโรคตดเชอจลนทรยดอยาทใชอยเดมรกษาไมไดผล จงจ าเปน ตองคนควาหายาชนดใหมเพอใชรกษาโรคตดเชอจลนทรยเหลาน แตการพฒนายาตองใหเวลานานมาก ดงนนนกวจยจงหนมาศกษาวจยดานการหาสารบรสทธและสารสกดสมนไพรเพอลดคาใชจายในการรกษา และลดอนตรายจากการรกษาดวยยาปฏชวนะ เพราะสมนไพรเปนผลตผลธรรมชาต หางาย ราคาถก มประวตการใชบรโภคมาอยางยาวนาน รางกายสามารถก าจดออกไดงาย กอใหเกดผลขางเคยงนอยกวายาปฏชวนะเมอใชเปนเวลานาน (Cheesman et al., 2017; Gupta & Birdi, 2017) งานวจยนจงมแนวคดทจะทดสอบการน าสารบรสทธจากธรรมชาตมาผสมกบยาแอมพซลลนและเตตราซยคลน เพราะยาแอมพซลลนและเตตราซยคลน เปนยาตนอนพนธของยาทใชแพรหลายกนอยในปจจบน และมกกอใหเกดการดอยาจากแบคทเรยเสมอ และยาเหลานยงคงจ าเปนเพอใชรกษาโรคตดเชอแบคทเรยบางกลม เชน Anthrax, Listeria, Clostridium, Actinomyces (Cheesman et al., 2017) นอกจากนเพอใชลดผลขางเคยงของการใชยาของการแพยา (anaphylaxis) และลดความเปนพษตอตบและไต และเพอเปนจดเรมตนของการศกษากลไกการออกฤทธของสารบรสทธในการแกปญหาภาวะดอยาของเชอแบคทเรยฉวยโอกาส ผลพลอยไดของการวจยนคอการน าสารบรสทธจากพชไปประยกตใชเปนสวนผสมของเวชส าอาง เปนสารบ ารงผว เปนตน Glochidiol คอสารบรสทธกลม Lupane เปนสารทสกดไดจากไครมด (Khraimot) ชอวทยาศาสตรคอ Glochidion eriocarpum (วงศ Euphorbiaceae).ใบมสรรพคณแกไข และอาการออนเพลย เปลอกมสรรพคณแกปวด ลดไข เปนตน (Smitinand et al., 2007) สารออกฤทธทางชวภาพทพบในไครมดไดแก ไตรเทอรพนอยด (triterpenoids) ซาโปนน (saponin) ฟลาโวนอยด (flavonoid) สเตยรอยด (steroid) และ lupane ปจจบนมการศกษาฤทธทางชวภาพของสารกลม lupane ไดแกฤทธยบยงการเจรญของเชอ Bacillus pyocyaneus, E. coli, K. pneumoniae, S. aureus, Salmonella Paratyphi และ S. Typhi (Nhiem et al., 2012; Zhang et al., 2012) แตไมพบรายงานของเชอฉวยโอกาสกลมอนๆ เชน A. baumannii, P. aeruginosa ฤทธทางชวภาพอนๆ ของสารกลม Lupane เชน Glochidone มฤทธฆาเซลลมะเรงปอดและเมดเลอด Lupeol



1519

CH3

H

H3CCH3

CH3 CH3

H

CH3

CH3

OHH

H

HO

สามารถตานอนมลอสระและตานการอกเสบ (Siddiqueand Saleem, 2011) นอกจากนยงมงานศกษาวจยของการเสรมฤทธของสารสกดจากสมนไพรรวมกบยาปฏชวนะ เชน eugenol รวมกบยาแอมพซลลน สามารถยบยงเชอ E. coli และ S. aureus (FICI เทากบ 0.26 และ 0.38) (Hemaiswarya and Doble, 2009) สาร pentacyclic และ triterpenoid เสรมฤทธกบยา methicillin และ vancomycin ในยบยงการเจรญของ S. aureus เพราะ triterpenoid มผลยบยงการสงเคราะห DNA และสาร macromolecule จงท าใหเกดความเสยหายตอเยอหมเซลลของเชอแบคทเรย (Chung et al., 2011) และการเสรมฤทธของ สารกลมอน เชน น ามนหอมระเหยจากอบเชยรวมกบยา piperacillin สามารถยบยงเชอ E. coli โดยไปรบกวนการการซมผานอเลคโตรไลทของเยอหมเซลลของแบคทเรย รวมถงไปหยดการสงสญญาณ qurum sensing ภายในเซลลแบคทเรย (Yap et al., 2015; Zhang et al., 2017) อยางไรกตามยงไมพบงานวจยทศกษาผลการเสรมฤทธของสารกลม lupane รวมกบ ยาปฏชวนะ ดงนนงานวจยครงนไดส ารวจฤทธยบยงการเจรญของแบคทเรยและศกษาประสทธภาพการเสรมฤทธของสาร Glochidiol รวมกบแอมพซลลนและเตตตราซยคลน งานวจยนอาจจะสามารถน า Glochidiol มาพฒนาเพอใชรวมกบยาปฏชวนะ เพอลดผลขางเคยงของยาปฏชวนะ หรอปรบสตรยาปฏชวนะทใชไมไดผลใหสามารถน ากลบมาใชใหม หรออาจจะน า Glochidiol ทแยกไดจากธรรมชาตนมาใชเปนสวนผสมของเวชส าอาง เปนตน วธด าเนนการวจย

การเตรยมสารบรสทธ Glochidiol แยกไดจากตนไครมด G. eriocarpum ทเกบมาจากจงหวดสราษฎรธาน (รหสพรรณไม BKF147874)

ไดรบความอนเคราะหจาก รองศาสตราจารย ดร.วาร เนองจ านงค ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา โดยน าเฉพาะสวนรากจากไครมดทบดละเอยดมาสกดดวยเฮกเซนไดคลอโรมเทน และเมทานอล ตามล าดบทอณหภมหอง และท าใหสวนสกดแหงดวยเครองระเหยแบบลดความดน จากนนน ามาท าใหบรสทธดวยวธโครมาโตกราฟและวเคราะหหาโครงสรางทางเคมดวย NMR spectroscopy และพสจนเอกลกษณ (Puapairoj et al., 2005) แสดงดงภาพท 1

ภาพท 1 โครงสรางของ Glochidiol (M.W. 442)



1520

แบคทเรยทดสอบ เชอแบคทเรย E. coli ATCC 25922, Bacillus subtilis, Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA), P. aeruginosa ATCC 27853 , Proteus mirabilis, P. vulgaris, Serratia marcescens และ S. aureus ไ ด รบความอนเคราะหและพสจนยนยนสายพนธ ดวยหลกการทางชวเคม จากภาควชาจลชววทยา มหาวทยาลยบรพา จงหวดชลบร ส าหรบ A. baumannii ซงดอยาปฏชวนะหลายชนด ไดแก amikacin, ciprofloxacin, sulperrazon, piperacillin, tazobactam, ceftriaxone, ceftazidime, imipenem, cefpirome, meropenem, cefepime แ ล ะ piperacillin แ ต ต อ บ ส น อ ง ต อ ย า gentamicin และ P. aeruginosa (ดอยา, รหส 1-375/04-2013 ดอยากลม aminoglycosides, β-lactams, carbapenem, quinolone) ไดรบความอนเคราะหจากโรงพยาบาลชลบร จงหวดชลบร

การเพาะเลยงเชอทดสอบ เลยงเชอแบคทเรยในอาหารเลยงเชอ nutrient agar (NA, Merck, Germany) แลวน าไปบมทอณหภม 37oC เปน

เวลา 18-24 h คดเลอกโคโลนเดยว ๆ ของเชอทใชทดสอบจ านวน 4-5 โคโลน น ามาเพาะเลยงในอาหารเลยงเชอ Mueller Hinton Broth (MHB, Becton Dickinson, USA) แลวน าไปบมทอณหภม 37oC เปนเวลา 3-5 h จากนนน ามาเทยบความขนกบ McFarland No. 0.5 เพอเตรยมเชอทดสอบใหมปรมาณ 1 x 108 CFU/ml การหาคาความเขมขนต าสดทสามารถยบยงเชอแบคทเรย (minimal inhibitory concentration, MIC) ประยกตการทดสอบดวยวธ Broth dilution assay (CLSI, 2016) เรมตน น าเชอทดสอบทปรบความขนของเชอใหมปรมาณ 1 x 108 CFU/ml ปรมาตร 100 µl ไปผสมกบสารทดสอบอยางละ 100 µl ไดแก ยาปฏชวนะความเขมขน 8 µM - 2,048 µM หรอ Glochidiol ความเขมขน 8 µM - 2,048 µM ทเจอจางดวยอาหารเหลว Mueller Hinton Broth (MHB) ปรมาตร 100 µl เพอใหมความเขมขนลดลงทละสองเทา จากนนผสมใหเขากนแลวน าสารทดสอบในแตละ treatment ไปบมทอณหภม 37oC เปนเวลา 18-24 h และแตละ treatment ท าการทดสอบจ านวน 3 ซ า จากนนวดความขนของเชอจาก microplate ท O.D. 610 ดวย microplate reader (VersaMax, U.S.A.) บนทกผลเพอหาคา MIC การศกษาเสรมฤทธรวมกนของสารบรสทธ ท าการทดลองเชนเดยวกนกบการหาคา MIC แตใสสารทดสอบในแตละ treatment ดวยการทดสอบแบบ checkerboard assay (Chung et al., 2011) ไดแกผสม Glochidiol ความเขมขน 16 µM - 4,096 µM กบยาปฏชวนะทระดบความเขมขน 16 µM - 4,096 µM อยางละ 50 µl จากนนผสมสารทดสอบดงกลาว ใสในเชอทดสอบ 100 µl (1 x 108 CFU/ml)

และเตมอาหารเหลว MHB 100 µl ผสมใหเขากน แลวจงน าไปบมทอณหภม 37C เปนเวลา 18-24 h และแตละ treatment ท าการทดสอบจ านวน 3 ซ า จากนนท าการเกบตวอยาง เชนเดยวกบ วธ Broth dilution assay โดยวดความขนของเชอจาก microplate แลวหาคา MIC ของการออกฤทธรวมกน แลวน าคา MIC ทงหมด มาค านวณคา FIC ของยาปฏชวนะ และคา FIC ของสารบรสทธ แลวจงน ามาหาคาดชนชวด โดยค านวณไดดงน

1. FIC ของยาปฏชวนะ = คา MIC ของการออกฤทธรวมกน/คา MIC ของยาปฏชวนะเพยงอยางเดยว 2. FIC ของสารบรสทธ = คา MIC ของการออกฤทธรวมกน/คา MIC ของสารบรสทธเพยงอยางเดยว

3. คาดชนชวด fractional inhibitory concentration index (FICI) = FIC ของยาปฏชวนะ + FIC ของสารบรสทธ



1521

การแปลผลดชนชวดประสทธภาพรวม FICI แปลผลดงน FICI < 0.5 คอเสรมฤทธกน (synergistic), 0.5 < FICI < 1 คอ เสรมฤทธกนบางสวน (partial synergistic), FICI = 1 คอมแนวโนมเสรมฤทธ (additive), 1 < FICI < 4 คอมฤทธไมแตกตางจากการใชสารตวเดยว (indifferent ), FICI > 4 คอตานฤทธกน (antagonistic) การศกษา Time-kill assay (Ramli et al., 2017) คอการศกษาการเจรญเตบโตของเชอแบคทเรย เมอทดสอบตอหนวยเวลาเปนเวลา 48 h ท าการทดสอบโดย เตรยมเชอแบคทเรยความขนของเชอกบ McFarland No. 0.5 (1.5 X108 CFU/ml) ปรมาตร 100 µl, เตม Glochidiol และยาปฏชวนะทระดบความเขมขนทเหมาะสม (เชนเดยวกบการทดสอบการเสรมฤทธ) ปรมาตรอยางละ 50 µl แลวผสมใหเขากน จากนนเตมอาหาร MHB ปรมาตร 2.8 ml เขยาสวนผสมใหเขากน แลวน าไปบมทอณหภม 37oC (ท าการเปรยบเทยบกบชดควบคม (control) คอน ากลนปราศจากเชอทผสม MHB และชดเปรยบเทยบ คอ Glochidiol และยาปฏชวนะ) เมอบมตามเวลาทก าหนด จงเกบตวอยางมานบเชอ เพอหาเชอแบคทเรยทรอดชวตทเวลาตางๆ ไดแก 0, 2, 4, 6, 8, 10, 24 และ 48 h เมอครบเวลาทก าหนดกจะเกบตวอยางเชอแบคทเรย แลวน ามาเจอจางดวยวธ 10-fold dilution ในน าเกลอ (0.85% NaCl) จากนน น าเชอปรมาตร 100 µl มาเกลยลงบนอาหาร NA บมตอทอณหภม 37oC เปนเวลา 18.24 h (ท าการทดสอบ 3 ซ า) เพอนบจ านวนโคโลนของเชอแบคทเรยทรอดชวต และบนทกผลเพอน าไปสรางกราฟความสมพนธระหวางจ านวนแบคทเรย ( log CFU/ml) ตอเวลา (h) และน าจ านวนแบคทเรย มาค านวณหาประสทธภาพการยบยงเชอ (The effectiveness antibacterial activity; EAA = รอยละของแบคทเรยทลดลงจากเวลาเรมตน) ค านวณจากสตรดงน

EAA % = (1)

N0 คอ จ านวนเซลลแบคทเรย (CFU/ml) ของกลมควบคม NE คอ จ านวนเซลลแบคทเรย (CFU/ml) ของกลมทดลอง การวเคราะหขอมลทางสถต

ส าหรบการทดลองทงหมดจะท าสามซ า เพอหาคาเฉลยและคาความคลาดเคลอนของการทดลอง ในแตละครง ดวย Excel แลวน าคาทไดมาวเคราะหคาทางสถตเปรยบเทยบสารบรสทธกบยาปฏชวนะดวยการวเคราะหความแปรปรวนแบบทศทางเดยว (one-way ANOVA) และเปรยบเทยบสารบรสทธรวมกบยาปฏชวนะ ดวยการวเคราะหความแปรปรวนแบบสองทาง (Two-way ANOVA) ดวยโปรแกรมสถต Minitab version 17

100

0

0X

N

NNE



1522

ผลการวจย ผลการส ารวจฤทธยบยงเชอแบคทเรยฉวยโอกาสของสาร Glochidiol ผลการส ารวจฤทธยบยงแบคทเรยของ Glochidiol แสดงดงตารางท 1 โดยพบวา Glochidiol มผลในการยบยงการเจรญของเชอแบคทเรยฉวยโอกาสจ านวน 7 สายพนธ จาก 11 สายพนธทน ามาทดสอบ กลาวคอสามารถยบยงการเจรญของเชอแบคทเรย B. subtilis และ MRSA ไดดทสดคอใหคา MIC เทากนคอเทากบ 128 µM รองลงมาคอ K. pneumoniae ใหคา MIC เทากบ 256 µM แตไมสามารถยบยงการเจรญของเชอ A. baumannii ดอยา, P. mirabilis, P. vulgaris และ P. aeruginosa ดอยา (ตารางท 1) เมอเปรยบเทยบการยบยงการเจรญของยาเตตราซยคลนของเชอ E. coli (>760 µg/ml) , S. aureus (56 µg/ml) และ P. aeruginosa ATCC27853 (56 µg/ml) และการยบยงการเจรญของเอมพซลลนของเชอ E. coli (>455 µg/ml), S.aureus (48 µg/ml) พบวาเชอเหลานปรบตวดอยา และ มคาสงกวาคา MIC มาตรฐาน (เตตราซยคลน = 2-8 µg/ml และแอมพซลลน = 2-8 µg/ml) (CLSI. ,2016). และเมอเปรยบเทยบประสทธภาพของสาร Glochidiol กบยาปฏชวนะ 2 ชนด พบวา Glochidiol มประสทธภาพต ากวายาแอมพซลลน และ เตตราซยคลน ยกเวนมประสทธภาพดกวา แอมพซลลนในการยบยงเชอ B. subtilis และยาเตตราซยคลนสามารถยบยงการเจรญของแบคทเรยฉวยโอกาส 7 สายพนธ ไดดกวายาแอมพซลลน และสาร Glochidiol อยางมนยส าคญทางสถต (p<0.05) ตารางท 1 เปรยบเทยบฤทธตานแบคทเรยของสาร Glochidiol กบยาปฏชวนะในการยบยงเชอแบคทเรยฉวยโอกาส

ชนดของแบคทเรย

คาความเขมขนต าสดทสามารถยบยงการเจรญของเชอแบคทเรย µM

Glochidiol ยาแอมพซลลน ยาเตตราซยคลน แกรมบวก

B. cereus 512 128 128 B. subtilis 128 2048 256 S. aureus 1024 128 128 MRSA 128 128 128

แกรมลบ A. baumannii ดอยา >2048 >2048 >2048

E. coli ATCC 25922 2048 >2048 1024

K. pneumoniae 256 128 1024 P. mirabilis >2048 128 2048 P. vulgaris >2048 1024 512 P. aeruginosa ATCC27853 2048 >2048 256

P. aeruginosa ดอยา >2048 >2048 >2048



1523

ผลการเสรมฤทธของสาร Glochidiol กบยาปฏชวนะ การทดสอบการเสรมฤทธไดเลอกทดสอบกบเชอทมกพบอบตการณการดอยาในโรงพยาบาลสง ไดแก A. baumannii

ดอยาและ P. aeruginosa ด อยา และเปรยบเทยบกบชดควบคมไดแก E. coli ATCC 25922 และ P. aeruginosa ATCC27853 ทงนเพอน าไปใชประโยชนในการศกษากลไกการยบยงการเจรญของแบคทเรยดอยา งานวจยนพบวา Glochidiol ไมเสรมกบยาแอมพซลลน ในการยบยงเชอแบคทเรย 4 สายพนธ (ตารางท 2) แตสามารถเสรมฤทธกบยาเตตราซยคลนในการยบยงการเจรญของเชอ E. coli ATCC 25922 และ P. aeruginosa ATCC27853 โดยพบวาเมอใชสาร Glochidiol รวมกบยาเตตราซยคลนความเขมขน 512 µM (เทากบ ½ เทาของคา MIC ยาเตตราซยคลนเดม) รวมกบใชสาร Glochidiol ดวยคาความเขมขน 32 µM (1/64 เทาของคา MIC Glochidiol เดม) สามารถยบยงการเจรญของ E. coli ATCC 25922 ไดอยางมประสทธภาพยงขน โดยใหผลเสรมฤทธกนบางสวน (Partially Synergistic effect) แสดงคา FICI เทากบ 0.5156 (ตารางท 3) และเมอใชยาเตตราซยคลน ความเขมขน 128 µM (เทากบ ½ เทาของคา MIC ยาเตตราซยคลนเดม) รวมกบสาร Glochidiol ความเขมขน 64 µM ( 1/32 เทาของคา MIC Glochidiol เดม) สามารถยบยงการเจรญของ P. aeruginosa ATCC27853 ไดอยางมประสทธภาพเชนเดยวกน โดยใหผลเสรมฤทธกนบางสวน แสดงคา FICI เทากบ 0.5313 (ตารางท 3) และยาเตตราซยคลนเพยงชนดเดยว มอทธพลในการยบยงเชอแบคทเรย ทระดบนยส าคญ 0.05 (p<0.05) (ไมไดแสดงผลการทดสอบ) ตารางท 2 เปรยบเทยบการเสรมฤทธของสาร Glochidiol กบยาปฏชวนะสองชนดในการยบยงการเจรญของเชอ แบคทเรยฉวยโอกาส

แบคทเรย

ประสทธภาพการออกฤทธรวมระหวางสาร Glochidiol กบยาปฏชวนะ Glochidiol + ยาแอมพซลลน Glochidiol + ยาเตตราซยคลน คา FICI แปลผล คา FICI แปลผล

A. baumannii ดอยา - - - - E. coli ATCC 25922 - - 0.5156 เสรมฤทธกนบางสวน

P. aeruginosa ATCC27853

- -

0.5313 เสรมฤทธกนบางสวน

P. aeruginosa ดอยา - - - -



1524

ตารางท 3 เปรยบเทยบคาดชนตางๆของการเสรมฤทธของสาร GE-15 กบยาปฏชวนะเตตราซยคลนในการยบยงการเจรญ

ของเชอแบคทเรยฉวยโอกาส

การศกษาผลของเวลาในการออกฤทธของสาร Glochidiol เมอผสมกบยาเตตราซยคลนในการยบยงการเจรญของ

แบคทเรยตอหนวยเวลา (Time-kill assay) เมอใชสาร Glochidiol เทากบ 1/64 MIC (32 µM /2048 µM) รวมกบยาเตตราซยคลน เทากบ ½ MIC (512

µM/1024 µM) สามารถยบยงการเจรญของ E. coli ATCC 25922 ไดดทสดในชวโมงท 4 กลาวคอจะท าใหจ านวนโคโลนของแบคทเรยจะลดลงจากเวลาเรมตน รอยละ 86.50 ของการยบยง และสามารถยบยงการเจรญของ E. coli ATCC 25922 อยในชวงเรมตนของ log phase นอกจากนยงสามารถลดระยะเวลาของการออกฤทธของยาเตตราซยคลนใหเรวยงขนจากเดม 2 ชวโมง (เดมออกฤทธในชวโมงท 6) (ภาพท 1 และภาพท 2) เมอใชสาร Glochidiol เทากบ 1/32xMIC (64 µM/2048 µM) รวมกบยาเตตราซยคลน เทากบ ½ MIC (128 µM/256 µM/) สามารถยบยงการเจรญของ P. aeruginosa ATCC 27853 ไดดทสดในชวโมงท 6 กลาวคอ จะท าใหจ านวนโคโลนของแบคทเรยจะลดลงจากเวลาเรมตน รอยละ 69.97 และสามารถยบยงการเจรญของ P. aeruginosa ATCC27853 ในชวงเรมตนของ log phase และลดระยะเวลาของการออกฤทธของยาเตตราซยคลนใหเรวยงขนจากเดม 4 ชวโมง (เดมออกฤทธในชวโมงท 10) (ภาพท 3 และภาพท 4)

เแบคทเรย

สาร GE-15 ยาเตตราซยคลน

FICI

แปลผล MIC GE-15

MIC ออกฤทธรวม

FIC GE-15

MIC ยาเตตราซยคลน

MIC ออกฤทธรวม

FIC ยาเตตราซยคลน

A. baumannii >2048 - - >2048 - - - -

E. coli ATCC 25922

2048 32 0.0156 1024 512 0.5 0.5156 เสรมฤทธกนบางสวน

P. aeruginosa ATCC27853

2048 64 0.03125 256 128 0.5 0.5312 เสรมฤทธกนบางสวน

P. aeruginosa ดอยา

>2048 - - >2048 - - - -



1525

วจารณผลการวจย ผลการส ารวจฤทธของ Glochidiol เพอยบยงการเจรญของแบคทเรยฉวยโอกาส แสดงใหเหนวา Glochidiol สามารถยบยงการเจรญของเชอ B. cereus, S. aureus, E. coli และ P. aeruginosa ATCC27853 ซงสอดคลองกบงานวจยทพบวาสารกลม lupane สามารถยบยงเชอจลนทรยในกลมเดยวกนแต งานวจยน พบวา Glochidiol มประสทธภาพทต ากวา (56.58-905.21 µg/ml) (Siddique and Saleem , 2011; Penduka et al., 2015) และสามารถยบยงเชอแบคทเรยกลมเดยวกนกบ lupane ทพบในพชวงศ Euphorbia hirta (MIC ระหวาง 64-128 µg/ml) Glochidiol สามารถยบยงเชอแบคทเรย ทงแบคทเรยแกรมบวกและแกรมลบ เพราะ Glochidiol เปนสารบรสทธคลายกบสารกลม triterpene จงอาจจะไปมผลตอ การการสงเคราะห DNA และ macromolecule หรอยบยงการสงเคราะหเยอหมเซลลของแบคทเรย (Chung et al., 2011) หรอ ATCC27853 ตอหนวยเวลา (time-kill curve assay ณ จดเวลาทดทสดของการยบยง คลายกบสารกลม triterpene อาจจะชวยลดการสรางไบโอฟลมของเชอแบคทเรย เชน E. coli และ S. aureus (Silva et al., 2019; Awolola et al., 2014) ดงนนจะเหนไดวา Glochidiol มฤทธยบยงแบคทเรยทงแกรมบวกและแกรมลบฉวย จงสามารถไปประยกตใช เชน เปนสวนผสมในน ายาท าความสะอาดเพอลดการตดเชอแบคทเรยฉวยโอกาสได อยางไรกตามควรทดสอบความเปนพษกอนน าไปใชจรง

ภาพท 1 ผลของสาร Glochidiol (GE-15) รวมกบยาเตตราซยคลนในการยบยงการเจรญของ E. coli ATCC 25922 ตอหนวยเวลา (Time-kill assay)

5

5.5

6

6.5

7

7.5

8

8.5

0 2 4 6 8 10 12 24 48

จ ำนว

นโคโ

ลน lo

g 10

(CFU

/ml)

เวลำ (ชวโมง)

Glochidiol+Tet

Tet

Glochidiol

น ำ



1526

ภาพท 2 เปรยบเทยบประสทธภาพของ (EAA) Glochidiol รวมกบยาเตตราซยคลนในการยบยงการเจรญของ E. coli

ATCC 25922 ตอหนวยเวลา (time-kill curve assay) ณ จดเวลาทดทสดของการยบยง

ภาพท 3 ผลของสาร Glochidiol รวมกบยาเตตราซยคลนในการยบยงการเจรญของ P. aeruginosa ATCC27853 ตอหนวยเวลา (Time-kill assay)

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10 12 24 48

รอยล

ะของ

จ ำนว

นโคโ

ลนท

เปลย

นแปล

งจำ

กคำเร

มตน

(EAA)


Glochidiol

เตตรำซยคลน

เตตรำซยคลน+Glochidiol

5

5.5

6

6.5

7

7.5

8

8.5

0 2 4 6 8 10 12 24 48จ ำนว

นโคโ

ลน lo

g 10

(CFU

/ml)


Glochidiol+Tet

Tet

Glochidiol

น า



1527

ภาพท 4 เปรยบเทยบประสทธภาพของ Glochidiol รวมกบยาเตตราซยคลนในการยบยงการเจรญของ P. aeruginosa

งานวจยนแสดงใหเหนวาสาร Glochidiol สามารถเสรมฤทธกบยาเตตราซยคลนในการยบยงเชอแบคทเรยแกรมลบ

คอ E. coli และ P. aeruginosa ซงสนบสนนผลการวจยเชนเดยวกบสารกลมเดยวกนคอ oleanolic acid (สารกลม

triterpenoid) สามารถเสรมฤทธยาเตตราซยคลนบางสวนในการยบยงการเจรญของเชอแกรมลบคอ A. baumannii (FICI

เทากบ 0.531) (Shin and Park , 2015) นอกจากนยงพบรายงานวจยทมการศกษาทสนบสนนการเสรมฤทธในสารกลม

triterpenoid จากตนพญาสตบรรณ เสรมฤทธกบแอมพซลนและเตตราซยคลน เพอยบยงการเจรญของเชอแกรมบวก Bacillus

cereus และ S. aureus (Wang et al., 2016) หรอสาร ursolic acid (triterpenoid) สามารถเสรมฤทธกบยาแวนโคมยซนและ

เซฟราดน เพอยบยงเชอแกรมบวก S. aureus (Hamza et al., 2016) อยางไรกตามงานวจยนแสดงใหเหนวา Glochidiol

รวมกบยาเตตราซยคลนไมสามารถยบยงเชอ A. baumannii และ P. aeruginosa ดอยา อาจจะเกดจากเชอดอยาเหลาน

มความสามารถในการปรบตวดอยาอยกอนแลว เชน การเปลยนแปลงเปาหมายในการจบของยาปฏชวนะ สรางเอนไซม

มาท าลายยาปฏชวนะ หรอขบยาออกนอกเซลลได ท าใหการเสรมฤทธของ Glochidiol ไมไดผล (Schroeder et al., 2017)

ซงจะตองศกษากลไกการออกฤทธของสาร Glochidiol และกลไกการเสรมฤทธของสารและยาปฏชวนะรวมกน นอกจากน

งานวจยนยงพบขอสงเกตคอยาเตตราซยคลนสามารถชวยลดปรมาณการใชสาร Glochidiol ใหนอยลงยงขน (1/64 - 1/32

ของ MIC ของ Glochidiol) อาจจะเปนไปไดทยาเตตราซยคลนไปเพมประสทธภาพการท างานของสาร Glochidiol

การศกษา Time-kill assay ของ สาร Glochidiol แสดงใหเหนวาสามารถสงเสรมยาเตตราซยคลน สามารถลดปรมาณการใชยาปฏชวนะใหนอยลง 1/2 เทาของเตตราซยคลน อกทงสามารถลดปรมาณการตดเชอแบคทเรยลง (ประมาณ 1-1.5Log10CFU/ml) และสามารถลดระยะเวลาในการออกฤทธของยาปฏชวนะใหเรวขน 2-4 ชงโมง แตมประสทธภาพต ากวา

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 2 4 6 8 10 12 24 48

รอยล

ะของ

จ ำนว

นโคโ

ลนทเ

ปลยน

แปลง

จำกค

ำเรมต

น (EA

A)


Glochidiol

เตตรำซยคลน

เตตรำซยคลน + Glochidiol



1528

สารกลมอลคาลอยด (cycloberberine) เพราะสามารถยบยงการเจรญของ MRSA มากวา 6 Log10CFU/ml ภายในเวลา 12 h เมอใชสาร 8XMIC (Yang et al., 2018) อยางไรกตามยงคงตองศกษากลไกการออกฤทธเบองตนของ Glochidiol เพอตอยอดไปสการศกษากลไกการดอยาและการแกไขภาวะดอยาของเชอแบคทเรย ประโยขนทไดรบคออาจจะน าสาร Glochidiol มาใชเปนสวนผสมเวชส าอาง หรออาหารเสรม หรอปรบใชกบยาปฏชวนะเพอลดขนาดการใชยาปฏชวนะ ทงนเพอชวยลดผลขางเคยงของยาเตตราซยคลน กอาจจะชวยลดปญหาการตดเชอแบคทเรย เชน การตดเชอซ าซอนเพมเตม (superinfection) ในกลมผ ปวยทตองใชเวลานานในการรกษา อยางไรกตามเนองจากการใชสารสกดจากพชรวมกบยาปฏชวนะทงสองชนดพรอมกนอาจจะสงผลเปนอนตรายตอเนอเยอ อวยวะของสตวหรอมนษยทได จงควรน าสาร Glochidiol ผสมกบยาปฏชวนะไปทดสอบความเปนพษ หรอการอกเสบกบเซลลไลนปฐมภมเพอทดสอบความปลอดภยกอนน าไปใชประโยชน สรปผลการวจย สาร Glochidiol สามารถยบยงการเจรญของเชอแบคทเรยฉวยโอกาส 7 สายพนธ จาก 11 สายพนธทน ามาทดสอบ และ Glochidiol มประสทธภาพต ากวายาแอมพซลลน และเตตราซยคลน นอกจากน Glochidiol สามารถเสรมฤทธกบยา เตตราซยคลนในการยบยงเชอ E. coli ATCC 25922 และ P. aerugiosa ATCC27853 และสามารถลดระยะเวลาของการออกฤทธของยาเตตราซยคลนใหนอยลง 2-4 ชงโมง กตตกรรมประกาศ งานวจยนส าเรจเรยบรอย เพราะไดรบการสนบสนนจากภาควชาจลชววทยา และโรงพยาบาลชลบร จงหวดชลบร ทใหความอนเคราะหเชอแบคทเรยทน ามาใชในงานวจย และขอขอบคณภาควชาชววทยา ทใหความอนเคราะหอปกรณและสถานทท าวจย เอกสารอางอง Chaudhary, H.J., Zeb, A., Bano, A., Rasul, F., Munis M.F.H., Fahad, S., & Naseem W. (2011). Antimicrobial

activities of Sapium sebiferum (L.) belonging to family Euphorbiaceae. Journal of Medicinal plant Research, 5(24), 5916-5919.

Chung, P.Y., Navaratnam, P., & Chung, L.Y. (2011). Synergistic antimicrobial activity between pentacyclic

triterpenoids and antibiotics against Staphylococus aureus stains. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 10(25), 1-6.



1529

Cheesman, M.J., Ilanko, A., Blonk, B., & Cock, I.E. (2017). Developing new antimicrobial therapies: are synergistic combinations of plant extracts/compounds with conventional antibiotics the solution? Pharmacognosy Reviews, 11(22), 57-72.

CLSI. (2016). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 26th edition. CLSI supplement

M100S. Pennsylvania: Clinical and laboratory standard institute. Fair, R.J. & Tor, Y. (2014) . Antibiotics and bacterial resistance in the 21st century. Perspectives in Medicinal

Chemistry, 6, 25-64. Gupta, P.D., & Birdi, T.J. (2017). Development of botanicals to combat antibiotic resistance. Journal of Ayurveda

and Integrative Medicine, 8(4), 266-275.

Hamza, M., Nadir, M., Mehmood, N., & Farooq, A. (2016). In vitro effectiveness of triterpenoids and their synergistic effect with antibiotics against Staphylococcus aureus strains. Indian Journal of Phamacology, 48(6), 1-5.

Hemaiswarya, S., & Doble, M. (2009). Synergistic interaction of eugenol with antibiotics against Gram negative

bacteria. Phytomedicine, 16, 997-1005. Nhiem, N.X., Thu, V.K., P.V., Minh, C.V., Tai, B.H., Quang, T.H., Cuong, N.X., Yen, P.H., Boo, H.J., Kang, J.l.,

Kang, H.K., & Kim, Y.H. (2012). Cytotoxic Oleane-type Triterpene Saponins from Glochidion eriocarpum. Archives of Pharmacal Research, 35 (1), 19-26.

Penduka, D., Gasa, N.P., Hlongwane, M.S., Amosa, R.A., Osunsanmi, F.O., & Opoku, A.R. (2015).The antibacterial

activities of some plant-derived triterpenes. African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines, 12(6), 180-188.

Patel, N.B., & Patel K.C. (2013). Antibacterial activity of Euphorbia hirta L. ethanomedicinal plant against gram

negative UTI pathogens. International Journal of Pharmaceutical Research & Allied Sciences, 3, 24-29.



1530

Puapairoj, P., Naengchomnong, W., Kijjoa, A, Pinto, M, Nascimento, M.S., Silva, A.M., & Herz, W. (2005). Cytotoxic activity of lupane-type triterpenes from Glochidion sphaerogynum and Glochidion eriocarpum two of which induce apoptosis. Planta Med, 71, 208-213.

Ramli, S. , Radu, S. , Shaari, K. , and Rukayadi, Y. (2017) . Antibacterial activity of ethanolic extract of Syzygium

polyanthum L. (Salam) leaves against foodborne pathogens and application as food sanitizer. Biomed Research International, DOI 10.1155/2017/9024246.

Schroeder, M., Brooks, B.D., & Brooks, A.E. (2017). The complex relationship between virulence and antibiotic

resistance. Gene, 8(39), 3-23. Shin, B., & Park, W. (2015). Synergistic effect of oleanolic acid on aminoglycoside antibiotics against

Acinetobacter baumannii. PLOS ONE. doi: 10.1371/journal.pone.0137751. Siddique, H.R., & Saleem , M. (2011). Beneficial health effects of lupeol triterpene: a review of preclinical

studies. Life Science, 88, 285-93. Silva, G.N.S., Primon- Barros, M., Macedo, A.J. & Gnoatto, S.C.B. (2019). Triterpene derivatives as relevant

scaffold for new antibiofilm drugs. Biomolecules, 9(2), 58. Tiwari, R., Chakraborty, S., Dhama, K, Rajagunatan, S., & Singh, V. (2013). Antibiotics resistance an emerging

health problem: causes, worries, challenges and solution: a review. International Journal of Current Research, 5, 1880-1892.

Wang, C.M., Chen, H.T., Wu, Z.Y., Jhan, Y.L., Shyu, C.L., & Chou, C.H. (2016). Antibacterial and synergistic activity

of pentacyclic triterpenoids isolated from Alstonia scholaris. Molecules, 21, 1-11. Wagner H. & Ulrich- Merzenich, G. ( 2 0 0 9) . Synergy research: approaching a new generation of

phytopharmaceuticals. Phytomedicine, 16, 97-110.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19211237



1531

Yap, P.S., Krishnan, T., Chan, K.G., & Lim, S.H.E. (2015). Antibacterial mode of action of Cinnamomum verum bark essential oil, alone and in combination with Piperacillin, against a multidrug-resistant Escherichia coli strain. Journal of Microbiology and Biotechnology, 25(8), 1299–1306.

Yang, Y.S., Wei, W., Hu, X.X., Tang, S., Pang, J., You, X.F., Fan, T.Y., Wang, Y.X., Song, D.Q. (2018). Evolution

and antibacterial evaluation of 8-hydroxy-cycloberberine derivatives as a novel family of antibacterial agents against MRSA. Molecules, 24(5), 984.

Zhang, J., Ye, K. P., Xin., Z., Pan., D.D., Sun, Y.Y., & Cao, J.Z. (2017). Antibacterial activity and mechanism

of action of black pepper essential oil on meat-borne Escherichia coli. Frontiers microbiology. DOI:10.3389/fmicb.2016.02094.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6429263/



https://www.researchgate.net/deref/http%3A%2F%2Fdx.doi.org%2F10.3389%2Ffmicb.2016.02094?_sg%5B0%5D=nKsuzeaTAEeEYMqifaRHDJ5WpQWyJ2fyJHBLiKrzYh-WIi27pTWKRH01HYfNzHO8q61tsoychO-BaBRkESItmrPUdg.38RfjyVo8lhztFqE3ARqOJE3_-Ba-ArGNyqNEoZmsiI78g-qqe8UmahiWnDlrVig4grvP16oMuZb7CcBtRJ3dQ

burapha science journal volume 26 no september …

Documents