chromatography ch 5-7

CHƯƠNG 5.

SẮC KÝ HẤP PHỤ

1

25.1 MỞ ĐẦU

S denotes sample molecule, E denotes molecule of strong polar solvent, and X and Y are polar functional groups of the stationary phase.

Prior to retention, the surface of stationary phase is covered with a monolayer of solvent molecules E. Theadsorption of S molecules upon the displacement of E molecules. The solvent molecules that cover the surface of the adsorbent may or may not interact with the adsorption sites, depending on the properties of the solvent.Fig. Hypothetical representation of the

adsorption mechanism of retention in normal-phase chromatography

35.1 MỞ ĐẦU

45.2 PHA TĨNH TRONG SẮC KÝ HẤP PHỤ


The ideal adsorbent must fulfill the following requirements:

Insoluble in mobile phase

Inert to solutes (adsorptive)

Colourless especially when work with coloured mixtures

Suitable particle size enough to give good separation and

reasonable flow rate

1- Silica gel - Silica - Silica acid:

• It is the most widely used adsorbent in both column and thin layer chromatography.

Silica gel is prepared by acidification of sodium silicate with sulphuric acid followed

by washing with water and drying.

• The active sites of silica gel are the hydroxyl groups attached to silicon atoms

"Silanol groups" .These groups are 5 A apart and form hydrogen bonding with

solutes. Silica gel reaches its maximum power when heated between 150 -2500C

to get rid of water. If silica gel contains water it then act by partition not by

adsorption. Decrease particle size increases the surface area and consequently

increases separation power.


2- Alumina: • It is aluminum oxide (Al2O3). Alumina activated by heating at 400 0C overnight.

• Advantages of alumina: 1- Large capacity 2- Insoluble

3- Relatively inert 4- Available

5- Adsorption is different from silica gel due to the strong positive field of Al3+

and the influence of basic sites which affect easily polarized compounds. It is good in separation of aromatics from olefins.


• Types of commercial alumina : 1- Neutral alumna pH 7– 7.5.

2- Acidic alumina pH 4. It is prepared by washing aluminum oxide with 2N HCl then with distilled water.

3 – Basic alumina pH 10. This type is prepared by washing with NaOH then distilled water.

8

3- Charcoal:

• There are two types of charcoal based on temperature of activation:

1-Non–polar of Charcoal prepared by activation at 1000 0C and act by

adsorption through hydrogen bonds and electrostatic forces.

2- Polar charcoal prepared at lower temp and contains water so act by

partition.

4- Kieselguhr (Diatomaceous earth):

• It have relatively low adsorption power.


Thứ tự rửa giải theo khả năng lưu giữ tăng dần:

olefins < aromatic hydrocarbons < ethers <

esters, aldehydes, ketones < alcohols, amines < amides <

carboxylic acids

95.3 ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ HẤP PHỤ

One exception is for the

analysis of isomers


Fig. Structures of cis and trans isomers of steroids

Fig. Chromatograms of isomers 3–6

Column: APEX silica, 250 × 4.6mm, 5μm (Jones chromatography);

Mobile phase: hexane-dichloromethane-2-propanol: 82 : 10 : 8 (v/v/v)

flow rate: 1 mL/min; detection: 280 nm; temperature: ambient


135.3 SẮC KÝ BẢN MỎNG (Thin Layer Chrom.)

Bản mỏng

Hơi của dung môi rửa giải

Dung môi rửa giải

Điểm chấm chất phân tích

Rf = x1/x0 (Rf: retardation factor)x1: quãng đường đi của chất phân tích (distance of center of the spot to the start line)

x0: quãng đường đi của dung môi rửa giải (distance of the start line to the solvent front)

CHƯƠNG 6.

SẮC KÝ PHÂN BỐ

PHA THUẬN VÀ PHA ĐẢO

14

The Nobel Prize in Chemistry 1952 for the invention

of partition chromatography"

Archer John Porter Martin

Richard Laurence Millington Synge

156.1 MỞ ĐẦU

166.1 MỞ ĐẦU

Chiết pha rắn (Solid Phase Extraction)

176.1 MỞ ĐẦU

186.1 MỞ ĐẦU

Pha thuận hay pha thường (Normal Phase)

Cột: mang tính phân cực

Pha động: mang tính không phân cực

Pha đảo (Reversed Phase)

Cột: mang tính không phân cực

Pha động: mang tính phân cực

196.1 MỞ ĐẦU

206.2 HỆ THỐNG BƠM (PUMP)

Fig. Schematic diagrams of a low-pressure mixing system (a) using two separate pumps and a controller to blend solvents under high pressure

(b) using a single pump and a four-port proportioning valve

216.3 BỘ PHẬN TIÊM MẪU (INJECTOR)

226.3 BỘ PHẬN TIÊM MẪU (INJECTOR)

236.4 PHA TĨNH

Fig. Schematic of various types of silanol and their relative acidities.

Note that the silanol can be activated by an adjacent metal group

Surface metals (M +) (esp. Al and Fe) can activate silanols to make them very acidic

246.4 PHA TĨNH

Fig. Schematic of different types of bonding

256.4 PHA TĨNH

Structures of some common bonded phases:

Normal-Phase (NPC)

Si Silica Si - OH

NH2 Amino Si- CH2- CH2- CH2- NH2

CN Cyano Si - CH2- CH2- CH2- CNDiol Silica modified with trimethoxy glycidoxypropyl silanes

Reversed-Phase (RPC)

C18 Octadecyl Si(CH3)2- (CH2)17 - CH3

C8 Octyl Si(CH3)2- CH2-CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH2- CH3

CN Cyano Si(CH3)2- CH2- CH2- CH2- CN

φ Phenyl Si(CH3)2- C6H6

Polar-embedded (Amide) Si(CH3)2- (CH2)3NHCO(CH2)14CH3

266.4 PHA TĨNH

(1) Paraffin

(2) n-hexadecyl palmitate

(3) cholesterol palmitate

(4) stearic acid methyl ester

(5) glycerol tripalmitate

(6) hexadecyl alchohol

(7) stearic acid

(8) cholesterol

(9) glycerol-1,3-dipalmitate

(10) glycerol-1,2-dipalmitate

(11) glycerol monopalmitate

(12) erucylamide

Fig. Separation of selected representatives of different lipid classes

Column LiChrosphereR Diol (125 × 3mm) 5-μm particles.

Gradient from isooctane (A) to 60% methyl tritbutyl ether (MTBE) in

34 min + 10 min isocratic hold.

276.4 PHA TĨNH6.4.1 Pha thuận hay pha thường (Normal Phase)

Fig. Structures of the typical bonding and end-capping reagents and diagram of the bonded silica with residual silanols

286.4 PHA TĨNH6.4.2 Pha đảo (Reversed Phase)

O OSiO

3OH-

Si(OH)4

XBridge 2.1 x 50mm, 3.5μm

Sunfire 2.1 x 50mm, 3.5μm

silica-based particle

dissolution of the underlying silica particle at high pH

pH limits of 2-8

Bridged Ethyl Hybrid extremely low area of underivatized silica surface

pH limits of 1-12

Ethylene Bridged Hybrid particle

reversed-phase C18 column


Dung môi pha động sử dụng cho sắc ký lỏng pha thuận

• Dung môi chủ yếu (không phân cực) :

– Hydrocarbons (Pentane, Hexane, Heptane, Octane)

– Aromatic Hydrocarbons (Benzene, Toluene, Xylene)

– Methylene chloride

– Chloroform

– Carbon tetrachloride

• Dung môi phụ (phân cực hoặc hơi phân cực) :

– Methyl-t-butyl ether (MTBE), Diethyl ether, Tetrahydrofuran

(THF), Dioxane, Pyridine, Ethyl acetate, Acetonitrile, Acetone, 2-

propaol, ethanol, methanol

• Dung môi chủ yếu được sử dụng chính làm pha động, dung môi phụ thường được

thêm vào với tỉ lệ nhất định để thay đổi thời gian lưu

• Các dung môi thường không hấp thu trong vùng UV để dễ dàng cho việc xác định

316.5 PHA ĐỘNG

Dung môi pha động sử dụng cho sắc ký lỏng pha đảo

• Dung dịch đệm + dung môi hữu cơ

– Methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) hay THF là các dung môi thường sử dụng

nhất cho sắc ký pha đảo.

– Nồng độ đệm và pH là những thông số rất quan trọng.

• Việc tối ưu hóa tỉ lệ của dung dịch đệm và dung môi hữu cơ cũng rất quan trọng.

• Với cùng một lọai vật liệu nhồi cột, tùy theo kích cỡ hạt nhồi cột, hãng chế tạo

cột … thành phần pha động cũng có thể phải thay đổi cho phù hợp

326.5 PHA ĐỘNG

336.5 PHA ĐỘNG

Các cách rửa giải trong HPLC:

• Rửa giải với chế độ Isocratic: pha động có thành phần không thay đổi

trong suốt quá trình rửa giải.

• Rửa giải với chế độ Gradient: pha động với thành phần thay đổi trong

quá trình rửa giải

346.5 PHA ĐỘNG

Ưu và nhược điểm của chế độ Isocratic

• Ưu:

– Thành phần pha động chính xác:có thể trộn trước bằng tay hoặc trộn liên

tục (nếu có bộ gradient)

– Hệ thống phân tích đơn giản, rẻ tiền.

– Đường nền ổn định do thành phần không đổi nên sử dụng tốt cho các đầu

dò thành phần nền ảnh hưởng nhiều đến tín hiệu như độ dẫn (CDD), đo chỉ

số khúc xạ (RI)…

• Nhược:

– Khả năng tách kém, đặc biệt trong các mẫu phức tạp.

– Việc khảo sát thay đổi thành phần pha động cho phù hợp thành phần mẫu

không thể thực hiện nhanh.

– Thời gian phân tích dài nếu muốn tách tốt.

– Nếu trộn trước (khi không có bộ gradient áp suất thấp) thành phần pha

động có thể thay đổi theo thời gian khi để lâu

356.5 PHA ĐỘNG

Ưu và nhược điểm của chế độ Gradient

• Ưu:

–Khả năng tách tốt

–Thành phần pha động khá chính xác, đặc biệt với hệ gradient áp suất cao.

–Có thể thay đổi rất nhiều thành phần trong pha động. Độ chính xác của thành

phần theo thời gian gần như không đổi

–Thời gian phân tích khá ngắn

• Nhược:

–Thiết bị đắt tiền hơn, đặc biệt là hệ gradient áp suất cao

– Độ chính xác của thành phần pha động kém hơn hệ isocratic

–Khi một thành phần có tỉ lệ nhỏ, thành phần pha động sẽ kém chính xác và

không ổn định.

366.5 PHA ĐỘNG

376.6 ĐẦU DÒ (DETECTOR)

Fig. A schematic of a UV-Vis absorbance detector (a)

and a photodiode array (PDA) detector (b)

Fig. (a) Schematic diagram of a fluorescence detector with dual monochromators and a square flow cell. (b) Schematic diagram of a refractive index detector.

386.6 ĐẦU DÒ (DETECTOR)

Fig. Ảnh hưởng của chiều dài cột lên hiệu năng, độ phân giải và độ nhạy

6.7 MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI KHẢ NĂNG TÁCH

39

40


Fig. Hiệu năng cột thay đổi theo kích thước hạt pha tĩnh

41

Fig. The effect of k on resolution in the separation of seven substituted phenols


42

Fig. Steroids. 1, Cortisol; 2, cortisone; 3, 6-OHF; 4, 6-OHE; 5, 20-DHF;

6,20-DHE; 7, prednisolone; 8, prednisone


43

Fig. Selectivity for steroids as a function of organic mobile-phase component

0.1% formic acid as the buffer phase

YMC ODS-AQ column at ambient temperature.

1.5-mL/min

1.2-mL/min

1.5-mL/min


44

Fig. Sự ảnh hưởng của pH pha động


CHƯƠNG 7.

CÁC LOẠI SẮC KÝ LỎNG KHÁC

45

467.1 SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION

N+E- + A- ⇔ N+A- + E-

]][[]][[

−−+

−−+

=AENEANKex


Pha tĩnh được tạo thành từ quá trình copolymer hóa của styrene/divinylbenzene

rồi sau đó được ghép với các nhóm trao đổi cation hoặc anion

trao đổi cation trao đổi cation

Cột trao đổi Cation

Strong Cation Exchange (SCX) (R-SO3-)

Weak Cation Exchange (WCX) (R-COO-)

Cột trao đổi Anion

Strong Anion Exchange (SAX) (R4N+)

Weak Anion Exchange (WAX) (DEAE – diethylaminoethyl)

Sắc ký trao đổi ion (Ion-Exchange Chromatography – IEC)

SP Sulfo propyl Si(CH3)2 - CH2- CH2- CH2- SO3-

CM Carboxymethyl Si(CH3)2-CO2-

DEAE Diethylaminoethyl Si(CH3)2 - CH2-CH2-CH2-NH+ (C2H5)2

SAX Triethylaminopropyl Si(CH3)2-CH2-CH2-CH2-N+(C2H5)3


Những điểm cần lưu ý trong quá trình phân tích bằng IEC:

pH của dung dịch đệm

Nồng độ của dung dịch đệm

Phương pháp rửa giải: đẳng dòng (isocratic), gradient pH, gradient lực ion

497.1 SẮC KÝ TRAO ĐỔI IONVới những ion vô cơ đơn giản, những ion nhỏ hơn như F- và Li+ sẽ có tương tác mạnh với nước nên sẽ ít bị giữ lại trên pha tĩnh.

Pha tĩnh trao đổi cation dạng sulfonate:

Với các ion 1 điện tích, giá trị Kex giảm theo thứ tự sau: Tl+ > Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+ > NH4

+ > Na+ > H+ > Li+

Với các cation 2 điện tích, thứ tự lưu giữ: Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Cd2+ > Cu2+ > Co2+ > Zn2+ > Mg2+ > UO2

2+

Pha tĩnh trao đổi anion dạng ammonium tứ cấp thì giá trị Kex giảm theo thứ tự sau: SO4

2- > CO42- > I- > NO3

- > Br- > Cl- > HCOO- > CH3COO- > OH- > F-

Fig. Tách một vài acid hữu cơ bằng sắc ký trao đổi cation



Fig. Phân tích Protein sử dụng cột trao đổi cation yếu

Fig. Suppression process

Rửa giải cation M+

Đầu dò độ dẫn

Ion sau qt suppressionIon trước qt suppression

Anionic suppressor Cột tách



suppresseur à fibre creuse installé en aval d'une colonne séparatrice anionique

suppresseur à membrane

suppresseur à régénération électrochimique

suppresseur à membrane autorégénérée installé en aval d'une colonne cationique

547.2 SẮC KÝ GHÉP CẶP ION● Sắc ký ghép cặp ion (Ion Pair Chromatography – IPC) được dùng để tách

các ion phân tích trên cột pha đảo

● 1 thuốc thử cặp ion (ion pair reagent) sẽ được thêm vào để điều chỉnh khả

năng lưu giữ trên cột của ion phân tích

● Những thuốc thử IP thông thường: alkylsulphonates, alkylsulphates,

tetraalkylammonium ions etc.

Sulfonate (S‐Series)

ion pair concentrates for anionic separations

S5 (1‐pentylsodiumsulfonate)

S6 (1‐hexylsodiumsulfonate)

S7 (1‐heptylsodiumsulfonate)

S8 (1‐octylsodiumsulfonate)

S12 (1‐dodecylsodiumsulfonate)

CH3CN

CH3OH

Quaternary Amine (Q‐Series)

ion pair concentrates for cationic separations

Q5 (1‐pentyltriethyl‐ammonium phosphate)

Q6 (1‐hexyltriethyl‐ammonium phosphate)

Q7 (1‐heptyltriethyl‐ammonium phosphate)

Q8 (1‐octyltriethyl‐ammonium phosphate)

Q12 (1‐dodecyltriethyl‐ammonium phosphate)

557.2 SẮC KÝ GHÉP CẶP ION

Fig. Mixture of nucleotides resolved by IPC

Flow: 1.5 ml/min

Detection: UV 254 nm

Injection volume: 20 μl

Temperature: ambient

Eluent: acetonitrile: tetrabutylammonium buffer pH 7.0Gradient Buffer concentration: 0,005 M tetrabutyl-ammonium hydrogensulfate (Cat. No 86853)+ 0,01 M Na2HPO4*12H2O (Cat. No 71649).Weigh-in: ~ 4 mg in 10 ml acetonitrile / water 1:9Acetonitrile gradient: t=0: 10%; t=4 min 10%; t=14 min: 25%

Column: DiscoveryTM C18 Column (250 x 4.0 mm) ID, 5 μm

(Cat. No 504971-40)


587.3 SẮC KÝ RÂY PHÂN TỬ

Sắc ký rây phân tử (Size-exclusion chromatography – SEC) dùng để tách các

phân tử polymer hoặc các hợp chất sinh học dựa trên sự khác nhau về kích thước

phân tử.

Có 2 loại SEC:

Sắc ký thẩm thấu gel (Gel Permeation Chromatography – GPC): thường được

sử dụng để tách và xác định trọng lượng các polymer tổng hợp:

Pha tĩnh: phổ biến nhất là polymer của styrene-divinylbenzene

Pha động: là các dung môi hữu cơ như tetrahydrofuranne (THF),

benzene, trichloromethane, trichlorobenzene (dùng cho những polymer

tổng hợp khó tan)

Sắc ký tinh lọc gel (Gel Filtration Chromatography – GFC): thường sử dụng

để tách các polymer sinh học tan trong nước (VD: polysaccharides) hay các đại

phân tử sinh học (VD: protein)

Pha tĩnh: polyhydroxyl hóa các alcools polyvinyl tinh khiết hoặc copolymer

hóa với các polyglyceromethacrylate hay với polyacetate vinyle; ngoài ra

còn có [≡Si(CH2)3–O–CH2CH(OH)CH2OH)]

Pha động: thường là các dung dịch muối.


Fig. Example of a separation of calibration mixture of polystyrene standards


Fig. Separation of proteins on Zorbax GF-250 and GF-450 preparative columns


chromatography ch 5-7

Documents

phn tim mu

dng cho sc

ghp cp ion

silica gel

hp ph

ry phn

hp ph1

qung ng