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Importancia de la Biología Molecular en el paciente con

TBC y Cáncer

MC. Msc. Vicente Taboada, William.

Laboratorio de Microbiología

INEN

I. INTRODUCCIONII. TUBERCULOSIS Y CANCERIII. BASES MOLECULARESIV. MÉTODOS PARA EL DIÁGNOSTICO

MOLECULAR.

Maestría de Biología Molecular- UNMSM

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CONTENIDO

TUBERCULOSIS, TBC-MDR, TB-XDRPROBLEMA DE SALUD PÚBLICA • OMS: 1.500 millones depersonas de infectados.• 10 mill casos nuevos / año.• Mueren mas de 3 mill / año• Enfermedad asociada a SIDA.• Mayoría de casos en países en vías de desarrollo.• TBC MDR, promedio mundial:

2-4%• 2013: TBC MDR 1281 casos.• 2013: TB-XDR 77 casos.

3Maestría de Biología Molecular-

UNMSM

Agente etiológico:Mycobacterium tuberculosis

• Bacterias de forma bacilar “acidoresistentes”, bacilo de Koch

• No toxinas, aerobio, no móvil, no espora, multiplicación lenta

• Causa la mayoría de los casos de tuberculosis.

• Micobacterias que causan la TB:M. tuberculosisM. bovisM. africanumM. microtiM. canetti

• M. avium, M. intracellulare en SIDA - TB Atipica

4Maestría de Biología Molecular-

UNMSM

Tinción ZN

Pared celular micobacteriana.

lipoarabinomanano

5Maestría de Biología Molecular-

UNMSM

TUBERCULOSIS, TBC-MDR, TB-XDR

6Maestría de Biología Molecular-

UNMSM

The heterogeneous evolution of multidrug-resistant Mycobacterium Tuberculosis. Muller B. Et al. Trends in Genetics March 2013, Vol. 29, No. 3

Factores intrínsecos y extrínsecos que contribuyen a la emergencia de Tuberculosis Multidrogoresistente (TBC-MDR).

Los signos de interrogación indican factores que podrián estar involucrados, para los cuales no hay evidencia directa en M. tuberculosis.

I. INTRODUCCIONII. TUBERCULOSIS Y CANCERIII. BASES MOLECULARESIV. MÉTODOS PARA EL DIÁGNOSTICO

MOLECULAR.

Maestría de Biología Molecular- UNMSM

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CONTENIDO

TUBERCULOSIS y CANCER

• Los pacientes con Cancer son vulnerables a desarrollar TB activa, debido a la inmunosupresión por malnutrición, o por el uso de quimioterapia intensa.• En USA, TBC es 50-100 v mas alta en pacientes nacidos en el extranjero con neoplasias hematológicas.•1970: tratamiento corticoide prolongado, gastrectomia, leucemia, Enf. De Hodgkin, silicosis, pneumoconiosis, diabetes no controlada, embarazo

8Maestría de Biología Molecular-

UNMSM

TUBERCULOSIS y CANCER

9Maestría de Biología Molecular-

UNMSM

Tasa de Tuberculosis en pacientes con diagnóstico de Cáncer

I. INTRODUCCIONII. TUBERCULOSIS Y CANCERIII. BASES MOLECULARES IV. MÉTODOS PARA EL DIÁGNOSTICO

MOLECULAR.

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CONTENIDO

LOCALIZACIONES GENOMICAS DE 85 GENES ASOCIADOS A RESISTENCIA A

DROGAS

LAS FRECUENCIAS DE LAS MUTACIONES PRESENTAN UNA VARIACION DEPENDIENDO DE LA PROCEDENCIA. LA MUTACION 315 PARA katG, EXPLICA LA RESISTENCIA A IINH EN 52% DE CEPAS DE MEXICO, 62% DE CEPAS DE ESPAÑA Y

100% DE CEPAS DE KAZAJISTAN.

MUTACIONES POR DELECION O INSERCION

MUTACIONES aa SUBSTITUIDOS POR MUTACIONES PUNTUALES

Rev. perú. med. exp. salud publica v.19 n.3 Lima jul./set 2002Caracterización de las mutaciones en el gen rpoβ asociadas a la rifampicina en pacientes con tuberculosis pulmonar *

 Juan Agapito1,2; Víctor Neyra1; Juan Castro1; Roberto Accinelli3; Isaías Rodríguez2; José R. Espinoza1.

65-85% Mut

I. INTRODUCCIONII. TUBERCULOSIS Y CANCERIII. BASES MOLECULARESIV. MÉTODOS PARA EL DIÁGNOSTICO

MOLECULAR.

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CONTENIDO

ROL DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

I. Contribuir al control y tratamiento de la tuberculosis

II. Detección precoz, rápida y confiable.

III. Un aislamiento inicial de M. tuberculosis debe ser testado frente a drogas 1ª línea

Procedimiento que permite detectar la resistencia de M. tuberculosis a las drogas antituberculosas.

DIRECTAS o RÁPIDASSe realiza a partir de muestras

de esputo BACTEC 460TB BACTEC MGIT 960 GRIESS MODS Métodos Moleculares

INDIRECTAS o CONVENCIONALES

Se realiza a partir de un cultivo positivo

Método Proporciones LJ Método Proporciones en

Agar en Placa (APP)

Métodos actuales para diagnóstico

PRUEBAS

DE SUSCEPTIBILIDAD

METODO MOLECULARES

Alternativa precisa y rápida de identificación.

Existen gran variedad de técnicas y con diferentes niveles de aplicación.

Detección de M tuberculosis de muestra clínica

Requieren una alta inversión para su implementación.

Métodos moleculares basado en PCR:Geno Type MTDR

plusGene Xpert

MTB RIF

Detección Directa de MTBC en muestras clínicas; Tests de Amplificación de Ácidos

Nucleicos (AAN)

Objetivo: detectar/identificar MTB. Tiempo de respuesta de 24-48 hrs.

Resultado Positivo demuestra la presencia de MTB.

No distingue bacilos vivos y muertos

Resultado Negativo no necesariamente significa ausencia de MTB.

Inhibición de la amplificación Blanco por debajo del límite de

detección.

Tests de Amplificación de Ácidos Nucleicos (AAN) para detección de MTBC

Aprobados por la FDA para su uso:

Amplified MTD (Mycobacterium tuberculosis Direct) test: Gen-Probe.

Genotype MTBDR, Hain Lifescience.

Cepheid GeneXpert MTB/RIF.

Diagnóstico de TB por Tests de Amplificación de Ácidos Nucleicos (NAAT)

Standard en la practica NO reemplaza el juicio clínico; NO

significa la única guía para el aislamiento o terapia.

Sensibilidad: 95% para pacientes BAAR

positivos. 55-75% en pacientes BAAR

negativo, cultivo positivo. Resultado mejora con alta sospecha

clínica de TB Beneficios potenciales; terapia, salud

pública, aislamiento respiratorio, procedimientos invasivos.

Limitaciones y Consideraciones

Sensibilidad Reducida muestras frotis NEG y algunos tipos

de muestra. Para confirmar o descartar la enfermedad. Plataforma dependiente

Especifidad Plataforma dependiente

No reemplaza la necesidad de cultivo Cultivo necesario para PS convencional y

genotipificación. Contaminación cruzada de los amplicones

en Sistemas abiertos. Costo y sostenibilidad

Alto costo limita su uso.

Cepheid Xpert MTB/RIF

Sistema comercial automatizado para la identificación de MTBC y mutaciones en rpoB

PCR tiempo real con sondas moleculares beacons 5 sondas para RRDR en rpoB y 1 sonda

para control de amplificación Descontaminación, digestión,

extracción de ADN, amplificación y detección en el mismo cartucho; requerimientos de BS son limitados.

Resultados en 2 horas Técnicamente simple, mínima

manipulación. Plataforma de acceso aleatorio.

Cepheid Xpert MTB/RIF

Future Microbiol. 2011 September; 6(9): 1067–1082.

Secuencia blanco de la región del núcleo del gen rpoB y tecnología molecular beacon(A) Gen rpoB, secuencia de nucleótidos de la región del núcleo y localización de las

sondas molecular beacon que cubren la región del núcleo completa.(B) Estructura del molecular beacon, establecimiento de la fluorescencia después de

su unión al ADN complementario. La estructura en anillo contiene la secuencia sonda de oligonucleótidos complementario; el quencher y el fluoróforo están adheridos al final de la estructura. Después de la hibridación se produce un cambio conformacional de la sonda que lleva a la separación del fluoróforo y quencher, que resulta en fluorescencia.

Cepheid Xpert MTB/RIF

-- GGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTG --

5 sondas – Cada sonda tiene un color diferente de fluoroforo

2 o más sondas = Mycobacterium tuberculosis

Pérdida de 1 sonda = Resistencia a Rifampicina

Ventajas Muestras NO

procesadas Ensayo rápido Plataforma multiuso Proceso automatizado Sistema cerrado Límite de

detección:131CFU/ml esputo.

No rx cruzada con MNT Recomendación OMS

Desventajas Requiere varias

sondas para cubrir regiones que se solapan

Mutaciones silentes resulta F resistencia

No configurable por usuario.

Cepheid Xpert MTB/RIF

Muestras clínicas Aislamientos (NO ADN extraído / ni cels. Lisadas)

MUCHAS GRACIAS