camera separatoria previously post py...

CAMERA SEPARATORIA previously POST PY CHROMATOGRAFII Volume 3, Number 1 / June 2011, 87-99

Grzegorz BOCZKAJ1, Mariusz JASZCZO T1, Agata LEMAN1, Anita SKRZYPCZAK1, Aleksandra KRÓLICKA2, Marian KAMI SKI1* 1 Politechnika Gda ska, Wydzia Chemiczny,

Katedra In ynierii Chemicznej i Procesowej, ul. G. Narutowicza 11/12, 80-233 Gda sk e-mail: [email protected]* 2 Zak ad Ochrony i Biotechnologii Ro lin,

Mi dzyuczelniany Wydzia Biotechnologii UG-GUMed, ul. K adki 24, 80-822 Gda sk

Zastosowanie chromatografii cieczowej w odwróconym uk adzie faz (RP-LC) w rozdzielaniu i oznaczaniu polifenoli i naftochinonów w materia ach ro linnych

Reversed phase liquid chromatography (RP-LC) for separation and quantitative determination of polyphenols and naphtoquinones in plant materials Streszczenie: W pracy przedstawiono przegl d metod rozdzielania i oznaczania naftochinonów i polifenoli pochodz cych z materia u ro linnego, z wykorzystaniem technik chromatografii w uk adzie faz odwróconych – RP-TLC (Reversed-Phase Thin Layer Chromatography) oraz RP-HPLC (Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography).

Uwzgl dniono procedury przygotowania próbki, etap rozdzielania, a tak e kontroli czy-sto ci zbieranych frakcji. Próbki materia u ro linnego s z regu y ekstrahowane rozpuszczalni-kami organicznymi dla wydzielania sk adników nisko- i redniopolarnych, albo wod dla wyod-r bniania sk adników polarnych. Proces ekstrakcji najcz ciej jest wspomagany ultrad wi kami. W ostatnich latach stosowane s do rozdzielania naftochinonów i polifenoli fazy stacjonarne ty-pu RP18 oraz eluenty w postaci mieszaniny wody i metanolu lub acetonitrylu. W przypadku roz-dzielania polifenoli, cz ciej ni przy rozdzielaniu naftochinonów, stosuje si elucj gradiento-w . Zastosowanie ortogonalnego rozdzielania, realizowanego poprzez rozdzielanie technik TLC w uk adzie faz normalnych lub HILIC, sk adników frakcji uzyskanych technik RP-HPLC, pozwala skutecznie kontrolowa efektywno rozdzielania oraz czysto frakcji. S owa kluczowe: cienkowarstwowa chromatografia cieczowa TLC, wysokosprawna kolumno-wa chromatografia cieczowa HPLC, naftochinony, polifenole, ekstrakty, metabolity ro linne, od-wrócone uk ady faz RP Abstract: The paper presents a review of naphtoquinones and polyphenols separation and quantitative determination methods using reversed phase chromatographic techniques – Re-versed-Phase Thin Layer Chromatography (RP-TLC) and Reversed-Phase High Performance Column Liquid Chromatography (RP-HPLC).

The procedures of sample preparation, chromatographic separation, as well as fraction purity control, are described in details. Samples of the plant material are mostly extracted with organic solvents or with water. The extraction processes are usually assisted by sonication. The most popular separation systems include a RP18 stationary phase and eluent which con-sists water and methanol or acetonitrile. In the case of polyphenols separations, much more of-

G. Boczkaj, M. Jaszczo t, A.Leman, A. Skrzypczak, A. Królicka, M. Kami ski

Camera Separatoria Vol. 3, No 1/2011

88

ten than during naphtoquinones separations, the gradient elution is used. The use of orthogonal separations by NP-TLC or HILIC-TLC separation of the fractions collected during RP-HPLC, gives a possibility for the separation effectiveness and fraction purity control.

Key words: Thin Layer Chromatography TLC, Reversed-Phase High Performance Column Liq-uid Chromatography RP HPLC, naphtoquinones, polyphenols, extracts, plant metabolites

1. Wst p (Introduction)

Kolumnowa chromatografia cieczowa - HPLC i chromatografia cien-kowarstwowa TLC, s najwa niejszymi technikami rozdzielania wykorzy-stywanymi w fitochemii [1]. Metabolity wtórne s zwi zkami chemicznymi, cz sto o skomplikowanej strukturze i o niezbyt wysokich masach molekular-nych. Nie odgrywaj one roli w podstawowym metabolizmie ro lin, jednak maj ogromne znaczenie w przystosowaniu si ro liny do funkcjonowania w danym rodowisku. W ro linach leczniczych metabolity wtórne pe ni rol substancji czynnych. Do tej pory na wiecie uda o si ju wyizolowa kilka-na cie tysi cy metabolitów wtórnych. Ze wzgl du na struktur , metabolity wtórne podzielono na trzy grupy: terpeny, metabolity fenolowe oraz metabo-lity zawieraj ce azot. Z tych ostatnich uda o si opisa ju 14000 substancji, nale cych do grup, takich jak: aminy, aminokwasy niebia kowe, alkaloidy, glikozydy cyjanogenne i glukozynolaty.

Metabolity wtórne w ro linnych tkankach wyst puj w bardzo niewiel-kich st eniach i akumulowane s w wakuolach. W ro linach ich g ówn funkcj jest obrona przed szkodnikami i patogenami.

Przyk ady takich farmakologicznie czynnych zwi zków naturalnych, którymi s metabolity wtórne ro lin, to [2]:

terpenoidy - monoterpeny, sekwiterpeny – kamfora - diterpeny, tetraterpeny – taksol, karotenoidy - triterpeny – glikozydy nasercowe - wieloterpeny – kauczuk

alkaloidy - indolowe – winkrystyna - tropanowe – atropina, skopolamina - pirydynowe i purynowe – nikotyna, kofeina

zwi zki fenolowe - proste fenole – kw. cynamonowy - fenole dwupier cieniowe – flawony, flawonole, flawonoidy,

antocyjany - wielopier cieniowe – garbniki - kumaryny - furanokumaryny

chinony - naftochinony – szikonina, plumbagina, juglon.

Zastosowanie chromatografii cieczowej w odwróconym uk adzie faz (RP-LC)…

Vol. 3, No 1/2011 Camera Separatoria

89

Rozdzielanie i oznaczanie naftochinonów z zastosowaniem chromatografii cieczowej w uk adzie faz odwróconych

W tabelach 1 i 2 zestawiono warunki chromatograficzne zastosowane do rozdzielania naftochinonów w ekstraktach wybranych materia ów pocho-dzenia ro linnego z wykorzystaniem odpowiednio TLC i HPLC.

Jak wynika z danych przedstawionych w tabeli 1, najcz ciej do roz-dzielania zwi zków z grupy naftochinonów z zastosowaniem chromatografii cienkowarstwowej w uk adzie faz odwróconych (RP-TLC) stosuje si p ytki z faz stacjonarn typu C18 [3], a eluent stanowi wodne roztwory metanolu lub kwasu mrówkowego. Detekcj plamek prowadzi si wietle UV.

W przypadku zastosowania wysokosprawnej chromatografii cieczowej (tabela 2) w odwróconym uk adzie faz, faz stacjonarn , podobnie jak w przy-padku TLC, stanowi el krzemionkowy modyfikowany grupami oktadecylowymi [4-8, 10], cz sto dla wyeliminowania powierzchniowych oddzia ywa z grupami OH wykorzystywane s kolumny „encappowane” RP18e [9]. Dobry efekt roz-dzielczy uzyskano tak e z zastosowaniem krótszych a cuchów w glowodoro-wych – faza stacjonarna C8 [10]. W przewa aj cej ilo ci metodyk stosowana jest elucja izokratyczna [4-8, 10] z eluentem w postaci wodnych roztworów ace-tonitrylu [6-8] lub metanolu [4-5, 9-10] z dodatkiem kwasu octowego lub mrów-kowego. Do detekcji substancji z grupy naftochinonów powszechnie stosowane s detektory spektrofotometryczne UV-VIS, korzystnie z matryc fotodiodow (DAD) [4, 6-10], a tak e detektor fluorescencyjny [5].

Zastosowanie elucji izokratycznej jest korzystne z punktu widzenia zastosowania opracowanych metodyk do preparatywnego lub procesowego otrzymywania frakcji substancji z zastosowaniem techniki chromatografii cie-czowej. Takie podej cie pozwala na atwiejszy odzysk sk adników eluentu, co czyni zaprojektowany proces rozdzielczy bardziej ekonomicznym. Rozdzielanie i oznaczanie polifenoli z zastosowaniem chromatografii czieczowej w uk adzie faz odwróconych

W tabelach 3 i 4 zestawiono warunki chromatograficzne zastosowane do rozdzielania polifenoli w ekstraktach wybranych materia ów pochodzenia ro linnego z wykorzystaniem odpowiednio TLC i HPLC.

W poni szych tabelach opisano tak e metodyki nie zaliczane do uk a-du faz odwróconych, ale stosowanych jako jeden z etapów przygotowania próbki lub uzupe niaj co, w pracach, w których na etapie „w a ciwego” roz-dzielania polifenoli stosowano RP. Ma to miejsce szczególnie w przypadku rozdzielania polifenoli z zastosowaniem cienkowarstwowej chromatografii cieczowej. W przypadku zbierania frakcji polifenoli rozdzielanych z zastoso-waniem RP-HPLC, na etapie kontroli czysto ci frakcji, przewa nie, stosowa-no TLC w uk adzie faz normalnych lub z zastosowaniem chromatografii oddzia ywa hydrofilowych (ang. Hydrophilic interaction chromatography - HILIC) [11-13]. Zastosowanie warunków rozdzielania ortogonalnego, po-zwala na skuteczn kontrol czysto ci zbieranej frakcji na etapie RP-HPLC, poprzez zastosowanie odmiennego mechanizmu separacyjnego na etapie kontrolnym realizowanego z wykorzystaniem TLC.

90

Tab

ela

1.

Ze

sta

wie

nie

wa

runków

rozdzie

lan

ia n

afto

ch

ino

nów

te

chn

ik T

LC

T

ab

le 1

.

A c

om

pa

riso

n o

f th

e s

ep

ara

tio

n c

ond

itio

ns o

f n

ap

hto

quin

on

es b

y T

LC

te

chniq

ue

Lp

. N

r M

ate

ria

ro

linny

(Pla

nt

mate

rial)

Analiz

ow

ane s

ubsta

ncje

(A

naly

zed s

ubsta

nces)

Faza

sta

cjo

narn

a

(Sta

tio

na

ry

ph

ase)

Elu

en

t W

art

oci

(Valu

es)

Rf

Wa

runki D

ete

kcji

(Dete

ction c

onditio

ns)

Uw

agi

(Com

ments

) L

it.

1.

Dro

sera

ro

tun

difo

lia,

Dro

sera

in

term

edia

1)

4-O

-glu

ko

zyd

7-m

ety

loh

ydro

juglo

nu

2)

4-O

-glu

ko

zyd h

yd

ro-

plu

mbagin

y

C18

MeO

H:H

2O

1

:1 (

v/v

) 1

) 0,3

8

2)

0,4

8

UV

prz

y 3

65 n

m

Kolo

r pla

mek:

1)

fiole

tow

o-n

iebie

ski

2)

nie

bie

ska

Wid

zia

lne r

ów

nie

w

w

ietle

dzie

nnym

po

kilk

u

godzin

ach –

br

zow

ienie

na

skute

k r

ozk

adu p

od w

py-

wem

po

wie

trza.

Cze

rwon

y k

olo

r zaró

wn

o p

od

U

V jak i w

w

ietle d

zie

nnym

p

o w

cze

nie

jszym

dzia

aniu

1%

AlC

l 3.

W p

en

i ro

zw

ini

t

D.

rotu

nd

ifo

lia o

trzy-

mano z

kultury

in

vitro

poprz

ez n

am

no

enie

na p

od

ou M

S i n

a

pod

ou

Rein

ert

-Mohr’a.

D.

inte

rme

dia

uzyska

no

rów

nie

na p

od

ou

Rein

ert

-Mohr’a.

wie

e r

olin

y e

kstr

a-

how

ano m

eta

nole

m.

[3]

2.

Ko

rze

nie

E

ch

ium

ita

licu

m L

.

1)

szik

on

ina

2)

alk

an

ina

3

) p

rod

ukty

sa

po

nifik

acji

chiraln

a faza

sta

cjo

narn

a

do

RP

- im

-pre

gnow

ana

nanokrz

em

ia-

nem

z d

odat-

kie

m C

u2+

z s

ekto

rem

chiraln

ym

MeO

H:H

CO

OH

2

0:1

(v/v

) S

zik

onin

a

0,7

A

lkanin

a

0,6

8

Pro

du

kty

sa

po

nifik

a-

cji

0,7

Dokum

enta

cja

pyte

k T

LC

zo

sta

a p

rze

pro

wa

dzo

na 1

2-

bito

w k

am

er

CC

D p

o-

czon

z

syste

mem

doku-

menta

cji

D

igiS

tore

2 (

Cam

ag)

Ko

rze

poddano lio

fili-

zacji,

a n

askóre

k o

d-

dzie

lon

o o

d r

dze

nia

ko-

rzenia

i s

pro

szkow

ano.

Na

ftoch

ino

ny e

kstr

a-

how

ano z

e s

pro

szko-

wan

ych

ko

rze

ni u

yw

a-

jc h

eksanu.

Rozpuszczaln

ik u

suni

-to

pod z

mnie

jszonym

ci

nie

nie

m.

Pozosta

-o

rozp

uszczo

no w

M

eO

H,

wytr

co

ne

wo-

ski o

dfiltro

wa

no

. R

oz-

puszczaln

ik o

dparo

wa-

no p

od z

mnie

jszonym

ci

nie

nie

m.

P

ozosta

o r

ozp

usz-

czon

o w

heksa

nie

.

[4]



Vo

l. 3

, N

o 1

/20

11

C

am

era

Se

pa

rato

ria

91

Tab

ela

2.

Ze

sta

wie

nie

w

aru

nków

ro

zdzie

lan

ia n

afto

ch

inon

ów

te

chn

ik w

yso

kospra

wn

ej

ch

rom

ato

gra

fii

ko

lum

now

ej

–

HP

LC

T

ab

le 2

.

A c

om

pa

rison

of

the

sep

ara

tio

n c

on

ditio

ns o

f n

ap

hto

qu

ino

nes b

y H

igh

Pe

rform

an

ce

Co

lum

n C

hro

ma

tog

raph

y

tech

niq

ue

– H

PL

C

Lp

. N

r

Mate

ria

ro

linny

(Pla

nt

m

ate

rial)

Analiz

ow

ane s

ubsta

ncje

(A

naly

zed s

ubsta

nces)

Kolu

mna

(Colu

mn)

Elu

ent/

pro

gra

m e

lucji;

N

at

enie

prz

ep

yw

u

(elu

tio

n p

rogra

m,

flo

w r

ate

)

Dete

kto

r (D

ete

cto

r)

Uw

agi

(Com

ments

) L

it.

1.

Pom

idor,

gro

ch,

Rzo

dkie

wnik

p

osp

olit

y,

kukury

dza, ry

, m

arc

he

w,

zie

mn

iaki.

1)f

iloch

ino

n

(wit.

K1)

2)m

enachin

on-4

(K

2)

Dis

covery

C18

250x4.6

mm

,

5

m S

upelc

o

MeO

H:E

tOH

8

0:2

0,

v/v

(+

1 m

M C

H3C

OO

Na,

+

2 m

M C

H3C

OO

H,

+ 2

mM

ZnC

l 2)

Elu

cja

izo

kra

tyczn

a

Obj

tocio

we n

at

enie

prz

ep

yw

u

elu

entu

: 1 m

l/m

in

Flu

ore

scencyjn

y:

ex:

23

8 n

m,

em:

426 n

m.

tka

nki w

arz

yw

po

bie

ran

o

be

zp

ore

dn

io p

rzed

eks-

trakcj

(E

tOH

:H2O

95

:5).

Czas o

d p

obra

nia

pró

bki

do

za

ko

czenia

ekstr

akcji

wynosi

30

s.

[5]

2.

Lithosperm

um

ery

thro

rhiz

on

Sie

b.

et

Zucc.

(hodow

la k

om

ó-

rek i k

orz

eni)

de

oksyszik

on

ina;

szik

on

ina

; a

ce

tylo

szik

on

ina;

izo

buty

loszik

on

ina;

,-d

ime

tylk

oakry

loszik

on

ina

; iz

ow

are

lyro

szik

on

ina;

-mety

lo-n

-buty

loszik

onin

a;

8-h

yd

roksyiz

ow

are

lyro

szik

on

ina.

LS

-410 O

DS

S

il.,

(Toyo-

soda C

o.,

Ltd

.)

CH

3C

N:H

2O

:TE

A:C

H3C

OO

H

70

:30:0

,3:0

,3 (

v/v

/v/v

) E

lucja

izo

kra

tyczn

a.

Obj

tocio

we n

at

enie

prz

ep

yw

u

elu

entu

: 1,1

ml/m

in

Dete

cto

r U

V-V

IS -

520 n

m

Szik

on

iny e

kstr

ah

ow

an

o

Et 2

O p

rzez o

kre

s

3 h

w a

pa

racie

So

xhle

ta.

Et 2

O u

suni

to w

pró

ni.

Po

zosta

o s

uszon

o,

a

nast

pnie

rozpu

szczo

-no w

CH

3C

N.

[6-7

]

3.

Angelic

a r

adix

Lithosperm

um

ra

dix

C

era

fla

va

A

deps s

uill

us

Szik

on

ina;

Acety

loszik

on

ina;

,-d

imety

loakry

loszik

onin

a;

izo

buty

loszik

on

ina;

de

oksyszik

on

ina;

izo

wa

rely

roszik

on

ina;

kw

as f

eru

low

y.

Therm

oQ

uest

C18

CH

3C

N:

(H2O

+ C

H3C

OO

H)

47

:53 (

v/v

) (p

H 2

,56)

Elu

cja

izo

kra

tyczn

a.

Obj

tocio

we n

at

enie

prz

ep

yw

u

elu

entu

: 1,0

ml/m

in

Dete

kto

r U

V-V

IS -

280 n

m

Spro

szkow

an

y A

ng

elic

a

radix

do

da

no d

o w

cze

-n

iej zm

iesza

nych

i s

to-

pio

nych

w 1

30

-14

0°C

:

15 g

ole

ju s

ezam

ow

ego,

12

,5 g

sm

alc

u

i 7

,5 g

ó

tego w

osku

. G

dy k

olo

r do

da

ne

go

ko-

rze

nia

sta

si

br

zow

aw

y

i utr

zym

yw

a s

i d

uej

ni

15 m

inut

dodano

5 g

Lithosperm

um

radix

. O

trzym

an

y p

rod

ukt filtro

-w

ano n

a g

or

co

.

[7-8

]



92

4.

Wókna

teksty

lne

law

so

n (

2-h

ydro

ksy-1

,4-n

afto

chin

on

);

jug

lon

(5-h

ydro

ksy-1

,4-n

aft

och

ino

n);

la

pachol (2

-hydro

ksy-3

-(3-m

ety

lobut-

2-

en

ylo

)-1

,4-n

afr

och

ino

n);

a

ntr

ach

ino

ny.

Pu

rosp

her

RP

18e (

5

m)

(Merc

k),

w

ym. 125x4

mm

MeO

H:H

2O

P

rog

ram

elu

cji:

3

min

– e

lucja

izo

kra

tyczn

a 4

0%

M

eO

H (

v/v

) N

ast

pnie

gra

die

nt do 9

5%

MeO

H

prz

ez 1

5 m

in

Obj

tocio

we n

at

enie

prz

ep

yw

u

elu

entu

: 0,6

ml/m

in

Dete

kto

r U

V-V

IS-

DA

D -

monitoro

wa-

na d

. fa

li 2

70 n

m

Wókna e

kstr

ahow

ano

prz

ez 1

0 m

inut p

od

ch

odnic

zw

rotn

HC

l-H

2O

-MeO

H (

2:1

:1, v/v

/v).

Do H

PLC

wykorz

ysta

no

supern

ata

nt

po w

irow

aniu

ekstr

aktu

.

[9]

5.

Dzb

an

eczn

ik

law

so

n;

1,4

-naft

och

ino

n;

jug

lon

; plu

mbagin

a;

2,2

’-(3

-hydro

ksy)-

1,4

-bin

aft

och

ino

n;

C8 i C

18

0,1

ml/l C

H3C

OO

H:

MeO

H

35

:65 (

%,

v/v

) E

lucja

izo

kra

tyczn

a.

Obj

tocio

we n

at

enie

prz

ep

yw

u

elu

entu

: 0,7

5 m

l/m

in

Dete

kto

r U

V-V

IS -

260 n

m

An

aliz

a H

PL

C e

kstr

aktó

w

dzb

an

eczn

ika

.

[10

]

6.

Ko

rze

nie

E

ch

ium

ita

licu

m L

.

szik

on

ina

; a

ce

tylo

szik

on

ina;

pro

pio

nylo

szik

on

ina;

izo

buty

loszik

on

ina;

3,3

-dim

ety

loa

kry

loszik

on

ina;

2-m

ety

lo-n

-bu

tyry

loszik

on

ina

; Iz

ow

are

lyro

szik

on

ina;

Alk

an

ina.

Kolu

mna

ze s

tali

nie

rdzew

nej

BD

S H

ypers

il C

18

250×

10 m

m

I.D

., 5

m

(T

herm

o,

US

A)

TH

F:C

H3C

N:H

2O

:HC

OO

H

30

:20:5

0:0

.5,

(v/v

/v/v

) E

lucja

izo

kra

tyczn

a.

Obj

tocio

we n

at

enie

prz

ep

yw

u

elu

entu

: 3,5

ml/m

in

Dete

kto

r U

V-V

IS-

DA

D –

monitoro

-w

ana d

. fa

li

518 n

m

Jak o

pis

ano p

ow

yej d

la

TLC

.

[4]



Za

sto

so

wa

nie

ch

rom

ato

gra

fii cie

czo

wej w

odw

róco

nym

uk

ad

zie

fa

z (

RP

-LC

)…

Tab

ela

3.

Ze

sta

wie

nie

wa

runków

rozdzie

lan

ia p

olif

en

oli

techn

ik c

hro

mato

gra

fii cie

nkow

ars

twow

ej T

LC

T

ab

le 3

.

A c

om

parison o

f th

e s

ep

ara

tion c

ond

itio

ns o

f p

oly

pheno

ls b

y T

LC

techniq

ue

L

p.

Ma

teria

ro

linn

y

An

aliz

ow

an

e

su

bsta

ncje

F

aza

sta

cjo

na

rna

E

lue

nt

Wart

oci R

f W

aru

nki D

ete

kcji

Uw

agi

Lit.

1.

ura

win

a

glik

ozyd

ßa

wo

no

lu;

ga

lakto

zyd

;

kw

erc

ety

ny;

a

rab

ino

zy;

kw

erc

ety

ny.

el

krz

em

ion

ko

wy

Octa

n e

tylu

B

rak d

an

ych

L

am

pa

UV

O

wo

ce

u

raw

iny m

acero

wa

no

w 7

0%

wo

dn

ym

ro

ztw

orz

e m

eta

-n

olu

, a

na

st

pn

ie o

trzym

an

za

-w

iesin

filt

row

an

o.

Ro

zp

uszcza

lnik

u

su

ni

to w

wyp

arc

e o

bro

tow

ej.

Wodn

y r

oztw

ór

ekstr

ah

ow

an

o

dw

ukro

tnie

ete

rem

nafto

wym

. F

rakcje

ete

ru e

tylo

we

go

po

czo

-n

o, filtro

wa

no

, a

na

st

pn

ie z

a-

gszczo

no

w w

yp

arc

e o

bro

tow

ej.

TL

C –

su

yo

wy

czn

ie d

o

wst

pn

ego

wyd

zie

len

ia f

rakcji.

D

als

ze

ro

zd

zie

lan

ia p

row

ad

zo

no

te

ch

nik

HP

LC

.

[11

]

2.

Zie

lon

a

he

rba

ta

(-)e

pik

ate

ch

ina

; (-

)ep

iga

lloka

tech

ina;

(-)g

alu

sa

n-3

-ep

ika

tech

iny;

(-)g

alu

sa

n-3

-ep

iga

llokate

ch

iny.

el

krz

em

ion

ko

wy

CH

Cl 3

:Me

OH

: H

2O

6

5:3

5:1

0,

(v/v

/v)

- e

pik

ate

ch

ina -

0,3

9

- e

pig

allo

ka

tech

ina

- 0

,28

- g

alu

sa

n-3

-ep

ikate

ch

iny -

0,3

- g

alu

sa

n-3

-e

pig

allo

ka

tech

iny -

0,1

9

Re

akcja

ba

rwn

a

wyw

oa

na

od

-czyn

nik

iem

va

ni-

lina

+kw

as s

oln

y

Ka

tech

iny z

su

row

ej h

erb

aty

eks-

tra

ho

wa

no

wo

d w

tem

pe

ratu

rze

8

0°C

. E

kstr

akt

rozd

zie

lan

o z

za

-sto

so

wa

nie

m k

olu

mnow

ej ch

rom

a-

togra

fii cie

czo

we

j.

TL

C –

za

sto

so

wa

no

w c

elu

uzy-

ska

nia

do

da

tko

wych

in

form

acji

nt.

fr

akcji

uzyskiw

an

ych

w R

P-H

PL

C.

[12

]

3.

Trz

cin

a

cu

kro

wa

Fla

wo

no

idy,

C

-glik

ozyd

y:

wite

ksyn

a;

orie

nty

na

; a

glik

on

y;

fla

wo

no

ido

we

.

el

krz

em

ion

ko

wy

Octa

n e

tylu

: kw

as m

rów

ko

-w

y:w

od

a

6:1

:1 (

v/v

/v)

Bra

k d

an

ych

R

ea

kcja

ba

rwn

a

z e

str

em

-

am

i-n

oe

tylo

wym

kw

asu

dife

nylo

-b

oro

we

go

(flu

-o

ryzu

jce

pla

my

w

wie

tle

UV

p

rzy 3

60

nm

)

Wyto

ki z t

rzcin

y c

ukro

we

j p

od

da

-n

o m

ace

racji

wsp

om

aga

ne

j p

ro-

mie

nio

wa

nie

m u

ltra

dw

iko

wym

w

ro

ztw

orz

e m

eta

no

l:w

od

a

(1:1

, v/v

) p

rze

z 1

,5 m

in

w t

em

pe

ratu

rze

po

ko

jow

ej. N

a-

st

pn

ie e

kstr

akt

oczyszcza

no

z z

asto

so

wa

nie

m S

PE

, fr

akcj

fla

-w

on

oid

ów

elu

ow

an

y m

eta

no

lem

.

TL

C –

za

sto

so

wa

no

w c

elu

kon

tro

-li

efe

kty

wn

oci o

czyszcze

nia

eks-

tra

ktu

na

SP

E o

raz p

otw

ierd

ze

nia

o

be

cn

oci fla

wo

no

idów

.

[13

]


Zastosowanie chromatografii cieczowej w odwróconym uk adzie faz (RP-LC)… 93

G

. B

oczka

j, M

. Ja

szczo

t, A

.Le

man,

A.

Skrz

ypcza

k,

A.

Kró

licka

, M

. K

am

iski

94

Tab

ela

4.

Ze

sta

wie

nie

wa

runków

rozdzie

lan

ia p

olif

en

oli

techn

ik H

PL

C

Tab

le 4

.

A c

om

parison o

f th

e s

ep

ara

tion c

ond

itio

ns o

f p

oly

pheno

ls b

y H

TLC

te

chniq

ue

L

p.

Ma

teria

ro

linn

y

An

aliz

ow

an

e s

ub

sta

ncje

K

olu

mn

a

Elu

en

t/p

rogra

m e

lucji;

N

at

en

ie p

rze

pyw

u

De

tekto

r U

wa

gi

Lit.

1.

Ja

bka

kw

. ch

loro

ge

no

wy;

(+)k

ate

ch

ina

; (-

)ep

ika

tech

ina

; flo

ren

tyn

a;

pro

cyja

nid

B1

; p

rocyja

nid

B2

; p

rocyja

nid

C1

.

Inte

rsil

OD

S-3

(G

L S

cie

nce

s In

c.

Ja

pon

ia)

wym

. 2

50

x4

,6 m

m i.d

.

A:

10

mM

KH

2P

O4

(pH

2,0

) B

: M

eO

H

Elu

cja

gra

die

nto

wa

: 1

0%

B –

10

min

1

0-5

0%

B –

40 m

in

50

% B

– 1

5 m

in

10

% B

– 1

0 m

in

Ob

jto

cio

we

na

te

nie

prz

e-

pyw

u e

lue

ntu

: 1,0

ml/m

in

De

tekto

r U

V-V

IS -

2

80

nm

Prz

ez r

ozd

rob

nio

ne

ow

oce

prz

ep

uszczo

no

1

0%

Na

2S

2O

5,

za

sto

sow

an

o e

nzym

y p

rote

oli-

tyczn

e w

ce

lu s

kla

row

an

ia s

oku

po

czym

mie

-sza

nin

od

wiro

wa

no

i o

czyszcza

no

z z

asto

-so

wa

nie

m z

iem

i o

krz

em

ko

we

j.

[1

4]

2.

Ja

bka

(w

ino

ja

bko

we

C

yd

r)

(+)k

ate

ch

ina

; (-

)ep

ika

tech

ina

; ty

rozo

l;

ka

techo

l;

kw

. b

en

zo

eso

we

; kw

. h

yd

roksycyn

am

ono

we

; kw

. fe

rulo

wy;

kw

. ch

loro

ge

no

wy;

glik

ozyd

y k

we

rcyty

no

we

.

Nu

cle

osil

120

C1

8 3

m

w

ym

. 2

50

x4

,6 m

m i.d

.,

(Te

kno

kro

ma

, B

arc

elo

-n

a,

His

zp

an

ia)

A:

uw

od

nio

ny 2

% C

H3C

OO

H

B:

10

0%

MeO

H

Elu

cja

gra

die

nto

wa

: 0

-45

% B

– 5

5 m

in

Da

lej E

lucja

izo

kra

tyczn

a

prz

ez 2

0 m

in

Ob

jto

cio

we

na

te

nie

prz

e-

pyw

u e

lue

ntu

: 0,8

ml/m

in

De

tekto

r U

V-V

IS

DA

D m

on

ito

row

a-

ne

d. fa

li: 2

80 n

m,

31

3 n

m,

35

5 n

m

Pró

bki 8

His

zp

askic

h w

in ja

bko

wych

od

ga

-zo

wa

no

w a

ni u

ltra

dw

iko

we

j p

rze

z

10

min

, filtro

wa

no p

rze

z f

iltr

z o

cta

nu

ce

lulo

zy

(0,4

5

m).

F

iltra

t d

ozo

wa

no

be

zpo

red

nio

do H

PL

C.

[15

]

3.

Win

ogro

na

cv.

Re

bu

la

estr

y k

wa

só

w h

yd

roksycyn

a-

mo

no

wych

C

18

Lu

na 3

m

(P

he

-n

om

ene

x)

wym

.15

0x2

mm

,

A:

2,3

% H

CO

OH

, p

H 2

,1

B:

ace

ton

itry

l E

lucja

gra

die

nto

wa

: 0

min

– 1

2%

B

15

min

– 2

2%

B

20

min

– 5

5%

B

25

min

– 1

2%

B

50

min

– 1

2%

B

Ob

jto

cio

we

na

te

nie

prz

e-

pyw

u e

lue

ntu

: 1,3

ml/m

in

De

tekto

r U

V-V

IS

DA

D,

mon

ito

row

a-

na

d. fa

li -

32

0 n

m

Do

win

ogro

n d

od

an

o 2

g p

iro

sia

rcza

nu

po

tasu

w

ce

lu z

ah

am

ow

an

ia o

ksyd

azy p

olif

eno

low

ej.

Wyci

ni

to s

ok z

win

ogro

n,

a s

kó

rki e

kstr

ah

o-

wa

no

3 r

azy p

o 1

0 m

in 6

0 m

l kw

asu

nad

ch

lo-

row

ego

o s

te

niu

6%

.

So

k i e

kstr

akty

po

czo

no

a n

ast

pn

ie s

czo

-

no

prz

ez f

iltr

PT

FE

0,4

5

m (

Ch

rom

afil).

[16

]

4.

Win

ogro

na

cis

-re

sw

era

tro

l;

tra

ns-r

esw

era

tro

l;

kw

erc

yty

na

; ru

tyn

a.

Hyp

ers

il O

DS

5 µ

m

wym

. 1

50

x4

.6 m

m,

(

Te

ch

no

ch

rom

a,

His

z-

pa

nia

)

A:

ace

ton

itry

l B

: H

2O

:CH

3C

OO

H:

CH

3C

N 8

7:3

:10

, (v

/v/v

) E

lucja

gra

die

nto

wa

: 5

% A

– 0

min

2

5%

A –

25

min

O

bj

tocio

we

na

te

nie

prz

e-

pyw

u e

lue

ntu

:

1,0

ml/m

in

de

tekto

r U

V-V

IS-

DA

D m

on

ito

row

a-

na

d. fa

li -

30

6 n

m

An

aliz

a H

PL

C e

kstr

aktó

w m

eta

no

low

ych

.

[17

]


Z G. Boczkaj, M. Jaszczo t, A.Leman, A. Skrzypczak, A. Królicka, M. Kami ski

Vo

l. 3

, N

o 1

/20

11

C

am

era

Se

pa

rato

ria

95

Se

mip

rep

ara

tyw

ne

H

PL

C:

Su

pe

lco

sil

L

C-S

i 5

µm

w

ym

. 2

50

x2

1,2

mm

CH

2C

l 2:M

eO

H:

HC

OO

H:H

2O

A

: 5

:43

:1:1

(v/v

/v/v

) B

: 41

:7:1

:1 (

v/v

/v/v

) E

lucja

gra

die

nto

wa

: 0

-20

% A

– 4

0 m

in

20

-100

% A

5 m

in

Ob

jto

cio

we

na

te

nie

prz

e-

pyw

u e

lue

ntu

: 20

ml/m

in

De

tekto

r

UV

- 2

80 n

m

5.

M

iazga

ka

ka

o

(-)e

pik

ate

ch

ina

; (+

)ka

tech

ina

; fla

wa

n-3

-ol;

pro

cyja

nid

B2

; p

rocyja

nid

C1

; p

ro a

nto

cyja

ny.

An

aliz

a k

ate

ch

in:

De

ve

losil

OD

S H

G-5

(N

om

ura

Chem

ica

l C

o.

Ltd

., A

ich

i, J

apo

nia

) 2

50

x4

,6 m

m

I.D

. 5

µm

A:

0,1

% T

FA

w

CH

3C

N

B:

0,1

% T

FA

w

H2O

E

lucja

gra

die

nto

wa

: 0

-10

% A

– 5

min

1

0-2

5%

A –

25 m

in

25

-100

% A

– 5

min

O

bj

tocio

we

na

te

nie

prz

e-

pyw

u e

lue

ntu

: 0,8

ml/m

in

De

tekto

r

UV

- 2

80 n

m

Mia

zg

z z

iare

ne

k k

aka

o p

odd

ano

3-k

rotn

ej

ekstr

akcji

n-h

eksa

ne

m

w t

em

p. p

oko

jow

ej p

rze

z

30

min

ut, w

ce

lu u

sun

icia

tu

szczy.

0

,5 g

od

tu

szczo

ne

j m

iazgi

3-k

rotn

ie e

kstr

aho

wa

no

80

% a

ce

ton

em

.

[18

]

6.

Ka

ka

o (

sp

rosz-

ko

wa

ne

ka

kao

C

oco

anO

X)

pro

cyja

nid

y (

mo

no

-,

di- i t

rim

ery

);

(-)e

pik

ate

ch

ina

; (+

)ka

tech

ina

.

Zo

rba

x

Eclip

se

XD

B-C

18

1

50

x2

.1 m

m,

5

m

A:

H2O

:HC

OO

H 9

9,9

:0,1

(v/v

) B

: C

H3C

N

Elu

cja

gra

die

nto

wa

: 2

0 m

in -

6-1

0%

B

5 m

in –

10

-13

% B

5

min

- 1

3-1

5%

B

10

min

– 1

5-1

0%

B

5 m

in –

10

-6%

B

Ob

jto

cio

we

na

te

nie

prz

e-

pyw

u e

lue

ntu

: 0,6

ml/m

in

De

tekto

r U

V-V

IS

DA

D -

28

0 n

m

Ekstr

akcja

mie

sza

nin

Me

OH

:HC

l, 9

9,7

:0,2

2

(v/v

), w

iro

wa

nie

, za

ta

nie

po

d z

mn

iejs

zo

nym

ci

nie

nie

m.

Po

zo

sta

y e

kstr

akt

rozcie

czo

no

w

od

i f

iltro

wa

no

(filtr

0,4

5

m P

TF

E).

[19

]

7.

He

rba

ta

Ka

tech

ina

; G

alu

san

; ep

ika

tech

iny;

Ga

lusan

; ep

iga

lloka

tech

iny;

Ep

ika

tech

ina;

Ep

iga

lloka

tech

ina

.

Ko

lum

na Z

orb

ax

SB

-C1

8 2

50

x4

.6 m

m

I.D

. 5

µm

H2O

:Me

OH

: C

H3C

OO

H

70

:30

:0,1

(v/v

/v)

Elu

cja

izo

kra

tyczn

a.

Ob

jto

cio

we

na

te

nie

prz

e-

pyw

u e

lue

ntu

: 1,0

ml/m

in

De

tekto

r U

V –

VIS

2

70

nm

P

rób

ki su

ch

ej he

rba

ty e

kstr

ah

ow

an

o w

rzca

w

od

prz

ez 1

go

dzin

. N

ast

pn

ie r

oztw

ór

fil-

tro

wa

no

(filtr

mem

bra

no

wy 0

,45

µm

).

[20

]

8.

He

rba

ta

(-)e

pik

ate

ch

ina

; (-

) e

pig

allo

ka

tech

ina

; (-

)ga

lusa

n-3

-ep

ika

tech

iny;

(-)g

alu

sa

n-3

- -e

pig

allo

ka

tech

iny.

Hilb

ar

RT

25

0 x

10 m

m

z L

ichro

sorb

RP

-18 7

m

(Me

rck,

Da

rmsta

dt,

N

iem

cy)

H2O

:CH

3C

N:M

eO

H:C

H3C

OO

H

79

,5:1

8:2

:0,5

(v/v

/v/v

) E

lucja

izo

kra

tyczn

a.

Ob

jto

cio

we

na

te

nie

prz

e-

pyw

u e

lue

ntu

: 3 m

l/m

in

De

tekto

r U

V-V

IS

K

ate

ch

iny w

ye

kstr

ah

ow

an

o z

Ch

iskie

j zie

lo-

ne

j he

rba

ty p

rzy u

yciu

wo

dy o

te

mpe

ratu

rze

8

0 o

C w

ci

gu

1 h

(m

iesza

nie

ci

ge

). O

czysz-

cza

nie

ekstr

aktu

z z

asto

so

wa

nie

m S

PE

.

[12

]



Z G. Boczkaj, M. Jaszczo t, A.Leman, A. Skrzypczak, A. Królicka, M. Kami ski


96

Rozdzielanie polifenoli obecnych w ekstraktach ro linnych technik HPLC w warunkach RP realizowane jest z zastosowaniem typowych uk a-dów chromatograficznych, tj. fazy stacjonarnej któr stanowi z elem krze-mionkowym modyfikowanym grupami oktadecylowymi (C18) [12, 14-20] oraz eluentów sk adaj cych si z wody oraz metanolu [14-15, 20] lub acetonitrylu [16-19]. W wi kszo ci przypadków stosowano elucj gradientow [14-19], rzadziej izokratyczn [20]. Powszechnie stosowanym w tego typu badaniach jest detektor UV, cz sto z matryc fotodiodow (DAD).

2. Podsumowanie

Warunki rozdzielania substancji z grupy naftochinonów oraz polifenoli s stosunkowo dobrze opracowane. Odpowiednia procedura przygotowania próbki do analizy chromatograficznej pozwala na zastosowanie typowych uk adów separacyjnych stosowanych w RP.

Dobór optymalnych technik oraz warunków przygotowania próbki jest podyktowany typem ro liny (zawarto ci t uszczów [18], obecno ci kutykuli, budowy tkanek), z jakiej prowadzona b dzie izolacja substancji, a tak e od rodzaju metabolitów wtórnych w niej zawartych - ich w a ciwo ci fizykoche-micznych i struktury.

Powszechnie stosowan technik izolacji substancji z materia u ro-linnego do analizy naftochinonów i polifenoli jest ekstrakcja ciecz , cz sto z

zastosowaniem aparatu Soxhleta [6-7], albo z maceracj [11]. Do ekstrakcji polifenoli z herbaty zastosowano gor c wod [12, 20], co jest rozwi zaniem korzystnym z punktu widzenia zielonej chemii, a przede wszystkim ekono-micznym. Wysok efektywno ekstrakcji uzyskiwano w przypadku zasto-sowania, jako czynnika wspomagaj cego, ultrad wi ków [13, 15, 21]. Uzy-skane ekstrakty poddawano wirowaniu, a uzyskany supernatant poddawano dalszemu oczyszczaniu, g ównie z zastosowaniem SPE [12-13], lub dodat-kowo filtrowano i poddawano analizie HPLC lub TLC. W przypadku analizy próbek ciek ych, tj. soków, wina, stosowano wy cznie filtracj próbki, któr bezpo rednio analizowano z zastosowaniem technik chromatografii cieczo-wej [15].

Ogólny schemat etapów procedury przygotowania próbki, rozdzielania i oznaczania polifenoli i naftochinonów przedstawiono na rysunku 1.



97

Rys.

1.

Eta

py a

na

lizy e

kstr

aktó

w ro

linn

ych

z za

sto

so

wa

nie

m ch

rom

ato

gra

fii

cie

czo

we

j ja

ko

te

ch

nik

i ro

zd

zie

lan

ia i

ozn

acza

nia

Fig

. 1

. S

tep

s o

f a

na

lysis

of

the

pla

nt

extr

acts

with

th

e u

se

of

liqu

id c

hro

ma

tog

rap

hy a

s a

se

pa

ratio

n a

nd

qu

an

tita

tive

de

term

ina

tio

n t

ech

niq

ue



98

Conclusions A conditions for separation of naphthoquinone or polyphenol groups of

compounds are quite good developed. An appropriate procedure of the sample preparation for chromatographic analysis, allows to use a typical chromatographic Reversed Phase conditions.

The selection of optimal technique and conditions of sample prepara-tion regards to the type of plant (a lipids or cuticula content [8],the tissue composition) from which the isolation will be made as well as to the type of secondary metabolites which are included in the plant – its physiochemical properties and structure.

A technique commonly used for isolation of the compounds from the plant material for naphthoquinones and polyphenols analysis is liquid extrac-tion, often in the Soxhlet Apparatus [6-7] or with maceration [11]. The extrac-tion of polyphenols from tea was made by extraction with hot water [12, 20], which is a valuable solution form the green chemistry point of view and also very economical. A high effectiveness of the extraction was achieved in the case of the ultra-wave extraction [13, 15, 21]. The extracts were then centri-fuged, and the supernatant was purified with another processes, often by SPE [12, 13] or additionally filtrated and than analyzed by HPLC or TLC. In the case of the liquid samples analysis i.e. juices, vines, only filtration of the sample was used before the chromatographic process made by LC [15].

A general scheme describing the steps of sample preparation, separa-tion and determination of polyphenols and naphthoquinones procedure is presented in figure 1. 3. Podzi kowania (Acknowledgements)

Praca wspó finansowana przez Uni Europejsk w ramach Europej-skiego Funduszu Spo ecznego. Projekt systemowy Województwa Pomor-skiego pn. „InnoDoktorant – stypendia dla doktorantów”, II edycja. Literatura (Literature) 1. A. Marston, Role of advances in chromatographic techniques in phyto-

chemistry, Phytochem., 68(2007)2785. 2. E. Leistner, Biosynthesis of plant quinones. The biochemistry of plants.

Secondary plant products. (red. E.E. Conn), Academic Press, 7(1981)413.

3. J. Budzianowski, Naphthohydroquinone glucoside od Drosera rotundifo-lia and D. intermedia drom in vitro cultures, Psychochem., 42(1996)1145.

4. A. Albrehta, I. Vovka, B. Simonovskaa, M. Srbinoska, IdentiÞcation of shikonin and its ester derivatives from the roots of Echium Italicum L., J. Chromatogr. A, 1216(2009)3156.



99

5. C. Oostende, J. R. Widhalm, G.J.C. Basset, Detection and quantiÞ- cation of vitamin K1 quinol in leaf tissues, Phytochem., 69(2008)2457.

6. Y. Fujita, Y. Maeda, C. Suga, T. Morimoto, Production of shikonin de-rivatives by cell suspension cultures of lithospermum erythrorhizon. Comparison of shikonin derivatives of cultured cells and ko-shikon, Plant Cell Reports, 2(1983)192.

7. B. Hazra, M. Das Sarma, U. Sanyal, Separation methods of quinonoids constituents of plants used in Oriental traditional medicines, J. Chroma-togr. B, 812(2004)259.

8. P.C. Wu, Y.B. Huang, I.C. Lin, Y.H. Tsai, A rapid, simple high perform-ance liquid chromatography method for the determination of traditional chinese medicine ointment Shiunko, J. Food Drug Anal., 12(2004)311.

9. P. Novotna, V. Pacáková, Z. Bosáková, K. Štulìk, High-performance liquid chromatographic determination of some anthraquinone and naph-thoquinone dyes occurring in historical textiles, J. Chromatogr. A, 863(1999)235.

10. P. Babula, V. Adam, L. Havel, R. Kizek, Noteworthy secondary me-tabolites naphthoquinones – their occurrence, pharmacological proper-ties and analysis, Cur. Pharm. Anal., 5(2009)47.

11. H. Chen, Y. Zuo, IdentiÞcation of ßavonol glycosides in American cran-berry fruit, Food Chem., 101(2007)1374.

12. R. Amarowicz, F. Shahidi, A rapid chromatographic method for separa-tion of individual catechins from green tea, Food Res. Intern., 29(1996)71.

13. R. Colombo, F.M. Lancas, J.H. Yariwake, Determination of ßavonoids in cultivated sugarcane leaves, bagasse, juice and in transgenic sugar-cane by liquid chromatography-UV detection, J. Chromatogr. A, 1103(2006)118.

14. T. Shoji, Y. Akazome, T. Kanda, M. Ikeda, The toxicology and safety of apple polyphenol extract, Food Chem. Toxicol., 42(2004)959.

15. B. Suárez, N. Palacios, N. Fraga, R. Rodríguez, Liquid chromatographic method for quantifying polyphenols in ciders by direct injection, J. Chromatogr. A, 1066(2005)105.

16. B. Mozeti , I. Tomaži , A. Škvar , P. Trebše, Determination of polyphe-nols in white grape berries cv. Rebula, Acta Chim. Slov., 53(2006)58.

17. O. Palomino, M.P. Gómez-Serranillos, K. Slowing, E. Carretero, A. Vil-lar, Study of polyphenols in grape berries by reversed-phase high-performance liquid chromatography, J. Chromatogr. A, 870(2000)449.

18. M. Natsume, N. Osakabe, M. Yamagishi, T. Takizawa, T. Nakamura, H. Miyatake, T. Hatano, T. Yoshida, Analyses of polyphenols in cacao liquor, cocoa, and chocolate by normal-phase and reversed-phase HPLC, Biosci. Biotechnol. Biochem., 64(2000)2581.

19. E. Cienfuegos-Jovellanos, M. del Mar Quiñones, B. Muguerza, L.Moulay, M. Miguel, A. Aleixandre, Antihypertensive effect of a poly-phenol-rich cocoa powder industrially processed to preserve the original flavonoids of the cocoa beans, J. Agric. Food Chem., 57(2009)6156.



100

20. M. Ding, H. Yang, S. Xiao, Rapid, direct determination of polyphenols in tea by reversed-phase column liquid chromatography, J. Chromatogr. A, 849(1999)637.

21. D. Ko odziejski, praca magisterska, „Porównanie efektywno ci wybra-nych technik ekstrakcji/ ugowania metabolitów wtórnych z suchego ma-teria u ro lin owado ernych”, An effectiveness comparison of selected techniques for extraction/leaching of secondary metabolities for dry in-sectivorous plant material, Politechnika Gda ska, Gda sk 2010.

camera separatoria previously post py...

Documents