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Cambios en el documento
SANCO 2009 y métodos de screening de residuos en
LCMSJuan Aybar
Especialista GCMS/LCMSAGILENT TECHNOLOGIES
Agenda
1. Introducción a la guía SANCOa) Novedadesb) Posibilidad de métodos de
screening genérico de plaguicidas en alimentacion
2. Métodos de sceening de plaguicidas basados en masa exacta
3. Métodos de screening basados en sistemas triple cuadrupoloa) LCQQQ – Dynamic MRMb) GCQQQ – Backflush
4. Resumen
Documento SANCO
Nuevas directrices de la Comisión Europea
Method Validationand Quality Control
Procedures forPesticide ResiduesAnalysis in Food
and Feed
Documento SANCO/10684/2009
Objetivos Fundamentales
Establecer un sistema armonizado y “cost-effective” de aseguramiento de la calidad en la UE Asegurar la calidad y comparabilidad de los resultados analíticos Asegurar una aceptable exactitud de los resultados analíticos Asegurar la ausencia de falsos positivos/negaticos en los reports Servir de apoyo para la acreditación ISO 17025
El documento es integral y complementario a los requisitos de 17025
Inicialmente está dirigido a los laboratorios de control oficial
Documento SANCO/10684/2009
Algunas novedades de cara a la acreditación
Establecimiento de un nuevo grupo de productos para la selección de matrices representativas Frutos de alto contenido en azúcar y bajo contenido en agua Diferencia Commodity Group/Commodity Category Nueva ubicación de algunos productos – patata, zanahoria
Documento SANCONovedades en identificación de plaguicidas en matriz alimentaria
Por primera vez la guía SANCO incorpora la
posibilidad de uso de sistemas
TOF para identificación de
residuos
Documento SANCO/10684/2009Puerta abierta a acreditación de métodos de screening genéricos
-Debe establecerse un grado de confianza para la detección/identificación de un analito a un nivel de concentración (Ratio de FN menor al 5%)-Una validación básica puede consistir en el análisis de 10 muestras diferentes de cada grupo de matrices fortificadas al SRL – Screening Reporting Level- Un analito detectado debe ser confirmado mediante un segundo análisis con una confirmación adecuada
ALTA RESOLUCION, EXACTITUD DE MASA, VELOCIDAD DE ANÁLISIS
Signal Response
Mass Spectrum
• Sensitivity
• Dynamic Range
• Linearity
• Ionization Profile
• Mass Accuracy
• Isotopic Fidelity
• Mass Resolving Power
• Acquisition Rate
• Data Mining
• Differential Profiling
• Compound ID
• Annotation
• Peak Resolving Power
• Peak Capacity
• Separation Speed
6540 Ultra High Definition
Q-TOF LC/MS
Beneficios de Agilent TOF Technology en el análisis de compuestos Non-Target
•Adquisición de espectro completo
• Todos los datos todo el tiempo
• Sin necesidad de desarrollar metodologías específicas
• Software de Data Mining exacto y automatizado para la identificación de compuestos (Molecular Feature Extractor)
• Búsquedas y Reports con la Accurate Mass Compound Database (Pesticide/Forensic PCD).
• Instrument Set-up Automatizado• Auto-tune total para uso a lo largo de todo el rango de masas
• Calibration Tune Solution y Reference Ion Introduction (CDS)
• Calibración del eje de masas conseguida en segundos y estabilidad a lo largo de toda una secuencia de análisis
• Adquisición de datos sensible y rápida• Hasta 40Hz de frecuencia de adquisición
• Permite sin problemas el trabajo con separaciones de cromatografía rápida
• Overlapped Autosampler Sample Injections para mayores ahorros de tiempo
• La mayor sensibilidad entre los sistemas TOF hasta picogramos bajos en columna
RRLC
QTOF
Q-TOF Analyzer Ion Optics
CuadrupoloCelda colision
Analizador de tiempo
de vuelo
Agilent QTOFTrabajo en Full Scan MS y MS/MS
6230 Accurate Mass TOF LC/MS
True Hi-Def Technology
Rendimiento sin
compromisos
Exactitud de masa < 2 ppm
> 20000 Resolucion
105 Rango Dinámico
Hasta 40 espectros/s
Opciones de ultra elevada
sensibilidad
Agilent JetStream
(conventional flow)
Chip-HPLC (nanoflow)
RRLC – 6230 Accurate
Mass TOF LC/MS
6540 Ultra High Definition
Q-TOF LC/MS
6540 UHD Q-TOF LC/MS
RESEARCH PERFORMANCE ON THE BENCHTOP
Acceso rutinario a Datos de Alta Resolución/Masa Exacta• Mantenimeinto automatizado de la calibración
• Sin influencias por alteraciones en la temperatura del laboratorio
Rendimiento sin precedentes en sistemas QTOF
• >40,000 resolucion a 20 espectros/s
• 5 órdenes de rango dinámico lineal
• <1 ppm MS exactitud de masa; <2 ppm MS/MS
• Sensibilidad sin rival en sistemas TOF/QTOF
El salto hacia nuevas aplicaciones
• Caracterización y análisis de muestras complejas
• Mass Profiler Professional para análisis diferencial
• Screening de compuestos Non-Targeted
• Qual / Quan: Capacidades Cuantitativas Garantizadas
-2.00
-1.50
-1.00
-0.50
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Mass E
rro
r (p
pm
)
Acquisition Rate (scans/second)
azoxystrobin 404 m/z
cyproconazole 292 m/z
cyprodinil 226 m/z
diazinon 305 m/z
linuron 249 m/z
paclobutrazol 294 m/z
propazine 229 m/z
tetraconazole 372 m/z
tricyclazole 190 m/z
Exactitud de masa invariable con la frecuencia de adquisiciónEjemplo de mix de pesticidas
Procesado de DatosPosibilidades• Diferentes algoritmos para eliminar background, extraer
compuestos
– Molecular feature extraction (MFE)
– Find by Formula (para datos MS)
– Find by Auto MSMS (usado en datos data-dependent MSMS)
– Find by Target MSMS (usado en datos desde adquisiciones target)
• Búsqueda en bases de datos de masas exactas con/sin RT
– Usado para datos MS provenientes de MFE, Find by Formula
– También usado para datos MS desde experimentos Auto MS/MS y targeted MS/MS
• Búsqueda en librerías de espectros MS/MS de masa exacta
– Usado para espectros MS/MS desde data-dependent Auto MS/MS
– Usado para espectros MS/MS desde experimentos target
– Usado para espectros MS/MS asignados a compuestos MFE
Los datos se procesan por un algoritmo desarrollado por Agilent de búsqueda de “features”
• Encuentra picos cromatográficos
– Encuentra todos los iones relacionados
– Incluye aductos, como Na+ o K+
– Incluye isotopos ([M+H]+, [M+H+1]+,…
– Chequea la presencia de dímeros
– Crea cromatogramas de compuesto extraído (ECC) y espectros
• Suma todos los iones en un único valor (Feature)
• Proceso totalmente automatizado
• Crea un fichero de datos para exportar
Molecular Feature Extraction Algoritmo de búsqueda de compuestos
Screenig Rápido en Aplicaciones de Seguridad AlimentariaPresencia de triazinas en tomate a baja concentración
4x10
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
6.5
7
7.332
5.037
5.018
3.384
7.254
3.034
7.332
Counts vs. Acquisition Time (min)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Ametryn
Propazine
Prometon
Simazine
Prometryn
Terbutryn
Atrazine
EICs
6x10
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4346.25850
701.42128213.14878922.00980
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
Espectro a 5.018 min
4x10
0
0.25
0.5
0.75
1
1.25
1.5
1.75
2
2.25
2.5
2.75
3 214.15648
216.10129C8H15ClN5
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)214 215 216 217 218 219
Atrazine
-1.1 ppm
Zoom
7x10
0
0.25
0.5
0.75
1
1.25
1.5
1.75
2
2.25
2.5
2.75
3
3.25
3.5
3.75
4
4.25
7.3327.3325.0375.0183.384 7.2543.034
Counts vs. Acquisition Time (min)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
TIC
Compound % RSD
(3 inj.)
Simazine 0.3
Prometon 1.6
Atrazine 0.3
Ametryn 2.2
Propazine 2.6
Prometryn 2.6
Terbutryn 2.2
Masa en columna de 5 pg (10 µL x 500 ppt) Identificación por búsqueda en base de datos
6230 TOF, Modo MS, Rango Dinámico Extendido
Page 17
Agilent TOF Solución de Screening
Agilent 6220/30 TOF
• 20K Resolucion
• 5 decadas en-scan
• Sensibilidad a nivel de pg bajos
Matriz Compleja de Pimiento extraída con método QUECHERS . ¿Cómo identifiar los pesticidas presentes en este cromatograma FS?
Tanto si el cromatograma tiene pesticidas como si no, el aspecto del cromatograma es
muy parecido
Pesticide Personal Compound Database1600 Pesticides and Related compounds
El usuario puede generar sus propias bases de datos en función de que
el método usado pueda mejorarse para una matriz en particular
Masa Monoisotópica
(varia en ppm)
Isotope spacing
(varia en ppm)
Distribucion Isotópica
(varia en %)
Scoring basado en
Resultados del Screening usando MFE + PCDB de pesticidas
COMPUESTOS TARGET - RTs conocidos – Estándares inyectados
COMPUESTOS NO TARGET - RTs desconocidos pero loresentes en la DB – Estándares no inyectados
Automatización de la búsqueda desde MassHunter Cualitativo
Una vez adaptada/comprobada la base de datos suele usarse desde MassHunter Qual
Importancia del uso del RT en el score(ejemplo – aldicarb sulfona / acetamiprid / butoxicarboxima)
2 ppm ventana de tolerancia de masa exactaAcetamiprid [C10H11ClN4], m/z=222.06722
Aldicarb-sulfona [C7H14N4O4S], m/z=222.06743Butoxicarboxima [C7H14N4O4S], m/z=222.06743
GC/MS/MS Pesticide Screening Analyzer Dos configuraciones posibles
Basado en un sistema 7890A/7000B GC/MS/MS, configurado con backflush usando la
Tecnología de Flujo Capilar. Bases de datos MRM incluídas en el método puesto en
marcha y chequeado químicamente en fábrica.
Dos posibles configuraciones:
7890-0501: Método basado en el método clásico de plaguicidas de Agilent (RTL) GC/MS/MS MRM
con una base de datos (500+ pesticidas) puesto en marcha a Presión Constante con Post-column
backflush. Proporciona flexibilidad para añadir detectores GC y escalarlo a menores tiempos.
7890-0502: Método basado en la USA targeted pesticide list RTL GC/MS/MS MRM con base de
datos de (200+ pesticidas) puesta en marcha a Flujo constante con backflush a mitad de columna. El
método proporciona el mejor rendimiento y los menores tiempos de ciclo para un consumo reducido de
carrier.
Un sistema específico para GC. Limitaciones para convertir un sistema LC/MS/MS en un sistema GC/MS/MS
ESI, APCI y APPI – Fuentes a presión Atmosférica
– Diseñadas para separar iones de moléculas ANTES de entrar al sistema de vacío
– Los rods metálicos de mayor rango de m/z estan compensados térmicamente para una operación entre 50-100º C. No es un problema en LCMS ya que “sólo” iones entran en el sistema de vacío
EI, PCI y NCI – Fuentes a Vacío
– Todas las moléculas neutras (carrier, matriz y analitos) ENTRAN AL SISTEMA DE VACÍO antes de la ionizacion
– La MAYOR PARTE de moléculas NO SE IONIZAN y deben ser eliminadas
– Las moléculas de altos Peb, comunes en GC, contaminaran todas las superficies frías
• La contaminación origina pérdidas de sensibilidad
• Los cuadrupolos metálicos (< 100ºC) contaminan fácilmente en GC
Interface draws ions into
vacuum and designed to
exclude neutrals
If neutrals do enter into
the first stage of
vacuum, most are small,
volatile solvents like H2O
and CH4OH
+
+
+
+
++
+
+ + +
+
+ +
+ +
+ + + + +
+
+
Heated nitrogen
drying gas
Dielectric capillary
entrance
Nebulizer tip aimed
at 90 degree angle to
inlet of capillary
Solvent spray
Ions
-5,000 V
Atmospheric Pressure
Vacuum
Celda de colisión con gas de quenching adicional
Celda de Colisión
Entrada PrecursorHe* +
Disociación por colisión
1 ml/min N2
Gas Colisión
La transmisión de helio metastablehacia el detector reduce de modo
notable. Además el TAD reduce aúnmás el ruido de
neutros
Fuente Detector
Cuadrupolo Cuadrupolo
He Buffer Gas
He* + He → 2 He + Q
Salida Producto
+ He*
Configuraciones disponibles
Columna(s)Tubo
desactivado
CFTs
Purged Ultimate Union
Splitter
15 x 0.25 x 0.25 30 x 0.25 x 0.25
Restrictor desactivado
(Siltek)
EPC
Inlet MS
Inlet MS
¡o divisor!
EPC
EPC¡Las configuracionesson intercambiables!
230°C
275°C
300°C
325°C
350°C
Nueva fuente iónica a Alta Temperatura
Respuestas mejoradas para un amplio rango de compuestos
– Operación más robusta para muestras “sucias”
– Mejor respuesta para compuestos “pegajosos”
– Picos más estrechos para compuestos de alto punto de ebullición
Tech Overview 5989-6051EN
Dos partes totalmente nuevas mejoran el rendimiento de la
fuente. El rendimiento de la lente de entrada elimina la necesidad
del pre-filtro
Backflush Tecnología de Flujo Capilar
S/SL Inlet
Capillary Flow Device
2 psi
60 psi
Detector/es
Split Vent
Durante GC Run
Después GC Run
S/SL Inlet
Capillary Flow Device
25 psi
4 psi
Detector/es
Aux EPCSplit Vent
Aux EPC
Backflush al final de cada inyección
Backflush 20 sec Flujo
Backflush 30 sec Flujo
Backflush 40 sec Flujo
Backflush 60 sec Flujo
ColumnaInlet
Fin del run Flujo
La finalidad es eliminar componentes pesados al final de cada inyección
PCBs en aceite de pescado. Análisis GC-ECDLos RTs se afectan por restos de la matriz
min5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6 6.1 6.2
Norm.
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000 10 Runs without BackflushingRetention times shift ~4-5 secduring 10 runs
min5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6 6.1
Norm.
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
10 Runs with Backflushing
Reproducibilidad* en RT para Trifluralin en extracto de lechuga. 100 Inyecciones, 3 minutos backflush. Secuencia de 21 horas
Min 6.070
Max 6.075
Mean 6.073
Std Devn 0.00186
% RSD 0.0306RT (mins)
* Agilent 2x RTL Pesticide Method
5.950
5.970
5.990
6.010
6.030
6.050
6.070
6.090
6.110
6.130
6.150
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91Injection Number
Nueva Purged Ultimate Union. Modo Analítico
Venteo
Presión / Control
de Flujo
15-m HP-5ms
(0.25mm id x0.25um)
15-m HP-5ms
(0.25mm id x0.25um)
Dispositivo
de Flujo
Capilar
5975C MSD
EI mode
7890A GC
Split/Splitless Puerto
de Inyección
Y ml/min
Y+Z ml/min
Z ml/min
Pueden usarse columnas de fases y dimensiones diferentes
Purged
Ultimate
Union
En Method Editor de MassHunter, añade “New Scan Segment”
Señala el segmentorecién añadido
Copia parámetros desde MRM Database
Pégalos en Method Editor
Agilent Serie 6400 Agilent Triple
Cuadrupolo LC/MS
Nuevo 6460 QQQ LC/MS
6410B Triple Quad LC/MS
S/N > 1000:1, 1 pg reserpina
Más de 10 veces más sensible
Cambio de polaridad 30 ms
500 MRMs por segmento
>10.000 MRMs programables en un método
Rango de masas de 5 a 3000 m/z
S/N > 150:1, 1 pg reserpina
Cambio de polaridad en 250 ms
200 MRMs por segmento
>10.000 MRMs programables en un método
Rango de masas de 5 a 2000 m/z
Extracto vegetal enriquecido – 200 ppb plaguicidas - TIC/MRM
Extracción
automatizada
de todas las
transiciones
programadas
en un
cromatograma
complejo
Con el número de MRMs que
podemos manejar en GCQQQ/LCQQQ
y los valores de dwell time, es posible hacer una labor de
screeningadicional con sistemas QQQ
x3 x4 x4 x3 x4 x2 x1# Concurrent dMRM =
Cycle time
Eficiencia en el manejo del tiempo de ciclo gracias a dynamic MRM
Solucion de screening con 6460 QQQ Dynamic MRM
Evitar el uso de los tradicionales segmentos de tiempo
Resumen Agilent TOF. Application Kit para screening de pesticidas
1. Diseñados para mantener una elevada sensibilidad – pocos pg en columna
2. Elevada resolución MS3. Exactitud de masa mejor que 2 ppm4. Elevado rango dinámico espectral5. Excelentes prestaciones para screening de
compuestos• Nueva base de datos personalizada de
compuestos • Adaptable• Inicialmente con 1600 entradas
Gracias por su
atención
Preguntas
Juan AybarEspecialista de Producto GCMSAGILENT TECHNOLOGIES