chromatographic forme - springeren chromatographic sur couche mince, les 6quilibres de r@arti- tion...

L A C H R O M A T O G R A P H I E S U I ~ C O U C H E

M I N C E : P R I N C I P E S E T P O S S I B I L I T E S

ROGE]a L. Mu~I~g*

Institut Pasteur, Paris

Les d6veloppements suceessifs de la belle technique analytique qu'est ]a chromatographic montrent l'influence fondamentale de la forme du dispositif s@arateur sur la facilit6 de mise en oeuvre du proc@d6 analytique.

C'est pourquoi, avant d'entrer dans le vif de notre sujet: "Prin- cipes et possibilit@s de la Chromatographic sur eouehe mince", j 'aimerais que nous nous posions les questions suivantes : - p o u r q u o i avoir cr@@ la chromatographic de surface (cl~'omato-

graphic sur papier ou sur eouche mince) et ne pas continuer ~ faire uniquement des chromatographies sur colonne ?

- pourquoi, aprgs la cr@ation de la chromatographic sur papier, avoir imaging la chromatographic sur eouche mince ? En un mot, pourquoi les techniques chromatographiques out

elles subi eette 5volution: chromatographic sur colonne, chromatographic sur papier, chromatographic sur couche mince ?

] ~ v o l u t i o n de l ' a n a l y s e c h r o m a t o g r a p h i q u e I1 est bien eonnu que c'est TswE~T (1) qui, le premier, imagina de

s@arer des substances en inerrant en jeu un dispositif s@arateur (eolonne chromatographique) eonstitu@ essentiellement par une masse eylindrique de mati6re finement divis@e (phase fixe) baignant dans un solvant (phase mobile) permettant de v@hieuler les substances ~ s@arer tout le long du dispositif S@lOarateur; pour obtenir nne belle s@aration des substances en une s~rie de zones fines sueeessives, il faut: - q u e la quantitg de chacune des substances soit suffisamment

faible, - que les affinit@s** des diverses substances pour la matigre solide

pulv6rulente eonstituant la eolonne soient suffisamment dif- fdrentes,

* Avec la collaboration technique de Mademoiselle Cm THOMMEGAY et de Mademoiselle A.-M. DRAPIEIt. ** Convenablement exprimdes par la valeur du coefficient de r@partition (ou de distribution) de chaque substance entre phase fixe et phase mobile consti- tuant la colonne (rapport de sa concentration dams la phase lixe/~ la concentration dans la phase mobile).

CCM: PRINCIPES ET P0$SIBILIT~]S 13

-- qn'en g6ngra!, le m61ange des substances ait 6t6 introduit initiale° ment, sous forme d'une zone fine.* Evidemment, le r6sultat de ee woe@d6 de s@aration pent 6tre

eonstat@ imm6diatement sur la eolonne ehromatographique ou ~ sa sortie si les substances du m61ange soumis & t 'analyse sont routes eolorges (eas des essais de TSWETT). En pratique, il en est. rarement ainsi et il est done n6eessaire, pour mettre en @videnee tes zones snecessives de substances, de doser eelles-ei ~ la sortie de la eolonne par une m6thode physique on/~ l'aide d 'un r6aetif ehromoggne. Ces op@rations analytiques sont trgs longues (-~- ~ I journ6e) at la mise an point d'une m6thode efficaee de s@aration dans Ie eas d'nne ehromatographie sur colonne est souvent nne entreprise de longue haleine. Un gain de temps eonsidgrable pent 6tre obtenu en ntilisant des dispositifs de dosage automatique, mais i] rant avoir pr6alablement mis au point ce dispositif, ce qui pose de nombreux probl6mes teehnologiques et ne pent 6tre envisag6 que pour les analyses de rou- tine.

Tout eeei avait ineit@, d@s 1944, CONSDEN, GO~DON & 5iAR.TIN (2) /~ imaginer la re@rhode de ehromatographie sur feuitte de papier filtre que l'on pent eonsid~rer eomme la premigre chromatographic de surface. Dans ce eas, le m~lange des substances/~ s@parer est dg- pos6 sons forme d'un petit volume de solution (taehe initiale) et le dispositif s@arateur est une bande plus ou moins longue de papier (phase fixe) qui est irrigu6e par un solvant appropri6 (phase mobile). Aprgs un temps suffisant de progression du front du solvant, les substances se t rouvent r@arties sous forme de taehes distinetes selon la direction de progression du solvant; elles peuvent gtre .simu~- tand.ment et ra,pidement (10 ~ 20 min) mises en @videnee grace & l'emploi d'un r6aetif ehromoggne ou d'une m~thode physique appro- pri6e.

On voit ainsi la simplification eonsid6rable qu'apporte l'emploi d'une feuille de mati~re fibreuse par rapport ~ eelui d'une eolonne de matigre pulv~rulente pour obtenir la s@aration des eomposants d'un m@lange, simplification d~te uniquement h la t~ossibilitd de raise en dvidence plus rapide des zones de substances. Ceei est un exemple de mise en oeuvre plus ais6e d 'nn proc~d6 de s@aration ehromatogra- phiqne par modification de la forme du dispositif s@arateur (exemple: emploi d'nne feuille de fibres de cellulose an lieu d'nne eolonne de poudre de cellulose).

Nous verrons tout g l'heure que la chromatographic sur eouehe mince est aussi une etn'omatographie de surface et qu'elle est d'ap-

* Ceci n'est plus n@cessaire si les valeurs des eoeffieients de r@partition pour los cliverses substances sont tr6s differences.

14 ~. L. MUIg.tER

plication plus g6n6ram que la ehromatographie sur papier; la ma- ti6re eonstituant la phase fixe du dispositif s6parateur est maintenue sur nn support plan inerte, et peut @tre pulv6rulente et done de nature queleonque.* I1 en d6eoule que tousles types physieo-ehimiques de ehromatographie peuvent 4tre r6alis6s en chromatographie sur eouche mince, ce qui n'6tait pas Ie cas en chromatographic sur papier.

P o u r q u o i a v o i r i m a g i n 6 de f a i r e des e h r o m a t o g r a p h i e s d u n s de s c o u c h e s m i n c e s de m a t i 6 r e p u l v 6 r e n t e ?

Sur feuitles de cellulose fibreuse on pent obtenir ais6ment des s6- parations par chromatographie de retargage, par chromatographic de partage direct avec phase fixe aqueuse ou avec phase fixe moins polaire qne l 'eau (technique dite par impr6gnation), par chromatographie de partage invers6 (phase fixe lipophile). Par contre, les possibilit6s de s6paration par chromatographic d'adsorption et par chromatographic d'6ehange d'ions sur feuille de mati6re fibreuse sont tr6s limit6es. Ces limitations sont bien sp6eifiqnes de ehaque eas. Ainsi, pour la chromatographic d'adsorption cette limitation tient au petit nombre de vari6t6s de feuilles de mati6re fibreuse adsorban- te qne l'on pent trouver dans le commerce, g la difficult6 de leur pr6- paration manuelle, ~ l'impossibilit6 d'aetiver par voie thermique Fad- sorbant (alumine, silice) pr6eipit6 entre fibres. En ce qui coneerne la ehromatographie d'6ehange d'ions sur feuille, la manipulation des feuilles form6es d'un m61ange de fibres de cellulose et de mierobilles de r6sine 6changeuse d'ions est ais6e; iI est loin d'en gtre de m~me avec les feuilles de fibres de cellulose 6changeuse d'ions (faible r6- sistance m6eanique de celles-ci dans les solutions aqueuses de r6g6- n6ration).

En fair, c'est l'impossibilit6 d'aetiver les adsorbants fix6s entre fibres de cellulose qui est ~ t'origine de l'id6e de faire des chromatographies clans ~tne couche mince. C'est ainsi qu'Iz~AISOV & SCHRAI- BER (3) out eu l'id6e de eonstituer une cou&e d'adsorbant entre plaques de verre et de l'utitiser pour obtenir des s6parations eomme en ehromatographie d'adsorption sur eolonne. Cependant, ]a chromatographic sur touche mince a pris la forme qn'elle a aetuellement lorsque, KIRC~I~ER, MIlLeR & KELLER (4) out imaging de faire et ~['utiliser pour la ehromatographie une eouche mince d'adsorbant for- ,~de sur une surface solide inerte, en l'esp6ce une plaque de verre. Bien d'autres substances que des adsorbants ont 6t6 ult6rieurement propos6es pour former des couches minces ehromatographiques.

* La nature fibreuse de la mati6re eonstituant la feuille limitait le nombre de supports ehromatographiques dont l'emploi pouvait ~tre envisag6.

Celg: I~I~INCIPES Err POSSIBILITIES 15

Pour rendre ais6e ta manipulation de ees plaques por tantune couehe mince de matigre pnlvdrulente (bonne r6sistanee m@eanique) il est quelquefois n6cessaire d 'employer un tiant (liant de nature diff@rente : plgtre, amidon soluble, alcool polyvinylique - suivant la matigre des couches - alumine, siliee, talc, charbon actif, silicates - et (on) les exigenees analytiques); eertaines couches sans liant ont une bonne r@sistanee m6eanique: couches g base de poudre de cellulose, de pondre de cellulose 6ehangeuse d'ions, de billes de dextrane rdtieul@, de billes de dextrane r@tieuld gehangeur d'ions.

C o m m e n t d 6 f i n i r la e h r o m a t o g r a p h l e en e o u e h e m i n c e ? La chromatographic en eouehe mince est trbs Iargement appli-

qude g la s@aration de substances appar~enant g routes les s6ries chimiques, depuis t'ion mindral jusqu'& Ia partieule de virus en pas- sant par tons ies eomposds de la ehimie organique et les substances naturelles eontenues dans Ies @tres vivants.

Or, beaucoup de sp6cialistes et beaucoup d'utilisateurs se font une id6e fausse de la chromatographic sur couche mince; fausse paree que trop restrictive, paree que trop bien adaptde g leur eas partieulier.

I1 faut souligner que la d@finition que l'on pent en donner ne peut 6tre que technologique ear, aueun principe nouveau n'est mis en oeuvre: ee sont seulement les modalit@s expdrimentates qui sont nouvelles, et il faut bien dire qn'en cela les ameliorations des proc& dds analytiques sont tellement eonsiddrables que routes ees id4es simples peuvent @tre quaIifi6es de g6niales; alors que beancoup d'autres mdthodes analytiques s 'aeheminent vers I'ntilisation d'ap- pardIs de plus en plus eorr~pliqnds, l 'analyse ehromatographique en aecroissant ses possibilit@s va vers une simplification de plus en plus pouss6e.

Q u ' e s t - c e d o n c que la c h r o m a t o g r a p h i e su r e o u e h e m i n c e ?

C'est nne m&hode de chromatographie qui met en jeu une touche plus on moins mince de fines partieules dont la forme est sensible ment, sinon, sph~rique.

Cet te dgfinition comprend ou impliqne trois id@es: - fines partieules, - partieules de forme sph~rique, - eouehe de partieutes dispos6es sur nn support solide. Ce ei entralne un certain nombre de eonsdquenees.

Fines particules: le fair d 'employer de fines particules pour con- stituer la phase fixe de chromatographic font que le temps de trans- fert entre phases fixe et mobile, pour les substance8 chromatographi&s

16 a . L . MUNIEI~

est t, r6s court; ainsi les 6quilibres de r@ar~ition, cause des s6para- tions chromatographiques, sont tr6s rapidement atteints et on obtient une meilleure d6finition des taehes de substance comparati- vement & une chromatographie duns unc masse de fibres longues.

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Fig. 1. D@lacements (h) des ]fonts de solvant et des substances (A, B, C, D), en chromatographic sur pap ier (CSP) e~ en chromatograph@ sur couche mince de poudre de cellulose sans l iant (CC1V[PC), en /onction du temps (t); eouche

20 x 20 c m ; feuille de pap ie r f i l tre 45 x 45 era.

Particules de forme sphdrique: duns le cas de l'a~cension d'un sol- rant duns un empitement de billes (chromatographie sur couche mince) la vitesse macroscopique d'aseension du solvant (V~) est voisine de ]a vitesse microscopique de transport de ce solvant (V~) entre les billes de phase fixe. Inversement, lors de la progression d'un solvant duns un enchev~trement de fibres, comme en chromatographic sur papier, la vitesse maeroscopique de progression du solvant est petite vis-a-vis de la vitesse de progression microscopique de ee m6me sol- r a n t le long des fibres de cellulose (progression par bonds rapides successifs).

En chromatographic sur couche mince, les 6quilibres de r@arti- tion des substances entre phases fixe et mobile sont ainsi plus sdre- ment atteints qu'en chromatographie sur papier; ceci entralne une meilleure d@finition et un moindre dlargissement des taches de sub- s t a n c e s .

En chromatographic sur eouche mince, la vitesse macrosc~pique initiale de progression du solvant est plus lente qu'en ehromatographie ascendante sur papier; ceci fair que les 6quilibres de rdpartition des substances entre phases sont plus parfaitement atteints pr6s de l'ori-

CO)f: ]Fi~INCIPES ET POSSIBILIT~S 17

gine du e h r o m a t o g r a m m e ("zone p e r d u e " en chromatogra .phie as- cendant, e sur papie r ) ; ceci est une ra ison de plus d ' o b t e n i r des taches plus pe t i t e s et m i e u x d6finies en c h r o m a t o g r a p h i c sur touche mince qu ' en ch roma tog raph i c a seendan te sur papier .

Ainsi, du fair que l 'on uti l ise une touche e h r o m a t o g r a p h i q u e for- m6e de fines par t ieules de fo rme sens ib lement sph6rique, on p o u r r a et on devra* choisir une surface chrontatographique plus petite quc s'i] s '6 ta i t agi de ch roma tog raph i c sur papier , et, p a r vole de eons6- quenee, rgduire le volunte de l' gchantillon ntis en jeu et la quantit~ de ntati~re sountise & l' analyse.

Tout, ceci p e u t a i s6ment se comprend re si on compare des s@a- ra t ions ch roma tog raph iqnes ident iques ob tenues avec le m~me so lvan t en ch roma tog raph i c sur eouche mince de poudre de cellulose e t en eh roma tog raph i e sur pap ie r (ce n ' e s t que dans ce eas q u ' u n e eompara i son r igoureuse p e a t 6tre faite) ; le ntgme degrd de sdparation sera obtenu si on arr~te l'ascension du solvant (et donc la ch romato - graphic) lorsque la va leur de la vi tesse macroseopique ]ocale

dh - - V M = t g a - - d t de progress ion du so lvan t sera sens ib lement

la re@me sur couche mince et sur pap ie r** [voir la courbe do rman t la progress ion (h) du so lvan t en fonct ion du t e m p s (t) : h = f (t); Fig. 1].

On vo l t que le passage de la ch roma tog raph i c sur feuille de ma- t i~re f ibreuse & la ch roma tog raph i c sur couche mince, pou r des conditions optimales de sgparation dans les deux cas, correspond g une r6duc~ion d '6chelle.***

Cet te r@duction d'@chelle es t ex t r~memen~ intdressante, car elle p e r m e t : a - d ' o b t e n i r les s@ara t ions d6sir6es en un t e m p s court , b - d ' e m p l o y e r un mat6r ie l plus simple, moins on6reux, moins en-

e o m b r a n t ,

* Ceci est li6 & la viscosit6 du solvant mobile de chromatographic et peut ais6- ment se comprendre en consid6rant les courbes de la cln@tique de progression du solvant (voir Fig. I). ** Dans ee gem'e de eomparaison, il est 6videmment ndcessaire d'employer un solvant de viscosit6 compatible avec une bonne chromatographic sur eouehe mince; la CCM exige des solvants en g~n6ral a~sez peu visque~rx; il est souvent indispensable de modifier dans ee sells les solvants utilis@s ell chroma~o- graphic sur papier. *** I1 faut se garder de comparer entre elles deux stu'faces ehromatographiques 6gales, ee serait comparer des objets sans relation; on ne peut que comparer les deux m6thodes analytiques dans teurs conditions optimales de s6paration (c'est-~-dire dans la condition de eompl6te s6paration de deux taehes rondes de substances correspondant a 1me variation de valeur de Rf (d Rf) 6gale a 0,1).

18 R. L M U ~ I E R

et donc de pouvoir faire simuttan6ment un grand nombre d'analyses et d'obtenir plus rapidement les r6sultats escompt6s.

Couches de particules disposdes sur support solide: L'aspect le plus int6ressant de la chromatographie sur couche mince est certaine- ment la possibili~6 d'obtenir des s6parations en met tant en oeuvre un "support chromatographique" de nature quelconque pourvu qu'il soit finement divis6 (5--15 #).

Ainsi peuvent 4tre r6alis6s tousles types physico-chimiques de chromatographic:

adsorption exclusion-diffusion* partage ch6]ation relargage chlatration 6change d'ions

D'autre part, les substances min6rales (alumine, silice, silicates divers, etc.) qui ne sont pus fibreuses st ne peuvent donc gtre raises en feuilles, peuvent gtre d6pos6es sur support solide et i! est alors possible d'emp]oyer le proc6d6 g6n6ral de r6v6lation des substances chromatographi6es connu sous le nora de r6v61ation par carbonisa- tion sulfochromique, si le l iant utilis6 duns les couches est de nature min6rale.

De l ' I d 6 e ~ la R 6 a l i s ~ t i o n Le beau tableau que nous venons de brosser /~ qui le doit-on?

L'id6e de r6aliser des chromatographies sur couche mince n'est pus neuve puisque - nous l 'avons dit tout £ l 'heure - on trouve son origine duns tes essais d'tzsIAmov & SC~RAIBEI~ (3) (rest6s d'ailleurs ignor6s des scientifiques jusqu'£ une date route r6cente) puis, duns eeux de KIRCtINER, MILLER & KELLER (4) qui avaient imagind de r6aliser une ehromatographie duns une couche d6pos6e sar une bande de verre. Enfin, RErrSEIUA (5) proposa d'utiliscr une plaque de verre comme support de la couche mince. La chromatographie sur couche mince commen~ait £ prendre corps, mais elle n 'avait alors pour but que de permet~re de faire une chromatographie d'adsorption (de surface), type de ehromatographie qui ne pouvait gtre r6alis6e qu'exeeptionnellement sur papier impr~gn6 d'adsorbant.

Pour que cette m~thode puisse gtre pratiqu6e duns ]es laboratoires, il 6tait encore n6cessaire que des appareils permettant de prgparer ces couches et de d6velopper des chromatogrammes soient mis au point; c'est £ STALL (6) que revient le m~rite d'avoir crY6 les pre- miers dispositifs entre 1956 et 1961. Le premier 6quipement de base apparaissait sur le march6 en 1958. Un peu plus tard, on publiait les

* P e r m e a t i o n s u r g e l o u t a r n i s ~ g e m o l 6 c u l a i r e ,

CCIE[; PI~INCIPES ET POSSIBILITIES 19

premieres revues ggn6rales sur cette technique ehromatographique (STAHL, 1962 (7), I4ANDERATH, 1963 (8)). Insistons sur l ' importance des reeherehes technologiques qui furent menses ~. bien par Ies cher- eheurs (dont on connait mat, sinon pas du tout ]e nom p~r suite d'une regrettable tradition) des diverses firmes (Merck AG, Woelm, Maeherey et NageI, Flucka, American Viscose Corporation, Phar- macia, Biorad) qui out eommereialis6 les supports pour chromatographic sur touche mince. Sans eux, cette technique chromatographique serait rest6e une m6thode pour laboratoire hautement @6- cialis6.

P o s s i b i l i t g s de la C h r o m a t o g r s p h i e sur t o u c h e mince Nous venons de faire remarquer que tousles types physico-chimi-

ques de chromatographic peuvent 6tre mis en jeu. C'est en utilisant une classification des proc6d6s chromatographiques selon ees types que nous allons essayer de donner une id6e des possibilit6s de la chromatographic sur touche mince en pr6sentant, dans chaque cas, nn exemp]e de s6paration.

Chromatographic d' adsorl)tion Elle a surtout ~t~ utilis6e avec sucegs pour la s@aration des sub-

stances liposolubles [revues: RANDEt~ATH (8), ST~a~tL (7), MARINETTI (9)].

Les adsorbants les plus divers peuvent 6tre mis en oeuvre; par suite de la possibilit6 d'activation d'une couche sur plaque de verre

L E

p-Carot~ne

I~ VitemineA p~. mi [ete

Vitamine Kt

Vi~amineAec~- ~ate

~-Tocoph&,ol

S Vil:emines D,~+ Ds VitamineA

Fig. 2

(jusqu'a l 'alumine d'activitg II, selon BROC~ANN & SC~O~)DER), eette m6thode est tr6s pr6eieuse pour le chimiste organicien. La chromatographic des substances liposolubles sera faite en milieu or-

20 R . L . l~UNIER

ganiqae. Comme exemple-type, eitons la s@aration des vitamines liposolubles (20--30 leg) en 6 rain (18 em) sur eouehe mince de gel de siliee G (indieateur fluorescent) par BOLLmER, (10), avee le solvant eyelohexane/6tber (8 : 2) [voir Fig. 2]. La s6paration des o-, m-, p- nitroph6nols sur eouehe mince d'Alumine d'aetivit6 I I I [selon BROCKMANN ~5 SCttODDER (11); chauffage ~ 160°C pendant ¢ heu- res] par du benz~ne a 5% d'gthanol, selon RANDERAT~ (12), en est un autre exemple (Fig. 3).

L tL

o-nil:r'oph~mol rn-nitroph~nol

• p-hi ~r'ophSnol

Fig. 3

On peut vraisemblablement obtenir des s@arations de substances hydrosolubles par chromatographie sur couche mince d'adsorbants en milieu aqueux, mais il n 'y a actuellement que peu d'exemples de eeci.

Chromatographic sp~cifique Pour ee type de chromatographic d'adsorption, les causes physieo-

chimiques de s@arations chromatographiques sont parfaitement connues. Comme exemple on peut citer la s@aration par chromatographie bi-direetionnelle des dansyl-aminoacides (1-dim~thylamino- naphtalgne, 5-sulfonyl-aminoacides) sur couche mince de poudre de polyamide (nylon 6) selon WOOD & WANG (13) par suite de la for- marion de liaisons hydrogSne entre groupes earbonyle des dansylaminoacides et groupe amino-amide du polyamide; on peut voir la s@aration de 26 substances en 60 et 30 nan sur une surface de 10 x 10 em (Fig. 4)* avec les solvants: eau/acide formique ~ 90% (1000 : 15), benzene/acide ae6tique (9 : 1).

Un autre exemple de chromatographic spdcifique est ]a s@aration

* Abrdviat ions ut'ilis~es pour les Dansy l aminoacides: D (radical dansyl), DNH~ = dansylaraide, DOH = dan~sylacide; Les m~mes abr6viations (voir Fig. 8) song utilisges pour les da, nsyl-aminoaeides clue pmxr les DNY-aminoacides (voir Fig. 4).

CO!Vf : I'I~INCII'ES ~T POSSIBILITES 21

des eomposds 6thyl6niques sur eouehe mince de gel de silice im- pr4gnde de nitrate d'argent; les s@arations sont dries & la formation de complexes 61ectroniques entre ions argent et carbones des doubles liaisons. C'est ainsi que BARRST, DALLAS & PADLnX ~ (14) s@aren~

~Pro

diHist. ~11~ ~DV~IL diTyr~ Phe dPDNH2

9!P ~DAla ~, Met

.diLys~'Me50 .~Giy~0pr~°GFuNH~ I O~ 0~ exMet Thr~ lllW~ ~ i "~" ~ry Glul~.- ~ IPAspNH~ ~Lys Nmono lllF~sp ~Ser ,~ ~" "lIP O LIPTYrlImmlD 0re°n° ~[~¢ar',g I

Cy5 CySO3H "----'D'OH wr l II lered rect on ! I~] ->

Fig. 4

sur couehe mince de gel de sitice impr6gn4e de nitrate d'argent sous Faction du sol-want chloroforme/acide ac4tique glacial (995 : 5) des triglycerides eontenant des acides gras non satur@s (voir Fig. 5). La s@aration obtenue d@end du hombre, de la nature, de la position des acides gras prdsents dans le glyeeride (Fig. 5).

~pist@arine

2-ol~odis~6adne I- ol@odist ~ar'ine

I~ s~@apo-diol@ine

l;rioI~ine

trilinol~ine

Fig. 5

Chromatographie d' ~change d' ion~ Elle peut-@tre faite sur couche mince de poudre fine de rdsine

dchangeuse d'ions (BERGnR, M~YmnL & I)ETIT (15)), de poudre de

22 m L. N~JZ~I~

cellulose 6changeuse d ' ions (LIn~EcQ et collaborateurs (16)), de dext ranes rdtieul6s 6ehangeurs d ' ions (WInLA~D & PrLnZDE~n~ (17)). RAt~DERATI{ (18 & 21) a pu faire des ehromatographies d '6change d ' ions sur couche mince de poudre de cellulose impr6gnde de polydth:yl6ne-imine avec dlution par 6tapcs [solutions salines de composit ions diverses changges au cours du d6veloppement du ehromatogramme] .* Comme on peut le voir, 22 nuel6osides poly- phosphates , nucl6otides-sueres, pyr idine nucl6otide du mdtabolisme sont s@ar6s (20) dans une chromatographic bidireetionnelle (Fig. 6).

L2____ '" I ' 2

L 1 I 1 4 . - is .22 13o ..2i

~ " 12e~e17 3 t l le 20 el9 - - iOo o18

i 9e °8116 o-| 4,'P.oa

X 1 2 > '1 ~'re dir'ecl:ion

Fig. 6

Chromatographie d' exclusion-di!]usion (tamisage mol6eulaire) La couche mince est form6e de granules de substances ma.cro-

mol~culaircs (dextranes, p01y~erylamide) plus ou moins r6ticulges (22, 23, 24) et relies que les tailles des cavit6s intragranulaires et des pores soient comprises d~ns une gamme de vMeurs dgterminges pour chaque sorte de gel. Les produi ts soumis g ]a chromatographic peu- ven t 6tre s@ar~s selon leurs m~sses mol~culaires. Comme exemple,

* D@veloppement en premigre direction suecessivement par des solutions aqueuses de LiC1 (0,2 M., 2 mn. ; 1 1K., 6 ran. ; 1,6 M. & 13 em au dessus du point de d6p6t) puis lavage au mgthanol anhydre (61imination du LiCI par dissolution) et enfin d6veloppement en 2e direction par la solution tampon aeide formique/formiate de sodium pi t 3,4 (0,5 1~[., 30 see.; 2 M., 2 ran. ; 4 3/I. & 15 em au dessus de la ligne de d6p6t) ; abr6viations : taehes 1 & 5 = 5'- triphosphodgrivgs respeetifs de 1~ guanosine (G), inosine (I), uridine (U), adenosine (A), cytosine (C); taehes 6 ~ 10 ~ 5'-diphosphod~Tivgs respeetifs des m6mes nuel6osides; taehes 11 ~ 15 -= 5'-monophosphod6rivgs respeetifs des m6mes nuelgosides; taehe 16 = uridine diphosphate glueuronique aeide; taehe 17 ~ llridine diphosphate - N-ac6tylglueosa,mine; taehe 18 ~ 21 nucl6oside diphosphate glucoses correspondant respeetivement & la guanosine, uridine, adenosine, eytidine; taehe 22 ~ diphosphopyridine nuel6otide.

CCI~: PI~INCIPES ET POSSIBII,ITI~S 23

eitons la s6paration (6luant: solution aequeuse de phosphates pH 7,4) de prot6ines sur couche mince de granules (exceptionnelle- ment: 40 #) de dextrane faiblement reticul6 (Sephadex G 100, Pha rmac i a ) en 7 h. selon FASELLA et eo l labora teurs (22). Dans cet exemple (Fig. 7) la subs tance exelue des grains de gel (h4moeyani-

tt ! It

!

~ <--l--Exclusion

1t r

t

Q <---- DiFi:usion fibre

X--X~X--X--X--X~ '1 2 3 4 5 M

Fi%, 7

he), pa r suite de sa hau t e masse mol4cuiaire ( > 2 x 10~), est s@ar4e des subs tances subissant le proeessus ch roma tog raph ique de t ami - sage mol4culaire: s4para t ion du dim~re de la s4rum a lbumine , de l 'h4moglobine, de la e h y m o t r y p s i n e dont les masses moldeulaires - 140.000, 68.000, 25.000 - sont suf f i samment diff4rentes. L a t aehe de p y r i d o x a m i n e donne la posi t ion d 'une subs tance subissant un processus ch roma tog raph ique de diffusion libre.*

Chromatographic de partage Dans ee domaine trois possibilit6s se p r6sen ten t :

- la ch roma tog raph ic de pa r t age direct avec phase fixe aqueuse.

- la ch romatograph ic de pa r t age direct avee phase fixe moins polaire que l 'eau.

- la ch roma tog raph i c de pa r t age invers6.

Chromatographic de partage direct avec phase fixe aqueuse: Elle dolt ~tre fai te sur touche mince de poudre de cellulose e o m m e

elle a 4t4 fai te sur pap ie r (reals ]e so lvan t employ4 dolt souven t 6tre rnoins visquenx) . On vol t alors que les s@ara t ions ob tenues sont les

* Dgsignation des substances (Fig. 7) : 1 = pyridoxamine, 2 = ehymotryp- sine, 3 = hgmoglobine, 4 = dimgre de ]a serum-albumine, 5 = h4moeyanine.

2 4 ~ . L. M U N I E R

m@mes que sur papier. Comme exemple eitons la s@paration de 23 amino-acides naturels ou modifi@s chimiquement contenus dans ]es hydrolysats de prot~ines en une seule chromato-@lectrophorSse sur couche mince (200--250 x 400 x 0,25 ram) de poudre de cellulose selon MvN~E]~ et T~OM~EGAr (25, 26); apr~s 5lectrophor~se basse tension (acide forlnique lq.) le chromatogramme est d@velopp@ avec un solvant contenant un m@lange de composants volatils ~ pouvoir tampon Butanol tertiaire/m~thanol/pyridine/acide formique ~ 98 %/ eau (330 : 430 : 96 : 4 : 200) ; on peut voir (Fig. 8a et 8b) que tous les aminoacides sauf la leucine et l'isoleueine* sont s~pargs sous forme de petites taches. C'est le proc~d~ ~ plus haut pouvoir s@parateur actuellement eonnu pour les aminoacides.

La chromatographie en couche mince avee phase fixe aqueuse peut ~galement ~tre rgalisde sur couche mince de kieselguhr ~ 10%

Fig. 8a

* Abrdviations utilis~es pour les aminoacide8: Ala (Manine), Arg (arginine), Asp (acide aspartique), Asp N H 2 (asparagine), Glu (aeide glutamique), Glu- N H 2 (glutamine), Gly (glyeoeolle), CySCI~ (S-carboxym6thyleyst6ine), Cy- SOaH (acide cysteique), His (histidine), Ileu (isoleucine), Leu (leueine), Lys (lysine), Met (methionine), 2YleSO (methionine sulfoxyde), MeSOn (methionine sulfone), Phe (ph6nyl~lanine), Opro (oxyproline), Pro (proline), Set (serine), Thr (thr@onine), Try (tryptophane), Tyr (tyrosine), Val (valine). (Voir Fig. 8a et 8b).

CCM: PRINCIPES ET 20SSIBILIT~S 25

de plgtre (on avec l 'amidon soluble comme liant). Dans le cas des sucres simples, STAUL & KALTmV~ACI~ (27) out montr6 que la touche doit 6tre formic darts une solution d'ac6tate de sodium pour 6viter les offers p@turbateurs de la chromatographic d'adsorption. Sc~wEmE~ (28) a montr6 que le m6me r6sultat peut &tre obtenu par chromatographic snr touche mince de poudre de cellulose sans liant

1'aide du solvant d'IsttE~wooD & JERMY~ (29) [propos6 pour la ehromatographie sur papier].

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J OCySO3H Asp OOAsp N Hal ~ O L.ys I i i I J i~°dir.ecHon HCOOH N mc l ® j J < "> i

Fig. 8b

I1 faut maintenant parler d'nn problgme bien particulier, celui des essais fairs par beaucoup d'auteurs pour obtenir la s6paration de substances hydrosolubles sur touche mince de gel de silice dans des conditions op@atoircs qui rappellent celles de la chromatographic de partage. Ces essais s'expliqucnt par le fair que le gel de silice, utilis4 avec grand succbs pour obtenir des s@arations par chromatographie d'adsorption, fur la premigre pr@aration de support ehromatographique finement divis6 (5--15 #) a 6tre commercialistic. Malhcureusement oct emploi n'a pas dr4 sans cr6er beaucoup de confusion dans l'expos6 des m6~hodcs de la ehromatographie en touche mince. Maintenant que la poudre de cellulose (5--15 #) est commerciMis6e il n 'y a plus de raisons d'essayer de faire des cbro- matographies de partage avec phase fixe aqueuse sur un autre support chromatographiquc.

I1 est bien 6vident que dans beaucoup de cas o~ l'on utilise une eouche de gel de silice et un solvant organiqne contenant 15 g 30% d'eau, il y a sonvent une chromatographic d'adsorption qui se superpose g la chromatographic de partage direct. Ceci est bien eonnu en chromatographie sur colonne. Comme excmple de Ia

26 a.L. MUNIER

superposition de deux proc6ssus chromatographictues sur touche mince de gel de silice, nous Woposons au lecteur de eomparer les r6- sultats obtenus pour les dansylaminoacides, avec le m~me solvant chromatographique (Tolu~ne/monochlorhydrine du glycol/pyridine/ ammoniaque 0,8 N - I50 : 90 : 45 : 90), par DEYL & ROSMUS (30) sur eouehe mince de gel de silice et par nous mSme sur touche mince de poudre de cellulose sans liant (31). On volt que les mobilit6s rela- tives des divers dansylaminoaeides sont tr~s diff6rentes dans Fun et l'autre proc6d6.

Chromatographic de partage direc~ avec phase fixe moins polaire que l~ eau

D'autre part, pour obtenir des s@arations de substances assez faiblement solubles dans l'eau par chromatographie s~r couche mince de gel de sitice certains auteurs se sont adress~s ~ des solvants de composition totalement diff6rente de la composition des sotvants employds en chromatographie de partage avec phase fixe aqueuse, citons/~ titre d'exemple les suivants: Chloroforme/m6thanol (95 : 5) ou (80 : 15) (32, 33, 34) Benzene/m6thanol/acdtone/acide ac6tique (70 : 20 : 5 : 5) (35) Chloroforme/heptane/ethanol (33 : 33 : 33) (36) Benzene/m6thanol/acide ac6tique glacial (90 : 16 : 8) (37) Benzene/dioxane/acide acdtique glacial (90 : 25 : 4) (37) Cyc]ohexane/chloroforme/acide aedtique glacial (40 : 50 : 10) (38) Cyc]ohexane/chloroforme/pyridine (20 : 60 : 5) (38) Cyelohexane ac6tone/aeide a, c6tique glacial (40 : 50 : 10) (38) Benzene/pyridine/acide ac6tique glacial (80 : 20 : 2) (39)

Ces solvants sont tous des m61anges de composants peu polaires (benzene, tolu6ne, chloroforme, cyclohexane, etc.) et de composants tr~s polaires (pyridine, acide ae6tiquc, mglange de ceux-ei, dioxane, m6thanol, etc.).

Si le support chromatographique ~tait non adsorbant, il s'agirait Mors vraisemblablement d'une chromatographie de partage avec phase fixe moins polaire que l'eau* : dans te cas du gel de silice - plus ou moins adsorbant - il y a fixation, au mSme titre que l'eau, du composant le plus polaire du m61ange so]vant. Cctte m~thode chromatographique rappet]e eelle imagin~e par Mt~GH (40) pour faire une chromatographic de p~rtage sur papier avec phase fixe moins polaire que l 'eau; Ies solvants alors propos6s 6taient: Heptane satur6 de mdthanol (40, 43, 44, 45)

* Les divers aspects de la chromatographie de partage sur papier ont 6t6 longuement discut6s dans une revue d'en~emble sur eerie technique (41) (pour la m6thode de ME~OtI voir (42)).

CCA{: PRIIgCIPES ]~T FOSSIBILITES 27

Ether de pgtrole/mdthanol (46) Heptane/acide ac4tique glacial (90 : 10) (47) Ligroine/ehloroforme/acide ac4tique glacial (100 : 40 : 4) (48)

Dans le cas de Ia chromatographic sur touche mince de gel de silice & 10% de pl&tre, on a route raison de penser que les eomposants les plus polaires de la phase mobile out aussi pour rSle de ddsaetiver partiellement le gel de silice et ainsi de r4duire les effets perturbateurs dfis au pouvoir adsorbant de la silice. Un exemple type (Fig. 9) es~ la s@aration des vitamines hydrosolubles (3 g 30/~g.) faites par GX~SSmRT & MALZAC~nR (35) sur couche mince de gel de siliee 10% de pl£tre (17 era; 40 ran.) avec le solvant Benzene/m4thanol/ ae6tone/aeide ae4tique glacial (70 : 20 : 5 : 5).

Acide Ascor'bique

Acide Nica~.inique

Pyridoxine Nico~inamide

I Ribo~lavine

0 Cyanocobalamine 0 Thiamine

--X--

Fig. 9

Dans bien des cas, cepcndant, los s6parations chromatographiques obtenues r6sultent du double proc6ssus d'une chromatographic d'adsorption et d'une chromatographic de partage direct avec phase fixe moins polaire que l'eau. Comme exemple de cette superposition des deux processus chromatographiques, citons la s4paration de la dansyl-leucine, de la dansyl-isoleucine, obteneu par M~SROB & HO~EYSOVSK¥ (49) sur couche mince de gel de silice g 10% de plgtre; cette s6paration n'aurait pu avoir lieu si une chromatographic d'adsorption ne se superposait g la chromatographic de partage. Re- marquons que dans ce cas, ceci est extr~mement int6ressant: c'est un nouvel exemple d'amglioration des s@arations par superposition de procgssus chromatographiques appartenant it divers types physico chimiques.

Voilg montr6, une nouvelle lois, qu'une bonne connaissance des procdssus physicoehimiques intervenant dans une s@aration chromato-

28 R.L. I~IINIER

graphique est essentielle pour l 'exp4rimentateur qui veut mener bien son travail de recherche.

Nous venons de voir que la m4thode de MEiOH peut ~tre raise en oeuvre en chromatographie son couche mince. La m4thode de ZAF- FARONI (50) peut 4gatement 6tre employ4e: une solution d'un composant moins polaire que l 'eau (glycol, glycdrol, formamide, dim4- thy]formamide) dans un produit ~olatil est pulv4ris4e (solution 5%) sur 1~ eouche mince de poudre de cellulose, de gel de siIiee ou de kieselguhr (avee ]iant). Apr~s 41imination (4vaporation) du composant volatil, la chromatographie est r4alis4e a.vec un solvant moins polaire que la phase fixe et satur4 de phase fixe (technique p~r im- pr4gnation).

Comme exemple, eitons (Fig. 10) ]a s4paration des alcaloides des solan4es mydriatiques sur couche mince de poudre de cellulose im- pr4gn4e de formamide avec d4veloppements successifs selon la m~me direction par les solvants Heptane/di4thylamine (500 : 1) (15 cm), Benz4ne/heptane/chloroforme/di4thylamine (600 : 500 : 100 : 2) (10 cm), selon TEICH~mT et col]aborateurs (51).

L E

I Apoa;'r-opine Belladonine

0 Scopolamine

I Atropine TroI~ne

- - x - -

Fig. 10

Chromatographie de partage invers~ (phase fixe tipophile, phase mobile hydrophile) :

Le support chromatographique ddj~ sous forme de couche sur un support solide inerte est tipophilisd (pulv4risation d'une solution de mati~re lipophfle darts un solvant volatil; ex. huile v4g4tale en solution dans une fraction de p4trole p.e. 100--140 ° C) ; le solvant mobile est hydrophile (exemple : m4thanol/ac4tone/eau (15 : 5 : 1) satur4 de tri- glyc4rides). Des substances tr~s lipophiles peuvent ~tre soumises

ce type d'analyse chromatographique, citons, £ titre d'exemple, la s4paration des colorants lipophfles (52) d 'un extrait de Syringa vulgaris selon EGGE~ (voir Fig. 11).

CCI~I : PRINCIPE8 ET POSSIBILITE8 29

L

N~oxant hine

Violexan[hine Lu~'eine 6poxyde LuL6ine

Chlor'ophylle b CNorophylle a

- - X - -

Fig. 11

Chromatographic de Relargage Cette chromatographic en milieu aqueux peut @ire appliqu@ & la

s@arat ion des substances ionisables hydrosoluble.s; elle est surtout in- g6ressante duns les couplages avec d'autres m6thodes ehromatographiques. /)ans ce cas, la pr6sence d'agengs tensioactifs dans les solvants est souvent essentielle au suec6s de l'ana]yse (54). Citons g tigre d 'exemple la s@aration des dinitroph6nyl-aminoacides (53, 54) sur eouche mince (200 x 300 x 0,25 ram) de poudre de cellulose; apr6s chromatographic de partage (16re direction) en atmosph6re ammoniacale par le solvant Tolu6ne/monochtorhycb'ine du glycol/ pyr idine/ammoniaque 0,8 N (150 : 90 : 45 : 90) (plus 200 mg d'a!- cool oetylique primaire ajout6s au solvant, d6cant6 et filtr6), Ie chromatogramme est d6velopp6 (2e direcgion) par chromatographic de relargage avee le solvant aqueux -eau/eau sagur6e de sulfate d 'am- monium/dod@yl sulfate de sodium (700 ml : 100 ml : 0,6 g.)

T o u s l e s dinitroph@ylaminoacides 6th6rosolubles song s6par6s (Fig. 12).* Signalons comme augre exemple, que simultan6ment to~s les dansylaminoacides (produits fluorescents) et tous ies dinitrophg- nylaminoacides (produits jaunes) peuvent ~gre s@ards par ee re@me proc6d6. (31).

* Abr@v~ia t ions: D N P == radicM d in i t roph6ny l , D N P O H = 2 ,4-d in i t rophenol~ les a b r 6 v i a t i o n s p o u r les s u b s t a n c e s m o n o s u b s t i t u a b l e s song les m 6 m e s que p o u r les aminoae ides (vol t Fig. 8a e t 8b) ; di Lys -= di D N P lysine, di T y r = di D N P t y r o s i n e ; N m o n o T y r = N m o n o D N P ~yrosine. (Voir Fig. 12).

3 0 ]~. Y.. , . ~ U ~ I E R

CCl~I: 3?l%I!gCIBl~S ET I~OSSIBILITES 31

CONCLUSION

Les quelques exemples que nous venous de pr4senter vous ont eonvaineus, je l'espgre, de l'int4r@t et de l'effieaeit4 de la chromatographic en eouehe mince eomme m4thode analytique de s@aration des substances dans les m41anges complexes. I1 ne faudrait eepen- dant pas eonelure que tous les probl@mes sont r4solus pour autant ear de Iarges domaines d'applieation restent ~ explorer. D'autre part la chromatographic en eouehe mince n'est pas destin4e ~ sup- planter tous les antres modes de chromatographie, ehaeun d'entre eux gardant ses domaines privil4gi4s d'applieation. La chromatographic sur eolonne, la chromatographic par feuille de mati~re fibreuse, la chromatographic s ur eouehe mince sont trois techniques eompl4mentaires de s4paration anquel ill faut d'ailleurs joindre les m4thodes de l'61eetrophor~se de zones en eolonne, sur feuille de matigre fibreuse et en eouehe mince, ainsi que les associations que l'on peut en faire. Toutes ees techniques d'ailleurs 4voluent pour lent propre eompte et tout l 'art de l 'analyste est d'en saisir les m4canis- mes intimes afin de ehoisir la m4thode 1~ mieux adapt4e g son problgme.

R£su~I~

Apr~s un bref rappel des avantages de la ehromatographie de surface sur la chromatographie sur eolonne, on compare les avan- rages et les ineonv4nients respeetifs de la chromatographic sur eouehe mince et de la ehromatographie sur papier. Les m4thodes g4n4rales de la chromatographic sur touche mince (CCM) sont pr4sent4es (pr@aration des couches, types de couches, d4pot des 4ehantillons ~ analyser, CCM anMytique, CCM prgparative, moyens de d4veloppement des ehromatogr~mmes). Lea prineipes g4n4raux des divers types de chromatographic (adsorption, partage direct, partage inversg, relargage, exclusion-diffusion, 4change d'ions, sp4eifique) qui peuvent gtre mis en oeuvre sont rappel4s et des exemples conerets sont donn4s dans ehaque eas. Les problgmes de l'41eetrophor4se et de la ehromato-eleetrophor4se sur eouehe mince sont 4galement 4voqn4s. Bien que eette m4thode analytique soit le plus simple et le puissant, moyen de sgp~ration des corps en m41ange, il est n4eessaire de rappeler qne bien des erreurs de conception sont ~ la base de son manque de dgveloppement dans eer- rains domaines (chromatographic des substanees hyeh~osolubles par exemple). A titre d'exemple on rappelle que la premigre chromatographic de relargage et la premiere ehromato-eleetrophor4se basse tension n 'ont 4t4 r4alis6es que tout r4eemment.

32 R.L. ~UNIER

SUMMARY

After a brief summary of the advantages of surface chromatography compared to column chromatography, the respective advantages and inconveniences of thin-layer and paper chromatography are compared. The general methods of thin-layer chromatography are presented (preparation of the layers, types of layers, de- position of the samples to be analyzed, analytical TLC, preparative TLC, methods for developing the chromatograms). The general principles of the various types of chromatography (adsorption, direct partition, reverse partition, salting out, exclusion-diffusion, ion-exchange, specific chromatography) that may be used are re- minded of, and concrete examples given in each case. The problems of electrophoresis and thin layer chromato-electrophoresis are also treated. Though this analytical method be the simplest and most powerful means for the isolation of components in mixtures, it is necessary to remind that qnite a number of errors in the conception are responsible for its lack of development in certain fields (water soluble substances chromatography, for instance). As an example one might remember that the first salting-out chromatography, and the first low-tension ehromatoelectrophoresis have been developed only very recently.

ZUSAg[~CIENFASSUNG

Die Vorziige der Oberflachen-Chromatographie gegenttber der S~ulen-Chromatographie wurden kurz aufgez/~hlt und die Besonder- heiten der Diinnsehicht- und der Papier-Chromatographie ver- glichen. Die Grundlagen der DC werden erk]~rt (Vorbereitung der Schicht, Arten der Schicht, Auftragen der Proben, analytische DC, vorbereitende DC, Entwicklungsverfahren der Chromatogramme). AnschlieBend werden die grunds~tzlichen Verfahren der verschiede- hen Typen yon Chromatographie erSrtert (Adsorption, direkte Trennung, inversierte Trennung, AussMzen, Diffusion, Ionenaus- tausch, spezifisehe Verfahren), die praktisch infrage kommen. Fiir jeden Typ werden Beispiele gegeben. Die Probleme der Elektro- phorese und der Elektrophoresc-DC werden cbenfalls behandelt. Obwohl diese AnMysenmethode das einfac!~ste und stiirkste Trenn- verfahren ftir Stoffgemische ist, so muB daran erinnert werden, dM~ ihre Entwicklung in gewissen Gebieten durch Fehler in der Auf- fassung gehemmt worden ist, zum Beispiel ihre Anwendung far wasserlSsliehe Stoffe. Verfasser weist darauf hin, dag die erste Aus- salz-DC und die erste Niederspannnngs-Chromato-Elektrophorese erst ganz kiirzlieh reMisiert wurden.

CCl~: :PICINCIPES lET POSSIBIL:[T~N 33

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