Cofactor engineeringCofactor engineering

Microbiologia industriale IIMicrobiologia industriale IIMetabolic Engineering (2002), Metabolic Engineering (2002), 44: 182-192: 182-192

Metabolic Engineering (2002), Metabolic Engineering (2002), 44: 217-229: 217-229

Metabolic Engineering (2003), Metabolic Engineering (2003), 55: 49-55: 49-55

Approccio usuale ingegneria metabolica

• Ottenere l’aumento della produttività manipolando l’output di alcuni pathways metabolici

• Alterazione dei livelli enzimatici– amplificazione, delezione o introduzione di geni

• Tuttora difficile considerare le dinamiche integrate e le strutture di controllo globali

I.M.I.M.

Nutrienti per biosintesi

Anabolismo

Macromolecole

Energia perbiosintesi

Catabolismo

Energiaper trasportonutrienti

Sostanze di scarto, prodotti di fermentazioneaccettori di elettroni ridotti

Chemicals, energia luminosa

Catabolismo Anabolismo

substrato

CO2 Biomassa

ATPATP

Catabolismo Anabolismo

substrato

scarti biomassa

ADPADPATPATP

NAD*NAD*NADHNADH

intermediintermedi

Il catabolismo porta intermedi, equivalenti riducenti e energia all’anabolismo, che produce biomassa

Definizione di un cofattore:

• molecola che partecipa alla reazione

• la sua struttura non è direttamente coinvolta nella formazione del prodotto

• non viene consumata

• passa da uno stato all’altro.

La quantità di cofattore presente all’interno della cellula è limitata : l’esempio del NAD(H/+)

• il NAD(H/+) è coinvolto in più di 300 reazioni metaboliche di ossidoriduzione

• nel catabolismo, una fonte di carbonio viene ossidata e si produce NADH

• in Escherichia coli la quantità di NAD(H/+) si stima attorno alle 10 moli per grammo di peso secco

necessità di rigenerazione: mantenere il bilancio redox

Importanza del bilanciamento redox sul metabolismo globale

Per ottenere 100 g biomassa calcolo le necessità biosintetiche (lievito in Per ottenere 100 g biomassa calcolo le necessità biosintetiche (lievito in anaerobiosi):anaerobiosi):669 mmoli Glucosio, 648 NADPH 1102 NADH669 mmoli Glucosio, 648 NADPH 1102 NADH

648/12=54 Glu648/12=54 Glu Formazione di glicerolo:Formazione di glicerolo:551 Glu551 Glu

551/1274 mmoli di glucosio “anabolico” sono spese per bilanciamento redox:551/1274 mmoli di glucosio “anabolico” sono spese per bilanciamento redox:si tratta del 43%!!si tratta del 43%!!

Se una reazione richiede cofattori, il processo globale dovrebbe risentire della disponibilità e della proporzione in forma attiva del cofattore.

LA MANIPOLAZIONE DEI COFATTORI DIVENTA LA MANIPOLAZIONE DEI COFATTORI DIVENTA CRUCIALE PER INCREMENTARE IL PROCESSOCRUCIALE PER INCREMENTARE IL PROCESSO

Come manipolare i cofattori?

• Ci sono vari esempi di manipolazione dei cofattori

• in generale, due strategie– manipolazione delle condizioni di crescita

– modifiche genetiche

Metabolismo centrale anaerobico in E. coli

Influenza della fonte di carbonio

GluconatoGluconato (+1) GlucosioGlucosio Sorbitolo (-1)Sorbitolo (-1)

Gluconato-6-P Glucosio-6-P

Fruttosio-6-P

Fruttosio-1,6-diP

Gliceraldeide 3P

Sorbitolo-1-P

PiruvatoPiruvato

NAD+

NADHNADH

PEP

Piruvato

ATP

ADP

ATP

ADP

PEP

Piruvato

NAD+

NADHNADH

Gluconate(+1) Glucose(0) Sorbitol(-1)

Substrate uptake 6.61 5.10 6.47Succinate 0.45 0.50 0.41Lactate 2.35 0.39 0.15Formate 2.35 2.29 3.48Ethanol 2.08 3.93 8.31Acetate 7.28 3.93 2.29Et/Ac 0.29 1.00 3.62NADH 4.57 4.17 6.45NAD+ 8.94 5.53 6.88

NADH/NAD+ 0.51 0.75 0.94

Total NAD(H/+) 13.5 9.7 13.3

Chemostati anaerobici

cambiano rapporti NADH/NAD+ ; EtOH/acetato. Ridistribuzione metabolica

Modificazioni genetiche

RICICLORICICLO

SINTESI DE NOVO

-

DH10B DH10B DH10B(pBCSK) (pPNCBIN) (pPNCBIM)

OD 1.200 1.305 0.702NAD+(mol/g DW) 14.49 22.22 31.39NADH(mol/g DW) 17.57 18.26 37.85NADH/NAD+ratio 1.21 0.82 1.21Total NAD(H/+) 32.06 40.48 69.24% change in totalNAD(H/+)

— 26 116

Incremento quantità NAD(H/+)

multicopia mutato

Introduzione di una FDH NAD- dipendente (C. boidinii)

PiruvatoPiruvato

Acetil-CoAAcetil-CoA

FormicoFormicoCOCO22

COCO22

HH22

COCO22

NADHNADH

FDH1

PDHPFL

FDHF

NADHNADH

Pathway originale NAD indipendente (FDHF formico deidrogenasi, NAD indipendente)

Nuovo pathway NAD dipendente (FDH1 formico deidrogenasi, NAD dipendente)

Pathway aerobico NAD dipendente (PDH piruvato deidrogenasi)

Anaerobiosi

• Effetto della presenza di una nuova FDH– aumento OD, consumo glucosio, etanolo, succinato

– diminuiscono lattato e acetato: et/ac aumenta fino a 36 volte

• Differenze tra wt e nuova– aumentano consumo glucosio, OD, etanolo e succinato

– calano acetato e lattato

• La nuova sembra competere con la vecchia: comportamento simile se ha solo eterologa o entrambe

Drastico cambiamento metabolico

• Deciso aumento NADH disponibile (raddoppia)

• Sono favoriti i prodotti ridotti, specialmente quelli che richiedono 2 NADH

• Etanolo diviene il maggior prodotto, 91% dei metaboliti prodotti

• Risultati simili si sono ottenuti clonando i geni di Zymomonas mobilis, ma qui non si è overespresso nessun enzima del pathway per l’etanolo

Incremento disponibilità NADH:caratterizzazione in aerobiosi

• Si induce produzione di etanolo, lattato, succinato, a differenza che nel wild type

• Ambiente più riducente, per bilancio redox si producono anche prodotti di fermentazione.

• La quantità di prodotti non spiega tutto il formato che sparisce: parte del NADH viene respirato.

Addizione acido formico in lievito

• Aumenta la disponibilità di NADH citoplasmatico

• Incremento della biomassa ceppo dipendente

• Produzione di etanolo!

Incremento quantità NAD(H) in lievito

Aumento produzione riboflavina

• Energia di mantenimento: la quantità di ATP che un microorganismo consuma per rimanere vitale e attivo, senza crescere.

• Produzione di riboflavina in Bacillus subtilis:– il pathway biosintetico è stato oggetto di molti studi e migliorie

(operoni multipli derepressi)

– la produzione sembra associata all’efficiente produzione di energia e a un basso metabolismo di mantenimento.

La catena respiratoria ramificata di B. subtilis

Ramo del citocromo c

Ramo della quinolo ossidasi

NADH

Menaquinone

Citc

aa3 ossidasi(qoxA-D)

caa3 ossidasi(ctaC-F)

bc ossidasi(qcrABC)

YthAB(ythAB)

bd ossidasi(cydAB)

NDH-II(YilD)

O2

H2O2H+/e

2H+/e

1H+/e

?H+/e

2H+/e

0H+/e

Strategia

• In dipendenza dalla composizione della catena respiratoria, per ogni elettrone trasportato sono traslocati tra 1 e 4 protoni

• La composizione è modulata dalle condizioni colturali

• La catena dei Bacilli interessanti industrialmente opera ben al di sotto del massimo valore teorico

REINDIRIZZARE IL FLUSSO DI ELETTRONI REINDIRIZZARE IL FLUSSO DI ELETTRONI VERSO LA VIA PIU’ EFFICIENTEVERSO LA VIA PIU’ EFFICIENTE

Maintenance e produzione

0.67 mmol gluc/0.67 mmol gluc/gDW/hgDW/h

0.39 mmol gluc/0.39 mmol gluc/gDW/hgDW/h

Dopo 48 h: incremento del 30% nella Dopo 48 h: incremento del 30% nella produzione di riboflavinaproduzione di riboflavina

Produzione di Isoamil acetato:alterazioni nella disponibilità del CoA

• Sintesi non naturale per E. coli

• Trasformato con gene AAT: alcol acetiltrasferasi

• Aggiunta esterna di alcol isoamilico

• Competizione per acetilCoA con le produzioni naturali EtOH e AcOH

Biosintesi CoA

• Oversepressione di PanK (Pantotenato kinasi), enzima limitante: aumenta tra il 125 e il 150% la concentrazione di CoA

Produzione di isoamilacetato

I flussi metabolici restano I flussi metabolici restano essenzialmente imperturbati, essenzialmente imperturbati, ma aggiungendo isoamilico si ma aggiungendo isoamilico si ottiene un buon incremento ottiene un buon incremento nella produzione di di nella produzione di di isoamilacetatoisoamilacetato

Concludendo

Le manipolazioni dei pool/flussi dei cofattori sono possibili con mezzi fisiologici e genetici,

e possono fornire un ulteriore mezzo per ottimizzare le applicazioni di ingegneria metabolica, sia da soli che accoppiati a modificazioni metaboliche “classiche”