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Il long non-coding RNA MALAT1:
coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi
multipla e regolazione del processo di splicing
alternativo e di backsplicing
Prof. Rosanna Asselta
Department of Biomedical Sciences
Humanitas University
&
Humanitas Clinical and Research Center
© Rosanna_Asselta Il metabolismo dell’RNA nelle malattie neurologiche – 6 Luglio 2018
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La Sclerosi Multipla
La sclerosi multipla (SM) è una
malattia complessa
neurodegenerativa del SNC
caratterizzata da
• infiammazione cronica
• demielinazione
• danno assonale
I sintomi clinici includono parestesia,
paresi, atassia, e disfunzioni di
intestino, vescica, e apparato sessuale
L′età di insorgenza è compresa tra i
20-40 anni, e la malattia è 1,5-2 volte
più comune nelle donne
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La SM è la causa primaria di invalidità tra i giovani adulti
In Europa
la prevalenza varia da 70 a 100 ogni 100.000 abitanti
l’ incidenza varia tra 2 e 4 ogni 100.000 abitanti
Esiste un gradiente nord-sud nella incidenza e prevalenza
della malattia
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La Sclerosi Multipla
DISTRIBUZIONE
GLOBALE
DELLA MS
ALTO RISCHIO
PROBABILE ALTO RISCHIO
BASSO RISCHIO
PROBABILE BASSO RISCHIO
GRADIENTE NORD/SUD
ALTRO RISCHIO
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La patogenesi della malattia non è ancora del tutto chiara, con
l’autoimmunità quale ipotesi più accreditata
Le cellule del sistema immunitario si attivano e attraversano la barriera
emato-encefalica, andando ad attaccare la mielina e gli assoni. Ciò
determina l’insorgenza delle lesioni cerebrali tipiche della SM
Cellule B
Cellule T attivate
CitochineChemochineMMP
Cellule T
NOMMPTNF-
macrophage
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La Sclerosi Multipla
Anticorpi e complemento
Macrofagi
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La Sclerosi Multipla – Quattro sottotipi
Evoluzione e sintomatologia sono eterogenee
Esistono quattro varianti cliniche della malattia
BENIGNA
INTERMITTENTE REMITTENTE (RR) PROGRESSIVA SECONDARIA (SP)
PROGRESSIVA PRIMARIA (PP)
D
I
S
A
B
I
L
I
T
Á
TEMPO
85%
5% 10%
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La Sclerosi Multipla – Una malattia complessa
La sclerosi multipla è una malattia complessa, caratterizzata
dalla interazione tra…
Componente ambientale Predisposizione genetica
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La sclerosi multipla è una malattia complessa, caratterizzata
dalla interazione tra…
Componente ambientale Predisposizione genetica
Analizzato 44 meta-analisi
416 studi
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La Sclerosi Multipla – Una malattia complessa
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Componente ambientale Predisposizione genetica
Associazioni supportate da prove convincenti
OR [95% CI] P value
Sieropositività all’antigene nucleare del virus
Epstein-Barr4.46 [3.26-6.09] 1.5 * 10-19
Fumo 1.52 [1.39-1.66] 7.0 * 10-18
Altre associazioni
Appendicectomia 20a 1.17 [1.02-1.34] 0.05
Tonsillectomia 20a 1.32 [1.09-1.61] 0.05
Vaccinazione contro difterite 0.60 [0.40-0.91] 0.05
Vaccinazione contro tetano 0.71 [0.57-0.88] 0.05
Ferite da trauma 1.41 [1.03-1.92] 0.05
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La Sclerosi Multipla – Una malattia complessa
La sclerosi multipla è una malattia complessa, caratterizzata
dalla interazione tra…
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Componente ambientale Predisposizione genetica
In più…
Mancanza di vitamina D
Uso eccessivo di sale
Stress ossidativo
… sembrerebbero avere
un effetto predisponente
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La Sclerosi Multipla – Una malattia complessa
La sclerosi multipla è una malattia complessa, caratterizzata
dalla interazione tra…
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Componente ambientale Predisposizione genetica
La predisposizione genetica spiegherebbe il 30% del rischio
di malattia
Di questo, solo un terzo è stato spiegato grazie a…
Studi di linkage estesi a tutto
il genoma in famiglie
Studi di associazione su gene
candidato
Studi di associazione estesi a
tutto il genoma (GWAS) su
grandi coorti caso-controllo
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La Sclerosi Multipla – Una malattia complessa
La sclerosi multipla è una malattia complessa, caratterizzata
dalla interazione tra…
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Componente ambientale Predisposizione genetica
La predisposizione genetica spiegherebbe il 30% del rischio
di malattia
Di questo, solo un terzo è stato spiegato grazie a…
Aplotipo DRB1*15:01
nella regione HLA
+
˃200 geni associati alla SM
(molti con funzioni immunologiche)
Tra gli altri, IL7R, SP140, e
PRKCA
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La Sclerosi Multipla – Una malattia complessa
La sclerosi multipla è una malattia complessa, caratterizzata
dalla interazione tra…
Studi di linkage estesi a tutto
il genoma in famiglie
Studi di associazione su gene
candidato
Studi di associazione estesi a
tutto il genoma (GWAS) su
grandi coorti caso-controllo
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Componente ambientale Predisposizione genetica
Solo in pochi casi la specifica variante funzionale è stata
identificata e caratterizzata
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La Sclerosi Multipla – Una malattia complessa
La sclerosi multipla è una malattia complessa, caratterizzata
dalla interazione tra…
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Componente ambientale Predisposizione genetica
Solo in pochi casi la specifica variante funzionale è stata
identificata e caratterizzata
Se caratterizzata, la variante funzionale è stata molto
spesso associata ad un pattern di splicing aberrante del
gene corrispondente
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La Sclerosi Multipla – Una malattia complessa
La sclerosi multipla è una malattia complessa, caratterizzata
dalla interazione tra…
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Le varianti funzionali che hanno conseguenze sullo splicing
causano solitamente...
Splicing aberranti più comuni
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La Sclerosi Multipla – Una malattia complessa
1
2
3
Skipping dell’esone
Ritenzione dell’introne
Attivazione di siti criptici
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… e i fattori coinvolti sono quelli responsabili della…
Splicing aberranti più comuni
1
2
Elementi in cis (i.e., sequenze
specifiche presenti sulla
molecola di RNA)
Elementi in-trans (i.e.,
proteine leganti sequenze
in-cis che aumentano o
diminuiscono l’efficienza
dello splicing)
Esempi:
proteine hnRNP e SRSF
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Regolazione dello splicing
La Sclerosi Multipla – Una malattia complessa
1
2
3
Skipping dell’esone
Ritenzione dell’introne
Attivazione di siti criptici
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Sclerosi multipla & splicing?
C’è una
disregolazione
del processo di
splicing nella
SM?
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Per rispondere a questa domanda…
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Parole chiave
“Multiple sclerosis”
“Blood”
“Homo sapiens”
Analisi di dati di microarray
STEP 1 – Consultazione del database GEO
Criteri di selezione
Design Caso-Controllo
Su campioni di sangue
Min di 10 casi & 10 contolli
1.800 voci
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7 dataset
Ulteriori criteri di selezione
Solo PAZIENTI RR
Solo pazienti LONTANI DA ULTIMO
TRATTAMENTO
190 pazienti RR
182 controlli sani
SM
Controlli
0
10
20
30
40
50
60
N in
div
idu
i
Distribuzione di casi SM e controlli nei 7 dataset
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Analisi di dati di microarray
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STEP 2 – Analisi dell’espressione genica
Software GEO2R
(basato su Bioconductor)
Recuperato i 3.000 geni più disregolati
per CIASCUN dataset
Indipendentemente dal fold change
Indipendentemente dal P value
Indipendentemente dalla direzione (UP / DOWN regulation)
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Analisi di dati di microarray
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STEP 3 – Ricerca di gruppi di geni
disregolati funzionalmente correlati
Software DAVID(The Database for Annotation,
Visualization and Integrated Discovery)
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Analisi di dati di microarray
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0
50
100
150
200
250
300N
ind
ivid
ui
GSE13732
GSE41848
GSE17048
GSE43592
GSE21942
GSE41849
I 5 pathway risultati arricchiti in geni disregolati
GSE41890
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Analisi di dati di microarray
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0
50
100
150
200
250
300N
ind
ivid
ui
GSE13732
GSE41848
GSE17048
GSE43592
GSE21942
Pathway più disregolato
Disregolazione significativa in 5 su
7 dataset
Meta-analisi: p value 7,7 * 10-23
Paraboschi et al., Int J Mol Sci. 16:23463-81, 2015
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Analisi di dati di microarray
I 5 pathway risultati arricchiti in geni disregolati
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STEP 4 – Identificazione di trascritti disregolati in
comune tra i dataset appartenenti alla categoria
"mRNA splicing"
CELF1
MBNL1
CSTF3
SRSF10
GEMIN6
HNRNPA2B1HNRNPH1
SRSF3 SCAF11
SRSF1
POLR2E
HNRNPH3
DDX39B
POLR2J
RPL36AP51
YTHDC1
mRNA
splicing
5/5 dataset
4/5 dataset
3/5 dataset
Paraboschi et al., Int J Mol Sci. 16:23463-81, 2015
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PCBP1
Analisi di dati di microarray
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Paraboschi et al., Int J Mol Sci. 16:23463-81, 2015
CELF1
MBNL1
CSTF3
SRSF10
GEMIN6
HNRNPA2B1HNRNPH1
SRSF3 SCAF11
SRSF1
POLR2E
HNRNPH3
DDX39B
POLR2J
RPL36AP51
YTHDC1
mRNA
splicing
CELF1
(CUGBP Elav-like family member 1)
Regolatore dello splicing di dozzine di
trascritti
Coinvolto nel processo di attivazione dei
linfociti T
Nei dataset analizzati, CELF1 è down-
regolato nei casi SM
(p = 4*10-5)
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Analisi di dati di microarray
STEP 4 – Identificazione di trascritti disregolati in
comune tra i dataset appartenenti alla categoria
"mRNA splicing"
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Misurazione di CELF1 in pazienti e controlli
Paraboschi et al., Int J Mol Sci. 16:23463-81, 2015
30 casi SM 30 controlli
Estrazione di RNA da PBMC
Real-time RT-PCR
8
6
4
2
0
Liv
ell
i d
i e
sp
res
sio
ne
di C
EL
F1
Controlli
N=30
MS casi
N=30
P=0,0015
Confermata la down-regolazione
di CELF1 nei casi SM
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Per ricapitolare brevemente…
CELF1
dysregulation
© Rosanna_Asselta Il metabolismo dell’RNA nelle malattie neurologiche – 6 Luglio 2018
Varianti associate a SM spesso
alterano lo
splicing
Dati derivanti dalla letteratura e da analisi di dati
depositati in banche dati
![Page 27: coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi multipla e ... · Appendicectomia 20a 1.17 [1.02-1.34] 0.05 Tonsillectomia 20a 1.32 [1.09-1.61] 0.05 ... 2015 CELF1 MBNL1 CSTF3 SRSF10](https://reader036.vdocument.in/reader036/viewer/2022071011/5fc8ed35a3e60475da3b9118/html5/thumbnails/27.jpg)
CELF1
dysregulation
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Disregolazione generale
dei geni dello splicing
Per ricapitolare brevemente…
Dati derivanti dalla letteratura e da analisi di dati
depositati in banche dati
Varianti associate a SM spesso
alterano lo
splicing
![Page 28: coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi multipla e ... · Appendicectomia 20a 1.17 [1.02-1.34] 0.05 Tonsillectomia 20a 1.32 [1.09-1.61] 0.05 ... 2015 CELF1 MBNL1 CSTF3 SRSF10](https://reader036.vdocument.in/reader036/viewer/2022071011/5fc8ed35a3e60475da3b9118/html5/thumbnails/28.jpg)
CELF1
dysregulation
Disregolazione di
CELF1
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Per ricapitolare brevemente…
Varianti associate a SM spesso
alterano lo
splicing
Disregolazione generale
dei geni dello splicing
![Page 29: coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi multipla e ... · Appendicectomia 20a 1.17 [1.02-1.34] 0.05 Tonsillectomia 20a 1.32 [1.09-1.61] 0.05 ... 2015 CELF1 MBNL1 CSTF3 SRSF10](https://reader036.vdocument.in/reader036/viewer/2022071011/5fc8ed35a3e60475da3b9118/html5/thumbnails/29.jpg)
Considerando che i geni regolatori dello splicing sono
disregolati nella SM…
Questi geni regolatori…
… hanno un effetto sullo splicing dei trascritti
«downstream»?
HNRNPFHNRNPH
Geni regolatori dello splicing
CELF1
Splicing pattern su trascritti a valle
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Caratteristiche comuni:
Avere un pattern di splicing con isoforme “fisiologiche" alternative
Presenza di un polimorfismo in grado di influenzare il pattern di splicing
Scelta di potenziali geni target
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Scelta di potenziali geni target
Caratteristiche comuni:
Avere un pattern di splicing con isoforme “fisiologiche" alternative
Presenza di un polimorfismo in grado di influenzare il pattern di splicing
Senza ipotesi a-priori
NFAT5
GSDMB
![Page 32: coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi multipla e ... · Appendicectomia 20a 1.17 [1.02-1.34] 0.05 Tonsillectomia 20a 1.32 [1.09-1.61] 0.05 ... 2015 CELF1 MBNL1 CSTF3 SRSF10](https://reader036.vdocument.in/reader036/viewer/2022071011/5fc8ed35a3e60475da3b9118/html5/thumbnails/32.jpg)
Senza ipotesi a-priori Associati alla SM
NFAT5
GSDMB
IL7R
SP140
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PRKCA
Scelta di potenziali geni target
Caratteristiche comuni:
Avere un pattern di splicing con isoforme “fisiologiche" alternative
Presenza di un polimorfismo in grado di influenzare il pattern di splicing
![Page 33: coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi multipla e ... · Appendicectomia 20a 1.17 [1.02-1.34] 0.05 Tonsillectomia 20a 1.32 [1.09-1.61] 0.05 ... 2015 CELF1 MBNL1 CSTF3 SRSF10](https://reader036.vdocument.in/reader036/viewer/2022071011/5fc8ed35a3e60475da3b9118/html5/thumbnails/33.jpg)
NFAT5
NFAT5, Nuclear factor of activated T-cells 5
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Paraboschi et al., Int J Mol Sci. 16:23463-81, 2015
Scelta di potenziali geni target
P=0,026
Controlli
P=0,96
Casi SM
% d
i is
ofo
rma
2
/ tr
ascritti to
tali
![Page 34: coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi multipla e ... · Appendicectomia 20a 1.17 [1.02-1.34] 0.05 Tonsillectomia 20a 1.32 [1.09-1.61] 0.05 ... 2015 CELF1 MBNL1 CSTF3 SRSF10](https://reader036.vdocument.in/reader036/viewer/2022071011/5fc8ed35a3e60475da3b9118/html5/thumbnails/34.jpg)
NFAT5
Splicing pattern
correlato a genotipo
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Paraboschi et al., Int J Mol Sci. 16:23463-81, 2015
Scelta di potenziali geni target
P=0,026
Controlli
P=0,96
Casi SM
Perdita della correlazione tra
splicing e genotipo in SM
![Page 35: coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi multipla e ... · Appendicectomia 20a 1.17 [1.02-1.34] 0.05 Tonsillectomia 20a 1.32 [1.09-1.61] 0.05 ... 2015 CELF1 MBNL1 CSTF3 SRSF10](https://reader036.vdocument.in/reader036/viewer/2022071011/5fc8ed35a3e60475da3b9118/html5/thumbnails/35.jpg)
GSDMB
P=0,14
Casi SM
GSDMB, Gasdermin B
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rs35104165
(G>A)
gagg[a/t]ttcca
4 85 6 75’ 3’ GSDMB
Cardamone et al., Int J Mol Sci. 18(3), 2017
Scelta di potenziali geni target
P=8*10-5
Controlli
![Page 36: coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi multipla e ... · Appendicectomia 20a 1.17 [1.02-1.34] 0.05 Tonsillectomia 20a 1.32 [1.09-1.61] 0.05 ... 2015 CELF1 MBNL1 CSTF3 SRSF10](https://reader036.vdocument.in/reader036/viewer/2022071011/5fc8ed35a3e60475da3b9118/html5/thumbnails/36.jpg)
GSDMB
Splicing pattern
correlato a genotipo
Perdita della correlazione tra
splicing e genotipo in SM
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rs35104165
(G>A)
gagg[a/t]ttcca
4 85 6 75’ 3’ GSDMB
Cardamone et al., Int J Mol Sci. 18(3), 2017
Scelta di potenziali geni target
P=0,14
Casi SM
P=8*10-5
Controlli
![Page 37: coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi multipla e ... · Appendicectomia 20a 1.17 [1.02-1.34] 0.05 Tonsillectomia 20a 1.32 [1.09-1.61] 0.05 ... 2015 CELF1 MBNL1 CSTF3 SRSF10](https://reader036.vdocument.in/reader036/viewer/2022071011/5fc8ed35a3e60475da3b9118/html5/thumbnails/37.jpg)
IL7R
Splicing pattern
correlato a genotipo
? ? ?
Perdita della correlazione tra
splicing e genotipo in SM
? ? ?
rs6897932
(C/T)
Controlli
N=36
Casi SM
N=20
35
40
45
50
55
60
***
% (
5
6 +
6
)/ T
rascritti to
tali
La frequenza dell’allele
minore è bassa, non
abbiamo trovato un numero
sufficiente di soggetti per
poter stratificare sulla base
dei tre genotipi
IL7R, Interleukin 7 Receptor
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Scelta di potenziali geni target
![Page 38: coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi multipla e ... · Appendicectomia 20a 1.17 [1.02-1.34] 0.05 Tonsillectomia 20a 1.32 [1.09-1.61] 0.05 ... 2015 CELF1 MBNL1 CSTF3 SRSF10](https://reader036.vdocument.in/reader036/viewer/2022071011/5fc8ed35a3e60475da3b9118/html5/thumbnails/38.jpg)
SP140
Splicing pattern
correlato a genotipo
Perdita della correlazione tra
splicing e genotipo in SM
Casi SM Controlli
6 7 8 SP1405’ 3’
rs28445040
(C>T)
N=4
P=0,23 P=0,0033
%
7/ T
rascritt
i to
tali
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SP140, Nuclear Body Protein
Scelta di potenziali geni target
![Page 39: coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi multipla e ... · Appendicectomia 20a 1.17 [1.02-1.34] 0.05 Tonsillectomia 20a 1.32 [1.09-1.61] 0.05 ... 2015 CELF1 MBNL1 CSTF3 SRSF10](https://reader036.vdocument.in/reader036/viewer/2022071011/5fc8ed35a3e60475da3b9118/html5/thumbnails/39.jpg)
Splicing pattern
correlato a genotipo
Perdita della correlazione tra
splicing e genotipo in SM
% d
i in
clu
sio
ne
di esone
3*
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PRKCA, Protein Kinase C Alpha Paraboschi et al., Hum Mol Genet. 23:6746-61, 2014
PRKCA 3 3* 4 PRKCA5’ 3’
rs35476409
(GGTG>GGTGGGTG)
Scelta di potenziali geni target
P=0,48
Casi SM
P=2,9*10-14
Controlli
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CELF1
dysregulation
Disregolazione di
CELF1
Perdita della
correlazione tra
splicing e genotipo
in SM
NFAT5
GSDMB
IL7R
SP140
PRKCA
Per ricapitolare brevemente…
Varianti associate a SM spesso
alterano lo
splicing
Disregolazione generale
dei geni dello splicing
![Page 41: coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi multipla e ... · Appendicectomia 20a 1.17 [1.02-1.34] 0.05 Tonsillectomia 20a 1.32 [1.09-1.61] 0.05 ... 2015 CELF1 MBNL1 CSTF3 SRSF10](https://reader036.vdocument.in/reader036/viewer/2022071011/5fc8ed35a3e60475da3b9118/html5/thumbnails/41.jpg)
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CELF1
dysregulation
Disregolazione di
CELF1
NFAT5
GSDMB
IL7R
SP140
PRKCA
Esiste un
meccanismo
unificante che
spieghi tutte
queste
osservazioni?
Per ricapitolare brevemente…
Varianti associate a SM spesso
alterano lo
splicing
Disregolazione generale
dei geni dello splicing
Perdita della
correlazione tra
splicing e genotipo
in SM
![Page 42: coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi multipla e ... · Appendicectomia 20a 1.17 [1.02-1.34] 0.05 Tonsillectomia 20a 1.32 [1.09-1.61] 0.05 ... 2015 CELF1 MBNL1 CSTF3 SRSF10](https://reader036.vdocument.in/reader036/viewer/2022071011/5fc8ed35a3e60475da3b9118/html5/thumbnails/42.jpg)
Prima di rispondere a questa domanda…
IL7R
… facciamo un passo indietro!
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Focus sui long non-coding RNA
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7 dataset
Ulteriori analisi
Considerati i 250 geni più disregolati
Analisi manuale
Geni disregolati in più di un dataset
Solo 3 dataset con dati sui lncRNA
GSE13732 GSE21942
GSE43592
DHRS4-AS1
DLEU2
FUT8-AS1
GAS5
HCG18
MALAT1
KIAA0125
LINC01004
LINC01128
LINC01184
LINC01560
LINC01578
MEG3
PAXIP1-AS2
PPP3CB-AS1
RUSC1-AS1
PSMD6-AS2 SNHG1
SNHG12
NCK1-AS1 TPT1-AS1
UBXN7-AS1
22 114
10LncRNA maggiormente disregolato
MALAT1
P value meta-analisi: 1,33*10-8
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Focus sui long non-coding RNA
![Page 45: coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi multipla e ... · Appendicectomia 20a 1.17 [1.02-1.34] 0.05 Tonsillectomia 20a 1.32 [1.09-1.61] 0.05 ... 2015 CELF1 MBNL1 CSTF3 SRSF10](https://reader036.vdocument.in/reader036/viewer/2022071011/5fc8ed35a3e60475da3b9118/html5/thumbnails/45.jpg)
Screenshot dal database GEO
Up-regulazione in casi SM
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Focus sui long non-coding RNA
![Page 46: coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi multipla e ... · Appendicectomia 20a 1.17 [1.02-1.34] 0.05 Tonsillectomia 20a 1.32 [1.09-1.61] 0.05 ... 2015 CELF1 MBNL1 CSTF3 SRSF10](https://reader036.vdocument.in/reader036/viewer/2022071011/5fc8ed35a3e60475da3b9118/html5/thumbnails/46.jpg)
Estrazione di RNA da PBMC
Real-time RT-PCR Confermata up-reglazione
di MALAT1 in casi SM
Casi SM Controlli
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Misurazione di MALAT1 in pazienti e controlli
Livelli di espressione di MALAT1in una coorte Italiana
Liv
elli
di e
sp
ressio
ne
Casi RR-SM
N=23
Controlli
N=30
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Estrazione di RNA da PBMC
Real-time RT-PCR
Casi SM Controlli
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Livelli di espressione di MALAT1in una coorte Statunitense
Liv
elli
di e
sp
ressio
ne
Confermata up-reglazione
di MALAT1 in casi SM
(accentuata in casi PP)
Casi
RR-SM
N=29
Controlli
N=20
Casi
PP-SM
N=7
Misurazione di MALAT1 in pazienti e controlli
![Page 48: coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi multipla e ... · Appendicectomia 20a 1.17 [1.02-1.34] 0.05 Tonsillectomia 20a 1.32 [1.09-1.61] 0.05 ... 2015 CELF1 MBNL1 CSTF3 SRSF10](https://reader036.vdocument.in/reader036/viewer/2022071011/5fc8ed35a3e60475da3b9118/html5/thumbnails/48.jpg)
MALAT1 - Metastasis-Associated Lung Adenocarcinoma Transcript 1
MALAT1 potrebbe essere il
responsabile della disregolazione
dello splicing?
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MALAT1 - Metastasis-Associated Lung Adenocarcinoma Transcript 1
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MALAT1 è un trascritto molto abbondante
E’ localizzato nelle speckle nucleari (corpuscoli arricchiti in fattori di splicing)
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MALAT1
Over-espressioneHeLa, HEK293, SH-SY5Y
MALAT1
silenziamento
Liv
elli
di e
sp
ressio
ne
di M
AL
AT
1
MALAT1 – Livelli di espressione in linee cellulari
,
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![Page 51: coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi multipla e ... · Appendicectomia 20a 1.17 [1.02-1.34] 0.05 Tonsillectomia 20a 1.32 [1.09-1.61] 0.05 ... 2015 CELF1 MBNL1 CSTF3 SRSF10](https://reader036.vdocument.in/reader036/viewer/2022071011/5fc8ed35a3e60475da3b9118/html5/thumbnails/51.jpg)
Abbiamo misurato l’effetto dell’over-espressione di MALAT1 sui geni correlati alla
regolazione dello splicing (HRNPF, HNRPH, CELF1 e SRSF1).
L’over-espressione di MALAT1 determina effetti opposti sui geni target a seconda
della linea cellulare
- Up-regolazione significativa in cellule HEK293 ed HeLa
- Down-regolazione significativa in cellule SY5Y
MALAT1 – Esperimenti di over-espressione
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Liv
elli
di e
spre
ssio
ne
![Page 52: coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi multipla e ... · Appendicectomia 20a 1.17 [1.02-1.34] 0.05 Tonsillectomia 20a 1.32 [1.09-1.61] 0.05 ... 2015 CELF1 MBNL1 CSTF3 SRSF10](https://reader036.vdocument.in/reader036/viewer/2022071011/5fc8ed35a3e60475da3b9118/html5/thumbnails/52.jpg)
MALAT1 – Esperimenti di silencing
Abbiamo misurato l’effetto del silencing di MALAT1 sui geni correlati alla
regolazione dello splicing (HRNPF, HNRPH, CELF1 e SRSF1).
Il silenziamento di MALAT1 determina,
anche in questo caso, effetti opposti sui
geni target, e con risultati in direzione
opposta a quelli della over-espressione
© Rosanna_Asselta Il metabolismo dell’RNA nelle malattie neurologiche – 6 Luglio 2018
Liv
elli
di e
spre
ssio
ne
Liv
elli
di e
spre
ssio
ne
![Page 53: coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi multipla e ... · Appendicectomia 20a 1.17 [1.02-1.34] 0.05 Tonsillectomia 20a 1.32 [1.09-1.61] 0.05 ... 2015 CELF1 MBNL1 CSTF3 SRSF10](https://reader036.vdocument.in/reader036/viewer/2022071011/5fc8ed35a3e60475da3b9118/html5/thumbnails/53.jpg)
Quindi, MALAT1 regola….
… i geni che regolano lo splicing
MALAT1
HNRNPFHNRNPH
Geni regolatori dello splicing
CELF1
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MALAT1 – E’ un «master gene»?
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La disregolazione di MALAT1…
… influisce sui geni correlati alla SM?
MALAT1
HNRNPFHNRNPH
Geni regolatori dello splicing
CELF1
Splicing pattern su trascritti a valle associati a SM
IL7R SP140
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PRKCA
MALAT1 – E’ un «master gene»?
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Effetto della modulazione di MALAT1 sui geni
associati alla SM
IL7R
La over-espressione e il
silenziamento di MALAT1
determinano effetti opposti
nelle diverse linee cellulari,
aumentando o diminuendo
significativamente i livelli di
skipping degli esoni 5 e 6
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Liv
elli
di skip
pin
g e
so
ni 5
+6
MALAT1
over-espressione
mock MALAT1
silenziamento
mock
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SP140
L’over-espressione di
MALAT1 determina un
incremento significativo
dello skipping dell’esone 7
SP140
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Effetto della modulazione di MALAT1 sui geni
associati alla SML
ive
lli d
i skip
pin
g e
so
ne
7
MALAT1
over-espressione
mock
HeLa
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PRKCA
Il silenziamento di MALAT1
determina effetti opposto
nelle diverse linee cellulari,
con aumento o
decremento significativo
dei livelli di skipping
dell’esone 3*
HeLa SH-SY5Y
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Effetto della modulazione di MALAT1 sui geni
associati alla SM
Liv
elli
di skip
pin
g e
so
ne
3*
MALAT1
silenziamento
mock MALAT1
silenziamento
mock
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Per confermare tutti questi dati…
Abbiamo adottato una strategia «omica», utilizzando un
sistema cellulare più rilevante per la SM
Cellule T Jurkat
3 controlli 3 knockdown
(siRNA)
High-coverage RNA-sequencing
1. Analisi di gene expression
80,5 milioni
read/campione
2. Profilo di splicing alternativo
3. Analisi degli RNA circolari
Software DCC
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1 - Analisi di gene expression
107 geni differenzialmente espressi (FDR<0,1)
30 geni up-regolati
77 geni down-regolati
mock MALAT1
kd
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100 gruppi arricchiti in geni funzionalmente correlati
(FDR<0,01)
Gene-set enrichment analysis (GSEA)
NES
Enri
chm
entscore
(E
S)
Adaptive immune systemNES=3.6
FDR=0.0
Respiratory electron transport
Enri
chm
entscore
(E
S) NES=5.0
FDR=0.0
Metabolism of mRNA
Enri
chm
entscore
(E
S) NES=4.0
FDR=0.0
Top gene set (FDR<0,001)
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1 - Analisi di gene expression
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2 - Profilo di splicing alternativo
Tipo di evento di splicing Numero di eventi
Esone skippato
5’ splice site alternativo
3’ splice site alternativo
Esoni mutualmente esclusivi
Introni ritenuti
699
96
93
38
197
Eventi totali 1123
Identificati 1123 eventi di splicing disregolati (FDR<0,05)
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Il silenziamento di MALAT1 diminuisce lo skipping dell’esone 6 di IL7R
Esone5 Esone 6 Esone 7
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2 - Profilo di splicing alternativo
Numero di eventi
Esone skippato
5’ splice site alternativo
3’ splice site alternativo
Esoni mutualmente esclusivi
Introni ritenuti
699
96
93
38
197
Eventi totali 1123
Identificati 1123 eventi di splicing disregolati (FDR<0,05)
Tipo di evento di splicing
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3 – Analisi degli RNA circolari
Validazione in real-time RT-PCR
mock
MALAT1 kd
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
RNF168
n=3
SLC45A4
n=3
** *
Liv
elli
di e
sp
ressio
ne
Log2FC
-log
10(p
-valu
e)
RNF168
SLC45A
4
Identificati 940 circRNA (di
cui 500 mai descritti prima)
49 circRNA
differenzialmente espressi
(P<0,05)
13 circRNA up-regolati
36 circRNA down-regolati
Prodotti dal processo di
backsplicing
La loro biogenesi compete con lo
splicing lineare
Possono agire come spugne
molecolari di miRNA e proteine
circRNA
L’analisi di RNA-seq ha
evidenziato un ruolo di
MALAT1 anche nel
processo di regolazione
del backsplicing
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Per ricapitolare brevemente…
Disregolazione di
CELF1
NFAT5
GSDMB
IL7R
SP140
PRKCA
La disregolazione di MALAT1 ha
effetti
su altri
geni
MALAT1 regola
anche il backsplicing
Varianti associate a SM spesso
alterano lo
splicing
Perdita della
correlazione tra
splicing e genotipo
in SM
Disregolazione generale
dei geni dello splicing
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Che cosa
regola
MALAT1?
Per ricapitolare brevemente…
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Che cosa
regola
MALAT1?
Per ricapitolare brevemente…
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Meccanismi molecolari responsabili della
up-regolazione di MALAT1
Sono note diverse condizioni di stress
in grado di up-regolare MALAT1
Ipossia (Lelli et al., 2015)
Stimolazione con LPS (Zhao et al., 2016)
Infezione con Flavivirus (Bhattacharyya and Vrati, 2015)
Trattamento con H2O2 (Yao et al., 2016)
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Effetto del trattamento con H2O2 in cellule Jurkat
H2O2
Estrazione
di RNA
Espressione di MALAT1
Norm
aliz
ed
expre
ssio
nle
vel
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
H2O2NT
*
Aumento di 1,5 volte nei livelli di
espressione di MALAT1
(IL7R
5
6 +
6)/
tota
l
transcripts
(rescale
dvalu
e)
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2 *
NT H2O2
Livelli di skipping
dell’esone 6 di IL7R
Aumento di 1,6 volte nei livelli di
skipping dell’esone 6 di IL7R
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In conclusione… Il nostro modello
Livelli di
MALAT1 aumentati
Membrana
plasmatica dei
macrofagi
Sistema
NADPH
ossidasi
Livelli di
ROS incrementati
up-/down-regolazione delle
proteine che
regolano lo splicing
Isoforme di proteine
aberranti
(possibili nuovi
antigeni?)
Traduzione
Splicing aberrante
Sclerosi
Multipla
Componentegenetica
Infezionivirali
Ridottaesposizione
solare(vitamina D)
Accumulo di linfociti e macrofagi
nel cervello
Ipossia &
Stress ossidativo
© Rosanna_Asselta
Backsplicing aberranteEffetto spugna sui miRNA deregolato
(espressione genica disregolata)
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Grazie a…
Prof. Stefano Duga
Dr. Giulia Soldà
Elvezia Paraboschi (Elvis)
Giulia Cardamone (Momo)
Valeria Rimoldi
Letizia Straniero
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Grazie a…
© Rosanna_Asselta Il metabolismo dell’RNA nelle malattie neurologiche – 6 Luglio 2018