chromsomal subunites in active genes have an altered conformation
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7/23/2019 Chromsomal Subunites in Active Genes Have an Altered Conformation
1/9
b e e n
e x t e n d e d
t o 5 6 e l e c t r o n s
b y
A .
R o s e n ,
D .
E l l i s ,
B .
F r i c k e ,
a n d
T .
M o r o v i c
[ i n
A b s t r a c t s ,
S e c o n d I n t e r n a t i o n a l
C o n f e r e n c e
o n
I n n e r - S h e U l
I o n i z a t i o n
P h e n o m e n a ,
W.
M e h l h o r n ,
E d .
( U n i v e r s i t y
o f
F r e i b u r g ,
F r e i b u r g , G e r m a n y ,
1 9 7 6 ) ,
p . 1 8 ] .
1 6 . M .
B a r a t ,
i n
T h e
P h y s i c s
o f f
E l e c t r o n i c a n d
A t o m i c
C o l l i s i o n s ,
B .
C . C o b i c
a n d M .
V .
K u -
r e p a ,
E d s .
( I n s t i t u t e o f P h y s i c s ,
B e l g r a d e , Y u g o -
s l a v i a , 1 9 7 3 ) , p .
4 3 ; R .
M c C a r r o l l , i n i b i d . , p .
7 1 .
1 7 . R .
D . E v a n s ,
T h e
A t o m i c
N u c l e u s
( M c G r a w -
H i l l , New
Y o r k , 1 9 5 5 ) ,
p .
8 4 5 .
1 8 . W.
B a m b y n e k ,
B .
C r a s e m a n n ,
R . W.
F i n k ,
H .
V .
F r e u n d ,
H .
M a r k ,
R .
E . P r i c e ,
P .
V .
R a o ,
R e v . M o d .
P h y s . 4 4 ,
7 1 6 ( 1 9 7 2 ) .
1 9 .
C .
K . D av i s
a n d
J .
S .
G r e e n b e r g ,
P h y s .
R e v .
L e t t . 3 2 ,
1 2 1 5
( 1 9 7 4 ) ;
T . K .
S a y l o r , p e r s o n a l
com-
m u n i c a t i o n .
2 0 .
W.
E . M e y e r h o f , T . K . S a y l o r ,
S .
M .
L a z a r u s ,
A .
L i t t l e ,
B . B .
T r i p l e t t ,
L . F .
C h a s e ,
J r . , R .
A n h o l t ,
P h y s .
R e v .
L e t t .
3 2 , 1 2 7 9
( 1 9 7 4 ) .
2 1 .
H .
D .
B e t z ,
F .
B e l l ,
H .
P a n k e ,
W.
S t e h l i n g ,
E .
S p i n d l e r ,
M .
K l e b e r ,
i b i d .
3 4 ,
1 2 5 6
( 1 9 7 5 ) .
2 2 .
K .
S m i t h ,
B .
M u l l e r ,
W.
G r e i n e r ,
J .
P h y s .
B
8 . 7 5 ( 1 9 7 5 ) .
2 3 . B .
M u l l e r ,
i n
T h e
P h y s i c s o f
E l e c t r o n i c a n d
A t o m i c C o l l i s i o n s , J . S .
R i s l e y
a n d R .
G e b a l l e ,
E d s . ( U n i v .
o f
W a s h i n g t o n
P r e s s , S e a t t l e ,
1 9 7 5 ) ,
p . 4 8 1 .
2 4 . W. E . M e y e r h o f ,
P h y s .
R e v .
L e t t .
3 1 ,
1 3 4 1
( 1 9 7 3 ) ;
K .
T a u l b j e r g ,
J . V a a b e n ,
B .
F a s t r u p ,
P h y s . R e v .
A
1 2 ,
2 3 2 5
( 1 9 7 5 ) .
2 5 . W. R .
T h o r s o n
a n d S .
H .
C h o i ,
i n
A b s t r a c t s ,
9 t h
I n t e r n a t i o n a l
C o n f e r e n c e
o n
t h e
P h y s i c s
o f
E l e c t r o n i c
a n d
A t o m i c
C o l l i s i o n s ,
J . S .
R i s l e y
a n d '
R .
G e b a l l e ,
E d s .
( U n i v .
o f
W a s h i n g t o n
P r e s s ,
S e a t t l e , 1 9 7 5 ) ,
p .
2 9 8 ;
p e r s o n a l
c o m m u n i -
c a t i o n .
2 6 . K .
S m i t h
a n d W.
G r e i n e r ,
J .
P h y s .
B , i n p r e s s .
2 7 .
J .
S .
B r i g g s ,
i b i d .
7 ,
4 7
( 1 9 7 4 ) .
2 8 .
J .
H .
M a c e k
a n d J . S .
B r i g g s , i b i d . ,
p .
1 3 1 2 .
2 9 .
W.
L i c h t e n , P h y s .
R e v .
A
9 ,
1 4 5 8
( 1 9 7 4 ) .
3 0 . J .
S . B r i g g s , J .
P h y s .
B ,
i n
p r e s s .
3 1 .
R .
A n h o l t , u n p u b l i s h e d
r e s u l t s .
3 2 . D .
H .
J a k u b a s s a
a n d
M .
K l e b e r ,
Z .
P h y s .
A
2 7 3 ,
2 9 ( 1 9 7 5 ) .
3 3 .
K .
A l d e r ,
A .
B o h r ,
T .
H u u s ,
B .
M o t t e l s o n ,
A .
W i n t h e r R e v .
M o d .
P h y s . 2 8 ,
4 3 2
( 1 9 5 6 ) ;
J .
R e i n h a r d t ,
G . S o f f ,
W. G r e i n e r ,
Z .
P h y s . A
2 7 6 ,
2 8 5
( 1 9 7 6 ) ;
H . P .
T r a u t v e t t e r ,
J .
S .
G r e e n b e r g ,
P .
V i n c e n t , P h y s .
R e v . L e t t . 3 7 ,
2 0 2
( 1 9 7 6 ) .
3 4 .
F . B e l l , H .
D .
B e t z ,
H .
P a n k e ,
E .
S p i n d l e r , W.
S t e h l i n g ,
M .
K l e b e r ,
i b i d . 3 S ,
8 4 1
( 1 9 7 5 ) .
3 5 .
W .
E . M e y e r h o f , T . K . S a y l o r ,
R . A n h o l t ,
P h y s .
R e v . A
1 2 ,
2 6 4 1
( 1 9 7 5 ) .
3 6 . P .
H .
M o k l e r ,
P .
A r m b t t u s t e r , F .
F o l k m a n ,
S .
H a g m a n n ,
G .
K r a f t ,
H .
J . S t e i n ,
i n T h e
P h y s i c s
o f
E l e c t r o n i c a n d A t o m i c
C o l l i s i o n s ,
J .
S .
R i s l e y
a n d
R . G e b a l l e ,
E d s .
( U n i v .
o f W a s h i n g t o n
P r e s s ,
S e a t t l e ,
1 9 7 5 ) ,
p .
5 0 1 ; F .
F o l k m a n n ,
P .
A r m b r u s t e r ,
S .
H a g m a n n , G . K r a f t ,
P .
H .
M o k -
l e r ,
H . J .
S t e i n , Z .
P h y s . A 2 7 6 ,
1 5 ( 1 9 7 6 ) .
3 7 . B .
M u l l e r ,
R .
K . S m i t h , W.
G r e i n e r , P h y s .
L e t t .
B
4 9 , 2 1 9
( 1 9 7 4 ) ; B . M u l l e r
a n d W.
G r e i n e r ,
P h y s .
R e v . L e t t . 3 3 , 4 6 9
( 1 9 7 4 ) ;
M .
G r o s ,
B .
M u l l e r , W.
G r e i n e r , J . P h y s . B ,
i n
p r e s s .
3 8 .
J .
S .
G r e e n b e r g , C . K .
D a v i s ,
P .
V i n c e n t ,
P h y s .
R e v . L e t t .
3 3 , 4 7 3 ( 1 9 7 4 ) .
3 9 .
W.
W o e l f l i ,
C .
S t o l l e r ,
G .
B o n a n i , M . S u t e r ,
M .
S t o e c k l i ,
L e t t .
Nuovo C i m e n t o 1 4 ,
5 7 7
( 1 9 7 5 ) ;
W.
W o e i f l i ,
C .
S t o l l e r ,
G .
B o n a n i ,
M .
S t o e c k l i ,
M .
S u t e r ,
P h ys . R e v .
L e t t .
3 6 , 3 0 9
( 1 9 7 6 ) .
4 0 .
R .
K .
S mi th , p a p e r
p r e s e n t e d
a t t h e
F o u r t h
I n t e r n a t i o n a l S e m i n a r
o n I o n - A t o m
C o l l i s i o n s ,
S t a n f o r d U n i v e r s i t y ,
1 9 7 5 ;
a n d
W.
G r e i -
n e r ,
i n
p r e p a r a t i o n .
4 1 . F .
F o l k m a n n , C .
G a a r d e ,
T . H u u s ,
K .
K e m p ,
N u c l .
I n s t r u m .
M e t h o d s
1 1 7 , 4 8 7 ( 1 9 7 4 ) .
4 2 . R e c e n t
p u b l i c a t i o n s , i n w h i c h e a r l i e r
r e f e r e n c e s
c a n
b e
f o u n d , a r e : A .
R .
S o h v a l ,
J . P .
D e l v a i l l e ,
K . K a l a t a , K .
K i r b y -D o c k en , H . W.
S c h n o p p e r ,
J .
P h y s . B 9 , L 2 5
( 1 9 7 6 ) ; i b i d . , p .
4 7 ;
H .
D .
B e t z ,
M .
K l e b e r , E .
S p i n d l e r , F . B e l l , H .
P a n k e ,
W.
S t e h l i n g , i n T h e P h y s i c s
o f E l e c t r o n i c a n d
A t o m i c C o l l i s i o n s ,
J .
S . R i s l e y a n d
R .
G e b a l l e ,
E d s . ( U n i v . o f W a s h i n g t o n
P r e s s , S e a t t l e ,
1 9 7 5 ) ,
p . 5 2 0 .
4 3 .
P . G i p p n e r ,
J o i n t
I n s t .
N u c l . R e s .
D u b n a
P u b l .
N o . E - 7 8 8 4 3
( 1 9 7 5 ) .
4 4 .
K .
H .
K a u n ,
i n
P r o c e e d i n g s
o f
t h e
S e c o n d
I n t e r -
n a t i o n a l
C o n f e r e n c e o n I n n e r - S h e l l
I o n i z a t i o n
P k e n o m e n a ,
W.
M e h l h o r n ,
E d .
( U n i v e r s i t y
o f
F r e i b u r g ,
F r e i b u r g , G e r m a n y , i n p r e s s ) .
4 5 .
K . H .
H e i n i g ,
H . U . J a g e r ,
H .
R i c h t e r , H .
W o i t t e n n e k ,
P h y s .
L e t t . B
6 0 ,
2 4 9 ( 1 9 7 6 ) .
4 6 .
W .
R .
S t o t t
a n d J .
C .
W a d d i n g t o n ,
B u l l . Am .
P h y s . S o c .
2 0 ,
6 3 8
( 1 9 7 5 ) ;
R . A n h o l t a n d T . K .
S a y l o r ,
L a w r e n c e B e r k e l e y
L a b . R e p . N o . L B L -
4 0 6 6
( 1 9 7 5 ) .
4 7 .
W.
E .
M e y e r h o f ,
T .
K .
S a y l o r , S .
M .
L a z a r u s ,
A .
L i t t l e , B .
B .
T r i p l e t t ,
L . F .
C h a s e , J r . , R .
A n h o l t ,
u n p u b l i s h e d r e s u l t s .
4 8 .
W. E .
M e y e r h o f , P h y s .
R e v . A
1 0 ,
1 0 0 5 ( 1 9 7 4 ) .
4 9 .
J . S .
G r e e n b e r g ,
p e r s o n a l
c o m m u n i c a t i o n .
5 0 .
B .
F r i c k e a n d
G .
S o f f , G e s .
S c h w e r i o n e n f o r s c h .
R e p . N o . G S I - T 1 - 7 4
( 1 9 7 4 ) ; B . F r i c k e ,
G e s .
S c h w e r i o n e n f o r s c h . R e p . N o .
G S 1 - 7 3 - 1 1
( 1 9 7 3 ) ,
p . 8 8 .
5 1 .
G .
B i s s i n g e r a n d L . F e l d m a n ,
P h y s . R e v . A
8 ,
1 6 2 4
( 1 9 7 3 ) ;
P hy s. R e v. L e t t . 3 3 , 1 ( 1 9 7 4 ) ; J . A .
C a i r n s
a n d L . C .
F e l d m a n ,
i n
New
U s e s
o f
Lo w
E n e r g y A c c e l e r a t o r s ,
J . F .
Z i e g l e r ,
E d .
P l e -
n u m ,
New
Y o r k ,
i n
p r e s s ) .
5 2 .
R . K .
S m i t h ,
B .
M U l l e r ,
W.
G r e i n e r , J .
S .
G r e e n -
b e r g ,
C .
K .
D a v i s ,
P h y s .
R e v . L e t t .
3 4 ,
1 3 4
( 1 9 7 5 ) . T h e e x p e r i m e n t a l e f f e c t
a p p e a r s t o
b e
s p u n i o u s .
S e e
W.
W o e l f f i ,
C .
S t o l l e r ,
G .
B o n a n i ,
M .
S u t e r ,
M.
S t o e c k l i , i b i d .
3 5 ,
6 5 6
( 1 9 7 5 ) .
5 3 .
D .
B u r c h ,
W. B .
I n g a l l s ,
H .
W i e m a n ,
R .
V a n -
d e n b o s c h ,
i n
A b s t r a c t s ,
9 t h
I n t e r n a t o n a l
C o n -
f e r e n c e
on t h e
P h y s i c s
o f
E l e c t r o n i c a n d A t o m i c
C o l l i s i o n s ,
J .
S .
R i s l e y
a n d
R .
G e b a l l e ,
E d s .
( U n i v .
o f
W a s h i n g t o n
P r e s s , S e a t t l e , 1 9 7 5 ) ,
p .
3 0 6 ; R .
S c h u l e ,
H .
S c h m i d t - B o c k i n g ,
I .
T s e r r u y a ,
G .
G a u k l e r , K .
B e t h g e ,
i n
i b i d . ,
p .
3 0 4 ;
1 .
T s e r r u y a ,
H .
S c h m i d t - B o c k i n g ,
R .
S c h u l e ,
K .
B e t h g e ,
R .
S c h u c h ,
H . J .
S p e c h t ,
P hy s. R e v .
L e t t . ,
i n
p r e s s ;
F .
J u n d t ,
G .
G u i l -
l a u m e ,
P .
F i n t z ,
K .
U .
J o n e s , P h y s .
R e v .
A
1 3 ,
5 6 3
( 1 9 7 6 ) .
5 4 .
B .
M u l l e r ,
J .
R a f e l s k i ,
W.
G r e i n e r ,
P h y s . L e t t .
B .
4 7 ,
5
( 1 9 7 3 ) .
5 5 . B . M u l l e r a n d W.
G r e i n e r , Z .
N a t u r f o r s c h .
T e i l
A
3 1 ,
1 ( 1 9 7 6 ) .
5 6 .
S . S .
G e r s h t e i n
a n d
V . S .
P o p o v , L e t t . Nuovo
C i m e n t o
6 ,
5 9 3
( 1 9 7 3 ) ;
H .
P e i t z ,
B .
M u l l e r ,
J .
R a f e l s k i ,
W.
G r e i n e r ,
i b i d .
8 ,
3 7
( 1 9 7 3 ) .
5 7 .
K .
S m i t h ,
H .
P e i t z ,
B . M u l l e r W.
G r e i n i e r ,
P h y s .
R e v . L e t t .
3 2 ,
5 5 4
( 1 9 7 4 ) .
5 8 . D .
B u r c h ,
W.
B . I n g a l l s ,
H .
W i e m a n ,
R .
V a n -
d e n b o s c h , P h y s .
R e v .
A
1 0 , 1 2 4 5
( 1 9 7 4 ) .
5 9 . C .
F o s t e r ,
T .
H o o g k a m e r , P . W o r l e e , F . W.
S a r i s ,
i n
A b s t r a c t s ,
9 t h I n t e r n a t i o n a l
C o n f e r -
e n c e o n t h e
P h y s i c s
o f
E l e c t r o n i c a n d A t o m i c
C o l l i s i o n s ,
J .
S .
R i s l e y
a n d R .
G e b a l l e ,
E d s .
( U n i v .
o f
W a s h i n g t o n P r e s s ,
S e a t t l e , 1 9 7 5 ) ,
p .
5 l
1 ;
J .
P h y s . B ,
i n
p r e s s .
6 0 .
3 . R a f e i s k i ,
B .
M u l l e r ,
R .
A n h o l t ,
p e r s o n a l
c o m m u n i c a t i o n s ;
W.
B e t z ,
G .
S o f f ,
B .
M U l l e r ,
W.
G r e i n e r , i n
p r e p a r a t i o n .
6 1 .
S y s t e m a t i c s e s t a b l i s h e d
i n W.
E . -
M e y e r h o f , R .
A n h o l t , T .
K .
S a y l o r , P . D . Bond
[ P h y s .
R e v . A
1 1 , 1 0 8 3
( 1 9 7 5 ) ]
l e a d t o
o K
-3
X
1 0 - 2 5
c m 2 .
From
( 1 8 ) ,
r K
=
7
x
1 0 - 1 8
s e c .
F o r 1 6 0 0 - M e v
U ,
v ,
= 4
x
1 0 9
c m / s e c ,
a n d f o r
U ,
n = 4 . 7 x
1 0 2 2 c m M 3 .
6 2 . V . O b e r a c k e r , G .
S o f f , W.
G r e i n e r , N u c l .
P h y s .
A
2 S 9 ,
3 2 4
( 1 9 7 6 ) .
6 3 . P . A r m b r u s t e r , i n
P r o c e e d i n g s o f t h e S e c o n d
I n t e r n a t i o n a l
C o n f e r e n c e
o n I n n e r - S h e l l
I o n i z a -
t i o n
P h e n o m e n a ,
W. M e h lh o r n, E d .
( U n i v e r s i t y
o f
F r e i b u r g , F r e i b u r g ,
G e r m a n y ,
i n
p r e s s ) .
6 4 .
E n l i g h t e n i n g
d i s c u s s i o n s
w i t h R . A n h o l t a r e
g r a t e f u l l y
a c k n o w l e d g e d . T h i s
w o r k w a s
p a r t l y
s u p p o r t e d
b y
t h e
N a t i o n a l S c i e n c e
F o u n d a t i o n .
K n o w l e d g e
o f t h e
s t r u c t u r e
o f
DNA
h a s
p r o v i d e d
many
i n s i g h t s
i n t o
i t s
b i o -
l o g i c a l
f u n c t i o n
( 1 ) .
I n
h i g h e r c e l l s ,
a
d e t a i l e d
u n d e r s t a n d i n g
o f t h e s t r u c t u r e
o f c h r o m a t i n
w i l l
p r o b a b l y p r o v i d e
a n a l o -
g o u s
i n s i g h t s
i n t o
how
g e n e s
a r e
r e g u l a t -
e d .
A l r e a d y ,
t h e r e a r e
a n u m b e r
o f
i m p o r -
t a n t
o b s e r v a t i o n s
d e m o n s t r a t i n g
a r e l a -
8 4 8 )
t i o n b e t w e e n t h e
s t r u c t u r e o f c h r o m a t i n
a n d
i t s
b i o l o g i c a l a c t i v i t y
2 , 3 ) .
T h e
p a c k a g i n g
o f
m o s t o f
t h e n u c l e a r
DNA i s
n o w
t h o u g h t
t o
b e
b a s e d
o n
r e p e a t i n g
u n i t s
o f a b o u t 1 8 0
t o
2 0 0
b a s e
p a i r s
o f
DNA
a s s o c i a t e d
w i t h
s p e c i f i c
c o m p l e x e s
o f h i s t o n e s
4 , 5 ) ,
p o s s i b l y
t w o
s e l f - c o m p l e m e n t a r y t e t r a m e r s e a c h
c o n t a i n i n g
o n e o f
t h e
f o u r
m a j o r
h i s t o n e s
6 ) .
T h e s e t w o t e t r a m e r s
c o u l d
d e f i n e
t h e t w o f o l d
a x i s o f
s y m m e t r y
w i t h i n
t h e
n u c l e o s o m e .
T h e s e
c o m p l e x e s
i n t e r a c t
t h r o u g h
7 0 t o 9 0
a m i n o a c i d r e s i d u e s
a t
t h e i r
c a r b o x y l
t e r m i n a l e n d t o
p r o d u c e
a
t i g h t , t r y p s i n - r e s i s t a n t
c o r e
7 ) .
T h e
p o s i -
t i v e l y
c h a r g e d
h i s t o n e
a m i n o t e r m i n a l
r e s i d u e s
e x t e n d
o u t w a r d f r o m
t h i s c o r e
a n d
d e f i n e w h a t
m ay
p r o v e
t o b e
a
k i n k e d
o r
c o i l e d
p a t h w a y
f o r
t h e
DNA
5 , 8 )
a b o u t
t h e
h i s t o n e
c o m p l e x e s .
T h e s e
s o - c a l l e d
p a r t i c l e s - o n - a - s t r i n g
o r
n u
b o d i e s c o n s t i t u t e
t h e
p r i m a r y
l e v e l
o f
f o l d i n g
f o r
t h e
b u l k o f
t h e
c h r o m o s o m e .
T h r o u g h
t h e i r m u t u a l
i n t e r -
a c t i o n s
h i g h e r
l e v e l s
o f
DNA
p a c k a g i n g
c a n
b e
a c h i e v e d , a l t h o u g h
d e t a i l s o f
t h i s
o r g a n i z a t i o n
a r e n o t k n o w n . A t
p r e s e n t
t h e r e i s n o
p r o o f
t h a t
n u b o d i e s
a r e
h o m o -
D r . W e i n t r a u b i s a n a s s i s t a n t
p r o f e s s o r
i n
t h e
D e p a r t m e n t
o f
B i o c h e m i c a l
S c i e n c e s ,
F r i c k
L a b o r a -
t o r i e s ,
P r i n c e t o n
U n i v e r s i t y , P r i n c e t o n ,
New
J e r s e y
0 8 5 4 0 . D r .
G r o u d i n e
wa s a
v i s i t i n g
f e l l o w
i n
t h e
s a m e
d e p a r t m e n t
a n d
i s n o w a t
t h e
D e p a r t m e n t
o f
R a d i a t i o n
O n c o l o g y ,
U n i v e r s i t y
o f
W a s h i n g t o n
H o s p i t a l ,
S e a t t l e
9 9 8 0 5 .
SCIENCE,
VOL. 1 9 3
C h r o m o s o m a l
S u b u n i t s
i n
A c t i v e
G e n e s
H a v e a n
A l t e r e d
C o n f o r m a t i o n
G l o b i n
g e n e s
a r e
d i g e s t e d
b y
d e o x y r i b o n u c l e a s e
I
i n
r e d b l o o d
c e l l
n u c l e i
b u t n o t i n f i b r o b l a s t
n u c l e i .
H a r o l d W e i n t r a u b
a n d Mark
G r o u d i n e
-
7/23/2019 Chromsomal Subunites in Active Genes Have an Altered Conformation
2/9
g e n e o u s
( 9 )
e i t h e r i n c o m p o s i t i o n
o r
i n
c o n f o r m a t i o n .
A l s o
l a c k i n g i s
c o n c r e t e
e v i d e n c e
t h a t n u
b o d i e s
a r e
a s s o c i a t e d
w i t h
a c t i v e g e n e s ( 1 0 )
a n d , i f s o ,
w h e t h e r
t h e y
a r e
i n
t h e s a m e
c o n f o r m a t i o n
a s
t h o s e
n u
b o d i e s
a s s o c i a t e d
w i t h
i n a c t i v e
g e n e s .
T l h e
i m p o r t a n t
f i n d i n g t h a t
E s c h e -
r i c h i a c o l i
RNA
p o l y m e r a s e p r e f e r e n -
t i a l l y t r a n s c r i b e s
g l o b i n
g e n e s
f r o m r e t i c -
u l o c y t e c h r o m a t i n
b ut n o t
f r o m l i v e r
o r
b r a i n
c h r o m a t i n
( 1 1 ) r e f l e c t s
t h e
f a c t t h a t
s o m e s t r u c t u r a l
a s p e c t o f a n a c t i v a t e d
g e n e
i s d i f f e r e n t
i n
d i f f e r e n t
t i s s u e s .
How-
e v e r ,
w h e t h e r
t h i s d i f f e r e n c e
o c c u r s
o n l y
a t
t h e 5 '
e n d o f
t h e
g e n e , p e r h a p s a t
a
p r o m o t o r r e g i o n ,
o r
t h r o u g h o u t
t h e e n -
t i r e
l e n g t h o f
t h e g e n e
i s n o t
k n o w n .
S i m i l a r l y ,
i t i s
n o t
c l e a r w h e t h e r
t h e
t i s -
s u e - s p e c i f i c
d i f f e r e n c e s
i n a c c e s s i b i l i t y
r e v e a l e d b y
RNA p o l y m e r a s e
a r i s e
f r o m
d i f f e r e n c e s
i n
t h e
b a s i c n u b o d y c o n f i g u -
r a t i o n
o r
i n
t h e
wa y
s o m e
o r
a l l
o f t h e
n u
b o d i e s
i n a t r a n s c r i p t i o n
u n i t
a r e
p a c k -
a g e d
i n t o
h i g h e r
l e v e l s
o f
o r g a n i z a t i o n .
I n t h i s a r t i c l e ,
we
s h o w t h a t a c t i v e
g e n e s
a r e l i k e l y
t o
b e
p a c k a g e d
b y
h i s -
t o n e s
b u t
t h a t
t h e s e
h i s t o n e s a r e
i n a i n
a l t e r e d c o n f o r m a t i o n ,
o n e
t h a t r e n d e r s
t h e a s s o c i a t e d
DNA e x t r e m e l y s e n s i t i v e
t o
d i g e s t i o n b y
p a n c r e a t i c
d e o x y r i b o n u -
c l e a s e
I .
D i g e s t i o n
o f
C h i c k e n
E r y t h r o c y t e
N u c l e i
b y
D e o x y r i b o n u c l e a s e
I
T h e
k i n e t i c s
o f
d i g e s t i o n
o f
c h i c k e n
e r y t h r o c y t e
n u c l e i
b y p a n c r e a t i c
d e o x y r i -
b o n u c l e a s e
I
( 1 2 )
a r e
s h o w n
i n F i g .
1 .
T h e b o t t o m
i n s e t s s h o w
t h e
c o r r e s p o n d -
i n g
p a t t e r n s
o f
r e s i s t a n t s i n g l e - s t r a n d e d
DNA f r a g m e n t s
d i s p l a y e d
o n
a
d e n a t u r -
i n g a c r y l a m i d e
g e l . T h e k i n e t i c s
r e v e a l a
r a p i d i n i t i a l
d i g e s t i o n
o f a b o u t
1 5
p e r c e n t
o f t h e
DNA
f o l l o w e d
b y
a
s l o w e r
d i g e s -
t i o n t h a t
l e v e l s o f f a t
a b o u t 5 0 p e r c e n t ,
a n d a n
e v e n s l o w e r
p r o c e s s t h a t
l e a d s
t o
d i g e s t i o n
b e y o n d 5 0
p e r c e n t .
T h e c h a r a c -
t e r i s t i c
p a t t e r n o f
r e s i s t a n t
p r o d u c t s
( b e -
t w e e n 2 0
a n d
1 6 0 b a s e s
i n
o u r s t a n d a r d
g e l s ) a p p e a r s
v e r y
e a r l y
i n
d i g e s t i o n
a n d
p e r s i s t s
t h r o u g h
5 0 p e r c e n t
d i g e s t i o n
w i t h
n o
a p p a r e n t
i n c r e a s e
o r d e c r e a s e
i n
t h e i n t e n s i t y
o f
a n y o n e p a r t i c u l a r
b a n d .
B e y o n d 5 0 p e r c e n t
d i g e s t i o n , t h e
l a r g e r
b a n d s d i s a p p e a r
b e f o r e
t h e
s m a l l e r
b a n d s d o .
T h i s
d i s a p p e a r a n c e
i s a c c o m -
p a n i e d b y
a n
a c c u m u l a t i o n
o f
DNA
b e -
t w e e n
t h e
u s u a l l y
w e l l d e f i n e d
DNA
p e a k s .
W e
i n t e r p r e t
t h i s
t o mean
t h a t
t h e
e n z y m e
i s
s e q u e n t i a l l y
d i g e s t i n g
a
b a s e
o r
t w o
a t a t i m e w h e n
d i g e s t i o n p r o c e e d s
b e y o n d 5 0
p e r c e n t ,
a n d t h a t t h i s p h a s e
o f
t h e
d i g e s t i o n
p r o c e s s p r o b a b l y
r e p r e -
s e n t s
n i b b l i n g
( d i g e s t i o n
o f
a
b a s e
a t
a
t i m e )
t h a t
o c c u r s
i n DNA r e g i o n s
t h a t
a r e i n t i m a t e l y
p r o t e c t e d
b y
p r o t e i n s ,
p r e -
s u m a b l y h i s t o n e s .
I n
c o n t r a s t ,
t h e
r e p e a t -
i n g p a t t e r n
o f d e n a t u r e d
DNA
f r a g m e n t s
b e t w e e n
2 0
a n d
1 6 0 b a s e s
p r o b a b l y
r e p r e -
s e n t s
t h e c u t t i n g
a t v e r y
a c c e s s i b l e r e -
g i o n s b e t w e e n
a n d
w i t h i n i n d i v i d u a l n u
b o d i e s .
I t
i s
n o t c l e a r
t o
u s
wh y t h e l a r g e r
f r a g m e n t s
f a i l
t o b r e a k d o w n
i n t o t h e
s m a l l e r
o n e s
b e f o r e
d i g e s t i o n
r e a c h e s
5 0
p e r c e n t
a n d
n i b b l i n g
e n s u e s .
T h e
c o n -
v e r s i o n o f
l a r g e r f r a g m e n t s
i n t o s m a l l e r
o n e s
w o u l d
h a v e b e e n
p r e d i c t e d
i f
t h e
f r a g m e n t s
a r o s e
f r o m
t h e
s t a t i s t i c a l
c l e a v a g e
o f
a
n u m b e r o f
a c c e s s i b l e s i t e s
w i t h i n
a
h o m o g e n e o u s
p o p u l a t i o n
o f
n u
b o d i e s .
T i s s u e - S p e c i f i c ,
P r e f e r e n t i a l
D i g e s t i o n
o f A c t i v e
G e n e s
S t a p h y l o c o c c a l
n u c l e a s e
s h o w s
n o
p r e f e r e n t i a l d i g e s t i o n
o f
s p e c i f i c n u c l e a r
DNA s e q u e n c e s ,
i n
p a r t i c u l a r
s e q u e n c e s
c o d i n g
f o r
a c t i v e g e n e s
( 1 3 ) .
S i n c e i t
i s
c l e a r
t h a t
p a n c r e a t i c d e o x y r i b o n u c l e a s e
h a s
a m u c h h i g h e r
a f f i n i t y
f o r s i t e s
w i t h i n
n u b o d i e s ,
a n d h e n c e
m i g h t
b e e x p e c t e d
t o
d i f f e r e n t i a t e
b e t w e e n
s i m i l a r
n u b o d -
i e s ,
we d e c i d e d
t o
i n v e s t i g a t e
w h e t h e r
p a n c r e a t i c
d e o x y r i b o n u c l e a s e
p r e f e r e n -
t i a l l y
d i g e s t e d
t h e
DNA
c o d i n g
f o r a c t i v e
g e n e s .
T h e r e
a r e
a
n u m b e r
o f
i n d i c a t i o n s
t h a t t h i s m i g h t
b e
o c c u r r i n g
d u r i n g t h e
d i g e s t i o n
o f
n u c l e i
w i t h
t h i s e n z y m e .
W e
h a v e
s h o w n t h a t r i b o s o m a l
DNA i n n u -
c l e i i s e s p e c i a l l y
s e n s i t i v e
t o
d e o x y r i -
b o n u c l e a s e
( 1 4 ) ; i n a d d i t i o n ,
B i l l i n g
a n d
B o n n e r ( 1 5 )
h a v e
s h o w n
t h a t RNA l a -
b e l e d f o r
a s h o r t p e r i o d
i s r a p i d l y
r e -
l e a s e d
o n
m i l d
d i g e s t i o n
o f
n u c l e i
w i t h
e i t h e r
d e o x y r i b o n u c l e a s e
I
o r
I I .
F i n a l l y ,
B e r k o w i t z
a n d D o t y ( 1 6 )
h a v e s h o w n
t h a t
a p u t a t i v e a c t i v e
f r a c t i o n
o f s h e a r e d
c h r o m a t i n ( i s o l a t e d
a s
a
s l o w - s e d i m e n t -
i n g f r a c t i o n
o n s u c r o s e
g r a d i e n t s )
i s
much
m o r e
s e n s i t i v e
t o d e o x y r i b o n u -
c l e a s e
I
t h a n i s
b u l k c h r o m a t i n .
To
i n v e s t i g a t e
t h i s q u e s t i o n
f u r t h e r ,
we
h a v e p r e p a r e d
a c o m p l e m e n t a r y
DNA
(cDNA)
p r o b e
t o g l o b i n m e s s e n g e r
RNA
(mRNA)
i s o l a t e d
f r o m t h e r e t i c u l o -
c y t e s
o f t h e
a d u l t c h i c k e n .
T h e
d e t a i l s
o f
t h e
p u r i f i c a t i o n
a n d a n a l y s i s
a n d t h e
c h a r -
a c t e r i s t i c s
o f
t h e
c D NA
h a v e
p r e v i o u s l y
b e e n
d e s c r i b e d
( 1 7 ) ; i n
p a r t i c u l a r
i t
h a s
b e e n
d e m o n s t r a t e d
t h a t
t h e c D N A
m a d e
t o a d u l t g l o b i n
mRNA c a n b e
u s e d t o
d e t e c t
g l o b i n
mRNA
c o d i n g
f o r e m b r y o n -
F i g .
1 .
D i g e s t i o n
o f
c h i c k
e r y t h r o c y t e
n u c l e i
w i t h
p a n c r e a t i c
d e o x y r i -
1 0 0 4
i 1 0 0
b o n u c l e a s e
I .
( C u r v e s )
A v i a n r e d
b l o o d
c e l l s
w e r e
i s o l a t e d
a s
d e -
s c r i b e d
( 1 7 ) .
T h e c e l l s
w e r e w a s h e d
t w i c e
i n
p h o s p h a t e - b u f f e r e d
s a l i n e ( P B S )
( G r a n d
I s l a n d ) ,
a n d t h e n u c l e i
w e r e
i s o l a t e d
b y s u s p e n -
s i o n i n
r e t i c u l o c y t e
s t a n d a r d
b u f f e r
( R S B ) ( 0 . O l M
t r i s - H C l , pH
7 . 4 ;
80
_
8 0
0 . O l M
N a C l ;
3 mM
M g C l 2 ) c o n t a i n i n g
0 . 5
p e r c e n t
N P - 4 0
( B r i t i s h
D r u g
*
A d d i t i o n o l
H o u s e ) .
T h e
n u c l e i w e r e
w a s h e d s e v e r a l
t i m e s
i n RSB
a n d
t h e n
D N a s e
d i g e s t e d
a t
a
DNA
c o n c e n t r a t i o n
o f 1
m g / m l
a t
3 7 C
w i t h
p a n c r e a t i c
Z
60
-
60
d e o x y r i b o n u c l e a s e
I
( S i g m a )
( 2 0
, g / m l )
f o r
i n c r e , a s i n g
p e r i o d s
o f
t i m e .
Z
T h e p e r c e n t a g e
o f
DNA
r e m a i n i n g
(
-
* )
wa s
d e t e r m i n e d
e i t h e r
b y
p r e c i p i t a t i o n
w i t h
c o l d
7
p e r c e n t p e r c h l o r i c
a c i d
a n d
s u b s e q u e n t 2 w
m e a s u r e m e n t
o f
t h e
a b s o r b a n c y
a t 2 6 0 n m o f
t h e
a c i d s o l u b l e
a n d
a :
40
4 0
i n s o l u b l e
f r a c t i o n o r b y
s e d i m e n t i n g
t h e n u c l e i
a t
l o w
s p e e d
a n d
c
m e a s u r i n g
t h e
r e l e a s e o f m a t e r i a l
a b s o r b i n g
a t 2 6 0
n m . E i t h e r m e t h o d
Z
g a v e e s s e n t i a l l y
t h e
s a m e r e s u l t s .
A d d i t i o n o f f r e s h d e o x y r i b o n u -
20
2 0
c l e a s e ( 2 0
p g / m l )
w h e n
t h e d i g e s t i o n
b e g i n s
t o l e v e l
o f f
( a t
a b o ut 5 0
F
2 0
p e r c e n t )
d o e s n o t a f f e c t t h e
c o u r s e o f
s u b s e q u e n t d i g e s t i o n .
(A-A)
T h e t i m e c o u r s e o f
d i g e s t i o n
a n d t h e
p a t t e r n
o f
r e s i s t a n t
f r a g m e n t s
( s e e
b e l o w )
i s
t h e s a m e
i n
c h r o m a t i n i s o l a t e d
e i t h e r
b y
s o n i c a t i o n o r
0 0 2 0 4 0
6 0
8 0 1 0 0 1 2 0
0
b y
m i l d t r e a t m e n t
w i t h n u c l e a s e .
S u b s t i t u t i o n
o f
C a C l 2 f o r
M g C l 2
a l s o
minutes)
d i d n o t
a f f e c t t h e
c o u r s e
o f d i g e s t i o n
o r p a t t e r n
o f r e s i s t a n t f r a g -
TIME
( m i n u t e s )
m e n t s . ( E l e c t r o p h o r e t i c
p a t t e r n s )
T h e
d e o x y r i b o n u c l e a s e - r e s i s t a n t
DNA
w a s
o b t a i n e d
f r o m t h e
s e d i m e n t e d
n u c l e i a t i n t e r v a l s
d u r i n g t h e
d i g e s -
t i o n .
T h e
f o l l o w i n g
w e r e
a d d e d
t o t h e n u c l e a r p e l l e t ( f i n a l
c o n c e n t r a t i o n ) E D T A
( 1 0
m M ) , s o d i u m d o d e c y l
s u l f a t e
( S D S ) ( 0 . 1
p e r c e n t ) ,
a n d
p r o t e a s e
( A l d r i c h )
( 5 0 0 , u g / m l ) .
T h e
m i x t u r e w a s
i n c u b a t e d f o r
6 0 m i n u t e s
a t 3 7 C ,
b o i l e d f o r
5
m i n u t e s ,
a d d e d
d i r e c t l y t o
s a m p l e b u f f e r
( 5 0 p e r -
c e n t
g l y c e r o l ,
0 . 0 1
p e r c e n t
b r o m p h e n o l
b l u e ) ,
a n d
l o a d e d
o n t o
a 6 p e r c e n t a c r y l a m i d e
s l a b g e l
c o n t a i n i n g
9 8 p e r c e n t
f o r m a m i d e
a n d
2 0
m M
s o d i u m
p h o s p h a t e
a t
pH
7 . 0 . E l e c t r o p h o r e s i s w a s
c o n d u c t e d f o r
5 h o u r s a t
1 6 0 v o l t s i n
a r u nn i ng
b u f f e r c o n t a i n i n g
2 0
mM
s o d i u m
p h o s p h a t e ,
pH
7 . 0 .
T h e
g e l s
w e r e
s t a i n e d
w i t h
e t h i d i u m
b r o m i d e ( 2 , u g / m l )
a n d t h e
d e n a t u r e d DNA
b a n d s ( b o t t o m i n s e t s )
w e r e
p h o t o g r ap h e d t hr o u g h
a r e d
f i l t e r
a f t e r
i l l u m i n a t i o n
w i t h
u l t r a v i o l e t
l i g h t .
D N a s e , d e o x y r i b o n u c l e a s e .
3 SEPrEMBER
1 9 7 6
8 4 9
-
7/23/2019 Chromsomal Subunites in Active Genes Have an Altered Conformation
3/9
c h i c k
e r y t h r o c y t e s - t h i s
l i n e o f r e d
b l o o d
c e l l s c o n t a i n s
t h e
a d u l t
g l o b i n
p o l y p e p t i d e
c h a i n s - i s
d i g e s t e d
w i t h
p a n c r e a t i c
d e o x y r i b o n u c l e a s e
I s o t h a t
1 0
p e r c e n t
i s
a c i d
s o l u b l e , a p p r o x i m a t e l y
7 5
p e r c e n t
o f
t h e g l o b i n c D NA
p r o b e
f a i l s
t o h y b r i d -
i z e w i t h
t h e
r e m a i n i n g 9 0 p e r c e n t
o f t h e
p u r i f i e d
e r y t h r o c y t e DNA
( F i g .
2 ) .
S i m i -
l a r l y , a f t e r
t h e same
a m o u n t
o f
d i g e s t i o n ,
DNA i s o l a t e d f r o m
t h e e m b r y o n i c l i n e
o f
e r y t h r o b l a s t s
p r o t e c t s o n l y a b o u t
5 0
p e r -
c e n t o f t h e c D NA a t
s a t u r a t i o n . I n
c o n -
t r a s t , u n d i g e s t e d
DNA i s o l a t e d
f r o m
e i -
t h e r e m b r y o n i c
o r
a d u l t
r e d c e l l s
s a t u -
r a t e s t h e
p r o b e
a t more t h a n 9 4
p e r c e n t .
T h e s e e x p e r i m e n t s
s h o w t h a t , i n
t h e
d i f -
f e r e n t
r e d c e l l
l i n e s , s p e c i f i c
g l o b i n
s e -
F i g .
2 .
P r e f e r e n t i a l
d i g e s t i o n
o f
a c t i v e
g e n e s *
T o t a l
D NA
( G l o b i n )
b y p a n c r e a t i c
d e o x y r i b o n u c l e a s e
I .
Red
b l o o d
100
_
5
Day
RBC
(Gl o bi n )
c e l l s
( R B C )
were
o b t a i n e d
b y
v e i n
p u n c t u r e
* a A 4
f r o m
1 8 - d a y ( c o n t a i n i n g
a d u l t - t y p e
g l o b i n
o 1 8
D a y
R B C
( G l o b i n )
c h a i n s )
a n d
5 - d a y
( c o n t a i n i n g
e m b r y o - t y p e 8 0
1 8
D a y
RBC
( O v a l )
/'
g l o b i n c h a i n s )
c h i c k
e m b r y o s .
F i b r o b l a s t s
. /
were
d i s s e c t e d f r o m t h e
r e g i o n
o f
t h e
d e v e l -
* 5Day
RBC
Oval)
o p i n g
b r e a s t
m u s c l e o f
1 1 - d a y
c h i c k
e m b r y o s
60_ F g b r o
Oval)
a n d
grown
i n
c u l t u r e
( 1 7 ) .
N u c l e i
from
1 8 - d a y
/
e m b r y o
R B C ' s ,
5 - d a y e m b r y o R B C ' s ,
and
1 1 -
_ A
d a y
c u l t u r e d
c h i c k
e m b r y o
f i b r o b l a s t s
were
I
40
i s o l a t e d
i n
RSB
c o n t a i n i n g
0 . 5
p e r c e n t
NP-40
4 0 *
a n d
d i g e s t e d
w i t h
p a n c r e a t i c
d e o x y r i b o n u -
c l e a s e
I
u n t i l 1 0 t o 2 0
p e r c e n t
o f t h e
DNA
was
*
s o l u b l e
i n
a c i d
( l e g e n d
t o
F i g .
1 ) .
DNA
was
2 0 _
p r e p a r e d
a s
f o l l o w s .
N u c l e i
were
c e n t r i f u g e d
a n d
s u s p e n d e d
i n
0 . 1
p e r c e n t
S D S ,
1 0 0
, u g
of
pronase
per
m i l l i l i t e r ,
and
5
mMEDTA
I
o v e r n i g h t
a t
3 7 C .
T h e
s a m p l e
was ex -
0 1
2
3
4
t r a c t e d s e v e r a l
t i m e s
with
e q u a l
volumes
of a mixture of
p h e n o l
a n d
c h l o r o f o r m
lo g
Cot
( 1
: 1 ) ,
a n d
s e v e r a l
t i m e s w i t h
a
mixture
o f
chloroform
a n d
i s o a m y l
a l c o h o l
( 2 4 : 1 ) .
T h e
r e s u l t a n t
a q u e o u s
p h a s e
was
m a d e
0 .
1M
w i t h
r e s p e c t
t o
N a C l ,
a n d
t h e n u c l e i c a c i d
was
p r e c i p i t a t e d
o v e r n i g h t
a t
-20C
with two
volumes o f 9 5
p e r c e n t
e t h a n o l .
T h e
n u c l e i c a c i d
was
recovered
b y
c e n t r i f u g a t i o n
f o r 30
minutes
a t
1 0 , 0 0 0
r e v / m i n
( H B - 4
head
o f a S o r v a l l R C-5
c e n t r i f u g e ) ,
s u s p e n d e d
i n
1 0 mM
N a C l ,
1 0
mM
t r i s - H C l (pH
7 . 4 ) ,
a n d
i n c u b a t e d f o r 3 0
m i n u t e s
a t
3 7 C
w i t h
l ; b o n u c l e a s e
A
( 2 0
, u g / m l )
( W o r t h i n g t o n )
t h a t
h a d
b e e n
b o i l e d f o r
30
m i n u t e s . T h e
p r e p a r a t i o n
wa s
a g a i n
e x t r a c t e d
w i t h
t h e
p h e n o l - c h l o r o f o r m
a n d
t h e n
c h l o r o f o r m - i s o a m y l
a l c o h o l
m i x t u r e s
an d
t h e e x t r a c t
was
p r e c i p i t a t e d
w i t h e t h a n o l .
The
DNA
c o n c e n t r a t i o n was
d e t e r m i n e d
b y
a b s o r b a n c y
a t
2 6 0 nm
i n
a
Z e i s s
s p e c t r o p h o t o m e t e r
(DNA
a t
1
m g / m l
g a v e
2 0 A 2 6 O ) .
TotalDNA
was
p r e p a r e d
d i r e c t l y
from
1 8 - d a y
r e d c e l l n u c l e i a nd
s o n i c a t e d
s o t h a t
t h e
a v e r a g e
l e n g t h c o r r e s p o n d e d
t o
5 0 0 n u c l e o t i d e s .
T he
cDNA
c o m p l e m e n t a r y
t o
g l o b i n
mRNA
from a d u l t
r e t i c u l o c y t e s
was
p r e p a r e d
as d e s c r i b e d
( 1 7 ) . H y b r i d i z a t i o n s
were
c o n d u c t e d
with
a n
excess
o f
DNA t o
cDNA
( 1
x
1 0 7
t o
2
x
1 0 7 : 1 )
a nd
a n a l y z e d ( 1 7 ) .
T he DNA
s a m p l e s
s u s p e n d e d
i n a
m i x t u r e o f 0 . 3 M
N a C l ,
50mM
t r i s - H C I
(pH
7 . 4 ) ,
and 0 . 1
p e r c e n t
S D S a n d
r a n g i n g
i n
c o n c e n t r a t i o n
from
1
t o
2 0
m g / m l
were d e n a t u r e d
b y
h e a t
a n d
a n n e a l e d a t
6 5 C ( a t
1 0 0 0
c o u n t l
m i n
p e r
5
, u l
o f
r e a c t i o n
m i x t u r e )
t o
[ 3 H ] d e o x y c y t i d i n e -
a n d
[ 3 H ] t h y m i d i n e - l a b e l e d
cDNA
( 5
x
1 0 7
t o
8
x
1 0 7
c o u n t / m i n
p e r
m i c r o g r a m ) .
Under
t h e s e
c o n d i t i o n s
t h e
c a l c u l a t e d r a t i o
o f
g l o b i n
DNA
t o
g l o b i n
cDNA wa s
1 0 :
I
t o 15:
1 .
P o l y p r o p y l e n e
t u b e s o v e r l a i d
w i t h
p a r a f f i n
o i l
were
used
f o r t h e
h y b r i d i z a t i o n s .
At i n t e r v a l s
( f r o m
5 . 7
m i n u t e s
t o 9 6
h o u r s ) ,
0 - , u l
s a m p l e s
o f
r e a c t i o n
m i x t u r e s
were
p i p e t t e d
i n t o 4 0 0
, 1
o f a
m i x t u r e o f
3 0 mM s o d i u m
a c e t a t e (pH
4 . 5 ) ,
0. 1 5 M
N a C l ,
I
mM
Z n S O 4 ,
an d
1 0
u g
o f
d e n a t u r e d
DNA
from s a l m o n
s p e r m .
H a l f
( 2 0 0
, u l )
o f
t h e
a b o ve m i x t u r e
wa s
i m m e d i a t e l y p r e c i p i t a t e d
w i t h t r i ch l o r oa c e ti c a c i d
( T C A )
a n d
t h e o t h e r h a l f
wa s
i n c u b a t e d w i t h
p a r t i a l l y p u r i f i e d
S I
n u c l e a s e
a t
4 5 C
f o r 4 0 m i n u t e s .
The
p e r c e n t a g e
o f
h y b r i d i z a t i o n
was
d e t e r m i n e d
b y c o m p a r i s o n
o f t h e
T C A - p r e c i p i t a b l e r a d i o a c t i v i t y r e m a i n i n g
a f t e r
SI
d i g e s t i o n
t o t ha t
p r e c i p i t a b l e
i n
t h e
u n d i g e s t e d
s a m p l e s .
Th e S I
b a c k g r o u n d
r a d i o a c t i v i -
t y
r a n g e d
from 2
t o
6
p e r c e n t .
The
p e r c e n t a g e
o f
h y b r i d i z e d
cDNA
i s
p l o t t e d
a s a
f u n c t i o n o f
t h e
C o t ,
which
r e p r e s e n t s
t h e
c o n c e n t r a t i o n
o f
d e o x y r i b o n u c l e o t i d e ( m o l e s )
t i m e s
t h e
t i m e o f
d i g e s t i o n
( s e c o n d s )
p e r
l i t e r
( 2 8 ) .
The
s a m e
p l a t e a u s
were
o b t a i n e d
a t
c o n c e n t a t i o n s
o f d r i v e r
DNA
f r o m 2 t o
20
m g / m l
i n
a r e a c t i o n
volume
o f 50
I A I
t o which cDNA
( 5 0 0 0
c o u n t / m i n )
was
a d d e d .
A-A)
T o t a l
DNA
h y b r i d i z e d
t o
g l o b i n
cDNA;
( @ -
5 - d a y
r e d c e l l DNA
t r e a t e d w i t h
d e o x y r i b o n u -
c l e a s e
I
a n d
h y b r i d i z e d
t o
g l o b i n cDNA;
00O)
1 8 - d a y
r e d c e l l
DNA
t r e a t e d
w i t h
d e o x y r i -
bonuclease
I
a n d
h y b r i d i z e d
t o
g l o b i n cDNA; O-
1 8 - d a y
r e d
c e l l
DNA
t r e a t e d w i t h
d e o x y r i b o n u c l e a s e
I
and
h y b r i d i z e d
t o
o v a l b u m i n
cDNA;
m-
)
5 - d a y
r e d
c e l l
DNA
t r e a t e d
w i t h
d e o x y r i b o n u c l e a s e
I
and
h y b r i d i z e d
t o o v a l b u m i n
cDNA;
A
i b r o b l a s t DNA
t r e a t e d
w i t h
d e o x y r i b o n u c l e a s e
I
a n d
h y b r i d i z e d
t o o v a l b u m i n
cDNA.
8 5 0
quences
a re
p a r t i c u l a r l y s e n s i t i v e
t o
d i -
g e s t i o n .
W e
p r e s e n t
e v i d e n c e
b e l o w
t h a t
e m b r y o n i c
b u t
n o t
a d u l t - s p e c i f i c
g l o b i n
seque,s
a n d i g e s t e d
i n
e m b r y o n i c
r e d
cells
adult
but not
e m b r y o - s p e c i f i c
sequences
are
d i g e s t e d
i n a d u l t
r e d
c e l l s .
T h e s a m e
p r e p a r a t i o n s
o f
d i g e s t e d
n u c l e i
f r o m
e i t h e r
t h e
a d u l t o r
e m b r y o n i c
l i n e o f
r e d c e l l s c o n t a i n s t h e
DNA
sequences
c o d i n g
f o r o v a l b u m i n mRNA
( F i g .
2 ) .
M o s t
i m p o r t a n t l y ,
n u c l e i f r o m c u l t u r e d
c h i c k
f i b r o b l a s t s o r
f r e s h l y i s o l a t e d
c h i c k
b r a i n ,
a f t e r
1 0
t o 2 0
p e r c e n t d i g e s t i o n
( m o r e e x t e n s i v e
a m o u n t s
o f
d i g e s t i o n
were
n o t
t e s t e d ) ,
r e t a i n
t h e
DNA
s e -
q u e n c e s c o d i n g f o r
b o t h a d u l t
a n d
e m b r y -
o n i c
g l o b i n
( F i g . 3 ) .
I n
a d d i t i o n ,
t h e f i b r o -
b l a s t
n u c l e i
r e t a i n
t h e
DNA
sequences
c o d i n g
f o r o v a l b u m i n
( F i g . 2 ) .
I n
c o n -
t r a s t ,
d i g e s t i o n
o f r ed
c e l l
n u c l e i t o
DNA
f r a g m e n t s o f a p p r o x i m a t e l y t h e
s a m e
s i z e
b y
a d i f f e r e n t
n u c l e a s e ,
s t a p h y l o c o c -
c a l
n u c l e a s e , r e s u l t s
i n
n o
p r e f e r e n t i a l
d i g e s t i o n
o f
a n y
g l o b i n
sequences
( F i g .
3 ) . T h i s
was
f i r s t s h o w n
b y
A x e l
e t a l .
( 1 3 )
a n d
r e c e n t l y e x t e n d e d b y
L a c y
a n d
A x e l
( 1 9 ) .
I n summary,
d i g e s t i o n o f n u c l e i
w i t h
p a n c r e a t i c
d e o x y r i b o n u c l e a s e r e v e a l s
t h a t
s p e c i f i c
g l o b i n sequen ces a re
p r e f e r -
e n t i a l l y d e g r a d e d i n e r y t h r o i d
c e l l s , b u t
n o t
i n n o n e r y t h r o i d
c e l l s . S i m i l a r l y ,
t h e
o v a l b u m i n gene
i s n o t p r e f e r e n t i a l l y d i -
g e s t e d i n c e l l s t h a t
d o n o t p r o d u c e o v a l -
b u m i n .
I d e n t i f i c a t i o n
o f
G l o b i n
G e n e s
D i g e s t e d
i n
A d u l t
a n d
E m b r y o n i c
N u c l e i
T h e f a i l u r e
o f DNA
i s o l a t e d
f r o m
r e d
c e l l n u c l e i t r e a t e d w i t h
d e o x y r i b o n u -
c l e a s e I t o s a t u r a t e t h e c D N A
p r o b e
( F i g . 2 ) c o u l d b e d u e i )
t o t h e
s p e c i f i c
d e g r a d a t i o n o f
a
u n i q u e
s u b s e t o f
g l o b i n
genes,
a s we
h a v e s u g g e s t e d , or
i i )
t o
a n
o v e r a l l
r e d u c t i o n
i n DNA
sequences
c o m p l e m e n t a r y
t o a l l
sequences p r e s e n t
i n t h e cDNA, r e s u l t i n g i n
a
s i t u a t i o n
w h e r e
t h e
c D N A
i s
i n
excess.
T o
e x c l u d e
t h e
s e c o n d p o s s i b i l i t y , we h a v e
p e r -
f o r m e d
s e v e r a l
o f
t h e r e a n n e a l i n g
exper-
i m e n t s s h o w n i n F i g .
2
w i t h o n e - t e n t h
t h e
a m o u nt
o f
d r i v e r
DNA
( t h a t
i s ,
t h e
DNA
w h i c h
d e t e r m i n e s t h e r a t e o f
t h e
r e a c t i o n )
a n d
t h e
s a m e
a m o u n t
o f
cDNA.
U n d e r t h e s e
c o n d i t i o n s ,
n o
c h a n g e
i s
o b s e r v e d i n t h e
l e v e l o f
s a t u r a t i o n
o f
t h e cDNA. T h i s
d e m o n s t r a t e s
t h a t
s p e -
c i f i c
g l o b i n
DNA
sequences
are
d i g e s t e d
b y
p a n c r e a t i c
d e o x y r i b o n u c l e a s e a n d
a l s o t h a t
s p e c i f i c
sequences
a re
r e s i s t a n t .
As
was
m e n t i o n e d
p r e v i o u s l y ,
o u r
c D N A
p r o b e
c o n t a i n s
sequences
c o m -
p l e m e n t a r y
t o t h r e e a d u l t
g l o b i n
mRNA
S C I E N C E , VOL. 1 9 3
i c g l o b i n
p o l y p e p ti d e c h ai n s
( 1 7 ) . T h u s ,
e m b r y o n i c
r e d c e l l
RNA
s a t u r a t e s a b o u t
7 0 p e r c en t
o f
t h e
c D N A
p r o b e
p r e p a r e d
f r o m a d u l t
r e d c e l l
g l o b i n
mRNA, w h i l e
a d u l t r e d
c e l l
RNA
s a t u r a t e s t h e l a b e l e d
p r o b e a t
a b o u t 9 5
p e r c e n t ( 1 7 ) . T h e
c r o s s r e a c t i o n o f t h e
a d u l t
p r o b e
w i t h
e m b r y o n i c
RNA
i s
q u a l i t a t i v e l y a t t r i b u t -
a b l e
t o
t h e f a c t t h a t
t h e
a d u l t
l i n e
o f
r e d
c e l l s
s y n t h e s i z e t h r e e m a i n
t y p e s
o f g l o -
b i n
c h a i n s ,
t w o o f
w h i c h
a r e
i d e n t i c a l t o
c h a i n s s y n t h e s i z e d
b y t h e
e m b r y o n i c
l i n e
o f
r e d
c e l l s
a n d
t h e t h i r d
b e a r s a b o u t a
5 0
p e r c e n t
h o m o l o g y b y t r y p t i c
p e p t i d e
a n a l y s i s
( 1 8 )
t o
t w o
o t h e r
e m b r y o n i c
g l o -
b i n
c h a i n s .
When t h e
DNA
i n
n u c l e i
f r o m
a d u l t
-
7/23/2019 Chromsomal Subunites in Active Genes Have an Altered Conformation
4/9
m o l e c u l e s . T h e
r e s i s t a n t DNA o b t a i n e d
a f t e r
e m b r y o n i c e r y t h r o b l a s t n u c l e i
are
m i l d l y t r e a t e d w i t h d e o x y r i b o n u c l e a s e
I
s a t u r a t e s
t h e c D N A
p r o b e a t a b o u t 5 0
p e r c e n t . O u r h y p o t h e s i s
i s t h a t
o n l y
a c -
t i v e l y
t r a n s c r i b i n g
g l o b i n genes a r e
d i -
g e s t e d .
S i n c e
two
o f t h r ee
a d u l t
g l o b i n
g e n e s a r e a l s o
a c t i v e
i n t h e
e m b r y o n i c
r e d c e l l l i n e , we p r e d i c t
t h a t two
a d u l t
g l o b i n g e n e s
a r e
d i g e s t e d
i n
e m b r y o n i c
c e l l s
a n d
t h e
t h i r d
i s
r e s i s t a n t . To
t e s t
t h i s , p o l y s o m a l RNA
f r o m
e m b r y o n i c
r e d
c e l l s w a s a d d e d
t o
t h e
h y b r i d i z a t i o n
m i x t u r e
w h i c h a l s o
c o n t a i n e d 3 H - l a b e l e d
c DNA f r o m a d u l t
g l o b i n
mRNA a n d
p a r -
t i a l l y
d i g e s t e d
DNA
f r o m e m b r y o n i c
r e d
c e l l n u c l e i .
Under t h e s e c o nd i ti o ns ,
t h e
c D N A i s f u l l y s a t u r a t e d
a t
a b o u t 9 8
p e r -
c e n t ( F i g . 4 ) . T h u s ,
e m b r y o n i c r e d
c e l l
RNA f u l l y
c o m p l e m e n t s t h e
d e f i c i e n c y
i n g l o b i n DNA sequences r e s u l t i n g
f r o m
t h e d i g e s t i o n . T h i s i m p l i e s t h a t
e m b r y o n -
i c
s e q u e n c e s a r e
a b s e n t a n d t h e
a d u l t -
s p e c i f i c
s e q u e n c e s
a re
p r e s e n t
i n
t h e
DNA
f r o m
t h e e m b r y o n i c
red
c e l l
n u c l e i
t r e a t e d w i t h
d e o x y r i b o n u c l e a s e
I.
A s i m i l a r t y p e
o f
a n a l y s i s
s u g g e s t s t h a t
a d u l t - s p e c i f i c sequences
a re
p r e f e r e n -
t i a l l y d i g e s t e d i n t h e a d u l t
l i n e
o f r ed
c e l l
n u c l e i .
F i g u r e
2 s h o w s t h a t t h e c D N A
i s
s a t u r a t e d a t
a b o u t
2 5 p e r c e n t b y
DNA
i s o l a t e d
f r o m a d u l t
r e d
c e l l n u c l e i
t r e a t e d
w i t h p a n c r e a t i c d e o x y r i b o n u c l e a s e .
O u r
h y p o t h e s i s i n
t h i s c a s e i s t h a t
o n l y
a d u l t -
s p e c i f i c g l o b i n genes
a re d i g e s t e d . I n
p r i n c i p l e ,
i f t h i s i s
t r u e , t h e n none o f t h e
p r o b e
s h o u l d b e
p r o t e c t e d
f r o m
n u cle-
a s e .
W e
b e l i e v e
t h a t t h e p a r t i a l
p r o t e c -
t i o n
o f
t h e
p r o b e
b y
DNA
o b t a i n e d
f r o m
a d u l t n u c l e i t r e a t e d w i t h
d e o x y r i b o n u -
c l e a s e I c a n b e e x p l a i n e d
b y two e m b r y -
o ni c g l o bi n
genes
t h a t b e a r a
m a r k e d
h o m o l o g y t o t h e / 3 - g l o b i n gene i n
t h e
a d u l t ( 1 8 ) . T h e s e e m b r y o - s p e c i f i c
g l o b i n
g e n e s ( n a m e d
E
a n d p ) w o u l d b e
p r e s e n t
i n t h e
d e o x y r i b o n u c l e a s e
I - r e s i s t a n t
f r a c -
t i o n f r o m a d u l t r e d
c e l l
n u c l e i a n d ,
b y
v i r t u e o f
t h e i r homology
t o t h e
a d u l t
/
g l o b i n , w o u l d
b e e x p e c t e d t o p a r t i a l l y
p r o t e c t
s o me
o f
t h e
c D NA.
S i n c e
t h e
a d u l t
( 3 - e n e
c o d e s f o r a b o u t 5 0
percent
o f
t h e
a d u l t
g l o b i n c h a i n s ,
i t i s n ot u n r e a -
s o n a b l e t h a t
i t
c o n s t i t u t e s
a b o u t
5 0 per-
c e n t o f
o u r cDNA
p o p u l a t i o n .
I n a d d i -
t i o n , p e p t i d e a n a l y s i s
h a s shown a b o u t a
5 0
p e r c e n t
i d e n t i t y i n t r y p t i c
p e p t i d e s
b e t w e e n
t h e
f 3 - g l o b i n
i n a d u l t s
a n d t h e
e -
a n d
p - g l o b i n c h a i n s
i n t h e embryo
( 1 8 ) .
T h u s , i f
o u r l o g i c i s c o r r e c t ,
we p r e d i c t
t h a t t h e d i g e s t e d a d u l t n u c l e i
s h o u l d s a t u -
r a t e a b o u t
2 5 percent
o f
t h e cDNA
probe
( 5 0
p e r c e n t
x
5 0
p e r c e n t
=
2 5
p e r c e n t ) .
T o
t e s t
t h i s ,
e m b r y o n i c r e d c e l l RNA
w a s
a d d e d
t o t h e
h y b r i d i z a t i o n m i x t u r e
c o n t a i n i n g
t h e
c D N A
a n d DNA
f r o m
t r e a t e d
a d u l t
n u c l e i . U n d e r
t h e s e
c o n d i -
3
S E P T E M B E R
1 9 7 6
4'
t i o n s , t h e p r o b e i s
s a t u r a t e d
a t a b o u t 7 0
p e r c e n t ( F i g . 4 ) .
T h i s
i s
p r e c i s e l y
t h e
s a t u r a t i o n
a c h i e v e d
b y
p u r e
e m b r y o n i c
r e d
c e l l RNA a l o n e
1 7 ) ,
a n
i n d i c a t i o n
t h a t t h e
d e o x y r i b o n u c l e a s e I - r e s i s t a n t
DNA f r o m a d u l t
r e d c e l l s c o n t a i n s n o
a d u l t - s p e c i f i c
g l o b i n
s e q u e n c e s
( T a b l e 1 ) .
T h e
s e n s i t i v i t y
o f
t h e
g l o b i n
g e n e s
t o
d e o x y r i b o n u c l e a s e
I
c o u l d
b e r e l a t e d
t o
t h e f a c t
t h a t t h e y a r e
e x t r e m e l y
a c t i v e
i n
t r a n s c r i p t i o n
a n d
a r e
t h e r e f o r e
n o t
t y p i -
c a l o f m o s t o f t h e
g e n e s
a c t i v e l y b e i n g
t r a n s c r i b e d .
T h e
c h i c k e n
g e n o m e
c o n -
t a i n s e n d o g e n o u s
DNA
s e q u e n c e s
c o m -
1 0 0
9 0 0
_
F i b r o b l a s t
( P a n c )
8
80
aRC
0
B r a i n
( P a n c ) 0
c 7 8 0
-
^
a 8
A n , R B C
( S t a p h )
0
7 0
D
60
2
0
( D
~ ~ ~ ~ 0
. O
5 0
_ - /
4 0
0
a :
v
c o
30
-
a
I
20
_
I O L
_
p l e m e n t a r y t o t ho s e o f
a v i a n
t u m o r v i r u s -
es
( A T V ) .
A c D N A p r o b e
ma de
a g a i n s t
a
s p e c i f i c t y p e o f a v i a n
tumor
v i r u s ,
a v i a n
m y e l o b l a s t o s i s
v i r u s
RNA
( A M V ) ,
h y -
b r i d i z e s w i t h c h i c k e n DNA
w i t h a s e -
q u e n c e
h o m o l o g y
o f a b o u t
6 0
p e r c e n t
a n d a
log
C 0 t 1 2
o f
a b o u t
1 . 7 5 .
T h i s
c o r r e -
s p o n d s t o a b o u t e i g h t
t o t e n c o p i e s
o f
en -
d o g e n o u s
ATV DNA
per
c e l l .
I n
s e p a r a t e
e x p e r i m e n t s
t h e t o t a l RNA
f r o m
e m b r y -
o n i c c h i c k
e r y t h r o b l a s t s
was
h y b r i d i z e d
t o
t h e
3 H - l a b e l e d
AMV
cDNA.
T h e
k i -
n e t i c s o f h yb r i d i z at io n
i n d i c a t e d
t h a t
f r o m
o n e - t e n t h
t o
two
c o p i e s
o f
e n d o g e -
0
2 3 4
1
2 3
4
l o g
C o t
l o g
C o t '
F i g .
3 l e f t ) .
R e t e n t i o n o f i n a c t i v e
genes
a f t e r
treatment
o f
n u c l e i
w i t h
p a n c r e a t i c
d e o x y r i b o n u -
c l e a s e . A s w a s d e s c r i b e dl e g e n d
t o F i g . 2 ) , 1 8 - d a y
R BC
n u c l e i a n d
1 1 - d a y f i b r o b l a s t
n u c l e i
were
i s o l a t e d f r o m
c h i c k
e m b r y o s . B r a i n s were
d i s s e c t e d f r o m 1 - d a y c h i c k
e m b r y o s ,
i n c u b a t e d f o r 3 0
m i n u t e s
i n
PBS
( G i b c o ) w i t h
0 . 1
p e r c e n t
t r y p s i n ,
washed r e p e a t e d l y
w i t h
PBS
t o
e l i m i n a t e c o n -
t a m i n a t i n g
R B C ' s ,
a n d
l y s e d
b y
h o m o g e n i z a t i o n
i n
RS B
w i t h
0 . 5
p e r c e n t
N P - 4 0 .
F i b r o b l a s t
a n d
b r a i n n u c l e i w e r e
d i g e s t e d
s o
t h a t 2 0 p e r c e n t o f t h e DNA was
a c i d
s o l u b l e
( l e g e n d
t o
F i g .
1 .
T h e
1 8 - d a y R B C ' s w e r e d i g e s t e d
u n t i l 5 0 p e r c e n t o f t h e
DNA
was a c i d
s o l u b l e w i t h
s t a p h y l o c o c c a l
n u c l e a s e
( 5 0g/ml) f o r 1 5
m i n u t e s
a t
7C i n RS B
s u p p l e m e n t e d
w i t h
1 0 - 4 M
C a C l 2 .
M o r e
t ha n 8 0
p e r c e n t
o f t h e a c i d
i n s o l u b l e
DNA
f r o m t h i s
p r e p a r a t i o n
c o n s i s t e d
o f
2 0 t o
1 4 5
b a s e
p a i r s ,
a s
a n a l y z e d - o n
6 p e r c e n t a c r y l a m i d e
g e l s .
Th e
i s o l a t i o n o f
r e s i s t a n t
DNA
f r o m
t h e
d i g e s t e d
n u c l e a r
p r e p a r a t i o n s
a n d
t h e
c o n d i t i o n s
a n d a n a l y s i s
o f
h y b r i d i z a t i o n ,
i n c l u d i n g
DNA
c o n c en -
t r a t i o n s a n d t i m e s o f i n c u b a t i o n , were
a s d e s c r i b e d ( F i g .
2 l e ge n d ) .
( 0 - 0 )
F i b r o b l a s t
DNA
d i g e s t e d w i t h
d e o x y r i b o n u c l e a s e I
a n d
h y b r i d i z e d
t o g l o b i n cDNA;
O - O
)
b r a i n DNA
d i -
g e s t e d
w i t h
d e o x y r i b o n u c l e a s e
I
a n d h y b r i d i z e d
t o
g l o b i n
cDNA;
(A-A)
1 8 - d a y
r e d
b l o o d
c e l l
D NA d i g e s t e d w i t h s t a p h y l o c o c c a l
n u c l e a s e a n d h y b r i d i z e d
t o
g l o b i n
cDNA.
F i g .
4
r i g h t ) .
H y b r i d i z a t i o n k i n e t i c s o f
g l o b i n
cDNA
a n d
m i x t u r e s
o f 5 - d a y
e r y t h r o i d RNA a n d
DNA
f r o m 1 8 - d a y o r 5 - d a y
RBC
n u c l e i d i g e s t e d
w i t h
p a n c r e a t i c
d e o x y r i b o n u c l e a s e .
E m b r y o n i c
e r y t h r o i d
RNA w a s p r e p a r e d f r o m t h e
c y t o p l a s m o f RBC's f r o m
5 - d a y
c h i c k
e m b r y o s .
T h e
5 - d a y
R B C ' s
w e r e o b t a i n e d
b y v e i n p u n c t u r e , washed
r e p e a t e d l y
w i t h
a u t o c l a v e d
P B S ,
a n d
l y s e d
i n
a u t o c l a v e d RSB
s u p p l e m e n t e d w i t h 0 . 5
percent NP - 4 0
an d
mouse
l i v e r r i b o n u c l e a s e
i n h i b i t o r
1 7 ) .
N u c l e i
w e r e
s e d i m e n t e d
i n
a
t a b l e - t o p
c e n t r i f u g e ,
a n d
t h e
s u p e r n a t a n t
wa s e x t r a c t e d
s e v e r a l t i m e s
w i t h
e q u a l v o l u m e s o f
a
s o l v e n t
m i x t u r e c o n t a i n i n g
p h e n o l - c h l o r o f o r m
( 1 : 1 )
a n d
t h e n s e v e r a l t i m e s w i t h
a m i x t u r e
o f
c h l o r o f o r m a n d i s o a m y l
a l c o h o l
( 2 4 :
1 ) .
T h e
a q u e o u s
p h a s e
w a s
m a d e
0 .
I M
w i t h r e s p e c t
t o
N a C l ,
a n d t he n u c l e i c
a c i d
was
p r e c i p i t a t e d
w i t h
t w o
v o l u m e s o f 9 5
p e r c e n t e t h a n o l
( o v e r n i g h t
at - 2 0 C ) a n d
r e c o v e r e d
b y
c e n t r i f u g a t i o n
f o r
6 0
m i n u t e s a t 1 1 , 0 0 0
r e v / m i n
( H B - 4 h e a d o f a
S o r v a l l
R C - 5 c e n t r i f u g e ) ;
i t
was
s u s p e n d e d
i n
a
s o l u t i o n
o f
1 0 mMa C I , 1 0
mM
t r i s - H C I
( p H
7 . 4 ) ,
a n d 5 mM
M n C l 2 , i n c u b a t e d
w i t h
r i b o n u c l e a s e - f r e e
d e o x y r i b o n u c l e a s e
( 1 0
u g/ml) ( W o r t h i n g t o n ) f o r
3 0
m i n u t e s a t
7C,
a n d
a g a i n e x t r a c t e d
w i t h
t h e
a b o v e
s o l v e n t m i x t u r e s . T h e
RNA wa s p r e c i p i t a t e d w i t h e t h a n o l a n d
s u s p e n d e d
i n
a
s o l u t i o n o f
1
0 m M
N a C l ,
1
0 m M
t r i s - H C I
( p H
7 . 4 ) ,
a n d
t h e
a m o u n t
o f RNA
was
d e t e r m i n e d
a t A 2 6 0
i n
a
Z e i s s
s p e c t r o p h o t o m e t e r
(RNA
a t
1
m g / m l
=
2 4 A 2 6 0 ) .
T h e
n u c l e i
were
d i g e s t e d w i t h
p a n c r e a t i c
d e o x y r i b o n u c l e a s e ( 1 0ug/ml) ( W o r t h i n g t o n )
f o r 3 0
m i n u t e s a t
7C, a n d
a g a i n e x t r a c t e d
w i t h
t h e
c o n d i t i o n s ,
a n d a n a l y s i s o f h y b r i d f o r m a t i o n a r e d e s c r i b e d
i n F i g .
2 .
The
r a t i o
o f DNA
t o
R NA i n
t h e
h y b r i d i z a t i o n
m i x t u r e
w a s 1 0 :
1 . The n u c l e i c a c i d
c o n c e n t r a t i o n
r a n g e d f r o m
( p e r
m i l l i l i t e r )
1 9
m g o f
D NA
a n d 1 . 9 m g o f
RNA
t o 1 . 9
mg o f DNA a n d
0 . 1 9
mg
f
RNA.
B e c a u s e
o f t h e
m i n o r
c o n t r i b u t i o n
o f
R NA
t o
t h e t o t a l n u c l e i c a c i d c o n c e n t r a t i o n ,
t h e
RNA
c o n c e n t r a t i o n wa s n o t
c o n s i d e r e d
i n
t h e
c a l c u l a t i o n
o f
C o t .
( -
- )
DNA
f r o m
p a n c r e a t i c
d e o x y r i b o n u c l e a s e -
t r e a t e d 1 8 - d a y r e d
b l o o d
c e l l s p l u s RNA
f r o m 5 - d a y
e m b r y o n i c
r e d
b l o o d
c e l l s
h y b r i d i z e d
t o
g l o b i n cDNA.
(0--)
DNA
f r o m
p a n c r e a t i c
d e o x y r i b o n u c l e a s e - t r e a t e d
5 - d a y
r e d
b l o o d
c e l l s
p l u s RNA
f r o m 5 - d a y
e m b r y o n i c
r e d
b l o o d c e l l s
h y b r i d i z e d
t o
g l o b i n
cDNA.
8 5 1
-
7/23/2019 Chromsomal Subunites in Active Genes Have an Altered Conformation
5/9
-4
- 3 - 2
- 1
0 2
3
4
Log
C o t
F i g .
5 . P r e f e r e n t i a l
d i g e s t i o n
o f
e n d o g e n o u s
a v i a n
tumor
v i r u s
( A T V )
genes
b y
d e o x y r i b o n u -
c l e a s e I ,
i n
t h e e m b r y o n i c
l i n e o f c h i c k
e r y t h r o b l a s t s .
P r e p a r a t i o n s
o f DNA an d
p r o c e d u r e s
f o r
d i g e s t i o n
a n d
h y b r i d i z a t i o n
were
as
d e s c r i b e d
( F i g s .
1
a n d
2 ) .
The
AMV
cDNA wa s
p r e p a r e d
b y
t h e
m e t h o d
d e s c r i b e d
( 1 7 )
f o r
g l o b i n
cDNA. The
t e m p l a t e
f o r
t h e r e a c t i o n
wa s
t h e
3 5 5
R NA
p r e p a r e d f r o m
p u r i f i e d
v i r u s
( a g i f t
f r o m J .
B e a r d ) .
The
s p e c i f i c
a c t i v i t y
o f
t h e
p r o b e
was
a b o u t
4
x
1 0 7
t o
6
x
1 0 7
c o u n t / m i n
per
m i c r o g r a m ,
a n d
t h e
p r o b e
h y b r i d i z e d
t o
a b o u t
9 0
p e r c e n t
w i t h
i t s
t e m p l a t e , w i t h
a
log
C o t 1 / 2
o f
a b o u t
- 2 . 7 5 .
n o u s
RNA
sequences
were
p r e s e n t per
c e l l .
S i m i l a r
very
l o w
b u t
d e t e c t a b l e l e v e l s
o f a c c u m u l a t i o n
o f RNA
sequences
f r o m
e n d o g e n o u s c h i c k e n
v i r u s e s h a v e
b e e n
r e p o r t e d b y H a n a f u s a e t
a l .
( 2 0 ) . D e s p i t e
t h e f a c t t h a t t h i s
gene
h a s a l o w
a c t i v i t y
i n
e r y t h r o b l a s t s ,
i t i s
n e v e r t h e l e s s
s e n s i t i v e
t o
d i g e s t i o n b y p a n c r e a t i c
d e o x y r i b o n u -
c l e a s e
i n
i s o l a t e d
n u c l e i
( F i g .
5 ) .
From
t h e
C O t 1 1 2
o f t h e
r e a c t i o n s , i t
i s p o s s i b l e t o
c a l c u l a t e t h a t
t h e s e
e n d o g e n o u s
v i r a l
s e -
q u e n c e s
a re a b o u t 1 0 0
t i m e s more s e n s i -
t i v e
t o
d e o x y r i b o n u c l e a s e I t h a n
t h e b u l k
o f
t h e n u c l e a r
DNA.
T h u s ,
two
s p e c i f i c
c l a s s e s o f
a c t i v e genes
a re p r e f e r e n t i a l l y
d i g e s t e d
b y
d e o x y r i b o n u c l e a s e
I - t h e
very a c t i v e g l o b i n
genes
a n d
t h e
l e s s
a c t i v e e n d o g e n o u s
RNA
tumor
v i r u s
genes.
D i g e s t i o n o f a
S p e c i f i c C l a s s
o f
N u c l e a r
D NA S e q u e n c e s
T h e
n e x t
q u e s t i o n
i s
w h e t h e r a f t e r
2 0
p e r c e n t
d i g e s t i o n
o f
n u c l e i
b y d e o x y r i -
b o n u c l e a s e I
a
s p e c i f i c
2 0
p e r c e n t
o f
t h e
DNA
sequences
i s
a b s e n t f r o m t h e r e -
m a i n i n g
DNA.
T o t a l
[ 3 H ] t h y m i d i n e - l a -
b e l e d c h i c k DNA was
h y b r i d i z e d
w i t h
a
1 0 , 0 0 0 - f o l d
excess o f d r i v e r
DNA
o b -
t a i n e d a f t e r m i l d
d e o x y r i b o n u c l e a s e
t r e a t m e n t o f
e m b r y o n i c
r e d
c e l l n u c l e i .
F i g u r e
6
s h o w s
t h a t
7 8
p e r c e n t
o f
t h e
t o t a l
3 H - l a b e l e d
DNA
i s
p r o t e c t e d
a t
s a t -
u r a t i o n
w h e n
DNA
f r o m
n u c l e i
t r e a t e d
w i t h
d e o x y r i b o n u c l e a s e
I
i s
u s e d t o d r i v e
t h e
r e a c t i o n .
I n
c o n t r a s t ,
w h e n
t h e
d r i v e r
DNA i s DNA
o b t a i n e d
f r o m
t h e
1 l S
m o n o me r s
p r o d u c e d
b y
s t a p h y l o c o c c a l
n u c l e a s e
t r e a t m e n t o f
n u c l e i ,
9 4
p e r c e n t
o f
t h e
l a b e l e d
DNA
i s
p r o t e c t e d
f r o m
S I
n u c l e a s e .
A d d i t i o n o f
t o t a l
DNA
( b u t
n o t
d e o x y r i b o n u c l e a s e I - t r e a t e d
DNA)
t o t h e
r e a c t i o n
a f t e r 7 8
p e r c e n t s a t u r a t i o n
i s
a c h i e v e d
i n c r e a s e s
t h e
e x t e n t
o f
h y b r i d i -
z a t i o n t o 9 5
p e r c e n t ( F i g .
6
a n d
T a b l e
2 A ) .
T h i s
s u g g e s t s
t h a t
t h e
s m a l l e s t
d e o x y r i -
b o n u c l e a s e - d i g e s t e d
f r a g m e n t s
d o
n o t
i n -
h i b i t
t h e
h y b r i d i z a t i o n
o f
l o n g e r
f r a g -
ments
a n d
t h a t
t h e
f a i l u r e
t o
r e a c h f u l l
s a t u r a t i o n
i s
d u e
t o
t h e a b s e n c e
o f a
p a r t i c u l a r s u b s e t
o f
s e q u e n c e s i n
t h e
d e o x y r i b o n u c l e a s e - t r e a t e d
DNA. T h e
s a t u r a t i o n
v a l u e
d e c r e a s e s
t o
6 5
p e r c e n t
a f t e r 5 2
p e r c e n t
d i g e s t i o n
( T a b l e
2 ) .
W h e t h e r
t h e
s p e c i f i c n u c l e a r
DNA
s e -
q u e n c e s
t h a t
a r e
p r e f e r e n t i a l l y
d i g e s t e d
b y
d e o x y r i b o n u c l e a s e
I
a r e
r e l a t e d t o
t h e
s e q u e n c e s
t h a t a r e
a c t i v e l y
b e i n g
t r a n -
s c r i b e d wa s
t e s t e d a s
f o l l o w s . T h e DNA
f r o m
n u c l e i d i g e s t e d
t o 2 0 p e r c e n t
a c i d
s o l u b i l i t y
wa s
h y b r i d i z e d
t o
t o t a l
[ 3 H ] t h y m i d i n e - l a b e l e d
t r a c e r DNA. A f t e r
s a t u r a t i o n
h a d
b e e n r e a c h e d
( 7 8
p e r -
c e n t ) ,
n u c l e a r RNA w a s
a d d e d
t o t h e
h y b r i d i z a t i o n
r e a c t i o n .
U n d e r
t h e s e
c o n -
d i t i o n s , t h e
s a t u r a t i o n
v a l u e i n c r e a s e s
t o
8 9 p e r c e n t
( F i g .
6
i n s e t ) .
T h e
d i f f e r e n c e
i n s a t u r a t i o n
b e t w e e n
t h e r e a c t i o n s
t h a t
o c c u r i n t h e
p r e s e n c e
a n d
a b s e n c e
o f
a d d e d
n u c l e a r RNA
( 7 8
v e r s u s
8 9
p e r -
c e n t )
i s
v e r y
r e p r o d u c i b l e a n d
i s
p r o b -
a b l y
d u e t o
RNA- DNA
h y b r i d
f o r m a t i o n
T a b l e
1 .
O b s e r v e d
a n d
p r e d i c t e d
s a t u r a t i o n
o f
g l o b i n
c D N A
b y
v a r i o u s
n u c l e i c a c i d
p r e p a r a t i o n s .
G l o b i n
g e n e
t e r m i n o l o g y
i s
b a s e d on
t h e
t r y p t i c
p e p t i d e
a n a l y s i s
o f
B r o w n a n d
I n g r a m
1 8 ) ,
a s i s
t h e
r e p r e s e n t a t i o n
o f
g l o b i n
c h a i n s
i n
t h e
a d u l t
( 1 8 - d a y )
a n d
e m b r y o n i c
( 5 - d a y )
r e d b l o o d
c e l l
( R B C ) ' p o p u l a t i o n s ; ( + )
i n d i c a t e s e i t h e r
t h e
p r e s e n c e
o f t h e
DNA
s e q u e n c e s c o d i n g
f o r
p a r t i c u l a r
g l o b i n
c h a i n s o r t h e
p r e s e n c e
o f t h e
g l o b i n
p o l y p e p t i d e
c h a i n s i n t h e
r e s p e c t i v e
e m b r y o n i c
o r
a d u l t
p o p u l a t i o n s ;
( - )
i n d i c a t e s t h e
a b s e n c e
o f
t h e
g l o b i n g e n e s
o r t h e a b s e n c e o f
t h e
g l o b i n
p o l y p e p t i d e
c h a i n s . I n
t h e n u c l e i c a c i d m i x t u r e s
c o n t a i n i n g
b o t h
DNA
a n d
RNA,
t h e c o n t r i b u t i o n o f
e a c h
n u c l e i c a c i d
t o
t h e
p r o t e c t i o n
o f
c D NA
f r o m
S I
n u c l e a s e
d i g e s t i o n
i s
r e p r e s e n t e d b y
t h e
s u b s c r i p t s
D a n d
R ,
r e s p e c t i v e l y . S a t u r a t i o n v a l u e s a r e
t a k e n f r o m
F i g s .
2
a n d
3 .
G l o b i n
g e n e s
S a t u r a t i o n
o f
a d u l t
lobin n s
c DNA
(
I t e m
s
p
O b -
P r e -
( a - l i k e )
a A a D
D 3 - l i k e )
3 - l i k e ) D
s e r v e d d i c t e d
c D N A f r o m
a d u l t
RBC*
3 5
1 5
5 0 o
A c t i v e
g e n e s
i n a d u l t
RBC
-
+
+
-
- +
A c t i v e
g e n e s
i n
e m b r y o n i c
RBC
+
+ +
+
P o s t u l a t e d
s e q u e n c e s r e m a i n i n g
a f t e r
t r e a t m e n t o f :
( A )
E m b r y o n i c
RBC
( F i g . 2 )
-
- -
-
-
+
5 0
5 0
( B )
A d u l t
RBC
( F i g . 2 )
+
-
-
+
+
-
2 8
2 5 t
( C )
E m b r y o n i c
RBC
p l u s
e m b r y o n i c
RBC
R N A ( F i g . 3 )
+ R
+ R
+ R
+ R
+ R
+ D
9 4
1 0 0
( D )
A d u l t
RBC
p l u s e m b r y o n i c
RBC
RNA
+ D . R +
D . R
+ D , R
7 2
7 5
* C o m p l e m e n t a r y
D NA
wa s
p r e p a r e d
f r o m
a d u l t
g l o b i n m RNA
1 7 ) .
T h e
p e r c e n t a g e
r e p r e s e n t a t i o n
o f
s p e c i f i c
g l o b i n
g e n e s
i n
t h e
c D N A
p o p u l a t i o n
i s
b a s e d o n
t h e
a n a l -
y s i s
o f
B r o w n
a n d
I n g r a m 1 8 ) ,
a n d o n
t h e
a s s u m p t i o n
t h a t
a
s t o i c h i o m e t r i c
r e l a t i o n e x i s t s
b e t w e e n
t h e
t e m p l a t e
mRNA
a n d c D N A
p r o d u c t .
t T h e
p r e d i c t e d
2 5
p e r c e n t
s a t u r a t i o n o t i t ) N A
b y
DNA o f
d e o x y r i b o n u c l e a s e
I - d i g e s t e d
a d u l t
RBC
n u c l e i i s b a s e d o n
t h e
s h a r e d
t r y p t i c
p e p t i d e s
o f t h e a d u l t
3 - c h a i n a n d
t h e
e m b r y o n i c
e - a n d
p - c h a i n s .
Z
8 0
0
U
>
6 0
9
4 0
c r
m
2 0 -
0 N
o
8 5 2
S C I E N C E ,
V O L . 1 9 3
-
7/23/2019 Chromsomal Subunites in Active Genes Have an Altered Conformation
6/9
F i g . 6 .
K i n e t i c s
o f
r e a s s o c i a t i o n
o f c h i c k t o t a l
3 H - l a b e l e d
DNA
1 0 0
a n d D NA f r o m n u c l e a s e - t r e a t e d
n u c l e i
o f
1 8 - d a y
R B C ' s .
T o t a l r
S t o p h
D NA
3 H - l a b e l e d
DNA
w a s
p r e p a r e d
b y
i n c u b a t i o n o f R B C ' s
f r o m
4 - d a y
c h i c k
e m b r y o s
w i t h
[ 3 H ] d e o x y t h y m i d i n e .
C e l l s
were
o b t a i n e d b y
v e i n
p u n c t u r e ,
w a s h e d s e v e r a l t i m e s i n
m e d i u m
w i t h a n
a u t o c l a v e d
s o l u t i o n
o f 0 . 5
p e r c e n t N P - 4 0
i n
R S B . T h e
I a
a
n u c l e i were w a s h e d
s e v e r a l
t i m e s i n a u t o c l a v e d
RSB a n d
l y s e d
N
2 0
i
b y g e n t l e h o m o g e n i z a t i o n
i n
2 0
v o l u m e s o f
0 . 1 5 M
N a C I , 0 . 0 5 M
0
3 . 0
3 . 5 4 . o
s o d i u m
a c e t a t e
( p H
5 . 1 ) ,
a n d
0 . 3
p e r c e n t
S D S . T h e
n u c l e a r
l y s a t e
l o g
C 0 t
w a s
e x t r a c t e d
t h r e e
t i m e s
w i t h e q u al
v o l u m e s
o f a m i x t u re o f
p h e n o l
a n d
c h l o r o f o r m ( 1 :
1 )
a n d n u m e r o u s t i m e s w i th a m i x tu r e
o f c h l o r o f o r m
a n d i s o a m y l a l c o h o l ( 2 4 : 1 ) . E t h a n o l p r e c i p i -
2 . 0 2 . 5 3 . 0
3 . 5 4 . 0
4 . 5
t a t i o n ,
e l i m i n a t i o n o f DNA,
a n d
d e t e r m i n a t i o n o f RNA
c o n c e n - l o g
C o t
t r a t i o n
w e r e a s d e s c r i b e d ( F i g . 4 ) . H y b r i d i z a t i o n
a n d a n a l y s i s o f